330 Baumann, Wurm und v. Bruchhausen Arch. Pharm.

Arch. Pharni. (Weinheim) 313. 330-337 (1980)

Hemmung der Prostaglandinsynthetase durch Flavonoide und Phenolderivate im Vergleich mit deren O,-.-Radikalfanger- eigenschaften

Joachim Baumann, Gotthard Wurrn&*) und Franz v. Bruchhauren’)

Pharmakologisches Institut der Freien Universitat Berlin, Thielallee 69/73, 1000 Berlin 33 “IPharmazeutisches Institut der Freien Universitat Berlin Eingegangen am 5. Juli 1979

Die Vorstellungen uber den eigentlichen Mechanismus der Cyclooxygenase-Reaktion bei der Prostaglandin-Biosynthese sowie deren Selbstbegrenzung s h d noch weitgehend ungekliirt. In Diskussion steht die Beteiligung von Redox-Systemen, Peroxiden und Radikalen (OH’, 02-*)14). In friiheren Arbeiten konnten wir zeigen, daR bestimmte einfache aromatische Verbindungen und Flavonoide die Prostaglandinsynthetase des Rattennierenrnarks ganz unterschiedlich beeinflussen kiinnen. Neben Verbindungen ohne signifikante Enzymaktivitats-Beeinflussung waren sowohl einfache Phenolderivate als auch Flavonoide in der [,age, die Cyclooxygenase-Reaktion teils deutlich zu aktivieren, teils stark zu hemmen7--’)). Bei diesen Struktur-Wirkungs-Untersuehungen zeigte sich, daR zumindest fur die Enzymaktivierung bestimmte Strukturmerkmale ausschlaggebend sind, und daR das Redox-Verhalten dieser Substanzen bei der Aktivierung der Prostaglandin-

313/80 Hemmung der Prostaglandinsynthetase 33 1

Synthese nicht entscheidend sein kann. Dabei stellte sich heraus, dal3 jene Substanzen, die aktivierende Eigenschaften besitzen, a!s Phenole mit polarer Seitenkette in m- oder p-Stellung aufzufassen sind. In der vorliegenden Studie wollen wir untersuchen, ob Aktivierung und Hemmung der Prostaglandinsynthetase durch verschiedene Substanzen mit deren Eigenschaften, freie Radikale abzufangen, in Verbindungstehen. Als besonders geeignet wahlten wir 22 Flavonoide und 23 entsprechende einfache aromatische Verbindungen aus, da bei ihnen sowohl Aktivierungen als auch Hemrnungen der Prostaglandinsynthetase moglich sind.

Bei den Messungen der Umwandlung von Arachidonsaure in Prostaglandine E zeigte sich wie erwartet eine maximale Enzymaktivierung durch Adrenalin, das bei allen Messungen als Vergleich diente. Ebenso wirkungsvoll erwies sich Dihydr~kaffeesaure~). Ohne Aktivator erreichte die Prostaglandinsynthetase-Praparation des Rattennieren- marks nur 46-50 % der Ausbeute des kompletten Systems, klassische Hemmstoffe wie Acetylsalicylsaure, Indomethacin und Mefenarninsaure lieBen die Umwandlung in dieser Versuchsanordnung auf 0-1 70 sinken. Abb. 1 zeigt exernplarisch die konzentrationsab- hangige Aktivierung der Prostaglandinsynthetase durch Adrenalin und Dihydrokaffeesau- re im Vergleich rnit den Hemmstoffen (+)-Catechin und (-)-Epicatechin sowie Brenzcatechin. Bei den folgenden Aussagen iiber die Beeinflussung der 0,-0-Radikalbil- dung wurde die unbeeinfluRte Radikalbildung je Zeiteinheit als Kontrolle mit 100 % angegeben, wobei Testsubstanzen rnit Radikalfangereigenschaften entsprechend niedrige- re Werte zeigen (Abb. 2).

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Abb. 1: Umwandlung von ( l-'4C)-Arachidonsaure zu Prostaglandin E als MaR der Prostaglandinsyn- thetase-Aktivitat. Konzentrationsabhangigkeit von zugesetzten Substanzen.

332 Baumann, Wurm und v. Bruchhausen Arch. Pharm.

Abb. 2: Zeitlicher Verlauf der 0; '-Kadikalbildung. EinfluR von zugeretzten Substanzen in Abhangigkeit von ihrer Konzentration.

Retrachtct man die auf ihre 02- -Radikalfangereigenschaften untersuchten aromatischen Verbindungen und Favonoide, so zeigt sich (Tab. 1, Spalte 1, zum Vergleich der Struktur s. Abb. 3), daR die o-Dihydroxy-Strukturen deutlich bis stark die Peroxidanion-Radikal- bildung hemmen. Hydrochinon und Verbindungen mit Monohydroxy-Struktur zeigten mittelstarke bis schwache Radikalfangereigenschaften (Tab. 1, Spalte 2); m-Dihydroxy- Verbindungen und Substanzen. die keine freien Hydroxyl-Gruppen im Molekiil aufwei- sen. sind fast ohne EinfluR auf die 02- *-Radikalabfangung. Die starkere Radikalfanger- eigenschaft der Flavonolcarbonsaure 4'-Carboxy-3.5,7-trihydroxyflavon (Nr. 10, Abb. 3) im Vergleich zu Galangin kann durch eine vinyloge p-Hydroxybenzoesaure-Struktur er- kliirt werden. Entsprechendes gilt auch fur Chrysin im Vergleich ZU der Flavoncarbon- siiure 4'-Carboxy-S.7-dihydroxyflavon (Nr . 5 , Abb. 3), das eine phenyloge p-Hydroxy- benzoesaure-Struktur besitzt. Diese Deutung wird erhartet durch die Tatsache, da8 Morin ein starker Radikalfanger ist: Es kann als vinyloges o-Dihydroxyphenol aufgefaOt werden. Als Radikalfanger reagiert es nicht als m-Dihydroxy-, sondern als vinyloge o-Dihydroxy- vcrbindung.

Heim Vergleich der untersuchten Verbindungen im Hinblick auf ihre Fahigkeit, die Cyclooxygenase-Reaktion bei der Prostaglandin-Synthese zu aktivieren oder zu hemmen,

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334 Baumann, Wurrn und v. Bruchhausen Arch. Pharm.

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Abb. 3a: Flavone und Flavonole.

zeigte sich’), daB fur die Enzymaktivierung ein Phenol mit polarer Seitenkette in m- oder p-Stellung erforderlich ist. Im Falle des Rutins 1aRt sich der Rhamnoglucosid-Anteil als polarcs Aquivalent betrachten. Werden die freien Hydroxyl-Gruppen im A- und B-Ring durch Hydroxy-Ethylierung verschlossen, geht auch die aktivierende Eigenschaft zu-

Auch eine Hemmungder Prostaglandinsynthetase ist durch Flavonoide moglich. Neben den Flavanolen Catechin8s9) und Epicatechin konnen auch Flavone und Flavonole deutliche Cyclooxygenase-Hemmstoffe sein (Abb. 3, Tab. 1). Alle diese hemmenden Verbindungen besitzen eine o-Dihydroxy-Struktur im Molekiil oder eine analoge

riick”.’O),

313/80 Hemmung der Prostaglandinsynthetase 335

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Abb. 3b: Flavanole und Flavanonole.

Anordnung in Form einer Hydroxyl-Gruppe in 3-Stellung in Nachbarschaft zu der Carbonyl-Gruppe. Als gemeinsames Strukturmerkmal fur eine Prostaglandinsynthetase- Hemmung bei den untersuchten Verbindungen scheint diese o-Dioxy-Struktur essentiell zu sein. Deshalb sind alle gemessenen Flavonole mit Ausnahme der 3-0-Glykoside Hemmstoffe, wahrend nur die Flavone das Enzymsystem hemmen, die tatsachlich Brenzcatechin-Struktur im A- bzw. B-Ring aufweisen. Im Hinblick auf bekannte Prostaglandinsynthetase-Hemmstoffe wie Acetylsalicylsaure, Indomethacin und Mefena- minsaure mogen neben diesem Brenzcatechin-Typ andere Hemmtypen moglich sein.

Substanzen mit 0,-*-Radikalfangereigenschaften konnen die Prostaglandinsynthetase sowohl hemmen als auch aktivieren oder sich neutral verhalten. Eine strikte Korrelation entweder zur Hemmung oder zur Aktivierung besteht also nicht. Dagegen konnen sowohl fur die Aktivierung als auch fur die Hemmung der Prostaglandinsynthetase durch einfache aromatische Verbindungen und Flavonoide bestimmte Strukturmerkmale in diesen Molekulen als essentiell angesehen werden.

336 Baumann, Wurm und v. Bruchhausen Arch. Pharrn.

Experimenteller Teil

I. Pros taglandinsynthe rase-Aktivitat

Mannliche Wistar-Ratten (250-300 g KG) wercien dekapitiert und die Nieren sofort entnommen. Der innere Nierenmarkbereich wird in flussigem Stickstoff gefroren und zur Emympraparation in 10 T. 0,l M K2HP04-Puffer (pH 8,O) bei 0" 4 min homogenisiert. Zur Prostaglandinsynthetase-Aktivitats- bestimmung wird eine vorgegebene Menge [ 1-'4C]-Arachidonsaure mit der Nierenmarkpraparation inkubiert und die gebildete Menge an Prostaglandinen bestimmt.

lnkuba tion und Prostaglandinbestimmun&"~1*~9)

SO pl [l-'4C]-Arachidonsaure (0,75 pCi/ml, sp. Akt. 50 C i h o l ) in lproz. ethanolischem 0,1 M K,HPO,-Puffer (pH 7,s) wird mit 50 pl reduziertem Glutathion (5,2 mM in Puffer), 50 pl Enzymsuspension (1 mg Protein) und Testsubstanz (1 mM in Puffer) im Gesamtvol. von 0,2 ml unter Luftzutritt 30 min bei 37" inkubiert. Die Keaktion wird im Eisbad durch sofortige selektive Extraktion der Arachidonsiiure mit 600 pl n-HexanEssigsaureethylester (2 : 1) terminiert. Nach Trennung der organischen und waBrigen Phase durch Zentrifugation (9000 g, 1 min) wird die organische Phase venvorfen und die Extraktion zweimal wiederholt. Die in der wahigen Phase verbleibenden gebildeten Prostaglandine (PG) werden durch szintillationsspektrometrische Messung der Pufferpha- se (Packard 3385, Pico-Fluor 15) quantitativ erfaBt.

11. Rildung freier O?- -Radiknle

Das Testsystem beruht auf der intermediaren Bildung freier Peroxidanion-Radikale aus molekularem Sauerstoff durch Phenazinmethosulfat (PMS), das mit NADH reduziert wird, wobei die aktuell vorliegende Radikalmenge durch Reduktion von 4-Nitrotetrazolium-Chloridblau (NBT) zum Formazan spektrophotometrisch erfaBt werden kanr~ '~ , '~) . Die Messungen erfolgen in einem Gilford 250 Spektrophotometer mit 500 pl 20 mM Na3P04-Puffer (pH 7,4), 500 pl 12,6 p M PMS in Puffer, 500p10,17mMNBTinPufferundO,l mMTestsubstanzinPuffer.DieReaktionwirdmit loop1 1,89 mM NADH gestartet (Gesamtvol. 2,1 mi). Die Fomazanbildungsgeschwindigkeit wird im linearen Teil der Reaktion uber 4 min bei 560 nm registriert. Fur die Einzelmessung werden jeweils als Kontrollen Proben ohne Zusatz sowie mit Zusatz eines starken Radikalfangers (Cate~hin) '~) mitgefuhrt. Testsubstanzen: 3',4'-Dihydro~yflavon'~), 7,8-Dihydro~yflavon'~), 3-Cyano-3',4'-dihy- droxyflavon"), 4'-Carboxy-5,7-dihydro~yflavon'~), 4'-Carbo~y-3,5,7-trihydroxyflavon~~), (+)- 3',4',5,7-TetramethyIcatechin'') sind Syntheseprodukte, 3',4',5,7-Tetra-0-((3-hydroxyethyl)-rutin (Zyma-GmbH, Miinchen). Alle anderen Verbindungen sind Handelspraparate.

Literatur

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313/80 DC-Bestimmung des Morphins 337

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[Ph 1411

Arch. Pharm. (Weinheim) 373, 337-343 (1980)

Haltbarkeitsspezifische diinnschichtchromatographische Bestimmungen des Morphins und seiner Abbauprodukte

Siegfried Ebel* und Dieter Rost

Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat Marburg, Marbacher Weg 6, D 355 Marburg/Lahn, und Chemische Untersuchungsstelle der Bundeswehr IV, Koblenz Eingegangen am 9. Juli 1979

Es wird eine Methode zur Bestimmung des Morphins und seiner Neben- bzw. Abbauprodukte Codein, Thebain, Pseudomorphin und Morphin-N-oxid beschrieben. Die Messung erfolgt nach diinnschichtchromatographischer Trennung iiber eine Remissionsmessung direkt auf der Platte. Der gefundene Gehalt an Codein und Pseudomorphin betragt biszu 0.3 %. Thebain konnte nur in Spuren, Morphin-N-oxid konnte auch nach langerer Lagerung nicht nachgewiesen werden. Die Genauigkeit der Morphin-Bestimmung liegt bei 1.8 70, die der Nebenprodukte bei 2 4 %.

Determination of Morphine and its Degradation Products in Dmgs by n C .

The determination of morphine and some of its degradation products is described. The evaluation is done by TLC with in situ measurement of reflectance. The content of codeine and pseudomorphine is

03654233 /80 /04044337 $02.50/0

0 Verlag Chemie, GmbH, Weinheim 1YXO