Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in humanen ... fileAus der Abteilung für...

Aus der Abteilung für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie

des Zentrums Innere Medizin der

Medizinischen Hochschule Hannover

Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in

humanen intestinalen Mastzellen

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

an der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Seza Bolat

aus Celle

Hannover, 2006

2

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 25.02.2008 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer: Prof. Dr. Stephan C. Bischoff

Referent/Referentin: Prof. Dr. med. Reinhard Pabst

Koreferentin: Prof.`in Dr. med. Bettina Wedi

Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2008

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Alexander Kapp

Prof. Dr. Burkhard Wippermann

Prof. Dr. Stefan Kubicka

3

Inhaltverzeichnis

1. Einleitung................................................................................................................ 8

1.1 Allergie .............................................................................................................. 8

1.2 Mastzellen......................................................................................................... 8

1.2.1 Morphologie, Entwicklung und Heterogenität............................................... 8

1.2.3 Funktion..................................................................................................... 10

1.2.4 Mediatoren................................................................................................. 11

1.2.5 Aktivierung................................................................................................. 13

1.2.6 Hemmung .................................................................................................. 14

1.3 Exozytose und SNARE-Proteine..................................................................... 15

1.4 Botulinum Neurotoxin...................................................................................... 18

1.5 Adenoviren...................................................................................................... 20

1.6 Fragestellung .................................................................................................. 21

2. Materialien und Methoden .................................................................................... 22

2.1 Materialien ...................................................................................................... 22

2.1.1 Chemikalien und Reagenzien .................................................................... 22

2.1.2 Antikörper .................................................................................................. 23

2.1.3 Kommerzielle Kits ...................................................................................... 24

2.1.4 Enzyme...................................................................................................... 24

2.1.5 Puffer, Lösungen und Medien.................................................................... 24

2.1.6 Verwendete Zelllinien ................................................................................ 26

2.1.7 Klonierungsvektoren .................................................................................. 27

2.1.8 Rekombinante Adenoviren......................................................................... 28

2.2. Molekularbiologische Methoden..................................................................... 28

2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA ........................................................ 28

2.2.2 Transformation........................................................................................... 29

2.2.3 Mini-Plasmidpräparation ............................................................................ 30

2.2.4 Maxi-Plasmidpräparation ........................................................................... 30

2.2.5 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen .......................................... 31

2.2.6 Phenol-Chloroform-Extraktion.................................................................... 31

2.2.7 RNA-Isolation und Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion .... 32

2.2.8 Agarosegelelektrophorese......................................................................... 34

4

2.3 Proteinbiochemische Methoden...................................................................... 35

2.3.1 Zellextraktion ............................................................................................. 35

2.3.2 Western Blot .............................................................................................. 35

2.4 Virale Methoden.............................................................................................. 36

2.4.1 Zellkultur .................................................................................................... 36

2.4.2 Transfektion............................................................................................... 36

2.4.3 Virusisolierung ........................................................................................... 37

2.4.4 Vermehrung und Präparation von Adenoviren........................................... 37

2.4.5 Titerbestimmung ........................................................................................ 38

2.4.6 Transduktion von Primärzellen .................................................................. 39

2.5 Zellbiologische Methoden ............................................................................... 39

2.5.1 Isolation von Mastzellen aus menschlichem Darmgewebe........................ 39

2.5.2 Mastzellanreicherung durch MACS (Magnetic beads-activated cell sorting)

.................................................................................................................. 40

2.5.3 Kultur menschlicher Darm-Mastzellen ....................................................... 42

2.5.4 Zellzählung und Differenzierung ................................................................ 42

2.5.5 Mastzellaktivierung/ Mediatormessung...................................................... 42

2.5.6 Permeabilisierung mit Streptolysin O (SLO) .............................................. 43

2.5.7 Konfokale Immunfluoreszenz-Mikroskopie ................................................ 44

2.6 Statistik ........................................................................................................... 45

3. Ergebnisse............................................................................................................ 46

3.1 Nachweis von SNARE-Proteinen in menschlichen Darm- Mastzellen ............ 46

3.1.1 SNARE-mRNA Nachweis mittels RT-PCR ................................................ 46

3.1.2 SNARE-Protein Nachweis mittels Western Blot......................................... 48

3.2 Untersuchung des Einflusses von Botulinum Neurotoxin auf die

Mastzelldegranulation..................................................................................... 49

3.2.1 Herstellung adenoviraler Konstrukte.......................................................... 49

3.2.2 Virusgenerierung ....................................................................................... 52

3.2.3 Transduktion der Mastzellen mit rekombinierten Adenoviren .................... 55

3.2.4 Untersuchung der Exozytose adenoviral transduzierter Mastzellen .......... 57

3.3 Funktionelle Bedeutung der gefundenen SNARE-Proteine............................. 59

3.3.1 Intrazelluläre Lokalisation der SNARE-Proteine ........................................ 59

3.3.2 VAMP-7 transloziert während der Exozytose............................................. 60

5

3.3.3 Die Inhibition des SNARE-Proteins VAMP-7 bewirkt eine

Degranulationshemmung .......................................................................... 62

4. Diskussion ............................................................................................................ 64

4.1 Expression von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen ......... 64

4.2 Hemmung der Mastzelldegranulation durch Botulinum Neurotoxin................. 65

4.3 Bedeutung von VAMP-7 für die Mastzelldegranulation ................................... 69

4.4 Ausblick........................................................................................................... 72

5. Zusammenfassung ............................................................................................... 73

6. Literaturverzeichnis............................................................................................... 75

7. Danksagung ......................................................................................................... 87

8. Lebenslauf ............................................................................................................ 89

9. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO ...................................................... 90

6

Abkürzungsverzeichnis

ACC Acetylcystein

BoNT Botulinumneurotoxin CAR Coxsackie Adenovirus Receptor

CD Cluster of Differentiation

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cys-LT cysteinyl-Leukotriene

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat

Fc konstante Region der Immunglobuline (Fragment crystallizable)

FCS fetales Kälberserum

FcεR Immunglobulin E Rezeptor

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase GFP Green Fluorescent Protein

HMC-1 Humane Mastzellinie-1

Ig Immunglobuline

IP3 Inositol Trisphosphat LB Luria Broth

MACS magnetische Zellseparation (magnetic-activated cell sorting)

mAk monoklonaler Antikörper

MC Mastzelle/n MCS Multiple Cloning Site

MCT Tryptase positive und Chymase negative Mastzelle

MCTC Tryptase und Chymase positive Mastzelle MHC Major Histocompatibility Complex

MOI Multiplicity of Infection (Anzahl infektiöser Partikel pro Zelle)

mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger RNA)

NSF N-ethylmaleimide-sensitive factor

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) PDT Protein Transduction Domains

PFU Plaque Forming Unit

PGD2 Prostaglandin D2 PMA Phorbol-Myristat-Acetat

RBL-2H3 rat basophilic leukemia cells

rh rekombinant, human

RIA Radioimmunoassay rpm Rotationen pro Minute

7

RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion

SCF Stem Cell Factor (c-kit Ligand, Stammzellfaktor)

SDS Sodiumdodecylsulfat

SLO Streptolysin O

SNAP-25 Synaptosome Associated Protein with molecular weight of 25 kd

SNARE Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor

TNF-α Tumornekrosefaktor-α (tumor nekrosis factor-α)

VAMP Vesicle-associated membrane protein

α-, β-, γ-SNAP α-, β-, γ-Soluble NSF Attachment Protein

Einleitung

8

1. Einleitung

1.1 Allergie

Der Begriff Allergie bezeichnet eine erworbene Hypersensibilität des Körpers.

Coombs und Gell unterteilten die Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems

in vier Typen, wobei die Immunglobulin E–vermittelte Sofortreaktion als Typ I

bezeichnet wurde. Durch Kontakt mit im Grunde harmlosen Antigenen, z.B.

Blütenpollen oder Hausstaub, kommt es zu einer überschießenden Immunantwort.

Effektorzellen dieser Reaktion sind zuvor durch Immunglobulin E sensibilisierte

Mastzellen, die verschiedene Mediatoren, unter anderem Histamin, freisetzen,

wodurch es zu Gewebeentzündungen und Organdysfunktionen kommt [1-3]. Die

Prävalenz der durch IgE und Mastzellmediatoren verursachten Erkrankungen, wie

Heuschnupfen und allergisches Asthma, liegt bei 20% [4;5].

1.2 Mastzellen

1.2.1 Morphologie, Entwicklung und Heterogenität

Ihren Namen verdankt die Mastzelle Paul Ehrlich. Er beschrieb 1877 erstmals die

Mastzelle, die wegen ihrer großen, reichhaltigen Granula wie „gemästet“ aussah [6].

Lichtmikroskopisch betrachtet besitzt die Mastzelle eine rundliche, spindelige,

zuweilen dendritisch verzweigte Form [7]. Aufgrund ihres runden Zellkerns kann man

die Mastzelle von den morphologisch und funktionell sehr ähnlichen basophilen

Granulozyten unterscheiden, die einen segmentierten Kern aufweisen.

Charakteristisch für beide Zellarten ist das Phänomen der Metachromasie.

Verwendet man einen basischen Farbstoff, so nehmen die das Zytoplasma dicht

ausfüllenden Granula eine Farbe an, die sich von der Kernfärbung unterscheidet.

Aus dem Knochenmark stammende myeloische Mastzell-Vorläuferzellen gelangen

über die Blutbahn durch Interaktion mit verschiedenen Adhäsionmolekülen

(z.B. VLA-4, VCAM-1) in die Zielorgane [8;9]. Dort differenzieren sie mit Hilfe des auf

Einleitung

9

der Oberfläche exprimierten Stammzellfaktor-(SCF-)Rezeptors c-kit . Im Gegensatz

zu anderen Zellen bleibt c-kit auf Mastzellen auch nach der Differenzierung

lebenslang erhalten [10]. Neben der Reifung ist der Stammzellfaktor (SCF) auch bei

anderen, die Mastzellfunktion modulierenden Effekten beteiligt. Aktivierung zur

Mediator-Freisetzung, Induktion von Chemotaxis und Regulation der Adhäsion an

extrazelluläre Matrixproteine werden durch SCF reguliert [8;11]. In hohen

Konzentrationen induziert SCF die Mastzell-Proliferation und wirkt in niedrigen

Konzentrationen überlebensfördernd. So lassen sich reife, aus Lunge und Darm

isolierte, humane Mastzellen nur in Anwesenheit von SCF kultivieren [12-16].

Nach Ausreifung finden sich Mastzellen bevorzugt in Geweben mit

Barrierefunktion gegen die Außenwelt, wie Lunge, Haut oder Gastrointestinaltrakt.

Aber auch in vielen anderen Organen, z.B. Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse und

Gebärmutter [7;10;17], sind Mastzellen eng assoziiert mit Blutgefässen, Nerven und

Epithelien [7;18-20].

Viele Erkenntnisse über Mastzellen beruhen auf Untersuchungen im murinen

System. Bei vergleichenden Untersuchungen zeigten sich jedoch erhebliche

Unterschiede zwischen Mastzellen aus Menschen und Mäusen oder Ratten. Daher

lassen sich an Nagern gewonnene Erkenntnisse nicht ohne Weiteres auf das

menschliche System übertragen. So konnte der Stammzellfaktor (SCF) als

essentieller Wachstumsfaktor für Mastzellen aller Spezies nachgewiesen werden,

während das Zytokin Interleukin-3 zwar im Nagermodell, nicht aber im humanen

System, eine wichtige Rolle beim Wachstum zu spielen scheint [21;22]. Jedoch

konnten nicht nur Unterschiede zwischen dem murinen und humanen System

aufgezeigt werden. Auch Mastzellen aus Menschen bilden keine homologen

Gruppen, sondern differenzieren abhängig vom Mikromilieu der jeweiligen Gewebe.

Vergleichbar mit dem Nagersystem, haben humane Mastzellen unterschiedliche

Ansprüche an die Anwesenheit von Wachstumsfaktoren, wie Zytokine. Humane

Mastzellen weisen Unterschiede in Fixierungseigenschaft, granulärer Ultrastruktur

und Stimulierbarkeit durch Agonisten (Substanz P, Compound 48/80) auf

[7;17;18;23]. Nach ihrem Gehalt an neutralen Proteasen lassen sich zwei Subtypen

abgrenzen. MCTC kommen in Haut, Tonsillen, Tela Submukosa des Darms vor und

enthalten die Proteasen Tryptase und Chymase. MCT enthalten nur Tryptase und

finden sich eher in der Schleimhaut von Lunge und Gastrointestinaltrakt [17;23]. Das

Einleitung

10

organspezifische Gewebemilieu scheint, unabhängig von den Subtypen, die

Mastzell-Funktion zu beeinflussen. Mastzellen der Haut - es kommen fast nur MCTC

vor - sind durch Substanz P und Compound 48/80 aktivierbar. Obwohl die Mastzell-

Population des Darms sowohl MCTC als auch MCT enthält, ist die Stimulation durch

Agonisten nicht möglich. Bei Subtypenspezifität müsste zumindest ein Teil der

Mastzellen reagieren. Aus verschiedenen Geweben isolierte Mastzellen

unterscheiden sich auch in ihrer Fähigkeit, nach IgE-abhängiger Aktivierung

Lipidmediatoren wie cysteinyl-Leukotrien (cys-LT) oder Prostaglandin D2 (PGD2) zu

synthetisieren [24;25]. Diese Heterogenität unterschiedlicher Mastzell-Populationen

lässt auf eine gewisse Plastizität an Reaktionsmustern schließen.

1.2.3 Funktion

Aufgrund ihrer weiten Verbreitung in Geweben und ihrer Fähigkeit, eine große Anzahl

verschiedener Mediatoren freizusetzen, sind Mastzellen an unterschiedlichen

physiologischen und pathophysiologischen Ereignissen beteiligt. So spielen sie eine

Rolle bei der Regulation neurophysiologischer Prozesse, wie Sekretion und Motilität,

und fördern Wundheilung und Angiogenese. Außerdem unterstützen sie die Abwehr

gegen infektiöse Mikroorganismen (Bakterien, Parasiten) [7;26-27]. Weiterhin sind

Mastzellen als gewebeständige Immunzellen in der Lage, mittels Histocompatibility II

(MHC II) Molekülen spezifischen Lymphozyten (T-Zellen) Antigene zu präsentieren

[28-30] und die Produktion von IgE-Antikörpern in B-Zellen bzw. Plasmazellen zu

fördern [31]. Wenn es zu einer pathophysiologischen Fehlregulation kommt, sind

Mastzellen auch an fibrotischen Prozessen in Geweben, chronischen Entzündungen

und Tumorentwicklung beteiligt [27;32-34]. Die IgE-abhängige Aktivierung von

Mastzellen ist ein zentrales Ereignis der Überempfindlichkeitsreaktion vom Soforttyp

(Allergie Typ I nach Coombs und Gell). Dazu gehören atopische Erkrankungen, wie

allergische Rhinitis, allergisches Asthma, atopisches Ekzeme, allergische

Gastroenteritis und anaphylaktische Erkrankungen, z.B. Urtikaria, Angioödem,

generalisierte Anaphylaxie.

Einleitung

11

1.2.4 Mediatoren

Generell unterscheidet man zwei Gruppen von Mediatoren. Histamin, Proteasen und

Tumornekrosefaktor-α (TNFα) können nach Stimulation schnell freigesetzt werden,

da sie in den Granula gespeichert vorliegen. Im Gegensatz dazu können Lipid-

Glykoprotein-Mediatoren (cys-LT, PGD2) und diverse Zytokine erst nach

Neusynthese abgegeben werden [18;26;35;36].

Einen wesentlichen Anteil an den Allergie-Symptomen wie Juckreiz, Ödeme und

Rötung hat der Mastzell-Mediator Histamin, der Schleimsekretion, Kontraktion glatter

Muskulatur, Gefäßerweiterung und –permeabilisierung vermittelt. Gleichzeitig

scheinen Histamin und Lipidmediatoren eine Rolle bei der Regulation

neurophysiologischer Prozesse, wie Sekretion und Motilität, zu spielen [18;37].

Histamin entsteht im Golgi Apparat nach Decarboxylierung der Aminosäure Histidin

und wird, gebunden an Proteoglykane und Proteine, gespeichert. Eine humane

Mastzelle enthält ungefähr 1 bis 8 pg Histamin.

Die biologischen Effekte diverser Mastzell-Mediatoren sind zusammengefasst in

Tabelle 1 dargestellt.

Einleitung

12

Mediatoren biologische Wirkungen

Biogene Amine:

Histamin Schleim- und Elektrolytsekretion

Muskelkontraktion, Peristaltik

Vasodilatation und Plasma Leakage

Regulation intestinaler Neurone

Granulozyten-Chemokinese

Proteasen:

Tryptase Abbau von Fibrinogen, Kininogen, Neuropeptiden, VIP

Endothelzellregulation

Chymase Abbau von Basalmembransubstanz und Substanz P

Schleimsekretion

Katalysierung des Umsatzes von AT I und AT II

Carboxypeptidase Abbau von AT I

Proteoglykane:

Heparin Bindung und Stabilisierung von Histamin, Proteasen und

Zytokinen

Antikoagulation

Inhibition von Komplement- und Kallikrein

Endothelzellregulation

Chondroitinsulfat wie Heparin, jedoch weniger potent

Lipidmediatoren:

Leukotriene

(LTC4, D4, E4) Schleim- und Elektrolytsekretion

Muskelkontraktion, Peristaltik

Vasodilatation und Plasma Leakage

Prostaglandin D2 wie Leukotriene

Zytokine:

TNF-α, IL-1, IL-6, IL-16, IL-18 proinflammatorische Effekte

IL-3, IL-4, IL-5, IL-13 Th2-dominierte Immunantworten

IL-10, TGF-β1 regulatorische Effekte auf Immunzellen

Wundheilung, Gewebeumbau

MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IL-8 Chemokine

β-FGF, VEGF Wachstumsfaktoren für Fibroblasten und Endothelzellen

Tab. 1: Mediatoren Nach Bischoff [18]

Einleitung

13

1.2.5 Aktivierung

Zwei Fcε-Rezeptoren für IgE sind bekannt, die von verschiedenen Zelltypen

präsentiert werden. Während der niedrigaffine Rezeptor Fcε-RII von zahlreichen

Entzündungszellen, wie Makrophagen, eosinophilen Granulozyten, Thrombozyten, B-

und T-Lymphozyten exprimiert wird, findet sich der hochaffine FcεRI vor allem auf

Mastzellen und basophilen Granulozyten [38;39]. FcεRI besteht aus vier

transmembranen Polypeptidketten – jeweils eine α- und β-Kette, sowie zwei γ-

Ketten. Während die α-Kette, mit ihrem aus der Zellmembran herausragenden Teil,

für die IgE-Bindung zuständig ist, vermitteln β- und γ-Kette die Signaltransduktion

über ITAMs (immunreceptor tyrosine based activation motif) [40-43].

Da der größte Anteil des monomeren IgE an die α-Kette des hochaffinen FcεRI

bindet, befindet sich freies IgE nur zu geringen Anteilen im Serum. Wenn IgE an den

Rezeptor bindet, steigt die Expression von Zytokinen und des Rezeptors FcεRI [44].

Ohne die gesamte Entzündungsreaktion mit ihren möglicherweise schädlichen

Folgen zu starten, soll das Immunsystem bei schwächeren Angriffen in Bereitschaft

versetzt werden, gegebenenfalls schnell weitere Prozesse einzuleiten.

Zur Degranulation der Mastzelle kommt es erst, wenn benachbarte, mit ihrem Fc-

Teil an den Rezeptor gebundene IgE-Moleküle durch polyvalente Antigene

kreuzvernetzt werden. Diese Brückenbildung verändert durch eine Annäherung der

Rezeptoren die Oberfläche und setzt somit die Signaltransduktion in Gang [40;45].

Daran sind an β- und γ-Kette sitzende Tyrosinkinasen, wie Lyn und Syk, beteiligt, die

durch Phosphorylierungen eine Kaskade komplexer biochemischer Reaktionen

einleiten [46]. Über die Bildung von IP3 kommt es zur Erhöhung der intrazellulären

Calciumkonzentration mit anschließender Freisetzung gespeicherter Substanzen aus

den Vesikeln oder Neusynthese verschiedener Mediatoren.

Neben der klassischen Aktivierung durch IgE-Rezeptor Kreuzvernetzung sind

unterschiedliche Agonisten bekannt, die IgE-unabhängig die Mastzelle stimulieren

können. Zu den Aktivatoren humaner Mastzellen gehören das Zytokin SCF,

Neuropeptide (Substanz P, Vasoaktives Intestinales Peptid – VIP, Neuropeptid),

Morphin, Anaphylatoxin (C5a), basische Substanzen (Compound 48/80), bakterielle

Produkte, wie Lipopolysaccharid oder FimH, sowie Calciumionophor (bewirkt

Calciumeinstrom) und PMA (aktiviert Proteinkinase C). Das Ausmaß der

Einleitung

14

Aktivierbarkeit durch verschiedene Substanzen hängt, wie bereits in Kapitel 1.2.1

„Morphologie, Entwicklung und Heterogenität“ beschrieben, von der anatomischen

Lokalisation, dem Differenzierungsgrad und nicht zuletzt von der Spezies ab [40;45-

46].

1.2.6 Hemmung

Die Mastzelle als Effektorzelle IgE-abhängiger Überempfindlichkeitsreaktionen des

„Soforttyps“ scheint ein geeignetes therapeutisches Ziel für die Behandlung von

Allergien zu sein. Zahlreiche Substanzen wirken auf Mastzellfunktionen, z.B. um die

Freisetzung oder Synthese von Mediatoren direkt zu hemmen. Verschiedene

Medikamente, wie Lodoxamid, die Cromone Dinatriumcromoglycat und Nedocromil-

Natrium, der Bromhexin-Metabolit Ambroxol [47], das Methylxanthin Theophyllin und

diverse Immunsuppressiva (Glukokortikoide, Cyclosporin A und Tacrolismus) werden

zur Hemmung der IgE-abhängigen Mediatorfreisetzung angewendet [48-50]. H1-

Antihistaminika der zweiten Generation besitzen nicht nur wie ihre Vorgänger eine

antagonistische Wirkung auf H1-Rezeptoren, sondern hemmen in unterschiedlichem

Ausmaß die Histaminfreisetzung aus Mastzellen [51;52]. Die Wirkmechanismen der

verschiedenen Wirkstoffe sind zum großen Teil noch ungeklärt. Man nimmt an, dass

die Cromone durch Blockade von Chloridkanälen den für die Degranulation

notwendigen initialen Calciumeinstrom verhindern [53]. Ähnliche Mechanismen

nimmt man auch für Lodoxamid an, während die mastzellstabilisierende Wirkung des

Theophyllins auf einer Hemmung der Phosphodieesterase mit anschließender cAMP-

Erhöhung beruht [54].

Neuere Therapieansätze gegen allergische Erkrankungen bieten Antikörper, die

zirkulierende IgE-Moleküle abfangen und der Eliminierung zuführen oder direkt den

Fcε-RI blockieren. So bildet der gegen IgE gerichtete Antikörper Omalizumab mit IgE

einen Komplex, der nicht mehr an den Fcε-RI-Rezeptor binden und daher auch keine

Degranulation mehr einleiten kann [55].

Einleitung

15

1.3 Exozytose und SNARE-Proteine

Grundsätzlich lassen sich zwei Formen der Exozytose unterscheiden: Konstitutive

und regulierte Exozytose [56;57]. In allen eukaryoten Zellen lässt sich konstitutive

Exozytose beobachten, die kontinuierlich und ohne äußeren Stimulus abläuft. Dabei

werden verschiedene Substanzen, beispielsweise Plasmamembranbestandteile zur

Aufrechterhaltung der Zellintegrität, in den Extrazellulärraum abgegeben. Abhängig

von der Zellart werden auch extrazelluläre Matrixkomponenten (Kollagene,

Proteoglykane), aber auch IgE, über die Plasmamembran ausgeschleust.

Besonders spezialisierte Zellen, wie Neuronen, endokrine Zellen oder Mastzellen

sind in der Lage, nach einem Stimulus, größere Mengen ihres Vesikelinhalts

auszuschütten. Dabei kann es entweder zu einer absoluten Verschmelzung von

Vesikel- und Plasmamembran kommen (total fusion) oder während der Fusion bildet

sich, unter Beibehaltung der Vesikelintegrität, nur eine Öffnung zwischen beiden

Strukturen (transient fusion; „kiss and run“). Dadurch sind die Zellen in der Lage, die

Mediatorauschüttung der jeweiligen Situation bzw. dem Bedarf entsprechend zu

regulieren [58;59].

Zur Fusion von Granula- bzw. Vesikel- mit der Plasmamembran kommt es durch

eine Reihe komplexer Prozesse. Zunächst gelangt das Vesikel durch Diffusion oder

Transport über das Zytoskelett in die Zellperipherie und bindet an die aktive Zone

der Plasmamembran. ATP-abhängige Reifeprozesse bereiten das Vesikel vor für die

Ca2+-getriggerte Membranfusion mit anschließender Freisetzung des Vesikelinhalts.

Anschließend werden die Vesikel internalisiert und recycled [59;60]. Obwohl es,

abhängig von der individuellen physiologischen Funktion der Zelle, einige

Unterschiede im Ablauf der Exozytose gibt (Dauer, Größe der Pore oder des

Vesikels), hat der Prozess der Membranverschmelzung eine grundlegende

Gemeinsamkeit: spezifische Interaktionen zwischen evolutionär konservierten

SNARE-Proteinen (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor)

[61-64].

SNARE-Proteine können, nach Ausbildung eines multimolekularen Komplexes,

die Fusion zweier gegenüberliegender Membranen katalysieren. Durch die

Komplexbildung ändern die SNARE-Isoformen ihre Struktur, d.h. die Proteinfaltung,

und ihre Anordnung zueinander. Dabei wird genug Energie freigesetzt, um die

Einleitung

16

normalerweise abstoßenden Kräfte zweier Membranen zu überwinden [65;66]. Der

sogenannte „core“-Komplex ist extrem stabil und resistent gegenüber Denaturierung

durch Temperaturen bis 950C und Einwirkung von Detergenzen [67].

Entlang des exozytotischen aber auch endozytotischen Pfades kommen SNARE-

Proteine in bestimmten Kompartimenten vor. Sie regeln nicht nur die Fusion, sondern

auch in welche Richtung die Membranverschmelzung erfolgt [68]. Eine mögliche

Einteilung erfolgt danach, ob ein Arginin- (R-SNARE) oder Glutamin-Rest (Q-

SNARE) zu der zentralen Region des Komplexes beigesteuert wird [69]. Die

alternative Klassifikation richtet sich nach der Lage der SNARE-Proteine. Zu den

Vesikel-assoziierten v-SNAREs (vesicle) gehören die homologen Proteine des

Synaptobrevin, das auch als VAMP (vesicle-associated membrane protein)

bezeichnet wird [70;71]. Die t-SNAREs (target) sind an die Plasmamembran

gebunden. Diese Gruppe umfasst die Syntaxine und SNAP-Proteine (synaptosome

associated protein with molecular weight of 25, 23 or 29 kd) [72-77].

Neben den SNARE-Isoformen haben auch andere zytosolische Proteine eine

wichtige Bedeutung für die Exozytose. Während des Reifeschrittes der Exozytose

wird der SNARE-Komplex, bestehend aus je einem Molekül Synaptobrevin, Syntaxin

und SNAP, gebildet [78-80]. Bei Neuronen handelt es sich dabei um VAMP-2,

Syntaxin-1A und SNAP-25 [79]. An diesen Kern- oder 7S-Komplex bindet SNAP

(soluble NSF attachment protein), wodurch sich die ATPase NSF (N-ethylmaleimide-

sensitive factor) anlagern kann und der 20S-Komplex entsteht [81-83]. Durch

Hydrolyse von ATP durch NSF werden Proteininteraktionen gestört, so dass der

SNARE-Komplex dissoziiert und beide Membranen verschmelzen [84-86]. Auch am

Recycling der SNARE-Proteine in ihrer jeweiligen Kompartimente sind NSF und

SNAP, man unterscheidet α-, β- und γ-SNAP, beteiligt [87]. Eine Voraussetzung für

die Bindung von NSF und SNAP an den 7S-Komplex ist die calciumabhängige

Synaptotagmin-Ablösung. Nach extrazellulärer Stimulation mit anschließendem

intrazellulären Calciumanstieg bindet Synaptotagmin Calcium und löst sich vom

SNARE-Komplex [88-90]. Auch andere akzessorische Proteine, wie Sec1/Munc18-

Proteine, Rab-Proteine (ras-like GTPasen) und Synaptophysin scheinen die SNARE-

Komplex-Bildung zu regulieren. Ein Schema der an der Komplex-Bildung beteiligten

SNARE-Proteine und ihrer Kofaktoren ist in Abbildung 1 dargestellt.

Einleitung

17

Zuerst beschrieben wurden SNARE-Proteine an Hefezellen und Neuronen und

sind hier besonders gut untersucht. Aber auch in anderen, sekretorisch aktiven

Zellen konnten SNARE-Isoformen nachgewiesen werden [91-93]. Obwohl SNARE-

Proteine grundlegende Prozesse der Membranfusion vermitteln, ist nicht hinreichend

geklärt, wie die einzelnen Isoformen in den verschiedenen Zellarten verteilt sind.

Deutliche Unterschiede konnten zwischen neuronalen und nicht-neuronalen

Geweben festgestellt werden. Bestimmte Isoformen, wie SNAP-25 oder Syntaxin-1

sind Neuronen-spezifisch, während SNAP-23 ubiquitär vorkommt.

Die Expression von SNARE-Isoformen in Mastzellen wurde überwiegend an der

Rattenmastzelllinie RBL-2H3 (rat basophilic leukemia cells) untersucht. Es zeigte

sich, dass VAMP-8, Syntaxin-4 und SNAP-23, ein SNAP-25 Homologon, in die

Exozytose involviert sind [94-96]. Nach Stimulation wird SNAP-23 von der

Plasmamembran in das Zellinnere verlagert. Wird der Lagewechsel verhindert,

kommt es zu einer Hemmung der Exozytose [94]. Die v-SNARE Isoformen VAMP-2,

VAMP-3, VAMP-8 (endobrevin) und VAMP-7 (tetanus insensitive VAMP) konnten in

der Vesikelmembran nachgewiesen werden [97;98], wobei die Neurotoxin-

insensitiven Synaptobrevine VAMP-7 und VAMP-8 in endozytotischen

Kompartimenten nicht-neuronaler Zellen beschrieben sind [97;99-102]. Außerdem

wird eine Beteiligung von VAMP-7 bei der Exozytose sekretorischer Lysosome aus

hämatopoetischen Zellen diskutiert [97;103-106]. Des Weiteren konnte die FcεRI-

abhängige Exozytose durch Überexpression von Syntaxin-4, nicht aber von Syntaxin-

2 oder-3, gehemmt werden. Als weitere Regulatoren der FcεRI abhängigen

Exozytose wurden in RBL-2H3-Zellen und RPMCs (rat peritoneal mast cells) die

Synaptotagmin-Homologe Synaptotagmin I und II gefunden. Während die

Transfektion von RBL-2H3-Zellen mit Synaptotagmin I die Ca2+-getriggerte Exozytose

begünstigt, scheint Synaptotagmin II die lysosomale Sekretion der Zellen zu

vermindern [107;108].

Von humanen Mastzellen sind bisher keine Informationen über Expression und

Funktion der SNARE-Proteine oder ihrer regulatorischen Ko-Faktoren vorhanden.

Einen Ansatz zur Analyse und Beeinflussung SNARE-vermittelter Exozytose-

Prozesse bieten SNARE-spezifische Proteasen, wie das Botulinum Neurotoxin.

Einleitung

18

Abb. 1: Schematische Darstellung des Exozytose vermittelnden SNARE-

Komplexes. Die SNARE-Proteine VAMP, Syntaxin und SNAP bilden den Komplex.

An der Membranfusion sind weiterhin akzessorische Proteine beteiligt, wie

Synaptophysin, Rab3a, Munc-18 oder das Calcium-abhängige Synaptotagmin. Die

Exozytose kann durch verschiedene Isotypen von Botulinum-Neurotoxin gestört

werden, die in der Lage sind, SNARE-Proteine zu spalten. Abbildung modifiziert nach

Shukla et al [139].

1.4 Botulinum Neurotoxin

Botulinum Neurotoxin, ein Toxin des anaeroben Bakteriums Clostridium Botulinum,

ist in der Lage, die Exozytose in Neuronen zu hemmen. Durch Spaltung von SNARE-

Proteinen wird sowohl die Zusammenlagerung zu „core“-Komplexen, als auch die

spätere Fusion von Vesikeln mit der Plasmamembran verhindert. Insgesamt werden

sieben Isoformen (BoNT-A – BoNT-G) des Botulinum Neurotoxins unterschieden,

Vesikel

Synaptotagmin

Plamamembran

Munc-18

Synaptophysin

Rab3a

Botulinum

NeurotoxinCa2+

Ca2+

VA

MP

SN

AP

-25

Syn

taxi

n

Einleitung

19

das unter den bekannten biologischen Giften eines der potentesten ist. Eine

intravenöse Dosis von 1-5 ng/kg Körpergewicht kann bereits tödlich sein [109;110]. In

der Regel stammen Vergiftungen mit Botulinum Neurotoxin, auch als Botulismus

bezeichnet, vom Verzehr verdorbener Lebensmittel. Über den Gastrointestinaltrakt

gelangt das Toxin in die Blutbahn und von dort an die motorischen Endplatten

quergestreifter Muskulatur, wo sie durch Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung

(Acetylcholin) eine schlaffe Lähmung bewirken. Da Botulinum Neurotoxin die Blut-

Hirn-Schranke nicht passiert, sind die Auswirkungen nur peripher sichtbar.

Das Neurotoxin wird als einkettiges Protein synthetisiert und durch bakterielle

Proteasen in eine schwere (HC: heavy chain; 100 kDa) und eine leichte

Polypeptidkette (LC: light chain; 50 kDa) gespalten, die durch eine Disulfidbücke

miteinander verbunden sind [111]. Nach einer spezifischen Bindung der HC an

Ganglioside, die in der Plasmamembran von neuronalen Zellen angereichert sind,

kommt es zu einer Rezeptor-vermittelten Endozytose [112-116]. Durch die

Translokationsdomäne der HC gelangt das Toxin unter Porenbildung aus dem

sauren Milieu des Endosomens ins Zytosol. Anschließend kommt es zu einer

enzymatischen Abtrennung der leichten von der schweren Kette. Erst nach der

Trennung von der HC, die Bindung und Translokation vermittelt, kann die LC ihre

proteolytische Aktivität entfalten. Extrazellulär sind beide Ketten für sich allein nicht

toxisch [116].

Zwar hemmen alle sieben Subtypen des Toxins die Acetylcholinfreisetzung in

Neuronen, haben aber unterschiedliche Zielproteine und Wirkstärken [117]. So

konnte für BoNT-A, -G und -E eine Spaltung von SNAP-25 nachgewiesen werden.

BoNT-B, -D und -F sind spezifische Proteasen für Synaptobrevin/VAMP, während

Bont-C1 die SNARE-Proteine Syntaxin und SNAP-25 spaltet [118-122].

Durch Hemmung der Exozytose von Acetylcholin aus Nervenendigungen kommt

es zu einer Lähmung der quergestreiften Muskulatur, aber auch von

parasympathischen Funktionen. Daher ist Botulinum Neurotoxin, vor allem BoNT-A

und -B, nicht nur ein tödliches Toxin, sondern wird seit den achtziger Jahren

vermehrt für therapeutische Zwecke eingesetzt. Botulinum Neurotoxin wird bei der

Behandlung von vorwiegend neurologischen Erkrankungen, wie dystone

Bewegungsstörungen und Spastizität, aber auch bei autonomen Störungen

(Blasenfunktionsstörung, Achalasie) verwendet [123;124]. In zahlreichen

Einleitung

20

Fachgebieten wird das Neurotoxin bereits genutzt. Dazu gehören Augenheilkunde,

Gastroenterologie, Orthopädie, Urologie und Dermatologie. Bekannt geworden ist

Botulinum Neurotoxin vor allem als BOTOX (BoNT-A) im kosmetischen Bereich, wo

es als Substanz zur Faltenreduktion durch Lähmung der Muskelaktivität im Gesicht

verwendet wird.

Dennoch wird das Potenzial der Neurotoxine noch nicht vollständig genutzt.

Zahlreiche weitere Anwendungsgebiete werden untersucht. So könnte Botulinum

Neurotoxin nicht nur die Acetylcholinfreisetzung aus Synapsen hemmen, sondern

auch die SNARE-vermittelte, IgE-abhängige Mediator-Freisetzung aus Mastzellen

einschränken.

1.5 Adenoviren

Eines der effektivsten Behelfsmittel, Fremd-DNA in Säugetierzellen einzuschleusen,

besteht in der Verwendung adenoviraler Vektoren. Adenoviren sind hüllenlose DNA-

Viren, deren Capsid aus verschiedenen Proteinen besteht. Zu Beginn einer Infektion

binden bestimmte adenovirale Oberflächenstrukturen, die sogenannten fiber knobs,

an den Zelloberflächenrezeptor CAR (Coxsackievirus und Adenovirus Rezeptor)

[125]. Die physiologische Funktion des CAR besteht in der Vermittlung von Zell-Zell

Kontakten [126], woraufhin es zu Wechselwirkungen zwischen Integrinen der

Zielzelle und Oberflächenproteinen des Adenovirus kommt. Das Ausmaß der

adenoviralen Transduzierbarkeit einer Zelle hängt von ihrem Rezeptorstatus ab.

Anschließend wird der Adenovirus durch rezeptorvermittelte Endozytose

aufgenommen und gelangt an den Kern, wo die Transkription und Replikation der

viralen DNA beginnt. Innerhalb von 18 h nach Infektion ist die Transgenexpression

detektierbar und erreicht ihr Maximum nach 48-72 Stunden [127]. Der Abschluß des

viralen Zyklus löst eine Zelllyse und damit die Freisetzung der vermehrten Viren aus.

Die Zellyse wird durch das "adenovirus death protein" E3 ausgelöst [128].

Adenoviren (Fam. Adenoviridae) des humanen Serotyps 5 sind einer der am

häufigsten verwendeten Vektortypen für den Gentransfer in Säugerzellen. Sie

können ein breites Spektrum an Zelltypen und Geweben, sowohl ruhende als auch

proliferierende Zellen, infizieren [129]. Außerdem lässt sich das adenovirale Genom

Einleitung

21

(ca 36 kb) einfach modifizieren. In adenovirale Vektoren können bis zu 8 kb große

DNA-Abschnitte kloniert und anschließend in hohen Mengen produziert werden

[130;131]. Im Infektionszyklus erfolgt die Expression der Gene zeitlich versetzt, so

dass zwischen „frühen“ und „späten“ Genen unterschieden wird. Während Gene der

späten Phase hauptsächlich für virale Strukturproteine kodieren, sind Gene der

frühen Phase (E1, E2, E3 und E4) für die Genexpression und Virusreplikation

essentiell. Fremde DNA kann durch Deletion verschiedener Regionen früher Gene in

das Virusgenom eingebracht werden [132]. Adenovirale Vektoren mit E1- und E3-

Deletion (pAdEasy-1) werden häufig verwendet. Die Deletion von E1 bewirkt, dass

sich die Zellen nicht mehr replizieren und auch keine infektiösen Viruspartikel in den

Zielzellen produzieren können. Das E3-Gen ist zur Umgehung einer Immunantwort

nötig. Somit können für den Laborgebrauch sichere, replifikationsdefiziente

adenovirale Vektoren hergestellt werden. Die Präparation der rekombinanten

Adenoviren erfolgt in entsprechend stabil transfizierten Zellen, die fehlende Faktoren

für die virale Replikation transkomplementieren [133].

1.6 Fragestellung

Mastzellen sind in der Lage, nach extrazellulärer Stimulation größere Mengen

unterschiedlicher Mediatoren mittels Exozytose freizusetzen, darunter Histamin,

welches mit verantwortlich ist für die pathophysiologische Rolle der Mastzelle als

Effektorzelle IgE-abhängiger Überempfindlichkeitsreaktionen vom Soforttyp (Typ I

Allergie nach Coombs und Gell).

SNARE-Proteine vermitteln die regulierte Exozytose von Neuronen und anderen

sekretorisch aktiven Zellen. Bisher sind Daten über die Expression von SNARE-

Proteinen in Mastzellen überwiegend anhand der Rattenmastzelllinie RBL-2H3

gewonnen worden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es aufzuzeigen, welche SNARE-

Isoformen in humanen Mastzellen vorkommen und welche Bedeutung sie für die IgE-

vermittelte Mastzell-Exozytose haben. Außerdem soll mit Hilfe adenoviraler

Transduktion geklärt werden, ob Botulinum-Neurotoxin in humanen Mastzellen die

Exozytose hemmen kann, was möglicherweise ein neuer Ansatz für die Therapie

allergischer Symptome sein könnte.

Materialien und Methoden

22

2. Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien und Reagenzien

Acrylamid/Bisacrylmid (30%/80%) (Rotiphorese® Gel 30) Roth

Agarose Gibco

Albumin Roche

Ammoniumperoxidsulfat (10%) Roth

Amphotericin B Gibco

Ampicillin Sigma

Ampuwa (steriles, pyrogenfeies Wasser) Boehringer

Bactotrypton Gibco

Bio Rad Protein Assays Bio Rad Laboratories

Bovines Serumalbumin (BSA, Fraktion 4, fettsäurefrei) Boehringer

Cäsiumchlorid Sigma

DiffQuick Dade Behring Marburg GmbH

DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) mit Glutamax Gibco

dNTPs Invitrogen

EDTA Merck

Essigsäure J.T.Baker

Ethanol J.T.Baker

Ethidiumbromid Sigma

Fetal Calf Serum (FCS) Gibco

Gelatine Merck

Gentamycin Gibco

Glucose Sigma

Hanks Basic Salt Solution (HBSS) Gibco

Hefeextrakt Gibco

HEPES Sigma

Isopropanol J.T.Baker

Kanamycin Merck

Lipofectamin Invitrogen

Low Range Maker BioRad


23

Magermilchpulver Merck

Magnesiumchlorid Merck

Methanol J.T.Baker

Metronidazol Fresenius

Natriumacetat Fluka

Natriumdodecysulfat (SDS) Sigma

OptiMEM Gibco

PBS 10 x Gibco

Penicillin/Streptomycin Biochrom

Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco

Protease Inhibitor Cocktail CompleteTM Mini Roche

2.1.2 Antikörper

Isotype mouse IgG Serotec, Oxford, UK

Isotype rabbit IgG Serotec, Oxford, UK

anti-SNAP-25 (SMI 81), monoclonal mouse antibody Sternberger Monoclonals Incorporated

anti-SNAP-23, polyclonal rabbit antibody Synaptic Systems, Germany

anti-VAMP-2 , polyclonal rabbit antibody Synaptic Systems, Germany

anti-VAMP-2 (Synaptobrevin), monoclonal mouse antibody Synaptic Systems, Germany

anti-VAMP-3 (Cellubrevin), polyclonal rabbit antibody Affinity BioReagents

ani-VAMP-7 (TI-VAMP), monoclonal mouse antibody T. Galli, Institut Jacques Monod, Paris

anti-VAMP-8 (Endobrevin), polyclonal rabbit antibody abcam, Cambridge, Uk

anti-Syntaxin-1A, polyclonal rabbit antibody Synaptic Systems, Germany

anti-Syntaxin-1B, polyclonal rabbit antibody Synaptic Systems, Germany

anti-Syntaxin-2, polyclonal rabbit antibody StressgGen Biotechnologies Corp

anti-Syntaxin-3, polyclonal rabbit antibody abcam, Cambridge, Uk

anti-Syntaxin-4, monoclonal mouse antibody BD Biosciences Pharmingen

Alexa Fluor® goat anti-mouse 488 Caltag Laboratories

Alexa Fluor® donkey anti-rabbit 594 Caltag Laboratories

ECL anti-mouse IgG Amersham Biosciences

ECL anti-rabbit IgG Amersham Biosciences

IgE-Fc-BoNT/B-LcHN Biotecon, Potsdam

anti-SCF-Rezeptor c-kit (anti-CD 117, mAk YB5.B8) Pharmingen, Hamburg

anti-IgE-Rezeptor α-chain (mA 22E7) Hoffmann-La Roche, Nutely, USA


24

2.1.3 Kommerzielle Kits

Rneasy Mini Kit Qiagen

Qiagen Plasmid Maxi Kit Qiagen

Qiagen Endofree Maxi Kit Qiagen

Qiaquick PCR Purification Kit Qiagen

Histamin-Radioimmunoassay (RIA) Coulter-Immunotech, Hamburg

2.1.4 Enzyme

Acetylcystein (ACC) Sigma

Chymopapain Sigma

Collagenase D Roche

DNAse I Roche

Lysozym Sigma

Platinum Taq Polymerase Invitrogen

Pronase Roche

Restriktionsendonukleasen Pme I, Pac I, NEB

RNAse freie DNAse Promega

Superscript TM Reverse Transkriptase Invitrogen

Trypsin Gibco

2.1.5 Puffer, Lösungen und Medien

Nährmedien

Für die Mastzellkultur wurde RPMI 1640 (mit 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin) ohne

Phenolrot verwendet, das versetzt war mit 10 % (v/v) FCS, 0,5 µg/ml Amphotericin,

100 µg/ml Gentamycin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin.

Die adhärente Zelllinie HEK-293 wurde in DMEM-Medium, versetzt mit 10% FCS,

100U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, kultiviert. Für die Infektionsversuche

mit Adenoviren wurde der FCS-Anteil auf 2% reduziert. OptiMEM wurde für die

Transfektionen benutzt.


25

Für die Bakterienkultur wurden 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl

in 1 l destilliertem Wasser gelöst und autoklaviert (LB-Medium). Zur

plasmidspezifischen Selektion wurde unmittelbar vor Inkulturnahme das

entsprechende Antibiotikum hinzugefügt. Zum Gießen von Agarplatten wurden

15 g Agar in 1l LB-Medium gegeben und autoklaviert. Erst nach Abkühlung auf unter

500 C wurde das Antibiotikum hinzugefügt.

Nach der Elektroporation wurden die kompetenten Bakterien in SOC-Medium

aufgenommmen. Für das SOC-Medium wurden 20 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt,

10 mM NaCl und 2,5 mM KCl mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt. Nach dem

Autoklavieren wurden 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glucose steril

zugegeben.

Puffer für die Mastzellaufarbeitung

Sämtliche Lösungen und Puffer wurden mit sterilem, pyrogenfreiem Wasser („Aqua

Spüllösung“, Delta Select GmbH, Dreieich) angesetzt, sterilfiltriert und bei 4°C

aufbewahrt.

ACC-Lösung (20 µg ACC in 50 ml Tyrode (1x) -EDTA-Puffer); CE-Lösung:

1,5 mg/ml Collagenase D in TGMD-Puffer); HA-Puffer (2,5 mg/ml BSA in HEPES-

Puffer); HEPES-Puffer (20 mM HEPES; 5 mM NaCl; 0,5 mM D-Glucose; 5 mM KCl);

10 x PBS-Puffer (Gibco Life Technologies, GB); PCh-Lösung (3 mg/ml Pronase,

0,75 mg/ml Chymopapain in TE-Puffer); TE-Puffer (500 mM EDTA in Tyrode-Puffer);

TEA-Puffer (0,2 % (v/v) Ampicillin; 0,4 % (v/v) Gentamycin; 4 % (v/v) Metronidazol,

in TE-Puffer); TGMD-Puffer (1,23 mM MgCl2; 0,015 mg/ml DNAse; 5 % (v/v) 2 %-ige

Gelatine, in 10 x Tyrode-Puffer); Tyrode-Puffer (37 mM NaCl, 2,7 mM KCl,

0,36 mM Na2HPO4, 5,55 mM D-Glucose)

Puffer für Westernblot

Acrylamidlösung (30 %ige Acrylamidlösung mit 0,8 % Bisacrylmid); Extraktionspuffer

(25 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5 mM EDTA; 0,5 mM EGTA; 0,05 % Triton x-100; 100 mM

β-Mercaptoethanol; 1 µg/ml Leupeptin; 1 µg/ml Aprotinin; für den Gebrauch: 0,5 ml

100 mM PMSF in 100 % Ethanol auf 100 ml Extraktions-Puffer geben);

10 x Laufpuffer (30 g Tris; 144 g Glycin; 100 ml SDS 10 %ig mit H2O auf 1 l


26

auffüllen); PBS-Tween (PBS; 0,25 % (v/v) Tween); 2 x Probenpuffer für Westernblot/

Laemmli-Puffer (0,2 mg/ml Glycerin; 20 ml 10 %iges SDS; 25 ml SGP; 20 ml DTT

[1 mol]; 0,5 mg Bromphenolblau, mit H2O auf 100 ml auffüllen pH 8,8); Sammelgel

(0,75 ml Sammelgelpuffer; 0,45 ml Acrylamidlösung; 1,8 ml H2O; 30 µl 10%-iges

Ammoniumperoxidsulfat; 3 µl TEMED); 4 x Sammelgelpuffer (18,18 g Tris; 12 ml

SDS 10%ig; mit H2O auf 100 ml auffüllen, pH 8,8); 10 x SDS-Page-Puffer (151,4 g

Tris; 720 g Glycin; 50 g SDS; pH 8,8); Trenngel (2,5 ml Trenngelpuffer; 4 ml

Acrylamidlösung; 3,4 ml H2O; 100 µl 10 %iges Ammoniumperoxidsulfat (0,1 g in 1 ml

H2O); 10 µl TEMED); 4 x Trenngelpuffer (18,18 g Tris, 4 ml SDS 10 %ig; mit H2O auf

100 ml auffüllen, pH 8,8); Westernblot-Puffer (2,9 g Glycin; 5,8 g Tris; 0,37 g SDS;

200 ml Methanol, mit H2O auf 100 ml auffüllen; pH 8,3)

Puffer für die Herstellung rekombinanter Adenoviren

Lyse-Puffer (10 mM Tris pH 8,0; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl2); CsCl-Gradient,

Dichte 1,2 g/ml (26,5 g CsCl2; 1 M Tris-HCl ph 7,5, mit H2O auf 100 ml auffüllen);

CsCl-Gradient, Dichte 1,4 g/ml (53,5 g CsCl2; 1 M Tris-HCl ph 7,5, mit H2O auf 100

ml auffüllen); 2 x Lagerungspuffer für Adenoviren (10 mM Tris-HCl ph 8,0;

100 mM NaCl; 1 mM MgCl2; 50% Glycerol; 0,1% BSA)

2.1.6 Verwendete Zelllinien

Prokaryote Zelllinien

BJ 5183 ist ein modifizierter E. coli Stamm, der für Rekombinationen geeignet ist. In

den verwendeten elektrokompetenten Zellen lag der adenovirale Backbone-Vektor

AdEasy-1 bereits vor (BJ5183-AD1 Electrocompetent Cells, Stratagene), so dass nur

noch pShuttle-CMV eingeschleust werden musste. Die Ausbeute an Plasmid-DNA ist

in diesen Zellen jedoch gering.

Der modifizierte E. coli Stamm XL10-Gold eignet sich zur stabilen Replikation von

Plasmiden in hoher Kopienzahl. Auch größere Plasmide können in die chemisch

kompetenten Zellen eingeschleust werden (XL10-Gold® Kan´ Ultracompetent Cells,

Stratagene).


27

Eukaryote Zelllinien

Die humane, embryonale Nierenzelllinie HEK 293 (human endocrine kidney cells;

ATCC CRL-1573) verfügt durch Transformation über die adenovirale E1 Region.

Daher eignen sich diese Zellen zur Vermehrung E1 deletierter rekombinanter

Adenoviren.

2.1.7 Klonierungsvektoren

pShuttle-CMV

In die Multiple Cloning Site dieses Shuttle Vektors wurden die cDNA der leichten

Ketten von BoNT-A, -B und –C1 kloniert. Da der Vektor keine zusätzliche

Expressionskassette für das Reportergen GFP (green fluorescent protein) enhält,

wurde die cDNA als N-terminaler Fusionspartner von eGFP Kloniert. Der Vektor

enthält ein Kanamycinresistenzgen zur Selektion in E. coli (pShuttle-CMV freundlich

überlassen von B. Vogelstein, John Hopkins Oncology Center, Baltimore, USA). Die

im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Plasmide pBoNT-A, -B und -C sind in Kapitel

3.2.1 ausführlich beschrieben.

pAdTrack-CMV

Der Vektor pAdTrack-CMV wurde als Kontrollplasmid eingesetzt. Er enthält eine

Expressionskassette für das Reportergen GFP (green fluorescent protein), wodurch

das Ausmaß der Genexpression direkt in den Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie

(Wellenlänge 456 nm) erkennbar ist. Der Vektor enthält ein Kanamycinresistenzgen

(freundlich überlassen von B. Vogelstein, Johns Hopkins Oncology Center,

Baltimore, USA).

pAD-Easy-1

Der Backbone-Vektor pAd-Easy-1 (33414 bp) enthält einen Großteil des

adenoviralen Genoms, mit Ausnahme der E1 und E3 Gene. Diese Deletionen

ermöglichen den Einbau von bis zu 8 kb fremder DNA und verhindern die Entstehung

replikationsfähiger Viren außerhalb bestimmter Zellen (z.B. HEK 293), die das


28

fehlende E1 Gen supplementieren. Der Backbone-Vektor befand sich bereits in den

BJ5183-AD1 Zellen (Stratagene), die für die Transformation durch Elektroporation

verwendet wurden.

2.1.8 Rekombinante Adenoviren

Für sämtliche Versuche wurden nur durch E1 Deletion replikationsdefiziente

Adenoviren des humanen Serotyps 5 verwendet. Die Vermehrung der Viren erfolgte

in der Zelllinie HEK 293, die das fehlende E1 Gen transkomplementierte.

Der Virus AdGFP wurde wegen seiner starken GFP-Signale als Kontrollvirus

eingesetzt (freundlicherweise überlassen von Dr. B. Fleischmann-Mundt).

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Adenoviren AdBoNT-A, AdBoNT-B und

AdBoNT-C generiert. Für diese Adenoviren wurden die von Biotecon konstruierte

nPlasmide pBoNT-A, pBoNT-B und pBoNT-C mit dem adenoviralen Genom in

pAdEasy-1 rekombiniert (vgl. Kapitel 3.2.1).

2.2. Molekularbiologische Methoden

2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA

Die Konzentration der DNA wurde photometrisch bestimmt. Dazu wurde die

Absorption der DNA-Lösung bei 260 nm gemessen. Eine Extinktion von 1,0

entspricht hierbei etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Für jede Probe wurde die

Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm gemessen , um eine Aussage über die

Reinheit der Nukleinsäuren treffen zu können. Der Absorptionsquotient E280/E260

beträgt für eine hinreichend reine DNA-Lösung 1,7 bis 1,9. Entsprechend tiefer liegt

der Absorptionsquotient bei größeren Proteinverunreinigungen.


29

2.2.2 Transformation

Transformation chemisch kompetenter Bakterien

Ein Aliquot der chemisch kompetenten Zellen wurde vorsichtig auf Eis aufgetaut. Von

der Bakteriensuspension wurden 50µl genommen, mit etwa 15 ng zirkulärer Plasmid-

DNA vermischt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock (90 sec bei

420C) regenerierten die Bakterien für 2 min auf Eis, wurden in 100µl SOC-Medium

aufgenommen und für eine Stunde bei 37°C und 225 rp m in den Heizblock gestellt.

Anschließend wurde der Transformationsansatz auf einer Kanamycin (10 mg/ml)

enthaltenden Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 370C inkubiert. Das

Antibiotikum diente zur Selektion der transformierten von den nicht-transformierten

Bakterienzellen.

Transformation durch Elektroporation

Besonders für größere Plasmiden, z.B. Adenovirusplasmide, ist das Verfahren der

Elektroporation geeignet, da es eine höhere Effizienz aufweist als die Transformation

in chemisch kompetente Zellen. Die elektrokompetenten Bakterien wurden auf Eis

aufgetaut, 40µl der Bakteriensuspension mit 1-2µl der DNA (5-50 ng in Wasser

gelöst) versetzt und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die

Elektroporation erfolgte bei 2,5 kV, 200 und 25 µF. Direkt im Anschluss an den

Elektroimpuls wurden 900 µl SOC-Medium hinzugefügt und der

Transformationsansatz für eine Stunde unter Schütteln inkubiert. Verschiedene

Volumina der Bakteriensuspension wurden auf Kanamycin enthaltenden Agarplatten

ausgestrichen und über Nacht bei 370C inkubiert.


30

2.2.3 Mini-Plasmidpräparation

Einzelne, transformierte Klone konnten durch Mini-Präparation und anschließendem

Restriktonsverdau relativ schnell überprüft werden.

Dazu wurden einzelne Kolonien von der Agarplatte gepickt und zur Vermehrung

der plasmidtragenden Klone in 3 ml LB-Medium mit dem ensprechenden

Antibiotikum bei 370C über Nacht unter Schütteln (225 rpm) inkubiert. Von der über

Nacht inkubierten Bakterien-Vorkultur wurden 1,5 ml in Eppendorfgefäße überführt

und 2 min bei 10.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen bis auf einen

kleinen Rest zum Resuspendieren. Nach Zugabe von 300 µl Lyse-Puffer und 10 µl

Lysozym (10 mg/ml) wurde die Suspension für 90 sec bei 950C erhitzt, 20 min

(10.000 g, 40C) zentrifugiert und das Pellet entfernt. Es folgte eine Fällung der DNA

im Überstand mit 400 µl Isopropanol für 10 min und Zentrifugation (15 min, 10.000 g,

40C). Das Pellet wurde mit 70%-igem Ethanol gewaschen, nochmals zentrifugiert und

anschließend 15 min luftgetrocknet. Nach Lösung in 50µl TE-Puffer wurde die

erhaltene DNA bei –200C gelagert.

2.2.4 Maxi-Plasmidpräparation

Größere Mengen endotoxinfreier DNA wurden mit dem Plasmid Maxi Kit bzw. dem

Endofree Maxi Kit nach einem modifizierten Protokoll des Herstellers gewonnen. Die

Effizienz der Transfektion wird durch die Verwendung endotoxinfreier DNA deutlich

erhöht.

Nach der Überprüfung einzelner, transformierter Klone durch Mini-Präparation und

anschließenden Restriktionsverdau, wurde der Rest der Bakterienkultur mit

antibiotikahaltigem LB-Medium auf 500 ml aufgefüllt und für etwa 16 h unter

Schütteln inkubiert (370C, 225 rpm). Am folgenden Morgen wurde die Kultur 30 min

mit 3.800 g bei 4°C zentrifugiert, das Bakteriensed iment in 10 ml Puffer P1

resuspendiert und nach Zugabe von 10 ml Puffer P2 unter Kippen des

Zentrifugenröhrchens 5 min lysiert. Auf eine 20 min Inkubation mit dem Puffer P3 (10

ml) folgte eine zweimalige Zentrifugation (30 min, 4°C, 20000 g), um genomische

DNA, Protein und den Zelldetritus von der gelösten Plasmid-DNA zu trennen. Zu dem


31

klaren Überstand wurden 2,5 ml ER-Puffer hinzugefügt, 30 min auf Eis inkubiert und

dann auf eine mit 10 ml Puffer QBT äquilibrierte Qiagen-tip Säule gegeben. Die

dabei gebundene DNA wurde mit 15 ml QN-Puffer gelöst, nachdem RNA, Proteine

und Endotoxine durch zweimaliges Waschen mit jeweils 30 l QC-Puffer entfernt

wurden. Die gewonnene DNA wurde mit 10,5 ml Isopropanol gefällt, durch 30 min

Zentrifugation bei 10000 g und 4°C sedimentiert und das Pellet mit 5 ml 70%-igem

Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugaton wurde das Pellet getrocknet und in

100-200 µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.5 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen

Die enzymatische Spaltung von Plasmid-DNA wurde nach den vom Hersteller der

Restriktionsenzyme (NEB) angegebenen Bedingungen durchgeführt. Zur Spaltung

von DNA aus Mini-Plasmidpräparationen wurden 10-15 µl DNA-Lösung mit 3 bis 6

Units des entsprechenden Enzyms inkubiert. Für präparative Restriktionen wurde

das Enzym im 2- bis 3-fachen Überschuss eingesetzt und der Ansatz inkubierte über

Nacht bei 370C.

2.2.6 Phenol-Chloroform-Extraktion

Zur Aufreinigung von DNA wurde eine Phenol-Chloroform-Extraktion mit

anschließender Ethanolfällung zum Konzentrieren der DNA durchgeführt. Die gelöste

Plasmid-DNA wurde mit dem gleichen Volumen Phenol (Roth) versetzt, durch

Schütteln gemischt und anschließend zur Phasentrennung 1 min bei 10000 g

zentrifugiert. Die wässrige, DNA-enthaltende obere Schicht wurde in ein neues

Eppendorfgefäß überführt, ohne dabei die denaturierten Proteine (z.B.

Restriktionsenzyme) enthaltende Interphase zwischen der wässrigen Phase und der

Phenolphase zu stören. Zur Beseitigung des restlichen Phenols wurde die wässrige

Phase mit dem gleichen Volumen Chloroform versetzt, gemischt und zur

Phasentrennung wiederum 1 min bei 10000 g zentrifugiert. Zu dem Überstand

wurden das dreifache Volumen Ethanol (97 %) und 1/10 des Volumens 3 mol/l


32

Natriumacetat gegeben. Nach gutem Durchmischen wurde die DNA über Nacht bei -

20°C gefällt und anschließend durch 10 min Zentrifu gation bei 10000 g sedimentiert.

Das Sediment wurde mit 200 µl Ethanol (70 %) gewaschen, um mitgefällte Salze zu

lösen. Es folgte eine erneute Zentrifugation von 10 min bei 10000 g. Nachdem das

entstandene Sediment getrocknet war, wurde es in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.

2.2.7 RNA-Isolation und Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

Zur Isolation von RNA aus kultivierten Mastzellen wurden 1-2 x 105 Zellen in 335µl

RLT-Puffer aufgenommen und bei –800 C gelagert bis zur Präparation der Gesamt-

RNA mit Hilfe des RNeasy Mini Kits. Durch reverse Transkription erfolgte

anschließend eine Umschreibung in cDNA. Die genomische DNA wurde durch

Inkubation mit 1 U RNAse-freier DNAse für 15 min bei 37°C verdaut und nach

Zugabe von 25 mM EDTA die RNA bei 70°C für 10 min d enaturiert. Durch

Superscript III Reverse Transcriptase und Zugabe von 20 pmol Oligo-dT-Primern

wurde die cDNA synthetisiert (60 min, 49 °C). Nebe n humanen intestinalen

Mastzellen wurden auch Proben mit in vitro entwickelten Mastzellen aus

Nabelschnurblut (CBMC) und der Mastzellinie HMC-1, sowie aus menschlichem Blut

isolierten eosinophilen Granulozyten, verglichen. HMC-1 ist eine Mastzelllinie mit

einem defekten Fcε-Rezeptor-I und einer Mutation am SCF-Rezeptor c-kit. Als

Kontrolle diente die humane Neuroblastom Zelllinie MHH-NB-11.

Für eine PCR-Reaktion wurden 1/20 bzw. 1/33 der erhaltenen cDNA-Menge

verwendet. Das 25 bzw. 50 µl große Reaktionsvolumen enthielt 1,25 bzw. 2,5 U

Platinum Taq Polymerase und 20 pmol der entsprechenden Primerpaare. Die

Amplifikation der cDNA-Fragmente fand in einem Peltier-Thermal-Cycler (PTC200,

MJ Research, USA) nach folgendem Schema statt:

1. Schritt: Aktivierung der Polymerase bei 94°C für 5 min.

2. Schritt: Denaturierung der DNA bei 94°C für 30 s ec.

3. Schritt: Annealing der Primer an die DNA bei 54-58°C für 45 sec.

4. Schritt: Synthese der neuen DNA-Stränge bei 72°C für 35 sec.


33

5. Schritt: 31-37 mal Wiederholung der Schritte 2 bis 4

6. Schritt: Elongation bei 72°C für 2 min.

Die Zyklenanzahl und die Annealing-Temperatur wurden abhängig von den

Primern und der entsprechenden Expression geringfügig variiert. Eine Auflistung der

verwendeten Primerpaare mit Sequenzen und Längen der jeweiligen Fragmente sind

in Tabelle 2 aufgeführt.

Für jede Probe wurde die RT-PCR mit GAPDH durchgeführt (30-32 Zyklen), um

zu überprüfen, ob tatsächlich RNA vorhanden war.

Gen

Sequenz (Sense, Antisense)

Fragmentlänge

GAPDH 5`-TGG TCT CCT CTG ACT TCA AC-3` 128 bp

5`-CCT GTT GCT GTA GCC AAA TT-3`

SNAP-23 5`-GTA CGA GGA GAA TCC TGG GT-3´ 194 bp

5`- CAG ACA CAA AGG CCA CAG CA-3`

SNAP-25 5`-AAG CCT GGG GCA ATA ATC AGG-3` 295 bp

5`-CTT TGT TGC ACG TTG GTT GGC-3`

Syntaxin -1A 5`- TGC CTC TGG GAT CAT CAT GG-3` 239 bp

5`- ACT TGA CGG CCT TCT TGG TG-3`

Syntaxin -1B 5´- ACA GGA GCT GGA GGA TCT CA –3´ 199 bp

5´- ACT GGG TCG CGT TAT ATT CG –3´

Syntaxin-2 5´- TGC TGT CTC GGA AGT TTG TG -3´ 120 bp

5´- CTG TGG TGG TTC TCC CAG TT -3´

Syntaxin -3 5´- GAG CCA AAA ACC AAG GAT GA -3´ 190 bp

5´- TTG GTC ATC ACC TCC ACA AA -3´

Syntaxin -4 5`-CAG AAG GAG GAA GCT GAT GA-3` 252 bp

5`-CAG GAT ATT GGA CAC AAA C-3`

Syntaxin -6 5´-TCA TCT GTG CAG GCA TTA GC-3´ 152 bp

5´-TGC TGC TCC TCA ATG AAA TG-3´

VAMP-2 5`-ACA GGA GAC TGC AGC AG-3` 176 bp

5`-TTT GCG CTT GAG CTT GGC TG-3`

VAMP-3 5`-GAA GCT CTC TGA GTT AGA CG-3` 173 bp

5`-GAG ACA ACC CAC ACG ATG AT-3`


34

VAMP-5 5`-CGT AAC AAC TTC GGC AAG GT-´3 235 bp

5´-TGT CAC TGC TCT GAG GGA GA-´3

VAMP-7 5´ -AAC GTT CCC GAG CCT TTA AT -´3 242 bp

5´- TCC TCG CTG AGC TAC CAG AT -´3

VAMP-8 5`-GTG CGG AAC CTG CAA AGT GA-3` 260 bp

5`-GAA GGC ACC AGT GGC AAA GA-3`

Synaptotagmin-1 5`-GAA GAT GGA TGT GGG TGG CT-3` 279 bp

5`- CAT GTC TGA CCA GTG TCG CA-3`

Synaptotagmin-2 5`-TCA AGG TGC CAT ACC AGG AG-3` 330 bp

5`-CCT CTT GCC ATT CTG CAT CA-3`

Synaptotagmin-4 5`-AAG TGA ACC TGT ACC ATG CC-3` 202 bp

5`-CTG CCC GAT TAC CTC ATT TC-3`

BoNT-A 5´-CAC CAC CAG AAG CAA AAC AA-3´ 360 bp

5´- CCA TAA CCA TTT CGC GTA AGA-3

BoNT-B 5´-CGT GAA CAA GCT CAT CTC CA-3´ 398 bp

5´- TAC AGC TCC TCA GCC TGG AT-3´

BoNT-C 5´-GGC ACA AGA AGG ATT TGG TG-3´ 343 bp

5´-ATC CAA TGC CTT TTC CTC AA-3´

GFP

5´-ACC ACC TCG AGT GAG GCC TCA CCG GTC GCC

ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G-3´

770 bp

5´-GAG AAT AAG CTT AAC GCG TCT TGT ACA GCT

CGT CCA TG-3´

Tabelle 2: Verwendete Primersequenzen, Fragmentlängen

2.2.8 Agarosegelelektrophorese

Die Proben wurden ihrer Größe entsprechend in einem 1 %igen Agarosegel mit 500

ng/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer aufgetrennt und dann unter UV-Licht fotografiert.

Zur Bildung der Markerbanden wurde ein 1 kb plus DNA-Ladder verwendet.


35

2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.3.1 Zellextraktion

Für die Western Blot Analysen mussten Zelllysate gewonnen werden. Pro Zelllysat

wurden 5 x 105 Zellen einer hochreinen, 2-3 Wochen kultivierten Mastzell-Kultur

eingesetzt. Nach Zentrifugation (5 min, 300 g) wurde der Überstand abgenommen

und das Zellpellet in 60-100 µl Extraktionspuffer mit Zusatz von Proteaseinhibitoren

(Protease inhibitor cocktail CompleteTM Mini) lysiert. Anschließend wurde das Lysat

nochmals zentrifugiert (14000 g, 40C), der proteinhaltige Überstand abgenommen,

aliquotiert und bei –800C aufbewahrt.

2.3.2 Western Blot

Um gleiche Mengen an Protein einsetzen zu können, wurde die Proteinkonzentration

mit Hilfe des Bio Rad Protein Assays (Bio Rad Laboratories) bestimmt. Es wurden je

Spur 10-25 µg Protein im Verhältnis 1:1 mit 2 x Probenpuffer (Laemmli-Puffer)

angesetzt, für 5 min bei 950C denaturiert und auf ein 4%-iges SDS-Acrylamid-

Sammelgel aufgetragen. Zur Bildung der Markerbanden, um die Proteingröße der

später auf dem Film ersichtlichen Banden erkennen zu können, wurde der Bio Rad

Low Range Marker eingesetzt. Nach dem Auftrag auf das Sammelgel erfolgte die

Auftrennung von Proben und Marker in einem 12%-igen SDS-Acrylamid-Trenngel (90

min, 120 V). Die im Trenngel enthaltenen Proteine wurden auf eine

Nitrozellulosemembran durch den Bau eines „Sandwiches“ nach dem Prinzip „Fast

Blot/ Semi-Dry“ transferiert (Kathode, 3 x Filterpapier, Acrylamid-Trenngel,

Nitrozellulosemembran, 3 x Filterpapier, Anode). Der Transfer erfolgte in einer mit

Westernblot-Puffer gefüllten Blotkammer (Mini Blot Kammer, BioRad) für 4h bei 40 V

und einer Temperatur von 40C. Anschließend inkubierte die Nitrozellulosemembran

über Nacht bei 40C mit 5%-iger Magermilchlösung in PBS-Tween, um unspezifische

Bindungen des im Folgenden Verwendeten Antikörpers zu blockieren.


36

Nach zweimaligem Waschen mit PBS-Tween inkubierte die Membran mit dem

Primärantikörper, seiner Spezifität entsprechend verdünnt, für 90 min bei

Raumtemperatur. Es folgten zweimaliges Waschen mit PBS-Tween und Inkubation

mit einem entsprechend verdünnten, Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper

für 90 min bei Raumtemperatur. Danach wurde die Nitrozellulosemembran zur

Entfernung unspezifischer Bindungen dreimal mit PBS-Tween gewaschen.

Anschließend konnte der Sekundärantikörper mittels Chemilumineszenz Reagenz

(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus) auf einem hochempfindlichen

Röntgenfilm dargestellt werden.

2.4 Virale Methoden

2.4.1 Zellkultur

Die adhärent wachsende Zelllinie HEK-293 wurde in 75 cm² Gewebekulturflaschen

mit DMEM (versetzt mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin) bei 370C und 5%

CO2 kultiviert. Bei Erreichen der Konfluenz des Zellrasens wurden die Zellen

passagiert. Dazu wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und

trypsiniert. Zum Lösen des Zellrasens wurden die Zellen mit 1 x Trypsin/EDTA

bedeckt und inkubierten 2-5 min bei 370C. Durch Abklopfen ließen sich die Zellen

vom Untergrund ablösen und wurden nach Resuspension in frischem Medium in

einem Verhältnis 1:4 bis 1:6 ausgesät.

2.4.2 Transfektion

Um ausreichende Mengen des Adenovirusplasmids in HEK 293 einzuschleusen,

wurde das Liposomenreagenz LipofectamineTM für die Transfektion verwendet. Es

bildet sich ein Liposomen/DNA-Komplex, der mit der Plasmamembran fusioniert und

die DNA ins Cytoplasma transferiert.


37

Für die Transfektion wurden in 25 cm ² Flaschen kultivierte HEK 293-Zellen mit

einer Konfluenz von 80% verwendet. Zu einem vorbereiteten Ansatz aus 5 µg zu

transfizierender DNA und 500µl OptiMEM wurden 20 µl LipofectamineTM gegeben

und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurden die Zellen mit

PBS gewaschen und mit 2,5 ml OptiMem versorgt. Nach 30 min wurde der

LipofectamineTM/OptiMem-Mix für 5 h auf die Zellen gegeben.

Unter dem Fluoreszenzmikroskop ließ sich der Transfektionserfolg beobachten,

der an der GFP-Expression und den abgerundeten lytischen Zellen (zytopathischer

Effekt) erkennbar war. Nach ca. 5-7 Tagen konnte die erste Virusisolation erfolgen.

2.4.3 Virusisolierung

Nach etwa sieben Tagen konnte der primäre Virusstock aus den transfizierten Zellen

isoliert werden. Der Zellrasen wurde durch Auf- und Abpipettieren des Mediums

resuspendiert, 10 min bei 500 g zentrifugiert und das Zellpellet in PBS

aufgenommen. Zur vollständigen Zelllyse wurde die Suspension in flüssigem

Stickstoff tiefgefroren, sofort wieder aufgetaut und kräftig auf dem Tischrüttler

durchmischt (freeze/thaw). Um eine möglichst hohe Ausbeute an infektiösen

Partikeln zu erhalten, wurde dieser Vorgang dreimal wiederholt. Die Suspension

wurde zentrifugert (700 g, 20 min, 40C), der Überstand in ein neues Gefäß überführt

und für die Transduktion weiterer Zellen verwendet.

2.4.4 Vermehrung und Präparation von Adenoviren

Für die Gewinnung größerer Virusmengen wurden HEK 293-Zellen bis zu einer

Konfluenz von 90% kultiviert. Vor der Transduktion wurde das zur Kultivierung

verwendete Medium (DMEM, 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin) gegen Medium

mit einem reduzierten Serumgehalt (DMEM, 2% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin)

ersetzt, da hierdurch die Transduktionseffizienz gesteigert wird. Der Zellüberstand

einer Virusisolierung wurde auf den Zellrasen der Kulturflasche gegeben. Der

Infektionserfolg konnte mikroskopisch bei GFP-exprimierenden Viren unter UV-Licht,


38

vor allem aber über die Entwicklung eines zytopathogenen Effekts (CPE) verfolgt

werden. Dieser zeigte sich nach etwa 48 h – erkennbar an den abgerundeten Zellen,

die sich großflächig von der Zellkulturflaschenoberfläche lösten. Nach der Ernte der

Zellen fand die Virusisolation (vgl. Kap. 2.4.3) statt. Anschließend konnten die Viren

in größerem Maßstab präpariert werden.

Die Anreicherung und Reinigung der Viruspräparation erfolgt über

Dichtegradienten-Zentrifugation. Hierzu wurde zunächst ein Cäsiumchlorid-

Stufengradient aus jeweils 3,5 ml CsCl2 mit den Dichten 1,4 g/ml und 1,2 g/ml

erstellt. Das Virusisoltat von 20-30 transduzierten Zellkulturflaschen (75 cm²) wurde

in einem Volumen von 6 ml auf den Gradienten geschichtet. Die

Dichtegradientenzentrifugation erfolgte mit 27.000 rpm (Beckman-Ultrazentrifuge,

SW-28 Rotor) über 4 h und bei 4°C. Durch seitliches Einstechen in das

Zentrifugenröhrchen mit einer Kanüle (Durchmesser 0,8 mm) wurde die als trüber

Ring sichtbare Virusbande aus dem Gradienten abgezogen. Um eine größere

Reinheit des Virusmaterials zu erhalten, wurde die Suspension mit PBS auf 6 ml

aufgefüllt, erneut auf einen CsCl2–Gradienten geladen und für weitere 2 h

zentrifugiert. Die entstandene Virusbande wurde in einem möglichst kleinen Volumen

abgezogen, mit 1 Vol. 2 x Lagerungspuffer versetzt und bei -20°C gelagert.

2.4.5 Titerbestimmung

Eine Titerbestimmung mit dem Immunoassay Adeno-X™ Rapid Titer Kit (BD

Biosciences) wurde nach Herstellerangaben durchgeführt, um Aussagen über die

Infektiösität der Viruspräparation zu erhalten. Mit Hilfe eines spezifischen

Primärantikörpers gegen das Protein Hexon und einem Peroxidase-konjugierten

Sekundärantikörper wurden adenoviral infizierte Zellen markiert. Somit konnte

berechnet werden, wie viele infektiöse Einheiten pro Milliliter Viruspräparation

enthalten waren (infectious units per milliliter; ifu/ml). Daraus wurde die MOI

(multiplicity of infection) berechnet, die im statistischen Mittel die vorhandene Anzahl

der infektiösen Partikel pro Zielzelle angibt.


39

2.4.6 Transduktion von Primärzellen

Humane intestinale Darmastzellen wurden in Mastzell-Kulturmedium mit reduzierter

FCS-Konzentration aufgenommen. Der auf 2% gesenkte FCS-Gehalt steigerte die

Infektionseffizienz. Da sich die Mastzellen schlecht transduzieren ließen, wurde das

CAR-PDT-Fusionprotein CARex-VP22 (coxsackievirus adenovirus receptor; protein

transduction domains) in einer Konzentration von etwa 400 ng/ml hinzugefügt, das

als eine Art Adaptor zwischen Mastzellen und Viren fungierte (feundlich überlassen

von Dr. F. Kühnel, MHH).

Nach einer Inkubation von 4 h wurde SCF (50ng/ml) hinzugefügt und 24 h später

wurden die Zellen in Kulturmedium mit 10 % FCS aufgenommen. Die Ernte mit

anschließenden Stimulationsexperimenten erfolgte ca. 48 h nach Infektion als etwa

50-60 % der Matzellen infiziert waren (s. Kapitel 2.5.5. Mastzellaktivierung).

2.5 Zellbiologische Methoden

2.5.1 Isolation von Mastzellen aus menschlichem Darmgewebe

Alle Untersuchungen an menschlichem Darmgewebe wurden durch die

Ethikkommission der Medizinischen Hochschule genehmigt (Nr. 2880). Die Isolation

von Mastzellen aus menschlichem Darmgewebe war durch eine Zusammenarbeit mit

der Abteilung für Viszeral- und Transplantationschirurgie der Medizinischen

Hochschule Hannover möglich. Es erfolgte eine zeitnahe Entnahme von

makroskopisch unauffälligen, tumorfreien Proben (10-50 cm² Schleimhaut) aus

chirurgischen Resektaten, die hauptsächlich aufgrund von Tumoren im Dünn- oder

Dickdarm, aber auch anderer Erkrankungen, wie M.Crohn, Divertikulose oder

Pankreas-Karzinom, operativ entfernt werden mussten. Für die Weiterverarbeitung

wurde die Probe sofort in TEA-Puffer bei 40 C über Nacht gelagert. Die weiteren

Schritte der Zellisolation erfolgten am Folgetag in einer Laminair-Werkbank und

einem 370 C Wasserschüttelbad:


40

1. Zuerst wurden Mukosa und Submukosa mit Hilfe einer Schere von der

Muskularis abpräpariert.

2. Der aus den Becherzellen freigesetzte Schleim wurde durch eine Inkubation

für 20 min in 50 ml ACC-Lösung und die Epithelzellen durch eine 30 min

Inkubation in Tyrode-Puffer mit 5mM EDTA bei 370C in einem

Wasserschüttelbad entfernt.

3. In einer Petrischale wurde das Gewebe unter Zusatz einer Enzymlösung

(PCh-Lösung: Pronase/Chymopapain) mit einer Schere zu einer Suspension

von ca. 1 mm² großen Gewebestücken zerkleinert und durch einen 250 µm

Nybold-Filter unter Spülung mit TE-Puffer filtriert. Anschließend inkubierte die

Gewebesuspension für 30 min in 25 ml PCh-Lösung.

4. Nach erneuter Filtration wurde das Filtrat wiederum verworfen und das

Gewebe inkubierte für 30 min in Collagenase-Lösung. Das nach dem Spülen

mit TGMD-Puffer gewonnene Filtrat wurde abzentrifugiert (300g 10 min,

20°C) und das Zellpellet in Kulturmedium aufgenomme n. Es erfolgte eine

Wiederholung dieses Schrittes mit dem auf dem Filter verbleibenden Gewebe.

5. Beide Filtrate wurden vereinigt und durch einen 100 µm Nybold-Filter gegeben

(Spülen mit 50ml Medium)

6. Die Zellen wurden wieder zentrifugiert (300 g, 10 min, 20°C), das Pellet in 20

ml Kulturmedium aufgenommen, gezählt (Trypanblau-Methode und Neubauer-

Zählkammer) und dann differenziert (DiffQuick-gefärbte Zytospins).

Die gewonnene Einzelzellsuspension ( 17±8*106 Zellen pro Gramm Mucosa) wurde

in einer Dichte von 2,5-4*106 Zellen/ml über Nacht in Kulturmedium ohne Zytokin-

Zusatz bei 370C kultiviert und am Folgetag der Mastzell-Aufreinigung mittels

magnetischer Zellseparation (Magnetic Cell Sorting, MACS) zugeführt.

2.5.2 Mastzellanreicherung durch MACS (Magnetic beads-activated cell sorting)

Aus der Darmzellsuspension wurden die Mastzellen nach dem Prinzip der

Positivselektion unter Verwendung des SCF-Rezeptors c-kit aufgereinigt. Die

Magnetseparation ermöglicht es, aus der heterogenen Zellsuspension einen


41

speziellen Zelltyp zu isolieren. Durch monoklonale Antikörper gegen zelltypspezifisch

exprimierte Oberflächenantigene kann die Zelle markiert werden. An den

Primärantikörper erfolgt die Bindung eines mit superparamagnetischen

Eisenkomplexen gekoppelten Sekundärantikörpers. Wird die mit den Antikörpern

inkubierte Zellsuspension durch eine sich in einem Magnetfeld befindliche Säule

gegeben, so werden die antikörpermarkierten Zellen im Magnetfeld zurückgehalten

(Positivfraktion), während mangels der zelltypspezifischen Oberflächenantigene nicht

markierte Zellen das Magnetfeld durch die Säule passieren können (Negativfraktion).

Nach Entfernung der Säule aus dem Magnetfeld kann die mastzellenthaltende

Positivfraktion durch Spülen gewonnen werden.

1. Die über Nacht kultivierte Darmzellsuspension wurde abzentrifugiert (10 min

bei 300 g), in HA-Puffer aufgenommen (1 x 108 Zellen/250µl) und mit dem

Primärantikörper gegen c-kit (YB5.B8; Maus IgG1; 5 ng/ml) für 15 min unter

leichtem Schütteln bei 40 C inkubiert.

2. Die Zellsuspension in 50 ml HA-EDTA-Puffer aufgenommen, abzentrifugiert

und das Pellet in HA-EDTA-Puffer (1 x 108 Zellen/250µl) resuspendiert.

3. Nach Zugabe eines mit magnetischen Beads gekoppelten

Sekundärantikörpers (Ziege-anti-Maus IgG, 50µl Antikörperlösung/ 250 µl

Zellsuspension) inkubierte die Zellsuspension 15 min unter leichtem

Schütteln bei 40 C, wurde danach in 50 ml HA-EDTA-Puffer aufgenommen

und abzentrifugiert.

4. Das Pellet wurde in 50 ml HA-EDTA-Puffer resuspendiert, über einen 30 µl

Nybold-Filter gegeben, erneut zentrifugiert und das Pellet in 1 x 108 Zellen/15

ml aufgenommen.

5. Nach Spülen einer Macs-Säule mit HA-EDTA-Puffer in einem Magnetfeld

(MidiMacs Seperator) wurde die Zellsuspension über die Säule gegeben und

anschließend die Negativfraktion herausgespült. Außerhalb des

Magnetfeldes wurde die Säule noch mal gespült und die MC-enthaltende

Positivfraktion (60-95% Mastzellen) unter den im Folgenden beschriebenen

Bedingungen kultiviert.


42

2.5.3 Kultur menschlicher Darmmastzellen

Die Mastzellen wurden in RPMI-Medium+Glutamax ( mit Zusatz von 10% FCS,

100µg/ml Gentamycin, 100µg/ml Streptamycin, 100U/l Penicillin und 0,5µg/ml

Amphotericin) mit Zusatz von SCF (50 ng/ml) bei 370 C, 5% CO2 und max.

Luftfeuchtigkeit kultiviert. Bei ungereinigten Zellkuturen (ohne MACS) betrug die

Zelldichte 1-4 x 106 Zellen/ml, bei aufgereinigten Kulturen 0,1- 0,4 x 106 Zellen/ml.

Wöchentlicher Wechsel des Mediums erfolgte unter Zugabe von SCF. Nach 21

Tagen Kultur betrug die Reinheit der Mastzellen 98 ± 2 %.

2.5.4 Zellzählung und Differenzierung

Es wurden 20 µl Zellsuspension abgenommen, mit 20 µl Trypan-Blau gefärbt und in

eine Neubauer- oder Fuchs-Rosenthal-Zählkammer überführt. Tote Zellen färbten

sich blau und erschienen dunkel. Mindestens 100 lebendige Zellen wurden gezählt,

die keine Farbe aufnahmen und hell leuchten. Ein Zählquadrat entspricht einem

Volumen von 0,1 µl (Neubauer) bzw. 0,2 µl (Fuchs-Rosenthal). Dadurch kann die

Gesamtzellzahl bestimmt werden.

Zur Differenzierung der Zellen wurden Zytospins aus 80 – 200 µl der

Zellsuspension mit einer Zytozentrifuge (Shandon, Pitsburg, PA, 500 rpm für 3 Min)

hergestellt. Danach folgte eine Färbung der Zytospins mit DiffQuick oder mit May-

Grünwald /Giemsa nach Pappenheim sowie eine differenzierte Auszählung von 200 -

500 Zellen. Aufgrund ihrer metachromischen Granula konnten die Mastzellen leicht

erkannt werden.

2.5.5 Mastzellaktivierung/ Mediatormessung

Nach mindestens 14-tägiger Kultur in Gegenwart von SCF wurden die Mastzellen

gewaschen, gezählt und in einer Dichte von 105MC/ml in Kulturmedium

aufgenommen. Es folgte eine Inkubation mit verschiedenen Substanzen

(Leichtketten der Botulinum Neurotoxine, rekombinierte Adenoviren, Antikörper


43

gegen SNAREs: Vamp2, Vamp7), welche die Mediatorausschüttung der Mastzellen

verringern sollten. Anschließend wurden die Mastzellen mit Hilfe des gegen die α-

Kette des IgE-Rezeptors gerichteten Antikörpers 22E7 (100 ng/ml) aktiviert, der die

IgE-Rezeptoren auf der Mastzelloberfläche kreuzvernetzt. Der PKC-Aktivator PMA

(Phorbol-Myristat-Acetat) und das Calciumionophor Ionomycin wurden als weitere

Mastzellaktivatoren angewendet. Als Messgröße für die Mediatorausschüttung diente

Histamin. Nach 60 min Inkubation mit den aktivierenden Substanzen im

Wasserschüttelbad bei 370 C wurden die MC abzentrifugiert (5 min, 350 g) und die

Überstände bis zur Histaminmessung bei –200 C gelagert. Zusätzlich wurde pro

Bedingung die basale, ohne Stimulation stattfindende Histaminfreisetzung

(Überstände mit PBS behandelter Mastzellen) und das intrazelluär gespeicherte,

präformierte Histamin bestimmt. Der Gehalt des Mastzell-Mediators Histamin in den

Überständen wurde in Relation zu dem präformierten Histamin (Mastzell-Lysate,

Aufnahme in Wasser 1:1, 2 Einfrier-Auftau-Zyklen) gesetzt. Die Histaminmessung

erfolgte mit einem kommerziellen Radioimmunoassay (RIA, Coulter-Immunotech,

Krefeld). Zur Darstellung der Histaminfreisetzung wurde jeweils die spezifische

Freisetzung (Subtraktion der basalen von der induzierten Freisetzung) angegeben.

2.5.6 Permeabilisierung mit Streptolysin O (SLO)

Zur Permeabilisierung der MC wurde Streptolysin O, ein Toxin ß-hämolysierender

Streptokokken, verwendet. Mit Hilfe von Cholesterol bindet Streptolysin O an die

Plasmamembran, wodurch es über die Bildung von Oligomeren zu über 12nm

großen Poren kommt. Durch das Streptolysin O werden die Zellen durchlässig für

Ionen und auch größere Moleküle wie Immunglobuline bzw. Antikörper [134].

Zur Permeabilisierung inkubierten die Mastzellen (1 x 105 MC/ml) 15 min bei 370C in

calciumfreier HBSS-Lösung, der 30 mM Hepes ph 7,2, SLO (10 µg/ml) und die

entsprechenden Antikörper zugefügt wurden (anti-VAMP-7, anti-VAMP-2; beide

Antikörper wurden 1:250 verdünnt). Zum Verschluss der Poren wurden die

Mastzellen nach Zugabe von calciumhaltigen RPMI-Medium für 60 min auf Eis

gestellt. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert ( 300 g, 5 min), resuspendiert

und für 60 min mit 22E7 stimuliert (s. Kapitel 2.5.5. Mastzellaktivierung).


44

Durch Anfärbung mit Trypanblau wurde die der Permeabilisierungserfolg (etwa

60 - 80 %) durch Auszählen der dunkler gefärbten Zellen lichtmikroskopisch

überprüft.

2.5.7 Konfokale Immunfluoreszenz-Mikrosopie

Zur Intrazellulärfärbung wurden je 1 x 105 Mastzellen in Kulturmedium aufgenommen

und für 60 min mit PMA/Ionomycin (10-6 M) stimuliert. Nach der Fixierung für 30 min

bei 40 C in 2%-iger Paraformaldehydlösung wurden die Zellen in 10 ml PBS

gewaschen, abzentrifugiert und für 10 min bei Raumtemperatur in Blockingreagenz

mit 0,3% Saponin aufgenommen. Saponin permeabilisierte die Zellen und das

Blockingreagenz (PBS + goat-serum + swine-serum + human IgG, je 1:100)

verhinderte unspezifische Bindungen des Primärantikörpers. Es folgte eine 30 min

Inkubation mit je zwei Primärantikörpern verschiedener Spezies (mouse antibody

anti-VAMP-7 (1:250)/ rabbit antibody anti-SNAP-23 (1:200); mouse antibody anti-

Syntaxin-4 (1:50)/ rabbit antibody anti-VAMP-3 (1:100)) und eine erneute

Zentrifugation. Danach inkubierten die MC in Blockingreagenz mit 0,3% Saponin und

den entsprechenden Sekundärantikörpern (Alexa Fluor® goat anti-mouse 488/ Alexa

Fluor® donkey anti-rabbit 594; je 1:200 verdünnt) abgedunkelt für 30 min. Nach

erneutem Waschen wurden die Zellen in 10 µl PBS aufgenommen, auf einen

Objektträger gegeben und nach Absinken der Mastzellen mit Hilfe eines

Konfokalmikroskops betrachtet. Für die Doppelfärbung VAMP-7/ Syntaxin-3

(1:250/1:250) erfolgte eine zusätzliche Kernfärbung mit To-Pro 3 (Molecular Probes)

zur besseren Lokalisierbarkeit der SNARE-Proteine. Für die Kernfärbung inkubierten

die Zellen für 3 min in To-Pro-3 (1:1000 in PBS) und wurden anschließend 10 min in

PBS gewaschen. Die Konfokalmikroskopie wurde mit Hilfe von Herrn Tibor Veres im

Frauenhofer-Institut für Toxikologie und experimentelle Medizin, Abteilung

Allergologie und Immunologie durchgeführt.


45

2.5.8 Patch-Clamp-Messungen

Die Patch-Clamp-Technik ermöglicht es, die Membranströme von Zellen in vivo zu

messen.

Zunächst wurde eine Suspension aus humanen Mastzellen auf eine mit

Fibronectin (BD Biosciences) gecoatete Petrischale gebracht. Nach einer

einstündigen Inkubation mit SCF (100 ng/ml) adhärierten die Mastzellen auf der

Oberfläche [8]. Anschließend wurde eine dünn ausgezogene Glaskapillare auf eine

intakte Zelle gedrückt. Damit bei der hier angewendeten cell-attached-Konfiguration

die Zellmembran fest an der Glaswand der Pipette anlag und somit ein kleiner

Abschnitt der Zellmembran (Patch) elektrisch von seiner Umgebung isoliert war,

wurde durch leichtes Ansaugen ein Unterdruck ausgeübt. Die Isotypen der Botulinum

Neurotoxin-Leichtketten sollten nun ihre proteolytische Wirkung in der Zelle entfalten

(mind. 5 – 10 min), um anschließend die Degranulation bzw. die

Degranulationshemmung zu messen (mind. 10-15 min). Jedoch erwiesen sich die

menschlichen Mastzellen als zu instabil. Die Zellintegrität konnte nicht bis zum Ende

der Messungen aufrechterhalten werden. Die Patch-Clamp-Messungen fanden in

Zusammenarbeit mit F. Wegner von der Neurologischen Klinik der Universität

Leipzig statt.

2.6 Statistik

Die Daten des Ergebnisteils wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD)

dargestellt. Signifikante Differenzen wurden mittels des one tailed t-Tests bestimmt.

Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von P < 0,05 wurde als signifikant bewertet.

Ergebnisse

46

3. Ergebnisse

3.1 Nachweis von SNARE-Proteinen in menschlichen Darm-

Mastzellen

3.1.1 SNARE-mRNA Nachweis mittels RT-PCR

Als Vermittler der Exozytose in Neuronen, aber auch in verschiedenen sekretorisch

aktiven Zellen, ist eine Gruppe hochkonservierter Proteine, die sogenannten SNARE-

Proteine, beschrieben worden. Bisherige Untersuchungen in Zellen des

Immunsystems zeigten, abhängig von der Zellart, unterschiedliche

Expressionsmuster der SNARE-Isoformen. Die Kenntnisse über das SNARE-

Vorkommen in Mastzellen beruhen hauptsächlich auf der Rattenmastzelllinie RBL-

2H3. Da sich im Nagersystem gewonnene Daten nicht ohne Weiteres auf das

menschliche System übertragen lassen, erfolgte eine Untersuchung verschiedener

Vertreter der VAMP-, Syntaxin- und SNAP-Familien in humanen Mastzellen. Dazu

wurden menschliche Darm-Mastzellen (Abb.2A) mit der humanen Neuroblastom-

Zelllinie MHH-NB-11 (Abb.2B), als Kontrolle für neuronale SNARE-Proteine

verglichen. Weitere Analysen erfolgten an in vitro entwickelten Mastzellen aus

Nabelschnurblut (CBMC) und der Mastzellinie HMC-1. Anhand von eosinophilen

Granulozyten, wurden die Mastzellen mit einem weiteren Vertreter sekretorisch

aktiver Immunzellen verglichen.

Die mRNA der SNARE-Isoformen SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –5, sowie

VAMP-3, -5, -7 und –8 ließ sich in allen untersuchten Zellen zeigen. Dagegen konnte

SNAP-25, das als neuronale Isoform des ubiqutär nachgewiesenen SNAP-23

angesehen wird, nicht in Mastzellen dargestellt werden. Außerdem wurden neben

SNAP-25 auch Syntaxin-1A und Synatxin-1B nur in Neuronen detektiert. Für SNAP-

25 und Synatxin-1B zeigte sich eine zusätzliche, wenn auch schwächere Expression

in HMC-1. In primären humanen Mastzellen waren keine Signale für diese Gene

nachweisbar (Abb.2 C-F).

Ergebnisse

47

Abb.2: Darstellung der Expression von SNARE-mRNA in verschiedenen Mastzellkulturen und Neuronen mittles RT-PCR (C-F). Lichtmikroskopische Bilder humaner intestinaler Mastzellen (A) und der Neuronenzelllinie MHH-NB-11 (B). C GAPDH; D SNAP-23, -25; E Syntaxin-1A, -1B, -2, -3, -4, -6; F VAMP-2, -3, -5, -7, -8; L 1 kb plus ladder zur Fragmentgrößen-Bestimmung, Banden verlaufen im Abstand von 100 bp; 1 - 3 MC1 - MC3; 4 CBMC; 5 HMC-1; 6 eosinophile Granulozyten; 7 humane Neuroblastom-Zelllinie MHH-NB-11. Als Kontrolle wurde die Expression von GAPDH als „house-keeping gene“ dargestellt. Zusätzlich wurde MHH-NB-11 als Positivkontrolle verwendet.

L 1 2 3 4 5 6 7

GA

PD

H

C

SN

AP

-25

SN

AP

-23

D L 1 2 3 4 5 6 7

Stx

-1B

Stx

-2

Stx

-3S

tx-4

Stx

-6

Stx

-1A

E L 1 2 3 4 5 6 7 L 1 2 3 4 5 6 7

VA

MP

-2

L 1 2 3 4 5 6 7

VA

MP

-5

VA

MP

-7

VA

MP

-3

VA

MP

-8

L 1 2 3 4 5 6 7 F

A

B

Ergebnisse

48

3.1.2 SNARE-Protein Nachweis mittels Western Blot

Die Analyse der SNARE-Expression auf Protein-Ebene erfolgte mittels Western Blot.

Für die Western Blots wurden Lysate aus humanen intestinalen Mastzellen (5 x105

Zellen) verwendet. Als Kontrolle diente dabei eine Präparation aus dem

Hirnhomogenat einer Maus. In humanen Mastzellen konnten die t-SNAREs SNAP-

23, Syntaxin-2, Syntaxin-3, Syntaxin-4 und die v-SNAREs VAMP-3, VAMP-7, VAMP-

8 nachgewiesen werden. SNAP-25 und Syntaxin-1A waren in Mastzellen nicht

vorhanden, jedoch gelang in der Postivkontrolle der Nachweis für diese neuronalen

Isoformen (Abb.3). Die mittels Western Blot gewonnenen Daten bestätigten auf

Protein-Ebene die Ergebnisse aus der RT-PCR.

Unterschiede fanden sich dagegen für die SNARE-Proteine VAMP-2 und

Syntaxin-1B. Während VAMP-2 auf mRNA-Ebene nocht starke Signale aufwies, war

es im Western Blot mittels eines monoklonalen Antikörpers nicht darstellbar. Erst bei

Verwendung eines polyklonalen Antikörpers ließ sich eine, wenn auch schwache,

Expression für VAMP-2 nachweisen. Die Positivkontrolle zeigte in beiden Fällen eine

starke Bande. Während Syntaxin-1B in der RT-PCR nicht detektiert wurde, konnte

man auf Protein-Ebene schwache Signale in Mastzellen sehen.

Abb. 3: Verschiedene an der Vesikel- (v-SNAREs) oder Plasmamembran (t-SNAREs) lokalisierte SNARE-Proteine konnten in humanen Darm-Mastzellen nachgewiesen werden. (VAMP-2*: monoklonaler Antikörper; VAMP-2**: polyklonaler Antikörper)

SNAP-23 SNAP-25 Syntaxin-1A Syntaxin-2 Syntaxin-3 Syntaxin-4

Kontrolle

(Maushirn-Extrakt)

Humane

Darm-Mastzellen

VAMP-2* VAMP-2** VAMP-3 VAMP-7 VAMP-8

Kontrolle

(Maushirn-Extrakt)

Humane

Darm-Mastzellen

t-SN

AR

Es

v-S

NA

RE

s

Syntaxin-1B

Ergebnisse

49

3.2 Untersuchung des Einflusses von Botulinum Neurotoxin auf die

Mastzelldegranulation

3.2.1 Herstellung adenoviraler Konstrukte

Durch Einschleusung von Tetanus-Toxin in eosinophile Granulozyten konnte die

Bedeutung des SNARE-Proteins VAMP-2 für die Exozytose gezeigt werden [135].

VAMP-2 dient sowohl Tetanus als auch Botulinum Neurotoxin Typ B als Substrat und

nach Proteolyse zeigte sich eine Exozytosehemmung in eosinophilen Granulozyten.

Mehrere Ansätze zur Einschleusung der proteolytisch wirksamen Leichketten von

Botulinum Neurotoxin erwiesen sich als nicht praktikabel, da nicht genug Mastzellen

überlebten, um anschließende Stimulationsexperimente durchzuführen. Dazu

gehörten Gangliosidbehandlung, Elektroporation und Patch Clamp-Technik. Ein

weiterer Ansatz bestand in der Verwendung adenoviraler Vektoren. Nachdem in

Vorarbeiten durch Lorentz et al. (unpublizierte Daten) die Infektion von Mastzellen mit

Adenoviren erfolgreich durchgeführt werden konnte, wurden zur Analyse der

Degranulationshemmung durch SNARE-spaltende Neurotoxine adenovirale

Konstrukte verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Aktivität der proteolytisch

aktiven, leichten Ketten von Botulinum-Neurotoxin Typ A, B und C1 untersucht. Dazu

kamen Adenoviren, welche die gewünschten Gene enthielten, sowie ein Kontrollvirus

ohne zusätzliche genetische Information zum Einsatz.

Zur Herstellung der verwendeten Plasmide pBoNT-A, pBoNT-B, pBoNT-C1

wurden die leichten Ketten der Botulinum-Neurotoxine Typ A, B und C1 als N-

terminale Fusionspartner von eGFP in die Multiple Cloning Site des pShuttle-CMV-

Vektors kloniert (Schema in Abb.4). Zunächst wurde das Gen für eGFP über XhoI /

HindIII eingefügt, im zweiten Schritt dann die Gene für die jeweiligen leichten Ketten

über Sal I / Stu I, wobei letztere Restriktionsschnittstelle durch die Klonierung von

eGFP eingebracht wurde. Anschließend erfolgte eine Umklonierung der drei

Konstrukte in den bakteriellen Expressionsvektor über NcoI / MluI. Die Kontrolle des

Klonierungserfolges durch Überprüfen der Größe der produzierten Proteine und der

Ergebnisse

50

Toxin-Protease-Aktivität fand, wie auch die Klonierung der leichten Ketten, in

Kooperation mit Herrn Dr. Specht (Biotecon, Posdam) statt.

Abb. 4: Klonierung der leichten Ketten des Botulinum Neurotoxins in den Vektor pShuttle-CMV; A Plasmidkarte des verwendeten Vektors pShuttle-CMV; B Schnittstellen im Vektor und Reihenfolge der Klonierungsschritte

HindIII XbaISalI NotI XhoIKpnI

pShuttle-CMV

eGFPS‘

StuI HindIII

BglII

eGFPS‘

pShuttle-CMV-eGFP

XhoI (EcoRV)StuINcoISalI

BoNT(A/Bopt/C1)-LS

EcoRV

XhoI MluI

XbaISalI NotIKpnIBglII EcoRV

eGFPS‘

StuI HindIIIXhoI MluI

L(A/Bopt/C)S

XbaIKpnIBglII EcoRV

eGFPS‘

HindIIIMluIStuINcoISalI

L(A/Bopt/C)SpShuttle-CMV-BoNT(A/Bopt/C1)-L-eGFP

B

A

Ergebnisse

51

Das weitere Vorgehen zur Herstellung rekombinanter Adenoviren erfolgte nach dem

System von He et al. [136], das sich als besonders effizient erwiesen hat (Schema in

Abb. 5).

Abb. 5: System nach He et al. zur Herstellung rekombinanter Adenoviren. Zunächst wird fremde DNA in einen Shuttle-Vektor kloniert, dessen Multiple Cloning Site (MCS) von adenoviralen Sequenzen flankiert ist. Als leichte Modifikation des Schemas wurde für die Herstellung rekombinanter Adenoviren pShuttle-CMV und nicht wie dargestellt pAd-Track-CMV verwendet. Nach homologer Rekombination mit pAd-Easy-1 in E. coli erfolgt die Generierung viraler Partikel in permissiven Zellen

CDS kodierende Sequenz; GFP Grün Fluoreszierendes Protein; Kan Kanamycin-Resistenzgen; Amp Ampicillin-Resistenzgen; LITR Left Inverted Terminal Repeats; RITR Right Inverted Terminal Repeats; CMV Promotor des Zytomegalie-Virus; Ori Ursprungsort der DNA-Replikation; PacI Erkenungssequenz für die Endonuklease PacI; PmeI Erkennungssequenz für die Endonuklease PmeI

Ergebnisse

52

Unter Nutzung einer homologen Rekombination konnten adenovirale Konstrukte in

Bakterien kloniert werden, da sowohl das verwendete Shuttle Plasmid als auch das

Backbone Plasmid zwei homologe Bereiche enthielten. Zunächst mussten die

Plasmide pBoNT-A, pBoNT-B und pBoNT-C1 durch den Verdau mit der

Restriktionsendonuklease PmeI linearisiert werden. Die linearisierten adenoviralen

Plasmide wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit anschließender

Ethanolfällung aufgereinigt, konzentriert und durch Elektroporation in E. coli der

Zelllinie BJ 5183-Ad1, in denen der adenovirale Backbone Vektor bereits vorlag,

transformiert. Nach einer DNA-Minipräparation konnten die gewünschten Klone

durch Restriktionsverdau mit PacI identifiziert und anschließend in den chemisch

kompetenten E. coli –Stamm XL10-Gold transformiert werden, um größere Mengen

an Plasmid zu erhalten. Nach einer endotoxinfreien Maxi-Plasmidpräparation wurde

durch PCR das Vorliegen des klonierten Gens überprüft (Abb.6).

Abb. 6: PCR zur Überprüfung der klonierten Gene; A BoNT-A; B BoNT-B; C BoNT-C (A-C: die PCR wurde mit den entsprechenden Primern durchgeführt); D-F GFP (in der Reihenfolge BoNT-A, BoNT-B, BoNT-C aufgetragen)

3.2.2 Virusgenerierung

Zur Herstellung infektiöser Viren aus Adenovirusplasmiden wurden Viren des

humanen Serotyps 5 verwendet, die aufgrund einer Deletion der E1- und E3-Region

nur in bestimmten Zelllinien, wie HEK-293, vermehrt werden können. Diese Zellen

transkomplementieren den viralen Defekt, da sie in ihrem Genom die stabil integrierte

E1-Region enthalten, womit eine Virusvermehrung ermöglicht wird. Zunächst erfolgte

eine Linearisierung der Adenovirusplasmide mit der Restriktionsendonuklease PacI,

A B C D E F

Ergebnisse

53

um den für die Herstellung infektiöser Viren notwendigen rechten und linken ITR

(Inverted Terminal Repeat) freizulegen. Dabei wurden gleichzeitig für die stabile

Replikation in E. coli notwendige DNA-Abschnitte entfernt. Nach Aufreinigung und

Konzentration durch Phenol-Chloroform-Extraktion mit Ethanolfällung wurden HEK

293-Zellen mit rekombiniertem Ad-Easy-1 transfiziert, um den primären Virusstock zu

erstellen. Nach siebentägiger Inkubation fanden die ersten Virusisolationen mit

anschließender Vermehrung und Präparation der Viren statt (vgl. Kap. 2.4.4).

Nicht nur mit Hilfe des zytopathischen Effekts, sondern auch durch die GFP-

Expression sollte die Transfektionseffizienz und später der Transduktionserfolg

abgeschätzt werden können. Es zeigten sich aber bereits während der Transduktion

von HEK 293-Zellen Unterschiede in der GFP-Expression. So wies das Kontrollvirus

AdGFP ein intensiveres GFP-Signal als die anderen rekombinierten Adenoviren auf.

Aber auch untereinander zeigten AdBoNT-A, AdBoNT-B und AdBoNT-C stark

unterschiedliche GFP-Signale (Abb. 7). Als Nachweis für die Replikationfähigkeit und

Infektiösität der Viren diente der bei allen Konstrukten etwa gleich starke

zytopathische Effekt. Er trat etwa zwei bis drei Tage nach Infektion auf - erkennbar

an der Abrundung und Ablösung der Zellen. Abschließend wurde eine

Titerbestimmung der präparierten Viren zur genauen Bestimmung der Infektiösität

durchgeführt. Die Titerbestimmung erfolgte über das Capsid-Protein Hexon, das nur

in infizierten, die E1-Deletion des Adenovirus transkomplementierenden Zellen, wie

HEK 293, produziert wird. In allen drei Fällen konnte ein Titer bestimmt werden.

Ergebnisse

54

Abb. 7: Darstellung der GFP-Expression der verwendeten Adenoviren in HEK

293-Zellen. Alle Bilder wurden mit den gleichen Lichtverhältnissen photographiert,

um die verschiedenen GFP-Signale vergleichen zu können; A AdGFP; B AdBoNT-A;

C AdBoNT-B; D AdBoNT-C;

* Auflicht

A

B

A*

B*

C C*

D D*

Ergebnisse

55

3.2.3 Transduktion der Mastzellen mit rekombinierten Adenoviren

Zur Einschätzung der Transduzierbarkeit von Mastzellen wurden verschiedene

Virustiter verwendet. Erst als etwa 500 infektiöse Viruspartikel pro Zelle eingesetzt

wurden (MOI 500), konnten 1-5 % der Mastzellen mit dem Kontrolvirus AdGFP

transduziert werden. Höhere Viruskonzentrationen erzielten kein wesentlich besseres

Ergebnis, da mit steigender MOI auch der zytopathische Effekt auf die Mastzellen

zunahm. So waren bei Verwendung höherer Titer etwa 70% der Mastzellen nach

72 h abgestorben, während weiterhin keine nennenswerte Infektion beobachtet

werden konnte. Der Transduktionserfolg wurde dabei mittels eines

Fluoreszenzmikroskops anhand der GFP-Expression von AdGFP abgeschätzt. Jede

GFP-produzierende Zelle konnte als erfolgreich infiziert gewertet werden. Aufgrund

der niedrigen Infektionsraten lag die Vermutung nahe, dass bestimmte Strukturen,

die den für die Virusaufnahme notwendigen initialen Kontakt zwischen Zielzelle und

Adenovirus vermitteln, auf Mastzellen nicht exprimiert werden. Das Fehlen dieser für

die Transduktion notwendigen Strukuren konnte durch ein CAR-PDT-Fusionprotein

(coxsackievirus adenovirus receptor; protein transduction domains) behoben werden

[137]. Bestimmte Proteine, wie VP22 aus dem Herpes simplex Virus, können über

rezeptorunabhängige Wege von Säugetierzellen aufgenommen werden.

Verantwortlich für diese Prozesse sind Protein Transduktions Domänen. So bindet

der CAR-Anteil des Fusionsprotein (CARex-VP22) an bestimme

Oberflächenstrukturen der Adenoviren, die sogenannten fiber knobs.

Währenddessen dockt der VP22-Anteil mit seiner PDT-Domäne an die Zielzellen an,

so dass es zu dem notwendigen initialen Kontakt zwischen Zelle und Virus kommen

kann. Die weiteren Schritte, die die Virusaufnahme zur Folge haben, werden durch

verschiedene Integrine vermittelt. Mit Hilfe des Fusionproteins CARex-VP22, das als

Adaptor zwischen den Mastzellen und dem Virus dient, konnte die Effizienz der

adenoviralen Infektion deutlich verbessert werden. Außerdem wurde der

zytopathische Effekt durch den Einsatz niedrigerer Viruskonzentrationen gesenkt.

Nach 48 h waren bei Verwendung einer MOI von 50 etwa 50-60 % der Mastzellen

infiziert. Zu diesem Zeitpunkt waren noch etwa 95 –100 % der eingesetzten Zellen

vital. Mit längeren Inkubationszeiten nahm der zytopathische Effekt der Adenoviren

auf die Mastzellen zu, so dass nach 72 h nur 70-80 % der Zellen überlebten,

Ergebnisse

56

während die Infektionsrate nicht wesentlich weiter stieg. Die GFP-Intensität der

konstruierten Adenoviren zeigte, wie bereits in den HEK 293-Zellen, starke

Unterschiede und war in den Mastzellen sogar heruntergesetzt (Abb.8). Während für

AdBoNT-A und AdBoNT-C, die auch in den HEK 293-Zellen schwache Signale

aufwiesen, in den Mastzellen kein GFP darstellbar war, wiesen AdBoNT-B-infizierte

Zellen nur sehr schwaches GFP auf. Jedoch wurden für alle Konstrukte gleiche

Viruskonzentrationen eingesetzt. Da die Transduktion über Oberflächenproteine von

Viren und Zellen vermittelt wird, die durch die eingefügten Gene nicht beeinflusst

werden, konnte für pBoNT-A, pBoNT-B und pBoNT-C1 von einer dem Kontrollvirus

entsprechenden Infektionsrate ausgegangen werden [137].

Abb. 8: Darstellung der unterschiedlichen GFP-Expression in infizierten

Mastzellen. Alle Bilder wurden mit der gleichen Beleuchtungsstärke photographiert,

um die verschiedenen GFP-Signale vergleichen zu können; A AdGFP; B AdBoNT-B;

In mit AdBoNT-A und AdBoNT-C transduzierten Zellen waren kaum GFP-Signale

detektierbar

* Auflicht

A A*

B B*

Ergebnisse

57

3.2.4 Untersuchung der Exozytose adenoviral transduzierter Mastzellen

Da der Transduktionserfolg unter dem Fluoreszenzmikroskop anhand der GFP-

Signale des Kontrollvirus abgeschätzt werden konnte, erfolgte die Ernte nach etwa

zwei Tagen, als 50-60 % der AdGFP-behandelten Mastzellen mit Hilfe des

Fusionsproteins CARex-VP22 infiziert waren. Zu diesem Zeitpunkt sollten auch die

leichten Ketten der Botulinum-Neurotoxine, deren cDNA in die Adenoviren kloniert

wurde, in den Zellen exprimiert werden. Nach zweimaligem Waschen erfolgte eine

Aktivierung der Zellen. Dazu wurden die Zellen sowohl mit dem gegen die α-Kette

des IgE-Rezeptors gerichteten Antikörper 22E7, als auch mit PMA und Ionomycin für

1 h inkubiert. Nach PMA/Ionomycin-Stimulierung konnte eine

Degranulationshemmung für BoNT-B und BoNT-C festgestellt werden, wobei die

spezifische Histaminfreisetzung mit etwa 50 % insgesamt auf einem hohen Niveau

lag. Zur besseren Anschaulichkeit wurde die Kontrollbedingung, die nur mit dem

Fusionsprotein CARex-VP22 inkubierte Zellen enthielt, als 100 % gesetzt (Abb.9A).

Mit dem Adenovirus AdBoNT-B infizierte Mastzellen zeigten im Vergleich zu AdGFP-

transduzierten Zellen einen um 24,6 ± 23,0 % gesenkten Histaminrelease. Der

hemmende Effekt des Neurotoxins auf die Degranulation war bei BoNT-C

exprimierenden Zellen noch stärker ausgeprägt. Hier wurden nach Stimulation 31,4 ±

25,7 % weniger Histamin freigesetzt. Dagegen konnte für BoNT-A keine signifikante

Reduktion festgestellt werden. Während nach einer PMA/Ionomycin-Aktivierung der

sekretionshemmende Effekt von BoNT-B und –C gezeigt wurde, konnten nach

Stimulation mit 22E7 keine signifikanten Unterschiede durch Botulinum-Neurotoxin-

Einwirkung dargestellt werden. Die spezifische Histaminfreisetzung war hierbei

generell niedriger als nach PMA/Iono-Aktivierung. Sie lag bei etwa 25 %. Auch hier

wurde die Kontrollbedingung als 100% gesetzt (Abb.9B). Auffällig war eine

allgemeine Hemmung der Exozytosefähigkeit, die 22E7-aktivierte Zellen nach

adenoviraler Transduktion zeigten. Für den Kontrollvirus ergab sich eine Reduktion

der Histamin-Freisetzung von 26,8 ± 24,8 %.

Ergebnisse

58

Abb. 9: Nach PMA/Ionomycin-Stimulation zeigt sich die

degranulationshemmende Wirkung von BoNT-B und –C; 2 Tage nach Infektion

der CARex-VP22 behandelten Zellen wurden die Mastzellen geerntet und aktiviert;

durch die GFP-Produktion in AdGFP-infizierten Zellen konnte der

Transduktionserfolg exemplarisch abgeschätzt werden; Für die in Abbildung 9A

dargestellte Bedingung betrug die spezifische Histaminfreisetzung der

Kontrollbedingung, die nur mit dem Fusionsprotein CARex-VP22 inkubierte Zellen

enthielt, etwa 50% und für die Bedingung in Abbildung 9B etwa 25%. Zur Besseren

Vergleichbarkeit wurden die Kontrollbedingungen jeweils als 100 % gesetzt. A

spezifischer Histaminrelease nach PMA/Ionomycin-Stimulation (10-6 M/10-6 M); B

spezifischer Histaminrelease nach 22E7-Stimulation (100 ng/ml); Die Mittelwerte (±

Standardabweichung) für A resultieren aus n = 3 Experimenten, für B aus n = 5

Experimenten.

Ap = 0,02

p = 0,01

B p < 0,01

Kontrolle

AdGFP

BoNT-A

BoNT-B

BoNT-C

0

25

50

75

100

125

His

tam

infr

eise

tzu

ng

nac

h I

nfe

ktio

n (

%)

Kontrolle

AdGFP

BoNT-A

BoNT-B

BoNT-C

0

25

50

75

100

125

His

tam

infr

eise

tzu

ng

nac

h I

nfe

ktio

n (

%)

Ergebnisse

59

3.3 Funktionelle Bedeutung der gefundenen SNARE-Proteine

3.3.1 Intrazelluläre Lokalisation der SNARE-Proteine

Zur genaueren Analyse der funktionellen Bedeutung sollte zunächst geklärt werden,

in welchen Kompartimenten die gefundenen SNARE-Isotypen liegen und ob es zu

einer Translokation nach Stimulation kommt.

Dazu wurden die humanen Darm-Mastzellen mit Saponin permeabilisiert, wodurch es

möglich war, Antikörper durch die Zellmembran zu schleusen, um die intrazellulär

gelegenen SNARE-Proteine der Mastzellen anzufärben. Zur genaueren Analyse der

Lokalisation der angefärbten Strukturen wurden die Zellen konfokalmikroskopisch auf

verschiedenen optischen Ebenen betrachtet. Da es sich bei den untersuchten

Mastzellen um nicht-adhärente Zellen handelte, wurde ein möglichst kleines Volumen

von der angefärbten Zellsuspension auf einen Objektträger getropft. Nachdem die

Zellen abgesunken waren, konnte etwas PBS hinzugefügt werden, um ein

Austrocknen der Zellen während des Mikroskopierens zu verhindern. Trockneten die

Zellen ein, so war eine konfokalmikroskopische Betrachtung über verschiedene

Ebenen nicht mehr möglich, da sie sich nun nicht mehr als runde, sondern als ovale,

stark abgeplattete Strukturen zeigten. Ähnliche Beobachtungen ergaben sich auch

für Cytospins oder mit unterschiedlichen Substanzen eingedeckelte Zellen.

In verschiedenen Doppelfärbungen wurden SNARE-Proteine als vesikel- oder

plasmamembranständige Strukturen nachgewiesen. SNAP-23 zeigte eine deutliche

membranständige Färbung, während sich VAMP-7 vorwiegend im Zellinneren befand

und scheinbar vermehrt in der Nähe des Zellkerns vorlag. Des Weiteren war eine

Darstellung des Syntaxin-4 an der Plasmamembran, sowie eine cytoplasmatische

Färbung von VAMP-3 möglich. Auch weitere Vertreter der VAMP-Familie wurden

untersucht, wobei eine Kernfärbung mit To-Pro 3 zur besseren Lokalisierbarkeit der

SNARE-Isoformen erfolgte. In einer Doppelfärbung mit dem

plasmamembranständigen Syntaxin-3 wurde VAMP-7 nochmals dargestellt. Es

zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung des SNARE-Proteine im Zellinnneren. Die

BoNT-B Zielstruktur VAMP-2, die bereits im Western Blot nur durch Verwendung

eines polyklonalen Antikörpers (pAk) darzustellen war, konnte in der

Ergebnisse

60

Immunfluoreszenz weder durch den monoklonalen noch den polyklonalen Antikörper

aufgezeigt werden. Darstellung der Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopischen

Bilder in Abbildung 10 A-I.

3.3.2 VAMP-7 transloziert während der Exozytose

Die Lage der verschiedenen SNARE-Proteine wurde nicht nur im Ruhezustand,

sondern auch nach einstündiger PMA/Ionomycin-Stimulation untersucht. Dadurch

sollte gezeigt werden, ob bestimmte SNARE-Isoformen während der Exozytose ihre

Lage wechseln, womit ein Hinweis auf ihre Beteiligung an den stattfindenden

Membranfusionen gegeben wäre. Bis auf VAMP-7 behielten alle untersuchten

SNARE-Proteine (s. Kap. 3.3.1) ihre jeweilige Position bei. Nach Aktvierung der

Mastzellen kam es zu einer Translokation des cytoplasmatisch gelegenen VAMP-7

zur Zellperipherie hin. Somit lagen in stimulierten Mastzellen die SNARE-Isoformen

SNAP-23, VAMP-7, Syntaxin-3 und –4 nach Stimulation an der Plasmamembran vor.

Darstellung der Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopischen Bilder nach Stimulation

in Abbildung 10 D * - I*.

Ergebnisse

61

Abb. 10: Darstellung der intrazellulär gelegenen t- und v-SNAREs durch

Immunfluoreszenz an Mastzellen. Gezeigt werden konfokalmikroskopische

Aufnahmen aus der Zellmitte.

D E F

D * E * F *

G H I

G * H * I *

A B C

Ergebnisse

62

zu Abb. 10: A Syntaxin-4; B VAMP-3; C Syntaxin-4/ VAMP-3 (grün/rot); D VAMP-7,

E SNAP-23, F VAMP-7/ SNAP-23 (grün/rot); G-I Zellkerne mittels nukleärem Marker

To-Pro 3 dargestellt (blau) ; G VAMP-7; H Syntaxin-3; I VAMP-7/Synatxin-3 (grün/rot)

Mit * markierte Abbildungen wurden ihrer Bezeichnung entsprechend angefärbt ,

sind aber vorher noch mit PMA/Ionomycin stimuliert worden

3.3.3 Die Inhibition des SNARE-Proteins VAMP-7 bewirkt eine

Degranulationshemmung

Mit der durch Immunfluoreszenz gezeigten Translokation von VAMP-7 nach

Stimulation war ein Hinweis für die Beteiligung diese SNARE-Proteins an

Exozytoseprozessen gegeben. Eine nähere Analyse mittels spezifischer, Antikörper-

vermittelter Inhibition schloss sich zur Klärung der Bedeutung von VAMP-7 an.

Obwohl VAMP-2 in den funktionell den Mastzellen ähnelnden eosinophilen

Granulozyten eine wichtige Rolle spielt, konnte es in der Immunfluoreszenz mittels

eines monoklonalen Antikörpers nicht angefärbt werden. Somit kann angenommen

werden, dass in den humanen Mastzellen kein VAMP-2 vorhanden ist, an das der

Antikörper hätte binden können. Daher diente der anti-VAMP-2 Antikörper als

Kontrolle. Zur Darstellung des Releases nach VAMP-2 bzw. VAMP-7 Inhibition

wurden die für SLO erhaltenen Werte als 100 % gesetzt. Im weiteren Ablauf wurden

zunächst die Zellwände der Mastzellen durch eine SLO-Behandlung so weit

permeabilisiert, dass spezifische Antikörper eingeschleust werden konnten, um

intrazellulär gelegene SNARE-Proteine zu blockieren (Abb.11). Etwa 60-80 % der

Zellen waren zum Zeitpunkt der Antikörper-Einschleusung permeabilisiert. Nach dem

Verschluss der Poren durch Zugabe von calciumhaltigem Medium und Inkubation auf

Eis, wurden die Mastzellen mit 22E7 stimuliert. Mit einem spezifischen Antikörper

gegen VAMP-7 behandelte Mastzellen konnten zwar noch Histamin freisetzen, doch

war dabei die Degranulation, verglichen mit der Sekretionsfähigkeit der

Negativkontrolle (anti-VAMP-2), um 54,7 ± 15,5 % vermindert. Eine

Sekretionshemmung durch die VAMP-7-Inhibition konnte auch im Vergleich zur

alleinigen SLO-Behandlung festgestellt werden. Die Reduktion des Releases betrug

hierbei 38,6 ± 28,0 %.

Ergebnisse

63

Abb. 11: Durch Blockade des SNARE-Proteins VAMP-7 wird die Mastzell-

Exozytose gehemmt. Die Mittelwerte (± Standardabweichung) resultieren aus n = 3

Experimenten. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml

eingesetzt. Während der Permeabilisierung mit SLO (10 µg/ml) wurden die

Antikörper hinzugefügt (anti-VAMP-2 (mAk), 1:250; anti-VAMP-7 (mAk), 1:250). Nach

dem Verschluß der Poren wurden die Zellen mit 22E7 (100 ng/ml) stimuliert. Für jede

Bedingung erfolgte die Messung des gespeicherten, präformierten Histamins, sowie

der basalen, ohne die Stimulation stattfindenden und der durch 22E7 induzierten

Histaminfreisetzung

p < 0,01

SLO

SLO + a

nti-VAM

P-2

SLO + a

nti-VAM

P-7

0

25

50

75

100

125

150

175H

ista

min

frei

setz

un

gn

ach

An

tikö

rper

beh

and

lun

g(%

)

p = 0,02

Diskussion

64

4. Diskussion

4.1 Expression von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen

SNARE-Proteine wurden als Vermittler grundlegender Prozesse der

Membranfusionen in Neuronen und anderen sekretorisch aktiven Zellen, wie

Mastzellen und weiteren Zellen des Immunsystems, nachgewiesen. Vor allem

zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen zeigten sich deutliche

Unterschiede im Expressionsmuster der einzelnen SNARE-Isoformen. Bisher gibt es

wenige Daten über die SNARE-Expression in Mastzellen, wobei die meisten

Kenntnisse anhand der leukämischen Rattenmastzelllinie RBL-2H3 gewonnen

wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Mastzellen verwendet,

die bislang nicht unter dem Aspekt der SNARE-Protein vermittelten Exozytose

untersucht worden sind.

Zu den zentralen Vorgängen, die während der Exozytose ablaufen, gehört die

Anlagerung von drei SNARE-Proteinen zum „core“-Komplex, der die Membranfusion

energetisch begünstigt. Je ein Vertreter der SNAP-, Syntaxin-, oder VAMP-Familie ist

beteiligt. Von Neuronen ist bekannt, dass es sich dabei um SNAP-25, Syntaxin-1 und

VAMP-2 handelt [79]. Diese SNARE-Proteine konnten nicht eindeutig in humanen

Mastzellen nachgewiesen werden. Dabei waren die neuronalen Isoformen SNAP-25

und der Isotyp 1A von Syntaxin weder auf mRNA- noch auf Protein-Ebene

vorhanden. Syntaxin-1B konnte auf mRNA-Ebene, trotz starker Signale für die

Positivkontrolle MHH-NB-11, nicht detektiert werden, obwohl wiederholt positive

Ergebnisse auf Protein-Ebene erzielt wurden. Mittels RT-PCR konnte VAMP-2

detektiert werden. Dagegen wurden im Western Blot auch bei Verwendung eines

polyklonalen Antikörpers nur schwache Signale für VAMP-2 in humanen Mastzellen

gezeigt, während in der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 die Expression dieses

SNARE-Proteins bereits bestätigt wurde [94]. Obwohl die den neuronalen „core“-

Komplex bildenden Isotypen nicht nachzuweisen waren, konnten verschiedene

andere, möglicherweise Exozytose-vermittelnde SNARE-Proteine, in Mastzellen

dargestellt werden. Dazu wurden humane intestinale Mastzellen mit in vitro

entwickelten Mastzellen aus Nabelschnurblut (CBMC) und der Mastzellinie HMC-1,

Diskussion

65

sowie aus menschlichem Blut isolierten eosinophilen Ganulozyten, als weiteren

Vertreter sekretorisch aktiver Immunzellen, auf mRNA-Ebene verglichen. Die

SNARE-Proteine SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –6 sowie VAMP-3, -5, -7 und –8

konnten in allen untersuchten Zellen detektiert werden. Diese Ergebnisse bestätigten

sich für humane Mastzellen auch im Western Blot auf Protein-Ebene. Die Beteiligung

dieser SNARE-Isoformen an Exozytose-Vorgängen, außer für VAMP-5, ließ sich

bereits an verschiedenen Zellen, darunter auch RBL-2H3-Zellen, zeigen [96]. Bis auf

das zusätzlich vorhandene Syntaxin-1 und VAMP-2 entspricht das

Expressionsmuster der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 humanen Mastzellen. In

eosinophilen Granulozyten, die den Mastzellen funktionell sehr ähneln – beides sind

sekretorisch aktive Zellen des Immunsystems - konnte die Expression von SNAP-23,

Syntaxin-3 und –4 sowie VAMP-1 und –2 nachgewiesen werden [138;139]. So

unterscheiden sich humane Mastzellen in ihrem SNARE-Expressionsmuster nicht nur

von neuronalen Zellen, sondern auch von RBL-2H3-Zellen, die bislang als Mastzell-

Modell dienten und von den funktionell nahestehenden eosinophilen Granulozyten.

4.2 Hemmung der Mastzelldegranulation durch Botulinum Neurotoxin

Um nun durch Spaltung und damit Inaktivierung zu zeigen, ob und welche SNARE-

Isotypen für die Exozytose-Vorgänge in Mastzellen notwendig sind, wurden die

Mastzellen mit verschiedenen SNARE-spezifischen Proteasen behandelt. Somit wäre

auch ein therapeutischer Ansatz für die Behandlung mastzellbedingter allergischer

Symptome gegeben, die zum großen Teil durch den ausgeschütteten Mediator

Histamin verursacht werden. Als ein nützliches Hilfsmittel zur Analyse der Bedeutung

der SNARE-Proteine für Degranulationvorgänge erwies sich Botulinum Neurotoxin,

das in Neuronen durch SNARE-Spaltung die Exozytose hemmt. Dabei sind die

bakteriellen Proteasen (Toxine) spezifisch für die jeweiligen SNARE-Subtypen.

Neurotoxine, die von verschiedenen Serotypen der Clostridien gebildet werden,

spalten verschiedene SNARE-Isoformen. Bisherige Erkenntnisse über Expression

und Funktion der SNARE-Proteine, sowie ihre Spaltung durch Neurotoxine, beruhen

größtenteils auf Untersuchungen an Neuronen. Dabei stellte sich heraus, dass

SNAP-25 durch BoNT-A, VAMP-1, -2 (Synaptobrevin) und –3 (Cellubrevin) durch

Diskussion

66

BoNT-B und SNAP-25, als auch Syntaxin-1A, -1B und –2 durch BoNT-C gespalten

werden [121;140;141]. Im Gegensatz dazu erwiesen sich VAMP-7 und VAMP-8 als

Neurotoxin-resistent [96;140]. Eine Hemmung der Exozytose durch SNARE-

spezifische Spaltung mit den verschiedenen BoNT-Isotypen konnte nicht nur in

Neuronen nachgewiesen werden, sondern auch in verschiedenen anderen

sekretorisch aktiven Zellen - unter anderem in azinösen Zellen der Ohrspeicheldrüse,

chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks oder beta-Zellen des Pankreas [142-

144]. Dabei sind vor allem SNAP-25, VAMP-2 und Syntaxin-1 als Zielstrukturen von

Botulinum Neurotoxin von Bedeutung. Zur Untersuchung der SNARE-Abhängigkeit

der Mastzelldegranulation kamen Botulinum Neurotoxin Typ A, B und C zum Einsatz.

Botulinum Neurotoxine binden aufgrund ihrer schweren Kette spezifisch an

Neuronen, in denen sie sich nach rezeptorspezifischer Endozytose anreichern. Um

den Einfluss des proteolytisch wirksamen Anteils des Toxins auf Mastzellen zu

untersuchen, wurden in mehreren Vorversuchen verschiedene Möglichkeiten zur

Einschleusung der Botulinum Neurotoxin-Leichtketten getestet.

Nach vorhergehender Gangliosidbeladung sind chromaffinen Zellen in der Lage,

das eigentlich streng neurotrope BoNT-A aufzunehmen [145]. Obwohl dieses

Verfahren bei verschiedenen Zellkulturen erfolgreich war, sorgte die

Gangliosidmischung bei den primären humanen Mastzellen zu einem vorzeitigen

Absterben der Zellkulturen, wie Vorversuche von L. Sander et A. Lorentz

(unpublizierte Daten) zeigten. Dabei konnte eine konzentrations- und zeitabhängige

Toxizität in entsprechenden Versuchsreihen nachgewiesen werden. Auch die

leukämische Mastzelllinie HMC-1, die üblicherweise eine starke Proliferationstendenz

aufweist, starb nach Inkubation mit den Gangliosiden ab.

Eine alternative Methode zur Einschleusung der Toxine bestand in der

Elektroporation. Die Anwendung dieses Verfahrens für primäre humane Mastzellen

wurde von L. Sander et A. Lorentz getestet. Durch Anlegen einer elektrischen

Spannung für wenige ms entstehen kurzfristig große Poren in der Zellmembran,

durch die Toxine aus dem Medium in die Zellen eindringen können. Es zeigte sich,

dass ein großer Teil der eingesetzten Mastzellen in den ersten Tagen nach der

Elektroporation starb. Erste Experimente mit BoNT-A , -B und –C unter Verwendung

einer Spannung, bei der ca. 30-50 % der Mastzellen überlebten, konnten keine

eindeutigen Ergebnisse bezüglich eines Effekts auf die Histaminfreisetzung aus den

Diskussion

67

Mastzellen liefern. Als zusätzliche Kontrolle wurde die Wirkung von Tetanus

Neurotoxin untersucht, das dieselben Zielstrukturen wie BoNT-B besitzt. Weder

durch Elektroporation der Zellen mit Fluoreszenz-markierten Proteinen und

anschließender Betrachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop noch mittels

Durchflußzytometrie konnte die Proteinaufnahme in die Zellen eindeutig

nachgewiesen werden. Auch nach Elektroporation mit 125I-markiertem Tetanus Toxin

(aus Clostridium Tetani, ein Protein mit etwa dem gleichen Molekulargewicht wie

Botulinum Neurotoxin) gelang kein eindeutiger Nachweis, da ein Anhaften der

Radioaktivität an die Zelltrümmer nicht auszuschließen war. Obwohl die Toxine in

einigen Experimenten scheinbar eine sekretionsinhibierende Wirkung ausübten,

konnten diese Daten aufgrund der auftretenden Zelllyse und der zum Teil geringen

Histaminfreisetzung nicht zufriedenstellend reproduziert werden.

Elektrophysiologische Experimente mittels Patch Clamp-Technik sollten dieses

Problem umgehen, indem über Membranströme die Degranulationsfähigkeit

einzelner toxinbehandelter Zellen untersucht wurde. Jedoch blieb die Zellmembran

bei dieser Methode nicht lange genug intakt, um die notwendigen Messungen

durchzuführen. Nach etwa 5 min gab die Membran nach und die Messungen konnten

nicht weitergeführt werden.

Nachdem das Einschleusen der proteolytisch aktiven Anteile der Botulinum

Neurotoxine mittels Gangliosiden, Elektroporation und Patch Clamp-Technik nicht

möglich war, wurden in einem weiteren Ansatz Adenoviren verwendet. Adenovirale

Vektoren sind als eines der effektivsten Behelfsmittel, Fremd-DNA in Säugetierzellen

zu bringen, in der Lage, ein breites Spektrum von verschiedenen Zellen zu infizieren.

Dazu gehören sowohl sich teilende als auch ruhende Zellen - Primärzellen konnten

ebenfalls erfolgreich transduziert werden [146]. Mittels adenoviraler Vektoren sollten

die betreffenden Gene nun in primäre humane Mastzellen eingeschleust und

anschließend exprimiert werden. Nachdem die Gene für die Leichtketten von BoNT-

A, -B und –C in einen kleinen Shuttle Vektor kloniert wurden, erfolgte unter

Verwendung des Systems nach He et al. eine Rekombination des konstruierten

Plasmids mit dem adenoviralen Backbone AdEasy-1 [136]. Die Generierung von

viralen Partikeln fand in Packungszellen (HEK 293) statt, die fehlende Faktoren des

adenoviralen Vektors transkomplementierten. Die Expression der Botulinum

Neurotoxin-Leichtketten in den Mastzellen sollte mittels der GFP-Signale der

Diskussion

68

jeweiligen Klone angezeigt werden. Obwohl die Klone alle unterschiedlich hohe GFP-

Signale aufwiesen, konnte anhand der starken GFP-Expression des Kontrollvirus

AdGFP stellvertetend für alle Viren die Infektionsrate abgeschätzt werden [137].

Nachdem die Gene für die proteolytisch wirksamen Leichtketten von BoNT-A, -B

und –C über adenovirale Vektoren in die Mastzellen eingeschleust und anschließend

exprimiert wurden, zeigte sich auch hier eine Senkung der Sekretionsfähigkeit. Dabei

wurde die Mastzelldegranulation durch BoNT-B um 24,6 ± 23,0 % und BoNT-C um

31,4 ± 25,7 % nach Stimulation mit PMA/Ionomycin gesenkt. Ein Effekt für BoNT-A

war nicht nachweisbar. Die Resistenz der Mastzellen gegenüber einer Behandlung

mit BoNT-A lässt sich durch das Fehlen des Substrates SNAP-25 erklären.

Verschiedene SNARE-Proteine werden, wie bereits aufgeführt, in Mastzellen

exprimiert und könnten als Substrate für BoNT-B und –C dienen. Welche SNARE-

Isoformen die Zielstrukturen in Mastzellen darstellen, lässt sich nicht genau sagen.

Da die beiden Neurotoxin Subtypen BoNT-B und -C die Exozytose der Mastzellen

hemmen, scheinen sie bestimmte SNARE-Proteine zu spalten. Die Spaltung von

VAMP, vor allem für die in Neuronen vorkommenden Isoformen VAMP-1 und –2,

aber auch für das ubiquitär exprimierte VAMP-3 (Cellubrevin) konnte für BoNT-B

aufgezeigt werden [140]. Außerdem gelang mittels Tetanus-Toxin eine

Degranulationshemmung in eosinophilen Granulozyten durch VAMP-2-Spaltung

[135]. Eine solche Beteiligung von VAMP-2 scheint in Mastzellen eher

unwahrscheinlich zu sein, da es in der Immunfluoreszenz aufgrund fehlender

Bindungstellen für den spezifischen Antikörper nicht dargestellt werden konnte. So

wäre die Proteolyse des BoNT-B-sensitiven VAMP-3 möglich, während die

Neurotoxin-resistenten Isotypen VAMP-7 und –8 eher keine Bedeutung als BoNT-B-

Substrate haben sollten. Auch VAMP–5 könnte als Zielstruktur eine Rolle spielen.

SNAP-25 und Sxyntaxin-1A, -1B und –2 dienen BoNT-C als Substrate, jedoch

konnten die SNARE-Proteine SNAP-25 und Syntaxin-1A in Mastzellen nicht

nachgewiesen werden, während sich für Syntaxin-1B unterschiedliche Ergebnisse

zeigten. Da im Western-Blot nur eine schwache Expression für Syntaxin-1B detektiert

werden konnten, wäre es möglich, dass die mRNA-Signale zu schwach waren, um

mit der angewandten Methode nachgewiesen zu werden. Auch Syntaxin-2, -3, -4

oder –6 könnten beteiligt sein. Obwohl nicht genau gezeigt werden kann, welche

SNARE-Isoformen für die Mastzellexozytose von unmittelbarer Bedeutung sind und

Diskussion

69

gleichzeitig als Botulinum Neurotoxin-Substrate dienen, lassen sich doch einige

potentielle Kandidaten darstellen, die auch in der Exozytose von Rattenmastzellen

beteiligt sind (vgl. Kapitel 4.1). Außerdem senken BoNT-B und BoNT-C die

Sekretionsfähigkeit in Mastzellen zwar um über 20 Prozent, aber eine vollkommene

Hemmung konnte nicht erzielt werden. Dies könnte darin begründet sein, dass die

Stimulationsexperimente schon etwa zwei Tage nach Infektion stattfanden, als der

zytotoxische Effekt der Viren, erkennbar am Zelltod, noch nicht auftrat. Der gewählte

Zeitraum von zwei Tagen könnte zu kurz gewesen sein, um die Toxine in

ausreichenden Mengen zu produzieren und anschließend die jeweiligen SNARE-

Proteine zu spalten. Des Weiteren waren zum Zeitpunkt der Experimente nur etwa

50-60% der Zellen transfiziert. Die nicht-infizierten Zellen sind in ihrer

Sekretionsfähigkeit nicht beeinträchtigt und tragen somit zum recht hohen

Histaminrelease bei. Denkbar wären auch zusätzliche, teilweise kompensierende

Exozytose-Vorgänge, die durch BoNT-resistente SNARE-Proteine vermittelt werden

oder gänzlich SNARE-unabhängig ablaufen. Außerdem entfalten Botulinum

Neurotoxine ihre proteolytische Aktivität nur an unkomplexiert vorliegenden SNARE-

Proteinen [147]. In verschiedenen Zellen liegen Vesikel als Reserve für eine schnelle

Sekretion bereits der Plasmamembran an [59]. Falls dies auch in Mastzellen der

Fall ist und die SNARE-Proteine der aneinander liegenden Membranen bereits

Komplexe gebildet haben, könnten die Neurotoxin-Behandlung die Exozytose dieser

Vesikel nicht verhindern.

Interessanterweise ließ sich eine Degranulationshemmung nur nach Stimulation

mit PMA/Ionomycin darstellen. Eine solche Senkung der Histaminfreisetzung war

nicht aufzuzeigen, wenn eine Aktivierung durch eine 22E7-bedingte Kreuzvernetzung

der IgE-Rezeptoren erfolgte. Da die Histaminfreisetzung nach 22E7-Stimulation

insgesamt auf einem weit tieferen Niveau stattfand, könnte der Release zu niedrig

gewesen sein, um die hemmenden Effekte der Neurotoxine aufzuzeigen.

4.3 Bedeutung von VAMP-7 für die Mastzelldegranulation

Eine Reihe verschiedener Zellen weist bestimmte SNARE-Proteine auf, die an

Membranen spezieller Kompartimente gebunden sind. Dies deutet darauf hin, dass

Diskussion

70

spezifische SNARE-Komplexbildungen die Richtung der Membranfusionen

regulieren [148], wobei die Lage der jeweiligen SNARE-Proteine von Bedeutung ist.

Während die VAMP-Isotypen an den Membranen verschiedener Kompartimente im

Zellinneren sitzen, liegen die Syntaxine und SNAP-25/-23 an der Plasmamembran.

Mittels Immunfluoreszenz ließ sich diese Einteilung auch für die in Mastzellen

untersuchten SNARE-Proteine bestätigen. So lagen SNAP-23 sowie Syntaxin-3 und

–4 an der Plasmamembran vor, während VAMP-7 und –3 in den Membranen

zytoplasmatischer Vesikel lokalisiert waren. Neben den SNARE-Proteinen SNAP-25,

VAMP-2 und Syntaxin-1, die den neuronalen SNARE-Komplex bilden, sind auch

andere Vertreter der drei SNARE-Familien in der Lage, miteinander in Kontakt zu

treten. Dabei müssen nicht immer die gleichen Partner interagieren. So konnte in

RBL-2H3-Zellen gezeigt werden, dass Syntaxin-4 mit SNAP-23 und verschiedenen

VAMP-Isoformen, außer mit VAMP-7, Komplexe bilden kann [96]. In Normal Rat

Kidney-Zellen (NRK cells) wiederum bildet Syntaxin-4 zusammen mit VAMP-7 und

SNAP-23 SNARE-Komplexe [149]. Abhängig von der Zellart und der Richtung der

Membranfusion scheinen unterschiedliche SNARE-Proteine in grundlegende

Prozesse der Exozytose involviert zu sein. Die große Vielfalt der möglichen SNARE-

Komplexbildungen in RBL-2H3-Zellen lässt eine ähnliche Varianz auch für

Mastzellen vermuten. Potentielle SNARE-Komplexbildner für humane Mastzellen

wurden bereits dargestellt, sollten aber näher untersucht werden.

Während sich VAMP-2 in humanen Mastzellen nicht durch Immunfluoreszenz

zeigen ließ, ergab sich anhand des Isotypen VAMP-7 ein Hinweis auf die Beteiligung

von SNARE-Proteinen an der Mastzellexozytose. Nachdem die Mastzellen stimuliert

wurden, um eine Membranfusion im Rahmen der Exozytose zu erreichen, wanderte

das in der Vesikelmembran liegende VAMP-7 vom Zytoplasma in Richtung

Zelloberfläche. Der für VAMP-7 gezeigte Postionswechsel nach Stimulation weist auf

eine Beteiligung an Degranulationsprozessen in Mastzellen hin. Auch in RBL-2H3

Zellen erfolgt eine solche Translokation von VAMP-7 [100]. Das translozierte

VAMP-7 lag zusammen mit SNAP-23 an der Plasmamembran vor. Während

Syntaxin-4 in RBL-2H3-Zellen keine Komplexe mit VAMP-7 bildet, ist nicht

auszuschließen, dass andere Syntaxine als Vertreter der dritten SNARE-Familie

dazu durchaus in der Lage sind. So wäre etwa ein Komplex, bestehend aus VAMP-7,

SNAP-23 und Syntaxin-3, dessen plasmamembranständige Position nachgewiesen

Diskussion

71

wurde, denkbar. Die für VAMP-7 gezeigte Lageveränderung konnte für andere

SNARE-Isoformen, wie das ebenfalls im Zellinneren gelegene und bestimmte

Membranfusionen vermittelnde VAMP-3/ Cellubrevin [150], nicht dargestellt werden.

Ein weiterer Hinweis für die Bedeutung von Vamp-7 ist dessen Anteil an der späten

endosomalen Sekretion von Makrophagen, die nach Hemmung des SNARE-Proteins

sinkt [151].

Zur weiteren Klärung der Funktion von VAMP-7 in sekretorischen Prozessen der

Mastzellen wurde das Neurotoxin-resistente SNARE-Protein mittels spezifischer

Antikörper gehemmt. Durch eine SLO-Permeabilisierung, die aufgrund der

entstehenden Poren den Eintritt größerer Moleküle in die Mastzellen erlaubte,

konnten spezifische Antikörper gegen VAMP-7 und VAMP-2 eingeschleust werden.

Passend zu den bisherigen Befunden – VAMP-2 konnte in humanen Mastzellen

weder durch Western Blot noch durch Immunfluoreszenz zufriedenstellend

dargestellt werden – zeigte anti-VAMP-2 keine Effekte auf die Mastzellexozytose,

während das in cytoplasmatischen Vesikeln gelegene VAMP-2 in eosinophilen

Granulozyten von entscheidender Bedeutung für die Degranulation ist [137]. Daher

wurde der monoklonale anti-VAMP-2 Antikörper, der keine Bindungsstellen in den

humanen Mastzellen haben sollte, als Isotyp-Kontrolle verwendet. Dagegen wurde

durch anti-VAMP-7 eine Degranulationshemmung von 54,7 ± 15,5 % erreicht.

Obwohl nur etwa 60-80 % der untersuchten Zellen überhaupt permeabilisiert und

somit in der Lage waren, die spezifischen Antikörper aufzunehmen, ließ sich eine

hohe Hemmung der Exozytose nachweisen. Wahrscheinlich käme es zu einer

nahezu vollständigen Inhibition der Histaminfreisetzung, wenn alle Zellen

permeabilisiert wären. Aufgrund des Absterbens der Zellen durch zu hohe SLO-

Konzentrationen konnten nicht alle Zellen permeabilisiert und sämtliche VAMP-7-

Proteine blockiert werden. Gelänge dies, so wäre eine noch höhere Hemmung der

Histamin-Freisetzung denkbar. Außerdem ist es möglich, dass neben der VAMP-7

vermittelten Sekretion noch andere Vorgänge stattfinden, die ausgleichend eingreifen

können. Möglich wäre auch eine Kompensation des inhibierten VAMP-7 durch

andere VAMP-Isoypen, die ebenfalls einen zur Exozytose führenden SNARE-

Komplex bilden könnten, wie etwa das ebenfalls Neurotoxin-resistene VAMP-8 oder

das Neurotoxin-sensitive VAMP-3. Eine Beteiligung dieser beiden Isotypen an

Degranulationsvorgängen wird für RBL-2H3-Zellen angenommen. Die Bedeutung der

Diskussion

72

Neurotoxin-sensitiven SNARE-Proteine an der Mastzell-Exozytose konnte bereits

durch Botulinum Neurotoxin-vermittelte Spaltung gezeigt werden. Daher ist es

möglich, dass beide SNARE-Familien, sowohl die Neurotoxin-sensitiven als auch die

insensitiven, Membranfusionen vermitteln, die zur Sekretion führen

4.4 Ausblick

Ein großer Teil der Kenntnisse über Exozytose-Vorgänge und der dabei beteiligten

SNARE-Proteine beruht auf Untersuchungen an Neuronen, wobei deutliche

Unterschiede zu nicht-neuronalen, sekretorischen Zellen bestehen. Die Bedeutung

der SNARE-Isoformen für die Mastzellexozytose ist noch nicht hinreichend geklärt,

weshalb weitere ergänzende Analysen mit humanen Mastzellen durchgeführt werden

sollten. Dazu gehört die Untersuchung der Komplex-bildenden SNARE-Proteine. In

RBL-2H3-Zellen formt Syntaxin-4 als multifunktionales SNARE-Protein mit SNAP-23

und diversen VAMP-Isotypen unterschiedliche Komplexe. VAMP-7 ist dabei jedoch

nicht involviert. So bleibt zu klären, mit welchen SNARE-Proteinen VAMP-7 in

humanen Mastzellen Komplexe formt, da es hier allem Anschein nach während der

Exozytose Membranfusionen vermittelt. Außerdem sollte analysiert werden, welche

SNARE-Proteine in den Mastzellen durch die Botulinum Neurotoxine gespalten

werden und ob somit eine relevante Senkung der Histaminausschüttung erreicht

werden kann. Dazu sollte die Expression der Botulinum Neurotoxine durch den

viralen Ansatz optimiert werden. Die große Vielfalt der gefundenen SNARE-

Isoformen in Mastzellen, sowie die Tatsache, dass sowohl Neurotoxin-sensitive als

auch insensitiven SNARE-Proteine an entscheidenden Exozytosevorgängen in

Mastzellen beteiligt sind, lässt eine Komplexität der Prozesse vermuten, die zum

besseren Verständnis weiter untersucht werden muss. Dabei könnte die

Ausschaltung von SNARE-Isoformen durch spezifische siRNA behilflich sein, die

mittels adenoviraler Vektoren in die Zellen eingeschleust und anschließend

exprimiert wird. Bessere Kenntnisse über die Mastzelldegranulation und der dafür

essentiellen SNARE-Isoformen könnten die Basis für die Generierung neuer

Therapiestrategien bilden.

Zusammenfassung

73

5. Zusammenfassung

Mastzellen sind als Effektorzellen allergischer Reaktionen (Hypersensitivitätsreaktion

vom Typ I) in der Lage, nach Aktivierung innerhalb kurzer Zeit eine Vielzahl von

Mediatoren mittels Exozytose freizusetzen und dadurch verschiedene physiologische

und pathophysiologische Reaktionen des Organismus zu bewirken.

Die exozytotischen Prozesse eukaryoter Zellen werden durch die Interaktion

sogenannter SNARE-Proteine reguliert, die zuerst als Vermittler der neuronalen

Membranfusion beschrieben worden, aber auch an der Degranulation von

Immunzellen beteiligt sind. Bisher gibt es wenige Daten über die Expression und

Funktion der verschiedenen SNARE-Isoformen in Mastzellen, wobei die meisten

Kenntnisse anhand der leukämischen Rattenmastzelllinie RBL-2H3 gewonnen

wurden. In der vorliegenden Arbeit erfolgten die Untersuchungen an primären

humanen Mastzellen, die bislang nicht unter dem Aspekt der SNARE-Protein-

vermittelten Exozytose analysiert worden sind.

Mittels quantitativer RT-PCR und Western Blot zeigte sich, dass humane

Mastzellen die SNARE-Isoformen SNAP-23, Syntaxin-2, -3, -4 und –6, sowie VAMP-

3, -5, -7 und –8 exprimieren. Unterschiede in der SNARE-Expression zeigten sich im

Vergleich humaner Mastzellen zu der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 und zu den

funktionell ähnlichen eosinophilen Granulozyten. In Eosinophilen konnte VAMP-2

durch Immunfluoreszenz dargestellt werden, während ein solcher Nachweis in

Mastzellen nicht gelang.

SNARE-Proteine stellen Substrate für Botulinum Neurotoxine dar, wobei

verschiedene Isotypen spezifisch für bestimmte SNARE-Subtypen sind. Nachdem

verschiedene Ansätze, wie Gangliosidbehandlung, Elektroporation und Patch-

Clamp-Technik, zur Einschleusung der Neurotoxine nicht zum Erfolg führten, wurde

in dieser Arbeit ein adenovirales System zur Expression der Botulinum Neurotoxine

Typ A, B und C in humanen Mastzellen verwendet. Zunächst wurden die

gewünschten Gene in einen kleinen Shuttle Vektor kloniert und mit einem

adenoviralen Backbone Vektor rekombiniert. In permissiven Zellen erfolgte

anschließend die Generierung von viralen Partikeln, die zur Transduktion primärer

humaner Mastzellen verwendet wurden. Nach adenoviraler Infektion und

Zusammenfassung

74

anschließender Expression der Neurotoxine zeigte sich eine

Degranulationshemmung für BoNT-B und –C, während eine Behandlung mit BoNT-A

die Mastzellexozytose unbeeinflusst ließ.

Im weiteren Verlauf gelang eine Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopische

Darstellung der an der Zellmembran gelegenen SNARE-Proteine SNAP-23,

Syntaxin-3 und –4 sowie der zytoplasmatischen Lokalistion von VAMP-3 und –7.

Dabei zeigte sich nach Stimulation eine Translokation des Neurotoxin-resistenten

VAMP-7 vom Zellinneren zur –peripherie. Dort lag es in Colokalisation zu

plasmamembranständigen SNARE-Isoformen, wie SNAP-23, Syntaxin-3 und –4, vor.

Zur funktionellen Analyse der Bedeutung von VAMP-7 für die Mastzellexozytose

wurden anti-VAMP-7 Antikörper in SLO-permeabilisierte Zellen eingeschleust. Dabei

zeigte sich eine deutliche Exozytosehemmnung von über 50 % für VAMP-7 inhibierte

Zellen, wobei nur etwa 70 % der Zellen permeabilisiert waren.

Zusammenfassend stellt die vorliegende Studie dar, dass komplexe Prozesse, an

denen sowohl BoNT-sensitive als auch -insensitive SNARE-Proteine beteiligt sind,

die Membranfusionen in Mastzellen vermitteln.

Literaturverzeichnis

75

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(143) Knight DE. Botulinum toxin types A, B and D inhibit catecholamine secretion from bovine adrenal medullary cells. FEBS Letters 1986; 207(2):222-226.

(144) Lang J, H.Zhang, V.V.Vaidyanathan, K.Sadoul, H.Niemann, C.B.Wollheim. 1997. Transient expression of botulinum neurotoxin C1 light chain differentially inhibits calcium and glucose induced insulin secretion in clonal [beta]-cells. FEBS Letters; 419(1):13-17.

(145) Bartels F, H.Bergel, H.Bigalke, J.Frevert, J.Halpern, J.Middlebrook. 1994. Specific Antibodies against the Zn2+-binding Domain of Clostridial Neurotoxins Restore Exocytosis in Chromaffin Cells Treated with Tetanus or Botulinum A Neurotoxin. Journal of Biological Chemistry 269(11), 8122-8127.


86

(146) Massie B, F.Couture, L.Lamoureux, D.D.Mosser, C.Guilbault, P.Jolicoeur, F.Belanger, Y.Langelier. 1998. Inducible Overexpression of a Toxic Protein by an Adenovirus Vector with a Tetracycline-Regulatable Expression Cassette. J Virol; 72(3):2289-2296.

(147) Pellegrini LL, V.O'Connor, F.Lottspeichl, H.Betz. 1995. Clostridial neurotoxins compromise the stability of a low energy SNARE complex mediating NSF activation of synaptic vesicle fusion. The EMBO Journal 14 (19), 4705-4713.

(148) Scales SJ, J.B.Bock, R.H.Scheller. 2000. Cell biology: The specifics of

membrane fusion. Nature; 407(6801):144-146.

(149) Rao SK, C.Huynh, V.Proux-Gillardeaux, T.Galli, N.W.Andrews. 2004. Identification of SNAREs Involved in Synaptotagmin VII-regulated Lysosomal Exocytosis. J Biol Chem; 279(19):20471-20479.

(150) Proux-Gillardeaux V, R.Rudge, T.Galli. 2005. The Tetanus Neurotoxin-Sensitive and Insensitive Routes to and from the Plasma Membrane: Fast and Slow Pathways? Traffic 6, 366-373.

(151) Braun V, V.Fraisier, G.Raposo, I.Hurbain, J.B.Sibarita, P.Chavrier, T.Galli, F.Niedergang. 2004. TI-VAMP/VAMP7 is required for optimal phagocytosis of opsonised particles in macrophages. The EMBO Journal 23, 4166-4176.

Danksagung

87

7. Danksagung

Mein vornehmlicher Dank gilt Herrn Professor Michael P. Manns für die

Bereitstellung von Laborflächen und Arbeitsgeräten und die Unterstützung des

Projekts.

Besonders möchte ich mich bei Herrn Professor Stephan C. Bischoff bedanken,

der die vorliegende Disseration betreut und ermöglicht hat.

Des Weiteren danke ich Herrn Dr. Axel Lorentz für die wissenschaftliche

Betreuung und Einführung in wichtige Arbeitsmethoden, sowie für die konstruktiv-

kritische Durchsicht der Arbeit.

Auch Herrn Leif Sander möchte ich danken für die Vorarbeiten in diesem Projekt,

sowie die vielen Anregungen und seine selbstverständliche Diskussionsbereitschaft.

Außerdem danke ich den Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn Professor

Kubicka, und Herrn Dr. Florian Kühnel im Besonderen, für ihre freundliche

Unterstützung beim Erlernen viraler Arbeitsmethoden und ihre selbstverständliche

Diskussionsbereitschaft.

Des Weiteren danke ich Herrn Professor Hans Bigalke der Abteilung für

Toxikologie, des Instituts Pharmakologie und Toxikologie, sowie Herrn Dr. Volker

Specht von der Firma Biotecon, Potsdam und Herrn Dr. Florian Wegner von der

Neurologischen Klinik der Universität Leipzig für ihre freundliche Unterstützung und

Anregungen beim experimentellen Teil meiner Arbeit.

Außerdem danke ich Herrn Tibor Veres vom Frauenhofer-Institut für Toxikologie

und experimentelle Medizin, Abteilung Allergologie und Immunologie für seine

freundliche Hilfe beim Erstellen der konfokalmikroskopischen Bilder. Herrn Dr. Tierry

Galli am INSERM, Paris danke ich für die freundliche Überlassung des anti-VAMP-7

Antikörpers.

Ich möchte auch den Mitarbeitern der Abteilung für Viszeral- und Transplantations-

chirurgie der Medizinischen Hochschule unter Leitung von Herrn Professor Jürgen

Klempnauer ausdrücklich für die gute Zusammenarbeit danken.

Einen großen Dank möchte ich den gegenwärtigen und ehemaligen Mitgliedern

unserer Arbeitsgruppe aussprechen. Hervorheben möchte ich die sehr gute

Danksagung

88

Arbeitsatmosphäre, Unterstützung und Zusammenarbeit - auch außerhalb der

Laborarbeit.

Nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Freunden für ihre motivierende und

moralische Unterstützung bedanken.

Meiner Familie und besonders meinem Vater danke ich für die langjährige finanzielle

und moralische Unterstützung meines Studiums und meiner Dissertation. Deswegen

möchte ich die Doktorarbeit meiner Familie widmen.

Lebenslauf

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8. Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Seza Bolat

Geburtsdatum/-ort: 29.04.1981 in Constanta (RO)

Wohnort: Rautenstrasse 4, 30171 Hannover

Familienstand: ledig

Schulbildung

1987- Einschulung, Celle

2000 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife, Celle

Hochschulausbildung

2000 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der

Medizinischen Hochschule Hannover (MHH)

2002 Ärztliche Vorprüfung

2003 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2006 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2006-2007 Praktisches Jahr am Klinikum Braunschweig,

Universitätsklinikum Kapstadt, Südafrika,

Medizinische Hochschule Hanover

Mai 2007 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Berufliche Tätigkeiten

seit Juni 2007 Assistentärztin an der Medizinischen Hochschule

Hannover, Abteilung Neurologie

Hannover, den 28. Februar 2008

Seza Bolat

9. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO

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9. Erklärung nach §2 Abs. 2 Nr. 5 und 6 PromO

Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion

eingereichte Dissertation mit dem Titel

„Expression und Funktion von SNARE-Proteinen in humanen intestinalen Mastzellen“

in der Abteilung Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der

Medizinischen Hochschule Hannover

unter der Betreuung von Professor Dr. med. S. C. Bischoff

ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine

anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe diese

Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion

eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel noch nicht

erworben habe.

Hannover, den 28. Februar 2008

Seza Bolat

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