Genstruktur und Genregulation bei Pro- und Eukaryoten

(Pt.2)

Kap. 33, 36

Thomas Hankeln Institut für Molekulargenetik hankeln@uni-mainz.de

WS 2016/17 Grundvorlesung „Allgemeine und Molekulare Genetik“

• jeder Schritt auf dem Weg vom Gen zum Protein ist prinzipiell ein Ansatzpunkt für Genregulation

Was? Wann? Wo? Wieviel?

DNA

RNA

TK

TL

Gewebe 1 Gewebe 2 Gewebe 2 Gewebe 1

Protein post-translational

post-transkriptionell

Gen 1 Gen 2 Gen 3

Operator -10 -35

Promoter Aktivator- Bindeort

RBS RBS RBS

RBS ribosome binding site (Shine-Dalgarno-Box)

Operons in Prokaryoten / Wiederholung

* * * • • •

* Translations-Startkodon (AUG) • Translations-Stopkodon (UAG, UAA,UGA)

TK-Stop

+1 polycistronische mRNA

• günstiger Zeitpunkt: Entscheidung im allerersten Schritt der Genaktivierung, keine Energieverschwendung durch Synthese un- benötigter mRNA • „einfach“ zu realisieren: ein einziger Schalter (Promoter) eines einzigen Gens muss reguliert werden • dennoch: auch bei Bakterien gibt es andere Ebenen der Genregulation

Schlüsselschritt: TK-Initiation

• viele Promoter zeigen ein schwache basale Transkription • so sind von vielen Proteinen oft wenig Exemplare +/- immer in Zelle • Promoter sind in ihrer Organisation und Sequenz unterschiedlich > 1000 x Unterschiede in basaler Transkription („Promoter-Stärke“)

Basale Transkription häufig

Abb: Watson et al Molecular Biology of the Gene

Genregulation an der RNA Pol durch σ-Faktoren

• Spezielle σ-Faktoren der RNA Pol erkennen bestimmte Promotersequenzen und transkribieren dann spezielle Gengruppen, z.B. in einer definierten zeitlichen Reihenfolge...

Zumeist regulieren Aktivatoren und Repressoren die TK-Initiation

Operator = Repressor-Bindestelle

..gezeigt ist der einfachste Fall, eine Blockade des Promoters. Andere Repressoren interagieren mit der RNA Pol kooperativ.

Einfachster Fall: Aktivator führt RNA Pol an den Promotor (kooperative Interaktion)

Manche Aktivatoren stimulieren die RNA Pol durch Allosterie

Konformationsänderung (= regulierender Schritt)

Aktivator ist hier ein „allosterischer Effektor“ der RNA Pol

Fernwirkung ist möglich…

Späte Regulation manchmal sinnvoll…

• z. B. wenn Zeitfaktor der TK eine Rolle spielt > mRNA schon gebildet, aber durch gebundenes Protein wird die TL noch verhindert > jedes mRNA-Molekül wird dann individuell reguliert

5‘

3‘ AUG STOP

Dauerwerbevorlesung

Das Lac-Operon in E. coli

A. Lwoff

F. Jacob

J. Monod

Nobelpreis 1965

Jan 2012 Grundpraktikum Genetik

BLAU oder WEISS?

Anwendung in Drosophila

Expression profile of an Fgf10-lacZ reporter transgene visualized after X-gal staining in an E14.5 mouse embryo showing transgene expression in Tbx1-dependent craniofacial skeletal muscles.

http://www.ibdm.univ-mrs.fr/equipe/genetic-control-of-heart-development/

Das Lac-Operon hat drei Enzymfunktionen

Lactose Galaktose + Glukose ß-Galaktosidase

(lacZ) CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

OH

OH

OH OH

OH

OH

OH OH OH OH

OH

OH OH

OH

Permease (lacY) Aufnahme von Lactose in die Zelle Transacetylase (lacA) Entgiftung von Lactose-ähnlichen Substanzen

Das Lac-Operon

20 Bp 20 Bp

• Drei Gene des Zuckerstoffwechsels • Promotor überlappt mit Aktivator-Bindestelle und mir Repressor-Bindestelle (= Operator) > Duale Kontrolle der Genregulation

Negative Kontrolle Operon wird durch Repressor blockiert („Bremse“)

Positive Kontrolle Operon wird durch Aktivator

angeschaltet („Gaspedal“)

Das Lac-Operon: duale Kontrolle

Negative und positive Kontrolle!

NEGATIVE KONTROLLE Bremse angezogen, kein Gas

Bremse gelöst, noch kein Gas (wenig Transkription)

POSITIVE KONTROLLE Bremse gelöst, Vollgas

Warum so kompliziert?

Glucose wird von E. coli leichter verwertet als Lactose…

! FEIN-TUNING des Operons:

duale Kontrolle ermöglicht eine ökonomische Substrat-Verwertung!

Warum positive und negative Kontrolle?

• bei Lactose plus Glucose im Medium:

Lactose de-reprimiert das Operon („Bremse gelöst“) hoher Glucose-Spiegel verhindert aber Aktivierung,

Glucose wird erst einmal aufgebraucht

• nur Lactose im Medium:

Lactose de-reprimiert das Operon niedriger Glucose-Spiegel aktiviert Operon („Gib Gas!“)

Die Akteure...

lac-Repressor - DNA-Bindeprotein, kodiert von eigenem Gen (lac I)

- lac I-Gen liegt in Nähe des Lac-Operons

- konstitutiv aktiviert, d.h. Repressor ist anwesend

- vermittelt „Lactose“-Signal

Activator - DNA-Bindeprotein mit zwei alternative Namen:

CAP (catabolite activator protein) CRP (cAMP receptor protein)

- vermittelt „Glucose“-Signal

Nochmal: die duale Kontrolle…

Default… Operon reprimiert

Operon de-reprimiert, aber nicht aktiviert

dereprimiert, aktiviert

Negative Kontrolle: Prinzip

Der Lac-Repressor verhindert sterisch die Bindung der RNA Pol und damit die Transkription….

Wie werden wir den Repressor los, wenn Laktose da ist?

Negative Kontrolle: der Repressor

Wie werden wir den Repressor los, wenn Laktose da ist?

Annotated crystal structure of dimeric LacI. Two monomers (of four total) co-operate to bind each DNA operator sequence. Monomers (red and blue) contain DNA binding and core domains (labeled) which are connected by a linker (labeled). The C-terminal tetramerization helix is not shown. The repressor is shown in complex with operator DNA (gold) and ONPF (green), an anti-inducer ligand (i.e. a stabilizer of DNA binding) wikipedia

Negative Kontrolle: Rolle des Induktors

Das Substrat Laktose zeigt seine eigene Anwesenheit selbst an: 1. Laktose bindet an Repressor > Konformationsänderung! 2. Repressor kann Operator nicht mehr binden > Induktion des Operons Laktose* ist deshalb ein allosterischer INDUKTOR! *Kommentar hierzu folgt später…

Induktor

Lac-Repressor (Tetramer)

ohne Lactose Repression

mit Lactose Repression aufgehoben

lacZlacI

Lac-Repressor

mRNA

Induktor

PromoterOperator

RNA-Polymerase

Negative Kontrolle: Prinzip

basale Transkription

Negative Kontrolle detaillierter…

Hilfsoperator

Lac-Repressor (360 As) bindet als Tetramer an Standard-Operator UND an stromaufwärts gelegenen „Hilfsoperator“. Eine Repressionsschleife von ca 90 Bp entsteht. Promoter im Inneren der Schleife ist unzugänglich.

Positive Kontrolle: Prinzip

CAP

Ein Signalmolekül (cAMP) übermittelt Zuckerstatus an CAP-Protein: CAP ändert Konformation nach Bindung von cAMP.

Glu hoch > cAMP niedrig > CAP inaktiv

Glu niedrig > cAMP hoch > CAP aktiv

inhibiert durch Glucose

Der cAMP-CAP-Komplex stimuliert die TK-Initiation durch kooperative Interaktion mit der RNA- Polymerase.

CAP bindet als Dimer an die DNA. Ein „helix-turn-helix“-Motiv erkennt die spezifische, symmetrisch gebaute DNA-Sequenz. Die Aminosäuren des Transkriptionsfaktors bilden H-Brücken zu Basen der DNA. Dieses allgemeine Prinzip gibt es auch bei Eukaryoten.

Positive Kontrolle: CAP als Aktivator

Lac-Operon - Henne/Ei...

• aufgrund geringer basaler TK-Aktivität des lac-Operons:

! einige Moleküle Permease und ß-Galaktosidase in der Zelle

! wenige Moleküle Lactose gelangen auch ohne Induktion in Zelle

! sie werden dort von ß-Gal in ‚Allo-Lactose‘ umgewandelt, die als wirklicher Induktor funktioniert.

Wie kommt Lactose in Zelle, wo doch die transportierende Permease des Operons erstmal induziert werden muss?

Warum Nobelpreis?

Lactose

Glucose

Die Experimente…

Ziel: erkläre den sigmoiden Verlauf der Wachstumskurve (Glu>Lac), der auf Genregulation hinweist

(nur grobe Architektur des Operons (3 Gene) war bekannt)

Methode: isoliere Mutanten, die β-Gal konstitutiv bilden (bei denen also die Regulation gestört ist)

Die Experimente…

> isoliere Mutanten, die β-Gal konstitutiv bilden > können Wildtyp-Sequenzen des Operons die Mutante

„komplementieren“, d.h. die Regulierbarkeit der Genaktivität wieder herstellen??

> erzeuge hierzu Bakterien mit 2 Kopien des Operons (mutiertes Lac-Operon im Genom plus Wildtyp-Operon auf Plasmid lokalisiert)

> rein genetische Daten, aber molekulare Schlussfolgerung…

Zwei Typen lac-konstitutiver Mutanten

I- O+ Z+

I+ Oc Z+

Mutierter Repressor

Mutierter Operator

Und nun: diesen Zellen ein zusätzliches Plasmid mit Wildtyp-Operon verabreichen…

Den hier schon gezeigten genetischen Unterschied und die Architektur der Mutanten kannten Jacob und Monod nicht!

Ergebnis 1: Repressoren sind diffusible Proteine und wirken in trans

I- O+ Z+

I+ O+ Z+ Beobachtung

Wildtyp-Allel stellt Regulierbarkeit wieder her, auch für das mutante Operon! Ergo: I muss diffundieren können, ist also wohl Repressorprotein!

Interpretation

Ergebnis 2: Operatoren sind auf DNA fixiert und wirken daher nur in cis

I+ Oc Z+

I+ O+ Z+

Beobachtung

Interpretation

Wildtyp-Operator kann mutantes Operon nicht wieder regulierbar machen. Es bleibt angeschaltet… Ergo: O sitzt fixiert auf gleicher DNA wie Gene selbst!

cis- und trans-agierende Faktoren in der Genregulation

cis - diesseitig trans - jenseits

• cis-Kontrollelemente wirken nur, wenn sie sich auf dem- selben DNA-Molekül befinden wie das zu regulierende Gen

Bsp. Promoter, Operator • trans-Kontrollelemente sind diffusibel und wirken auch zwischen verschiedenen DNA-Molekülen

Bsp. Regulatorproteine, Transkriptionsfaktoren

Dieses Prinzip gilt auch für Eukaryoten...

Variationen des Regulator/Operator-Prinzips

• Lac-Operon, katabolisch default: OFF > bei Bedarf Aktivierung • Tryp-Operon, anabolisch, zumeist ON default: ON > bei Bedarf Repression

Variation des Regulator/Operator-Prinzips im anabolischen Tryptophan-Operon

• default: ON > reprimierbares Operon

Variation des Regulator/Operator-Prinzips im anabolischen Tryptophan-Operon

• Endprodukt des Stoffwechselweges (Trp) reprimiert Operon durch Aktivierung des Repressors (und wirkt somit als „Co-Repressor“)

Feinabstimmung des Tryptophan- Operons durch Attenuation

• = Verminderung der Genexpression • nur in Prokaryoten möglich, da hier TK und TL gekoppelt ablaufen

....TrpTrp....

Social Networking in Bacteria: QUORUM SENSING Lux-Gene von Vibrio fischeri-

Bakterien in Leuchtorganen des Kalmars aktiv

!  Koordination von Biolumineszenz, Biofilm-Bildung, Sekretion von Pathogenitätsfaktoren

!  sogar Kommunikation zwischen Spezies möglich !  Target für Entwicklung antibakterieller Therapien

Autoinduktor-Moleküle werden ins Medium abgegeben. Wenn Konzentration hoch, werden über einen Rezeptor vermehrt AI aufgenommen. Positive Rückkopplung aktiviert AI-Gen (> noch mehr AI werden freigesetzt). Weitere Zielgene werden aktiviert.