H HLA™ 96/11 K A CE K B CE (REF: REF: G V 1 02.05CE+User+Manuals+in... · [email protected], wenn...

0086PräpariertDNAfürdieSequenzierung

aufdemIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/11KONFIGURATIONAUNDCEUNDKONFIGURATIONBUNDCE(REF:H32UNDREF:H34)GEBRAUCHSANWEISUNG

VERSION102.05.2018

FürdenGebrauchinderIn-vitro-Diagnostik

V1

OmixonHolotype96/11KONFIGURATION|KonfigurationAundCEundKonfigurationBundCE|Gebrauchsanweisungv1.FürdenGebrauchinderIn-vitro-DiagnostikCopyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Vertraulichundgeschützt

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InhaltsverzeichnisINFORMATIONENZUMHERSTELLER...........................................................................................................7

SYMBOLERLÄUTERUNG..............................................................................................................................7

INHALTDESKITSHOLOTYPEHLA-96/11KONFIGURATIONAUNDCE(REF:H32)ODERKONFIGURATIONBUNDCE(REF:H34).......................................................................................................................................8

PRIMERKOMPONENTEN-BOX................................................................................................................................8REAGENZIENKOMPONENTEN-BOXFÜRDIEBIBLIOTHEKSPRÄPARIERUNG.........................................................................896-WELL-ADAPTERPLATTE...................................................................................................................................9EXCEL-ARBEITSMAPPE.........................................................................................................................................9SOFTWARE–OMIXONHLATWIN.........................................................................................................................9

VERSANDUNDLAGERUNG.........................................................................................................................9

WARNUNGUNDVORSICHTSMAßNAHMEN..............................................................................................10

BEKANNTEPRODUKTEINSCHRÄNKUNGEN..............................................................................................................10

SICHERHEITSHINWEISE.............................................................................................................................10

LEISTUNGSPARAMETER............................................................................................................................11

TECHNISCHEUNTERSTÜTZUNG.................................................................................................................11

TelefonischerSupport:.....................................................................................................................................11

GERÄTE,REAGENZIENUNDZUBEHÖR......................................................................................................12

TECHNISCHEUNDGERÄTEEMPFEHLUNGEN............................................................................................................12EMPFEHLUNGENZUZUGEHÖRIGENREAGENZIEN.....................................................................................................12

KapazitätdesMiSeqReagenzienkit.................................................................................................................13EMPFOHLENESZUBEHÖR...................................................................................................................................13

RECHTLICHEHINWEISE.............................................................................................................................14

BESTIMMUNGSGEMÄßEVERWENDUNG..................................................................................................14

WICHTIGERHINWEISVORDEMSTART.....................................................................................................15

EMPFOHLENEGENOMISCHEDNA-ISOLIERUNG.......................................................................................................15

PRINZIPDERMETHODE............................................................................................................................15

ZUSAMMENFASSUNGDERSCHRITTE........................................................................................................17

GLOSSAR/DEFINITIONEN..........................................................................................................................18

SCHRITT1–PRÄPARIERUNGDESHLA-AMPLIFIKATIONS-MASTERMIX......................................................19

REAGENZIENLISTE.............................................................................................................................................19PROTOKOLL.....................................................................................................................................................19

Mastermix:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1undDQA1..............................................................20Mastermix:HLA-DRB4......................................................................................................................................20Mastermix:HLA-DQB1Satz3...........................................................................................................................20

SCHRITT2–AMPLIFIKATIONHLA-KLASSEIUNDII....................................................................................21


TaqPolymerase-beladenerMastermix:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1undDQA1..............22TaqPolymerase-beladenerMastermix:HLA-DQB1Satz3...............................................................................22


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KlasseI-Amplifikation(HLA-A,BundC)...........................................................................................................22KlasseII-Amplifikation(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1undDQB1).................................23ErwarteteAmplicongrößen..............................................................................................................................23

SCHRITT3–AMPLICON-QUANTIFIZIERUNGUND-NORMALISIERUNG(MITEINEMPLATTENFLUOROMETER)..........................................................................................................................24


Amplicon-Pooling.............................................................................................................................................26ExoSAP-ITExpressPCR-Aufreinigung...............................................................................................................26

SCHRITT4–BIBLIOTHEK-PRÄPARIERUNG.................................................................................................27


Fragmentierungs-Mastermix...........................................................................................................................28Fragmentierungsprogramm.............................................................................................................................28Endenreparatur-Mastermix.............................................................................................................................29Endenreparaturprogramm...............................................................................................................................29Ligations-Mastermix........................................................................................................................................30Ligationsprogramm..........................................................................................................................................30PoolingundBibliotheksaufreinigung...............................................................................................................31

SCHRITT5–AUSWAHLDERBIBLIOTHEKSGRÖßE......................................................................................33


SCHRITT6–BIBLIOTHEKSQUANTIFIZIERUNGMITQPCR-GERÄT................................................................34


qPCRPrimer-Mix..............................................................................................................................................34qPCRMastermix...............................................................................................................................................35

SCHRITT7–SEQUENZIERUNGAUFILLUMINAMISEQ...............................................................................37

REAGENZIENLISTE.............................................................................................................................................37KapazitätdesMiSeqReagenzienkit.................................................................................................................37

PROTOKOLL.....................................................................................................................................................37

SCHRITT8–ANALYSEDERHLA-SEQUENZIERUNGSDATEN........................................................................39

AUTOMATISIERTESPROTOKOLL...........................................................................................................................39IT-Einrichtungund-Konfiguration....................................................................................................................39ProtokollproAnalyse.......................................................................................................................................39

MANUELLESSERVER-PROTOKOLL........................................................................................................................39IT-Einrichtungund-Konfiguration....................................................................................................................39ProtokollproAnalyse.......................................................................................................................................39

MANUELLESDESKTOP-PROTOKOLL......................................................................................................................40IT-Einrichtungund-Konfiguration....................................................................................................................40ProtokollproAnalyse.......................................................................................................................................40

ERGÄNZENDEABBILDUNGEN...................................................................................................................41

PLATTENBEISPIELFÜRAMPLICONPLATTE,AMPLIFIKATIONSPLATTE,VERDÜNNUNGSPLATTE,AMPLICON-QUANTIFIZIERUNGSPLATTE(FÜREINENEINZELNENLOCUS)UNDREAKTIONSPLATTE.......................................................41BEISPIELFÜRSTANDARD-QUANTIFIZIERUNGSPLATTE...............................................................................................41BEISPIELFÜRKAPABIBLIOTHEKSQUANTIFIZIERUNGS-QPCR-PLATTE..........................................................................42


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ANHANG1:PIPPINPREP..........................................................................................................................43

PROGRAMMIERUNGVONPIPPINPREP..................................................................................................................43PIPPINPREPAUSFÜHREN...................................................................................................................................43

ANHANG2:AMPLICON-QUANTIFIZIERUNGMITEINEMQPCR-GERÄT.......................................................46


ANHANG3:BIBLIOTHEKSQUANTIFIZIERUNGMITINTERKALIERENDEMDSDNA-FLUORESZENZFARBSTOFF48



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Dokumentenhistorie–WichtigeHinweiseundUpdates

Version Datum Autor ZusammenfassungderÄnderungen Freigabedurch Ausgabedatum V1 14.12.2017 TündeVágó ErstenVersion EfiMelista 2.5.2018


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Haftungsausschluss

OmixonhatalleAnstrengungenunternommen,umsicherzustellen,dassdieseGebrauchsanwei-sung(IFU,InstructionsforUse)korrektist.OmixonübernimmtkeineHaftungfüreventuelleUnge-nauigkeitenoderAuslassungen.InformationenindieserIFUkönnenohnevorherigeAnkündigunggeändertwerden.OmixonübernimmtkeineVerantwortungfüreventuelleUngenauigkeiten,dieindieserIFUenthaltensind.

OmixonbehältsichdasRechtvor,dieseIFUund/oderdieindieserIFUbeschriebenenProduktejederzeitundohneVorankündigungzuverbessern.

WennSieindiesemHandbuchfalsche,irreführendeoderunvollständigeInformationenfinden,freuen wir uns über Ihre Kommentare und Anregungen. Bitte senden Sie diese [email protected].


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InformationenzumHerstellerNamedesUnternehmens:OmixonBiocomputingLtd

Besuchsadresse:Fehérváriút50-52/6

Stadt:Budapest

PostleitzahlH-1117

Land:Ungarn

Symbolerläuterung

LOT/Chargennummer

Referenz/Katalognummer

Gebrauchsanweisungbeachten

EnthältReagenzfürMengeNanTests

LegalerHersteller.DasmitdiesemSymbolverbundeneDatumbeziehtsichaufdasHerstellungsdatum

EmpfohleneLagertemperatur

Verfallsdatum

MedizinproduktfürdieIn-vitro-Diagnostik

EnthältErsatzkomponenteErsatzkomponente


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InhaltdesKitsHolotypeHLA-96/11KonfigurationAundCE(REF:H32)oderKonfigurationBundCE(REF:H34)

Primerkomponenten-BoxDiePrimerkomponentebietetspezifische,gebrauchsfertigePrimerlösungenfürdiegezielteLongRangePCR-AmplifikationderHLA-GeneA,B,C,DRB1,DRB3,DRB4,DRB5,DPA,DPB1,DQA1undDQB1.ZusätzlichenthältsiezweiArtenvonPCR-Additiven(Enhancer1undEnhancer2).

Primer-Mix REF-Nr. Rxns Vol/Röhrchen AnzahlRöhrchen FarbcodeHLA-A P012 96 220µl 1 GelbHLA-B P022 96 220µl 1 RotHLA-C P032 96 220µl 1 OrangeHLA-DRB1/3 P042 96 220µl 1 GrünHLA-DRB4 P072 96 220µl 1 WeißHLA-DRB5 P112 96 220µl 1 PinkHLA-DPA1 P132 96 220µl 1 SchwarzHLA-DPB1 P072 96 220µl 1 ViolettHLA-DQA1 P082 96 220µl 1 BraunHLA-DQB1(Satz3) P122 96 220µl 1 BlauEnhancer1 E01 96 1100µl 1 KlarEnhancer2 E02 96 300µl 1 Klar

Reagenzienkomponenten-BoxfürdieBibliothekspräparierungDieKomponenten-BoxfürdieBibliothekspräparierungbietetReagenzienfürdieBibliotheksprä-parierung(Fragmentierung,AbstumpfungundAdenylierungderAmpliconendenundAnbindungindizierterAdaptersequenzen)ausHLA-Amplicons.

Reagenz REF-Nr. Rxns Vol/Röhrchen AnzahlRöhrchen FarbcodeFragmentierungEnzym(A) R11 96 278µl 1 GelbFragmentierungspuffer(B) R21 96 278µl 1 RotEndenreparaturEnzym(C) R31 96 162µl 1 GrünEndenreparaturPuffer(D) R41 96 324µl 1 OrangeLigationsenzym(E) R51 96 324µl 1 BlauLigationspuffer(F) R61 96 1800µl 2 Schwarz


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96-Well-AdapterplatteDie 96-Well-Adapterplatte enthält gebrauchsfertige indizierte NGS-Adapter (doppelsträngigeDNA-Oligonukleotide)in5µlLösungzurGenerierungindividuellerNGS-Bibliotheken.Die96-Well-AdapterplatteenthältgenügendindexierteAdapterfürdieErstellungvon96individuellenNGS-BibliothekenundfürdienachgeschalteteProbenidentifikation.

Kit-Version Reagenz REF-Nr. Rxns Volumen/Kavität

AnzahlPlatten

H32 AdapterplatteA(i1-96) N1 96 5µl 1H34 AdapterplatteB(i97-192) N2 96 5µl 1

Excel-ArbeitsmappeZurUnterstützungdesHolotypeHLA96/11-ProtokollsstehteineExcel-ArbeitsmappemitBerech-nungen,Plattenlayouts,Protokollierung,MiSeq-ProbenblatterstellungundvielemmehrzurVer-fügung.WennSiekeineKopiedavonhaben,[email protected].

Software–OmixonHLATwinWenden Sie sich im Zusammenhang mit dem Kauf des Holotype HLA 96/11 Kits [email protected],wennSieOmixonHLATwin-Gutschriftenbenötigen.

WichtigerHinweisVerwendenSiealledreiOmixonHolotypeHLA96/11Kit-KomponentenunddieOmixonHLATwin-SoftwareimselbenWorkflow,umfürdieIn-vitro-DiagnostikeinenWorkflowzubilden.SieheAb-schnittWarnungundVorsichtsmaßnahmenfürEinschränkungenbeiderProduktverwendung.

ErsatzkomponentensindaufspezielleBenutzeranfrageerhältlich.BittebeachtenSie,dassOmixonErsatzfürKomponentenboxenbietet,nichtfüreinzelneFlä[email protected].

VersandundLagerungDerVersanderfolgt auf Trockeneispackungen in Styropor-VersandkartonsundmussnachAn-kunftbei -20 °Cgelagertwerden.BitteüberprüfenSiedieTemperaturkontrolleund -überwa-chungIhrerGefrierschränkeundwartenSiedieseregelmäßig.UngeöffneteKitssindbeiLagerungbei-20°CbiszumVerfallsdatumdesKits(sieheEtikettdesKits)haltbar.NachdemÖffnendesProduktswerdenmaximalvier(4)Frost-Auftau-Zyklenempfohlen,umdieStabilitätdesProduktszugewährleisten.GeöffneteKitssindbei-20°Cbiszu3Monatehaltbar.


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WarnungundVorsichtsmaßnahmenEinschränkungenbeiderProduktverwendung

FüroptimaleLeistungverwendenSiebittedenHolotypeHLA24/7Kit-WorkflowunddieOmixonHLATwin-SoftwarefürdieHLA-TypisierungvonNGSmitdenimAbschnitt„GeräteundReagen-zien“empfohlenenMaterialien,ReagenzienundGeräten.DieVerwendungandereralsderinAbschnitt„GeräteundReagenzien“genanntenMaterialienmussvomAnwenderüberprüftundvalidiertwerden.DieReagenziendürfennichtinanderenalsdenindieserIFUbeschriebenenMengenneuzusam-mengestelltoderverdünntwerden.VerwendenSienichtwenigerVolumenderReagenzienalsindieserIFUangegeben.AnderenfallskönnenPerformance-FehlerdieFolgesein.OmixonkannkeineUnterstützungfürProblemebieten,diesichausderNichteinhaltungderindieserIFUbeschriebenenProtokollschritteergeben.VerwendenSiedasProduktnichtbeierkennbarenSchädenandenKomponenten(zerbrocheneFläschchenoderPlatten,loseKappenusw.).

BekannteProdukteinschränkungenInformationenzubekanntenUnklarheitenundSoftwarebeschränkungendesProduktsHolotypeHLAfindenSieimDokument„LeitfadenzubekanntenProdukteinschränkungen“.DerLeitfadenwirdzusammenmitder IFUgeliefert,kannaberauchaufderOmixon-WebsiteunterMyHolo-type/SupportandServices/HLATwin InstructionsforUsegefundenoderü[email protected].

SicherheitshinweiseLesen Sie die Abschnitte „Sicherheitshinweise“ und „Wichtige Hinweise“ der im Abschnitt„Geräte,ReagenzienundZubehör“aufgeführtenReagenzienoderKits,bevorSiebeginnen.Bei der Arbeit mit Chemikalien immer einen geeigneten Laborkittel, Einweghandschuhe undSchutzbrilletragen.WeitereInformationenfindenSieindenentsprechendenSicherheitsdaten-blättern(SDSs),diebeimangegebenenProduktlieferantenerhältlichsind.DieÜbersichtüberdiechemischenKomponentenderProduktreagenzienfindenSieindenSDSsdesHolotypeHLA96/11-Kits;sieistaufAnfrageerhältlich.ProduktkomponentenalsallgemeinenmedizinischenAbfallentsorgen.


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LeistungsparameterFestlegungderwichtigstenLeistungsparametergemäßderProduktvalidierung.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Empfindlichkeit 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Spezifität 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Präzision 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Genauigkeit 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reproduzierbarkeit 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Wiederholbarkeit 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

TechnischeUnterstützungAllgemeineHilfezudiesemProtokollerhaltenSiebeisupport@omixon.com.

TelefonischerSupport:VereinigteStaaten|+1(617)500-0790Europa|+36705748001ÜbrigeWelt|+1(617)500-0790


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Geräte,ReagenzienundZubehör

TechnischeundGeräteempfehlungen§ Thermocyclermit96-Well-Format§ Plattenfluorometer(oderjedesandereGerät,daszurFluoreszenzdetektionim96-Well-

Plattenformatgeeignetist,zurVerwendungmitdemPromegaQuantiFluordsDNA-System)

§ PippinPrep(Katalog-Nr.PIP0001)oderBluePippin(Katalog-Nr.BLU0001)vonSAGEScience

§ qPCR-Gerätim96oder384-Well-Plattenformat§ QubitFluorometer(Katalog-Nr.Q33216,ThermoFisherScientific)(optional)§ IlluminaMiSeq(Katalog-Nr.SY-410-1003)§ 64-Bit-Computermitmindestens4Kernenund16GBRAM§ Langzeit-Datenspeicherung(ca.2TBDatenproMiSeqproJahr)

EmpfehlungenzuzugehörigenReagenzien§ LongRangePCR-KitsvonQiagen(Katalog-Nr.206401,206402oder206403)

§ JedeProbeerfordert4,4µlTaqPolymerase§ Katalog-Nr.206401LongRangePCR-Kit(20),enthält8µlTaqPolymerase§ Katalog-Nr.206402LongRangePCR-Kit(100),enthält40µlTaqPolymerase§ Katalog-Nr.206403LongRangePCR-Kit(250),enthält100µlTaqPolymerase

§ ExoSAP-ITvonAffymetrix(Katalog-Nr.75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLoder75001-10ML)

§ JedegepoolteProbeerfordert4µldesEnzymsExoSAP-IT.§ Katalog-Nr.75001-200,enthält200µldesEnzymsExoSAP-ITExpress.§ Katalog-Nr.75001-1-ML,enthält1mldesEnzymsExoSAP-ITExpress§ Katalog-Nr.75001-4X-1ML,enthält4mldesEnzymsExoSAP-ITExpress§ Katalog-Nr.75001-10ML,enthält10mldesEnzymsExoSAP-ITExpress

§ Bibliothek-Quantifizierungskit–Illumina/UniversalvonKAPABiosystems(Katalog-Nr.KK4824)

§ QubitdsDNABRAssay-Kit(Katalog-Nr.Q32850oderQ32853)(optional)§ Katalog-Nr.Q32850enthält100Assays§ Katalog-Nr.Q32853enthält500Assays

§ QuantiFluordsDNA-SystemvonPromega(Katalog-Nr.E2670)§ AgencourtAMPureXPBeadsvonBeckmanCoulter(Katalog-Nr.A63880,A63881oder

A63882)§ FürjedenHolotypeHLA-Laufwerdenmaximal900µlAMpureXP-Beadsbenötigt.§ Katalog-Nr.A63880enthält5mlAMPureXP-Beads§ Katalog-Nr.A63881enthält60mlAMPureXP-Beads§ Katalog-Nr.A63882enthält450mlAMPureXP-Beads

§ Gelkassette,1,5%Agarose,farbstofffreimitinternemStandard(MarkerK/R2),fürPippinPrep/BluePippin(Katalog-Nr.CDF1510fürPippinPrepundBDF1510fürBluePippin)


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§ MolekularesEthanol(wasserfreierAlkohol)§ MolekularesWasser(DNase-undRNase-frei)§ Natriumhydroxid§ 1×TE-Puffer(pH8,0)§ MiSeq-ReagenzienkitvonIllumina

KapazitätdesMiSeqReagenzienkit

IlluminaMiSeq-Reagenzienkit

ZeitStunden

96/11Proben

ZyklusStd500(MS-102-2003)

ca.39 96


ca.24 72

ZyklusMicro300(MS-103-1002)

ca.19 20

ZyklusNano500(MS-103-1003)

ca.28 8


ca.17 4

EmpfohlenesZubehör§ 1,5mlMikrozentrifugenröhrchen§ 1,5mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchen§ 2,0mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchen(empfohlen:EppendorfDNALoBind,Katalog-

Nr.022431048)§ 0,5mldünnwandigeRöhrchenfürQubit-Instrumente(empfohlen:QubitAssay-Röhrchen

Katalog-Nr.Q32856)§ PipettenmiteinstellbaremVolumen(Kapazität1,0–1000µl)§ 8-KanalPipettenmiteinstellbaremVolumen(Kapazität1,0–100µl)§ 96-Well-Platten,kompatibelmitdemThermocycler§ Optische96-Well-Platten,kompatibelmitdemPlattenfluorometer§ 96-Well-Platten,kompatibelmitdemqPCR-Gerät§ PlattendichtungenfürdenallgemeinenGebrauch§ Plattendichtungen,kompatibelmitdenThermocyclern(aufLongRangePCRgetestet)§ Optikplattendichtungen,kompatibelmitdemqPCR-Gerät(optional)§ Magnetstativ,kompatibelmit2mlMikrozentrifugenröhrchen§ 96-Well-Kühlgestelle(2Stück)§ konischeRöhrchen50ml§ Behälter50ml


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RechtlicheHinweiseHolotype HLA 96/11 IFU und alle Inhalte sind Eigentum von Omixon Biocomputing Limited(„Omixon“)undsindausschließlichfürdievertraglicheVerwendungdurchdenKundeninBezugaufdas/diehierbeschriebene(n)Produkt(e)undkeinenanderenZweckbestimmt.DiesesDoku-mentundseinInhaltdürfenohnevorherigeschriftlicheGenehmigungvonOmixonnichtfüran-dereZweckeverwendetoderverteiltund/oderanderweitigkommuniziert,offengelegtoder inirgendeinerWeisevervielfältigtwerden.OmixonüberträgtdurchdiesesDokumentkeineLizenzunterseinenPatent-,Marken-,Urheber-oderCommonLaw-RechtenoderähnlichenRechtenDritter.

OmixonHLATwin(„Software“)wirddemKundenunterdenOmixonHLATwinEULA-Bedingungen(www.omixon.com/hla-twin-eula/)lizenziert.WennSiedendarinenthaltenenBedingungennichtzustimmen, lizenziertOmixondieSoftwarenichtanSie,undSiedürfendieSoftwarenichtver-wendenoderinstallieren.

DieAnweisungenindiesemDokumentmüssenstriktundexplizitvonqualifiziertemundgeschul-temPersonalbefolgtwerden,umdenordnungsgemäßenundsicherenGebrauchdes/derhierbe-schriebene(n)Produkts/Produktezugewährleisten.DergesamteInhaltdiesesDokumentsmussvollständiggelesenundverstandenwerden,bevoreinsolchesProdukt/solcheProdukteverwen-detwird/werden.

DIE NICHTBEACHTUNG ALLER HIERIN ENTHALTENEN ANWEISUNGEN KANN ZU SCHÄDEN ANDEM/DEN PRODUKT(EN), ZU VERLETZUNGEN VON PERSONEN, EINSCHLIESSLICH BENUTZERNODERANDERENPERSONEN,UNDSONSTIGENSACHSCHÄDENFÜHREN.

OMIXON ÜBERNIMMT KEINE HAFTUNG FÜR DIE UNSACHGEMÄSSE VERWENDUNG DER HIERBESCHRIEBENENPRODUKTE(EINSCHLIESSLICHTEILENDAVONODERSOFTWARE)ODERFÜRDIEVERWENDUNG DIESES(R) PRODUKTE(S) AUSSERHALB DES RAHMENS DER VON OMIXON IMZUSAMMENHANGMITDEMERWERBDIESES(R)PRODUKTE(S)DURCHDENKUNDENGEWÄHRTENAUSDRÜCKLICHENSCHRIFTLICHENLIZENZENODERGENEHMIGUNGEN.

FÜRDENGEBRAUCHINDERIN-VITRO-DIAGNOSTIK2017OmixonBiocomputingLtd.AlleRechtevorbehalten.

BestimmungsgemäßeVerwendungDieHolotypeHLA96/11–KonfigurationAundCEundKonfigurationBundCE (bezeichnetals„HolotypeHLA“)isteineKombinationausin-vitro-diagnostischenAssay-ReagenzienundDaten-analyse-Software(OmixonHLATwin™)undistfürdieIdentifizierungundDefinitionvonhumanenLeukozytenantigenenderKlassenIundII(HLA)bestimmt;siewirdbeiderHLA-TypisierungunterVerwendungder Illumina®MiSeqNextGenerationSequencing-Plattformverwendet.DieHolo-typeHLAliefertInformationenzurmenschlichenHistokompatibilitätvonHLA-LociderKlassenI(A,BundC)undII(DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4undDRB5)unterVerwendunghumangenomischerDNA.


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DieimHolotypeHLA-ProduktenthalteneSoftwareOmixonHLATwin™dientderInterpretationunddemAbgleichderaufdemIllumina®MiSeq-SystemgeneriertenSequenzierungsdaten,wasinnureinemDurchgangzueinerhochgenauenHLA-TypisierungaufAllelebenemit sehrgeringerAmbiguitätaufder2-Felder-Ebeneführt.

DasHolotypeHLA-ProduktistfürdieIn-vitro-DiagnostikdurchprofessionellesGesundheitsperso-nalwieLaborantenundÄrztebestimmt,dieindiagnostischenLaborsinderHLA-Typisierungaus-gebildet sind, die entweder EFI- oder ASHI-akkreditiert sind oder nach EFI- oder ASHI-Spezifikationenarbeitenkönnen.

WichtigerHinweisvordemStart

EmpfohlenegenomischeDNA-IsolierungHumangenomischeDNAmussmitgutgetesteten,kommerziellerhältlichenDNA-Präparationskitshergestelltwerden,umdieDurchgängigkeitderPräparationzugewährleisten.UnabhängigvomAnsatzisteinegenaueBestimmungderKonzentrationundReinheiterforderlich,umeinerobusteAssayleitungzuerzielen.

DieDNAmussfreivonVerunreinigungensein,diediespätereAmplifikation,Bibliothekspräparie-rungunddieSequenzierungsschrittebeeinflussenkönnen(z.B.Alkohol,Salze,Detergenzien,For-maldehydundHeparin).BlutdarfnichtinheparinisiertenRöhrchenundBlutprobenvonPatien-ten, die sich einer Heparintherapie unterziehen, entnommen werden, und es dürfen keinelipämischenoderhämolytischenProbenverwendetwerden.

Die präparierte genomischeDNA kann sofort verwendetwerden,wenn sie in nukleasefreiemWasserhergestelltoderübereinenlängerenZeitraumbei-20°Coderkältergelagertwird.WirempfehlendieVerwendungvonWasserfürdiegDNA-Präparation,dadieEDTAinTE-Pufferweit-reichendePCR-Reaktionenhemmenkann.WiederholtesAuftauenistzuvermeiden,umdieDe-gradationzureduzieren.

EineKonzentrationvon20-30ng/µlDNAwirddringendempfohlen,um100-150nggenomischeDNAproPCR-Amplifikationbereitzustellen.WirempfehlennachdrücklichdieVerwendungeinerfluoreszenzbasiertenQuantifizierungsmethodezurBestimmungdergDNA-Konzentration.

EinAbsorptionsverhältnisvon260nm/280nmund260nm/230nm-Wertenvon1,7–2wirddrin-gendempfohlen.

Für die Amplifikation von HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1undHLA-DQB1werden1,0-1,5µggDNAbenötigt.

PrinzipderMethodeSeitvielenJahrenarbeitetdieHLA-GemeinschaftaneinerMethode,diedenumfangreichenPoly-morphismusderHLA-GeneundihrerGenproduktegenauidentifiziert.DasAufkommenderPCR,kombiniertmitanderenTechnologien(Sanger-Sequenzierung,SSOP,SSP,Luminex),lieferteeine


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FormelzursignifikantenVerbesserungdesNachweisesvonHLA-Polymorphismen,allerdingsmiteinigenEinschränkungen,dieunsereFähigkeit,dieHLA-Geneumfassendzucharakterisieren,wei-terhinbeeinträchtigen.DieindenletztenJahrenentwickeltenTechnologien,inihrerGesamtheitNextGenerationSequencing(NGS)genannt,habenneueMöglichkeiteneröffnet,dieeinevoll-ständigeCharakterisierungderHLA-GeneaufhaploideWeiseermöglichen.DasNGShatzweiun-terschiedlicheMerkmale:1)klonaleSequenzierungvonDNA-Fragmentenund2)enormhoherDurchsatz.DasNGSbietetdieMöglichkeit,Polymorphismenzuphasieren,wodurchalleMehr-deutigkeiteneliminiertwerden,undbietetHLA-TypisierungaufderEbenevondreibisvierFeldernohnereflexiveTests,wodurcheinepotenzielleGesamtlösungfürdasHLA-Typisierungsproblemermöglichtwird. Das hier beschriebene Protokoll nutzt diese Technologie und kombiniert dieLangstrecken-PCR-AmplifikationvonHLA-GenenmitderSequenzierungaufderIlluminaMiSeq-Plattform.KonkretwerdendieHLA-GeneA,B,C,DPA1,DQA1undDQB1überihregesamteCo-dierlänge,einschließlichderElementederuntranslatierten5'-und3'-Endbereiche,amplifiziert,währendDRB1,DRB3undDRB4vonIntron1aufIntron4undDRB5undDPB1vonIntron1aufdenuntranslatierten3'-Endbereichamplifiziertwerden.DieAmpliconswerdendanndurcheineReihevonSchrittenverarbeitet,die:

1. die Amplicons auf eine für die Sequenzierung auf der Illumina-Plattform geeignete Größefragmentieren,

2. dieEndenderfragmentiertenAmpliconsabstumpfenundadenylieren

3. Adaptersequenzenanbinden,diewährenddesgesamtenProzessesaufdemMiSeqverwendetwerden,umdieDNAzuerfassen,zuamplifizierenundzusequenzieren.DieAdapterenthaltenaucheinenIndex,dereinekurze,fürjedenAdaptereindeutigeSequenzdarstellt,diedenUr-sprungderBibliothek(Probe/Locus)identifiziert.

NachdemZusammenführenderindiziertenBibliotheken,derGrößenauswahlundderQuantifi-zierungwirddieProbezurSequenzierungaufdenMiSeqgeladen.DergesamteProzessdauertabhängigvonderAuswahlderDurchflusszelleaufder Illumina-Plattform3-5Tage.DieZusam-menfassungderSchrittedesProtokollsistinderfolgendenAbbildungdargestellt:


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ZusammenfassungderSchritte

GDNA-PRÄPARIERUNGMASTERMIX-PRÄPARIERUNG

BEARBEITUNGSDAUER:2HGESAMTDAUER:2H

HLA-KLASSEIUND-KLASSEIIAMPLIFIKATION

BEARBEITUNGSDAUER:2H10,GESAMTDAUER:8H10

AMPLICON-QUANTIFIZIERUNGUND-

NORMALISIERUNG


BIBLIOTHEKS-PRÄPARIERUNG

BEARBEITUNGSDAUER:1H20,GESAMTDAUER:3H

AUSWAHLDERBIBLIOTHEKSGRÖSSE


BIBLIOTHEKS-QUANTIFIZIERUNG

BEARBEITUNGSDAUER:0H15,GESAMTDAUER:1H15

SEQUENZIERUNGEINILLUMINAMISEQ


ANALYSEVONHLASEQUENZIERUNGSDATEN



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Glossar/Definitionen§ Ampliconplatte–AlternativeBezeichnungfüreineAmplifikationsplatte§ Amplicon-Quantifizierungsplatte–96-Well-Platte,kompatibelmitdemPlattenfluorometer,

mitdemdieverdünntenAmpliconsquantitativbestimmtwerden§ Amplifikationsplatte–96-Well-PCR-PlattezurAmplifikationderHLA-Loci§ FinaleBibliothek–Bibliothek,diealleProbenbibliothekenenthält,die ineinemeinzigen

MiSeq-Laufsequenziertwerdenkönnen§ Reaktionsplatte–Platte,aufderdiesequentiellenReaktionendurchgeführtwerden,diedie

indiziertenAdapterfragmentieren,andenEndenreparierenundandieProbenbibliothekenbinden

§ Reagenzplatte–PlattezurAliquotierungderverschiedenenzurHerstellungderBibliothe-kenverwendenReagenzien

§ Probenbibliothek–EineBibliothek,diedurchKombination(Pooling)allerHLA-LocifüreinegegebeneProbeerstelltwurde

§ GepoolteAmplicon-Platte–Platte,dieeineProbenbibliothek(alleLocikombiniert)proKa-vitätenthält

§ Standards-Quantifizierungsplatte–mitdemPlattenfluorometerkompatible96-Well-Platte,inderDNA-StandardsfürdieAmplicon-Quantifizierungplatziertwerden


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Schritt1–PräparierungdesHLA-Amplifikations-MastermixDauer:ca.2StundenZieldiesesSchrittesistes,locusspezifischeMastermixevorzubereiten,umjedenHLA-Locusindi-viduellzuamplifizieren.DiedurchdiesesProtokollamplifiziertenLocisindHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1undHLA-DQB1.

Hinweis:DieindiesemSchritthergestelltenMastermixeenthaltenallefürdieAmplifikationbe-nötigtenReagenzienmitAusnahmederTaq-Polymerase.

ReagenzienlisteArtikel Lagerung Geliefertvon

HLA-APrimer-Mix -20°C OmixonHLA-BPrimer-Mix -20°C OmixonHLA-CPrimer-Mix -20°C OmixonHLA-DRB1/DRB3Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DRB4Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DRB5Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DPA1Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DPB1Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DQA1Primer-Mix -20°C OmixonHLA-DQB1Satz3Primer-Mix -20°C OmixonEnhancer1 -20°C OmixonEnhancer2 -20°C OmixonLongRangePCR-Puffer(10×) -20°C QiagendNTPs(je10mM) -20°C QiagenH2O,hochrein -20°C Qiagen

Protokoll1.1 –AllePrimer-Mixes,Enhancer1und2,diedNTPsunddenLong-RangePCR-Puffer(10×)aus

derLagerungnehmenundbeiRaumtemperaturauftauen.

1.2 –DenkombiniertenEnhancerpräparieren:132µlEnhancer2indasEnhancer1-Röhrchengeben.Enhancer1-Röhrchenals„kombiniertenEnhancer“umetikettieren.Denverbleiben-denEnhancer2fürdieVerwendunginderDRB4Long-RangePCR-Reaktionaufbewahren.

1.3 –FürjedenPrimer-MixgemäßdenfolgendenTabelleneinenMastermixpräparieren:


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Mastermix:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1undDQA1

Reagenz Volumen/Probe/Locus Volumen/96Proben/LocusPrimer-Mix 2µl 204µlLongRangePCR-Puffer(10×) 2,5µl 255µldNTP-Mix(je10mM) 1,25µl 127,5µlH2O,hochrein 13,85µl 1412,7µlGesamtvolumen 19,6µl 1999,2µl

Mastermix:HLA-DRB4

Reagenz Volumen/Probe/Locus Volumen/96Proben/LocusPrimer-Mix 2µl 204µlLongRangePCR-Puffer(10×) 2,5µl 255µldNTP-Mix(je10mM) 1,25µl 127,5µlEnhancer2 0,6µl 61,2µlH2O,hochrein 13,25µl 1351,5µlGesamtvolumen 19,6µl 1999,2µl

Mastermix:HLA-DQB1Satz3

Reagenz Volumen/Probe/Locus Volumen/96Proben/LocusPrimer-Mix 2µl 204µlLongRangePCR-Puffer(10×) 2,5µl 255µldNTP-Mix(je10mM) 1,25µl 127,5µlKombinierterEnhancer 5,6µl 571,2µlH2O,hochrein 7,85µl 800,7µlGesamtvolumen 19,2µl 1958,4µl

1.4 –JedenMastermixvortexenundfür1Sekundeherunterzentrifugieren.MastermixeaufEislegen.

1.5 –AllegDNAsaufeineKonzentrationvon30ng/µlverdünnen(Mindestvolumen55µl).

Hinweis:HolotypeHLAenthältgenügendReagenzienfür96ReaktionenplusZu-satzvolumenfürPipettierverlustundfehlgeschlageneAmplifikation.


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Schritt2–AmplifikationHLA-KlasseIundIIDauer:ca.8Stunden10MinutenDer Zweck von Schritt 2 ist die Amplifikation der HLA-Loci. HLA Klasse I- und Klasse II-AmplifikationenwurdenunterVerwendungvonzweiverschiedenenSätzenanPCR-Bedingungenoptimiert.NachAbschlussderPCR-ReaktionenwirddieAmplifikationdurchAgarosegel-Elektro-phoreseverifiziert(optional).

KurzerTipp–DieAgarosegel-Elektrophorese(Schritt2.5)wirdzwarempfohlen,istaberzumerfolgreichenAbschlussdesHolotypeHLA-Protokollsnichterforderlich.Bei der Quantifizierung von Amplicons (Schritt 3) gilt jede Konzentration über50ng/µlalserfolgreicheAmplifikation.DieAgarosegel-Elektrophoreseisteinwich-tiger Qualitätskontrollschritt und sollte ohne ausreichende Erfahrung mit demkomplettenHolotypeHLA-Protokollnichtübersprungenwerden.


HLA-AMastermix -20°C Schritt1HLA-BMastermix -20°C Schritt1HLA-CMastermix -20°C Schritt1HLA-DRB1/DRB3Mastermix -20°C Schritt1HLA-DRB4Mastermix -20°C Schritt1HLA-DRB5Mastermix -20°C Schritt1HLA-DPA1Mastermix -20°C Schritt1HLA-DPB1Mastermix -20°C Schritt1HLA-DQA1Mastermix -20°C Schritt1HLA-DQB1Satz3Mastermix -20°C Schritt1Taq-Polymerase -20°C QiagengDNA 4°C BenutzerH2O,hochrein 20°C Benutzer

Protokoll2.1 –DieTaq-PolymeraseausdemLagernehmen,herunterzentrifugierenundzujedemMas-

termixgemäßdenuntenstehendenTabellenzugeben;dazudiePipettenspitzengründlichdurchPipettierenausspülen:


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Taq Polymerase-beladener Mastermix: HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1,DPB1undDQA1

Reagenz Volumen/Probe/Locus Volumen/96Proben/LocusMastermixausSchritt1 19,6µl 1999,2µlTaq-Polymerase 0,4µl 40,8µlGesamt 20µl 2040µl

TaqPolymerase-beladenerMastermix:HLA-DQB1Satz3

Reagenz Volumen/Probe/Locus Volumen/96Proben/LocusMastermixausSchritt1 19,2µl 1958,4µlTaq-Polymerase 0,8µl 81,6µlGesamt 20µl 2040µl

2.2 –AllemitTaqPolymerasebeladenenMastermixekurzvortexenundherunterzentrifugie-ren.20µlvonjedemTaqPolymerase-beladenenMastermixinseparateKavitätenvon96-Well-PCR-Plattenaliquotieren.

Hinweis:DieKlasseI-undKlasseII-AmplifikationwurdenunterVerwendungvonzweiverschiedenenPCR-Bedingungenoptimiert,daherdürfenKlasseI-undKlasseII-MastermixenichtinderselbenPlatteliegen.

2.3 –5µljederverdünntengDNAindenentsprechendenKavitätenderimvorherigenSchrittpräpariertenPlattengeben.DurchPipettierenmischen.Miteiner thermischenVersiege-lungverschließenundjedeKavitätvisuellprüfen.AlleAmplifikationsplattenineinerZentri-fugeherunterzentrifugieren.

2.4 – Die Amplifikationsplatten in den Thermocycler einsetzen und die Programme für dieKlasseI-undKlasseII-AmplifikationgemäßdenfolgendenTabellenausführen:

KlasseI-Amplifikation(HLA-A,BundC)

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 95°C 3Minuten 95°C 15Sekunden35 65°C 30Sekunden 68°C 5Minuten1 68°C 10Minuten1 4°C ∞


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Klasse II-Amplifikation (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 undDQB1)

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 95°C 3Minuten 93°C 15Sekunden35 60°C 30Sekunden 68°C 9Minuten1 68°C 10Minuten1 4°C ∞

Hinweis:DerAmplifikationserfolgkannüberprüftwerden,indem2µlvonjedemAmpliconinein2%-Standard-Agarosegelbei250Vfür30Minutenlaufengelassenwird.(Optional)

ErwarteteAmplicongrößen

HLA-Locus ErwarteteAmplicongröße(kb)HLA-A,BundC ca.3HLA-DRB1/DRB3 ca.4,3

HLA-DRB4 ca.4,2HLA-DRB5 ca.4,2HLA-DPA1 ca.5,7HLA-DPB1 ca.6,7HLA-DQA1 ca.6

HLA-DQB(Satz3) ca.6,6

SichererHaltepunkt.AmpliconskönnenüberNachtbei4°Coderlängerbei-20°Cge-lagertwerden.


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Schritt3–Amplicon-Quantifizierungund-Normalisierung(miteinemPlattenfluorometer)Dauer:ca.2StundenDieAmplicon-Quantifizierungund-Normalisierungwirdempfohlen,umeinepräziseEingabeindieBibliothekspräparierungzugewährleisten(optional).DieAmpliconkonzentrationwirdmitdemQuantiFluordsDNA-Systemgemessen,daseinenfluoreszierenden,DNA-bindendenFarbstoffundeinenDNA-StandardfüreineempfindlicheQuantifizierungkleinerMengendoppelsträngigerDNA(dsDNA)enthält.AnweisungenzurDurchführungderAmplicon-QuantifizierungmiteinemqPCR-GerätbefindensichinAnhang2.

KurzerTipp–DieAmplicon-Quantifizierungwirdzwarempfohlen,istaberzumer-folgreichen Abschluss des Holotype HLA-Protokolls nicht erforderlich. DieAmplicon-NormalisierungerfordertkeinegenaueMessungderAmpliconkonzent-ration.StattdessenkanneineAbschätzungderAmpliconkonzentrationaufBasisvon Erfahrungswerten oder der Agarosegel-Elektrophorese verwendet werden.DieAmplicon-QuantifizierungsollteohneausreichendeErfahrungmitdemkom-plettenHolotypeHLA-Protokollnichtübersprungenwerden.


KlasseI-Amplifikationsplatte 4°C Schritt2KlasseII-Amplifikationsplatte 4°C Schritt2Lambda-DNA-Standard(100ng/µl) 4°C PromegaQuantiFluordsDNA-Farbstoff(200×) 4°C Promega20×TE-Puffer(pH7,5) 4°C PromegaH2O,hochrein 20°Cbis25°C BenutzerExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


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Protokoll3.1 – DNA-Standards durch Serienverdünnung des im QuantiFluor-Kit enthaltenen Lambda-

DNA-Standards(100ng/µl)gemäßuntenstehenderVerdünnungstabelleherstellen:

EtikettaufdemRöhrchen Eingangs-DNA VolumenDNA

(µl)Volumen1xTE

(µl)Abschlusskonz.

(ng/µl)Standard1 Lambda-DNA 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlStandard2 Standard1 250µl 250µl 0,75ng/µlStandard3 Standard2 250µl 250µl 0,38ng/µlStandard4 Standard3 250µl 250µl 0,19ng/µlStandard5 Standard4 250µl 250µl 0,09ng/µlStandard6 Standard5 250µl 250µl 0,05ng/µlLeer Leer 0µl 250µl 0ng/µl

3.2 –DieAmplicon-Quantifizierungsplattenpräparieren(sieheergänzendeAbbildungen).99µl1xTE-PufferindieKavitäteneineroptischen96-Well-PlattefürdieGesamtzahlderzuquan-tifizierendenAmpliconsaliquotieren.

3.3 –1µlAmpliconsausdenentsprechendenKavitätenindenAmpliconplattenzudeneinzel-nenKavitätenindenAmplicon-Quantifizierungsplattengeben.DurchPipettierenmischen.

3.4 – 1× QuantiFluor Farbstoff-Gebrauchslösung nach folgender Formel herstellen: 0,5 µlQuantiFluorFarbstoff(200X)+99,5µl1×TEPuffer.Ausreichend1×QuantiFluorFarbstoff-Arbeitslösungpräparieren,sodassjedeProbe(GesamtprobeinAmplicon-Platten)undderStandard(14insgesamt)einAliquotvon100µlerhält.

3.5 –EineStandard-QuantifizierungsplatteundAmplicon-Quantifizierungsplattenpräparieren.100µl1×QuantiFluorFarbstoff-ArbeitslösungindieKavitätender96-Well-Optikplatte,diezurStandard-Quantifizierungssplattewird,undindieAmplicon-QuantifizierungsplattenausSchritt3.2aliquotieren.

3.6 –UnterVerwendungderobenpräpariertenStandards100µlvonjedemStandarddoppeltzudeneinzelnenKavitäteninderStandard-Quantifizierungsplatte(insgesamt14Kavitäten)hinzufügen.DurchPipettierenmischen.

3.7 –ZumVermischengutvortexenundherunterzentrifugieren.

3.8 –DieStandard-QuantifizierungsplattedurchdasPlattenfluorometerlaufenlassen,gefolgtvondenAmplicon-Quantifizierungsplatten.

3.9 – Die Konzentration der DNA in den Amplicon-Quantifizierungsplatten anhand der vomPlattenfluorometererzeugtenRFU-Datenberechnen.HilfezudenBerechnungenfindenSieaufderRegisterkarteVerdünnungindermitgeliefertenArbeitsmappe.

3.10 –DNAindenAmplicon-PlattenmithochreinemH2Overdünnen,sodassdieEndkonzentra-tionderDNAetwa67ng/µlbeträgt.

§ BeieinerDNA-Konzentrationvon150ng/µloderhöher:25µlH2Ohinzufügen.


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§ BeieinerDNA-Konzentrationvon100-150ng/µl:10µlH2Ohinzufügen.§ BeieinerDNA-Konzentrationvon100ng/µloderniedriger:keinH2Ohinzufügen.

Amplicon-Pooling3.11 –AlleLocifürjedeProbeineinereinzigengepooltenAmpliconplattezusammenfassen.Die

fürjedenOrtangegebenenVoluminawieinderfolgendenTabelleangegebenkombinieren,umeinEndvolumenvon35µlzuerhalten:

HLA-Locus GepooltesVolumenA 3,5µlB 3,5µlC 3,5µl

DRB1/DRB3 3,5µlDRB4 3,5µlDRB5 3,5µlDPA1 3,5µlDPB1 3,5µlDQA1 3,5µl

DQB1Satz3 3,5µl

3.12 –4µlExoSAP-iTExpressinjedeProbenbibliothekgeben.PipettenspitzendurchPipettierenspülen.DiePlattemiteinerthermischenVersiegelungschließenundherunterzentrifugieren.

3.13 –DiegepoolteAmpliconplatteineinenThermocyclerunddasfolgendeProgrammausfüh-ren:

ExoSAP-ITExpressPCR-Aufreinigung

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 37°C 4Minuten1 80°C 1Minute1 4°C ∞

SichererHaltepunkt.AmpliconskönnenüberNachtbei4°Coderlängerbei-20°Cge-lagertwerden.


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Schritt4–Bibliothek-PräparierungDauer:ca.3StundenIndiesemSchrittwerdendiegepooltenAmpliconsfürdieSequenzierungaufdemIlluminaMiSeqpräpariert.DieAmpliconssindenzymatischfragmentiert,dieEndensindrepariertundadenyliert,undandenEndensindindexierteAdapterangebracht.AnschließendwerdendieBibliothekengepoolt,gefolgtvoneinemReinigungs-undKonzentrationsschrittmitAMPureXP-Beads.

Hinweis:OmixonempfiehltgrößereVoluminaalsfür96Probennotwendigwären,davielederEnzymeundPufferviskossind,waszueinemübermäßigenPipettier-verlustführt.


GepoolteAmpliconplatte 4°C Schritt3FragmentierungEnzym(A) -20°C OmixonFragmentierungspuffer(B) -20°C OmixonEndenreparaturEnzym(C) -20°C OmixonEndenreparaturPuffer(D) -20°C OmixonLigationsenzym(E) -20°C OmixonLigationspuffer(F) -20°C OmixonAdapterplatte -20°C OmixonAMPureXP-Beads 4°C BeckmanCoulter80%Ethanol(frischpräpariert) 20°Cbis25°C BenutzerH2O,hochrein 20°Cbis25°C Benutzer

Protokoll4.1 –DenThermocyclereinschalten.Prüfen,obsichderbeheizteDeckelerwärmt.

Hinweis:DasFragmentierungsenzym(A)vorGebrauchgründlichvortexen.

4.2 –Fragmentierungs-MastermixgemäßuntenstehenderTabellepräparieren:


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Fragmentierungs-Mastermix

Reagenz VolumenproBibliothek(µl)

EmpfohleneVoluminafür96Bibliotheken(µl) Farbcode

FragmentierungEnzym(A) 2µl 220,8µl GelbFragmentierungspuffer(B) 2µl 220,8µl RotGesamtvolumen 4µl 441,6µl

4.3 – Eine Reagenzplatte präparieren: Dazu eine neue 96-Well-PCR-Platte auf ein PCR-KühlgestelllegenunddiegleicheMengedesFragmentations-MastermixinjedeKavitätei-nereinzelnenReihegeben.

Hinweis:Die Fragmentierungsreaktionwurde so konzipiert, dassdieDNA fürdieSequenzierungaufdemIlluminaMiSeqinidealerGrößezurVerfügungsteht.BiszumBeginnderReaktion imThermocyclermüssendieReagenzienkaltgehaltenwerden,umeineübermäßigeFragmentierungzuvermeiden.DerEinsatzvonMehrkanalpipettenwirdempfohlen,umdieMöglichkeiteneinerübermäßigenFragmentierungzuminimieren.

4.4 –DiegepoolteAmpliconplatte10SekundenlangzentrifugierenundaufEisodereinenKühl-blocklegen.

4.5 – Eine Reaktionsplatte präparieren: eine frische 96-Well-PCR-Platte auf einen PCR-Kühlblocklegen.

4.6 –4µlFragmentierungs-MastermixvonderReagenzplatteindieKavitätenderReaktions-plattegeben,entsprechenddenProbenindergepooltenAmpliconplatte.DieVerwendungeinerMehrkanalpipettewirdempfohlen.

4.7 –16µljedesAmpliconsausdergepooltenAmpliconplattemiteinerMehrkanalpipetteindieentsprechendeKavitätaufderReaktionsplatteübertragen.DurchPipettierenmischen.

4.8 –DieReaktionsplattemiteinerthermischenDichtungschließenund10Sekundenzentrifu-gieren.

4.9 –DieReaktionsplatteineinemThermocyclermitfolgendemProgramminkubieren:

Fragmentierungsprogramm

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 37°C 10Minuten1 70°C 15Minuten1 4°C ∞

SichererHaltepunkt.BibliothekenkönnenüberNachtbei4°Coderlängerbei-20°Cgelagertwerden.

4.10 –DenEndenreparatur-MastermixgemäßderfolgendenTabellepräparieren:


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Endenreparatur-Mastermix

Reagenz VolumenproBibliothek(µl)

EmpfohleneVoluminafür96Bibliotheken(µl) Farbcode

H2O,hochrein 1,25µl 139,2µl EndenreparaturEnzym(C) 1,25µl 139,2µl GrünEndenreparaturPuffer(D) 2,5µl 278,4µl OrangeGesamtvolumen 5µl µl

4.11 –EinegleicheMengeEndenreparatur-MastermixineineeinzigeunbenutzteSpaltederRe-agenzplattealiquotieren.

4.12 –DieReaktionsplatte (mitden fragmentiertenProben)10Sekundenzentrifugieren.5µlEndreparatur-MastermixausderReagenzplatteinjedeKavitätderReaktionsplattegeben.DieVerwendungeinerMehrkanalpipettewirdempfohlen.DurchPipettierenmischen.


4.14 –DieReaktionsplatteineinemThermocyclermitfolgendemProgramminkubieren:

Endenreparaturprogramm



4.15 –DieindizierteAdapterplatteausdemLagernehmenundbeiRaumtemperaturauftauen,nachdem das Endenreparaturprogramm im Thermocycler gestartet wurde. Sobald dieAdapterplatteRaumtemperaturhat,diese3Minutenbei3000U/minzentrifugieren.

4.16 –DieDichtungvorsichtigvonderAdapterplatteabziehen.NachdemAbnehmenderDich-tungdieAdapterplattenichtschütteln,umKreuzkontaminationzuvermeiden.

4.17 –DasgesamteVolumenjederKavitätausderReaktionsplatte(25µl)indieentsprechendeKavitätinderAdapterplatteübertragen.


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Hinweis:WennNICHTdiegesamteAdapterplatteverwendetwird,istesmöglich,nurdieerforderlicheAnzahlvonAdapternzuverwenden.DiePlattendichtungzwi-schendenzuverwendendenunddenzubehaltendenKavitätenabschneiden.DieDichtungvorsichtigvonderAdapterplatteabziehenundüberdenzubehaltendenKavitätenliegenlassen.

a. 25µlvonjederendenrepariertenProbederReaktionsplatteineineKavitätinderAdapterplatteübertragenundmiteinerPipettegutvermischen.

b. DiegesamteProbevonderAdapterplatteindieOriginalkavitätderReaktions-platteübertragen.

c. DieAdapterplattewiederverschließenundauf -20 °Czurückstellen.FürdieweiterenSchritteimHandbuchdieReaktionsplatteanstellederAdapterplatteverwenden.

4.18 –DenLigations-Mastermixpräparieren.Für jedeProbeausreichendLigations-Mastermixpräparieren.

Ligations-Mastermix

Reagenz Volumen(µl) EmpfohleneVoluminafür96Bibliotheken(µl) Farbcode

Ligationsenzym(E) 2,5µl 252,5µl BlauLigationspuffer(F) 30µl 3030µl SchwarzGesamtvolumen 32,5 3282,5µl

4.19 –DenLigations-Mastermix in3unbenutztenSpaltenderReagenzplattealiquotieren.DieVerwendungeinerMehrkanalpipettewirdempfohlen.

4.20 –32,5µldesLigations-MastermixinjedeKavitätderReaktionsplattegeben.DieVerwen-dungeinerMehrkanalpipettewirdempfohlen.DurchPipettierenmischen.


4.22 –DieReaktionsplatteimThermocyclermitfolgendemProgramminkubieren:

Ligationsprogramm




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PoolingundBibliotheksaufreinigung4.23 –AMPureXP-BeadsaufRaumtemperaturerwärmenlassen.Sicherstellen,dassdiesehomo-

gensind(keineKlumpenoderPellets).5ml80%igesEthanol(4mLEtOH+1mLH2O)frischpräparieren.

4.24 –DieBibliothekerstellen;dazueinAliquotausjedemgepooltenAmplicon,jetzteinepro-benspezifische Bibliothek, in einem einzigen 2,0ml Low-Bind-Mikrozentrifugenröhrchenkombinieren.

I. 16odermehrProben–DieMengejederProbenbibliothekberechnen,diezueinereinzigenBibliothekmiteinemGesamtvolumenvon900µlgepooltwerdenkann.900µldurchdieAnzahlderProbenbibliothekenteilen.Dies istdasVolumendesAliquots,dasausjederProbenbibliothekentnommenundindieBibliothekpipettiertwird.

II. Wenigerals16Proben–60µljederProbenbibliothekineineBibliothekübertragen.

4.25 –900µlAMPureXP-Beads indasBibliotheksröhrchengeben.DurchVortexengründlichmischen und kurz zentrifugieren. Die Beads dürfen sich nicht separieren. Die Bibliothek10MinutenbeiRaumtemperaturinkubieren.

Hinweis:WennimEnd-Poolwenigerals900µlderBibliotheksind,eineentspre-chendeAnzahlvonAMPureXP-Beadshinzufügen.ZwischenEnd-PoolundAMPureXP-BeadsmussdasVerhältnis1:1bestehen.

4.26 –DasBibliotheksröhrchenineinenMagnetstativgebenund10Minuteninkubieren.

4.27 –MitdemRöhrchenimMagnetstativvorsichtig,ohnedieBeadszuberühren,denÜber-standausdemBibliotheksröhrchenentfernenundentsorgen.

4.28 –MitdemRöhrchenimMagnetstativca.1,5-2mlfrischpräpariertes80%igesEthanolindasBibliotheksröhrchengeben.DieMengedeszugesetztenEthanolsmusszumAbdeckenderBeadsausreichen.

Hinweis:DasEthanolindieSeitedesRöhrchensohneBeadseinbringen.

4.29 –DasBibliotheksröhrchen30SekundenbeiRaumtemperaturinkubieren,danachdenÜber-standvorsichtigentfernenundentsorgen.

4.30 –Schritte4.28und4.29wiederholen.

4.31 – Das Bibliotheksröhrchen schnell herunterzentrifugieren und mit geöffnetem DeckelzurückindasMagnetstativgeben.VerbleibendesEthanolmiteinerPipetteentfernen.DieBeadsnichtberühren.


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Hinweis:Sicherstellen,dasssichimBeads-PelletkeinRestethanolbefindet.Dazukanneserforderlichsein,dasRöhrchenaufdemMagnetstativzudrehen,umEtha-nolohneStörungdesBeads-Pelletzuentfernen.

4.32 –DieBeads5-8MinutenaufdemMagnetstativanderLufttrocknenlassen,bisdasBeads-Pellettrockenist.

4.33 –DasBibliotheksröhrchenvomMagnetstativnehmenunddieBibliothekmit31µlhochrei-nemWassereluieren.NichtmitderPipettenspitzedieBeadsberühren,dasiedaranhaftenbleiben.

4.34 –DieBibliothekvortexen,umdieBeadsvollständigzuresuspendieren.WenneinigeTröpf-chenandenSeitenwändenzurückbleiben,kurzzentrifugieren.Sicherstellen,dassdieBeadsinderSchwebebleiben.

4.35 –BibliothekbeiRaumtemperatur2Minuteninkubieren.

4.36 –DasBibliotheksröhrchen2MinutenindasMagnetstativgeben.

4.37 –Bibliothekabnehmen:MitdemEnd-BibliotheksröhrchenimMagnetstativ31µldesÜber-standesineinneues1,5mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchenabnehmen.

SichererHaltepunkt.BibliothekenkönnenübereinenlängerenZeitraumbei-20°Cge-lagertwerden.


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Schritt5–AuswahlderBibliotheksgrößeDauer:ca.1StundeInSchritt5wirddieBibliothekausSchritt4übernommenunddieGrößenauswahlmitHilfevonPippin-Prep durchgeführt. Das Pippin Prep kann automatisch eine Reihe von DNA-FragmentgrößenauswählenundineineSammelkammereluieren.Hinweis:AnstellevonPippinPrepkannBluePippinverwendetwerden.DieGebrauchsanweisungfürPippinPrepbefindetsichinAnhang1.


1,5%AgaroseGel-Kassette,farbstofffrei 20°Cbis25°C SageSciencePippin-Stammlösung/Markermix(beschriftetmitK) 4°C SageScienceGepoolteBibliothek 4°C Schritt4

Hinweis:MarkerKwirdmitPippinPrepverwendet.BluePippinverwendetdenMarkerR2.

Protokoll5.1 –DieMarkerK-StammlösungaufRaumtemperaturbringen.

5.2 –31µldesPoolszu10µlderMarkerK-Stammlösunggeben.

5.3 –DurchVortexenmischenundherunterzentrifugieren.

5.4 –PippinPrepzurSammlungvonDNA-Fragmentenzwischen650und1300bpskonfigurieren.Die40µl-ProbeindenProbenportgebenundstarten.DieLaufzeitbeträgt45-50Minuten.

5.5 –DengesamtenInhalt(ca.40µl)ausdemElutionsportdesPippinPrepentnehmenundineinneues1,5mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchengeben.DiesistdiegrößenselektierteBibliothek.

SichererHaltepunkt.BibliothekenkönnenübereinenlängerenZeitraumbei-20°Cge-lagertwerden.


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Schritt6–BibliotheksquantifizierungmitqPCR-GerätDauer:ca.1Stunde15MinutenDiegrößenselektierteBibliothekmussquantifiziertwerden,umdieErgebnissedesIlluminaMiSeqSequencersoptimalnutzenzukönnen.DieKonzentrationdergrößenselektiertenBibliothekkannmitqPCRgenaugemessenwerden.OptionalkönnenderQubitdsDNABR-KitundeineQubit-MaschinezurMessungderBibliotheks-konzentrationverwendetwerden.DiesesProtokollfindenSieinAnhang3.


10×IlluminaPrimerPremix -20°C KAPABiosystems2×KAPASYBRFASTqPCRMastermix -20°C KAPABiosystemsStd1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsStd3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsStd4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsIlluminaDNA-Standards -20°C KAPABiosystemsH2O,hochrein 20°Cbis25°C Benutzer1×TE-Puffer(pH8,0) 20°Cbis25°C BenutzerGrößenselektierteBibliothek 4°C Schritt5

Protokoll1 –DenqPCRPrimer-Mixpräparieren,dazuden10×IlluminaPrimerPremixundden2×KAPA

SYBRFASTqPCRMastermixverwenden:

Hinweis: Die KAPA SYBR FAST qPCR Kit Reagenzien (qPCR Mastermix, Primer-PremixundROX-Lösungen)werdenbeimerstenEinsatzdesKitskombiniert.Diesekombinierte Lösung ist mindestens 30 Frost-Tau-Zyklen stabil. Der KAPA-Dokumentation folgen,um festzustellen,obROX für IhrqPCR-Gerätempfohlenwird.

qPCRPrimer-Mix

Reagenz Volumen(ml)10×IlluminaPrimerPremix 1ml2×KAPASYBRFASTqPCRMastermix 5mlGesamtvolumen 6ml

2 –qPCRMastermixpräparieren.


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qPCRMastermix

Reagenz Volumen(µl)qPCRPrimer-Mix 228µlH2O,hochrein 76µlGesamtvolumen 304µl

3 –EineSerienverdünnungdergrößenselektiertenBibliothekpräparieren.

a. EineVerdünnung1:1000präparieren;dazu1µldergrößenselektiertenBibliothekin999µldes1×TE-Puffers(pH8,0)gebenunddiePipettenspitzegründlichausspülen.Vortexenundherunterzentrifugieren.

b. EineVerdünnung1:2000präparieren;dazu100µlderVerdünnung1:1000in100µl1×TE-Puffer(pH8,0)geben.Vortexenundherunterzentrifugieren.

4 –EineqPCR-Quantifizierungsplatteineinerfrischen,mitIhremqPCR-SystemkompatiblenPCR-Plattepräparieren.

5 –16µldesqPCRMastermixfürdieStandards1-4,dieVerdünnung1:1000unddieVerdün-nung1:2000(sieheergänzendeAbbildungen)dreifachaliquotieren.

6 –4µlderStandards1-4,dieVerdünnung1:1000unddieVerdünnung1:2000indieentspre-chendenWellsaliquotieren.

7 –DieqPCR-Quantifizierungsplatteversiegelnund10Sekundenzentrifugieren.

Hinweis:BlasenbildungindenKavitätenderqPCR-Quantifizierungsplattenvermei-den.BeiBedarfzentrifugieren,umBlasenzuentfernen.

8 Die1:1000-und1:2000-TriplikatealsZielprobeneinstellenunddieStandardsdefinieren(Punkte:4,Anfangskonzentration:20pM,Verdünnung:1:10).DasfolgendeProgrammaufderqPCR-Maschineausführen,umdieDNA-KonzentrationdergrößenselektiertenBiblio-thekzubestimmen:

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 95°C 5Minuten25

(keineSchmelzkurve)95°C 30Sekunden60°C 90Sekunden(Datenerfassung)

9 – Um das qPCR-Ergebnis von pM in nM-Konzentrationen umzurechnen, die „Quantitymean“ (mittlereMenge)-Ergebnisse der beiden Bibliotheksreplikate in die Registerkarte„LibraryQuantitation“(Bibliotheksquantifizierung)derOmixon-Arbeitsmappeeingeben.

10 –UnterVerwendungderVoluminaausderArbeitsmappe10µldergrößenselektiertenBib-liothekineinemfrischen1,5mlLow-Bind-MikrozentrifugenröhrchenmitsterilemH2OaufeineKonzentrationvon2nMverdünnen.DieverbleibendegrößenselektierteBibliothekbei-20°Clagern.


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SichererHaltepunkt.BibliothekenkönnenübereinenlängerenZeitraumbei-20°Cge-lagertwerden.ImFalleeinerLangzeitlagerungwirdeineerneuteQuantifizierungderBibliothekdringendempfohlen,bevordieseaufderMiSeqverarbeitetwird.


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Schritt7–SequenzierungaufIlluminaMiSeqDauer:ca.24-40StundenDasIlluminaMiSeqisteinautomatisiertesNGS-Gerät,dasdieindenvorherigenSchrittenpräpa-riertegrößenselektierteBibliotheksequenzierenkann.DieEntmultiplexierungderindiziertenPro-benerfolgtautomatischnachAbschlussdesSequenzierungslaufs.

KurzerTipp–Ein1%PhiXSpike-InkannalszusätzlicheKontrollezurÜberwachungderSequenzierungsreaktionverwendetwerden.WeitereInformationenfindenSieinderIllumina-DokumentationzurPhiX-Steuerung.


Reagenzbehälter -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaMiSeq-Durchflusszelle 4°C IlluminaBibliothekbei2nM 4°C Schritt6NaOH1Noder2N 20°Cbis25°C BenutzerH2O,hochrein 20°Cbis25°C Benutzer

KapazitätdesMiSeqReagenzienkit

IlluminaMiSeq-Reagenzienkit

ZeitStunden

96/7Proben


ca.39 96


ca.24 96

ZyklusMicro300(MS-103-1002)

ca.19 28


ca.28 12


ca.17 6

Protokoll7.1 –DenMiSeqgemäßdenStandardprotokollenvonIlluminapräparieren.


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7.2 –Eine1nMdenaturierteBibliothekpräparieren:10µlderfrischpräparierten0,2NNaOHund10µlder2nMverdünntengrößenselektiertenBibliothekineinemneuen1,5mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchenzusammenbringen.Vortexenundherunterzentrifugieren.Diese1nMdenaturierteBibliothekbeiRaumtemperatur5Minuteninkubieren.

7.3 –Eine20pMdenaturierteBibliothekpräparieren:980µlgekühltesHT1zuden20µlder1nMdenaturiertenBibliothekgeben.Vortexenundherunterzentrifugieren.

7.4 –Eine9pMdenaturierteBibliothekpräparieren:550µldergekühltenHT1und450µlder20pMdenaturiertenBibliothekineinfrisches1,5mlLow-Bind-Mikrozentrifugenröhrchengeben.Vortexenundherunterzentrifugieren.

7.5 – 600 µl der 9 pM denaturierten Bibliothek in das Probenladungsreservoir desMiSeq-Reagenzbehältersübertragen.

KurzerTipp–Eswirdempfohlen,diemitgelieferteArbeitsmappezuverwenden,umdasvomMiseqbenötigteProbenblattzuerstellen.


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Schritt8–AnalysederHLA-SequenzierungsdatenDieIlluminaMiSeqverarbeitetdie9pMgepoolteBibliothekunderzeugtSequenzierungsdateninFormvonFastq-Dateien.InformationenzurkorrektenInstallationdesHLATwinundzurInterpre-tationderGenotypisierungsanalyse Ihrer Sequenzierungsdaten entnehmen Sie bitte demHLATwin-Handbuch.FürdieImplementierungdesautomatisiertenProtokollsundbeiFragenzurIn-stallationoderAnalysevonDatenwendenSiesichbitteansupport@omixon.com.

AutomatisiertesProtokoll

IT-Einrichtungund-Konfiguration1. HLATwinServeraufdemServerinstallieren.

§ HLATwinClientaufeinemClient-Computerinstallieren–mehrereHLATwinClientskönnensichmitdemSerververbinden.

§ Benutzerdefinierte Installationsanweisungen für die Automatisierung erhalten Sie beimOmixon-Support([email protected]).

ProtokollproAnalyse1. HLATwinClientstartenundAnmeldungdurchführen.

2. DieDatensindbereitsverarbeitetoderwerdengeradeverarbeitet.DieErgebnissemitdemAmpelsysteminHLATwinüberprüfen.

3. DieGenotypisierungsergebnisseund/oderKonsenssequenzennachBedarfexportieren.

ManuellesServer-Protokoll

IT-Einrichtungund-Konfiguration§ HLATwinServeraufdemServerinstallieren.§ DenHLATwinClientaufeinemClient-Computerinstallieren.

ProtokollproAnalyse§ HLATwinClientstartenundAnmeldungdurchführen.§ Die MiSeq-Daten im Format fastq oder fastq.gz wählen und den Holotype HLA-

Typisierungslaufstarten.§ AnAbschlussderHolotypeHLA-TypisierungdieErgebnissemitdemAmpelsysteminHLA

Twinüberprüfen.§ DieGenotypisierungsergebnisseund/oderKonsenssequenzennachBedarfexportieren.


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ManuellesDesktop-Protokoll

IT-Einrichtungund-Konfiguration§ HLATwinDesktopinstallieren.

ProtokollproAnalyse6 HLATwinstartenundAnmeldungdurchführen.

7 Die MiSeq-Daten im Format fastq oder fastq.gz wählen und den Holotype HLA-Typisierungslaufstarten.

8 AnAbschlussderHolotypeHLA-TypisierungdieErgebnissemitdemAmpelsysteminHLATwinüberprüfen.

9 DieGenotypisierungsergebnisseund/oderKonsenssequenzennachBedarfexportieren.


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ErgänzendeAbbildungen

Plattenbeispiel für Ampliconplatte, Amplifikationsplatte,Verdünnungsplatte, Amplicon-Quantifizierungsplatte (für eineneinzelnenLocus)undReaktionsplatte

BeispielfürStandard-Quantifizierungsplatte


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BeispielfürKAPABibliotheksquantifizierungs-qPCR-Platte


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Anhang1:PippinPrep

ProgrammierungvonPippinPrep1. AufdieRegisterkarteProtokoll-EditorunddannaufdieSchaltfläche„Neu“klicken.

2. AufdasOrdnersymbolnebendemFeldCassetteklickenund„1.5%DFMarkerK“fürPippinPrepoder„1.5%DFMarkerR2“fürBluePippinwählen.

3. FürdieprogrammierteLanefolgendesdurchführen:

a. DasFeld„Bereich“markieren.b. Die„RefLane“aufdieLane-Nummereinstellen,indergearbeitetwird.c. DasFeld„Start*“auf650setzen.d. DasFeld„Ende*“auf1300setzen.

4. ImFeldReferenz-LanedieLanewählen,indergearbeitetwird.

5. AufdieSchaltfläche„Speichernunter“klickenunddasProgrammbenennen.

PippinPrepausführen1. PippinPrepeinschalten;dazudenNetzschalteraufderRückseitedesGerätesdrücken.

2. SichtkontrollederPippinPrepdurchführen.Sicherstellen,dassdie5LEDsleuchtenunddasInneredesGerätessauberundtrockenist.

3. AufdasSageScience-LogountenrechtsaufdemBildschirmklicken.JetztkanneinPassworteingegebenwerden.DaswerkseitigvoreingestelltePasswortist„pips“.

4. AufdieRegisterkarte„FactorySetup“(Werkseinstellung)klickenundsicherstellen,dassderWert„Base-to-Threshold“auf0,02eingestelltist.

5. DieKalibriervorrichtungindasPippinPreppositionierenunddaraufachten,dassderdunkleStreifenmitderVorderseitenachuntenundüberdenLED-Leuchtenliegt.

6. AufderRegisterkarte„Main“aufdieSchaltfläche„Calibration“(Kalibrierung)klicken.

7. ImKalibrierfenster sicherstellen,dassdas Feld „Target I pHmA“auf0,80 (0,60 fürBluePippin)eingestelltist;anschließendaufdieSchaltfläche„Calibrate“(Kalibrieren)klicken.

8. ZurRegisterkarte „Protocols“ (Protokolle)wechseln.Aufdie Schaltfläche „Load“ (Laden)klicken und das Programm fürHolotypeHLA und die zu verwendende Lane auswählen.Folgendessicherstellen:

a. DierichtigeLaneisteingeschaltetb. Breitband-Auswahlanzeigeisteingeschaltetc. DieReferenz-LaneistdiegleicheLane,dieverwendetwird.

9. ZurRegisterkarte„Main“wechseln.Folgendessicherstellen:

a. DasgeladeneProgrammistdasjenige,dasausgewähltwurde.


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b. DieentsprechendeReferenz-LaneistausgewähltundgleichzeitigdieLane,inderdieProbeverarbeitetwird.

10. DieKassetteüberprüfen.VordemAbnehmendesdieKavitätenabdichtendenKlebebandsprüfen,obsichhinterdemElutionsportBlasenbefinden.WennsichhinterdemElutionsportBlasenbefinden,leichtaufdieKassetteklopfenundvorsichtiginderHandrollen,damitdieBlasensichlösen.

11. DieKassettemitdemKlebebandüberdenKavitätenindasPippinPrepeinlegen.

12. DasBandvorsichtigabziehen;esmussvondersauberenSeitederKassette (Lane5)zurbenutztenSeitederKassette(Lane1)abgezogenwerden.Daraufachten,dassbeimEntfer-nendesBandeskeineFlüssigkeitverspritztwird,umKontaminationzuvermeiden.

13. DasgesamtePuffervolumenausdemElutionsportderverwendetenLaneentfernenund40µlfrischenElektrophoresepufferindiesenElutionsportgeben.

14. EinendünnenStreifenKlebebandüberdieElutionsportsgeben.

15. Alle zuweniger als 3/4 gefüllten Reservoirsmüssenmit Elektrophoresepuffer aufgefülltwerden.DieKavitätennichtüberfüllen!DerRanddesPuffersdarf„geradeeben“dieKunst-stoffkanteerreichen,umeinZiehenbeimVerschiebendesDeckelszuverhindern.PufferausdensauberenKavitäten(Lane5)aufdiebenutztenKavitäten(Lane1)geben.

16. Sicherstellen,dassjedederLade-Kavitäten(KavitätenmitAgarose)mitElektrophoresepuf-fergefülltist.DerPuffermuss„geradeeben“überderAgaroseliegenundvölligflachaus-sehen.

17. DasPippinPreplangsamschließenunddaraufachten,dassbeimSchließendesGerätskeinPufferdenDeckelberührt.

18. DenDurchgangstestdurchführen.WenndieSensorenleichtausgetrocknetsind,schlägtderDurchgangstestnormalerweiseeinmalfehl.WennderDurchgangstestfehlschlägt,denTestnocheinmaldurchführen.SobaldderDurchgangstestabgeschlossenist,dasPippinlangsamöffnen.Sicherstellen,dasskeineFlüssigkeitvomDeckeldesPippinPrepüberdieKassettegezogenwird.

19. DieMarkerK-Stammlösung kurz vortexenundherunterzentrifugieren. 10µl derMarkerK-Stammlösungzudenca.30µlderBibliothekhinzugeben.

20. DieBibliothekkurzvortexenundherunterzentrifugieren.

21. 40µldesPuffersausderProbenkavität,dieverwendetwerdensoll,wegnehmen.

22. Ca.40µldermitMarkerKgeladenenBibliothekindiezuverwendendeProbenkavitäthin-zufügen.

23. DiezuverwendendeLanemitdenInitialendesTechnikersunddemDatumbeschriften.

24. DasPippinPrepschließenundaufdieSchaltfläche„Start“klicken.Sicherstellen,dassdieent-sprechendeLaneeingeschaltetist.DieBearbeitungszeitfürdieProbebeträgtca.45Minuten.


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25. NachEndederVerarbeitungdasPippin-Prepvorsichtigöffnen.Genaubeobachten,obderDeckelFlüssigkeitüberdieKassettezieht.

26. DasKlebebandüberdenElutionsportsentfernenunddaraufachten,keineFlüssigkeitzuverschütten.

27. DasgesamteVolumenausdemElutionsportineinneues1,5mlLow-Bind-Röhrchengeben.

28. AlleoffenenKavitätenmitzweiStückPlattendichtbandabdecken.Nichtvergessen,aufdersauberenSeiteeineGrifflaschezubelassen.Diesmachteseinfacher,dasBandvondersau-berenzurgebrauchtenSeiteabzuziehen.

29. DieversiegelteKassetteindenBeutelundbeiseitelegen.

30. DieWaschkassettemitMiliQ-Wasserfüllen.DenDeckeldesPippinPrepvorsichtigschlie-ßen,dabeidaraufachten,obFlüssigkeitüberdieWaschkassettegezogenwird.

32. DasPippin-PrepeinigeSekundengeschlossenhalten.

33. DasPippinPrepöffnen,dabeidaraufachten,obFlüssigkeitüberdieWaschkassettegezogenwird.

34. DieWaschkassetteherausnehmen,entleerenundtrocknenlassen.

35. DasPippinPrepvonWasserreinigenundvorsichtigschließen.

36. ImPippinPrep-MenüdieSchaltfläche„ShutDown“(Herunterfahren)klicken.


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Anhang2:Amplicon-QuantifizierungmiteinemqPCR-GerätDauer:2Stunden


20×TE-Puffer(pH7,5) 4°C PromegaLambda-DNA-Standard(100ng/µl) 4°C Promega200×QuantiFluordsDNA-Farbstoff 4°C PromegaSterilesH2O 20°Cbis25°C BenutzerAmplifikationsplatte(n)derKlasseI 4°C Schritt2Amplifikationsplatte(n)derKlasseII 4°C Schritt2

Protokoll2. EineSerienverdünnungmit1,5mlMikrozentrifugenröhrchenunddemQuantiFluorLambda

DNA-Standard(100ng/µl)herstellen.FolgendeVerdünnungstabelleverwenden:

EtikettaufdemRöhrchen Eingangs-DNA VolumenDNA

(µl)Volumen1xTE

(µl)Abschlusskonz.

(ng/µl)Standard1 Lambda-DNA 7,5µl 492,5µl 1,5ng/µlStandard2 Standard1 250µl 250µl 0,75ng/µlStandard3 Standard2 250µl 250µl 0,38ng/µlStandard4 Standard3 250µl 250µl 0,19ng/µlStandard5 Standard4 250µl 250µl 0,09ng/µlStandard6 Standard5 250µl 250µl 0,05ng/µlStandard7,leer Leer 0µl 250µl 0ng/µl

3. DieAmplicon-Quantifizierungsplattenpräparieren(sieheergänzendeAbbildungen).49,5µl1xTE-PufferindieKavitäteneinersauberen96-Well-PlattefürdieGesamtzahlderzuquan-tifizierendenAmpliconsaliquotieren.

4. 0,5µlAmpliconsausdenentsprechendenKavitätenindenAmpliconplattenzudeneinzel-nenKavitätenindenAmplicon-Quantifizierungsplattengeben.DurchPipettierenmischen.

5. 1× QuantiFluor Farbstoff-Gebrauchslösung nach folgender Formel herstellen: 0,25 µlQuantiFluorFarbstoff(200X)+49,75µl1×TEPuffer.Ausreichend1×QuantiFluorFarbstoff-Arbeitslösungpräparieren,sodassjedeProbe(GesamtprobeinAmplicon-Platten)undderStandard(14insgesamt)einAliquotvon50µlerhält.


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6. Eine Standard-Quantifizierungsplatte und Amplicon-Quantifizierungsplatten präparieren.50 µl 1× QuantiFluor Farbstoff-Arbeitslösung in die Kavitäten der 96-Well-Optikplattealiquotieren, dazu das Format der Standard-Quantifizierungssplatte und der Amplicon-Quantifizierungsplattenverwenden(sieheErgänzendeAbbildungen).

7. UnterVerwendungderobenpräpariertenStandards50µlvonjedemStandarddoppeltzudeneinzelnenKavitäten inderStandard-Quantifizierungsplatte (insgesamt14Kavitäten)hinzufügen.

8. ZumgründlichenVermischenvortexenundherunterzentrifugieren.

9. JedeQuantifizierungsplatteeinzelnindieqPCR-MaschineeinlegenunddasfolgendePro-grammausführen:

AnzahlderZyklen Temperatur Zeit1 25°C 10Sekunden 25°C 15Sekunden2 25°C 30Sekunden(Datenerfassung)

10. DieKonzentrationderDNAindenAmplicon-QuantifizierungsplattenanhanddervomqPCR-GeräterzeugtenrohenRFU-Datenberechnen.

11. DNAindenAmplicon-PlattenmitsterilemH2Overdünnen,sodassdieEndkonzentrationderDNAetwa67ng/µlbeträgt.

§ BeieinerDNA-Konzentrationvon150ng/µloderhöher:25µlH2Ohinzufügen.§ BeieinerDNA-Konzentrationvon100-150ng/µl:10µlH2Ohinzufügen.§ BeieinerDNA-Konzentrationvon100ng/µloderniedriger:0µlH2Ohinzufügen.


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Anhang3:BibliotheksquantifizierungmitinterkalierendemdsDNA-FluoreszenzfarbstoffDauer:ca.15MinutenDieKonzentrationdergrößenselektiertenBibliothekkannmiteineminterkalierendendsDNA-Flu-oreszenzfarbstoff,wiez.B.SYBRgreenodergleichwertig,genaugemessenwerden.Handelsübli-cheKitsund Instrumente fürdiesenZwecksindunteranderemderQubitReadervonThermoFisher(verwendetdenQubitBroad-RangedsDNAAssayKit),derQuantusReadervonPromega(verwendetdendsDNA-FluoreszenzfarbstoffQuantifluor)undandere.HierwirddieQubit-Me-thodebeschrieben,dasiedasamhäufigstenverwendeteInstrumentist.FallseinanderesGerätundeinandererKitverwendetwerden,bittedieStandardanweisungendesHerstellersbefolgen.

Hinweis: Diese dsDNA-fluorometrischeMethode ist eine schnelle, aber genaueMethodezurBestimmungderKonzentrationderendgültigengrößenselektiertenBibliothek.SiemisstalleinderBibliothekvorhandenendsDNAs.


QubitdsDNABRAssayKit Raumtemperatur ThermoFisherQubitdsDNABRStandards 4°C ThermoFisherGrößenselektierteBibliothek 4°C Schritt5

Protokoll6.1 –DieQubit-StandardsaufRaumtemperaturbringen.Qubit-Assay-Röhrchen(500µl,dünn-

wandig)fürdieBibliothekindoppelterAusführungunddiebeidenStandardspräparieren.DieStandardsunddieBibliothekvortexenundzentrifugieren.

6.2 –995µlPufferund5µlFarbstoffinein1,5mlZentrifugenröhrchengeben.Vortexenundherunterzentrifugieren.

6.3 –190µlausderReagenzienmischungindieQubit-RöhrchenfürdiebeidenStandardsüber-tragen.198µlausdemReagenzienmischungindiebeidenQubit-RöhrchenfürdieDuplikatederBibliothekübertragen.

6.4 –10µlvonStandard1indasentsprechendeQubit-Röhrchengebenund2Sekundenvorte-xen.DiesmitStandard2wiederholen.

6.5 –2µlausderBibliothekzudenbeidenentsprechendenQubit-Röhrchenhinzugebenund2Sekundenvortexen.

6.6 –DieQubit-Röhrchen2MinutenbeiRaumtemperaturinkubieren.

6.7 –Qubit-MaschineeinschaltenundBR-Protokollwählen.


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6.8 –Qubit-RöhrchenmitStandard1einsetzenundGOdrücken.DiesmitStandard2wieder-holen.

6.9 –DasBibliotheksröhrcheninQubiteinsetzenundGOdrücken.FürdieReplikationwieder-holen.

6.10 – Um das Qubit-Ergebnis von ng/µl in nM-Konzentrationen umzurechnen, die mittlereKonzentrationderbeidenBibliotheksreplikate indieRegisterkarte„LibraryQuantitation“(Bibliotheksquantifizierung)derOmixon-Arbeitsmappeeingeben.

6.11 –UnterVerwendungderErgebnisseausderQubit-Messung10µldergrößenselektiertenBibliothekineinemfrischen1,5mlLow-Bind-MikrozentrifugenröhrchenmitsterilemH2OaufeineKonzentrationvon2nMverdünnen.DieverbleibendegrößenselektierteBibliothekbei-20°Clagern.

SichererHaltepunkt.BibliothekenkönnenübereinenlängerenZeitraumbei-20°Cgelagertwerden. ImFalleeiner LangzeitlagerungwirdeineerneuteQuantifizie-rungderBibliothekdringendempfohlen,bevordieseaufderMiSeqverarbeitetwird.

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