NanomaterialienDOI: 10.1002/ange.201209099

Graphen: sicher oder toxisch?Alberto Bianco*

Prof. Maurizio Prato zum60. Geburtstag gewidmet

Graphen · Kohlenstoffmaterialien ·Materialwissenschaften · Nanotoxizit�t

1. Einleitung

Das Kohlenstoffallotrop Graphen wird als einzelneSchicht von monokristallinem Graphit definiert, in der dieKohlenstoffatome mit sp2-Hybridisierung angeordnet sind. Inden bahnbrechenden Arbeiten von Novoselov und Geim[1] istdas enorme Anwendungspotenzial des Graphens in den Ma-terialwissenschaften aufgezeigt worden.[2] Auch in der Bio-medizin findet Graphen großes Interesse, z. B. als Kompo-nente f�r Biosensoren, im Gewebe-Engineering und imWirkstofftransport.[3–6] Eine Roadmap f�r Graphen mit zu-k�nftigen Entwicklungsrichtungen auf den Gebieten derElektronik, Photonik, Verbundmaterialien, Energieerzeu-gung und -speicherung, Sensoren, Meteorologie und Biome-dizin wurde k�rzlich vorgeschlagen.[7]

Prinzipiell kann die Entwicklung neuer Nanotechnologi-en nicht von der Erforschung der Nanomaterialsicherheitabgekoppelt werden. Wie alle neuen Nanomaterialien istauch Graphen nicht frei von mçglichen Risiken f�r diemenschliche Gesundheit und die Umwelt. Daher kann Gra-phen, dessen Herstellung auf grçßerem Maßstab bereits be-gonnen hat, im Sinne einer verantwortungsvollen Verwen-dung nicht von derartigen Untersuchungen ausgeschlossen

werden. Bevor aber vom „Teufel“ ge-sprochen wird, muss gekl�rt werden,welchen Grad an Toxizit�t Graphen�berhaupt erreichen kçnnte und wasder Grad an gew�nschter Sicherheitist. Das Kl�ren der Sicherheits- undToxizit�tsfragen ist nicht nur f�r dieIntegration in neue Kompositmateria-

lien, z.B. f�r die Nanoelektronik, von Bedeutung, sondernauch f�r mçgliche biomedizinische Anwendungen, an denenaktuell geforscht wird. Das biomedizinische Potenzial vonGraphen und anderen Graphen-abgeleiteten Materialienwurde bereits in aktuellen �bersichten behandelt.[8, 9] �berden Einfluss von Graphen auf die menschliche Gesundheitund die Umwelt liegen aber nur beschr�nkte Informationenin der Literatur vor.[10–14]

Dieser Kurzaufsatz behandelt den aktuellen Stand derToxizit�tsstudien �ber Graphen und verwandte Materialien,einschließlich Graphenoxid (GO), reduziertes Graphenoxid(rGO), Graphen mit wenigen Schichten, Graphen-Nano-bl�tter und -Flocken, Graphenb�nder und -punkte, die ge-meinsam als Nanomaterialien der Graphenfamilie (GFNs)bezeichnet werden. Da die Graphenfamilie so verschiedeneMitglieder mit verschiedenen physikalisch-chemischen Ei-genschaften umfasst, ist ihr toxikologisches Profil noch wenigverstanden und muss daher weiter untersucht werden. Ausden verf�gbaren Daten entwickelt sich ein Bild mit ver-schiedenen Wirkungen, die eng mit der speziellen Beschaf-fenheit des entsprechenden Graphens verkn�pft sind. Wirversuchen, diese Wirkungen mit den Merkmalen der unter-suchten Graphene zu korrelieren, mit dem Ziel, die verf�g-baren Daten zu rationalisieren und das Ergebnis in den Zu-sammenhang der mçglichen zuk�nftigen Anwendungen, ins-besondere auf dem biomedizinischen Gebiet, zu setzen. Esliegt auf der Hand, dass chemische Modifikationen vonGraphen dessen toxikologische Wirkungen modulieren, wie

Graphen wird als bahnbrechendes Material der Zukunft angesehen.F�r seine weitere Entwicklung ist nun die Beurteilung des Sicher-heitsprofils und des Einflusses auf die menschliche Gesundheit vongrçßter Bedeutung. Graphen gehçrt zu einer grçßeren Familie vonNanomaterialien, die als Graphenfamilie („graphene family nano-materials“ GFNs) bezeichnet wird. Es sind verschiedene Formen vonGraphen bekannt, deren biologische Wirkungen mit den physikalisch-chemischen Eigenschaften der jeweiligen Strukturen korreliert werdenm�ssen. Einige In-vitro- und In-vivo-Studien zeigten keine besonde-ren Risiken auf, w�hrend andere auf mçgliche gesundheitsgef�hr-dende Eigenschaften von GFNs hinweisen. Dieser Kurzaufsatz soll dieaktuellen Studien �ber die Toxizit�t von GFNs kritisch diskutieren, umdie mçglichen Risiken f�r ihre zuk�nftige Entwicklung in den Mate-rial- und Biowissenschaften abzusch�tzen.

[*] Prof. A. BiancoCNRS, Institut de Biologie Mol�culaire et CellulaireLaboratoire d’Immunopathologie et Chimie Th�rapeutique15 Rue Ren� Descartes, 67084 Strasbourg (Frankreich)E-Mail: a.bianco@ibmc-cnrs.unistra.fr

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es auch f�r Kohlenstoff-Nanorçhren gefunden wurde.[8, 9,15]

Dies ist g�nstig f�r die Entwicklung solcher Nanomaterialienf�r die Biomedizin. Die aktuelle Beobachtung einer mçgli-chen biologischen Abbaubarkeit von GO ist ein weitererg�nstiger Aspekt, der aber noch genauer zu untersuchenist.[16] Mit der Entwicklung der Graphenproduktion auf demGroßmaßstab, der Zunahme seiner Verwendung und derVerf�gbarkeit auf dem Markt wird es auch notwendig, dieExposition unter Realbedingungen abzusch�tzen und dengesamten Lebenszyklus des Materials zu erfassen.

2. Nanomaterialien der Graphenfamilie

Graphen gehçrt zu einer grçßeren Familie, die als GFNsbezeichnet wird. Graphen wird in verschiedenen Formenbeobachtet, und f�r die Zuordnung toxischer Wirkungen zuden physikalisch-chemischen Eigenschaften jedes Mitgliedsm�ssen auch die Unterschiede zwischen den Mitgliedern derFamilie verstanden werden. GFNs umfassen Einzelschicht-Graphen, Graphen mit wenigen Schichten (2–10 Graphen-schichten), GO (gewçhnlich eine Einzelschicht), rGO (ge-wçhnlich eine Einzelschicht), Graphen-Nanobl�tter, ultra-feinen Graphit (mehr als 10 Schichten, aber Dicken unter100 nm), Graphenb�nder und Graphenpunkte. Abbildung 1zeigt die chemische Struktur einiger GFNs.

Innerhalb jeder dieser Formen sind vielf�ltige Strukturenmçglich. Beispielsweise sind bei GO der Typ, der Grad unddie Position der oxygenierten Gruppen, die bei dem Vorgangder Graphit-Exfoliation eingef�hrt werden, außerordentlichschwer auf der molekularen Ebene zu beschreiben.[17] DieVorg�nge bei der Umwandlung von GO unter reduzierendenBedingungen sind noch schwerer zu verstehen.[18,19] Kçnnenwir die intakte graphitische Ebene wiederherstellen? Werdeneinfach nur die sauerstoffhaltigen Gruppen eliminiert? Wer-den diese Funktionen durch die Reduktionsmittel ersetzt?Alle diese Fragen werden gegenw�rtig untersucht. Die ge-naue Beschreibung der verschiedenen Graphenformen istaber notwendig, um ihre biologischen Wirkungen aufzukl�renund mit der Struktur des Materials zu korrelieren.

Zudem kann eine einzelne Graphenschicht verschiedeneFl�chenabmessungen aufweisen, wobei kleine Graphen-flocken ebenso mçglich sind wie große Graphenbl�tter, die 10bis 100 mm2 erreichen kçnnen (Abbildung 2). Die Analysedieses Parameters ist auch f�r die Bewertung der Toxizit�ts-risiken von GFNs außerordentlich wichtig.

Einige Untersuchungen widmen sich der Beurteilung dertoxischen Wirkungen von GFNs in vitro und in vivo. Bei ei-nigen der Studien wurden keine besonderen Risiken gefun-den, w�hrend andere auf gesundheitsgef�hrdende Eigen-schaften der Materialien hinweisen. Einer der Hauptexposi-tionswege des Menschen ist die Inhalation. Einige GFNshaben eine aerodynamische Grçße, die zu Inhalation undAbsetzen in den Atemwegen f�hren kçnnen, mit mçglichenFolgen der Entstehung von Granulomen und Lungenfibro-se.[20] Die biologische Antwort variiert abh�ngig von derAnzahl der Schichten, der lateralen Grçße, der Steifigkeit,der Hydrophobie, der Oberfl�chenfunktionalisierung, der

Alberto Bianco promovierte 1995 an derUniversit�t Padua. Er war Gastwissenschaft-ler an den Universit�ten Lausanne (1992),T�bingen (Alexander-von-Humboldt-Stipen-diat; 1996–1997) und Padua (1997–1998).Gegenw�rtig ist er Forschungsdirektor amCNRS Strasbourg. Seine Forschungen geltender Funktionalisierung von Kohlenstoff-Nanomaterialien f�r therapeutische unddiagnostische Anwendungen und deren Aus-wirkungen auf Gesundheit und Umwelt.

Abbildung 1. Repr�sentative chemische Strukturen einiger GFNs:a) Graphen, b) Graphen mit wenigen Schichten, c) Graphenoxid(O-Atome rot) und d) reduziertes Graphenoxid.

Graphen

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verabreichten Dosis und der Reinheit des Materials.[11–14]

�ber die mçglichen Unterschiede des biologischen Verhal-tens zwischen großen und kleinen Graphenbl�ttern oderzwischen Graphen mit wenigen Lagen und solchem mit vielenLagen ist nur wenig bekannt. Dies ist ein potenziell interes-santes Thema, das eine gr�ndliche Analyse verdient. In denn�chsten Abschnitten werden wir die wichtigsten Ergebnissein Hinblick auf weitere Studien, die im Zusammenhang derSicherheit von GFNs ins Auge gefasst werden kçnnen, vor-stellen und kritisch diskutieren. Die aktuellen Arbeiten sindweder umfassend noch decken sie alle Aspekte der Auswir-kungen von Graphenen auf die Gesundheit ab. Die meistender verf�gbaren Studien behandeln GO und rGO. Dies liegtwohl an der besseren Lçslichkeit/Dispergierbarkeit in Wasserund unter physiologischen Bedingungen gegen�ber den an-deren GFNs. Die Parameter, die bei diesen Untersuchungenber�cksichtigt worden sind, umfassen Typ und Qualit�t desMaterials (das Vorhandensein von Verunreinigungen kçnntezu falsch positiven Ergebnissen f�hren), der Typ von Zellen,die Dosen (der Konzentrationsbereich erstreckt sich von 0.01bis 1000 mgmL�1), die Inkubationsdauer und bei Tierversu-chen den Verabreichungsweg. In den meisten F�llen sind diePr�fdosen, die mit einer potenziellen Gefahr in Verbindunggebracht werden kçnnen, hçher als die Konzentrationen vonNanomaterialien, die im Allgemeinen f�r therapeutische,Bildgebungs- oder diagnostische Zwecke verwendet werden.

3. In-vitro-Wirkungen von GFNs

Bei Studien �ber den Einfluss neuer Materialien auf le-bende Systeme wird im Allgemeinen das erste Screening aufder Zellebene durchgef�hrt, liefert also eine In-vitro-Beur-teilung mçglicher zytotoxischer Wirkungen. Was geschiehtnun, wenn GFNs in Kontakt mit Zellen kommen? Es kannvermutet werden, dass sie, wenn sie die richtige Grçße haben,�ber verschiedene Mechanismen internalisiert werden kçn-nen (siehe unten). Sobald es sich im Inneren der Zelle be-findet, kçnnte das Material aus subzellul�ren Kompartimen-ten austreten, im Zytoplasma wandern und in den Kern ge-langen. Zudem kçnnten GFNs oxidativen Abbau erfahren(Abbildung 3). Neben einem mechanistischen Verhaltenkçnnen GFNs einen gewissen Grad an Zytotoxizit�t zeigen.

Die folgenden Beispiele erl�utern die biologischen Wirkun-gen von GFNs und die mçglichen Mechanismen, die zu un-erw�nschten Wirkungen f�hren.

Bei einer ersten Vergleichsstudie wurden Graphen undeinwandige Kohlenstoff-Nanorçhren in einem Konzentrati-onsbereich von 0.1 bis 100 mgmL�1 an neuronalen PC12-Zellen der Ratte gepr�ft (Tabelle 1).[21] Beide Materialienzeigten eine dosisabh�ngige Zytotoxizit�t. Bei kleinen Kon-zentrationen (< 1 mgmL�1) induzierte Graphen eine st�rkeremetabolische Wirkung als einwandige Nanorçhren. Bei denhçheren Konzentrationen war das Verhalten umgekehrt.Ferner wurde bei Graphen ein hoher oxidativer Stress be-obachtet, bei dem konzentrations- und zeitabh�ngig reakti-onsf�hige Sauerstoffspezies entstanden. Caspase-3-Aktivie-rung wies auf den Beginn eines apoptotischen Vorgangs hin.Der Vergleich von Graphen mit Kohlenstoff-Nanorçhrenzeigte, dass die Morphologie des Materials eine wichtigeRolle spielt. Diese Studie ergab ein Zytotoxizit�tsprofil vonGraphen mit einem oxidativen Potenzial, das von der Zell-expositionsdosis abh�ngt. Bei einer weiteren Studie wurdenGO (unpassend als unbehandeltes Graphen, „pristine gra-phene“, bezeichnet) und carboxyliertes GO (GO, das einermilden S�urebehandlung unterzogen wurde, um mehrCOOH-Gruppen anzuf�gen) mit 10 bis 300 mgmL�1 an Af-fennierenzellen gepr�ft.[22] W�hrend sich GO haupts�chlichan der Zellmembran akkumulierte und zu einer wesentlichenDestabilisierung der F-Actin-Ausrichtung f�hrte, wurde dasst�rker hydrophile carboxylierte GO von den Zellen inter-nalisiert und akkumulierte im perinukle�ren Bereich, bis zuder grçßten gepr�ften Dosis (300 mgmL�1) ohne die Mor-phologie des Zytoskeletts zu beeintr�chtigen. F�r beide Na-nomaterialien wurde keine zu Nekrose f�hrende physischeSch�digung der Zellmembran beobachtet, eine Erh�rtung derHypothese, dass ein anderer Apoptosemechanismus, ver-mutlich mit intrazellul�rem Stress, der programmiertenZelltod auslçst, zur Zytotoxizit�t beitr�gt. Besondere Auf-merksamkeit ist f�r die Definition des Materials erforderlich,das in diesen Studien behandelt wurde, da „pristines Gra-phen“ eigentlich GO entsprach, was zu Unstimmigkeitenbeim Vergleichen des zytotoxischen Verhaltens der Materia-lien f�hren kçnnte. K�rzlich wurde auch die Lokalisierungvon mit Polyethylenglycolamin modifiziertem GO in F-Ac-

Abbildung 2. Optische (links) und AFM-Aufnahmen (rechts) von Gra-phenoxid, das durch Schleuderbeschichtung auf eine Siliciumoxid-Oberfl�che aufgetragen wurde (Bildnachweis: Vincenzo Palermo undEmanuele Treossi). Abbildung 3. Mçgliche Wechselwirkungen von GFNs: mit der Plasma-

membran, w�hrend der Zellaufnahme, mit der Kernmembran und imZytoplasma, in dem Abbau erfolgen kann.

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tinfilamenten beschrieben.[23] Bei einer Konzentration von75 mgmL�1 wurden Ver�nderungen des Zellzyklus, Apoptoseund oxidativer Stress beobachtet. Bei �hnlichen Studienwurde gezeigt, dass die Zytotoxizit�t von GO und oxidiertenGraphen-Nanob�ndern (im Bereich 10–400 mgmL�1 gepr�ft)stark vom Zelltyp und den Zellkulturbedingungen abh�ngenkann.[24–26]

In Verbindung mit der Entdeckung der antibakteriellenAktivit�t von GO (siehe Abschnitt 5) und der Mçglichkeit,diese Eigenschaft f�r die Behandlung von Erkrankungen desAuges zu nutzen, wurden bei einer interessanten Untersu-chung Ergebnisse �ber die intraokul�re Biovertr�glichkeitdieses Materials beschrieben.[27] Der Einfluss von GO aufMorphologie, Viabilit�t (Lebensf�higkeit), Membranintegri-t�t und Apoptose wurde an menschlichen Retinapigment-Epithelzellen untersucht. Nur nach Langzeitkultur wurdenVer�nderungen von Viabilit�t und Morphologie der Zellenbeobachtet.

In weiteren Studien zur Wirkung von GO auf Zellviabi-lit�t und zellul�re Antworten wurden Schichten mit ver-schiedenen lateralen Grçßen (350 nm und 2 mm) gepr�ft. Vonsechs verschiedenen mit GO kultivierten Zelllinien konntennur die beiden phagozytischen Zelllinien sowohl nanometer-großes als auch mikrometergroßes GO internalisieren.[28]

Bez�glich der Zellviabilit�t wurden bei Dosen bis zu20 mgmL�1 GO (der grçßten gepr�ften Dosis) nur kleineUnterschiede beobachtet. Das Vorhandensein von Manganals Verunreinigung in den Proben durch ungen�gende Rei-nigung w�hrend des Oxidationsverfahrens zur Herstellungvon GO f�hrte dagegen zu hoher Zellmortalit�t. Dieses Er-gebnis zeigt die Bedeutung der Reinigungsschritte, um falschpositive Ergebnisse zu vermeiden, die f�lschlicherweise miteiner unerw�nschten Wirkung des gepr�ften Nanomaterialsin Verbindung gebracht werden kçnnten. Die Aufnahmedurch Makrophagen wurde in einem Konzentrationsbereichzwischen 2 und 6 mg mL�1 untersucht. Die Zellinternalisie-rungskinetik zeigte eine identische intrazellul�re Akkumu-lation von GO mit 350 nm und GO mit 2 mm nach 24 h. ZurAufkl�rung der grçßenunabh�ngigen Aufnahme wurden dieMechanismen der Zellpenetration analysiert. Diese Analysezeigte klar, dass die ersten Zellwechselwirkungen der beidenGOs unterschiedlich sind (das GO mit 350 nm GO wurde vonden aktiven Filopoden von Makrophagen umwickelt, w�h-rend das GO mit 2 mm GO beinahe senkrecht in die Zell-membran eintrat) und dass die intrazellul�re Lokalisierungvon der Grçße bestimmt wurde, was zu unterschiedlicherKompartimentalisierung f�hrte. Sobald sich das GO inner-halb der Zelle befand, bildete das grçßere GO mit 2 mmFalten und neigte zu einem gewissem Maß zur Faltung zuLysosomen mit Sequestrierung. Nach der Internalisierungwurde beobachtet, dass die grçßeren GO-Flocken eine vielst�rkere entz�ndliche Antwort mit hoher Freisetzung vonSchl�sselzytokinen induzierte. Diese Ergebnisse sind außer-ordentlich interessant, da das unterschiedliche Verhalten derbeiden Typen von GOs in anderen biomedizinischen Zu-sammenh�ngen genutzt werden kann. Die unerwarteteHochregulierung der Zytokine durch mikrometergroßes GOkann beispielsweise als Hilfswirkung bei Impfstoffsystemengenutzt werden, um schwache Immunantworten zu aktivie-

ren. Das niedrige Entz�ndungsprofil von nanometergroßemGO kann f�r Anwendungen bei der Krebstherapie g�nstigsein, bei der verbesserte Biovertr�glichkeit gew�nscht wird.Bei einer �hnlichen Untersuchung wurden C2C12-Zellen(mesenchymale Progenitorzellen der Maus) mit Protein-(BSA)-�berzogenem GO unterschiedlicher Grçßen behan-delt, um die Aufnahmemechanismen aufzukl�ren.[29] GO mitlateralen Abmessungen von 500 nm wurde durch Clathrin-vermittelte Endozytose internalisiert, w�hrend grçßereBl�tter (etwa 1 mm) durch Phagozytose aufgenommen wur-den. F�r beide Typen von Graphen wurde bis 100 mg mL�1 nureine sehr geringe Hemmung der Zellproliferation beobachtet.Abbildung 4 zeigt ein in unserem Labor durchgef�hrtes Bei-spiel der GO-Aufnahme durch peritoneale Makrophagen derMaus.

Die Studie an Makrophagen wurde auch auf pristinesGraphen erweitert, das in 1% Pluronic F108 dispergiertwar.[30] Maus-Makrophagen, die mit Graphenkonzentratio-nen zwischen 20 und 100 mgmL�1 behandelt wurden, durch-liefen eine dosisabh�ngige Apoptose �ber einen Mechanis-mus mit einer Abnahme des mitochondriellen Potenzials undeiner Zunahme von reaktionsf�higen Sauerstoffspezies(ROS). Das Identifizieren verschiedener Mechanismen, dieMakrophagen-Apoptose auslçsen, ist außerordentlich n�tz-lich und liefert wichtige Informationen f�r die Entwicklungmçglicher Strategien zum Steuern von programmiertemZelltod, der von Graphen induziert wird. Mit GO inkubierteMaus-Makrophagen (Maximaldosis 100 mgmL�1) konntenauch Autophagie und mit Toll-artigem Rezeptor (TLR) ver-bundene entz�ndliche Antworten auslçsen.[31] Es ist interes-sant, dass Autophagie von Zellen genutzt wird, um endogeneMolek�le zu beseitigen, und weist auf einen mçglichen Weghin, der von Zellen zum R�umen von internalisierten gra-phenbasierten Materialien eingesetzt wird. Neben Makro-

Abbildung 4. GO wird von peritonealen Maus-Makrophagen internali-siert. Die Pfeile markieren in Phagosomen vorhandene GO-Bl�tter.

Graphen

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phagen sind dendritische Zellen (DCs) eine weitere Klassevon wichtigen Immunzellen. DCs sind wichtig, da sie T-Zel-len-vermittelte Immunit�t und Immuntoleranz induzierenund aufrechterhalten. Mit GO behandelte (im Konzentrati-onsbereich 1–25 mgmL�1) DCs waren in ihrer funktionellenAktivit�t beeintr�chtigt.[32] Die DC-Antigen-Pr�sentationwurde durch GO gehemmt. Diese Ver�nderung war mit einerAbregulierung der intrazellul�ren Spiegel einer f�r die An-tigen-Verarbeitung in DCs verantwortlichen Immunprotea-som-Einheit verbunden. Diese Untersuchung unterstreichtdie Bedeutung einer sorgf�ltigen Beurteilung der immun-modulierenden Wirkungen neuer Nanomaterialien.

F�r die Entwicklung von Graphen und anderen GFNs alsTransportsysteme f�r die systemische Verabreichung thera-peutischer Molek�le[8,9] muss auch die Blutvertr�glichkeitbestimmt werden, da das Material mit Blutkomponenten inBer�hrung kommen wird.[33, 34] Im Vergleich zwischen Gra-phen und GO zeigte das erstgenannte eine etwas st�rkerezytotoxische Wirkung durch die starke hydrophobe Wech-selwirkung mit Zellmembranen. Beide Graphene zeigtenaber nur wenig H�molyse von roten Blutzellen (im Konzen-trationsbereich 10–75 mgmL�1).[33] Graphen zeigte keinenEinfluss auf die Koagulationswege, ein Hinweis auf ein nurgeringes Thromboserisiko bei intravençser Verabreichung.Obwohl die gepr�ften Materialien nur schwer zu vergleichensind, stehen die fr�heren Ergebnisse in klarem Gegensatz zujenen von zwei Studien, die klar ein Thrombotoxizit�ts-potenzial von GO belegten.[34–36] Es wurde gezeigt, dass GOeine wesentliche h�molytische Aktivit�t aufweist und hoch-gradig thrombogen ist, indem es starke Aggregation vonBlutpl�ttchen des Menschen induziert (bei 2 mgmL�1). ZumModulieren der Zytotoxizit�t wurde GO mit Chitosan �ber-zogen,[34] oder seine Carbons�urefunktionen wurden entwe-der durch W�rmebehandlung reduziert[34, 35] oder �ber Cur-tius-Umlagerung zu Ammoniumgruppen umgewandelt.[36]

Die zweitgenannte Umwandlung f�hrte zu einem neuenfunktionalisierten Material ohne Stimulationswirkung aufBlutpl�ttchen, ohne Lyse von Erythrozyten und ohne In-duktion von Thromboembolyse. Es bleibt aber unklar, wasw�hrend der chemischen Umwandlung der Carbons�ure-gruppen zu Aminen wirklich geschieht, da Graphenoxid auchHydroxygruppen, Epoxide, Ketone und Aldehyde enth�lt,die keine Curtius-Umlagerung durchlaufen sollten. DieseUntersuchungen zeigen, wie die toxischen Wirkungen vonGO auf rote Blutzellen durch chemische Modifikation desMaterials gemildert werden kçnnen.

Bei komplement�ren Untersuchungen zur Beurteilungder Auswirkung von Kohlenstoff-Nanomaterialien auf Zellenwurden mçgliche Ver�nderungen des Proteinprofils analy-siert.[37, 38] rGO (erhalten durch Hydrazinbehandlung von GOund unrichtig bezeichnet als Graphen) und einwandigeKohlenstoff-Nanorçhren wurden auf die Expression vonProteinen, die am Stoffwechsel, der Redoxregulation, derZytoskelettbildung und dem Zellwachstum beteiligt sind,verglichen. W�hrend Kohlenstoff-Nanorçhren die Expressi-on einer Reihe dieser Proteine stark hemmt, wurden bei mitrGO behandelten menschlichen Hepatomzellen nur m�ßigeVer�nderungen der Proteinspiegel beobachtet. Dies weistdarauf hin, dass reduziertes Graphenoxid hinsichtlich mçgli-

cher Ver�nderungen von Proteinfunktionen weniger zyto-toxisch ist als Kohlenstoff-Nanorçhren. Freies oder mit Ten-siden dispergiertes GO wurde auch an menschlichen undMaus-Fibroblasten gepr�ft.[39,40] Es wurde eine dosisabh�n-gige Toxizit�t an Zellen beobachtet (Konzentration 3–100 mgmL�1). Ein umgekehrtes Ergebnis wurde bei zwei un-abh�ngigen Untersuchungen beschrieben, die zeigten, dassGO im Konzentrationsbereich zwischen 7.8 und 200 mg mL�1

nur eine leichte Verringerung der Proliferation der A549-Zelllinie ohne Zeichen von Apoptose oder Zelltod induzier-te.[41–43] Nach Behandlung mit Hydrazin zur Herstellung vonrGO f�hrte das Material dagegen zu hoher Zytotoxizit�t miteiner erheblichen Verringerung der Viabilit�t des gleichenTyps von Zellen.[41]

Alternativ zu der Reduktion mit Hydrazin kçnnen auchandere chemische Ans�tze zum Modifizieren von GO ein-gesetzt werden. Die kovalente PEGylierung oder Funktio-nalisierung mit biovertr�glichen Polymeren (beispielsweiseDextran) moduliert die zytotoxische Wirkung f�r eine Reihevon Zelllinien und ergibt bis zu einer Dosis von 200 mg mL�1

eine erhçhte Zellviabilit�t.[6, 44, 45] PEG-GO mit weniger als50 nm Seitenl�nge war unter physiologischen Bedingungenstabil, drang vermutlich �ber einen Endozytosemechanismusin die Zellen ein und zeigte bei verschiedenen Konzentra-tionen keine erkennbare Toxizit�t.[6]

Die aktuellen Ergebnisse stellen wichtige erste Daten�ber die In-vitro-Toxizit�t von GFNs dar. Um eine �hnlicheSituation wie bei Kohlenstoff-Nanorçhren zu vermeiden ist esaber wichtig, nicht zu verallgemeinern, sondern die großeVariabilit�t des Materials zu betrachten. Die verschiedenenTypen von GFNs m�ssen miteinander verglichen und ihrEinfluss auf Zellen muss mit ihren physikalisch-chemischenEigenschaften und gegebenenfalls eingef�hrten chemischenModifizierungen korreliert werden. Dies vermeidet eineVerallgemeinerung und Beschreibung aller Typen vonGraphenen als letztlich gef�hrlich f�r die menschliche Ge-sundheit, wenn dies f�r einige von ihnen nicht zutrifft.

4. In-vivo-Wirkungen von GFNs

Parallel zu der Untersuchung des Einflusses auf zellul�rerEbene wurden auch die toxischen Wirkungen in Tiermodel-len gepr�ft, wenn auch zu einem geringeren Ausmaß (Ta-belle 2). F�r GO und rGO wurde die Wirkung auf Blut-pl�ttchen analysiert, die Zellen, die f�r das Aufrechterhaltenvon H�mostase und Thrombusbildung verantwortlichsind.[35, 36] GO lçste eine starke Pl�ttchenaggregation aus, undintravençse Verabreichung an M�use induzierte ausgedehnteLungenthromboembolie. Dieses Verhalten stand mit derLadungsverteilung an der Oberfl�che von GO in Beziehung,da das Aggregationsverhalten bei Material, das zur Erzeu-gung von rGO chemisch behandelt wurde, wesentlich ver-ringert war. Die In-vivo-Toxizit�t von GO wurde an M�usenund Ratten nach intravençser Verabreichung bestimmt.[39,46]

Bei einer Dosis von 10 mg kg�1 Kçrpergewicht wurden we-sentliche pathologische Ver�nderungen gefunden, ein-schließlich entz�ndlicher Zellinfiltration, Lungençdem undEntstehung von Granulomen. Andererseits zeigte GO bei

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Tabelle 1: In vitro untersuchte GFNs und ihre biologischen Wirkungen.

Material In-vitro-Modell Gepr�fteDosis

Biologische Wirkungen Lit.

Graphen neuronale PC12-Zellen 0.01–100 mgmL�1

erhçhte Aktivierung von Caspase-3; geringeFreisetzung von LDH; starke Freisetzung vonROS

[21]

pristines Graphen(GO)

Affen-Nierenzellen (Vero) 10–300 mgmL�1

Zellmembran-Akkumulation; F-Actin-Destabili-sierung; dosisabh�ngiger oxidativer Stress; Zell-tod bei 50 mgmL�1

[22]

carboxyliertes GO Affen-Nierenzellen (Vero) 10–300 mgmL�1

Zellaufnahme; kein Austreten von LDH; keineApoptose bis 300 mg mL�1

[22]

GO dekoriert mit Po-lyethylenglycolamin

Saos-2-Osteoblasten; MC3T3-E1 Pr�osteoblas-ten; Maus-Makrophagen RAW 264.7

75 mgmL�1 F-Actin-Lokalisierung; Ver�nderung des Zell-zyklus; Apoptose; oxidativer Stress

[23]

GO Neuroblastom-SH-SY5Y-Zellen 10–100 mgmL�1

dosis- und zeitabh�ngige Wirkung auf die Zell-viabilit�t bei �ber 80 mg mL�1; erhçhte Retinol-s�ure-induzierte Differenzierung

[24]

GO normale menschliche Lungenzellen (BEAS-2B) 10–100 mgmL�1

konzentrations- und zeitabh�ngige Apoptose [25]

oxidierte Graphen-Nanob�nder, �berzo-gen mit PEG-DSPE

HeLa-Zellen; NIH-3T3-Zellen; SKBR3-Zellen;MCF-7-Zellen

10–400 mgmL�1

dosisabh�ngige und zeitabh�ngige Abnahme derViabilit�t; zellspezifische Zytotoxizit�t; wesent-lich hçhere Zytotoxizit�t f�r HeLa-Zellen (mit10 mg mL�1) als Folge einer hçheren Aufnahmedurch diese Zellen im Vergleich zu den anderenZellen

[26]

GO menschliche Retinalpigment-Epithelzellen 5–100 mgmL�1

wenig Einfluss auf die Morphologie; keine we-sentliche Apoptose; geringe Freisetzung vonLDH

[27]

GO (350 nm und2 mm laterale Grçße)

menschliche Hepatokarzinom-Zellen (HepG2);menschliche Brustkrebs-Zellen MCF-7; mensch-liche Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC);Lewis-Lungenkarzinom-Zellen (LLC); Maus-Ma-krophagen J774A.1; Peritoneal-MakrophagenPMØ

1–20 mg mL�1 keine Zellaufnahme durch nicht-phagozytischeZellen; keine grçßenabh�ngige Internalisierungin Makrophagen; keine Unterschiede der Zell-viabilit�t bis 20 mg mL�1; starke entz�ndlicheAntwort auf 2 mm GO; hohe Freisetzung von Zy-tokinen bei 2 mm GO

[28]

BSA-�berzogenes GO(420 nm und 860 nmlaterale Grçße)

C2C12 (mesenchymale Progenitor-Zellen derMaus)

10–100 mgmL�1

verschiedene Aufnahmemechanismen; keineVer�nderung der metabolischen Aktivit�t

[29]

pristines Graphen in1% Pluronic F108

Maus-Makrophagen RAW 264.7 20–100 mgmL�1

Apoptose durch Abnahme des mitochondrialenPotenzials und Zunahme von ROS; verschiedeneSignalwege aktiviert; Freisetzung proapoptoti-scher Zytokine

[30]

GO Maus-Makrophagen RAW 264.7 5 und100 mgmL�1

Induktion von Autophagie; Aktivierung von TLR4und TLR9; Zytokinsekretion (IL2, IL10, INFg undTNFa)

[31]

GO dendritische Zellen aus Knochenmark (DCs) 1–25 mg mL�1 keine Ver�nderung des Antigen-Einschlusses;keine Wirkung auf die MHC-I/Peptid-TCR-Wech-selwirkung; Herunterregulierung des Spiegelsder Untereinheit LMP7 von Immunproteasom

[32]

Graphen und GO rote Blutzellen (RBCs) 10–75 mgmL�1

keine H�molyse bis 75 mgmL�1; keine Pl�ttchen-aktivierung oder -aggregation; kein Thrombose-risiko

[33]

GO menschliche Erythrozyten (RBCs) 3.125–200 mgmL�1

hohe h�molytische Aktivit�t [34]

Graphen

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sehr niedrigen Dosen eine gute Biovertr�glichkeit mit rotenBlutzellen, w�hrend bei 80 mgmL�1 H�molyse induziertwurde.

Lungentoxizit�t ist ein Hauptproblem bei der industriel-len Herstellung von Nanomaterialien, da ihre AtembarkeitSch�digung und schließlich chronische Erkrankungen beiPersonen verursachen kçnnte, die mit derartigen Materialienin Kontakt kommen. Es wurde gezeigt, dass GO und ag-gregiertes Graphen nach direkter Injektion in die Organe vonM�usen (50 mg pro Tier) zu schwerer und anhaltender Ver-letzung der Lunge f�hren.[47] Bei in Pluronic-Tensid disper-giertem, pristinem Graphen waren die toxischen Wirkungendeutlich geringer. Anscheinend ist die Oxidation des Gra-phens die wahrscheinliche Ursache der Lungentoxizit�t. Beieiner anderen aktuellen Untersuchung wurde auch f�r pris-tine Graphen-Nanopl�ttchen aus nur wenigen Graphen-schichten, die eine Grçße bis zu 25 mm aufwiesen und in 0.5%

Rinderserumalbumin dispergiert waren, ein Risiko f�r dieAtemwege belegt.[20] Es zeigte sich, dass sich Graphen-Na-nopl�ttchen nach Inhalation (50 mg Nanopl�ttchen pro Tier)hinter den ziliarisierten Atemwegen ablagern. Es wurdenakute entz�ndliche Antworten in M�usen, Zellentz�ndungund beeintr�chtigte Makrophagen-Phagozytose beobachtet.Die Entz�ndungswirkung in vitro und in vivo wurde dematembaren aerodynamischen Durchmesser zugeschrieben,der Kenngrçße, die die Atembarkeit eines Teilchens und denOrt der Ablagerung bestimmt. Schließlich kçnnte die Abla-gerung in der Lunge auf lange Sicht zu Mesotheliom undanderen Pleura-pathologischen Zust�nden f�hren. Es istschwer zu verstehen, wo die Unterschiede dieser beidenStudien liegen, die zu dem entgegengesetzten Verhalten vonpristinem Graphen f�hren. Vermutlich gehçren die Mor-phologie der gepr�ften Materialien, die Anzahl der Schich-ten, die Oberfl�che und das Dispergierungsverfahren zu den

Tabelle 1: (Fortsetzung)

Material In-vitro-Modell Gepr�fteDosis

Biologische Wirkungen Lit.

Chitosan-�berzoge-nes GO

menschliche Erythrozyten (RBCs) 100 mgmL�1 keine h�molytische Aktivit�t [34]

GO Erythrozyten (RBCs) 5–25 mg mL�1 Thrombotoxizit�t; Aggregation von menschli-chen Blutpl�ttchen

[35]

rGO Erythrozyten (RBCs) 2–20 mg mL�1 verringerte Pl�ttchenaggregation [35,36]

Amino-GO Erythrozyten (RBCs) 2–20 mg ml�1 Keine Thromboh�molyse; keine Pl�ttchenanre-gung; keine Zelllyse

[36]

rGO menschliche Hepatokarzinom-Zellen (HepG2) 1 mg ml�1 m�ßige Variation von Proteinspiegeln [37,38]

GO menschliche Fibroblasten (HDF) 5–100 mgmL�1

Toxizit�t bei Dosen von >50 mgml�1; Abnahmeder Zelladh�sion; Zellapoptose

[39]

GO mit PEG disper-giert

L929-Fibroblasten 3.125–100 mgmL�1

leichte Toxizit�t bis 25 mgmL�1 [40]

GO A549-Zellen 20 und85 mgmL�1

leichte Abnahme der Zellproliferation; keineApoptose oder Zelltod bis 85 mg mL�1

[41]

rGO A549-Zellen 20 und85 mgmL�1

erhebliche Verringerung der Zellviabilit�t [41]

GO A549-Zellen 10–200 mgmL�1

keine Zellaufnahme; dosisabh�ngiger oxidativerStress; leichter Verlust an Zellviabilit�t bei200 mgmL�1

[42]

gereinigtes GO A549-Zellen 7.8–125 mgmL�1

dosisabh�ngige Zytotoxizit�t; 80% Zellviabilit�tbei 125 mgmL�1

[43]

PEG-GO RAJI-Zellen; HCT-116-Zellen; OVCAR-3-Zellen;U87MG-Zellen; MDA-MB-435-Zellen; MCF-7-Zellen

0.5–150 mgmL�1

keine Wirkung auf die Zellviabilit�t bis100 mgmL�1; verringerte Toxizit�t

[6,44]

Dextran-GO HeLa-Zellen 10, 50,200 mgmL�1

erhçhte Zellviabilit�t; normale Zellproliferation [45]

GO NIH-3T3-Zellen 1000 mg mL�1 keine Wirkung auf die Zellviabilit�t [58a]

.AngewandteKurzaufs�tze

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Parametern, die zu den unterschiedlichen Toxizit�tseigen-schaften f�hren kçnnen. Es �berrascht nicht, dass Materialienmit Mikrometergrçße einen besorgniserregenden Grad anToxizit�t zeigen.[48, 49] Andererseits kçnnte auch das Vorhan-densein von Begleitstoffen wie nichtumgesetztem Graphit-oxid oder graphitischen Fraktionen f�r Entz�ndungen ver-antwortlich sein. Durch mehrere Waschvorg�nge und Zen-trifugationsschritte gr�ndlich gereinigtes GO zeigte tats�ch-lich keine Erhçhung der Proteinspiegel und polymorpho-nukle�ren Leukozyten an den Tagen 1 und 7 nachperitonealer Verabreichung (injizierte Dosis 50 mg proTier).[43] Im Vergleich zu langen pristinen mehrwandigenKohlenstoff-Nanorçhren wurde keine Ansammlung vonRiesenzellen, entz�ndliche Antwort und Entstehung vonGranulom beobachtet (Abbildung 5). Das Modell, das f�r dieBeurteilung des karzinogenen Potenzials nach Expositiongegen�ber GO verwendet wurde, war f�r faserfçrmige Ma-terialien ausgelegt,[49] und es ist noch nicht klar, ob das Modellauch f�r Nanomaterialien mit anderer Gestalt geeignet ist.

Durch chemische Funktionalisierung kann eine Modula-tion der Toxizit�t in vivo erzielt werden.[50] Beispielsweiseverringert PEGylierung von GO die toxische Wirkung inM�usen. Bei der Verwendung von GO als Komponente in-jizierbarer Hydrogele zum Gewebe-Engineering wurde keineschwere Toxizit�t in vivo gemessen.[51] In dieser Studie bliebdie Rolle von Graphen unklar, abgesehen von der Herab-setzung der zur Bildung eines w�rmeempfindlichen Hydro-gels erforderlichen Tensidkonzentration. Das Vermçgen vonGO zur Absorption im Nahinfrarotbereich ist einer derVorteile der Verwendung von GO in Kompositmaterialien f�rdie regenerative Medizin, da es so durch kontrollierte Be-strahlung die Freisetzung eines im Hydrogel eingebettetenWirkstoffs erhçhen kann.

Die In-vivo-Studien wurden auch auf andere Tiermodelleals Nager erweitert.[52] Caenorhabditis elegans ist ein frei le-bender Fadenwurm mit Vorteilen wie der Mçglichkeit zurLaborkultur. C. elegans (mit einer Lçsung von 250 mg mL�1

behandelt) wurde als Wirt verwendet, um die Wirksamkeitvon Graphit-Nanopl�ttchen, die aus 3 bis 60 Graphen-schichten mit lateralen Grçßen von 1 bis 10 mm zusammen-gesetzt waren, als antimikrobielles Mittel nach Expositiongegen�ber dem Pathogen Pseudomonas aeruginosa zu be-stimmen. Das Vorhandensein dieses Materials im Inneren derFadenw�rmer verringerte die Anzahl der infektiçsen Zelleneindeutig, vermutlich durch mechanische Sch�digung derBakterienmembran, w�hrend es die Lebensdauer und dieReproduktionskapazit�t des Organismus nicht ver�nderte(d.h. keine Genotoxizit�t). C. elegans wurde auch bei aktu-ellen Versuchen zur Aufkl�rung der chemischen Vorg�ngeneben der Toxizit�t von GO in vivo verwendet.[53] GO wurdemit PEGyliertem Poly-l-lysin �berzogen oder nicht�berzo-gen verwendet. Bei der Behandlung des Organismus mit GOim Konzentrationsbereich zwischen 5 und 20 mgmL�1 wurdekeine Ver�nderung der Lebensdauer, Sch�digung auf derEbene der Zellwand, Beeintr�chtigung der Beweglichkeitund Verringerung der Reproduktionsf�higkeit des Faden-wurms beobachtet. Stattdessen verringerte das Polymer-�berzogene GO die Widerstandsf�higkeit des Fadenwurms,insbesondere unter oxidativem oder thermischem Stress, be-tr�chtlich und f�hrte zum Tod. �berm�ßiges Vorhandenseinvon reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beeintr�chtigte dasinh�rente antioxidative Abwehrsystem und f�hrte zu einerdrastischen toxischen Wirkung auf C. elegans unter patho-physiologischen Bedingungen.

Wie bei der In-vitro-Wirkung sind viele Parameter zuber�cksichtigen, wenn GFNs auf Toxizit�t in vivo gepr�ftwerden. Tats�chlich ist die Variabilit�t der Proben außeror-dentlich hoch. Diese Situation ist jener �hnlich, die bei Koh-lenstoff-Nanorçhren beobachtet worden ist. Erneut ist esgrunds�tzlich wichtig, die morphologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften f�r jeden Typ von Probe zu be-trachten und zu beschreiben, ohne Verallgemeinerungen zutreffen, die mit dem Risiko von Fehlern bei der Verwendungoder Betonung von Begriffen wie „Sicherheit“ oder „Toxizi-t�t“ von GFNs verbunden sind. Die Toxizit�t von GFNs kanneng mit ihrer Oberfl�chenfunktionalisierung in Beziehungstehen. Die Grçße ist der zweite wichtige Parameter, dersorgf�ltig zu ber�cksichtigen ist.

Abbildung 5. Granulombildung an der Diaphragma-Membran nach7 Tagen. Weiblichen C57Bl/6-M�usen wurden 50 mg Tr�gerkontrolle(0.5% Rinderserumalbumin/Kochsalzlçsung), pristine mehrwandigeKohlenstoff-Nanorçhren (NT-lang, pristin), Graphit und reines GO(pGO) intraperitoneal injiziert; die M�use wurden nach 1 Tag odernach 7 Tagen getçtet, und die Diaphragmen wurden entnommen, fi-xiert und f�r die Visualisierung vorbereitet. SEM-Aufnahmen der Dia-phragma-Oberfl�che (A, B) und histologische Aufnahmen (C) unterVerwendung von H�matoxylin- und Eosin-F�rbung zeigen die Ansamm-lung von Riesenzellen und verdeutlichen das Vorhandensein von gra-nulomatçser Entz�ndung mit NT-lang, nicht aber mit Graphit undpGO. Die SEM-Aufnahmen sind in niedriger und hoher Auslçsung ge-zeigt. Abdruck aus Lit. [43].

Graphen

5093Angew. Chem. 2013, 125, 5086 – 5098 � 2013 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.de

Tabelle 2: In vivo untersuchte GFNs und ihre biologischen Wirkungen.

Material In-vivo-Modell Gepr�fte Dosis Biologische Wirkungen Lit.

GO Kaninchen 100–300 mg/Auge keine Augenver�nderungen; normaler Augeninnendruck; normalesSehen

[27]

GO Maus 250 mgkg�1 Thrombotoxizit�t; ausgedehnte Lungen-Thromboembolie; Blutpl�tt-chenaggregation beim Menschen

[35]

rGO Maus 250 mgkg�1 weniger wirkungsvoll bei der Pl�ttchenaggregation [35,36]

Amino-GO Maus 250 mgkg�1 keine Thrombotoxizit�t; Gef�ße erscheinen normal mit keinem Zeichenvon okklusiver Pathologie

[36]

GO Maus 100, 250, 400 mg/Tier chronische Toxizit�t und Tod der Tiere bei der hçchsten Dosis; Lungen-,Milz- und Lebergranulom; keine Clearance �ber die Niere

[39]

gereinigtes GO Maus 50 mg/Tier keine akute und chronische Entz�ndung nach intraperitonealer Verab-reichung

[43]

Dextran-GO Maus 20 mgkg�1 Akkumulation in Leber und Milz; allm�hliche Beseitigung binnen einerWoche; keine Kurzzeit-Toxizit�t

[45]

GO Maus/Ratte 1 und 10 mgkg�1 (Tiere)10 und 80 mg mL�1 (Zel-len)

dosisabh�ngige Lungentoxizit�t; granulomatçse L�sionen bei10 mgkg�1; Lungençdem-Fibrose bei 10 mg kg�1; entz�ndliche Zell-infiltration bei 10 mgkg�1; RBC-H�molyse bei 80 mg mL�1

[46]

GO und aggregiertesGraphen

Maus 50 mg/Tier Erzeugung von ROS; Entz�ndung; Apoptose; Zunahme der mito-chondrialen Respirationsrate; Lungentoxizit�t-Entz�ndung

[47]

Graphen in 2% Pluro-nic F108

Maus 50 mg/Tier verringerte toxische Wirkungen [47]

Graphen-Nanopl�tt-chen (25 mm) in 0.5%BSA

Ratte 50 mg/Tier (pharyngealeAspiration)5 mg/Tier (intrapleuraleInjektion)

entz�ndliche Zytokinfreisetzung (IL1b); akute entz�ndliche Lungen-antwort

[20]

PEG-GO Maus 20 mgkg�1 hohe Tumorakkumulation; geringe Aufnahme durch RES; kein Zeichenvon Anomalie in Niere, Milz, Herz, Leber und Lunge; allm�hlicheClearance

[50]

GO-Pluronic-Hydro-gele

Maus Gel-Zusammensetzung:0.4% GO/0.25–1 %Pluronic

keine schwere Toxizit�t [51]

Graphit-Nanopl�tt-chen (1–100 mm)

Caenorhabditiselegans

50–250 mgmL�1 keine Ver�nderung der Lebensdauer des Fadenwurms; keine Ver�nde-rung der Reproduktionskapazit�t

[52]

GO und PEG-(Poly-l-lysin)-�berzogenesGO

Caenorhabditiselegans

5–20 mgmL�1 keine Ver�nderung der Lebensdauer des Fadenwurms; keine Sch�di-gung auf der Ebene der Zellw�nde; keine Ver�nderung der Reproduk-tionskapazit�t; keine Verringerung der Beweglichkeit

[53]

PEG-(Poly-l-lysin)-�berzogenes GO

Caenorhabditiselegans

5–20 mgmL�1 Zellen werden unter oxidativem oder thermischem Stress kultiviert:verringerte Best�ndigkeit, die zum Tod f�hrt; intrazellul�re ROS-Bil-dung; beeintr�chtigter Elektronentransfer

[53]

PEG-GO Maus 20 mgkg�1 RES-Akkumulation; Nieren- und F�zes-Beseitigung; keine Ver�nderungvon biochemischen Blutparametern

[61]

GO (groß 1–5 mm undklein 110–500 nm)

Maus 1–10 mgkg�1 schnelle Clearance aus dem Blut; Akkumulation haupts�chlich in Lungeund Leber

[62]

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5. Bakterientoxizit�t von GFNs

Zu den toxischen Wirkungen von GFNs auf Mikroorga-nismen gibt es eine Reihe aktueller Untersuchungen an ver-schiedenen Typen von Bakterien und Pilzen. Die erkennbareantibakterielle Aktivit�t kçnnte interessante zuk�nftige An-wendungen von Graphen in antimikrobiellen Produkten fin-den (Abbildung 6). Abscheidungen von GO und rGO aufEdelstahlsubstrat zeigten antimikrobielle Aktivit�t gegenGram-negative E. coli und Gram-positive S. Aureus.[54] rGOwar in beiden F�llen wirksamer. Eine Wirkung auf die me-tabolische Aktivit�t war mit einer Sch�digung der Zellmem-bran der Mikroorganismen kombiniert.[41] Zur Erweiterungdieser Untersuchungen wurde der antimikrobielle Mecha-nismus auch durch Vergleich verschiedener Typen von Gra-phenmaterialien, einschließlich Graphit, Graphitoxid, GOmit verschiedenen lateralen Grçßen und rGO (Konzentration5–80 mg mL�1), analysiert (Abbildung 6).[55] Auch hier wurdeunter den verschiedenen Typen von Graphenderivaten diehçchste antibakterielle Aktivit�t f�r GO mit der kleinstenGrçße gefunden.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Gra-phenmaterialien scheinen eine wichtige Rolle f�r die Wirk-samkeit der Bakterienabtçtung zu spielen und kçnnen ent-sprechend angepasst werden, um die sch�dliche Wirkung aufGesundheit und Umwelt zu minimieren. Die Ergebnissewurden aber von einer weiteren Studie in Frage gestellt,[56] beider GO zu E. coli zugegeben wurde und die Bakterienschneller wuchsen, indem sie dichte Biofilme um das sus-pendierte Nanomaterial bildeten. Nur die Kombination mitSilber-Nanopartikeln f�hrte zum Zelltod.[56,57] In Anbetrachtdieser Befunde stellt die Untersuchung der bakteriostatischenEigenschaften von GO eine Herausforderung dar und wirdzweifellos weitere Studien anregen.

Graphit-Nanopl�ttchen und andere Typen von GFNszeigten bakterizide Eigenschaften in vitro auf isolierten

P. aeruginosa und in vivo an einem gegen�ber diesem Pa-thogen exponierten Wirt-Fadenwurm.[52] Die antibakterielleAktivit�t von GO blieb erhalten oder war sogar verbessert,wenn es in Poly-N-vinylcarbazol dispergiert und auf einemSubstrat elektrodeponiert wurde, ohne zytotoxische Wir-kungen auf S�ugerzellen zu zeigen, die gegen�ber einer Dosisvon 1000 mgmL�1 exponiert wurden.[58] Es ist interessant, dassdie Wechselwirkung von GO mit E. coli zu einer „gr�nen“Reduktion von Graphenbl�ttern f�hrte (Verlust von 60% derSauerstoff-enthaltenden funktionellen Gruppen), die mittelsTropfenbeschichtung auf Si2O/Si(100)-Substrat aufgetragenwurden.[59] W�hrend dieses Vorgangs zeigten die BakterienProliferationshemmung und Ablçsen von der Oberfl�chedurch die antibakterielle Aktivit�t von rGO, das durch diebakterielle metabolische Wirkung entstanden ist. Fernerzeigte rGO (zwischen 1 und 500 mgmL�1 gepr�ft) fungizideAktivit�t gegen nichtpathogenen Aspergillus oryzae und pa-thogene Aspergillus niger und Fusarium oxysporum.[60]

W�hrend diese Eigenschaft bei pathogenen Pilzen von Nut-zen sein kann, muss hinsichtlich nichtpathogener n�tzlicherMikroorganismen eine gewisse Besorgnis gelten.

Ein Vergleich der verf�gbaren Daten zur antibakteriellenund fungiziden Wirksamkeit von GFNs ist schwierig, da dieZellkulturbedingungen und der Typ der Ausgangsmaterialienin den beschriebenen Experimenten variierten. Andererseitskçnnten manche der widerspr�chlichen Daten weitere For-schungen zur Beurteilung der antimikrobiellen Rolle vonGFNs als Funktion ihrer physikalisch-chemischen Eigen-schaften anregen.

6. Bioverteilung und Pharmakokinetik von GFNs

Die In-vivo-Untersuchung von Bioverteilung, Akkumu-lation und Beseitigung von Graphen-Nanomaterialien ist einwichtiger Schritt zum Verst�ndnis der Risiken, die mit ihrer

Abbildung 6. Oben links: AFM-Bild von GO-Bl�ttern, getrocknet auf einer Glimmer-Oberfl�che. Unten links: E.-coli-Zellen nach 2 h Inkubation mitGO-Dispersion (40 mgmL�1); die meisten Bakterien werden nach Exposition gegen�ber GO-Dispersionen abgeflacht und verlieren ihre zellul�reIntegrit�t. Rechts: Messungen der Zellviabilit�t nach Inkubation mit Graphit-, Graphitoxid-, GO- und rGO-Dispersionen. Eine 5-mL-Portion vongraphenbasierten Materialien (80 mgmL�1) wurde 2 h bei 37 8C mit E. coli inkubiert. Der Verlust von Zellviabilit�t wurde durch Koloniez�hlungbestimmt. Als Kontrolle wurde eine isotonische Kochsalzlçsung ohne graphenbasierte Materialien verwendet. Abdruck aus Lit. [55], Copyright2011, American Chemical Society.

Graphen

5095Angew. Chem. 2013, 125, 5086 – 5098 � 2013 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.de

Verwendung verbunden sind. Untersuchungen der Biover-teilung (injizierte Dosen von 1 oder 10 mgkg�1) zeigten, dassintravençs injiziertes GO vornehmlich in der Lunge akku-muliert, w�hrend eine nur geringe Aufnahme durch das reti-kuloendotheliale System (RES) beobachtet wurde (Tabel-le 2).[46] GO zeigte lange Zirkulationszeiten im Vergleich zuanderen Formen von Kohlenstoff. Nach Injektion von1 mgkg�1 Kçrpergewicht wurden keine pathologischen Ver-�nderungen in verschiedenen Organen beobachtet, w�hrendbei einer Dosis von 10 mgkg�1 wesentliche Ver�nderungen inder Lunge auftraten. Es ist interessant, dass PEG-POhaupts�chlich im Tumor von xenotransplantierten Tierenakkumuliert, mit geringerer Aufnahme durch das RES undohne wesentliche toxische Wirkungen.[50] Nach einer anf�ng-lichen Akkumulation in RES-Organen wurde zwischen denTagen 3 und 15 eine allm�hliche Beseitigung beobachtet.Nach drei Monaten waren die Graphenbl�tter ohne Zeichenvon Anomalie in Hauptorganen (d.h. Nieren, Leber, Milz,Herz und Lunge) vollst�ndig beseitigt. Dieser Typ von mo-difiziertem, mit 125I radiomarkiertem Graphen wurde auchverwendet, um die Pharmakokinetik, die Langzeit-Biover-teilung und die toxischen Wirkungen eingehender zu unter-suchen.[61] Die intravençs verabreichten Graphenbl�tterwurden durch Clearance �ber Niere und F�zes allm�hlichbeseitigt. Die gepr�fte Dosis von 20 mg kg�1 f�hrte �ber ei-nen Zeitraum von 3 Monaten zu keiner ersichtlichen Toxizi-t�t, wie durch Messung der biochemischen Parameter im Blutund der h�matologischen Marker (weiße und rote Blutzellen,H�moglobin, Blutpl�ttchen usw.) gezeigt wurde. Die histo-logische Untersuchung der verschiedenen Organe zeigtekeine Sch�digung oder L�sionen, mit der Ausnahme einerZunahme der F�rbung von Milz und Leber durch Akkumu-lation von braunem GO. Die Auswirkung der lateralen Grçßevon GO-Bl�ttern auf Organverteilung und Akkumulationwurde ebenfalls mit iodiertem Material untersucht.[62] GroßesGO (1–5 mm) und kleines GO (110–500 nm) wurde jeweilsmit Na125I markiert. Unabh�ngig von der Grçße wurde GOschnell aus dem Blut beseitigt und akkumulierte haupts�ch-lich in Lunge und Leber. W�hrend kleines GO in der Lebergefunden wurde, akkumulierte großes GO in der Lunge. MitAnsteigen der injizierten Dosen des kleinen GO von 1 auf10 mg kg�1 �nderte sich dessen Verteilung und zeigte einehçhere Lokalisierung in der Lunge als Folge der bei hohenDosen erfolgenden Aggregation. Ein Vergleich des pharma-kologischen Profils der beiden Typen von GO weist daraufhin, dass das Material mit der kleineren lateralen Grçße f�rmçgliche biomedizinische Anwendungen besser geeignetist.[43]

Die Daten aus diesen Untersuchungen sind außeror-dentlich interessant und werden weitere Untersuchungenanstoßen. Tats�chlich muss das Verhalten anderer Graphen-Nanomaterialien, anderer Tiermodelle, hçherer Dosen undanderer Verabreichungswege gegen�bergestellt werden.Diese Untersuchungen werden das Verst�ndnis der Wirkun-gen von GFNs bei gezielter Verabreichung oder bei Kontaktdurch unbeabsichtigte Exposition verbessern.

7. Zusammenfassung und Ausblick

Dieser Kurzaufsatz fasst verschiedene Fallstudien �berdie In-vitro- und In-vivo-Wirkung von GFNs zusammen. SindGFNs also sicher oder toxisch? Die verf�gbaren Ergebnissezeigen, dass dieses neue Nanomaterial zu einer Gefahr f�r diemenschliche Gesundheit werden kçnnte, dass aber chemischeManipulation ein Weg ist, die mçglichen Risiken in Verbin-dung mit der zuk�nftigen Entwicklung von GFNs auf denverschiedenen Anwendungsgebieten (beispielsweise Kom-positmaterialien, elektronisch gesteuerte biomedizinischeWerkzeuge usw.) zu mildern. In dieser Hinsicht ist k�rzlicheine Gegen�berstellung von GFNs und Kohlenstoff-Nano-rçhren erschienen, die einige Leitlinien zum Modulieren dertoxischen Wirkungen von Graphen gibt.[13] Wenn wir solche„Regeln“ beachten, kçnnten wir eine Verzçgerung der Pro-blembetrachtung, wie sie bei Kohlenstoff-Nanorçhren auf-getreten ist, vermeiden, indem wir die zehnj�hrige Erfahrungbei deren Entwicklung nutzen. In diesem Zusammenhangkann der Kurzaufsatz auch als vorgreifend angesehen werden,da er die Aufmerksamkeit der Forscher bei der Entwicklungneuer Nanomaterialien gewinnen will. Auf die Anfangsfragekann keine klare Antwort gegeben werden, es gibt aber starkeHinweise darauf, dass die toxischen Wirkungen modular sind.Ferner sollte die Verallgemeinerung der Toxizit�t von GFNsvermieden werden, da die mit ihnen verbundenen Risikenvon den spezifischen Anwendungen und Entwicklungen ab-h�ngen.

Es ist allerdings noch Forschungsarbeit notwendig, um diebiologischen Antworten und die Sicherheitsfragen von Na-nomaterialien der Graphenfamilie genauer zu untersuchen,wobei die verschiedenen physikalisch-chemischen Eigen-schaften zu ber�cksichtigen sind. Die am h�ufigsten unter-suchten GO und rGO sind hydrophiler als ein- und mehr-schichtiges Graphen. Die Schwierigkeit, stabile kolloidaleDispersionen von hydrophoben Graphenoberfl�chen auf-rechtzuerhalten, ist eine der Beschr�nkungen bei der Be-stimmung des Sicherheitsprofils dieses Nanomaterials. In je-dem Fall sollten die Analysen auf all die Mitglieder derGraphenfamilie ausgedehnt werden, die bisher weniger ge-nauer gepr�ft wurden (beispielsweise Graphenpunkte).[63]

Es gibt mehrere wichtige Faktoren, die mit der Toxizit�tneuer Nanomaterialien verbunden sind. So m�ssen die Er-zeugung reaktionsf�higer Sauerstoffspezies, die indirekteToxizit�t durch GFN-Adsorption wichtiger Biomolek�le unddie physikalische Toxizit�t in Verbindung mit der Wechsel-wirkung mit den Lipiden in Zellmembranen, Geweben undOrganen sorgf�ltig untersucht und analysiert werden. Fernermuss die Aufnahme als Funktion der Grçße untersucht wer-den. Die laterale Grçße von Graphen kçnnte die verschie-denen Rezeptoren, die bei den Eindringmechanismen betei-ligt sind, auf energieabh�ngige Weise beeinflussen (d.h. En-dozytose/Phagozytose-aktive Mechanismen). Wenn passiveMechanismen ablaufen, wie es bei Kohlenstoff-Nanorçhrender Fall ist,[64] w�re es interessant zu verstehen, wie sich dieflache Form des Materials auf die Organisation der Membranauswirkt (d.h. Unterbrechen der Membran oder einfachGleiten zwischen den Lipid-Doppelschichten).[65] Alle dieseUntersuchungen werden f�r die sicherere Entwicklung und

.AngewandteKurzaufs�tze

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Herstellung von GFNs von Nutzen sein, um die Risiken f�rdie menschliche Gesundheit und die Umwelt zu minimieren.

Der Autor dankt dem Centre National de la RechercheScientifique (CNRS) und der Agence Nationale de la Recher-che (DECANO, Projekt Nr. ANR-2011-CESA-007-01) sowieFanny Bonachera f�r ihre Hilfe bei der Erstellung der Abbil-dungen und H�l�ne Dumortier und C�cilia M�nard-Moyon f�rkritisches Lesen des Manuskripts.

Eingegangen am 13. November 2012,ver�nderte Fassung am 13. Dezember 2012Online verçffentlicht am 11. April 2013

�bersetzt von Dr. Thomas Steiner, Neu-Ulm

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