Hemmstoffnachweise erstellt von Dr. Gudrun Nagl

Hemmstoffnachweis mittels Brillantschwarz Reduktionstest

Brillantschwarz-Reduktionstest (BR-Test) Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §64 LFBG L01.01-42-52(EG) Kap. 3

Nach dem neuen Lebensmittelsicherheits- und Verbraucherschutzgesetz 2006 gilt der BR Test als anerkannter Hemmstofftest. Den BR Test gibt es in 2 verschiedenen Ausführungen:Der BR Test ist nur für den Nachweis von Antibiotika geeignet und der BR AS Test erfasst in einem Arbeitsgang Antibiotika und Sulfonamide.

Prinzip:Die Kavitäten (kleine Röhrchen) einer Mikrotiterplatte sind mit einem Nährmedium gefüllt, welches Brillantschwarz als Redox-Indikator enthält. Im Nährboden ist auch der Testkeim Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis C953 enthalten. Der Hemmstoff der Probe diffundiert in den Agar und inhibiert den Stoffwechsel des Testkeims und der blaue Farbton des BR Testsystems bleibt erhalten. Kann sich der Testkeim ungehindert entwickeln, so wird der Indikator Brillantschwarz reduziert und schlägt von blau nach gelb um.

Bei den Antibiotika kann zwischen Penicillin (ß-Lactam Antibiotika z. B. Ampicillin) und anderen Antibiotika mittels der Penicillinase (Penase) unterschieden werden. Das Enzym Penicillinase spaltet das Penicillin auf und macht es als Hemmstoff unwirksam.Weiters kann mit PABA (para-Aminobenzoesäure) die bakterizide Wirkung der Sulfonamide gehemmt werden und daher kann zwischen antibiotika- und sulfonamidhaltiger Milch unterschieden werden.

Die Nachweisgrenze dieser Methode liegt bei 0,003-0,008 U Penicillin-G-Na/ml.

Anwendung:Rohmilch, Magermilch, Milchpulver, saure Milcherzeugnisse, Honig, Fleisch

Durchführung für Rohmilch und Magermilch:Je 100 µl Milchprobe, Negativkontrolle (hemmstofffreie Milch) und Positivkontrolle (mit Penicillin versetzte Milch) werden in je eine Kavität der Mikrotiterplatte pipettiert. Der Teststreifen wird mit Klebefolie verschlossen und schwimmend im Wasserbad oder in einem speziellen Wärmeblock mind. 2,5h bei 64±1°C bebrütet.

Beim BR-AS-Test (für Antibiotika und Sulfonamide) wird in eine Kavität zusätzlich 25µl wässrige-PABA - Lösung (5 µg/ml) und dann erst 100 µl Milchprobe einpipettiert.

Die Gegenprobe mit Penase dient zur Prüfung, ob der festgestellte Hemmstoff Penicillin ist. Hiezu werden 0,4 ml einer Penaselösung (1000 Units/ml) mit 10 ml der zu testenden Milch vermischt und 30 Minuten bei 30 °C bebrütet. Anschließend wird der Test wie oben beschrieben durchgeführt. Oder die Penaselösung wird direkt in die Kavitäten, aber vor Zugabe der Probe einpipettiert.

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Hemmstoffnachweise erstellt von Dr. Gudrun Nagl

Möglicher Versuchsaufbau BR-AS-Test

Jede Kavität wird mit 100µl Probe bzw. Lösung befüllt. Um auf Sulfonamide zu testen, wird vorher in die Kavität 25µl PABA einpipettiert und dann erst die 100µl Probe.Um die Funktionstüchtigkeit des BR-Tests zu überprüfen, muss eine Positiv- und eine Negativkontrolle gemacht werden.Als Penicillin-Positivkontrolle können verschiedene Penicillinkonzentrationen (z.B.0,1-0,0025U) eingesetzt werden, ebenso verschiedene Sulfonamid-Konzentrationen.

Die 1. Reihe wird mit je 100µl Lösung (Probe, Negativkontrolle= garantiert hemmstofffreie Probe, Penicillinlösungen, Sulfonamid-Positivkontrolle) befüllt.Die 2. Reihe wird ebenso befüllt. jedoch wird vorher 25µl Penase bzw. PABA zugegeben.

Probe Probe Neg. Kont-rolle

0,1 UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,001UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,005UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,0025UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

Sulfa-pos. K.

Probe Probe Neg. Kont-rolle

25µl Penase + 0,1 U

25µl Penase + 0,01 U

25µl Penase + 0,005U

25µl Penase + 0,0025

25µlPABA+ Sulfa-Pos. K

Auswertung:

Probe Probe Neg. Kont-rolle

0,1 UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,001UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,005UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

0,0025UPenicillin-LösungPos. Kontrolle

Sulfa-pos. K.

Probe Probe Neg. Kont-rolle

25µl Penase + 0,1 U

25µl Penase + 0,01 U

25µl Penase + 0,005U

25µl Penase + 0,0025

25µlPABA+ Sulfa-Pos. K

Hemmstofffreie Proben färben sich gelb und hemmstoffhältige Proben bleiben blau.

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Hemmstoffnachweise erstellt von Dr. Gudrun Nagl

Originalbild eines BR-AS-Tests; die 2 linken Kavitäten haben sich verfärbt und zeigen damit keinen Hemmstoff an; die 6 anderen Kavitäten sind blau geblieben und zeigen Hemmstoff an;

Im Handel erhältlich:http:/www.bhg.co.at; office-wien@bhg.co.at

Literatur:Arbeitsanleitung BR-AS-Testwww.afema-ev.de/3.1/afema-ev.de/data/media/2265/Leitfaden-Hemmstoff-Endversion.pdfhttp://www.milchtest.de/lang/de/service.html

Weitere Hemmstofftest mit ähnlichem Prinzip:Milchtest MT http://www.milchtest.de/lang/de/service.htmlDelvotest

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