Abbildung 1.1: Ausgewählte Projektionen der mesencephalen dopaminergen Kernregionen

Der schematische Sagittalschnitt durch das Gehirn eines Nagers zeigt ausgewählte Projektionen der DA Mittelhirnneurone in corticale und subcorticale Hirnregionen. Neurone der SN innervieren das dorsale Striatum (DS) und den lateralen Shell des Nucleus accumbens (NAc). Diese Areale erhalten auch zu geringen Anteilen Afferenzen aus der Area retrorubralis (RRF). Projektionen in die basolaterale Amygdala (Amyg), den medialen präfrontalen Cortex (mPFC) und den Core und medialen Shell des NAc haben ihren Ursprung in der VTA.

Abbildung 1.2: Das ventrale Mittelhirn im coronaren Hirnschnitt

Links: Schematische Darstellung der Kerngebiete des ventralen Mittelhirns der Maus (nach Paxinos und Franklin 2007, bei Bregma -3,52 mm). Medial befindet sich die VTA mit den Subnuclei interfascicularis (IF), paranigralis (PN) und parabrachialis pigmentosus (PBP). Durch den Fasertrakt Lemniscus medialis (ML) wird die VTA von der SN getrennt. In der SN pars compacta (SNc) und pars lateralis (SNl) befinden sich überwiegend DA Neurone, in der SN pars reticularis (SNr) überwiegend GABAerge Zellen. Rechts: Tyrosinhydroxylase-Immunfluoreszenzfärbung eines entsprechenden coronaren Hirnschnitts (Größenbalken entspricht 250 μm). Die TH kann im ventralen Mittelhirn als Markerenzym für DA Neurone verwendet werden, da es hier keine Noradrenalin- oder Adrenalin-produzierenden Zellen gibt (Björklund und Dunnett 2007).

Abbildung 1.3: Die elektrische Aktivität von dopaminergen Neuronen wird durch verschiedene somatodendritische Ionenkanäle moduliert

A, Somatodendritische Kalium-, Natrium- und Calciumkanäle sind an der Kontrolle des langsamen oszillatorischen Potentials beteiligt, welches der spontanen in vitro Pacemaker-Aktivität der DA Neurone zugrunde liegt. Zusätzlich kann diese Aktivität durch afferente Eingänge moduliert werden (nach Schiemann 2005). Weitere Erläuterungen siehe Text (Kapitel 1.1.3 und 1.1.4.2). B, Langsame Spontanaktivität eines DA Neurons der SNc. C, Die breiten Aktionspotentiale besitzen eine Schwelle von etwa -30 mV und erreichen Maximalwerte von +30 mV. Die Strichlinie zeigt jeweils 0 mV an.

Abbildung 1.4: In vivo Aktivitätsmuster von dopaminergen Neuronen

A, DA Neurone zeigen in vivo drei unterschiedliche Aktivitätsmuster: Pacemaker mit sehr regulären Interspike-Intervallen (oben), irreguläre Einzelspikes (Mitte) oder burstende Aktivität (unten). B, Extrazelluläre (oben) und intrazelluläre (unten) in vivo Burst-Aufnahmen von Grace und Bunney (1984a). Typischerweise nimmt im Verlauf des Bursts die Amplitude der Aktionspotentiale ab, ihre Dauer und die Dauer der Interspike-Intervalle dagegen zu.

Abbildung 1.5: Ausgewählte direkte Afferenzen der dopaminergen VTA Neurone

DA Neurone der VTA erhalten inhibitorische und exzitatorische Afferenzen aus verschiedenen Kernregionen. Glutamaterge Eingänge (rot) stammen aus dem präfrontalen Cortex (PFC), der Amygdala (Amyg), dem laterodorsalen Tegmentum (LDTg) und dem pedunculopontinen Nucleus (PPN). Aus dem LDTg und dem PPN stammen außerdem cholinerge Afferenzen. GABAerge Eingänge (blau) haben ihren Ursprung im ventralen Globus pallidum (VP), dem Nucleus accumbens (NAc) und dem rostromedialen tegmentalen Nucleus (RMTg). Zusätzlich gibt es Afferenzen durch GABAerge Neurone der VTA. Modulatorischen Einfluss haben monoaminerge Afferenzen (gelb) aus dem Locus coeruleus (LC, noradrenerg) und den Nuclei raphe (RN, serotonerg) (nach Morikawa und Paladini 2011).

Abbildung 1.6: Funktionelle Anatomie der Basalganglien

Das Striatum erhält afferente Eingänge aus corticalen und thalamischen Arealen. Innerhalb der Basalganglien werden die Informationen im sogenannten direkten bewegungsfördernden („Go“, rote Pfeile) und indirekten, bewegungsinhibierenden Weg („No-Go“, blaue Pfeile) verarbeitet. Die Ausgangskerne sind das GPi und die SNr. DA moduliert sowohl den direkten als auch den indirekten Weg (nach Gerfen und Surmeier 2011). Weitere Erläuterungen im Text.

Direct pathway

Indirect pathway

Direct pathway

Indirect pathway

Striatum

GPe

SNrGPi

Superiorcolliculus

PPNCorticalinput Basal

gangliaoutput

Corticalinput Basal

gangliaoutput

Cortico-striatal inputs

Thalamus

STN

Abbildung 1.7: Beispielaufgaben zur Überprüfung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses

Sowohl in Primaten als auch in Nagern kann die Leistungsfähigkeit des WM mit einfachen Tests überprüft werden. A, Beim Menschen wird beispielsweise eine „Delayed-Match-to-Sample“ Aufgabe genutzt, bei der die räumliche Position eines Objekts (hier des roten Kreises) nach einer Verzögerungszeit korrekt zugeordnet werden muss. B, Im Nager kann man diese Funktion mit einer T-förmigen Plattform untersuchen. Die Tiere beginnen einen Testlauf im langen Arm des „T“ und erhalten im ersten Arm eine Futterbelohnung. Nach einer kurzen Pause müssen sie in den zuvor unbetretenen Arm laufen, um auch eine zweite Belohnung zu bekommen (nach Kellendonk et al. 2009).

Abbildung 1.8: Dopaminwirkung im präfrontalen Cortex

A, Die Leistungsfähigkeit des WM hängt von einer optimalen D1R Aktivierung bzw. DA Konzentration im PFC ab. Sowohl zu viel als auch zu wenig Dopamin schadet der Leistung des WM. WM Defizite und eine Dopamin-Dysregulation im PFC treten beispielsweise bei der Schizophrenie auf (siehe Kapitel 1.2). B, Stark vereinfachtes Verschaltungsmuster der präfrontalen Neurone. Dopamin (DA) wirkt sowohl postsynaptisch an Pyramidenzellen (braun) und GABAergen Interneuronen (blau) als auch präsynaptisch an glutamatergen (Glu) Afferenzen aus anderen Cortexarealen, dem Hippocampus (HC) und dem Thalamus (Thal). Weitere Erläuterungen im Text. DB: Double-Bouquet-Interneurone, Ch: Chandelier-Interneurone.

Abbildung 1.9: Das D2-Rezeptor-Überexpressionsmodell

A, Die Kreuzung von zwei genetisch veränderten Mauslinien bewirkt eine selektive Überexpression des D2R im Striatum. Die humane Form des D2R wird unter der Kontrolle des Tetrazyklin-sensitiven Promoters (tetO) exprimiert. Der Tetrazyklin-Transaktivator (tTA) wird vom CaMKIIα-Promoter kontrolliert, welcher die Expression des D2R auf das Striatum beschränkt. Durch die Gabe des Antibiotikums Doxyzyklin (Dox), welches an den Transaktivator bindet, kann die Überexpression zu jedem beliebigen Zeitpunkt beendet werden. B, Die in situ Hybridisierung zeigt die streng begrenzte Expression des D2R im dorsalen und ventralen Striatum sowie im Tuberculum olfactorium (oben, Transgen an). Bereits nach fünf Tagen mit Doxyzyklin-Behandlung kann keine mRNA-Expression mehr nachgewiesen werden (unten, Transgen aus). C, Die Leistung in einem Test zur Überprüfung des Arbeitsgedächtnisses (T-förmige Plattform, Erläuterung siehe Abbildung 1.7) ist in Mäusen mit D2R-Überexpression (D2R OE) stark beeinträchtigt (oben). Auch nach Abschalten der transgenen Überexpression in adulten Tieren für mehrere Wochen brauchen D2R OEs länger, um das Kriterium (mindestens 11 von 12 Armeintritte korrekt) zu erreichen (unten; nach Kellendonk et al. 2006).

Tabelle 2.1: Extrazelluläre Lösungen der in vitro Elektrophysiologie

Tabelle 2.2: Liste der eingesetzten Blocker für Neurotransmitterrezeptoren

Tabelle 2.3: Pipettenlösungen der in vitro Elektrophysiologie

Tabelle 2.4: Pipettenlösung der in vivo Elektrophysiologie

Tabelle 2.5: Lösungen der Immunhistochemie

Tabelle 2.6: Liste der verwendeten Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe

Tabelle 2.7: Stereotaktische Koordinaten der Tracingareale

Abbildung 2.1: Dopaminerge Innervationsdichte der Tracingareale

A, Schematische Darstellung eines coronaren Hirnschnitts auf Höhe des PFC und des NAc (nach Paxinos und Franklin 2007; Bregma +1,9 mm). B, TH-Immunfluoreszenzfärbung (grün) des entsprechenden coronaren Hirnschnitts. In rot ist eine Spur der Beads der Injektionsstelle zu sehen (Größenbalken entspricht 200 μm). Die Ausschnitte 1 aus dem PFC bzw. 2 aus dem NAc werden in den Bildern C bzw. D vergrößert dargestellt. C - D, Deutlich erkennt man die unterschiedliche Dichte der TH-positiven Fasern zwischen PFC (C) und NAc (D), welche für die unterschiedlich langen Wartezeiten nach dem Tracing verantwortlich sind (Größenbalken entspricht 20 μm).

Tabelle 2.8: Stereotaktische Koordinaten der in vivo Messareale

Abbildung 2.2: Juxtazelluläre Einzelzellmarkierung

A, Originaldaten eines Labelling-Protokolls. Die modulierte zelluläre Aktivität ist selektiv in den 200 ms andauernden on-Pulsen zu beobachten. B, Schematische Darstellung des zugrunde liegenden applizierten Stroms. On- und off-Pulse besitzen jeweils eine Dauer von 200 ms.

Abbildung 2.3: Auswertung der elektrophysiologischen in vivo Daten

Zur Analyse des vorherrschenden Aktivitätsmusters wurden Autokorrelationshistogramme (ACHs) erstellt. In den ersten drei Teilabbildungen A - C wird im oberen Teil jeweils ein Ausschnitt aus Originalaufzeichnungen von extrazellulären in vivo Aktivitätsmustern gezeigt, im unteren Teil wird das zugehörige ACH dargestellt. Die grauen Anteile demonstrieren dabei das Original-ACH, die schwarze Linie eine geglättete Kurve. Die Klassifizierung erfolgte nach den Kriterien von Wilson et al. (1977) und Tepper et al. (1995). A, Ein ACH mit mindestens drei regelmäßigen Peaks wird durch eine sehr reguläre Pacemaker-Aktivität hervorgerufen. B, Irreguläre Aktivität verursacht ein flaches ACH ohne deutliche Peaks. C, Ein initialer Peak unterhalb von 160 ms ist typisch für ein burstendes Neuron. D, Die Definition eines Bursts in DA Neuronen von Grace und Bunney (1984a) wird noch heute angewendet – ein Burst beginnt mit einem Interspike-Intervall von weniger als 80 ms und endet, sobald ein Intervall 160 ms überschreitet (Balken in oberer Abbildung). Die mit Pfeilen markierten Aktionspotentiale des unteren Ausschnitts werden demnach als „Spikes im Burst“ gezählt. E, Die typische Aktionspotentialform von DA Neuronen bei extrazellulären in vivo Messungen ist triphasisch. Der initiale Peak (P1) weist häufig zu Beginn eine Schulter auf und wird gefolgt von einem prominenten negativen Ausschlag (P2). Meist ist danach auch ein weiterer positiver Ausschlag zu beobachten. In der Literatur wird sowohl die biphasische als auch die triphasische Dauer angegeben.

Abbildung 2.4: Protokolle der in vitro Elektrophysiologie

A, Hyperpolarisation in -25 pA-Schritten. B, Depolarisation durch Stromrampen ausgehend von einem Membranpotential von -60 mV. C, Depolarisation in 10 pA-Schritten ausgehend von einem Membranpotential von -60 mV. D, Depolarisierende Spannungssprünge zur Analyse des A-Stroms. E, Depolarisierende Spannungssprünge zur Analyse des Delayed Rectifiers. F, Hyperpolarisierende Spannungssprünge zur Analyse des H-Stroms.

Abbildung 3.1: Elektrophysiologische in vivo Aktivität von identifizierten dopaminergen VTA Neuronen

A - B, Repräsentative Beispiele der in vivo Aktivität von identifizierten DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A) und D2R OEs (B). Oben links wird jeweils ein Ausschnitt der Originalaktivität der Neurone gezeigt. Ein Aktionspotential in höherer zeitlicher Auflösung ist jeweils oben rechts dargestellt (Ausschnitt, Größenbalken entspricht 1 ms bzw. 0,1 mV; gemittelt aus ca. 20 Einzelaufnahmen). Der Rasterplot in der Mitte veranschaulicht das Feuerverhalten über einen längeren Zeitraum (50 s). Interspike-Intervall-Histogramme (oben rechts) geben einen ersten Aufschluss über das vorherrschende Aktivitätsmuster des Neurons. In der Kontrollzelle gab es viele Intervalle von weniger als 160 ms in einem breit auslaufenden Histogramm, was typisch für eine burstende Aktivität ist. Das schmale, gaußförmige Histogramm der Zelle von D2R OEs entsprach dagegen einem Pacemaker-Rhythmus. Die konfokalmikroskopische Aufnahme in der untersten Bildreihe lieferte den Nachweis der DA Identität der Neurobiotin-gefüllten Einzelzelle (grün) durch die TH-Färbung (blau). Der Größenbalken entspricht jeweils 20 μm.

Abbildung 3.2: Striatale D2R-Überexpression vermindert die mittlere Aktionspotentialrate von identifizierten dopaminergen VTA Neuronen in vivo

A, Über einen Zeitraum von 10 min wurde die zelluläre Aktivität aufgenommen und daraus die mittlere Frequenz der DA Neurone ermittelt. Es konnte eine signifikante Verminderung der Aktivität selektiv in den Neuronen der VTA beobachtet werden. B, Der Variationskoeffizient als Maß für die Regularität der Aktivität unterschied sich nicht in den einzelnen DA Subpopulationen zwischen Kontrollen und D2R OEs. C, Mit Hilfe von Autokorrelationshistogrammen wurde das vorherrschende Aktivitätsmuster bestimmt und eine Einteilung in Pacemaker, irreguläre und burstende Neurone vorgenommen. In der VTA nahm im D2R-Überexpressionsmodell die Anzahl der burstenden Zellen zu Gunsten von mehr irregulär feuernden Neuronen ab. Ein statistisch signifikanter Effekt ergab sich jedoch nur in der SN, in der mehr irregulär aktive Neurone zu finden waren.

Abbildung 3.3: Die Burst-Aktivität von dopaminergen VTA Neuronen des D2R-Überexpressionsmodells ist deutlich reduziert

A, Der Anteil von Aktionspotentialen in Bursts an der Gesamtzahl von Spikes (SFB) wurde nach dem klassischen 80/160 ms-Kriterium ermittelt. Bei den DA VTA Neuronen von D2R OEs war der Anteil auf weniger als die Hälfte der Kontrollzellen reduziert. B, Damit übereinstimmend war auch selektiv in den DA Neuronen der VTA eine signifikant verminderte Burstrate zu beobachten. C, Die durchschnittliche Anzahl von Aktionspotentialen innerhalb eines Bursts unterschied sich nicht zwischen DA Subpopulationen von Kontrolltieren und D2R OEs. D - E Darüber hinaus waren weder die mittlere Frequenz (D) noch die absolute Maximalfrequenz (E) in den Bursts verändert.

Abbildung 3.4: Funktionelle Kartierung der in vivo gemessenen dopaminergen Mittelhirnneurone

A, Funktionelle Kartierung der in vivo gemessenen DA Neurone von Kontrolltieren (linke Hälfte, gefüllte Symbole) und D2R OEs (rechte Hälfte, offene Symbole) hinsichtlich ihrer Spontanfrequenz. VTA (blau) und SN (grün) Neurone wurden jeweils in vergleichbaren Arealen der Subnuclei gemessen. B, Kartierung der identischen Zellen hinsichtlich ihres Burstverhaltens. Die Größe der Symbole entspricht hier dem prozentualen Anteil der Aktionspotentiale in Bursts (SFB). Die einzige DA VTA Zelle mit einem SFB von mehr als 25 % bei den D2R OEs befand sich in der lateralen VTA, während burstende Zellen der Kontrolltiere gleichmäßig in den VTA Subnuclei verteilt waren (Atlasvorlagen nach Paxinos und Franklin 2007).

Tabelle 3.1: Zusammenfassung der Ergebnisse der elektrophysiologischen in vivo Messungen von dopaminergen VTA und SN Neuronen

Abbildung 3.5: Elektrophysiologische in vivo Aktivität von dopaminergen VTA Neuronen nach Abschalten der striatalen D2R-Überexpression

A - B, Repräsentative Beispiele der in vivo Aktivität von identifizierten DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A) und D2R OEs (B) nach etwa fünfwöchiger Gabe von Doxyzyklin. Darstellung wie in Abbildung 3.1. Die Kontrollzelle wies eine burstende Aktivität auf, die sowohl im Originalausschnitt und Rasterplot gut zu erkennen war, als auch durch die Form des ISI-Histogramms reflektiert wurde. Das Neuron eines D2R OE Tiers (B) zeigte dagegen eine Spontanaktivität mit ähnlicher mittlerer Rate, aber sehr regulärer Pacemaker-Aktivität (Ausschnitt einzelnes Aktionspotential: Größenbalken 1 ms bzw. 0,1 mV). Die konfokalmikroskopische Aufnahme in der untersten Bildreihe lieferte den Nachweis der DA Identität der Neurobiotin-gefüllten Einzelzelle (grün) durch die TH-Färbung (blau; Größenbalken entspricht jeweils 20 μm).

Abbildung 3.6: Doxyzyklin-Gabe normalisiert die in vivo Frequenzen von dopaminergen VTA Neuronen im D2R-Überexpressionsmodell

A, Mittlere Frequenz der DA Mittelhirnneurone von Kontrolltieren und D2R OEs nach Abschalten der transgenen Überexpression durch fünfwöchige Doxyzyklin-Gabe. Die Spontanfrequenz von VTA bzw. SN Neuronen war identisch zwischen beiden Gruppen. B, Der Variationskoeffizient war signifikant geringer in den DA VTA Neuronen von D2R OEs im Vergleich zu Kontrollzellen. C, Damit übereinstimmend nahm in der VTA im D2R-Überexpressionsmodell die Anzahl der burstenden Zellen zu Gunsten von einem größeren Anteil von Zellen mit Pacemaker- und irregulärem Aktivitätsmuster ab.

Abbildung 3.7: Das Burstverhalten von dopaminergen VTA Neuronen im intakten Netzwerk ist auch nach Abschalten der transgenen D2R-Überexpression irreversibel beeinträchtigt

A, DA VTA Neuronen von D2R OEs wiesen auch nach fünfwöchiger Doxyzyklin-Gabe einen signifikant reduzierten Anteil von Aktionspotentialen in Bursts auf. B, Entsprechend konnte selektiv in den DA Neuronen der VTA eine signifikant verminderte Burstrate beobachtet werden. C, Bei der absoluten Maximalfrequenz innerhalb der Bursts ergab sich eine nicht signifikante Tendenz zu geringeren Werten in den DA VTA Neuronen von D2R OEs.

Tabelle 3.2: Ergebnisse der elektrophysiologischen in vivo Charakterisierung von dopaminergen VTA und SN Neuronen nach Doxyzyklin-induziertem Abschalten der striatalen D2R-Überexpression

Abbildung 3.8: Funktionelle Kartierung der in vivo gemessenen dopaminergen Neurone nach Abschalten der D2R-Überexpression durch Doxyzyklin-Gabe

A, Kartierung der in vivo gemessenen DA Neurone von Kontrolltieren (linke Hälfte, gefüllte Symbole) und D2R OEs (rechte Hälfte, offene Symbole) innerhalb des ventralen Mittelhirns hinsichtlich ihrer Spontanfrequenz. DA VTA (blau) und DA SN (grün) Neurone wurden auch in dieser Messreihe in vergleichbaren Arealen der Subnuclei gemessen. B, Mapping der identischen Zellen hinsichtlich ihres Burstverhaltens. Die Größe der Symbole entspricht hier dem prozentualen Anteil der Aktionspotentiale in Bursts (SFB). Die drei DA VTA Neurone der D2R OEs mit einem SFB von mehr als 5 % befanden sich an der lateralen Grenze der VTA zur SN (Atlasvorlagen nach Paxinos und Franklin 2007).

Abbildung 3.9: Die in vitro Spontanfrequenz ist selektiv erhöht in mesocorticalen und mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen von D2R OE Mäusen

A - B, Whole-Cell Ableitungen von mesocorticalen DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A) und D2R OEs (B) im akuten Hirnschnittpräparat. Die Zellen wiesen eine typische langsame Schrittmacher-Aktivität auf (jeweils oben links, die Strichlinie entspricht in allen Teilabbildungen -40 mV). Die breiten Aktionspotentiale (jeweils oben rechts) erreichten Maximalamplituden von etwa 20 mV und Nachhyperpolarisationen von etwa -45 mV. Die Neurobiotin-Füllung der Zellen während der Messung ermöglichte den späteren immunhistochemischen Nachweis der DA Identität durch eine TH-Färbung (jeweils unten; weiß: Retrobeads, grün: Neurobiotin, blau: TH; Größenbalken entspricht 20 μm). C - D Repräsentative Beispiele von mesolimbisch projizierenden DA VTA Neuronen eines Kontrolltiers (C) und eines D2R OE Tiers (D). E - F, Klassische DA Neurone der rostromedialen SN von Kontrollen (E) und D2R OEs (F). Im Gegensatz zu den retrograd markierten

Subpopulationen der VTA sieht man keine Beads in den DA SN Neuronen. G, Scatterplot der Frequenzen aller gemessenen DA Neurone. Die mesocorticalen und mesolimbischen DA VTA Subpopulationen (blau) wiesen eine signifikant höhere Spontanaktivität in D2R OE Mäusen auf (offene Symbole). Die Frequenz der DA SN Neurone (grün) unterschied sich dagegen nicht zwischen Kontrollen und D2R OEs.

Abbildung 3.10: Injektionsstellen und frequenzcodierte Kartierung der dopaminergen Subpopulationen

A, Rekonstruktion der Tracer-Injektionsstellen im mPFC (links) und NAc (rechts). Die linke Hälfte der jeweiligen Abbildung zeigt die Fluoreszenzaufnahme eines mit Nissl-Grün gefärbten coronaren Hirnschnitts, die rechte Hälfte die entsprechende Atlaskarte nach Paxinos und Franklin (2007). Der weiße Pfeil zeigt auf das Tracerdepot, welches sich im mPFC selektiv in prälimbischen (PrL) und infralimbischen (IL) Arealen, im NAc im Core (NAc C) und medialen Shell (NAc Sh) befindet. B, Funktionelle Kartierung der gemessenen mesocorticalen (linke Bildreihe) und mesolimbischen (rechte Bildreihe) DA VTA Neurone hinsichtlich ihrer Spontanfrequenz in coronaren Mittelhirnschnitten (nach Paxinos und Franklin 2007). Es konnte keine selektive Frequenzänderung in spezifischen Subnuclei der VTA beobachtet werden. C, Auch für die DA SN Neurone wurde eine frequenzcodierte Kartierung vorgenommen.

Abbildung 3.11: Aktionspotential-Parameter der dopaminergen Subpopulationen

A - D, Spontane Aktionspotentiale der einzelnen DA Subpopulationen wurden hinsichtlich Schwelle (A), Maximum (B), Nachhyperpolarisation (C) und Dauer bei halbmaximaler Amplitude (D) ausgewertet. Signifikante Unterschiede zwischen Kontrollen und D2R OEs wurden nur bei den Maximalwerten der mesolimbischen DA VTA und der DA SN Neurone beobachtet. Tendenziell zeigten mesocorticale und mesolimbische DA VTA Neurone von D2R OEs jeweils eine weniger ausgeprägte Nachhyperpolarisation. E - F, Auch die maximalen Geschwindigkeiten von Depolarisation (E) und Repolarisation (F) unterschieden sich in einzelnen DA Subpopulationen nicht zwischen Kontrollen und D2R OEs.

Abbildung 3.12: Striatale D2R-Überexpression hat keine Auswirkungen auf die induzierbaren in vitro Maximalfrequenzen von dopaminergen Neuronen

A - B, Rampenförmige Strominjektionen ermöglichen die Analyse der maximalen in vitro Frequenzen. Mesocorticale DA VTA Neurone von Kontrollen (A) und D2R OEs (B) zeigten im aufsteigenden und absteigenden Anteil der Rampe jeweils vergleichbare Aktivitätsmuster. C, Im statistischen Vergleich der absoluten Maximalfrequenzen konnte kein Unterschied innerhalb der DA Subpopulationen von Kontrollen und D2R OEs beobachtet werden.

Abbildung 3.13: Antwortverhalten der dopaminergen Neurone auf hyperpolarisierende Strominjektionen

A - D, Veränderung des Membranpotentials durch hyperpolarisierende Ströme in mesocorticalen DA VTA Neuronen (A, Kontrolle; B, D2R OE) und in nigrostriatalen DA SN Neuronen (C, Kontrolle; D, D2R OE). Die Strichlinie markiert in allen Teilabbildungen -40 mV. DA VTA Neurone besaßen eine geringe HCN-Kanal vermittelte Sag Amplitude. Typisch war ein langer Rebound Delay vom Ende der Strominjektion bis zum ersten folgenden Aktionspotential. DA SN Neurone wiesen dagegen eine prominente Sag Amplitude und einen kurzen Rebound Delay auf. E, Innerhalb der DA Subpopulationen ließen sich keine Unterschiede in der Sag Amplitude zwischen D2R OEs und Kontrollen beobachten. F, Hinsichtlich des Rebound Delays konnte eine signifikant längere Dauer in den nigrostriatalen DA SN Neuronen von D2R OEs ermittelt werden.

Abbildung 3.14: Passive Membraneigenschaften dopaminerger Mittelhirnneurone im D2R-Überexpressionsmodell

A, Vergleich der Kapazität der gemessenen DA Mittelhirnneurone, welche einen Rückschluss auf die Membranfläche und somit auf die Größe des Zellkörpers ermöglicht. Während in mesocorticolimbischen DA VTA Neuronen nur Tendenzen zu geringeren Kapazitäten in D2R OEs sichtbar wurden, zeigte sich in nigrostriatalen DA SN Neuronen ein signifikanter Unterschied. B, Der Eingangswiderstand unterschied sich nicht innerhalb der DA Subpopulationen von Kontrollen und D2R OEs.

Tabelle 3.3: Zusammenfassung der Ergebnisse der elektrophysiologischen in vitro Grundcharakterisierung der dopaminergen Subpopulationen im Current-Clamp-Modus in Kontrollen und D2R OEs

Abbildung 3.15: Innerhalb der dopaminergen Subpopulationen bestehen keine prägnanten Unterschiede in den Eigenschaften des A-Stroms

A - D, Mesocorticolimbische DA VTA Neurone wiesen einen A-Strom mit langsamer Inaktivierungskinetik auf (A, mesocortical Kontrolle; B, mesocortical D2R OE; C, mesolimbisch Kontrolle; D, mesolimbisch D2R OE). E - F, Bei DA SN Neuronen war die Inaktivierungskinetik deutlich schneller (E, Kontrolle; F, D2R OE). Die blau dargestellten Ströme wurden durch einen Spannungssprung von -100 mV auf -40 mV generiert und in allen Zellen statistisch ausgewertet. G, Hinsichtlich der Amplitude konnte eine signifikante Erhöhung selektiv in mesolimbischen DA VTA Neuronen von D2R OEs beobachtet werden. H , Bei der Inaktivierungskinetik wurden keine Unterschiede zwischen Kontrollen und D2R OEs festgestellt.

Tabelle 3.4: Ergebnisse der Voltage-Clamp-Messungen von dopaminergen Subpopulationen in Kontrollen und D2R OEs

Abbildung 3.16: Die erhöhte in vitro Spontanfrequenz von mesocorticolimbischen dopaminergen VTA Neuronen persistiert auch nach Abschalten der transgenen D2R-Überexpression

A - B, Beispiele von Spontanaktivität und individuellen Aktionspotentialen von mesocorticalen DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A) und D2R OEs (B) nach fünfwöchiger Behandlung mit Doxyzyklin. Die Strichlinie entspricht in allen Teilabbildungen -40 mV. Die konfokalmikroskopischen Bilder im unteren Teil der jeweiligen Abbildung zeigen den immunhistochemischen Nachweis durch die TH-Färbung (blau; Neurobiotin grün; Beads weiß). Der Größenbalken entspricht 20 μm. C - D, Entsprechende Darstellung von mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrollen (C) und D2R OEs (D). E - F, Beispiele der DA Neurone aus der rostromedialen SN von Kontrollen (E) und D2R OEs (F). G, Der statistische Vergleich der jeweiligen Subpopulationen ergab irreversibel erhöhte Spontanfrequenzen in den mesocorticolimbischen DA VTA Neuronen von D2R OEs auch nach Abschalten der transgenen D2R-Überexpression, während nigrostriatale DA SN Neurone weiterhin eine unveränderte Aktivität zeigten.

Abbildung 3.17: Frequenzcodierte Kartierung der gemessenen Neurone einzelner dopaminerger Subpopulationen nach Doxyzyklin-Gabe

A, Frequenzcodierte Kartierung der nach Abschaltung der transgenen D2R-Überexpression gemessenen DA VTA Neurone (links: mesocortical, rechts: mesolimbisch). Die Eintragungen in den Subnuclei des ventralen Mittelhirns erfolgten mit Hilfe der Atlasvorlagen von Paxinos und Franklin (2007). B, Entsprechendes Mapping der DA SN Neurone dieser Messreihe. Die Zellen von Kontrollen und D2R OEs befanden sich jeweils in vergleichbaren Arealen.

Abbildung 3.18: Die in vitro Maximalfrequenz von mesocorticolimbischen dopaminergen VTA Neuronen von D2R OE Mäusen wird durch Doxyzyklin-Gabe erhöht

A - B, Repräsentative Beispiele der zellulären Reaktionen auf depolarisierende Stromrampen von mesocorticalen DA VTA Neuronen von Kontrollen (A) und D2R OEs (B) nach etwa fünfwöchiger Behandlung mit Doxyzyklin. C, Vor dem Eintreten des Depolarisationsblocks konnten mesocorticale und mesolimbische DA VTA Neurone von D2R OEs signifikant höhere Maximalfrequenzen erreichen. In nigrostriatalen DA SN Neuronen von D2R OEs war die Maximalfrequenz im Vergleich zu Kontrollen dagegen vermindert.

Abbildung 3.19: Passive Membraneigenschaften dopaminerger Mittelhirnneurone nach Abschalten der striatalen D2R-Überexpression

A, Nach fünfwöchiger Behandlung mit Doxyzyklin war die Kapazität der mesocorticolimbischen DA VTA Neurone von D2R OEs im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant vermindert. Bei DA Zellen der SN konnte im Gegensatz zu Kontrollbedingungen kein Unterschied mehr nachgewiesen werden. B, Darüber hinaus war der Eingangswiderstand von mesolimbischen DA VTA Neuronen von D2R OEs unter diesen Bedingungen signifikant gesteigert. Eine vergleichbare Tendenz zeichnete sich in mesocorticalen DA VTA Neuronen ab.

Tabelle 3.5: Ergebnisse der Current-Clamp-Experimente nach Doxyzyklin-induziertem Abschalten der transgenen D2R-Überexpression

Abbildung 3.20: Der NMDA-Rezeptor Antagonist DL-AP5 normalisiert die in vitro Frequenz von mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen

A - B, Repräsentative Beispiele von Spontanaktivität und Aktionspotentialen der mesolimbischen DA VTA Neurone von Kontrollmäusen (A) und D2R OEs (B) unter dem Einfluss des nicht Subtyp-spezifischen NMDA-Rezeptor Antagonisten DL-AP5. Die Strichlinie markiert -40 mV. Die konfokalmikroskopischen Aufnahmen bestätigten die DA Identität (Größenbalken: 20 μm). C, Im statistischen Vergleich konnten bei pharmakologischer Blockade von NMDA-Rezeptoren keine unterschiedlichen Spontanfrequenzen zwischen Kontrollen und D2R OEs beobachtet werden.

Abbildung 3.21: NMDA-EPSCs in mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen weisen eine langsamere Decay-Kinetik in D2R OE Mäusen auf

A, Schematische Darstellung der Messkonfiguration zur Stimulation der glutamatergen Afferenzen im coronaren Hirnschnitt. Die Stimulationselektrode (Stim) wurde 100-300 μm lateral zur Messpipette (Rec) bzw. Zellkörper positioniert. B, Repräsentative Beispiele der NMDA-EPSCs (gemittelt aus etwa 10 Einzelantworten) von mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrollmäusen (B1) und D2R OEs (B2) bei einem Haltepotential von +40 mV. Die Amplituden wurden zur besseren Vergleichbarkeit normalisiert. C, Die gewichtete Zeitkonstante τW des Decays wurde mittels Anpassung einer doppelten Exponentialfunktion bestimmt. In den mesolimbischen DA VTA Neuronen konnten signifikant langsamere Zeitkonstanten beobachtet werden. D, Die Absolutwerte der Amplitude unterschieden sich nicht zwischen mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrollen und D2R OEs. E, Zur Erstellung der Strom-Spannungskurven der NMDA-EPSCs wurden die Stromamplituden bei Haltepotentialen zwischen -80 mV und +60 mV gemessen. Die Normierung erfolgte anhand der Amplitude bei einem Haltepotential von +40 mV. Es konnten keine Veränderungen zwischen den mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrollen und D2R OEs festgestellt werden.

Abbildung 3.22: Die langsamere Decay-Kinetik von NMDA-EPSCs in mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen persistiert nach Abschalten der transgenen D2R-Überexpression

A, Repräsentative Beispiele von NMDA-EPSCs in mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A1) und D2R OEs (A2) nach fünfwöchiger Behandlung mit Doxyzyklin. Die dargestellten Ströme wurden aus etwa 10 Einzelantworten bei einem Haltepotential von +40 mV gemittelt und ihre Amplituden zur besseren Vergleichbarkeit normalisiert. B, Die mittlere gewichtete Decay-Zeitkonstante τW war auch nach Abschalten der transgenen D2R-Überexpression signifikant langsamer in mesolimbischen DA VTA Neuronen von D2R OE Mäusen. C, Unter dem Einfluss von Doxyzyklin waren die Stromamplituden signifikant vermindert in den Zellen von D2R OEs. D, Bei den Strom-Spannungskurven konnten keine Unterschiede zwischen den Neuronen von D2R OEs und Kontrollen festgestellt werden.

Tabelle 3.6: Effekte des selektiven NR2B-Antagonisten Ifenprodil auf die NMDA-EPSCs von dopaminergen VTA Neuronen

Abbildung 3.23: NR2B-Untereinheiten verursachen die langsamere Decay-Kinetik von NMDA-Rezeptor vermittelten Strömen in mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen

A, Repräsentative Beispiele von normalisierten NMDA EPSCs von mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrolltieren (A1) und D2R OEs (A2). Die Ströme unter Kontrollbedingungen (schwarze Linie) und in Ifenprodil (10 μM, grüne Linie) wurden jeweils in identischen Zellen bei einem Haltepotential von +40 mV gemessen und aus etwa 10 Einzelantworten gemittelt. B, Für individuelle Zellen wurde die mittlere gewichtete Zeitkonstante τW vor (schwarz) und nach fünfminütiger Ifenprodil-Applikation (grün) aufgetragen. Während in Kontrolltieren keine Veränderungen durch das Einwaschen des selektiven NR2B-Antagonisten beobachtet werden konnten, war eine deutliche Verringerung der Zeitkonstante in einzelnen DA VTA Neuronen von D2R OEs erkennbar. C - D, Diese Veränderungen galten sowohl für die schnelle (C), als auch für die langsame (D) Komponente des Decays. E, Unter dem Einfluss von Ifenprodil (Ifen) wurden die NMDA-EPSCs von zusätzlichen mesolimbischen DA VTA Neuronen gemessen. Unter diesen Bedingungen konnten identische Zeitkonstanten bei Kontrollen und D2R OEs ermittelt werden. F, Dabei unterschieden sich auch die absoluten Amplituden der NMDA Ströme nicht. G, In Ifenprodil konnten keine Veränderungen der Strom-Spannungskurve zwischen Kontrollen und D2R OEs beobachtet werden.

Abbildung 3.24: Ifenprodil normalisiert die Spontanfrequenz von mesolimbischen dopaminergen VTA Neuronen im D2R-Überexpressionsmodell

A - B, Beispiele von spontaner Aktivität und Aktionspotentialen von mesolimbischen DA VTA Neuronen von Kontrollmäusen (A) und D2R OEs (B) unter dem Einfluss des selektiven NR2B-Antagonisten Ifenprodil (10 μM). Die Strichlinie markiert jeweils -40 mV. Die konfokalmikroskopischen Aufnahmen auf der rechten Seite dienten dem Nachweis der DA Identität (Größenbalken: 20 μm). C, Im statistischen Vergleich konnten bei pharmakologischer Blockade von NR2B-Untereinheiten keine Unterschiede in der Spontanfrequenz von Kontrollen und D2R OEs festgestellt werden.

Tabelle 4.1: In vivo Aktivität von dopaminergen VTA Neuronen im D2R-Modell im Vergleich mit anderen Schizophrenie-Modellen

Abkürzungen: poly I:C: Polyriboinosin-Polyribocytidil Säure; MAM: Methylazoxymethanolacetat; PCP: Phencyclidin; PBP: Ncl. parabrachialis pigmentosus; PN: Ncl. paranigralis (Erläuterungen im Text).

Abbildung 4.1: Lokalisation des transgenen D2R in den striatalen MSN Populationen

A, In situ Hybridisierung mit Sonden für endogene D1R (grün) und transgene D2R (rot). In blau sind die Nuclei der striatalen Zellen angefärbt. Einige Zellen weisen eine Kolokalisation von D1R und D2R auf (weiße Pfeile). B, Im Vergleich zu Kontrollen nimmt der Anteil von MSN mit einer Koexpression von D1R und D2R in D2R OEs zu. Der Anteil der Neurone mit selektiver Expression von D2R bleibt konstant, die Fraktion der Zellen selektiv mit D1R nimmt dagegen ab. Unveröffentlichte Daten zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Eleanor Simpson (Columbia University, New York).

Abbildung 4.2: Mögliche Veränderungen in den mesostriatalen Feedback-Schleifen durch den transgenen D2-Rezeptor

A, D1R exprimierende MSN des Striatums werden durch DA aktiviert. Sie projizieren mit ihren axonalen Fortsätzen zurück in das Mittelhirn, wo sie präferentiell GABAerge Neurone der VTA (oder der SNr) inhibieren. B, Durch die zusätzliche Expression des D2R in den D1R-MSNs sinkt ihre Erregbarkeit durch DA. Der inhibitorische Einfluss auf Neurone des Mittelhirns nimmt ab, was durch die präferentielle Verschaltung mit den dortigen GABAergen Neuronen zu einer Disinhibition dieser Zellen führt. Als Folge werden die DA Neurone der VTA (und der SN) stärker durch die benachbarten GABAergen Zellen inhibiert. Weitere Erläuterungen und Literaturverweise im Text.