Grundlagen der molekularen Diagnostik und konkretes Rhesus ... der...CNI SVTM Bern, Januar 2012...

Grundlagen der molekularen Diagnostik und konkretes Rhesus-Projekt

Christoph Niederhauser

Blutspendedienst SRK Bern

CNI SVTM Bern, Januar 2012

Inhalt

• Grundlagen Molekularbiologie

• Grundlagen der Blutgruppen

• Molekulare Diagnostik im Bezug auf Blutgruppen

• Wie entstehen Blutgruppenvarianten

• RHD Projekte

• Umsetzung der RHD Projekte in die Routinetestung


Grundlagen Molekularbiologie


Blutgruppensysteme

• 30 Blutgruppensysteme

• > 300 Verschiedene Antigene / > 1000 Allele


Vergleich Serologie / Molekularbiologie

• Traditionelle Blutgruppentypisierung beruht auf serologischen Methoden -> Phänotypisierung (Zelle)

• Blutgruppen können auch mit molekularbiologischen Methoden typisiert werden -> Genotypisierung (Genom)

Phänotypisierung Genotypisierung


Genom / Chromosom


Das Buch der Erbsubstanz

Menschliches Genom als Buch vorstellen

Es besteht aus 23 Kapiteln namens

Chromosomen.

Jedes Kapitel enthält tausende von

Absätzen, die wir Gene nennen

(60-80‘000).

Und jeder Absatz besteht aus Sätzen,

die Exons/Introns heissen.

Jeder dieser Sätze setzt sich aus Wörtern

namens Codons zusammen und

jedes Wort besteht aus Buchstaben,

die wir Basen nennen.

In dem Buch des menschlichen

Genoms stehen ungefähr 3 Milliarden Buchstaben


Was wird untersucht: Zielsequenz


Grundlagen der Blutgruppen


Blutgruppensysteme

• 30 Blutgruppensysteme

• > 300 Verschiedene Antigene / > 1000 Allele


Einteilung der Blutgruppensysteme

• Antigene des Blutgruppensystems werden durch ein einziges Gen codiert. Sie sind deshalb verschiedene Ausprägungen eines einzigen Gens (Allele)

(z.B. Kell-System, Kidd-System, Duffy-System)

• Die Antigene des Blutgruppensystems werden durch mehrere eng verbundene homologe Gene codiert

(z.B RH-System, MNS-System)

International Society of Blood Transfusion (ISBT)


Was Sind Blutgruppenantigene?

• Proteine oder Glykolipide auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen die als Antigene wirken (Ak Bildung möglich)


Beispiel: Rhesus D Gen / Protein

Abbildung: FF Wagner, DRK Blutspendedienst NSTOB, Springe

Ebene Protein

Ebene Chromosom/Gen


Molekulare Diagnostik im Bezug auf Blutgruppen


Vorgehen um zu Resultaten zu kommen

• Extraktion der Nukleinsäure (DNA und RNA)

• Amplifikation (Vermehrung) der Nukleinsäure

- PCR (Polymerase chain reaction),

- LCR (Ligase chain reaction),

- TMA (Transcription mediated amplification),

- NASBA (Nucleic acid sequence based amplification),

- etc. • Detektion (Nachweis) der amplifizierten Nukleinsäure

- einfaches Gel,

- fluoreszierende Sonden,

- Kapillarelektrophoresen

- etc. (RFLP, Sequenzierung)


„Zielsequenzen“

Um solche kleine Mengen

und so kleine Fragmente

nachweisen zu können

benötigen wir eine

Amplifikationsmethode um

die Nadel im Heuhaufen

zu entdecken

PCR

TMA


Amplifikationsmethoden: PCR

Denaturierung (Melting, Schmelzen) Primerhybridisierung

(primer annealing)

Elongation (Extending, Polymerisation,

Verlängerung, Amplifikation) Exponentielles Anwachsen des kurzen Produktes

Eine Methode, um die Erbsubstanz DNA in vitro zu vervielfältigen


Nachweis- (Detektions) verfahren

• Agarose-Gele

• Kapillarelektrophoresen

• Kapillargelektrophoresen

Kp(b

)

Co(b

)

Lu(b

)

Yt(b)

k

Kp(a

)

Co(a

)

Lu(a

)

Yt(a)

K

Fy(a

)

Do(a

)

M S

Jk(a)

Fy(b

) Do(b

)

N s

Jk(b)

Auch kommerzielle Systeme wie Innotrain, BAG etc. beruhen noch auf solchen Detektionssystemen

• Hybridisierungen

• Labeling von Sonden

• komplexe Systeme


Nachweis- (Detektions) verfahren

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11


Wie entstehen Blutgruppenvarianten


Wie entstehen Genvarianten (Allele)?

• Einzelnukleotidpolymorphismen

(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)

• Insertions- und Deletionspolymorphismen

• Crossover und Rekombination

• Multiplikationen (Verdoppelungen, Vervielfachungen)

• Genkonversionen


SNPs als Basis für Blutgruppenantigene

Bekannte Antigenpaare kodiert von SNPs:

• RH C/c, E/e

• MNS M/N, S/s

• Kell K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb etc.

• Duffy Fya/Fyb

• Kidd Jka/Jkb

• Lutheran Lua/Lub

• Dombrock Doa/Dob

• Cartwright Yta/Ytb,

• Colton Cob/Cob


SSP-(Sequenz-spezifische Primer) PCR

C G

T

G

Amplifikation

Keine Amplifikation

Primer spezifisch

für KEL4

5’

5’

KEL3

Kp(a)

KEL4

Kp(b)

Allel SNP

KEL4 KEL3

Interne Ref.

KEL4

Agarosegel

tgtcaatctccatcacttca ggctgttccagtttctgagg

ccgacaaggtcaaagactcc

tgtcaatctccatcacttca ggctgttccagtttctgagg

ccgacaaggtcaaagactcc


Was bewirken SNPs?

• In den kodierenden Regionen – Aminosäurenaustausch (Missense Mutation)

– Aminosäure Stop Codon (Nonsense Mutation)

• In den nicht-kodierenden Regionen – Modifiaktion der Splicing sites (splice site junctions)

– Veränderungen der Transkription

• Stille Mutationen

– In der Regel ohne Wirkungen

– RHD Gen Protein als Beispiel


Wie kommen weak D, DEL und partial D zustande ?

• Mutation welche einen Aminosäurenaustausch des Rhesus Antigens in der Erythrozytenmembran oder an der „Innenseite“ bewirkt

• Mutation welche einen Aminosäurenaustausch des Rhesus Antigens auf der „Aussenseite“ der Erythrozytenmembran bewirkt

Weak D, DEL

Partial D

Abbildungen: FF Wagner, DRK Blutspendedienst NSTOB, Springe


RHD Projekte


Ausgangslage

• Es wurden Fälle beschrieben wo Erythrozytenkonzentrate vom Typ DEL aber auch vom Typ weak D (Bsp.: weak D 4 und 15) bei Patienten Immunisierungen ausgelöst haben

• Hämovigilance-Berichte von Swissmedic

– ein gewichtiger Anteil der gemeldeten Alloimmunisierungen ist auf Rhesus D zurückzuführen


Molekulares in-house SSP-PCR System im Minipoolverfahren zum Nachweis des RHD Gens

• Hintergrund:

– Das RhD Antigen ist stark immunogen

– Abhängig von der D Variante wird diese serologisch nicht detektiert

• Ziel:

– Reduzierung der Immunisierungsrate mit Hilfe des molekularen RHD Screening von serologisch RhD negativen Spendern

• Fragen:

– Müssen alle serologisch RhD negativen Spender gescreent werden?

– Kann eventuell auf den IAT verzichtet werden ?

• Methode:

– Screening von 700 RhCdE und 17’000 Rhcde Spender auf die RHD Exone 3, 5 und 10 mittels PCR und/oder DNA-Sequenzierung


Molekulares RHD Screening

PCR der Exone 3, 5 und 10 des RHD Gens


Methodik

• Molekulares Screening auf die 3 Exons 3,5,10 (PCR)

• Falls Typisierung mit SSP-PCR möglich i.O.

• Falls Typisierung nicht möglich

• Sequenzierung der entsprechenden Exons

WT

Weak D


Resultate: Pilotstudie (652 CdE Spender)

RhD Varianten Anzahl Serologie

positiv*

RhD Status

weak D 11 (M295I) 4 1 positive

weak D 31 1 positive

DEL RHD (IVS3+1G>A) 3 1 positive

DEL RHD (IVS5-38del4) 2 positive

DVL-2 2 2 positive

Ccdes 2 negative

RHD-CE(2-9)-D 2 negative



No mutation found 3 negative

Not specified 2 negative

total 24 4

*Abhängig vom eingesetzten anti-D


Resultate: Screening (17’391 vorwiegend cde Spender)

Phenotyp RHD Varianten Anzahl RhD Status

ccddee RhD psi 3 negativ

4bp del in Exon4 (and Dau-0) 1 negativ

no mutation 1

Total 5

Ccddee RHD psi 1 negativ

RHD-CE(2-9)-D 5 negativ

RHD-CE(3-7)-D 3 negativ

no mutation 2 nicht spez.

ccddEe RHD-CE(4-9)-D 1 negativ

Total 12

Ccddee weak D 38 (833 G>A) 1 positiv

CcDdee possible splice site

mutation IVS3+5G>A

1 positiv

Total 2


Wie werden RHD positive Spender deklariert ?

Mutation Serologie* PCR Als Spender Als Empfänger

Weak D 11 (M295I) negativ/positiv positiv RhD positiv RhD negativ

Weak D 31 negativ/positiv positiv RhD positiv RhD negativ

DVL-2 negativ/positiv positiv RhD positiv RhD negativ

DEL RHD IVS3+1G>A negativ/positiv ? positiv RhD positiv RhD negativ

RHD-CE (2-9)-D negativ positiv RhD negativ RhD negativ



* Abhängig vom eingesetzten anti-D


Umsetzung der RHD Projekte in die Routinetestung


Daten der 2 Studien / weiteres Vorgehen

• 1. Studie wurde mit ca. 700 CE positiven Proben aus 4 Regionen durchgeführt

• 2. Studie wurde mit ca. 17‘300 vorwiegend Rh cde Proben durchgeführt

• Auf Grund der erarbeiteten Daten: – Antrag an die DK mit möglichen Vorgehensweisen – Direktorenkonferenz hat beschlossen das molekulare RHD Screening einzuführen – Arbeitsgruppe Immunhämatologie hat das genaue Vorgehen für die Vorschriften

BSD SRK beschrieben – Verzicht auf den IAT – Anpassung Vorschriften – Übergangsregelung 2012 – Ab 1.1.2013 obligatorisch

• Routinetestung ab 1.1.2013


Mehrfachspender 2012 / Erstspender 2013

RhD Screen mit monoklonalen anti-D Testseren

RhD positive Spender RhD negative Spender

Rhesus Phänotypisierung CcEe

anti-CDE Screening

CE positiv

Molekulare Testung für Exone 3, 5, 7 und 10 Einzelspendentestung

Molekulare Testung für Exone 3, 5, 7 und 10 Minipools bis zu 24 Spenden

• negative molekulare Testresultate: Deklaration als RhD negativ • positive molekulare Testresultate: Minipool Auflösung und/oder Spezifikation der RHD Varianten (Deklaration abhängig von der Variante)

CE positiv CE negativ

Molekulare Testung für Exone 3, 5, 7 und 10 Einzelspendentestung


Konklusionen

• Serologisches RhD Screening ist nicht immer “fehlerfrei” und daher sind mit grosser Wahrscheinlichkeit einige serologisch RhD negative Spender genetisch RHD positiv

• Individuen die weak D 1, 2 and 3 sind, müssen als RhD positiv deklariert werden und können auch RhD positives Blut bekommen

• Individuen mit partial D, “nicht -1, 2, 3 weak Ds” und DELs müssen als RhD positive Spender deklariert werden, müssen aber als Empfänger RhD negatives Blut bekommen

• Individuen mit Hybridgenen können sowohl als Spender wie auch als Empfänger als RhD negativ gelten


Besten Dank für Ihre Aufmerksamkeit

Peter Gowland Hein Hustinx Sofia Lejon Crottet

Christine Henny Sandra Kretzschmar Martin Stolz Stefano Fontana

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