Fachtheorie nach Lernfeldern für Chemielaboranten – Teil 3

Biochemische und mikrobiologische Inhalte3. und 4. Ausbildungsjahr

Angelika Janß

Lösungen

Best.-Nr. 1625Holland + Josenhans Verlag Stuttgart

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1. Aufl age 2013

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ISBN: 978-3-7782-1625-5

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3

1. Zellen von

Tieren Pfl anzen Pilzen Bakterien

Zellmembran Zellmembran Zellmembran Zellmembran

Zellkern Zellkern Zellkern –

– Zellwand aus Cellulose Zellwand aus Chitin Zellwand aus Murein

Mitochondrien Mitochondrien Mitochondrien –

– Chloroplasten – –

Ribosomen Ribosomen Ribosomen Ribosomen

2. Mitochondrien: Zellatmung, Energiegewinnung

Chloroplasten: Fotosynthese

Ribosomen: Proteinbiosynthese

3. Proteine: Peptidbindung (Carbonsäureamid)

Fette: Carbonsäureester, olefi nische Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren

Polysaccharide: primäre und sekundäre alkoholische OH-GruppenHalbacetalgruppe im Ring der MonosaccharideinheitenAcetal (Etherbrücke) bei der glykosidischen Bindung

Nucleinsäuren: PhosphorsäureesterAmino- und Amidogruppen in den Stickstoffbasen

4. a) Abbildungsoptik:

Objektiv: erzeugt ein vergrößertes, reelles Zwischenbild

Okular: erzeugt ein vergrößertes virtuelles Endbild

b) Beleuchtungsoptik:

Lampe: Lichtquelle

Kollektor: vergrößert die Lichtquelle und projiziert sie auf den Kondensor

Kondensor: sammelt das Licht und überträgt es im optimalen Öffnungswinkel durch das Präparat zum Objektiv

Kondensorblende: verändert den Öffnungswinkel

5. V = VOb · VOk

a) Objektiv: 10 ×, Okular: 40 × V = 400 ×

b) Objektiv: 100 ×, Okular: 10 × V = 1000 ×

Charakterisierung und Untersuchung lebender Zellen und ihrer Inhaltsstoffe1

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1 Charakterisierung und Untersuchung lebender Zellen und ihrer Inhaltsstoffe

4

6. Das Aufschlussmedium muss Puffer, Saccharose und Stabilisatoren enthalten.

Beim Aufschluss muss gekühlt werden.

7. RZB = 1,117 · 10−5 · ( Upm ) 2 · r (· g)

RZB = 1,117 · 10−5 · ( 8000 ) 2 · 8,7 = 6219 (· g)

8. Upm = 1000 · √ ________ RZB ________

11,17 · r = 1000 · √ __________

2 · 104

__________ 11,17 · 6,5

= 16 597 min–1

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5

Durchführung mikrobiologischer Arbeiten21. C-heterotroph, chemo-organo-heterotroph, obligat anaerob, mesophil

2. pH-Wert leicht sauer einstellen.

3. Fleischextrakt und Pepton: Quelle für C, N, Vitamine und Mineralstoffe.

NaCl: Ionenkonzentration der Zelle.

Lactose: C-Quelle, nur von einigen Bakterien nutzbar, daher Selektivnährboden.

Fuchsin und Natriumsulfi t: Bestandteile des Nachweisreagenzes für Aldehyde aus dem Stoffwechsel, daher Differenzierungsnährboden.

Agar-Agar: Verfestigungsmittel.

4. a) N = N0 · 2n

Nach 24 Stunden haben 12 Teilungen stattgefunden.

N = 8 · 106 · 212 = 3,3 · 1010 Zellen.

b) Nährstoffverknappung, Absterben einiger Zellen …

5.

Generationszeit

1

10

100

50 60 70 80 90 100 110 120 130

Zellzahlin 10 000 000

Zeit in min

Wachstumskurve in halblogarithmischer Darstellung

3,00

5,60

10,30

doppelteZellzahl

Aus der Wachstumskurve lässt sich eine Generationszeit von etwa 35 min ablesen.

Eine rechnerische Lösung kann über die Gleichungen S. 50 erfolgen.

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2 Durchführung mikrobiologischer Arbeiten

6

Die Anzahl der Zellteilungen n wird nach folgender Formel aus der Zellzahl zu Beginn N0 und am Ende der Teilungen N gemäß Gleichung 2 errechnet:

n = lg N – lg N0 __________ lg 2

n = lg 10,3 · 107 – lg 3,0 · 107

______________________ lg 2

= 8,013 – 7,477 _____________ 0,301

= 0,536 ______ 0,301

= 1,781

Die Generationszeit g ist mit der Zeit t über die Anzahl der Zellteilungen n verknüpft gemäß Gleichung 4:

g = t __ n

g = 60 min _______ 1,781

= 33,7 min

6. Raumluft: Arbeiten unter der Werkbank, UV-Bestrahlung nachts.

Nährmedien: Autoklavieren.

Arbeitsfl ächen: Ethanol oder Propanole.

Glasgeräte: Heißluftschrank.

Enzymlösungen: Sterilfi ltration.

7. • Schimmelpilze: Exosporen werden an den Enden der Sporenträger (Lufthyphen) gebildet und dienen der ungeschlechtlichen Vermehrung.

• Bakterien: Endosporen werden im Inneren der Zelle durch Wasserverlust und dicke Hüllen gebildet und dienen als Dauerformen dem Überleben unter schlechten Bedingungen.

8. • Schimmelpilze: ungeschlechtlich durch Exosporen, die an Sporenträgern gebildet und nach außen abgegeben werden. Auch geschlechtliche Vermehrung ist möglich.

• Hefen: ungeschlechtlich durch Knospung oder Sprossung. Dabei wandert ein neu gebildeter Kern in einen Auswuchs der Mutterzelle und schnürt sich ab. Auch geschlechtliche Vermehrung ist möglich.

• Bakterien: ungeschlechtlich durch Zweiteilung (die DNA wurde zuvor verdoppelt).

• Viren: keine selbstständige Vermehrung möglich. Übertragung der Nucleinsäure auf eine Wirtszelle, die dann das Virus vermehrt.

9. a) Größe, Farbe, Oberfl ächenbeschaffenheit, Rand und Profi l der Kolonien.

b) Form der Zellen: Kokken, Stäbchen, Spirillen, Vibrionen.

Beweglichkeit der Zellen (Hängetropfenpräparat).

Gramfärbung (grampositiv violett, gramnegativ rot).

10. Bildung des Mittelwerts der Koloniezahlen: 51 + 53 + 58 ____________ 3 = 54

Berechnung des Verdünnungsfaktors: 1 : 100, 1 : 100, 1 : 10, 1 : 10, 1 : 10, also 107

Berechnung der KBE/mL: 54 KBE sind in 200 µL der verdünnten Kultur. Daraus errechnet sich die Anzahl der KBE in 1 mL der Ausgangskultur folgendermaßen:

54 · 107

_______ 0,2

KBE/mL = 2,7 · 109 KBE/mL

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2 Durchführung mikrobiologischer Arbeiten

7

11. Berechnung des Volumens der Zählkammer:0,05 · 0,05 · 0,02 mm3 = 0,000050 mm3 = 5 · 10–5 mm3 = 5 · 10–8 mL

Berechnung der Zellzahl pro Milliliter:in 5 · 10–8 mL sind 11 Zellen, in 1 mL sind 11 _______

5 · 10–8 Zellen = 2,2 · 108 Zellen/mL

Berechnung der Zellzahl der Gesamtkultur:in 40 mL sind 40 · 2,2 · 108 Zellen = 8,8 · 109 Zellen.

Umrechnen mit Verdünnungsfaktor:8,8 · 109 · 20 = 176 · 109 Zellen, aufgerundet 1,8 · 1011 Zellen

12. a) Begeißelungsformen:

• monotrich unipolar: eine Geißel an einem Zellende eines Stäbchenbakteriums;

• polytrich unipolar: viele Geißeln an einem Zellende eines Stäbchenbakteriums;

• polytrich bipolar: viele Geißeln an beiden Zellenden eines Stäbchenbakteriums;

• peritrich: viele Geißeln über die gesamte Zelloberfl äche verteilt.

b) Nachweis durch den „Hängenden Tropfen“: Ein Tropfen der Bakteriensuspension hängt an einem Deckglas über einem Objektträger mit einer Vertiefung. Beim Betrachten mit dem Mikroskop erkennt man, dass begeißelte Bakterien schwimmen.

c) Zielgerichtete Bewegung auf einen Reiz zu.

13. Bunte Reihe O/F-Test Katalase-/Oxidase-Test

Stoffwechsel-eigenschaft

Fähigkeit bestimmte Stoffe, vor allem Zucker, abzubauen.

Fähigkeit, Atmung (O) oder Gärung = Fermentation (F) zu betreiben und dabei Säure zu bilden.

Fähigkeit, mit Hilfe der Enzyme Katalase bzw. (Cytochrom)-Oxidase H2O2 zu entgiften.

Nachweisreagenz Säure-Base-Indikator. Säure-Base-Indikator. H2O2

Beobachtung Farbumschlag des Indikators.

Farbumschlag des Indikators oxidativer Abbau: Wachstum an der Oberfl äche des Röhr-chens ohne Paraffi n, fermen-tativer Abbau: Wachstum im Röhrchen mit Paraffi n.

Katalase:Aufschäumen durch O2.

Oxidase: Rotfärbung durch Oxidation des Farbstoffs.

14. a) Agardiffusionstest: Auf einer dicht mit dem Testkeim bewachsenen Agarplatte bilden sich um Blättchen mit dem Antibiotikum Hemmhöfe aus.

b) Reihenverdünnungstest: In Kulturröhchen mit dem Testkeim und verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums kommt es nur dann zur Trübung, wenn das Antibiotikum den Keim nicht hemmt.

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Durchführung biotechnologischer Arbeiten3

1. Chemisches Verfahren Biotechnisches Verfahren

Ausgangsstoffe: Ethen erdölabhängig Kohlenhydrate nachwachsende Rohstoffe

Energie: hohe Temperatur Raumtemperatur

Anlage: Druckbehälter Gärtank

2. Die Zeit t ist mit der Generationszeit g über die Anzahl der Zellteilungen n verknüpft gemäß Gleichung 4:

g = t __ n

t = n · g

Die Anzahl der Zellteilungen kann nach folgender Formel aus der Zellzahl zu Beginn N0 und am Ende der Teilungen N gemäß Gleichung 2 errechnet werden:

n = lg N – lg N 0 __________ lg 2

n = lg 1 0 8 − lg 3,5 · 1 0 4 _________________ lg 2

= 8 – (0,544 + 4) ______________ 0,301

= 3,456 ______ 0,301

= 11,48

t = 11,48 · 40 min = 459 min = 7 h 39 min

3. Die Wachstumsrate µ ist mit der Zellmasse X und der Zeit t über Gleichung 5 verknüpft:X = X 0 · e μ · t

Durch Umformen ergibt sich:

X ___ X 0

= e μ · t

Logarithmieren zur Basis e und Aufl ösen nach µ ergibt:

ln X ___ X 0

= µ · t ln X – ln X0 = μ · t µ = ln X – ln X 0 _________ t

μ = ln 20 000 − ln 300 ________________ 24 h

= 9,903 – 5,704 _____________ 24 h

= 0,176/h

Setzt man in der obigen Gleichung für t die Verdopplungszeit td und für die Zellmasse X die doppelte Anfangszellmasse 2 X0 ein, so erhält man:2 · X 0 = X 0 · e μ · t d

Der Ausdruck vereinfacht sich dadurch zu 2 = e μ · t d

Nach dem Logarithmieren zu Basis e ergibt sich

ln 2 = μ · t d und damit t d = ln 2 ____ µ

t d = 0,693 ______ 0,176

td = 3,9 Stunden

4. 80 % entsprechen 0,8 Y = Pr oduktmenge ______________ Substratmenge

= P __ S

Y = 80 g _____________ 100 g Glucose

= 0,8

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3 Durchführung biotechnologischer Arbeiten

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5. Die Reaktionsgleichung für die aerobe Atmung lautet wie folgt:C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2Oaus 1 mol Glucose entsteht 6 mol CO2.

Berechnung der Stoffmenge an CO2 aus dem Volumen:

n (C O 2 ) = V (C O 2 ) _________ V m,n (C O 2 )

= 650 L · mol __________ 22,4 L

= 29,02 mol

Berechnung der Stoffmenge an Glucose aus der Stoffmenge an CO2:

n (Glucose) = 1/6 n (CO2) = 29,02 ______ 6

= 4,84 mol

Berechnung der Masse der verbrauchten Glucose:m = M · n M (Glucose) = 180 g · mo l –1 m (Glucose) = 180 g · mo l –1 · 4,84 mol = 870,53 g

Berechnung der restlichen Glucose:1000 g – 870,53 g = 129,47 g

6. • Abtrennung der Zellmasse, z. B. durch Filtration,

• schonender Zellaufschluss, z. B. mechanisch,

• Isolierung des Proteins, z. B. durch Ausfällung des Proteins mit einem Neutralsalz,

• Konzentrierung, z. B. durch Dialyse,

• Reinigung, z. B. durch Gelfi ltration (Chromatographie).

7. a) C6H12O6 → C3H7-COOH + 2 H2 + 2 CO2

b) C6H12O6 → CH3-CHOH-COOH + C2H5OH + CO2

8. a) Emers: Essigsäure, Citronensäure, Glutaminsäure

Submers: Ethanol

b) Primärmetabolite: Ethanol, Milchsäure, Essigsäure

Sekundärmetabolite: Antibiotika

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Durchführung biochemischer Arbeiten41. pH 5,88 Bei pH 5,88 liegt das Phenylalanin als

Zwitterion vor und wandert nicht,das Lysin dagegen als Kation und wandert.

O O

C

C H

CH2

–

NH

H

H

+NH

O O

CH

C H

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3

H

–

+

+

pH 9,9 Bei pH 9,9 liegt das Lysin als Zwitterion vor und wandert nicht, das Phenylalanin dagegen als Anion und wandert.

H2N

O O

C

C H

CH2

–O O

C

C H

CH2

CH2

CH2

CH2

–

H2N

NH H

H

+

2. a) Puffersäure

b) korrespondierende Base

a)

H3N CH2 C CH2 CNH

O

+O

OH

b)

H3N CH2 C CH2 CNH

O

+O

O–

3.

H2N CH C CH CNH

OO

O CH3CH2CH2

C

OHO

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4 Durchführung biochemischer Arbeiten

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4. Disulfi dbrücke zwischen 2 Cysteinresten:R-S-H + H-S-R → R-S-S-R + 2 H (gebunden)

G L PC N

C Y

ES

S I

Tertiärstruktur

5. a) 13 640 g · mol–1

______________ 110 g · mol–1 = 124; 124 Aminosäuren

b) 2332 · 110 g · mol–1 = 256 520 g · mol–1, entsprechend etwa 260 kDa

6. • Aussalzen, fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfatlösungen unterschiedlicher Konzentration.

• Aus der verdünnten Lösung fällt das Fibrinogen aus, aus der konzentrierten das Albumin.

• Durch Dialyse wird das jeweilige Protein vom Salz befreit.

7. Bei der Gelfi ltration dringen kleine Moleküle in die Kügelchen der Trägersubstanz ein, große nicht und werden deshalb schneller eluiert.

Bei der SDS-PAGE wandern kleine Moleküle schneller durch das Gel.

8. a) Ninhydrin: Nachweis von Aminosäuren bei der DC

b) β-Mercaptoethanol: Denaturierung von Proteinen für die SDS-PAGE

c) Kupfer(II)sulfat: in der Proteinanalytik: Biuretreaktion, Lowry-Methode, BCA-Methode

d) SDS: Denaturierung von Proteinen für die SDS-PAGE. Erzeugung einer negativen Ladung aller Proteinmoleküle

e) Coomassie-Brilliant-Blau: Anfärben von Proteinen bei der Elektrophorese, Bradford-Methode

9. • Die Ausfällung ist in der Regel ein reversibler Vorgang, bei dem ein Protein von seinen Begleitstoffen getrennt wird. Seine biologische Funktion bleibt dabei erhalten.

• Bei der Denaturierung erfolgt häufi g auch eine Zusammenballung, die aber irreversibel verläuft. Weil Quartär- und Tertiärstruktur zerstört werden, geht die biologische Funktion verloren.

10. a) Ladung, Größe und Form bestimmen die Wanderungsgeschwindigkeit.

b) • Bei der SDS-PAGE wird der Einfl uss der Ladung ausgeschaltet, indem durch das SDS alle Proteine einheitlich negativ geladen sind. Die Auftrennung erfolgt nach der Molmasse.

• Bei der IEF erfolgt die Auftrennung von Proteinen mit ähnlicher Molekülgröße auf Grund der Ladung in Zonen mit verschiedenen pH-Werten innerhalb des Gels, weil am isoelektrischen Punkt keine Wanderung erfolgt.

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Durchführung immunologischer und diagnostischer Arbeiten – Enzyme5

1. Wirkungsspezifi tät: Beide Enzyme gehören zur Klasse 3, den Hydrolasen. Diese können nur die hydro lytische Spaltung katalysieren und keine andere Reaktion.

Substratspezifi tät:

• α-Glucosidase kann nur die α-1,4-glykosidische Bindung im Maltosemolekül spalten, wobei 2 mol D-Glucose entstehen.

• β-Galactosidase kann nur die β-1,4-glykosidische Bindung im Lactosemolekül spalten, wobei 1 mol β-D-Galactose und 1 mol D-Glucose entstehen.

2. Die Reaktion ist eine Transaminierung, das Enzym also eine Transaminase und gehört in die Klasse 2der Transferasen.

H2N

O OH

C

C H

CH2

CH2

O OH

C

GPT

CO

O OH

C

CH3

H2N

O OH

C

C H

CH3

O

O OH

C

C

CH2

CH2

O OH

C

+ +

Glutaminsäure Brenztraubensäure Alanin α-KetoglutarsäureGlutamat Pyruvat α-Ketoglutarat

3.

HO

O OH

C

C H

CH3

+LDH

NAD+ + NADH + H+CO

O OH

C

CH3

Milchsäure BrenztraubensäureLactat Pyruvat

Je kleiner der KM-Wert, desto größer ist die Affi nität eines Enzyms zu seinem Substrat, d. h. Brenztraubensäure wird schneller umgesetzt als Milchsäure und das Gleichgewicht liegt links.

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5 Durchführung immunologischer und diagnostischer Arbeiten – Enzyme

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4. Für das Lineweaver-Burk-Diagramm müssen die reziproken Werte von c(S) und v berechnet werden.

ohne Inhibitor mit Inhibitor

c (S) in in mmol ______ L 1 ____

c (S) in L ______

mmol v in mmol ______

min · 1 0 −3 1 __

v in min ______

mmol · 1 0 3 v in mmol ______

min · 1 0 –3 1 __

v in min ______

mmol · 1 0 3

2 0,500 0,187 5,35 0,150 6,67

4 0,250 0,263 3,80 0,227 4,41

6 0,167 0,308 3,25 0,274 3,65

8 0,125 0,330 3,03 0,303 3,30

10 0,100 0,351 2,85 0,323 3,10

a) 1 ____ vmax

= 2200 min ______ mmol

vmax = 0,455 · 1 0 –3 min ______ mmol

ungehemmte Reaktion ohne Inhibitor

– 1 ___ K M

= – 0,35 L ______ mmol

KM = 2,79 mmol ______ L

gehemmte Reaktion mit Inhibitor

− 1 ___ K M

= – 0,245 L ______ mmol

KM = 4,12 mmol ______ L

b) Da vmax konstant bleibt und KM größer wird, handelt es sich um eine kompetitive Hemmung

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

-0,50 -0,30 -0,10 0,10 0,30 0,50 0,70

Lineweaver-Burk-Diagramm

min · mmol−1 · 103

in

1v

in L · mmol−11c(S)

grün rot

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5 Durchführung immunologischer und diagnostischer Arbeiten – Enzyme

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5. Lambert-Beersches Gesetz:

E = ε · c · d c = E ____

ε · d

c = 0,042 ____________ 1,85 · 104 · 1

mol · cm ________ L · cm

c = 0,0227 _______ 104 mol ____

L c = 2,27 _____

106 mol ____ L c = 2,27 _____

103 mmol ______

L c = 2,27 μmol _____

L

Die Enzymaktivität wird in U, d. h. µmol/min angegeben.

In diesem Fall werden 2,27 µmol pro 10 µL Probe umgesetzt.

Das Ergebnis muss noch mit dem Gesamtvolumen in der Küvette (1000 µL) und dem eingesetzten Probe-volumen (10 µL) korrigiert werden.

Zur Berechnung muss das Konzentrationsergebnis also noch mit dem Faktor 1010 _____ 10

multipliziert werden.

Die Aktivität beträgt: 2,27 · 1010 _____ 10

µmol/L = 229 U/L.

Umrechnung der Einheiten:Um von 229 U/L (U in µmol/min) auf die Angabe in µkat/L (µkat in µmol/s) zu kommen, muss man durch 60 dividieren und erhält damit die Aktivität 3,82 µkat/L.

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Durchführung immunologischer und diagnostischer Arbeiten – Immunglobuline6

1. polyklonale Antikörper monoklonale Antikörper

Herkunft verschiedene B-Lymphocyten, daher liegen im Antiserum verschiedene Antikörper gegen ein Antigen vor

ein Zellklon von Hybridoma-Zellen, fusioniert aus einem B-Lymphocyten und einer Myelomzelle (Krebszelle)

Wirkungsweise Antiserum gegen mehrere Epitope eines Antigens gerichtet, jeder Antikörper gegen ein anderes

gegen ein einziges Epitop eines Antigens gerichtet

2. Spaltung durch Papain:

3 Fragmente:2 Fragmente mit je einer Antigen-bindungsstelle, 1 Fragment ohne Antigen- Bindungsstelle

Spaltung durch Pepsin:

2 Fragmente:1 Fragment mit 2 Antigen-bindungsstellen, im Prinzip ein verkleinerter Antikörper,2 Fragmente ohne Antigen-bindungsstellen.

3. Enzym Antikörper

Spezifi scher Reaktionspartner Substrat Antigen

Komplex Enzym-Substrat-Komplex Antigen-Antikörper-Komplex

Bindungsstelle des spezifi schen Reaktionspartners

aktives Zentrum Antigen-Bindungsstelle = Paratop

weitere Bindungsstellen außerhalb des aktiven Zentrums weitere Bindungsstellen für andere Proteine wie Antikörper

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6 Durchführung immunologischer und diagnostischer Arbeiten – Immunglobuline

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4. a) Enzymklasse: Hydrolase (Ziffer 3)

katalysierte Reaktion: hydrolytische Spaltung einer Esterbindung (Ziffern 3.1)

hydrolytische Spaltung einer Phosphodiesterbindung (Ziffer 3.1.3)

b) Bei der hydrolytischen Spaltung der Phosphodiesterbindung durch die alkalische Phosphatase (AP) entsteht das p-Nitrophenolation. Dieses bildet ein chinoides System aus, das sich leichter durch Licht anregen lässt.

+ H2O H2PO4O N +

–

APP

O

O

O N

O

O–

+–

O

NO–

O N

O–

+

O

O–

–

+

O

O–

+

O– –

5. Reihenfolge der Schritte:

1. Beschichtung der Mikrotiterplatte mit Antikörpern gegen das Afl atoxin

2. Entfernen überschüssiger AK durch Waschen mit Pufferlösung

3. Blockierung unspezifi scher Proteinbindungsstellen durch BSA (Rinderserumalbumin)

4. Entfernen des überschüssigen BSA durch Waschen mit Pufferlösung

5. Zugabe von Afl atoxin, das mit einem Enzym markiert wurde, z. B. Peroxidase

6. Zugabe der Probe mit Afl atoxin

7. Das an den Antikörper auf der Platte gebundene enzymmarkierte Afl atoxin konkurriert mit dem unmarkierten Afl atoxin der Probe um die Bindungsstellen am Antikörper. Bei hoher Konzentration in der Probe wird das markierte Afl atoxin verdrängt.

8. Inkubation: Bildung des AK-AG-Komplexes.

9. Entfernen des überschüssigen Afl atoxins durch Waschen mit Pufferlösung

10. Zugabe eine zweiten Antikörpers, der gegen den Afl atoxin-Antikörper gerichtet ist

11. Erneutes Waschen mit Pufferlösung

12. Zugabe der Substratlösung, z. B. TMB/H2O2

13. Umsetzung des Substrates zu einer farbigen Verbindung durch das Enzym

14. Je mehr enzymmarkierter Antikörper gebunden wurde, desto intensiver die Färbung, je mehr Afl atoxin in der Probe, desto schwächer die Färbung.

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17

Durchführung molekularbiologischer Arbeiten7

1. Es entsteht die Strukturformel von ATP.

P

O

O

O

–

HO P

O

O

O

–

P

O

O

O

–

N N

NN

NH2

CH2 O

HH

OHOH

H H4’ 1’

3’ 2’

3942

17

8

5

5’

6

2. a) entfernt Bestandteile der Zellmembran, nämlich Lipide

b) fällt Proteine aus

c) entfernt RNA

d) fällt DNA aus (Anreicherung aus verdünnten Lösungen)

3. a) E = 1,0 = 50 μg · mL–1 DNA ⇒ E = 0,550 = 27,5 μg · mL–1 DNA

Umrechnen auf die ursprüngliche Probe: · 1000 _____ 20

DNA: 1375 μg

b) Umrechnen der DNA-Menge von 1 mL (1000 μL) auf 50 μL Plasmidpräparation

1375 · 50 _____ 1000

μg = 68,75 μg

c) E260 ____ E280

= 0,550 ______ 0,305

= 1,803 Die DNA ist rein genug.

4. a) Beim Schmelzen der DNA werden die Wasserstoffbrücken zwischen den Basen aufgebrochen. Zwischen Guanin und Cytosin werden drei Wasserstoffbrücken ausgebildet, zwischen Adenin und Thymin dagegen nur zwei, die getrennt werden müssen.

b) Der obere Strang wird vervielfältigt, weil sich der Primer so anlagert, dass eine OH-Gruppe an seinem 3’-Ende zur Anlagerung weiterer Nucleotide zur Verfügung steht. Der neue Strang wächst in 5’-3’-Richtung von rechts nach links.

5’ 3’3’ ← HO Primer 5’

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7 Durchführung molekularbiologischer Arbeiten

18

5. neuer Strang: 5’-TCCTG AGGCC ACCTC GGGTC AGC-3’

ursprünglicher Strang: 3’-AGGAC TCCGG TGGAG CCCAG TCG-5’

bzw. 5’-GCTGA CCCGA GGTGG CCTCA GGA-3’

blau , grün , rot

6. a) Übertragung von Nucleotiden bei der Synthese des komplementären Einzelstranges (Transferase)

b) Verursachen von Doppelstrangbrüchen durch Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen (Hydrolase)

c) Verknüpfung der Nucleotide durch Bildung neuer Phosphodiesterbindungen (Ligase)

d) Übertragung von Nucleotiden bei der Synthese eines zu RNA komplementären DNA-Stranges (Transferase)

7. a) PvuII: 5’CAG↓CTG3’ grün , SmaI: 5’CCC↓GGG3’ rot

5’TTCCGAATTG ATGCCCGGGT AAACTACTAT GTGTTGTGCA CTAATGTTTC AGCTGAAACC TGGCCATAGG CTACTATTAG

3’AAGGCTTAAC TACGGGCCCA TTTGATGATA CACAACACGT GATTACAAAG TCGACTTTGG ACCGGTATCC GATGATAATC

TATTATCTCT GGGAAACGAG CTCTCGGCCC GGGGATTAAT GTCAAAGTCT GAAATTCCCA ATCATCATCC TGGGAGGGTG

ATAATAGAGA CCCTTTGCTC GAGAGCCGGG CCCCTAATTA CAGTTTCAGA CTTTAAGGGT TAGTAGTAGG ACCCTCCCAC

CAGCTGAGAG AAGGCCATGA CCACACTCTA TGTGAAAAGT GAGCAGCACC CGGGTCTTTC ATATGGGCC AGAGCCCTTTA 5’

GTCGACTCTC TTCCGGTACT GGTGTGAGAT ACACTTTTCA CTCGTCGTGG GCCCAGAAAG TATACCCGG TCTCGGGAAAT 3’

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7 Durchführung molekularbiologischer Arbeiten

19

b) PvuII: 2 Erkennungsstellen, 3 Fragmente: 52 bp, 111 bp, 77 bp

SmaI: 3 Erkennungsstellen, 4 Fragmente: 16 bp, 94 bp, 101 bp, 29 bp

c)

100

bp

80

60

40

20

–

+

8. Spender-DNA und Plasmid-DNA werden mit demselben Restriktionsenzym geschnitten.

Spender-DNA und Plasmid-DNA werden gemischt.

Durch das Enzym Ligase werden die Restriktionsfragmente verknüpft.

Die Plasmide werden auf – vorher kompetent gemachte – Bakterienzellen übertragen.

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20

Durchführung zellkulturtechnischer Arbeiten8

1. Tierisches Gewebe Pfl anzliches Gewebe

Zellbegrenzung Zellmembran Zellmembran + Zellwand

Verbindung zum Gewebe

Extrazelluläre Matrix aus Polysacchariden und Protei-nen, Verknüpfungen durch Proteine (tight junctions, Desmosomen, gap junctions)

Mittellamelle aus Pektin

Stoffaustausch Tunnelkontakte, Proteine der Zellmembran Plasmodesmen, die durch die Tüpfel der Zellwände führen

2. • Adulte Stammzellen: Tierische Gewebe, z. B. Haut und Schleimhaut. Sie erzeugen neue Zellen desselben Gewebes.

• Embryonale Stammzellen: Tierisches Gewebe von Embryos. Sie können jede Zelle des betreffenden Organismus hervorbringen.

• Kalluszellen: Pfl anzliches Gewebe nach Verletzung. Sie können eine vollständige neue Pfl anze hervorbringen.

3. • Die PBS-Lösung entfernt Spuren von Medium, dessen Proteine die Wirkung des proteolytischen Enzyms Trypsin beeinträchtigen. Ca2+- und Mg2+-Ionen würden EDTA binden und dem Prozess entziehen. Der Puffer hält den pH-Wert stabil.

• Trypsin hydrolysiert die Proteine der extrazellulären Matrix, EDTA bindet die Ca2+- und Mg2+-Ionen der Zellverbindungen. Dadurch werden die Zellen von der Unterlage abgelöst und vereinzelt.

• Enthält besonders viele Proteine. Dadurch wird überschüssiges Trypsin daran gehindert, Zellproteine zu zerstören.

4. Zellsuspension: x mL _____ 1 mL

= 2 · 1 0 5 Zellen ______________ 7,5 · 1 0 5 Zellen

x mL = 0,27 mL

Medium: 5 mL – 0,27 mL = 4,73 mL

5. geforderte Gesamtzellzahl: 5 · 1 0 4 Zellen · 96 = 4,8 · 1 0 6 Zellen

gefordertes Gesamtvolumen: 0,2 mL · 96 = 19,2 mL

Berechnung des Volumens der Zellsuspension, das 4,8 · 1 0 6 Zellen enthält:

x mL _____ 1 mL

= 4,8 · 1 0 6 Zellen _______________ 1,95 · 1 0 6 Zellen

, x mL = 2,46 mL

Berechnung des zuzusetzenden Mediums:19,2 mL – 2,46 mL = 16,74 mL

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