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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.

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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

Übungen Im Experimentalvortrag für Lehramtskandidaten SS 1998

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Veranstaltungsleiter:

Vortragende:

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Dr. E. GerstnerProf. H. PerstDr. J. Butenuth

Silke Alexander

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Chemie in der Schule: www.chids.de

GLIEDERUNG - INHALTSVERZEICHNIS

EinIeitun9 1

!J Nachweis und Bestimmung eines essentiellen Metallsim Organismus • Beispiel: Elsen 4

1. Qualitativer Eisennachweis in Schweine- oder Rinderleber 5

2. Quantitative Bestimmung von Eisen in Leber (photometrisch) ...•......•..5

!!J Metalle als Reaktionszentren wichtiger Enzyme 7

1. Eisen in Meerrettich - Peroxidase 7

2. Zink in Carboanhydrase ..........•.................................................................9

3. Kupfer in Tyrosinase .....................................•.....................................•...13

4. Nickel in Urease a ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16

!!U Biomineralisation • Konstruktion biologischerHochleistungsmaterialien 19

1. Hydroxylapatit in Wirbeltierknochen .......................•..............................21

2. Calciumcarbonat in Eierschalen 24

3. Die Natur selbst ist der Versuchsleiter: Ausstellung vonBiomineralien - Hydroxylapatit und Calciumcarbonat 26

Literaturverzelchnls 27


Einleitung

Das Ziel dieses Vortrags es zu zeigen, daß die Anorganische Chemie noch viel viel mehr ist, als nurdas Vorkommen, die Gewinnung, die Eigenschaften und die verschiedenen Verbindungenanorganischer Elemente, als sie im Grundpraktikum studiert werden. Anorganische Elemente spielenin unserem eigenen täglichen Leben - und "leben" ist dabei im wahrsten Sinne des Wortes zuverstehen - eine unersetzliche wichtige Rolle. Außerdem soll auch vermittelt werden, daß auch dieBiochemie noch viel mehr ist als die ganzen organischen Reaktionszyklen, bei denen ja dieanorganischen Metallzentren in den Enzymen die essentielle Rolle spielen.

Der Vortrag gliedert sich in drei Teile:

Teil I: Zunächst soll nachgewiesen werden, daß es im Organismen überhaupt anorganischeElemente gibt und in welchen Größenordnungen sich diese bewegen. Dies soll am Beispieldes Eisens in der Leber von Schweinen oder Rindern gezeigt werden.

Teil 11: In diesem Teil wird auf die essentielle Funktion von Metallionen in Enzymen als katalytischesZentrum eingegangen. Hierfür wurden vier Experimente ausgesucht mit vier verschiedenenMetallzentren aus dem Bereich der Übergangsmetalle und auch in verschiedenenOrganismen:

Metallzentrum Enzym Vorkommen, BeispielEisen Meerrettich-Peroxidase höhere PflanzenZink Carboanhydrase Mensch, Tier

Kupfer Tyrosinase höhere PflanzenNickel Urease Mikroorganismen

Teil 111: Dieser Abschnitt soll einen Einblick geben in die Faszination der Biomineralisation und in dieUnterschiede zwischen anorganischer Mineralisation und was Organismen daraus allesmachen.

Der Name "Bioanorganische Chemie" existiert wegen des Irrglaubens, daß organische Stoffe nur auslebenden Organismen gewonnen werden können, wohingegen anorganische Stoffe 'tote Materie" sei.1828 wurde dies durch die berühmte Wöhlersche Harnstoffsynthese aus 'totem" Ammoniumcyanatwider1egt. Seitdem wird unabhängig von der Materialherkunft unter Organik die Chemie derKohlenstoff- und Kohlenwasserstoffverbindungen sowie deren Heteroverbindungen mit Sauerstoff,Schwefel und Stickstoff verstanden. Für die Chemie lebender Organismen wurde trotzdem eineigener Name eingeführt: die Biochemie, die lange Zeit auch nur organische Verbindungen zumHauptgegenstand hatte. In neuerer Zeit wurde jedoch zunehmend die Bedeutung anorganischerElemente für biochemische Prozesse entdeckt: die Bioanorganische Chemie war geboren.

Die Bioanorganische Chemie wird erst nach 1960 zu einem eigenen Teilgebiet der Chemie: dieIsolations- und Reinigungsmethoden werden immer besser, die physikalischen Nachweise (z.B.Atomabsorptions- und -emissionsspektren) benötigen immer geringere Mengen an Probensubstanz,und immer mehr anorganische Elemente und deren essentielle Bedeutung werden entdeckt underkannt.

In der Biochemie waren einige anorganische Elemente schon sehr früh bekannt:- 1669: Phosphor (P4) wird mittels trockener Destillation in Hamrückständen entdeckt;- 18.Jhd: Pottasche (K2C0 3) wird aus Pflanzen gewonnen;- 1704~ Blutlaugensalze ( K3I4[Fe(CN)6] ) werden aus Blut hergestellt;- 1812: Iod wird in Meeresalgenasche entdeckt;- 1930: Zink wird eindeutig als Enzymbestandteil gefunden;- 1970: Nickel wird als Teil mehrerer wichtiger Enzyme nur zufäll:g in Marburg

entdeckt.

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Einige Ergebnisse und Entdeckungen in der bioanorganischen Chemie kamen völlig unerwartet undzufällig, z.B. die Ergebnisse an einer Untersuchung von Escherichia coIi, den Darmbakterien, diejeden von uns bewohnen. Es sollte untersucht werden, wie sich diese Bakterien verhalten, wenn sieeinem schwachen Wechselstrom ausgesetzt werden. Dazu wurde eine Nährpurfertösunq und einePlatin-Elektrode verwendet, von der bekannt ist, daß sie inert ist. Was jedoch mit der scheinbarinerten Platin-Elektrode geschah, von der keinertel Reaktion erwartet wurde, war, daß sie mit den inder Nährlösung vorhandenen Chlorid- und Ammoniumionen in ausreichender Menge einen Komplexbildete: cis-Diamminodichloropfatin(II), kurz cis-Platin. Das Spektakuläre: dieser Komplex hemmte dieZellteilung der Coli-Bakterien!!! Es kam zu fadenfönnigem Wachstum der Zellen, jedoch ohne, daßdiese sich teilten - ein Antitumormittel war entdeckt! Verwendet wird dieses cis-Platin seitdem gegenHoden-, Ovarial-, Blasen- und Lungenkarzinome sowie gegen Tumore im Hals- und Kopfbereich. DasMedikament hat weniger Nebenwirkungen als vergleichbare Medikamente und ist eines dererfolgreichsten Produkte der amerikanischen Universitäten: seit 1970 hat es die unglaubliche Summevon mehr als 55 Mio. US$ eingebracht!Auch die Entdeckung von Nickel als essentielles Element anaerober Bakterien gehört zu einemdieser großartigen Zufälle (s, Kap.ll, 4 ).

An diesem Beispiel läßt sich ansatzweise erkennen, wie hochgradig interdisziplinär dasForschungsgebiet der Bioanorganischen Chemie ist. Eine Auswahl der anderen beteiligtenFachrichtungen sei hier gegeben:

AnorganikOrganikBiochemiePhysik

ToxikologiePharmazieMedizinBiologie

PhysiologiePaläontologieMineralogie

Agrar-WissenschaftenEmährungs-WissenschaftenMaterial-Wissenschaften

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Die Organismen betreiben zum Teil einen großen Aufwand bei der Aufnahme, der Anreicherung, demTransport und der Speicherung anorganischenr Elemente. Hier eine Auswahl an Aufgaben, die imOrganismus von anorganischenStoffen übernommen werden:

Katalysatorfunktion als Lewis-Säure oder -Base:- oft Bedarf an saurer oder basischer Katalyse bei Auf- und Abbaureaktionen organischer

Verbindungen---> physiologischer pH-Wert im Organismus oft vorgegeben,

kaum Spielraum für "Extrembedingungen" für saure oder basische Katalyse(z.8. Blut: pH 7)

---> Alternative zu Protonen- oder Hydroxid-Katalyse:Lewis-Säure - Lewis-Base - Katalyse mit Metallionen in hydrolytisch aktivenEnzymen

Strukturfunktion:- Aufbau fester Strukturen durch Biomineralisation:

z.B. Hydroxylapatit in Knochen (s.Kap. 111)- Metallkationen +11+11 gewährleisten Doppelhelixstruktur der DNA als Polyanion,sie vermindern Abstoßung zwischen negativen Nukleotid-Phosphatgruppen

Aktivierung kleiner, hochsymmetrischer Moleküle:- Aktivierung von Molekülen mit hoher Bindungsenergie

--> . z.B. Kohlendioxid: Organismen können problematische Reaktionen nur unterphysiologischem pH durchführen: Reduktion von Kohlendioxid zu Methandurch Aktivierung mit Nickel im Enzym; Stickstoff-Fixierung und -Reduktionmit Eisen, MolytxJän und Vanadium im Zentrum

---> Übergangsmetallzentren stellen ungepaarte Elektronen zur Verfügung;nehmen gleichzeitig Elektronen auf und geben sie wieder ab:... - Rückbindung

Ladungsträgerfunktion für schnelle Informationsübertragung:- aktiver Aufbau eines Konzentrationsgradienten über Membranen durch Ionenpumpen

---> Ausschüttung nicht abbaubarer anorganischen Ionen in Nerven und Muskeln

Elektronentransoort im Energiehaushalt:- zum Großteil auf redoxaktive Metallzentren angewiesen

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Bei den anorganischen Elementen wird häufig von Spurenelementen und Essentiellen Elementengesprochen. Ein essentielles Element ist so definiert, daß wenn ein Mangel an diesem im Körperbesteht, es zu Leistungs- und Befindlichkeitsbeeinträchtigungen kommt; fehlt ein essentielles Elementim Körper völlig, so werden schwere irreversible Schäden hervorgerufen.Bei einem Spurenelement handelt es sich um ein für den Organismus notwendiges Element, dessentäglicher Bedarf 25mg nicht überschreiten darf.

Essentielle Elemente in der menschlichen Nahrung:

Anorganische Empfohlene tägliche NährstoffzufuhrBestandteile für Erwachsene (mg)

K 2000 - 5500Na 1100 - 3300Ca 800 - 1200Mg 300 - 400Zn 15Fe 10 - 20Cu 1,5 - 3Cr 0,05 - 0,2Co 0,2

Phosphat 800 - 1000CI 3200F 1,5 - 4I 0,15

Für essentielle Elemente gilt nicht der Grundsatz: "Viel hilft viel", sondern es gibt eine engeBeziegung zwischen der Konzentration, in der das betreffende Element vorliegt, und dem Effekt aufden Organismus. Liegen essentielle Elemente in einer zu geringen Konzentration im Körper vor, sokommt es zu Mangelerscheinungen, bei zu hohen Konzentrationen kommt es dagegen zuVergiftungserscheinungen und sogar zum Tod, und in dem Bereich dazwischen ist der Organismusgesund.

In diesem Vortrag soll jeweils auf das essentielle Element im Organismus im Allgemeinen und dasauf das entsprechende Enzym im besonderen eingegangen werden .

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I. Nachweis und Bestimmung eines essentiellen Metalls

im Organismus • Beispiel: Eisen

Eisen ist das häufigste 3d-Metall im menschlichen Körper. Seine wichtige Aufgabe im Haemoglobinals Sauerstoff-Transporter führen dazu, daß es in der relativ großen Menge von 4,2g pro 70kgKörpergewicht im Organismus vorkommt, die empfohlene tägliche Nährstoffzufuhr liegt bei 10-20mg.Entdeckt wurde Eisen als essentielles Element im Körper schon im 17.Jhd.

Der menschliche Körper enthält im Durchschnitt 4-5g Eisen. Die Verteilung des Eisens ist wie folgt:- 730/0 im Haemoglobin,- 16% im Ferritin, der eigentlichen Fe-Reserve,- 3,3°A> im Myoglobin und- O,2°~ in den Enzymen.

Eisen ist essentiell für die -Synthese des Haemoglobins, in dem es als Sauerstoff-Träger fungiert, undfür die Synthese wichtiger Enzyme, in denen es als Reaktionszentrum fungiert (s. Kap. 3 ).

Der tägliche Fe-Bedarf liegt bei Männem bei 12mg und bei Frauen bei 18mg. Die Form derDarreichung ist wichtig für die Bioverfügbarkeit

- eine geeignete Komplexierung verbessert die Bioverfügbarkeit: z.B. durch organischeSäuren wie Zitronensäure, Gluconsäure o.ä.:

- Eisen aus tierischen Nahrungsmitteln ( besonders Innereien) sind besser resorbierbar alsEisen aus pflanzlicher Kost;

- die Resorption wird durch Vitamin C verbessert, Kaffee und Tee hemmen hingegen dieResorption durch Entstehen schwerlöslicher Gerbstoffkomplexe.

Ein Eisenmangel äußert sich meist in einer Eisenmangelanämie. bei der die Haemoglobin-Bildungdurch den Mangel an Fe behindert ist. Es kommt zu:

- Muskelschwäche und Kraftlosigkeit,- Kopfschmerzen,- Müdigkeit,- Schlafstörungen,- depressive Verstimmungen,- Fahler Blässe der Haut und der Schleimhäute.- Mundwinkelrisse,- brüchigen Fingernägel,- Haarausfall,- Atemnot und Steigerung der Herzfrequenz in schlimmeren Fällen.

Die Ursachen des Fe-Mangels liegen darin begründet, daß:- Blutungen auftreten, z.B. versteckte Blutungen im Magen-Darm-Trakt;- das im Magen aufgenommene Fe mangelhaft ausgenutzt wird;- die Resorption des Fe im Dann mangelhaft ist;- die Fe-Zufuhr mangelhaft ist, was in unseren Gebieten aber eher selten auftritt.

Außer Eisenmangel kann auch eine Eisenakkumulation zu pathologischen Störungen führen. DieAnreicherung von Eisen kann genetisch bedingt sein: bei der Haematochromatose wird sehr vielEisen im Gewebe eingelagert, das dann degeneriert. Die betroffenen Patienten bekommen eine"südländisch" braune Haut, unbehandelt führt diese Krankheit zum Tode. Als Therapie wird dasangereicherte Eisen regelmäßig mit wenig toxischen Komplexbildnern entfernt.

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1. Qualitativer Eisennachweis in Schweine- oder Rinderleber:

Chemikalien:

Durchführung:

Ergebnis:

Rinder- oder Schweineleber (ca. 100-150g)Salzsäure, konzentriertGelbes Blutlaugensalz

100-150g Leber werden z.B. in der Küchenmaschine zerkleinert und in einePorzellanschale gegeben. Im Abzug wird der Leberbrei mit einemBunsenbrenner vollständig verascht. Die Leberkohle wird dann in einemMörser fein gerieben und mit konzentrierter Salzsäure übergossen. DieMischung wird abfiltriert und das Filtrat mit Wasser etwa 1:1 verdünnt. Zudieser Lösung werden einige Tropfen einer Lösung von GelbemBlutlaugensalz gegeben.

Die Lösung färbt sich blau, es ist Lösliches Ber1iner Blau entstanden.

Fe2+aq + [Fe(CN)e]4- + 4K+ ~==~ K2Fe[Fe(CN)6l ~ + 2K+weiß

Autoxidation:2 K2Fe[Fe(CN)6J+ 1/2 O2 + H20 ---~~--- 2 KFe[Fe(CN)6l + 2~ + 20H

Lösl.Ber1iner Blau

2. Quantitative Bestimmung von Fe in Schweine- oder Rinderleber ( photometrisch ):

Chemikalien: Eisen-(II)-StammlösungAscorbinsäureAcetatpufferPhenanthrolinNatriumacetatSalzsäure, konzentriertaq bidest

( 1OO~-ige Lösung )(pH 4,5)(O,5%-ige Lösung )

Durchführung:

Alle Lösungen sind mit aq bidest anzusetzen undalle Reagenzien müssen p.a. sein.

Vorbereitung der Leberprobe:Etwa 10g zerkleinerte Leber werden in einen Porzellantiegel eingewogen undvollständig mit einem Bunsenbrennerverascht. Die erkaltete Asche wird in20ml konzentrierter Salzsäure aufgenommen, auf 1-2ml eingeengt und ineinen 100rnl Meßkolben abfiltriert. Der Tiegel und das Filterpapier werden mitinsgesamt etwa 70ml aq bidest gründlich gewaschen, das Waschwasserebenfalls in den Meßkolben gegeben. Zu dieser Lösung werden etwa 5-6gfestes Natriumacetat gegeben, um auf einen pH-Wert von etwa 5abzupuffem. Dann wird der Meßkolben mit aq bidest auf 100ml aufgefüllt.

Erstellen der Eichkurve:In 100ml-Meßkolben werden jeweils 0, 50, 150, 250, 350, 450 und 550IL1 derFe-(II)-Stammlösung mit einer Eppendorf-Pipette gegeben. Es werden zuerstjeweils SmI10%-ige Ascorbinsäurelsg. und 20ml Acetatpuffer ( pH 4,5 )zugegeben. Nach Smin werden 10ml O,50k-ige Phenanthrolinlsg. und nachweiteren 20min aq bidest bis zur 100ml-Marke dazugegeben. Im Photometerwerden die Proben bei 546nm gegen den Blindwert gemessen.

Messen der Leberprobe:50 oder 25ml ( oder bei Bedarf noch weniger) der erstellten Leberprobewerden in einen 100ml-Meßkolben pipettiert und damit wie beim Ansetzender Lösungen für die Eichkurve ( s.o. ) verfahren.

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Die erhaltene Extinktion für die Leberprobe wird auf der Eichkurveeingetragen und abgelesen, wieviel Fe die Probe enthielt. Je nachentnommener Menge aus dem 100rnl-Kolben mußauf die Gesamtmenge derProbe zurückgerechnet werden. Angegeben werden die Werte immerbezogen auf den Fe-Gehalt in 100g Probenmaterial.

Ergebnis: Bei Zugabe der Phenanthrolin-Lösung bildet sich ein orangerotes1,1O-Phenanthrolin-Fe(II)-Komplexion.

10 P ..g Leber wurden eingewogen und verascht.r ml wurden für die Extinktions-Bestimmung behandelt.Der Extinktionswert betrug O,AS'"'8.Der Fe-Gehalt derS'ml-Probe betrug nach der Eichkurve daher~1rJ-Lg.

Die Leberprobe enthielt insgesamt ~g x ~o =~ J-LQ Fe.In 1019 Leber sind somit3,S ta9 enthalten:

~\) g =\.r fIQ Fe1009 =&r fIQ Fe

Der Literaturwert für Fe-Gehalt der Leber beträgt 6,SILQ.

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11. Metalle als Reaktionszentren wichtiger Enzyme

1. Eisen in Meerrettich - Peroxidase

Die Bedeutung des Eisens in wichtigen Enzymen wird am Beispiel der Peroxidasen deutlich. DiePeroxidasen gehören zu den Entgiftungsenzymen, die Wasserstoffperoxid zu Wasser umsetzenkönnen. Als weitere. biologisch sinnvolle Substrate für Peroxidasen kommen viele, nicht einfachoxidierbare Verbindungen wie Fettsäuren. Amine, Phenole, xenobiotische Substanzen und vieleSchadstoffe in Betracht.

Zu den wichtigsten Reaktionen einiger Häm-Peroxidasen gehören:- die lodierung und Kopplung von Tyrosin zu Schilddrüsenhonnonen (Thyreoperoxidase ).- die Oxidation von Chlorid zu bakterizidem Hypochlorit ( Myeloperoxidase ),- der Auf- und Abbau von Lignin ( Ligninperoxidase ) ( Lignin stellt 25% der Weltbiomasse I!! ).- die Nutzung von Wasserstoffperoxid und Hydrochinon in einer explosiv verlaufenden Reaktion zu

Sauerstoff und aggressivem. oxidierendem Chinon in Bombadierkäfem ( im Käfer werden in zweiverschließbaren Kammern je Hydrochinonverbindungen und 23%-iges!!! Wasserstoffperoxidgelagert; bei Gefahr werden die Ventile beider Kammern geöffnet, die Stoffe fließen in einen dickwandigen Reaktionsraum mit den Peroxidasen, und es kommt zu einer explosionsartigen Reaktion,bei der dem Angreifer die Produkte entgegen geschossen werden)

- Peroxidase-Aktivität in Mikroorganismen führt zum Abbau von Dioxinen, Furanen ete., derengroßtechnische Nutzung zur Detoxifikation getestet werden.

Die Im Versuch eingesetzte Meerrettich-Peroxidase ( engl. horse-radish peroxidase HRP) gehört zuden bekanntesten Peroxidasen. Sie gehört zu den Häm-Peroxidasen; diese durchlaufen reaktiveZwischenstufen mit ungewöhnlich hohen Oxidationsstufen des Eisens: für Eisen(lV) gibt es nurwenige Beispiele ( (FelV(S2CNR2l3]+).

Reduktion von Wasserstoffperoxid durch Meerrettich-Peroxidase

Chemikalien: MeerrettichWasserstoffperoxidGuajacol-HarzEthanol

(als frische Wurzel oder schon kochfertig get<auft)( O,5%-ige Lösung)

(96%)

Durchführung:

Ergebnis:

Die frische Meerrettichwurzel wird zerkleinert, mit 20ml aq dest homogenisiertund zentrifugiert; der kochfertig gekaufte Meerrettich wird gleich zentrifugiert.Der Überstand wird dann 1:100 mit aq dest verdünnt. Vom Guajacol-Harz( Brenzkatechinmonomethylether ) wird eine ethanofische Lösung hergestellt:das Harz wird dabei im Wasserbad erwärmt, so daß es schmilzt, dann wird 19( entspricht O,S8rnl ) in 67,5ml in 96% -igem Ethanol gelöst.In ein Reagenzglas werden dann 2ml des Meerrettich-Extraktes gegeben,dann werden 3 Tropfen 0,5%-ige Wasserstoffperoxidlösung und 3 Tropfendes ethanolischen Guajacol-Harzes hinzugetropft. In ein zweites Reagenzglaswerden als Blindprobe 2ml aq dest statt des Extraktes vorgelegt, und der Restwird wie im ersten Versuch hinzugegeben.

Im ersten Versuch kommt es nach wenigen Sekunden zu einer Braunfärbung,im zweiten Versuch findet keine Reaktion statt .

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-- 8-Chemie in der Schule: www.chids.de

2. Zink in Carboanhydrase

Zink ist nach Eisen das zweithäufigste 3d-Metall im menschlichen Organismus: es kommen etwa29 Zink pro 70kg Körpergewicht vor, die empfohlene tägliche Nährstoffzufuhr liegt bei 15mg. Bis jetztsind über 300 verschiedene Zn-haltige Enzyme bekannt, z.T. kommen sie in den Enzymenzusammen mit anderen Metallen vor. Eindeutig wurden Zinkproteine und -enzyme im Organismusjedoch erst 1930 nachgewiesen. Unter diesen Enzymen sind viele essentielle Enzyme, sie fungierenals:

• Aufbau-Katalysatoren: - z.B. Synthetasen, Polymerasen, Ligasen, Transferasen,• hohe Zinkgehalte im Fötus und im Säugling, sowie in

Fortpflanzungsorganen und besonders im Sperma geben denHinweis darauf, daß Zink wichtige Funktionen bei Aufbaureaktionenübernimmt;

- Abbau-Katalysatoren: • l.B. Hydrolasen, die Proteine, Nudeinsäuren, Lipide undPorphyrinvorstufen abbauen;

- Fixierer:

- Stabilisierer:

- bestimmter Proteinkonformationen in Oxidoreduktasen, die dieReaktionsgeschwindigkeit und I oder die Stereoselektivität beeinflussen;

- struktureller Art von Insulin, Hormon-Rezeptor-Komplexen undTranskriptions-regulierenden Faktoren für die Übertragung genetischerInformation.

Zn2+ < 8- Substrat ö+

Ein Mangel an Zink führt zu gravierenden pathologischen Erscheinungen wie Appetitlosigkeit,Abstumpfung des Geschmacksinnes, Neigung zu Entzündungen, Beeinträchtigung desImmunsystems (AIDS-ähnliche Symptome). Auch schwerere Homologe wie z.B. Cadmium oderQuecksilber, die das Zinkion aus den Enzymzentren verdrängen, richten schwere Schäden an, da dieEnzyme ohne das Zink unwirksam sind.In der Medizin wird Zink als Therapeutikum eingesetzt: Schon in der Antike wurden Zink-haltigeSalben zur Wundheilung eingesetzt: die Wirkung beruht darauf, daß Kollagenasen als Zentralion Zinkenthalten. Auch zur Behebung von Wachs1umsstörungen kann Zink eingesetzt werden, da es inWechselwirkung mit Wachstumshormonen tritt. Außerdem soll Zink als Vorbeugung gegen Grippehelfen, weil es Rezeptoren blockiert.Alkohol-Konsum erhöht den Bedarf an Zink.Für höhere Dosen an Zink besteht eine relativ große Toleranz, bevor es zu Vergiftungserscheinungenkommt.

Die wesentliche biologische Wirkung des Zinks liegt in seiner Lewis-Acidität: es kann beiphysiologischem ph-Wert Reaktionen durch Polarisation des Substrats katalysieren - ansonstenwären starke Säuren oder Basen zur Katalyse notwendig, was aber physiologisch nur selten der Fallist ( z.B. im Magen ):

Zink(ll) als Lewis-Säure;Angriff an nucleophilen Substraten.

Zink als Lewis-Säure kann jedoch - wie im Fall der Carboanhydrase • auch zur Lewis-Base umgepoltwerden, Grundlage dafür ist eine Deprotonierung von Aquakomplexen:

Zn - OH2 '2+ ~==~ Zn. OH 1+ + H+ Zink(lI) als Lewis-Base;Wasseraktivierung.

Das Zinkion ist im Gegensatz zu Kupfer und Nickel nicht redoxaktiv I unerwünschte Elektronentransfer-Prozesse werden sogar ausgeschlossen.


In Proteinen und Enzymen wird Zink wie Kupfer vor allem durch das Imin-Stickstoff-Zentrum amImidazolrings des Histidins kinetisch fest gebunden. Es bevorzugt eine eher niedrigeKoordinationszahl bei ungerichteter Polarisationswirkung.

Die menschliche Carboanhydrase ist ein mittelgroßes Protein aus 259 Aminosäuren. Das Zinkionbefindet sich am Grund eines Hohlraumes und wird von 3 Histidinresten koordiniert. Die vierteKoordinationsstelle wird von einem Wassennolekül besetzt, welches wiederum über H-Brückenbindungen mit weiteren Aminosäureresten und weiteren Wassermolekülen verbunden ist. Es ergibtsich also eine verzerrt tetraedrische Koordination des Zinks.Inner- und außerhalb des Enzyms befinden sich zahlreiche Wassennoleküle, die durchWasserstoffbrückenbindungen verbunden ein richtiges Netzwerk bilden. Dieses Wassernetz stellteinen sehr wichtigen Bestandteil für die Struktur und die Funktion der Carboanhydrase als wichtigemHydrolyse-Enzym dar.

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"Katalytischer Effekt der Carboanhydrase

Chemikalien:

Durchführung:

frisches Rinder- oder SchweineblutNaCI ( 0,9%; physiologische Lösung)Ethanol ( Ethanol:aq dest = 4:6 )ChloroformPhenolrotNatriumhydrogencarbonat ( 2,2g zu 24ml aq dest =Lsg. A )Dinatriumhydrogencarbonat ( 5,3g zu 40ml aq dest = Lsg. B )Mineralwasser

Enzymisolation aus Blut:6ml Blut werden zentrifugiert, der Überstand verworfen, die Erythrocyten in4ml physiologischer Kochsalzlösung aufgeschwemmt und erneut zentrifugiert.Der Überstand wird erneut verworten. Zu den Erythrocyten werden 2,5ml derwässrigen Ethanollösung ( 4:6 ) und 1ml Chloroform gegeben und kräftigdurchgeschüttelt, danach zentrifugiert. Die Carboanhydrase befindet sichdann im Überstand, der mehrere Tage lang im Kühlschrank aufbewahrtwerden kann.

Lösungen für den Enzymtest:Für die Indikatorlösung werden 12,5mg Phenolrot und 218mg Natriumhydrogencarbonat zu 11 aq dest gelöst.Den Puffer stellt man durch zusammengießen von 20,6ml Lösung A und30ml Lösung B her. Dies wird mit aq dest zu 10o-200ml aufgefüllt.

Enzymtest:In zwei Reagenzg.läser wird jeweilsa) 1ml Phenolrotlsg. + OISml Puffer + 1ml Enzymlsg;b) 1ml Phenolrotlsg. + O,5ml Puffer + 1ml aq destvorgelegt. Dann werden möglichst gleichzeitig und gleichmäßig je Sml kaltesMineralwasser ( mit Kohlensäure! ) dazugegeben.


Ergebnis: In beiden Fällen ändert sich die Farbe des Indikatorsvon rosa nach gelb.Eindeutig und offensichtlich unterschiedlich ist die Geschwindigkeit derReaktion: der Farbumschlag erfolgt im Reagenzglas mit der Enzymlösungdeutlich schneller als ohne das Enzym.

Vor der Diskussion der mechanistischen Hypothesen bei der Katalyse soll jedoch auf die Problematikder reinen anorganischen Reaktion eingegangen werden:

CO2 + aq i===~ C02aqC02aq + H20 ~==~ tlH2COj'

" H2COj' + H20 ~==~ HC03- + H+sehr langsamschnell

Die Hydrolyse von Kohlendioxid ist stark pH-abhängig, neben physikalischgelöstem Kohlendioxidspielt auch in geringem Maß schon gelöste Kohlensäure eine Rolle. Die erstaunlich langsameHydratisierung von Kohlendioxid ( das Gleichgewicht liegt bei 20°C und 1,013bar zu ca. 99% auf derlinken Seite) ist durch konventionelle Säure-Base-Katalysejedoch wenig beeinflußbar.

Da Kohlendioxid linear und symmetrisch und ohne permanenten Dipol ist, wird für die Polarisierungeine Kombination von Lewis-Säure und Lewis-Base benötigt:

eS+

lj- 0 =C =0 lj- --> Lewis-Säure~

Lewis-BaseEs handelt sich also um eine bifunktionelle Katalyse mit einem push-pull-Effekt: durch die LewisSäure wird Elektronendichte abgezogen, durch die Lewis-Base Elektronendichte hineingeschoben. Inder Carboanhydrase dient das am Zinkion gebundene Hydroxid als basisches Zentrum für dennucleophilen Angriff am Kohlendioxid-Kohlenstoffzentrum. Das Zinkion selbst trägt dazu bei, dasKohlendioxid-Molekül weitgehend linear anzuziehen, zu orientieren und zu polarisieren. Einproduktiver Angriff auf den 0 des Kohlendioxids erfolgt durch aeide Protonen innerhalb desWasserstoffbtücken-Netzwerkes.

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der enzymatischen Reaktion hat nichts mit derWasserstoffüberlragung am Kohlenstoff direkt zu tun. Geschwindigkeitsbestimmend ist dieWasseraktivierung am Zinkion, d.h. die H-Abspaltung und deren Abtransport über Aminosäureresteund das Wassemetzwerk im Molekül.

Die hohe Reaktionsgeschwindigkeit bei physiologischem pH-Wert wird durch die Protonen imNetzwerk begünstigt, durch die eine sehr schnelle Protonenverschiebung möglich wird. Im Endeffekterfolgen die entscheidenden Angriffe am Kohlendioxid durch die Bestandteiledes Wassers: Hydroxid

;---., vom am Metall gebundenen Wasser und Protonen aus dem intramolekularem Wassemetzwerk.

Im Organismus katalysiert die Carboanhydrase also die Einstellung des Gleichgewichtes2H20 + CO2 i===~ HC03- + H30+.

Die Reaktion vertäuft wie oben schon gesehen nonnalerweise sehr langsam. Durch dieCarboanhydrase wird die Reaktion auf das 107·fache beschleunigt! DeshalbwerdenCarboanhydrasen auch als "perfekt evaluierte" Enzyme mit maximal möglichem Umsatz bezeichnet.

Carboanhydrasen sind biologisch sehr bedeutsame Enzyme:- in tierischen Organismen sorgen sie bei der Atmung für eine schnelle Kohlendioxid-Entsorgung;- sie puffern den pH-Wert im Blut- bei einer Hyperventilation z.B.bei psychisch Kranken kommt es

zum verstärkten Abatmen des Kohlendioxids durch schnelles, kurzes Atmen - dadurch sinkt derPartialdruck an Kohlendioxid im Blut, zu wenige Protonen sind vorhanden, es kommt zum pHAnstieg, zur Alkalose;

- bei der Photosynthese in Pflanzen ist die Carboanhydrase für eine effektive Kohlendioxid-Aufnahmezuständig;

- und beim Auf- und Abbau kalkhaltiger Skelette ( z.B. bei Muscheln, Eierschalen, Korallen etc. ) istsie für die Calcifizierung und Decalcifizierung mitverantwortlich.


3. Kupfer in Tyrosinase ( Phenoloxidase 1

Kupfer ist ein wichtiges Spurenelement, es werden zwei Hauptgruppen von Kupferproteinenunterschieden:1. Kupferproteine als reine Elektronenüberträger, wie z.B. das Kupfer in Enzymen der Atmungskette;2. Kupferproteine, die mit Sauerstoff oder dessen Metaboliten wechselwirken.Der tägliche Bedarf an Kupfer tiegt bei 1,5-3mg, die Gesamtmenge im Körper liegt aber nur bei150mg, da Kupfer nicht zum Sauerstofftransport benötigt wird wie das Eisen. 'Ist derKupfersloffwechsel im Organismus immens gestört, so kann es zu pathologischen Störungenkommen, an deren Ende der Tod stehen kann.

Kupfer wird oft als die Alternative zu biologischem Eisen in Protein- und Enzymzentren angesehen.Dies meint, daß Eisen- und Kupferproteine oft eine vergleichbare Funktion besitzen:

Funktion Eisen - Proteine Kupfer - Proteine

Sauerstoff - Transport Haemoglobin (h) Haemocyanin (Molluscen,

Haemoerythrin (nh) ( Spritz- und Arthropoden: Spinnen, Schnecken,

Priapswürmer, Armfüßer) Insekten e1c. )

Oxygenierung Cytochrom P450 (h) TyrosinaseMethan-Monooxygenase (nh)

Oxidase - Aktivität Peroxidasen (h/nh) Amin-OxidasenLaccasen

Es gibt jedoch auch wesentliche Unterschiede zwischen Eisen und Kupfer in Enzymen. Einer ist z.B.,daß Kupfer nie Tetrapyrrol-komplexiert ist, und es so nie zu Kupfer-Häm-Proteinen kommen kann(das "h" in der Tabelle steht für "Häm-Protein" und das "nh" für "Nicht-Häm-Proteinj. Kupfer in einund zweiwertiger Fonn kann durch das Imin-Stickstoff-Zentrum am Imidazolring des Histidinrestesausreichend feste gebunden werden. Auch das Kupferion der Tyrosinase ist so gebunden.

Es gibt einen weiteren Aspekt im Vergleich zwischen Kupfer und Eisen, der biologisch undf' erdgeschichtlich höchst interessant ist: in neutraler wässriger Lösung und im Meerwasser ist von

Kupfer die oxidierte Form Cu2+ besser löslich als die reduziert Form Cu+. Vom Eisen dagegen ist diereduzierte Fonn Fe2+ besser löslich als die oxidierte Form Fe3+. Dieser scheinbar unwichtigeUnterschied hatte geochemisch jedoch immense Folgen: als die ersten Pflanzenzellen begannen,oxidierenden Sauerstoff zu produzieren, wurden beide vorhandene Ionen zunehmend oxidiert. DerUnterschied nach dieser Oxidation: die Konzentration an gut löslichem CU2~ nahm plötzlich zu,während die Konzentration des schlechter löslichen Fe3+ abnahm. D.h., daß früh in derErdgeschichte, vor der Sauerstoffproduktion, viel Fe zur Verfügung stand und weniger Cu, nachErfindung der Photosynthese aber mehr Cu und weniger Fe. Dieses Phänomen wird auch als KupferMobilisierung bzw. als Eisen-Ausfällung bezeichnet. Als biologische Folge werden daherEisenproteine eher intra- und Kupferproteine dagegen eher extrazellulär gefunden.

Tyrosinase übernimmt im tierischen Organismus sehr wichtige Aufgaben. Es kann aber auch in Pilzenund in höheren Pflanzen gefunden werden. Der Trivialname Tyrosinase kommt daher, da lange ZeitTyrosin als Ausgangssubstrat der Phenoloxidase angesehen wurde.Besondere Bedeutung hat das Tyrosin in tierischen Zellen, wo es aus Tyrosin über Dopa an Proteinegebundene Melanine synthetisiert. Tyrosin wird dabei oxidativ über Dopa und Chinone umgewandelt t

nach Polymerisierungen wird das Melanin gebildet, das unsere Haut braun färbt als UV-Schutz ( kannbei den ersten Sonnenstrahlen im Sommer leicht an der eigenen Haut beobachtet werden ).Außerdem kann es auch wieder über Dopa wichtige Hormone und Neurotransmitter herstellen, z.B.Adrenalin oder Noradrenalin.


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Auch Insekten besitzen das Enzym Tyrosinase: bei ihnen bildet es wie beim Menschen Melanin, dasauch die lnsektencutlcula braun färbt, außerdem bewirkt es eine Sklerotisierung der Cuticula. Auch inHaut, Haaren und Federn bewirkt Melanin eine Färbung.In den Pflanzen bewirkt Tyrosinase ein Nachdunkeln von Schnittflächen, was jeder aus der eigenenKüche kennt, wenn er schon mal einen aufgeschnittenen oder angebissenen Apfel einige Minuten ander Luft liegen lassen hat.

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Bei der Struktur der Tyrosinase handelt es sich um ein verbrücktes Dimer, das Kupfer ist jeweils amImin-Stickstoffzentrum des Imidazolrings eines Histidinrestes gebunden. Die Funktion ist die orthoHydroxylierung von Phenolen und deren Weiteroxidation zu ortho-Chinonen ( 2.8. in der Haut, imFruchtfleisch etc, ).

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Phenoloxidation durch Tyrosinase:

Chemikalien: Kartoffelnp-KresolKaliumcyanid

, Kupfer(II)-phosphatOCtanol

( O,4% -ige Lösung)( verdünnte Lösung)( verdünnte Lösung)

!" Durchführung: Ein bis zwei Kartoffeln werden geschält und auf einer Glasreibe kleingerieben. Der Saft der Kartoffeln wird dann abzentrifugiert und 10ml davon inein Reagenzglas gegeben. Soll der Kartoffelsaft für einige Minuten gelagertoder aufbewahrt werden, so sollte entweder jetzt schon eine dünneOctanolschicht über den Saft im Reagenzglas gelegt werden und/oder im Eisgekühlt werden. Dies verhindert, daß die Reaktion der Tyrosinase schonvorzeitig eintritt und sich der Saft bräunt. Zu dem Saft werden dann 3 Tropfenp-Kresollösung getropft und, sollte dies nicht vorher schon geschehen sein,noch 5 Tropfen Octanol. Das Reagenzglas wird dann mit einemGummistopfen verschlossen, und es werden Smin lang kräftig geschüttelt.

In einem weiteren Versuch werden zu 10ml Kartoffelsaft zunächst 3Tropfen Zyankalilösung gegeben und einige Minuten gewartet. Dann wird wieim ersten Versuch verfahren ( 3 Tropfen p-Kresol und 5 Tropfen Octanolhinzugeben und 5min lang schütteln ), es kommt nicht zu demgleichenErgebnis wie im ersten Versuch. Wird jedoch mit einer Kupfer(II)phosphatlösung Kupfer im Überschuß hinzugegeben und nochmalsgeschüttelt, stellt sich dasgleiche Ergebnis wie oben ein.

Emebnis: Im ersten Versuch kommt es nach einigen Minuten schüttein zu einerBraunfärbung. Im zweiten Versuch tritt die Braunfärbung erst nach Zugabedes Kupferüberschusses auf, vorher zeigt sich keine Reaktion.

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4. Nickel in Urease

Nickel und seine biologische Bedeutung wurden lange Zeit übersehen, da Ni(lI) mit seinenphysiologisch relevanten Liganden keine sehr charakteristische Lichtabsorption zeigt, außerdem istNickel meist nur eines von mehreren komplexen Bestandteilen - in Eisen-Schwefel-Clustern konntees sich so lange Zeit versteckt halten. Ende der 60er Jahre wurde zum ersten Mal vermutet, daßNickel ein notwendiger Bestandteil einiger anaerober Bakterien sein könnte.Die AG um Prof. Dr. Thauer untersuchte Klärschlammbakterien auf ihre Fähigkeit, Methan zuproduzieren. Die dafür entnommenen Klärschlammproben aus dem Faulturm der Marburger .Kläranlage, erzielten jedoch kaum reproduzierbare Ergebnisse. 1970 stellte sich heraus, daß dieProben mit einer Kanüle entnommen wurden, die Nickel enthielt. Das Nickel löste sich in Spuren underhöhte den Umsatz der Bakterien: ein Nickelion war nämlich auch das reaktive Zentrum desuntersuchten Enzyms, das für die Methanproduktion verantwortlichwar!1975 wurde Nickel dann auch in pflanzlicher Urease nachgewiesen.

Nach dem heutigen Forschungsstand kommt Nickel als essentielleKomponente mit verschiedenenOxidationsstufen in vier verschiedenen Enzymtypen vor:

a) Ureaesen:

b) Hydrogenasen:

c) CQ-Oehydrogenasen:

d) Methyl-Coenzym M-Reduktase:

- in Bakterien und Pflanzen- weitgehend oktaedrisch gebundenesNi; N-, o-Liganden;

- in vielen Bakterien ( z.B. "Knallgas"-Bakterien odersulfatreduzierende Stämme );

- Ni mit S-Liganden;

- in anaeroben Bakterien;- Ni mit S-Liganden;

- in methanogenenBakterien ( Thauer, M'arburg );- Ni-Tetrapyrrol-Komplex (lll) als prosthetische Gruppe.

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Nickel ist sowohl in der Lithosphäre als auch als gelöstes Nickel im Meerwasserausreichendvorhanden. Als Folge dessen treten natürliche Nickel-Mangelerscheinungen kaum auch, was auch indem geringen Bedarf an Nickel als Uttraspurenelement begründet ist ( 10mg Ni pro 70kgKörpergewicht). Daß selbst der Nickel-Gehalt in Edelstahl ausreicht, um von Mikroorganismenmobilisiert zu werden, hat der Klärschlammversuch von Thauer eindeutig bewiesen.Für die ziemlich verbreiteten Allergien gegen Nickel sind Ni(lI)-spezifische Antikörper verantwortlich.Nickel als Bestandteil von Meteoriten aus dem Weltall soll laut einer "exotischen" Hypothese für dasAussterben der Dinosaurier und vieler anderer Lebewesen am Ende der Kreidezeit verantwortlichsein. Das damalige Massenaussterben soll auf globale Nickel-Vergiftungen zurückzuführensein.

Bei der Urease handelt es sich um ein historisch sehr interessantes Enzym: es ist das erste Enzym,das in reiner, kristalliner Fonn dargestellt wurde ( 1926), sein Ni-Gehalt wurde jedoch erst 1975festgestellt. Von den Ureasen sind zwar die Aminosäuresequenzen bekannt, im Bezug auf dasNickelion im reaktiven Zentrum sind jeoch nur sehr wenige Infonnationen bekannt:- es handelt sich um ein Holoenzym aus 6 Untereinheiten;- jede Untereinheit enthält wahrscheinlich zwei benachbarte Nickelionen;- in der ersten Koordinationssphäre des Nickels sind wahrscheinlich nur 0- und N-Liganden;- Ni(lI) ist wahrscheinlich fünffach koordiniert.

In Besitz des Enzyms Urease sind Bakterien und Pflanzen, die sich durch dessen Katalyse Harnstoffals Stickstoffquelle verfügbar machen. Durch die Bakterien-Enzymez.B. wird der gesamte Harnstoffzu Ammonium oder Ammoniak gespalten - die Anwesenheit dieser Bakterien in Schweine- oderPferdeställen verursacht den typischen dortigen Gestank. An die durch Ammoniak bzw. Ammoniumentstehenden erhöhten pH-Werte von 9-10 sind die Bakterien natür1ich angepaßt.

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Harnstoff ist ein sehr stabiles Molekül, das unkatalysiert mit 3,6 Jahren HalbYiertszeit bei 38°C zuIsocyansäure und Ammoniak hydrolysiert:

H2N-CO-NH2 + H20 ~==~ NH3 + H20 + H-N=C=O

Durch die Enzymkatalyse mit Urease wird die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor von ca. 1014

(!) erhöht! Dieser Effekt ist erkJärbar durch eine Änderung im Reaktionsmechanismus:- unkatalysiert erfolgt eine direkte Eliminierung von NH3,

- mit Enzym entsteht zunächst Carbaminat H2N-COO· als erstes Zwischenprodukt.

H2N-CO-NH2 + H20 ~==~ [H2N-COO- + NH..+] ==== 2NH3 + CO2

Dies wird wahrscheinlich durch die Metall-Substrat-Bindung erteichtert.

/--.., Harnstoffspaltunq durch Urease

Chemikalien: HarnstoffUrease

( 1%-ige lösung)( 20mg in 10ml aq dest )

Durchführung:

Emebnis:

Unkatalysier1:Im Reagenzglas wird eine Spatelspitze Harnstoff mit der Bunsenflammeerhitzt.Vor die Reagenzglasöffnung wird ein feuchtes Indikatorpapiergehalten.

Katalysiert:In einem Becherglas auf einem Magnetrührer werden 20ml derHamstofflösung vorgelegt, die Doppelelektrode einesLeitfähigkeitmeßgerätes wird eingetaucht, danach werden 1-2ml derUreaselösung zugetropft.

Unkatalysief1:Das feuchte Indikatorpapier färbt sich blau:

H2N-Co-N~ + H20NH3 + H20

~==~ 2NH3 + CO2~==~ NH4+ + OH-

Katalysiert:Elektrophiler Angriff eines Ni(II)-Zentrums am Carbonyl-Sauerstoff,nucleophiler Angriff einer Ni(II)-hydroxo-Spezies am Carbonyl-Kohlenstoff:push-pull-Mechanismus.

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111. Biomineralisation •

Konstruktion biologischer Hochleistungsmaterialien

Die Biomineralisation ist ein Prozeß, bei dem lebende Organismen Minerale herstellen, dieauskristallisieren und zu Hartteilen zusammengefügt werden. Die Bildung der Minerale erfolgt immeraus zwei unterschiedlichen Komponenten: einem organischen und einem anorganischen Anteil (s.u.).

Biologische Mineralisation kommt in Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren vor, so entstehen z.B,Knochen, Zähne, Schnecken- und Muschelschalen, Perlen, Korallen, Seeigelstachein u.v.m.Die Hauptfunktionen der Biominerale sind:

- mechanische Stützfunktion,- Speicherfunktion,- Entgiftung,- Schutz,- Werkzeug- und Waffenfunktion,- Gleichgewichtssensoren,

z.8. Knochen;z.8. Knochen;z.8. Knochen, Eischaie;z.8. Ei- und Muschelschale, Gehäuse von Einzellern;z.B. Zähne;z.B, Statolithen in Labyrinthorganen.

Bei den Biomineralen, z.B. den Knochen und Zähnen, handelt es sich nicht um statischeAblagerungen, sie sind vielmehr in einem ständigen Auf.. und Abbauprozeß verwickelt. So müssenschwangere Frauen z.8. auf eine ausreichende Ca-Versorgung achten, da sonst der Embryo derMutter so viel Ca entzieht, daß ihre Knochen und Zähne abgebaut werden, was z.B. zu einemerhöhten Kariesrisiko führt. Daß ein ständiger Auf- und Abbauprozeß vor1iegt, kann in einemSelbstversuch erfahren werden: ißt man eine Zitrone, so wird die Oberfläche der Zähne stumpf. Nacheinigen Stunden ist so jedoch wieder glatt.

Eine gestörte Biomineralisation oder gar Demineralisation führt z.8. zur Osteoporose ( Knochenresorption ), Rhachitis ( ungenügende Mineralisation) oderzu Karies. Pathologische Biomineralisate

~. umfassen z.B. Nieren- oder Gallensteine, auch Gefäßablagerungen (Arteriosklerose) hat ihrenUrsprung in der Biomineralisation.

Die Kenntnis frühester Lebensfonnen beruht ausschließlich auf bioanorganischen Fossilien. Siekönnen in ihren Gesamtmengen riesige Ausmaße haben: Korallenriffe, Inseln, sogar ganzeGebirgszüge können rein aus biogenem anorganischen Material bestehen. Außerdem wurde durchdie Bildung anorganischer Carbonate durch biologische Organismen der Treibhauseffekt der Frühzeitzurückgedrängt.

So läßt sich erkennen, daß die Biomineralisation ein hochgradig interdisziplinäres Forschungsgebietist, das Bereiche wie Biologie, Mineralogie, Kristallographie, Paläontologie, Geologie, Chemie,Medizin, Pharmazie, Materialwissenschaften u.v.m. betrifft.


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Die wichtigsten Biominerale

Chemische Zusammensetzung Mineralische Vorkommen und FunktionErscheinungsform

Calciumcarbonat CaC03 Calcit Exoskelette (Eier-, Muschel-, Schnecken-Aragonit schalen, Korallen, SeeigeL ..)Vaterit Stacheln ( Einzeller)

amorph Schwe rkraftsensoren

Calciumphosphat Ca10(OH)2(P04)2 Hydroxylapatit Endoskelette (Wirbeltierknochen,Ca10F2(P04)e Fluorapatit Wirbeltierzähne )

Calciumoxalate Ca~04 (x nH2O) Whewellit Ca-Speicher u. Fraßschutz bei Pflanzen( n= 1,2 ) Weddelit Ham-, und Nierensteine

Metallsulfate CaS04x 2H20 Gips Schwerkraftsensorerso, Cölestin Stützgerüste ( Einzeller)BaS04 Baryt Schwerkraftsensor

Kieselsäure Si02 x nH20 amorph DiatomeenschaienRadiolarenschalenSchutzmechanismen ( Gräser, SChachtel-

halme)

Eisenoxide Fe304 Magnetit Magnetsensor, Käferschnecken-"zähne-a,ß - Fe(O)OH Goethit, "Schneckenzähne" auf Radula

"5Fe203 x 9H2O" LepidodrokitFerrihydrit "Schneckenzähne", Fe-Speicher

Biominerale liegen wie schon erwähnt als Verbundstruktur anorganischer und organischer Materialienvor. Zu den organischen Bausteinen gehören u.a. Glycoproteine, Mucopolysaccharide und Lipide. Diewichtigsten anorganischen Elemente sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die beiden Komponenten erfüllenin Bezug auf die Eigenschaften des Biominerals unterschiedliche Aufgaben:

- anorganische Bestandteile: -> Härte,-> Druckfestigkeit,

- organische Bestandteile: -> Elastizität,-> Zug-, Biege-, Bruchfestigkeit.

Für die Mechanismen der Biomineralisation gibt es zwei unterschiedliche Hypothesen:

Matrizen - Hypothese

~ organische Matrix als Substratbzw. als dirigierende Matrize

• Keimbildung und -wachstumerfolgt dann auf der Oberflächeder organischen Untenage

- die Matrize dirigiert durch ihreStruktur die Art, Form und Größeder aufgelagerten Kristalle

Kompartiment - Hypothese

- organische Substanz als Begrenzungfür Hohlraum, in dem sich Kristalle bilden

- eine reaktive Matrize ist nicht vorhanden

- der Hohlraum bzw. die organischeHülle prägen den Kristall-Habitus

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1. Calciumphosphat I Hydroxylapatit in Wirbeltierknochen

Knochen als Stützgerüste von Wirbeltierkörpem sind nicht alle gleich aufgebaut: das unterschiedlicheVerhältnis von anorganischen zu organischem Material ermöglicht eine große Variationsbreite dermechanischen Eigenschaften.. Der Anteil der anorganischen Substanzen beeinflußt die Härte desKnochens und der Anteil der organischen Substanzen die Bruchfestigkeit.

Die Forschung an Biokeramiken als Knochenersatzmaterial in der Medizin zeigen, wie perfektKnochen gebaut und abgestimmt sind: dazu bei trägt außer dem Bau aus den zwei verschiedenenKomponenten der makroskopische Bau mit Knochenbälkchen ete. und die Leichtbauweise desKnochens. Die Tragfähigkeit des Oberschenkelknochens beträgt z.B. 1650kg!!!

Unübertroffen in Materialhärte und Haltbarkeit in der Biologie ist der Zahnschmelz, der zellfrei ist undzu 80-90% aus Hydroxylapatit besteht. Die Kristalle sind im Zahnschmelz größer als im Knochen, esbilden sich lange, hochorientierte scnmelzpnsmen. Eine Regeneration des Schmelzes ist jedochanders als im Knochen nicht möglich, da der Zahnschmelz zellfrei ist. Problematisch ist deswegen dieKariesbildung, da der Karies von alleine nicht mehr heilen kann. Welche Rolle das Fluorid in derKariesprophylaxe spielt, ist noch umstritten: sicher ist, daß Fluoroapatit gebildet wird. Ob dieser dannaber zur Härtung, zur verbesserten Remineralisation oder zur Desaktivierung der Kariesenzymebeiträgt, ist noch nicht bekannt.


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Die Hauptfunktionen des Knochens sind:- Stütze für Wirbeltierkörper; /- Speicherort l.B. für Ca2+;- Depot für SChwermetatlionen, Cd2+ und Pt>2+ können anstatt Ca2+ in den anorganischen

Teil eingebaut werden, Folgen davon sind:- Veränderungen der Knochenstruktur,- schlechtere mechanische Eigenschaften des Knochens,- schmerzhafte Knochendeformationen.

Die Interzellularsubstanz des Knochens ist zusammengesetzt aus:- 500/0 Mineralien: 50% P043- , 35% Ca2+, Rest: Citrat als Bindemittel,

C032-, N03-tP, Na", Mg2+;

- 25°k organische Substanzen: 90-95% Kollagen, Rest: verschiedene Proteine;- 250/0 Hydrationswasser: um Apatit-Kristalle herum, für Ca2+-Austausch wichtig.

Der menschliche Körper enthält durchschnittlich 1050g Ca2+ , davon sind 99% im Knochen lokalisiert!

Im Knochen liegt kein amorphes Calciumphosphat vor, sondern das Calcium wird in regelmäßigenund der Kristallstruktur entsprechenden Abständen an Phosphatgruppen gebunden. DiesePhosphatgruppen befinden sich an Proteinen der organischen Kollagenmatrix desKnochens.

Die Bildung der Calciumphosphatkristalle beginnt schon in von Osteoblasten abgeschnürtenVesikeln. Nach dem Platzen der Vesikellagem sich die Kristalle an die Kollagenfibrillen an undwerden in nadelfönnige, hexagonale Hydroxylapatitkristalle umgewandelt. Es kommt schließlich zuintrafibrillären Mineralkristallen innerhalb der Kollagenfibrillen und zu interfibrillären Mineralkristallenzwischen den einzelnen Koflagenfibrillen.

a) Entfetten der Knochen:

Chemikalien: Klei ntierknochenKaliumhydroxid ( 5°k-ige Lösung)

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Durchführung:

Ergebnis:

Kleintierknochen ( am besten Hase oder Hühnchen, klappt auch mit schongebratenen Knochen von "Halben Hähnchen" ) werden von Fleisch und Hautgesäubert. In ca. 500mI5%-iger KOH - Lsg. werden sie 1Q-15min gekocht,dann in Wasser gut ausgewaschen und im Wärmeschrank bei 105°C 4050min getrocknet. Die poröse Knochensubstanz wird vom noch vorhandenenKnochenmark abgeschabt und für die folgenden Nachweise am bestenzennörsert.

Das noch am Knochen befindliche Fett und der Knorpel werden herausgelöst.ebenso Teile des Knochenmarks. Auch durch Einlegen der Knochen in Ether,Trichlonnethan, Tetrachlonnethan oder Benzin können die Knochen entfettetwerden. .

b) Phosphat - Nachweis im Knochen:

Chemikalien: entfettete KnochenSalpetersäureAmmoniumheptamolybdat

( 5%-ig )( 1O%-ige Lösung )

Durchführung: Entfettetes und zermörsertes Knochenpulver wird im Reagenzglas oder imEf1enmeyerkolben mit 5%-iger Salpetersäure übergossen und 5min lang imWasserbad erwännt. Die Lösung wird abflltrtert, und zu dem Filtrat wirdAmmoniummolybdat-Lösung gegeben. Danach muß im Wasserbad wiedererwärmt werden.


Ergebnis: Nach dem Erwärmen fällt ein gelber Niederschlag von Ammonium-12Molybdatophosphat aus:

a12 (NH~6Mo702~ + 7 H3P04 + 21HN03 i====~

Ammonium- 7 (NH4)3[P(M01204)] ~ + 51 NH..N03 + 36 H20heptamolybdat Ammonium-12_

gelb

Es findet eine Lewis-Säure-Base Reaktion statt zwischen dem Phophat desKnochens als Base und dem "Mo03" als Säure.

cl Calcium - Nachweis im Knochen:

Chemikalien: entfettete KnochenSalzsäureAmmoniakEssigsäureAmmoniumoxalat

(5%-ig)( 25%-ige Lösung)(verdünnt)( 3%-ige Lösung )

Durchführung:

Ergebnis:

Die entfetteten und zermörserten Knochen werden im Reagenzglas oder imErlenmeyerkolben mit 5%-iger Salzsäure übergossen, nach Smin wird dieLösung abfiltriert. Das Filtrat wird mit 25°A»-iger Ammoniaklösung schwachalkalisch gemacht, danach mit verdünnter Essigsäure wieder leichtangesäuert. Es wird nochmals abfiltriert. Zu dem letzten Filtrat werden einigeTropfen einer 3%-igen Ammoniumoxalatlösung zugegeben.

Bei Zugabe der Oxalatlösung bildet sich ein weißer Niederschlag vonCalciumoxalat:

ca2+8q + 2NH~+ + ~042- f==~ CaC204 ~ + 2NH4+ + aqweiß

2. Calciumcarbonat in Eierschalen

,,-......! Eischalen sind aus drei Teilen aufgebaut ( Aufzählung von außen nach innen ):

- Tegment (Cuticula):

- Biokristallitschicht:

- Eischalenhaut:

Das Tegment besteht im wesentlichen aus Glycoproteinen und ist ander Calcifizierung nicht beteiligt. Bei frischgelegten Eiern fluoresziertdas Tegment rötlich.

In dieser Schicht ist der Kalk enthaften, der die Härte der Eischaleausmacht.

Die Eischalenhaut bildet die organische Matrix, auf der derMineralisationsprozeß des Kalks beginnt. Calcium undHydrogencarbonat werden hier - nicht direkt von der Eischalenhaut,aber durch ihr aufgelagerte unlösliche Membranen - gebunden undder Kristallisationsprozeß beginnt.Die biologische Funktion der Eischalenhaut besteht in einerFilterwirkung für Mikroorganismen.

Die Schalen der Eier sind nicht nur bei Vögeln mit Kalk verstärkt, auch einige Reptilien, Kloakentiereoder Schnecken verstärken ihre Eischalen mit Calciumcarbonat. Die Einlagerung von Kalk in dieEischalen war beim Übergang des Lebens an Land sehr wichtig für die Vennehrung der Tiere, wennsie nicht immer an das Wasser gebunden sein wollten - wie z.B. bei Amphibien, die Eier ohneKalkschaJe legen, diese dann aber im Wasser deponieren müssen.


Interessant ist auch die Entstehung der CalciflZierung, also wie die Organismen begannen, diehärtende Wirkung des Kalkes auszunutzen. Calcium ist ein sehr wichtiges Ion für alle Zellen, das fürsehr viele physiologische Prozesse innerhalb der Zellen benötigt wird ( z.B. im Muskel - Kontraktionhängt mit Ausschüttung von Calcium zusammen ). Da es für so viele physiologische Prozesse eineso große Rolle spielt, muß die Calcium-Konzentration im Zellinneren immer auf das genauestestimmen, der intrazelluläre Calciumspiegel muß streng reguliert werden.Steigt die Calciumkonzentration an, so müssen die überflüssigen Ionen eliminiert und unwirksamgemacht werden. Dies wird im Organismus z.B. dadurch erreicht, daß sie in unlösliche Substanzenüberführt werden, die dann intra- oder extrazellulär abgelagertwerden. Es wird also vermutet, daß essich bei der Bildung von Calcium-haltigen Kristallen primär um einen Entgiftungsprozeß handelte.sekundär wurde dann erst die Schutzwirkung der harten Kristalle entdeckt und in der Evolutionverbessert und gezielt eingesetzt, wie z.B. bei der Eischale.

Die Funktionen der Eierschaien sind hauptsächlich:- Schutz vor mechanischen Einflüssen, z.B. beim Bebrüten;- Ennöglichen des Gas- und Wasseraustauschs durch Poren in der Schale;- Schutz vor Vertrocknung des Embryos, v.a. in ariden Gebieten wie der Wüste;- Ennöglichen des Austausches von Wänne beim Brüten, besonderswichtig für Pinguineier

im Eis';/~ - Calcium-Reservoir für die Skelettbildung des Embryos.

Als Calcium-Speicher kann die Eischale deshalb genutzt werden, da das schon besprochene EnzymCarboanhydrase (s. 11,2) in der organischen Matrix der Schale vorkommt. Die Eischale wird lokaldurch das Enzym wieder aufgelöst, so daß Calcium für den Embryo verfügbar wird. Diese Auflösungkann sogar makroskopisch gesehen werden: bei bebrüteten Eiern sind sog. Resorptionskratersichtbar.

Die Carboanhydrase dient aber nicht nur dem Wiederauflösen der Schale, sie trägt auch zumEntstehen der Schale bei: wahrscheinlich ist sie für die Erzeugung Hydrogencarbonat-übersättigterLösungen erforderlich und ennöglicht so ein raschesWachstum der Schale.

a) Entkalken von Eiern:

I Chemikalien: EierEssigsäureBariumhydroxid

(verdünnt )( frisch abfiltrierte Aufschlämmung )

Durchführung:

Ergebnis:

Ein Ei wird in ein Becherglasgelegt und mit verdünnter Essigsäureübergossen. Das entstehende Gas kann mit Barytwasser identifiziert werden.

Es beginnt sofort KohlendioxidentwickJung. das Gas bildet mit Barytwassereinen weißen Niederschlag. Es kann jedoch auch beobachtet werden, daßnicht die ganze Eischale ausauflösbarem Calciumcarbonat besteht, esentstehen immer wieder unlösliche Teile: die organische Matrix derEierschaie. Nach einigen Stunden ist der kalkhaltigen Teil der Schalevollständig aufgelöst, übrig bleibt das Ei, das nur noch von der organischenEischalenhaut umgeben ist.

C02aq + Ca2+ + 8a2+ + 20H- ~==~ CaC03 ~ + BaC03 , + H20vveiß vveiß


b) Nachweis von Calciumcarbonat in Eierschalen :

Chemikalien: EierschaienSalzsäureBariumhydroxidOctanol

I( halbkonzentriert )( frisch abfiltrierte Aufschlämmung )

Durchführung:

Ergebnis:

Von den Eierschaien von rohen Eiern wird die Eischalenhaut entfernt, damitmöglichst wenig organischesMaterial in die Reaktion miteinbezogen wird. DieSchalen werden dann im Mörser zerkleinert und in einen Dreihalsrundkolbengegeben.Eine seitliche Öffnung des Kolbens wird mit einem Stopfen verschlossen, auf~ie mittlere Öffnung wird ein Tropftrichter mit Druckausgleich montiert undauf die zweite seitliche Öffnung wird ein Übergangsstück montiert, das miteiner Gaswaschflascheverbunden wird.Auf die zermörserten Eierschaien im Kolben werden einige Tropfen Octanolgegeben, damit die Proteine, die in der organischen Matrix der Schalevorhanden sind, beim Denaturieren durch die Säure nicht so sehr schäumen.In den Tropftrichter wird die Salzsäure eingefül" und in die Waschflasche dasBarytwasser. Dann wird die Salzsäure auf die Eierschaien getropft, dasentstehende Gas ins Barytwassereingeleitet.

Die Säure löst das Calciumcarbonatder Eierschalen, das entstehendeKohlendioxid färbt durch Entstehungvon Barium- und Calciumcarbonat dasBarytwasser weiß ( Reaktionsgleichung siehe oben ).

3. Die Natur selbst ist der Versuchsleiter:Ausstellung von Biomineralen - Hydroxylapatit und Calciumcarbonat

Hydroxvlaoatit:

Calciumcarbonat:

aufgeschnittenes, entfettetes RöhrenknochenpräparatWeisheitszahnKJeintierschädel

lebende Seesterne, Seeigel und MiesmuschelnSchnecken- und MuschelschalenKorallenskelett


Literatur

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- Urbach I Rupp I Stunn: Expeimente zur Stoffwechselphysiologie der PflanzenBotanisches Institut der Universität Würzburg 8.240; 1.Teil

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- Schlegel: Allgemeine MikrobiologieThieme-Ver1ag, 1992

-- J.:~--Chemie in der Schule: www.chids.de

- Praxis der Naturwissenschaften - Chemie:• Braun: Portrait eines Biokatalysators: Carboanhydrase A- DiemanruWenck: Die bioanorganische Chemie des Eisens• Brüning: Enzymatische Versuche unter quantitativen Aspekten

für den arbeitsteiligen Gruppenunterricht

3/39; 19908/40; 1991

9/80

.: Chemie in unserer Zeit:- Vahrenkamp:• Mann:

- Lippert/Beck:

- Angewandte Chemie:- KrampitzlGraser:

Metalle in LebensprozessenBiomineralisation:Ein neuer Zweig der bioanorganischen ChemiePlatin-Komplexe in der Krebstherapie

Molekulare Mechanismen der Biomineralisationbei der Bildung von Kalkschaien

Nr.3, 1973

Nr.3, 1986Nr.6, 1983

100; 1988


Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · Metallzentrum Enzym Vorkommen,...

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