E M XPRESIÓN DE I I , C NNATA ITOCINAS E Ig M I UCOSA R E ...

MÉXICO, D. F. 2011

EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS DE LA INMUNIDAD

INNATA, CITOCINAS E IgA SECRETORIA EN LA

MUCOSA INTESTINAL DE RATONES SOMETIDOS A

EJERCICIO

T E S I S

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

DIRECTORES DE TESIS

DRA. ETHEL A. GARCÍA LATORRE

DR. RAFAEL CAMPOS RODRÍGUEZ

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

P R E S E N T A

M A R Í A D E J E S Ú S V I L O R I A B E L T R Á N

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

EXPRESIÓN DE MOLÉCULAS DE LA INMUNIDAD INNATA, CITOCINAS E IgA SECRETORIA EN LA MUCOSA INTESTINAL DE RATONES SOMETIDOS A EJERCICIO

Mary Viloria

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Mary Viloria

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Mary Viloria

AGRADECIMIENTOS

Mil gracias a todas las personas que contribuyeron a la culminación

de mis estudios de doctorado, y a las que hicieron agradable mi

estancia en la Escuela Superior de Medicina.

DRA. ETHEL GARCÍA LATORRE, gracias por haberme aceptado en el

posgrado a pesar de las circunstancias, gracias por permitirme

cambiar de proyecto, gracias por sus consejos y, en especial,

gracias por todo su apoyo y comprensión.

DR. RAFAEL CAMPOS RODRÍGUEZ, gracias por darme la libertad de

pensar, decir, hacer y escribir lo que creí conveniente. Gracias por

compartir sus conocimientos conmigo, gracias por darme su punto

de vista respetando el mío, gracias por las discusiones que, además

de divertidas, fueron muy enriquecedoras, y gracias por su

paciencia.

DR. PEDRO LÓPEZ SÁNCHEZ, gracias por abrirme las puertas de su

laboratorio para estandarizar el Western Blot, gracias también por las

horas de trabajo y por toooooodas las horas de psicoterapia!

Q. F. B. TERESITA CRUZ HERNÁNDEZ, gracias por tu asesoría en las

técnicas de Biología Molecular y gracias por la compañía en las

tardes-noches de trabajo en el laboratorio.


Mary Viloria

DR. ALEXANDER KORMANOVSKY, gracias por su colaboración en la

cuantificación de las hormonas, y gracias también por las donas, los

cuernitos, el café, las galletas, los pasteles...

A todos los compañeros del laboratorio GLORIA, MONTSE, MARTÍN,

PABLO N, PABLO B, TONY, LUZ, ELIA, ELISA... espero que no me falte

alguno... gracias por aguantar mis gritos, obsesiones y berrinches, y

gracias también por alegrar mis días.


Mary Viloria

ÍNDICE GENERAL

ABREVIATURAS ........................................................................................... i

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................... ii

ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................... ii

RESUMEN .................................................................................................... iii

ABSTRACT ................................................................................................. iv

I.- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1

ANTECEDENTES ........................................................................................... 7

JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 9

HIPÓTESIS ……............................................................................................ 9

OBJETIVOS .................................................................................................. 10

II.- MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 11

ANIMALES ............................................................................................. 12

PROTOCOLO DE ENTRENAMIENTO ...................................................... 12

OBTENCIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO ............................................... 13

CUANTIFICACIÓN DE CORTICOSTERONA Y NOREPINEFRINA .............. 14

ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE S-IgA........................................ 14

EXPRESIÓN DE CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE INMUNIDAD INNATA POR

PCR EN TIEMPO REAL ................................................................... 15

WESTERN BLOT ..................................................................................... 16

III.- RESULTADOS ............................................................................................. 18

MOLÉCULAS DE INMUNIDAD INNATA .................................................. 19


Mary Viloria

S-IgA ................................................................................................... 20

CADENA α, CADENA J Y pIgR .......................................................... 21

EXPRESIÓN DE CITOCINAS ................................................................... 21

CUANTIFICACIÓN DE HORMONAS .................................................... 24

IV.-DISCUSIÓN ............................................................................................... 25

V.- CONCLUSIONES ......................................................................................... 29

VI.-BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 31


i

ABREVIATURAS

BALT Tejido linfoide asociado a bronquios

ELISA Inmunoensayo enzimático

GALT Tejido linfoide asociado al tracto gastrointestinal

Ig Inmunoglobulina

IL Interleucina

LPS Lipopolisacárido

MALT Tejido linfoide asociado a mucosas

NALT Tejido linfoide asociado a nasofaringe

PAMP Patrones moleculares asociados a patógenos

PBS Solución reguladora de fosfatos

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

pIgA IgA polimérica

pIgR Receptor de inmunoglobulina polimérica

PRR Receptores de reconocimiento de PAMPS

RT-PCR PCR con transcriptasa reversa

S-IgA IgA secretoria

TLR Receptor Tipo Toll

Tregs Células T reguladoras

WB Western Blot


ii

RELACIÓN DE FIGURAS

FIGURA 1.- Expresión relativa de mRNA de moléculas de

inmunidad innata

FIGURA 2.- Cuantificación de S-IgA en lavados intestinales

FIGURA 3.- Expresión relativa de mRNA de cadena α, cadena

J y pIgR

FIGURA 4.- Expresión relativa de las proteínas cadena α,

cadena J y pIgR

FIGURA 5.- Expresión relativa de mRNA de citocinas de

inmunidad innata

FIGURA 6.- Expresión relativa de mRNA de citocinas de

inmunidad adaptativa

TABLAS

TABLA 1.- Primers utilizados para la PCR en tiempo real

TABLA 2.- Concentraciones plasmáticas de corticosterona y

norepinefrina


iii

RESUMEN

El propósito de este trabajo fue determinar el efecto del ejercicio

moderado sobre la producción y secreción de IgA en el duodeno de

ratones, así como también el efecto sobre la expresión de los genes que

codifican para moléculas de inmunidad innata y sobre las citocinas que

regulan la síntesis tanto de la cadena α como del pIgR. Se utilizaron ratones

macho de la cepa Balb/c distribuidos en 2 grupos, uno sedentario y el otro

fue sometido a un programa de ejercicio (natación) durante 16 semanas.

Los niveles de IgA en la luz del duodeno fueron medidos por ELISA; la

expresión génica fue analizada por PCR en tiempo real y la expresión de

proteínas por Western Blot. El entrenamiento físico provocó un aumento en

los niveles de IgA, así como en la expresión de las moléculas de inmunidad

innata α-defensina, lisozima y fosfolipasa. Además, el ejercicio incrementó

la expresión de los genes que codifican para IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α y TGF-β,

citocinas que regulan la síntesis de IgA y de pIgR, la respuesta inflamatoria

y la respuesta inmunológica en general. Entonces, el incremento de IgA

encontrado en la luz del duodeno se debe, probablemente, al aumento

en la producción de IgA y al incremento en el transporte de complejos

pIgA-pIgR a través de las células epiteliales.


iv

ABSTRACT

The aim of the present study was to determine the effect of

moderate exercise on the production and secretion of IgA in mouse

duodenum and on gene expression encoding for innate immunity

molecules and cytokines that regulate the synthesis of α-chain of IgA

and the expression of pIgR in the lamina propria. Two groups of

young Balb/c mice were fed ad libitum, one sedentary and the other

with an exercise program (swimming) for 16 weeks. IgA levels in the

duodenum were quantified by ELISA; gene expression was analyzed

by real-time PCR, and the expression of proteins by Western blotting.

Because of physical training, in the duodenum there was an increase

in the levels of IgA, defensins, lysozime and phospholipase.

Additionally, exercise increased the expression of the genes

encoding for IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α and TGF-β, cytokines that regulate

the synthesis of IgA and pIgR, the inflammatory response, and the

immune response in the intestine. Thus, the increased IgA found in the

duodenal lumen is probably due to the increased production of IgA

in the LP and the increased transport of the pIgA-pIgR complex

across epithelial cells.

INTRODUCCIÓN


Mary Viloria 2

INTRODUCCIÓN

Las mucosas han desarrollado un aparato inmune grande y

complejo que es anatómica y funcionalmente diferente al resto del

sistema inmunológico, formando una red denominada tejido linfoide

asociado a mucosas (MALT, por sus siglas en inglés) (Lycke, 2002).

El MALT comprende elementos linfoides asociados con las

superficies internas del cuerpo como son el tejido linfoide asociado al

tracto gastrointestinal (GALT, por sus siglas en inglés), el tejido linfoide

asociado a los bronquios y a la nasofaringe (BALT y NALT

respectivamente) (Bienenstock & McDermott, 2005) y el tejido linfoide

asociado al tracto urogenital (Wira et al, 2005); además incluye

glándulas de secreción exócrina que están ligadas a estos órganos,

como las glándulas salivales, lagrimales, mamarias y el páncreas

(Lycke, 2002).

El intestino no es sólo un lugar de transporte y absorción de

alimentos, al ser la superficie más vulnerable del cuerpo que

interactúa con el ambiente externo, representa también una barrera

inmunológica. Estas funciones de barrera y transporte, aunque

contradictorias, pueden llevarse a cabo debido a la polarización del

epitelio intestinal y a la heterogeneidad tanto axial (del duodeno al

colon), como vertical (de la vellosidad a la cripta). La regionalización

de las funciones de transporte está altamente regulada por los

sistemas neuronal, parácrino, endócrino e inmunológico (Field, 2003;

Sellin, 2003).


Mary Viloria 3

Si el intestino estableciera respuestas inmunológicas dirigidas

contra lo “no propio”, como pasa en los mecanismos inmunológicos

sistémicos, las consecuencias serían desastrosas. En términos estrictos

la tolerancia oral es “una forma de tolerancia periférica donde los

linfocitos maduros presentes en ganglios periféricos no responden a

antígenos previamente administrados por vía oral” (Strobel & Mowat,

1998). Nuestra dieta contiene una gran cantidad de moléculas que

continuamente pasan intactas a la circulación general, de tal manera

que el intestino tiene que impedir una respuesta inmunológica

sistémica contra antígenos alimenticios y, al mismo tiempo, tiene que

ignorar —inmunológicamente hablando— la presencia de

microorganismos comensales, pero debe de ser capaz de reconocer

y eliminar sustancias y microorganismos patógenos.

La primera línea de defensa en el GALT la proporciona el moco

presente entre los enterocitos y la luz del intestino (Cario et al, 2002).

Curiosamente, esta barrera provee también de los nutrientes que

permiten el asentamiento de la flora bacteriana necesaria para resistir

la colonización por microorganismos patógenos (Deplancke &

Gaskins, 2001; Bourlioux et al, 2003; Nagler-Anderson, 2001). Está

constituida por diversos tipos de mucinas cuyas proporciones varían

de acuerdo a los microorganismos presentes en la luz intestinal

(Deplancke & Gaskins, 2001). También contiene enzimas bacteriolíticas

como la lisozima y la fosfolipasa A2, así como péptidos

antimicrobianos como las α-defensinas (Müller et al, 2005).

Los mecanismos de inmunidad innata pueden impedir el paso

de los microorganismos comensales a la lámina propia, restringiendo

su localización a la luz del intestino. Ocasionalmente pueden traspasar

la capa de enterocitos a través de las células M o las dendríticas sin


Mary Viloria 4

que esto represente daño al hospedero (Mach et al, 2005). En la

lámina propia residen abundantes macrófagos capaces de

reconocer, fagocitar y matar microorganismos, por pertenecer a un

fenotipo diferente [ausencia del receptor para lipopolisacárido (LPS),

ausencia de estallido respiratorio, producción nula de citocinas, etc.]

son incapaces de presentar antígenos y de disparar respuestas

inflamatorias locales, manifestándose lo que se conoce como anergia

inflamatoria (Smith et al, 2005).

La decisión de montar o no una respuesta adaptativa depende

de la forma cómo un antígeno logre accesar a la lámina propia: los

patógenos invasivos rompen la capa epitelial (Mayer, 2003). La

respuesta adaptativa inicia con la inducción de la expresión de

moléculas coestimuladoras en las células dendríticas inmaduras, al

cambiar su fenotipo adquieren la capacidad de activar a los linfocitos

T. Las células dendríticas pueden madurar mediante 2 mecanismos:

1. Por interacción entre los Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

(PAMPS) y los Receptores de Reconocimiento de PAMPS (PRR), como

los Receptores Tipo Toll (TLR) (Nagler-Anderson, 2001)

2. Por citocinas proinflamatorias producidas por enterocitos que hayan

interactuado con microorganismos también a través de TLR’s o que se

encuentren bajo estrés por infección (Kelsall & Leon, 2005).

La inflamación es una respuesta fisiológica que, probablemente,

haya evolucionado como una adaptación para restablecer la

homeostasia después de un daño tisular. Como no discrimina entre

microorganismos y células propias, generalmente hay daños

colaterales que no son graves gracias a que se resuelve rápidamente

(Medzhitov, 2008). Si hay fallas en los mecanismos de regulación y

desbalance de citocinas pro y anti-inflamatorias, la inflamación


Mary Viloria 5

puede volverse crónica, provocando la destrucción del epitelio

intestinal (Monteleone et al, 2002; Sanchez-Muñoz et al, 2008).

La enorme carga antigénica que recibe el intestino requiere de

abundante producción de anticuerpos que lo provean de un sistema

de combate no inflamatorio (Shroff et al, 1995). Mientras el isotipo IgG

activa complemento y origina una respuesta inflamatoria, la IgA

presenta propiedades antiinflamatorias que impiden que la integridad

de la mucosa se vea alterada. La S-IgA tiene la capacidad de

neutralizar la actividad biológica de toxinas, enzimas y virus, la

neutralización de estos últimos no sólo ocurre en la luz intestinal, sino

también en el interior de los enterocitos (Mazanec et al, 1992).

En lo que se lleva a cabo una respuesta adaptativa primaria

contra un patógeno, los sistemas nervioso y endócrino son vitales para

el desalojo inespecífico del contenido intestinal (Lundgren, 2004). La

inducción de vómito, el aumento de secreciones y los cambios en la

motilidad intestinal, aseguran un lavado completo del intestino (Field,

2003; Spiller, 2002). Algunas citocinas como IL-1β, IL-6 y TNF-α llegan al

cerebro provocando cambios en el comportamiento del individuo

tales como anorexia y aversión a ingerir el alimento que el sistema

nervioso asocia como causante del vómito (Holzer et al, 2001).

Mientras todo esto ocurre se generan diversos tipos de células T

reguladoras (Tregs) capaces de moderar la intensidad de la respuesta

inmunológica y evitar así daño al hospedero (Faria & Weiner, 2005). En

modelos animales donde las Tregs están ausentes o no son

funcionales, se generan estados de inflamación intestinal crónica

similares a la colitis ulcerativa y a la enfermedad de Crohn en el ser

humano (Elson et al, 2005). La etiología de estos dos padecimientos

aún no se ha esclarecido pero, además de las fallas en los


Mary Viloria 6

mecanismos de regulación del sistema inmunológico, están

involucrados diversos mecanismos de la inmunidad innata, factores

ambientales, genéticos y microbiológicos (Sartor, 2006).


Mary Viloria 7

ANTECEDENTES

La actividad física es un proceso complicado que requiere de

una serie de interacciones entre varios sistemas corporales. Activa al

sistema nervioso simpático y al eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, con la

consecuente liberación de catecolaminas y glucocorticoides,

respectivamente (Kregel, 2006; Wilmore & Costill, 2007; Irwin, 2008).

Estos cambios fisiológicos se denominan “estrés” y son un intento

normal del cuerpo para mantener o restaurar la homeostasia y

asegurar la supervivencia del organismo (Prasanta, 1998; McEwen,

1998).

Una respuesta provocada por cualquier agente estresante es

sostenida por un tiempo y luego desaparece, el resultado es un

organismo más adaptado, de tal manera que el mismo agente no

volverá a disparar una respuesta estresante (McEwen, 1998). Así, los

sistemas corporales reaccionan de forma diferente ante una serie de

ejercicio extenuante (reacción aguda) y ante un entrenamiento a

largo plazo (adaptación crónica) (Wilmore & Costill, 2007).

La evidencia clínica y experimental sugiere que el estrés

desempeña un papel prominente en la patofisiología y la

presentación clínica de las enfermedades inflamatorias del intestino,

es decir, el estrés exacerba la inflamación (Mawdsley & Rampton,

2005; Collins, 2001); sin embargo, comúnmente se acepta que

cualquier tipo de estrés provoca supresión de la respuesta

inmunológica debido a la liberación de glucocorticoides. La relación

entre estrés e inmunosupresión data de la década de los 80’s, cuando


Mary Viloria 8

se medían solamente parámetros de inmunidad sistémica adaptativa

como proliferación de linfocitos y concentraciones plasmáticas de

anticuerpos (Fleshner & Laudenslager, 2004). Estudios más recientes

proponen que el estrés activa algunos mecanismos del sistema

inmunológico, dependiendo del grado y de la duración de la

exposición (Prasanta, 1998; McEwen, 1998; Fleshner & Laudenslager,

2004; Solomon, 2001; García-Bueno & Leza, 2008).

Recientemente, en el laboratorio se ha demostrado que el

estrés por inmovilización afecta los niveles intestinales de IgA (Jarillo-

Luna et al, 2007), así como la población de linfocitos intraepiteliales de

la mucosa duodenal de los ratones (Jarillo-Luna et al, 2008). Algunos

investigadores han examinado la relación entre S-IgA en saliva y

condiciones estresantes, tales como ejercicio intenso, estado de

humor y exámenes académicos, con resultados contradictorios,

algunos estudios muestran disminución de S-IgA mientras que otros,

aumento o ningún cambio (Mackinnon, 1999).

Por otra parte, diversos estudios han analizado el efecto del

ejercicio intenso sobre diversas poblaciones celulares como

macrófagos peritoneales (Ortega et al, 1993) y linfocitos intestinales

(Hoffman-Goetz & Quadrilatero, 2003; Hoffman-Goetz et al, 2004;

Marra et al, 2005). Sin embargo, poco se sabe del efecto del ejercicio

en la expresión de citocinas y moléculas de inmunidad innata en el

GALT.


Mary Viloria 9

JUSTIFICACIÓN

La adaptación al ejercicio crónico tiene efectos benéficos

sobre la salud y la esperanza de vida. Produce cambios en la

composición corporal, el metabolismo, en sistema cardiovascular

(Warburton et al, 2006), y se le atribuyen propiedades antiinflamatorias

(Petersen & Pedersen, 2005). Activa los sistemas de reparación de DNA

y la resistencia contra el estrés oxidativo, mientras que el ejercicio

extenuante genera estrés oxidativo (Navarro & Boveris, 2007). Sin

embargo, los efectos del ejercicio sobre el sistema inmunológico de la

mucosa intestinal no se han explorado detalladamente.

HIPÓTESIS

“El ejercicio moderado incrementa los mecanismos de protección en

la mucosa del intestino proximal”.


Mary Viloria 10

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar los cambios en la expresión de moléculas de inmunidad

innata, S-IgA y citocinas en la mucosa del intestino proximal debido al

ejercicio.

OBJETIVOS PARTICULARES

1. Determinar la influencia del ejercicio sobre la expresión de las

moléculas de inmunidad innata defensina-α, lisozima, fosfolipasa A2 y

TLR4 en la mucosa del intestino proximal de ratón.

2. Determinar la influencia del ejercicio sobre la secreción de S-IgA hacia

la luz del intestino proximal, así como de las moléculas involucradas en

su formación: Cadena α, Cadena J y pIgR.

3. Determinar la influencia del ejercicio sobre expresión de las citocinas

IL2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, TNF-α y TGF-β.

4. Determinar la concentración plasmática de corticosterona y

norepinefrina en ratones entrenados y sedentarios.

MATERIALES Y

MÉTODOS


Mary Viloria 12

MATERIALES Y MÉTODOS

ANIMALES

Se utilizaron ratones machos de la cepa Balb/c obtenidos de Harlan

Sprague Dawley Inc. y se distribuyeron en 2 grupos: sedentarios y

entrenados, con 6 ratones cada uno. Los ratones se adquirieron recién

destetados (edad de 21 días) y se mantuvieron en el bioterio de la

ESM hasta su sacrificio a las 27 semanas de edad. Recibieron una

dieta balanceada NIH-31 y agua potable ad libitum, permanecieron

en jaulas individuales con ciclos de luz-oscuridad de 12 horas (las luces

se encienden a las 8:00 a.m.). Se les permitió adaptarse a estas

condiciones durante 5 semanas antes de iniciar el entrenamiento.

PROTOCOLO DE ENTRENAMIENTO

Se eligió la natación como modelo de ejercicio con sesiones de 60

minutos 3 veces por semana, durante 4 meses, en condiciones que

redujeran al máximo la posibilidad de estrés. Los ratones no se

trasladaron a otra habitación para las sesiones de nado.

Se diseñaron tinas de plástico transparente de 1x0.8m, lo que permitía

a los ratones ver hacia el exterior y orientarse. Se utilizaron separadores

para formar compartimentos individuales de 0.25x0. 26m (12 en cada

tina) con una profundidad de 0.40m, la distancia de la superficie del

agua al límite superior de los separadores fue de 0.10m. El hecho de

nadar en compartimientos separados impedía que los ratones se


Mary Viloria 13

montaran unos encima de otros. La temperatura del agua se mantuvo

entre 30 y 32°C y, después de cada sesión, los ratones se secaron con

una toalla para impedir que descendiera su temperatura corporal.

El entrenamiento para el nado inició con un periodo de adaptación a

las 9 semanas de edad. La primera sesión fue de 10 minutos y

diariamente se fueron incrementando 5 minutos, de tal manera que al

quinto día nadaron 30 minutos. Se les permitió descansar dos días

para continuar con sesiones diarias de 30 minutos durante 5 días de la

semana 10 de vida. Nuevamente descansaron 2 días y, a partir de la

semana 11 de vida y hasta la 26, los ratones nadaron 60 minutos tres

veces por semana (Kregel, 2006).

OBTENCIÓN DE MATERIAL BIOLÓGICO

A los 2 grupos de ratones se les retiró el alimento a las 7:00 a.m. del

primer día de la semana 27 de edad, a la 1 p.m. se anestesiaron con

éter etílico y se les extrajo la sangre por punción cardiaca. Se separó

el plasma y se congeló a -80°C hasta su uso.

Inmediatamente después de que los ratones murieron, se les retiró el

intestino delgado, se seleccionó la porción proximal y se lavó con PBS

frío. Al lavado se le adicionó un cocktail de inhibidor de proteasas

(“complete mini” de Roche, cat. 11836153001), se centrifugó durante

10 minutos a 1,500 rpm y se colectó el sobrenadante, el cual se

almacenó en alícuotas a -80°C.

Una vez lavado el segmento proximal se abrió y se raspó con un

cubreobjetos para obtener la mucosa, se colocó en tubos eppendorf

de 1.5 mL con y sin inhibidores de proteasas (para WB y PCR


Mary Viloria 14

respectivamente) y se congelaron inmediatamente en nitrógeno

líquido. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su uso.

CUANTIFICACIÓN DE CORTICOSTERONA Y NOREPINEFRINA

Las concentraciones plasmáticas de corticosterona y norepinefrina se

determinaron mediante los kits comerciales “Costicosterone assay

ELISA kit” (Assay designs, Cat. no 901-097) y “Epinephrine assay ELISA

kit” (Alpco Immunoassays, cat. No. 17-Epihu-E01). Las concentraciones

de ambas hormonas se calcularon a partir de una curva de

calibración y se expresaron en nanogramos por mililitro.

ELISA PARA LA DETERMINACIÓN DE S-IgA

La determinación del nivel de S-IgA en el lavado intestinal se realizó

mediante la técnica de ELISA. Para ello, se sensibilizaron placas de 96

pozos con anticuerpo de conejo anti-IgA de ratón, durante 1h a 37˚C.

El bloqueo se realizó a 37˚C por 2 h con leche descremada al 3%.

Después se incubaron, a 37˚C por 1h, 100 μL/pozo de cada muestra

en dilución 1:2. Posteriormente se incubó con un anticuerpo

peroxidado de cabra anti-IgA de ratón a 37°C por 1 h.

La reacción se reveló incubando las placas 20 min a temperatura

ambiente y en oscuridad con una solución de ortofenilendiamina

(0.4mg/mL) y peróxido de hidrógeno (0.03%) en regulador de citratos

(pH 5). Después de cada una de las incubaciones se eliminó el exceso

de reactivo lavando los pozos 5 veces con PBS-tween. La reacción se

cuantificó en un lector de ELISA a 492 nm.


Mary Viloria 15

EXPRESIÓN DE CITOCINAS Y MOLÉCULAS DE INMUNIDA INNATA POR

PCR EN TIEMPO REAL

Las muestras almacenadas sin inhibidor de proteasas se sumergieron

varias veces en nitrógeno líquido, alternando unos segundos a

temperatura ambiente para asegurar la lisis celular sin degradación

de mRNA. Estando la muestra congelada se le adicionó Trizol®, se

homogenizó y se extrajo el mRNA siguiendo las indicaciones del

fabricante (Tri Reagent, technical Bulletin MB-205, 1999). El mRNA se

resuspendió en H2O DEPC, se calentó 25 minutos en baño a 55°C e

inmediatamente después se colocó en hielo, se tomó una alícuota

para cuantificar y el resto se almacenó a -80°C.

Una vez cuantificado se realizó la RT-PCR (reacción en cadena de la

polimerasa con transcriptasa reversa) con iniciadores inespecíficos

(random primers), utilizando el kit comercial “Reverse Transcriptase 1st

Strand cDNA Synthesis Kit” (Epicentre cat. MM070150). El cDNA

obtenido se cuantificó y se almacenó a -80°C.

Se cuantificó la expresión de los genes que codifican para IL2, IL-4, IL-

6, IL-10, IL-12, IFNγ, TNFα, TGFβ, cadena α, cadena J, pIgR, defensinaα,

lisozima, fosfolipasa A2 y TLR4, mediante PCR en tiempor real utilizando

TaqMan® Universal PCR Master Mix, siguiendo las indicaciones del

fabricante. Se hizo la cuantificación relativa por el método 2-ΔΔCT

(Livak & Schmittgent, 2001; Huggett et al, 2005; Tsai & Wiltbank, 1996;

Valasek & Repa, 2005; Butt et al, 2007). Las sondas específicas para

cada gen fueron diseñadas con anterioridad por el grupo de trabajo

mediante el software Universal ProbeLibrary (www.universalprobelibrary.com) y

se muestran en la tabla 1.

http://www.universalprobelibrary.com/


Mary Viloria 16

Tabla 1. Primers utilizados para la PCR en tiempo real.

WESTERN BLOT

Las muestras con inhibidores de proteasas (“complete mini” de Roche,

cat. 11836153001 en buffer de lisis RIPA) se sacaron del nitrógeno y,

antes de que se descongelaran, se homogenizaron. Una vez

homogenizadas se tomó una alícuota para cuantificar por el método

de Lowry y el resto se almacenó a -80°C hasta su uso.

Las muestras, una vez cuantificadas, se mezclaron con el buffer de

carga desnaturalizante de Laemmli e hirvieron por 10 minutos en baño

maría. Se separaron 50µg de la muestra en geles de poliacrilamida a

concentraciones que van del 10 al 12% por electroforesis a 88 volts

durante 2 h. Posteriormente las proteínas se transfirieron a membranas

de PVDF en una cámara de transferencia “semi dry” (Trans-Blot SD

Semi-Dry Cell Bio-Rad), a 15 V por 45 min para Cadena J, a 18 y a 20 V

para IgA y pIgR respectivamente, durante 1h.

Gen/código Forward primer 5´-3´ Reverse primer 5´-3´

IgA / 04692101001 cgtccaagaattggatgtga agtgacaggctgggatgg

Igj/04685105001 gaactttgtataccatttgtcag

acg

ctgggtggcagtaacaacct

IFN- / 04686942001 tctggaggaactggcaaaag ttcaagacttcaaagagtctgagg

IL-10 / 04686942001 actgcacccacttcccagt tgtccagctggtcctttgtt

IL-12 / 04692110001 atccagcgcaagaaagaaaa ctacgaggaacgcacctttc

IL-2 / 04685148001 gctgttgatggacctacagga ttcaattctgtggcctgctt

IL-4 / 04692250001 catcggcattttgaacgag acgtttggcacatccatctc

IL-6 / 04685032001 gctaccaaactggatataatcag

ga

ccaggtagctatggtactccagaa

pIgR / 04688635001 agtaaccgaggcctgtcctt gtcactcggcaactcagga

TGF- 1 / 04688953001 tggagcaacatgtggaactc gtcagcagccggttacca

TNF / 04686993001 ctgtagcccacgtcgtagc ttgagatccatgccgttg


Mary Viloria 17

Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% en TBS-

Tween (Tween 20 al 0.1% en TBS) durante 2 horas a temperatura

ambiente y en agitación constante. Después se incubaron toda la

noche en agitación constante a 4°C con anticuerpo anti cadena J,

anti cadena-α o anti pIgR. Al día siguiente se incubron, durante 2 hs,

con el anticuerpo secundario peroxidado. Entre cada incubación se

realizaron 3 lavados de 10 minutos con TBS-Tween al 0.1%

Después del último lavado, las membranas se incubaron 1 min con

Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz) y se expusieron

inmediatamente a una película fotográfica (Amersham Hyperfilm ECL)

durante tiempos que variaron desde 30 segundos hasta 2 min.

Después se bañaron en solución de revelado (Kodak) y en solución

fijadora (Kodak). La cuantificación relativa de proteína se calculó con

base en el análisis densitométrico realizado con el software Quantity

One 1-D Analysis Software (Bio-Rad) (Chow et al, 1997; Kurien &

Scofield, 2003).

RESULTADOS


Mary Viloria 19

RESULTADOS

MOLÉCULAS DE INMUNIDAD INNATA

Para investigar si el ejercicio provocó cambios en la inmunidad innata

de la mucosa intestinal, se cuantificó por PCR en tiempo real, la

expresión de los genes que codifican para las moléculas α-defensina,

fosfolipasa y lisozima, así como también el receptor TLR-4, en la

mucosa duodenal de ratones sedentarios y entrenados. El ejercicio

incrementó la expresión de α-defensina, fosfolipasa y lisozima, mientras

que disminuyó la expresión de TLR-4 (Fig. 1).


Mary Viloria 20

S-IgA

Con la finalidad de saber si el ejercicio también induce cambios en la

inmunidad adaptativa, a partir de duodeno se colectó el contenido

de la luz intestinal y cuantificó el anticuerpo importante de las

mucosas, la S-IgA. La concentración de S-IgA se determinó por ELISA y

se expresó en µg/mL. Obteniendo un aumento significativo de dicho

anticuerpo en el intestino de los ratones entrenados comparado con

los sedentarios.


Mary Viloria 21

CADENAS α, J Y pIgR

El aumento de S-IgA en la luz intestinal puede deberse a una mayor

producción en la lámina propia de polímeros de IgA unidos por la

cadena J, así como también a un aumento en el transporte desde la

lámina propia hacia la luz, a través del epitelio, por medio del pIgR.

Con la finalidad de explorar las 2 posibilidades se cuantificó la

expresión de cadena J, cadena α y pIgR en la mucosa duodenal de

ratones entrenados y sedentarios. Los ratones entrenados presentaron

un incremento tanto en la expresión de los genes que codifican para

estas 3 moléculas (Fig. 3), como en las respectivas proteínas (Fig. 4),

cuantificado por PCR en tiempo real y western blot respectivamente.

EXPRESIÓN DE CITOCINAS

Como la expresión de las cadenas α, J y el pIgR está regulada por

citocinas tanto de inmunidad innata como adaptativa, se cuantificó

la expresión de los genes que codifican para IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12,

TNF-α, TGF-β e IFN-γ por PCR en tiempo real. El entrenamiento físico

incrementó significativamente la expresión de los genes que codifican

para TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-12 (Fig. 5) así como también la expresión de

IL-4 y TGF-β (Fig. 6). Sin embargo, disminuyó la expresión del gen para

IL-2 (Fig. 6), mientras que el IFN-γ permaneció sin cambios (Fig. 6).


Mary Viloria 22


Mary Viloria 23


Mary Viloria 24

CUANTIFICACIÓN DE HORMONAS

Como tanto los glucocorticoides como las catecolaminas regulan la

síntesis de IgA y pIgR, se determinaron las concentraciones

plasmáticas de ambas hormonas en ratones sedentarios y entrenados,

aunque la concentración es más elevada en los ratones entrenados,

no se observaron diferencias significativas entre ambos grupos (Tabla

2).

Tabla 2.- Concentraciones plasmáticas de corticosterona y

norepinefrina en ratones sedentarios y entrenados.

DISCUSIÓN


Mary Viloria 26

DISCUSIÓN

El aspecto más relevante de este trabajo es que se demuestra,

por primera vez, que el entrenamiento físico a largo plazo tiene

efectos benéficos sobre la respuesta inmunológica intestinal. Se

observó incremento tanto en la producción de moléculas de la

inmunidad innata α-defensina, fosfolipasa y lisozima, así como en la

más importante de la inmunidad adaptativa intestinal: la S-IgA.

Las células plasmáticas productoras de IgA están distribuídas a

lo largo de la lámina propia de la superficie de las mucosas. Estas

células producen grandes cantidades de dímeros y algunos

tetrámeros de IgA (IgA polimérica o pIgA) y, a diferencia de las

células plasmáticas encontradas en otros sitios, expresan grandes

cantidades del polipéptido denominado cadena J, el cual facilita la

interacción covalente espontánea con el receptor de

inmunoglobulina polimérica (pIgR) expresado en la región basolateral

de las células epiteliales y transporta al complejo a través de la

barrera epitelial. Una vez que alcanza la membrana apical, las

proteasas rompen la porción extracelular del pIgR, de tal manera que

la S-IgA se libera a la luz intestinal. Entonces, el incremento en los

niveles de S-IgA en la luz del duodeno está relacionado con 2

mecanismos principales: (i) producción de pIgA por las células

plasmáticas de la lámina propia, y (ii) transporte de complejos pIgA-

pIgR (Johansen & Brandtzaeg, 2004; Brandtazaeg & Johansen, 2005;

Woof & Mestecky, 2005).


Mary Viloria 27

Los resultados aquí presentados demuestran un aumento en la

expresión génica de las cadenas α y J, lo que correlaciona con el

aumento de las proteínas correspondientes. Este aumento sugiere dos

posibilidades, que se haya incrementado la presencia de células

plasmáticas en la lámina propia, o que cada célula individual haya

incrementado la síntesis de pIgA. Resultados del mismo grupo de

trabajo muestran, por inmunohistoquímica, que el entrenamiento

provoca disminución del número de células plasmáticas productoras

de IgA, lo que apoya la idea de que se incrementó la producción de

pIgA por célula.

Aunque el mecanismo por el cual el ejercicio incrementa la

transcripción génica para las cadenas α y J es desconocido, el

incremento observado en la expresión de estos genes por las células

plasmáticas de la mucosa intestinal, puede ser el resultado del

aumento en la expresión de los genes para IL-4, IL-6, IL-10 y TGF-β,

citocinas que regulan la producción de IgA. El TGF-β se considera ser

el factor esencial en el cambio de isotipo para IgA (Johansen &

Brandtzaeg, 2004; Zan et al, 1998).

Por otro lado, en sistemas in vitro se ha demostrado que

citocinas como TNF-α, IL-4 y TGF-β incrementan la expresión del pIgR

(Ackerman et al, 1999; Kaetzel, 2005; Kaetzel & Mostov, 2005). Así, el

aumento en la expresión del pIgR en los ratones entrenados puede ser

el resultado del aumento en la expresión de los genes que codifican

para estas 3 citocinas. Como no se observaron cambios en los niveles

de corticosterona y norepinefrina, el incremento en la síntesis de pIgA

y pIgR no puede ser atribuido a estas hormonas.

Hay estudios que demuestran que el ejercicio intenso reduce la

expresión del pIgR en las glándulas salivales de rata (Kimura, et al.,


Mary Viloria 28

2008), en el presente estudio se demuestra que el ejercicio moderado

indujo un incremento tanto en la expresión como en la síntesis de pIgR

en la mucosa intestinal. Esta discrepancia puede ser debida a la

respuesta diferente que tiene el organismo antes un ejercicio

moderado y uno extremo, así como a la regulación de la expresión

del pIgR específica de cada tejido (Cox et al, 2007; Lambert et

al,1994).

Estudios tanto in vivo como in vitro han demostrado que las altas

concentraciones de TNF-α pueden incrementar la permeabilidad del

epitelio intestinal (Bruewer, et al., 2003; Mazzon & Cuzzocrea, 2008;

Suenaert, et al., 2002; Ye, et al., 2006). A pesar del incremento de TNF-α

que observamos en los ratones entrenados, el incremento en S-IgA no

puede ser explicado por aumento de permeabilidad intestinal. La

existencia de una barrera intestinal defectuosa hubiera provocado

inflamación intestinal, produciendo cambios en la arquitectura

intestinal y reclutamiento de células inmunológicas hacia la lámina

propia. Sin embargo, nuestro grupo de trabajo no observó ninguna

modificación en la estructura histológica del intestino de los ratones

entrenados. Además, en los ratones entrenados no solamente se

observó disminución de las células plasmáticas productoras de IgA,

sino también de linfocitos T CD4+ y linfocitos B en general, esta

disminución de linfocitos encontrada en los ratones entrenados refleja

una respuesta anti-inflamatoria en lugar de una inflamatoria.

CONCLUSIONES


Mary Viloria 30

CONCLUSIONES

El aumento significativo en la expresión de las cadenas α y J y

en el pIgR en la mucosa duodenal de los ratones entrenados

correlaciona con el aumento en la síntesis de las correspondientes

proteínas, y de S-IgA en la luz intestinal.

En general, se demostró que el incremento en la S-IgA en el

duodeno de los ratones entrenados se debe, en parte, al aumento en

la producción de IgA en la lámina propia y al incremento en el

transporte de complejos pIgA-pIgR a través de las células epiteliales.

Nuestros resultados apoyan el hecho de que el ejercicio crónico

es benéfico para varios sistemas, incluyendo al inmunológico

intestinal.

BIBLIOGRAFÍA


Mary Viloria 32

BIBLIOGRAFÍA

Ackerman, L., Wollenweber, L., & Denning, G. (1999). IL-4 and IFN-gamma

increase steady state levels of polymeric Ig receptor mRNA in human airway

and intestinal epithelial cells. J Immunol (162), 5112-5118.

Bienenstock, J., & McDermott, M. R. (2005). Bronchus- and nasal- associated

lymphoid tissues. Immunol Rev , 206, 22-31.

Bourlioux, P., Koletzko, B., Guarner, F., & Braesco, V. (2003). The intestine and

its microflora are partners for the protection of the host: report on the Danone

Symposium "The intelligent intestine". Am J Clin Nutr , 78, 675-683.

Brandtazaeg, P., & Johansen, F. (2005). Mucosal B cells: phenotypic

characteristics, transcriptional regulation, and homing properties. Immunol

Rev (172), 32-63.

Bruewer, M., Luegering, A., Kucharzik, T., Parkos, C., Madara, J., Hopkins, A., et

al. (2003). Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by

apoptosis-independent mechanisms. J Immunol (171), 6164-6172.

Butt, R., Pfeifer, T., Delaney, A., Grigliatti, T., Tetzlaff, W., & J, C. (2007). Enabling

coupled quantitative genomics and proteomics analyses from rat spinal cord

samples. Molecular and Cellular Proteomics (6), 1574-1588.

Cario, E., Gerken, G., & Podolsky, D. K. (2002). "For whom the bell tolls!" -

Innate defense mechanisms and survival strategies of the intestinal epithelium

against luminal pathogens. Z Gastroenterol , 40, 983-990.

Chow, W., Pang, J., & Selsted, M. (1997). Semidry electroblotting of peptides

and proteins from acid-urea polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry

(253), 225-230.

Collins, S. (2001). Stress and the gastrointestinal tract IV. Modulation of

intestinal inflammation by stress: basic mechanisms and clinical relevance.

Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (280), G315-G318.

Cox, S., Ebersole, L., Carpenter, G., & Proctor, G. (2007). Effects of autonomic

agonists and immunomodulatory cytokines on polymeric immunoglobulin

receptro expression by cultured rat and human salivary and colonic cell lines.

Arch Oral Biol (52), 411-416.


Mary Viloria 33

Deplancke, B., & Gaskins, H. R. (2001). Microbial modulation of innate

defense: globet cells and the intestinal mucus layer. Am J Clin Nutr ,

73(suppl), 1131S-1141S.

Elson, C., Y, C., Mc Cracken, V., Dimmitt, R., Lorenz, R., & Weaver, C. (2005).

Experimental models of inflammatory bowel disease reveal innate, adaptive

and regulatory mechanisms of host dialogue with the microbiota. Immunol

Rev (206), 260-276.

Faria, A., & Weiner, H. (2005). Oral Tolerance. Immunol Rev , 206, 232-259.

Field, M. (2003). Intestinal ion transport and the pathophysiology of diarrhea. J

Clin Invest , 111, 931-943.

Fleshner, M., & Laudenslager, M. (2004). Psychoneuroimmunology: Then and

Now. Behavioral and Cognitive Neuroscience Reviews (3), 114-130.

García-Bueno, B., & Leza, J. (2008). Mecanismos

inflamatorios/antiinflamatorios en el cerebro tras la exposición a estrés.

Revista de Neurología (46), 675-683.

Hoffman-Goetz, L., & Quadrilatero, J. (2003). Treadmill exercise in mice

increases intestinal lymphocyte loss via apoptosis. Acta Physiol Scan (179),

289-297.

Hoffman-Goetz, L., Quadrilatero, J., Boudreau, J., & Guan, J. (2004).

Adrenalectomy in mice does not prevent loss of intestinal lymphocytes after

exercise. J Appl Physiol (96), 2073-2081.

Holzer, P., Michl, T., Danzer, M., Jocic, M., Schicho, R., & Lippe, I. (2001).

Surveillance of the gastrointestinal mucosa by sensory neurons. J Physiol

Pharmacol , 52, 505-521.

Huggett, J., Dheda, K., Bustin, S., & Zumla, A. (2005). Real-time RT-PCR

normalization; strategies and considerations. Genes and Immunity (6), 279-

284.

Irwin, M. (2008). Human psychoneuroimmunology: 20 years of discovery.

Brain, Behavior and Immunity (22), 129-139.

Jarillo-Luna, A., Rivera-Aguilar, V., Martínez-Carrillo, B., Barbosa-Cabrera, E.,

Reyna, H., & Campos-Rodríguez, R. (2008). Effect of restraint stress on the

population of intestinal intraepithelial lymphocytes in mice. Brain, Behavior

and Immunity (22), 265-275.


Mary Viloria 34

Jarillo-Luna, A., Rivera-Aguilar, V., Reyna, H., Lara-Padilla, E., Kormanovsky, A.,

& Campos-Rodríguez, R. (2007). Effect of repeated restraint stress on the

levels of intestinal IgA in mice. Psychoneuroendocrinology (32), 681-692.

Johansen, F., & Brandtzaeg, P. (2004). Transcriptional regulation of the

mucosal IgA system. Trends Immunol (25), 150-157.

Kaetzel, C. (2005). The polymeric immunoglobulin receptor: bridging innate

and adaptive immune responses at mucosal surfaces. Immunol Rev (206), 83-

99.

Kaetzel, C., & Mostov, K. (2005). Immunoglobulin transport and the polymeric

immunoglobulin receptor. In J. Mestechky, J. Lam, W. Strober, J. Bienenstock,

D. McGee, & L. Mayer, Mucosal Immunology (pp. 211-250). Elsevier.

Kelsall, B., & Leon, F. (2005). Involvement of intestinal dendritic cells in oral

tolerance, immunity to pathogens, and inflammatory bowel disease.

Immunol Rev , 206, 149-159.

Kimura, F., Aizawa, K., Tanabe, K., Shimizu, K., Kon, M., Lee, H., et al. (2008). A

rat model of saliva secretory immunoglobulin: a suppression caused by

intense exercise. Scand J Med Sci Sports (18), 367-372.

Kregel, K. (2006). Resource book for the design of animal exercise protocols.

Bethesda, Maryland: American Physiological Society.

Kurien, B., & Scofield, R. (2003). Protein blotting: a review. Journal of

Immunological Methods (274), 1-15.

Lambert, R., Kelleher, R., Wickham, L., Vaerman, J., & Sullivan, D. (1994).

Neuroendocrinimmune modulation of secretory component production by

rat lacrimal, salivary, and intestinal epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci

(35), 1192-1201.

Livak, K., & Schmittgent. (2001). Analysis of relative gene expression data

using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods (25), 402-

408.

Lundgren, O. (2004). Interface between the intestinal environment and the

nervous system. Gut , 53, ii16-ii18.

Lycke, N. (2002). Mucosal lymphoid tissues. In Encyclopedia of Life Sciences.

Nature Publishing Group.

Mach, J., Hshieh, T., Hsieh, D., Grubbs, N., & Chervonsky, A. (2005).

Development of intestinal M cells. Immunol Rev , 206, 177-189.


Mary Viloria 35

Mackinnon, L. (1999). Advances in exercise immunology. Human Kinetics.

Marra, S., Burnett, M., & Hoffman-Goetz, L. (2005). Intravenous catecholamine

administration affects mouse intestinal lymphocyte number and apoptosis.

Journal of Neuroimmunology (158), 76-85.

Mawdsley, J., & Rampton, D. (2005). Psychological stress in IBD: new insights

into pathogenic and therapeutic implications. Gut (54), 1481-1491.

Mayer, L. (2003). Mucosal immunity. Pediatrics , 111, 149-159.

Mazanec, M., Kaetzel, C., Lamm, M., Fletcher, D., & Nedrud, J. (1992).

Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies. Proc Natl

Sci , 89, 6901-6905.

Mazzon, E., & Cuzzocrea, S. (2008). Role of TNF-alpha in ileum tight junction

alteration in mouse model of restraint stress. Am J Physiol Gastointest Liver

Physiol (294), G1268-1280.

McEwen, B. (1998). Protective and damaging effects of stress mediators. New

England Journal of Medicine (338), 171-179.

Medzhitov, R. (2008). Origin and physiological roles of inflammation. Nature ,

206, 428-435.

Monteleone, I., Vavassori, P., Biancone, L., Monteleone, G., & Pallone. (2002).

Immunoregulation in the gut: succes and failures in human disease. Gut , 50,

iii60-iii64.

Müller, C., Autenrieth, I., & Peschel, A. (2005). Innate defenses in the intestinal

epithelial barrier. Cell Mol Life Sci , 62, 1297-1307.

Nagler-Anderson, C. (2001). Man the barrier! Strategic defenses in the

intestinal mucosa. Nature Rev Immunol , 1, 58-67.

Navarro, A., & Boveris, A. (2007). The mitochondrial energy transduction

system and the aging process. Am J Physiol Cell Physiol (292), 670-686.

Ortega, E., Forner, M., Barriga, C., & de la Fuente, M. (1993). Effect of age

and swimming-induced stress on the phagocytic capacity of peritoneal

macrophages from mice. Mechanisms of Ageing and Development (70), 53-

63.

Petersen, A., & Pedersen, B. (2005). The anti-inflamatory effect of exercise. J

Appl Physiol (98), 1154-1162.


Mary Viloria 36

Prasanta, K. (1998). Protective role of stress genes. Enviromental Health

Perspectives (106), A217-A218.

Sanchez-Muñoz, F., Dominguez-Lopez, A., & Yamamoto-Furusho, J. (2008).

Role of cytokines in inflammatory bowel disease. Gastroenterol , 14, 4280-

4288.

Sartor, R. (2006). Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and

ulcerative colitis. Nature Clin Prac Gastroenterol Hepatol (4), 390-404.

Sellin, J. (2003). Functional anatomy, fluid, and electrolyte absorption. In

Feldman's Gastro Atlas Online. Science Press Internet Services.

Shroff, K., Meslin, K., & Cebra, J. (1995). Commensal enteric bacteria

engender a self-limiting humoral mucosal immune response while

permanently colonizing the gut. Infect Immun , 63, 3904-3913.

Smith, P., Ochsenbauer-Jambor, C., & Smythies, L. (2005). Intestinal

macrophages: unique effector cells of the innate immune system. Immunol

Rev (206), 149-150.

Solomon, G. (2001). Psiconeuroinmunología: sinopsis de su historia, evidencia

y consecuencias. Segundo Congreso Virtual de Psiquiatría, Interpsiquis 2001.

Spiller, R. (2002). Role of nerves in enteric infection. Gut , 51, 759-762.

Strobel, S., & Mowat, A. M. (1998). Immune response to dietary antigens: oral

tolerance. Immunol Today , 19, 173-181.

Suenaert, P., Bulteel, V., Lemmens, L., Noman, M., Geypens, B., Van Assche,

G., et al. (2002). Anti-tumor necrosis factor tratment restores the gut barrier in

Crohn's disease. Am J Gastroenterol (97), 2000-2004.

Tri Reagent, technical Bulletin MB-205. (1999).

Tsai, S., & Wiltbank, M. (1996). Quantification of mRNA using competitive RT-

PCR with standard curve methodology. Biotechniques (21), 862-866.

Valasek, M., & Repa, J. (2005). The power of real-time PCR. Advances in

Physiology Education (29), 151-159.

Warburton, D., Nicol, C., & Bredin, S. (2006). Health benefits of physical

activity: the evidence. Canadian Medical Association Journal (174), 801-809.

Wilmore, J., & Costill, S. (2007). Fisiología del esfuerzo y del deporte (6a ed

ed.). Paidotribo.


Mary Viloria 37

Wira, C. R., Fahey, J. V., Sentman, C. L., Pioli, P. A., & Shen, L. (2005). Innate

and adaptative immunity in the female genital tract: cellular responses and

interactions. Immunol Rev , 206, 306-335.

Woof, J., & Mestecky, J. (2005). Mucosal immunoglobulins. Immunol Rev (206),

64-82.

Ye, D., Ma, I., & Ma, T. (2006). Molecular mechanism of tumor necrosis factor-

alpha modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am J Physiol

Gastrointest Liver Physiol (290), G496-504.

Zan, H., Cerutti, A., Dramitinos, P., Schaffer, A., & Casali, P. (1998). CD40

engagement triggers switching to IgA1 and IgA2 in human B cells through

induction of endogenous TGF-beta: evidence for TGF-beta but not IL-10-

dependent direct S mu-->S alpha and sequential S mu-->S gamma, S

gamma-->S alpha DNA recombination. J Immunol (161), 5217-5225.

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