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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.

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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

\04 '

) )

Gliederung

" 01.. - Arn i nos ä ure n "

Protokoll vom 2(1.10.83

Andrea Sobotschinski

I.

11.

111.

IV.

V.

VI.

VII.

Einleitung

Aufbau und Struktur

1. Die Ninhydrin-Reaktion

Säure-Base-Verhalten

1. Bestimmung der pK-Werte von Glycin

2. Zuordnung dr r pK-u/erte

3. Bestim~ung des IEP von Glutamins~ure

4. Konsequenzen der Zwitterionstruktur

Oe-Chromatographie

1. Oie Hydrolyse

2. Die Oansylierung

3. Die 20 natürlichen Aminosäuren

4. Die Aminosäuren im Menschenhaar

Konformation

1. Die Peptidbindung

1.1. Modellversuch zur PrimärstruktuL

1.2. Die 8iuret-Reaktion, Nachweis der Peptidbindung

2. Die Wasserstoffbrückenbindung

2.1. Die Wasserwelle, Versuch zur Sekundärstruktur

2.2. Die oe Helix

3. Die Oisulfidbrücken

3.1. Bildung der Oisulfidbrücken

3.2. Die Dauerwelle, Versuch zur Tertiärstruktur

3 • 3 • Ana 1 y 5 e der hle 11 f 1 ü55 i 9ke i t u nd des Fix i e r e r 5

Literatur

Chemie in der Schule: www.chids.de

I. ,) )- 3 - - 4 -

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R.-c..... l-f

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0::tp-CGo IQI(:)

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COQH,l!N=C

I

e

X..- r;l- J-,·-o~cL",.t..../

/ ~

und der noch weitere funktionelle Gruppen tragen kann. Dem

nach ist das ~-C-Atom chiral gebaut, die Verbindung optisch

aktiv. Fast alle in den Proteinen vorkommenden Aminosäuren

gehören der L-Reihe an, dh. die Aminogruppe steht in der

Fischer-Projektion auf der linken Seite, der Drehsinn ist

aber unabhängig von der Zugehörigkeit einer sterischen Reihe.

( A.... t'\"t. T s. ~W\"'c..~ )

ll~_1~-2~~_~!~~xEE~~=~~~~!~E~

Alle Aminosäuren mit einer frp.ien ~-Aminogruppe gehen die

Ninhydrin-Reaktion ein.( Reaktion ist negativ bei Prolin ).

Bei Anwesenheit von Aminosäuren färbt sich die Lösung blau

violett, nebenbei entweicht CO2 •

Versuchs durchführung :Geräte: Becherglas 25 ml, 1ml-Spritze, Bunsenbrenner, Zange.Zu 15ml einer 1% Glycihlösung gibt man 1ml Ninhydrinlösung(gesättigt) und erhitzt zum Sieden, das entweichende Gas kannevtl. in Ba(OH)2 zur Identifizierung geleitet werden.

Reak tionsgl eichung V ~'. CL, n'.s -k~ ~ J...9 G

(QOH,lltJ - c~,

I

«.

coo.,I

~ -7-8R. I ...

'])... Pt I-'\.ll ~.\ o S fLl.t .(.

oe-hf.!",,) nl., ~·v

c o e ~,

(11 ~\ t~-c-~,

R.L - ~'--:"'O_~Q..k'-C

01') i,'sch a("i1' ,-;"

COOHI

~, N - c - ".~ I

#f

opt;s.c~ ; ~l(;.khv

1) Karlson 5.27

._5 ie re n.

Aminosäuren besitzen Trivialnamen, die mit den ersten drei

Buchstaben qbgekürzt werden, der einfachste Vertreter ist

das Glycin.

J. Einlei~

~-Aminosäuren sind die Grundbausteine der Eiweiße, deren

Struktur und Funktion durch die Aminosäure-Sequenz festge

legt wird. Die Sequenz wird von der DNA codiert, ist also

genetisch fixiert. Als die häufigsten Biomoleküle machen

Proteine mehr als 50% des Trockengewichtes einer Zelle aus.

Zu den Aminosäuren,die nicht in Proteinen vorkommen, gehören

das ß-Alanin, pine Vorstufe der Panthothensäure, ein Vitamin

des 82-Ko~plexes, sowie die ~·Aminobuttersäure, die in freier

Form im Gehirn zu finden ist. 1 )

In meinem Vortrag möchte ich mich auf die ~-Aminosäuren b8

schränken, die allein befähigt sind, zu Proteinen zu polymeri-

Bei allen anderen Aminosäuren steht am '!-C-Atom ein kohlen

stoffhaitiger Rest, der aliphatisch oder aromatisch sein kann

11. Aufbau und Struktur

~J i e der fJarne sag t, be s i t zen all e Aminosä ure n i n eine m Mol e kü1

zwei charakteristische funktionelle Gruppen, die Aminogruppe

-NH2 und die Carboxylgruppe -COOH.

Beide stehen am selben C-Atom, also in ~-Stellung. Alle tl-


)

- 5 -- 6 -

ion liegt die Aminosäure vor, wenn der pK1-Wert der Carboxyl

gruppe zugeordnet wird.

coo G

GJtH51J -c. f-1

I

R-

V\tAA-t""t a..f klc. ,: ~'"

__ H fCOO-

'2,

:-:::: .,..'Jj-C-H

+ H'" ~ ,• Rpt< 2.

c..OOHI

~IJ-CH,(

Betain enthält ein quatäres Stickstoffatom, das immer positiv

geladen sein muß, also im neutralen Bereich als Zwitterion

vorliegt. Es erscheint wahrscheinlicher, da! auch die AS

als Zwitterion vorliegt.Um dies zu Ilb e r p r ü f e n ~,:ll zunächst eine Titrationskur"E '1C'"

GI yc in aufge nommme n werden, d ie pK-~t1erte bes t immt und anse hl ie

ßend zugeordordnet werden.

Ltk1t.l~dll.-\ 2",~ 11e-ll0~

Di~ lwitterionstruktur ist v~~~l~ichbar mit der Struktur des

Oetains (N-Trimethylglycin), das in der Melasse der Zucker

rübe, Beta vulgaris entdeckt wurde.

L~',Uty:o~ 0 ~c.~4.:"'" rr ,C.I C 00\'::/

C.OO~\ ,Cf) , CJ'.s <, ID IH -P-CH CH5~IJ-Cti~ /' I CH,3 ,/' )

~ ~

C.OOH

EU'~AJ-C.-H~ ,

R

In der vereinfachten Reaktionsgleichung wird das Reagenz

Ninhydrin (Triketohydrinden) durch die ~-Aminosäure teilwei

se reduziert (in den entsprechenden Alkohol Pberführt), dabei

geht die Aminosäure in die intermediär gebildete ~·Iminosäure

über. Nach Hydrolyse und Decarboxylierung wird das entsprech

ende Aldehyd gebildet. Der freigesetzte NH 3 liefert mit dem

red. rJinhydrin (Hydindantin) und dem noeh nicht umgesetzten

Ninhydrin einen violetten Farbstoff.

Ich verzichtete auf den Nachweis von CO 2, da dieser langwieri

ger verläuft. (Anm. U. s , Anhanl;"J

III. Säure-Base-Verhalten

Die Säure-Base-Wirkung der Aminosäuren wird durch ihre bi

funktionelle Eigenschaft, bas~sche Aminogruppe und saure

Carboxylgruppe, bestimmt; man bezeichnet sie daher auch a~

Ampholyte.

Im stark sauren Medium liegt die Aminosäure vollständig pro

toniert vor, das Gesamtmolekül erscheint nach außen als

Kation.

In dieser Form stellt die Aminosäure eine zweifache Broen

stedt- SHure dar, die zur vollständigen Titration zwei Äqui

valente Lauge benötigt, nach dieser liegt die Aminosäure im

alkalischen als Anion vor. Folglich erhält man 2 Dissoziati

onskonstanten und zwei pK-Werte; daraus kann sich vor allem

beim SchUler folgendes Problem stellen:

- die ZuorJnung der pK-Werte zu der entspr~chenden funktio

nellen Gru~pe,

- das Str~kturproblem geladen oder un~eladen im neutralen Ge

reich.

uJe n n d nr n Ledr i9 e re pl<-Wer t der Aminogr uppe z uz uordne n wä re,

so verliert diese bei der Titration zunächst ihr Proton, das

f"1olckül uiä r a im neutralen pH-Bereich unq eLa de n , Als Zwitter-


)

- 7 - - 8 -

.L. , pK, A pK 11~ BetainGlycin

,....

AD, S pK2 "'" pK S,'i Glycinethylester'"

Der pK der 8etainlsg. nähert sich dem pK1 ' der von GlycinethYl-

Versuchsdurchführung :Geräte: 2 Büretten 25ml, 2 Rührer mit Rührfischen, 2 Enghalserlenmeyer, 100 ml.Es wird das Vecfahreh der Halbneutralisation angewendet.Zu 50ml O,1M wäßriger 8etainlsg werden 25ml O,1~ Naoh gegebenund der pH-gemessen.Zu 50ml O,1M Glycinethylesterlsg werden ebenfalls 25ml NaOHgegeben und erneut der pH-Gemessen.

!l~~~~_~~~E~~~~~_~~E_E~:~~E~~

Um die pK-Werte zuzuordnen, werden diese mit den pK-Werten

entsprechender Substanzen bei denen eine der funktionellen

Gruppe blockiert ist, vergli~hen.

Im Betain ist die Aminogruppe methyliert, im Glycinethylester

die Carboxylgruppe verestert.

COOe

I

C it fl~ 0 -,~ ~

Die pI( -lV e r te hJerdendur c h die Wende pu nktede r T i t rat ions kurve

gekennzeichnet. Im pH-8ereich um die pK-Werte zeigen bifunkti

onelle Aminosäuren wie Glycin Pufferwirkung, im physiologi

schen Oereich dagegen nicht~ nur Histidin.

Zur genauen Ermittlung der pK-Werte einer neutralen Amino

s~ure kann man ein anderes Verfahren anwenden, die Halbneu

tralisation, diese beruht auf der Anwendung der Henderson

Hasselbalch'schen Gleichung

Bei Halbneutralisation liegen 50% Säure und 50% [auge vor,

der Bruch A-/IIA uri r d zu 1, da der log = 0 ist, wird pH = pK.

Die pK-uJerte sind bei 50ml AS-Vorgabe demnach bei 25ml und

75 ml Laugenzugabe zu suchen.

11l~-2~_~~~!i~~~~~_~~E_r~=~~E~~_~E~_~!~E2~

[;r~rätc: St.t1t iV'Jlateriul, 28üretten, Hührer mit Rührfischen,p H- F. 1 f2 k t rod (?, (J i g i t al - p 11-Met e r 1 2 5 0m1 Eng hal s be c her 9 1 a s •5 (J rn1 p i ne r f1, 1 r~l G1 y c i n1 Ci 5 U n9 ~ MM 75) i n 0, 1M Hel soll e n mitt I'Um l [1,11'1 NaCHt in l nt.c r v a Ll e n t i t r i c r t werden. Folgende Int e r v oLl e prtlli~scn s i c n faus Vorversuchen)als geeignet:(1, 1:', 25, 1.. rl, 14 5, 5 Cl, SS, 60, 75, 90, 1 0 Dm 1 Na0 H.Die Aminos~ure liegt vor der Titration vollständig protoniertvor.

ester dem pK2•Das bedeutet, daß bei der Titration mit NaOH zunächst das Pro

ton der CarhDMyl;ruppe ebgeQ~be~.wird, die AS im Neutralen

als Zwitterion vorliegt, entsprechend der Retainstruktur.

COO~t COO8 c.eoe

0) , -'H~ (f) \ _ 4t t

~f ßJ _. C if ~ Hj

1..) - eH -----> }J ~f~ - c.u.3 I ~

~~--

• Hf •.. +I~ Ri

e: ~

~ (\h 0", l '-0: Hf. 't' :f.\". f1 ",,'0,,-,

1.{ (I


)

- 9 - - 10 -

Die Aminosäure löst sich aufgrund ihres amphctheren Charak

ters sowohl in Säure, wie auch in Lauge, dagegen in Wasser

nur unvollständig. Hier muß der IEP vorliegen und der PHI

kann somit ermittelt werden.

Es liegt folgendes Gleichgewicht vor

111~_~~_~~~~=9~~~~~~_~~E_~~l!!~Ei~~~!!~~!~E

Aminosäuren besitzen auch im kristallinenl Zustand überwiegend

Ionenstruktur, somit wirken zwischen den entgegengesetzt ge

ladenen Gruppen elektrostatische Wechselwirkung, daraus

rolgt

-Aminosäuren schmelzen nur unter Zersetzung bei zoooe

-Extrem niedriger Dampfdruck

-Geringe Löslichkeit in unpolaren Lösungsmitteln

-Hohe Dielektrizitätskonstante wäßriger AS-Lösungen.

(,000@ , pL(~

fl~ IJ - c ti e;===::::;. :#,C.~l 4, S,c.~t

Icoer"

coouCD I rL<"1f-i1J-C~ ~~~ I

C. ff 1-, olJ.

I

CHi.t

C.OO ~

,.. G@\.( ce&" (t)'" c P ~ ,,~ N '- C~ c;;- }J~ - Cf'l, ~ ,/, 5 '1 '

c~' C.ff/, L ,

C~ CU,l ,

~ C006

-F?1--Zunächst dissoziert die ol-Carboxylgruppe aufgrund ihrer höhere

Acidität, anschließend die zweite Carboxylgruppe. Die Summe

der negativen Te Ll Le dunq e n muß im IEP die positive Ladung der

Aminogruppe kompensieren, daraus folgt die theoretische Berechnung des pHI von :

\~-P-H-I-=-1-/-2-(-P-K-1-+-p-K

R-)--3-,-2-S-p-"r\.;-t·. ~1

Weitere funktionelle Gruppen beeinflussen die Laqe des IEP j

dies soll am Beispiel der Glutaminsäure gezeigt werden.

Versuchsdurchführung :Gr: r~i te : 3 9 r necll] e nz gl äser, 8ec hergl as 5 Om 1 t p~"f-El ek trode,3 r,lL! ß z y 1 in d r: r 25 rn 1In den 3 nc befinden sich je 29 Glutaminsäure, dazu werdenjeweils 25m12M Hel, Wasser und 2M NaOH gegeben. Es wird derpH von der wäßrigen Lösung gemessen.

djl~_~~_~~~!~~~~~2_~~~_lsE

Im IEP sind alle Ladungen des Moleküls intramolekular kom

P8nsiert, das Molekül erscheint nach außen hin neutral und

w~~ert somit im elektrischen Feld nicht. Da die L6slichkeit

am IEP minimal ist, kann der IEP demnach bestimmt werden.

Der pHI einer neutralen AS ist gleich dem arithmethrischen

Mittel der beiden pK-Werte •

.~ -: _p-t< A 2,+ r kz...

Der pHI für Glycin beträgt Q,Oe prkt. 6,55.

(Fehlerquelle, pH-Elektrode konnte nicht genau geeicht werden,

außerdem relativieren sich die ermittelten pK-Werte für

Glycin, da bc i de Itlerte um den gleichen Faktor zu hoch liegen)

Vergleicht man die Carboxylgruppe einer ~-Aminosäure

mit der en~snrechenden ~arbonsäure, so stellt man fest,

daß diese sß~rcr ist 215 die Carbonsäure.<f.ou";o ~

6"' \ ~l-\!> D - C ~ Ii - C ~, ,

Jf +'~f~Ct'v, pk~ 2,35 Ess~rtiLtre pU 4,7J('

Die hängt mit der induktivelektronenziehenden Wirkung

(-I-Effekt) des benachbarten positiv geladenen Stickstoffes

z usamme n • 0 e r pi< - Wer t des G1 yc i ne t hy1 e s te r s ist her a b9 es e t z t ,

weil das Sauerstoffatom der Carbonylgruppe elektronenziehend

bis in die protonierte Aminogruppe wirkt und die Abstoßung

des Protons von dieser begünstigt.


)

- 11 - - 12 -1 .

((,oUt

COOfl\ _l-lCt

fi~1J -C\i -~,-4-

f\r

HCI-Abspaltung zum Sulfonamid.Die DNS-AS werden mit einer selbstgezogenen Kapillare auf

Oe-Karten aufgetragen und zunächst in ein polares Fließmittel

gestellt, hier laufen vor allem die polaren Aminosäuren,

Arginin, Lysin und Serin •Da die Trennung nur unzureichend ist, wird um 9~o gedreht

und in ein unpolares Fließmittel gestellt. Es laufen die un

polaren Aminosäuren Prolin, Leuein und Isoleuein, Alanin.

Als Nebenprodukte der Dansylierung treten das intensiv blau

fluoreszL,erende Oansylsäure DNS-OH sowie das sehr zart-blau

fluoreszi~erende DNS-NH2 auf. Die DNS-AS fluoresziLeren gelb-

grün.

,S6 -IJH-CH

J., ,

J)~~s~1 - A~- Cl

Das Säurechlorid kondensiert mit der Aminogruppe der AS unter

IV.2. Die DansylierungDie Aminosäuren werden mit einem fluoreszL~~renden Farbstoff

umgesetzt und somit sichtbar gemacht.

Dansylchlorid ist 1~imethy~mino-5-~phthali~ulfonYlchlorid

Haare be s t e hn n aus ~-Ker tin (Griech. Keras = Horn) einem

Protein, das bei saurer Hydrolyse in ein Gemisch von Amino

der Reaktion liegt auf

()fJ elC!. J t

H, ~) / C ,,"", C'H --:>

.J "c" ~/ «.I 10 / '\ __ ,, c f~' CDcf

H

säuren zerfällt. Das Gleichgewicht

der SeitG der Endprodukte./:O\~ (Y ~ -~/,O

111 H I 't ~-

",. C. Ol + fll.O'>" ./ -, f'-)

~) coc>-==',ft

Unter Protonierung der Carbonylgruppe und nukleophi/lem An-

9 r i f f des ula s S Grs auf das se hr r e ak ti onsfä hige Carbenium ion,

sowie Umlagerung von Protonen wird die Peptidbindung gespalten.

Die Carboxylgruppe geht unter H+-Abspaltung in die stabilere

Form des Carboxylatanions über. Die Reaktion wird durch Säure

katalysiert.

Die auf diese Weise erhalteten Aminosäuren werden mit Dansyl- .

chlorid umgesetzt.

Iv. DC-Cbromatographie

Im n~chsten V~rsuch sollen die Aminosäuren der Haare mit Hil

fe der zweidimensionalen OC-Chromatographie nachgewiesen wer

den. Die einzelnen Arbeitsgänge sind dem Anhang zu entnehmen,

im Vortrag werden die entscheidenden Reaktionen beschrieben.(~Y'\y-.,. lU" s. l::>h ~IC\.'~ )


._~._-~.- ._._------)

- 13 -- 14 -

L-Glutamln(Clu·NH,oder Gin)

L-Mtthlonln(M")

eOOe• I

HsN-C-HI~Hz

~H2

CONH!

cooe• I

HsN-~-H

CH.I

HsC",C:CH,

l-ltucln(leu)

L-Prolin(Pro)

~reHtO

L-Valln(VII)

l-AsparlglnfAsp·NH,oderAsn)

l-Cysttln(tys)

eOOe

Hs:-~-HICH,IeONH.

~ toOe eoo9 COOe

HzN-~-HI • I

HaN-C-H H.N-~-H

~HI tHI CHI

!HII bCHZ NH2

tHI H2b b~$!HI~H,

......~/ "NHz."·lysln l-Ar'9ln1n ,,-HIstidin

flys) (A'1) fHls)

,~ .--

cooe• I

HJN-~-H

CHz

©L-Phenyt.llnln

fPhl)

L-Alanln(All)

L-Tyrosln(lyr)

L-Threonln(Thrt

COoe• I

H,N-f-H

~OH

cooe• I

HJN-~-H

H-C-OHICH,

L- Glut.m;.,slur.(Glu)

eooe• I

HsN-~-H

/C~CHz CH,

~HJ

L-Isoleuein(llet

GlykokollfGly)

eooe• I

HJN-~-H

CHz-OH

L-Serln(Ser)

COOe

• IH3N-~-H

0:}I

l-Aspareglnslur.(Asp)

Die Tabelle wurde geglied~rt nach

r - unpolarer Restn:. - polarereRestm- saure Aminosäuren (Glutaminsäure)~ _ basische Aminosäuren

3. Die 20 natürlichen Aminosnuren---------~--~-----------~-~-----~

TolkOI !4-10k}( .9

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X UU IIX

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7111ei Amirtn~;iuren o n t hn l tcn Schwefel, Cy s t o Ln und Methionin.( \.]./ ~i h r r~ n d der 1 n (h~ n t 1 f i z i e run g der ehr 0 ma t 0 g IJ a p h i ewe r denrlie Aminns~uren angekreuzt)

- 15 -

ß~_~~i~~~~~~~~_i~_~~~~~~~~~E~!

lur l11r~f1t.irili'~runq d i u ri t n Lne Vergleichs-Chromötogröphie

mit eine A~-Standardlösung.

Identifizierte Aminosäurcm :

Glycin (G1y), Alnnin (Al~), Leucin und Isoleuein (Leu,Ilc),

Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Glutaminsäure (Glu),

Arginin (Arg), Lysin (Ly s ) , Cystin , Prolin (Pro), Serin (Ser)

1\1 e t h ion i n (n'le t ) •

Wie anhand der folgenden Tabelle zu entnehmen ist, wurden im

Haar 3 weitere Aminosäuren nachgewiesen.

Das Z~hlenmaterial stammt von 1958, sicherlich wurden die

Nac~l\l1eisrnethoden verbessert, so daß die Tabelle unvollstän

dig ist, andererseits muß auf eine mögliche Fehlerquelle hin

gewiesen werden. Die Haare dUrfen nicht mit den Händen berührt

werden und ein vorheriges Waschen mit einem Haarschampoo ist

ebenso zu vermeiden, da die Schampoos als pflegende Substanzen

Protcino enthalten!

Da dieser Nac hure i s sehr empfindlich ist, ergeben sich genügend

Fehlerquellen!

c.~

:<

---::sG

u:::I:~

.5St'I:;G


@0 fl~"C I

/-, /Ct(

C~ 1J \, ,~(l.A tf

J- -17-

V. I<onforrnntion

1~_9~~_~~E~~~~i~~~~2

Jie biologische Redeutung cer ~-Aminosäuren beruht auf der

Fähigke:_t, Peptidbindungen auszubilden.

Eine AmL'roq r upp pe einer AS kann mi t der Carboxylgruppe der

anderen AS unter ul a s s e r e bs pa Lt urtq kondensieren. Das Gleich-

9 C hl ich t die s e r r< e akt ion 1 i e g tunte r ~i 0 r ma 1- Be d ingung we i t

auf der linken Seite; Energie wird notwendig, die im leben

den Organismus in Form von ATP une GTP zur Verfügung steht.

T~ der Chemie aktiviert man die Carboxylgruppe mit Halrngenen.

Oie Polymerisation kann weitergehen, da das entstandene Dimere

eine freie I\;nlnogruppe neben einer freien CarboxylgruPPß be

sitzt.

Die so entstandQncn Polymerisate unterteilt man in

-r-lligopept.ide ( 10 AS

- I ~ (J 1 y pep t .i cJ e 10-1 00 A5

-rroteine ) 100 AS

Der folgende ModellverSuch soll verdeutlichen, wie aus einzel

n~n Aminosilurcn durch die Peptidbindun~ eine lange Kette

- die rrim~rstruktur - entsteht.

l~!~-~~~~!!~~E~~~~-~~E_~E~~~E~!E~~~~E(Nylon-Syn~hese)

L~sung I : 8ml Sebacinstiurechlorid in SnOml CC1 4Lösung 11: 229 Hcxamethylendiamin und 4ng Na2C03 in 500ml H

20.

)

- 18 -

Geräte: SOml Becherglas, 2 Glasstäbe, Motorwinde, PinzetteZunächst wird die organische Lösung vorgeleg: und mit derwßßrigen Lösung überschi~htet. An der Gren~fläche entstehteine Haut, die man mi~ der Pinzette hochziehen kann und mitder Moto~winde aufspult. Der Faden ist deutlich sichtbar,wenn man Phenolphthaleinlsg zugibt.Sebacinsäurechlorid ist nur begrenzt haltbar in CC1 4• 0

Reaktionsgleichung : ~ ~he.t\ »<: /\. A r-: .I c.~#t>/C- \/V\/~ /'v'V'vV ..Cf0-'(/ V V V V LI t'tJ..N c.. LfJ

-- _~CI "-) - H c.,f{ D H 0, " I 11JJ , c C I.J c...t~'~/ VV'\c./ 'c~ <.»:Il ' I, I

o tI 0 Ji

Hier sind die Carboxylgruppen durch Chlorid aktiviert ,

die Carboxylgruppe der Sebacinsäure kondensiert unter Hel

äbspaltung mit der Aminogruppe von Hexamethylendiamin.

Esen t s te ht 6, 1 0 Ny1 0 n • (14 , , \ .., • \~- s. r~)" t 1f\ l \! )

l~~~_Q~~_~~~E~!:~=~~~l~~~_~~~~~~!~_~~E_E~E!l~ElDg~Dg

Da Nylon selbst in kochender KOH unlöslich ist wird die

8iuret-Reaktion mit Eiklarlsg durchgeführt. Ansetzen einer

Eiklarlsg.s. Anhang. Anm.

Versuchsdurchführung :Geräte: gr RG mit Eiklarlsg, Pipette, 10% C~S04-Ls9. 10% NaOHMan versetzt etwa 20ml-Eiklarlsg mit 20ml 10~ NaOH und gibtanschließend einige Tropfen 10% CuS04-Lsg hinzu. und schüttelt.

Bei Vorhandensein von mindestens 2 Peptidbindungen färbt sich

die Lösung violett, zwischenzeitig kann Cu-Albumin ausfallen.Albumin ist ein Hauptbestandteil des Eiklars (Protein) •

Cu-Ionen bilden mit NH2-Gruppen, die in Biuret und Proteinen

enthalten sind intensiv gefärbte Komplexe.

Der Narue Biuret kommt in Anlehnung an das beim Erhitzen von

Harnstoff unter Freisetzung von NH 3 ents~ehende Biuret.

J'A... Al - C 0 - 0 H.t 4- "'l 0 - c. 0 - IV ~'l -) t~ IJ - cO -- IJ f' -c o - Iv U.L

"B : u. .c. 1


J )

- 1 9 - - 20 -

Oe r Komp lex hat wahrschei~lich folgende S t r u k t u r : die Stick

stoffliganden liegen i n einer Ebene, 2 weitere Wassarmole küle

sin d in we i te re reE n t f e r n u ng gebunden, der Komp l e x liegt also

v e r z er rt okt ae d r is c h vor.

•o

IJ

C~

<, ~';,cI

0"

(",,:c. \..<(.+0-

E"'° 1- "Ic........JOh-H_C'" ~~ )

,e.'1AVMe ~Ol--\,a~ Sr(~·l r,.~ ....e (

b ;"",c.l~",*

um die Peptidbindung eingeschränkt ist und die Peptidgruppe

in einer Ebene angeordnet ist.

---_ .- - - _.--

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C- NI

Q. - Cl'

Ana l og d a zu hat de r Bi u r e t -K omplex mit Eiklar folge nde Struk-

tur "tO

Die R ~ n t ge n s t r uk t u ra n alys e zeigt, d aß der c- N Abstand geringer

ist al s be i d er e n t sp r e c he n de n Einfachbindung, s tatt 1,47 A

nur 1, 32 A. Es liegt Mes ome r i e s t ab i li t ä t v o r , dh. d ie Elek

tronen der Ca rbo ny lg r u p pe sind ü be r d ie Pe p t i d b i nd un g del o

kalis ie r t , s omi t er hält die c-N Bindung einen Doppelbindungs

charakter v on 4D7~ . Dara us fol gt, daß die freie Dre hbarkeit


J )

- 21 - - 22 -

bindung :

An den d- C-At omen, die die Seitenketten tragen, sind die Amid

ebenen frei dr ehb ar, di e Flexibilität der Pe p t i dk e t t e bleibt

g e w~ h rle is te t . Di es e Ta t s a c he ist für d ie Bi l d u ng von schrau

ben od e r f al t b l att art igen Strukturen von großer Bedeutung.

Die re p t i dg r u p pe sel bst ist relativ stabil, also keine rea k

tive Gr up pe , j e d och ka n n der Wa s s e r s t o f f der Iminogruppe mit

der Carbonylgru pp e in We c hs e l wi r k u ng tr et en und Wasserstoff

b rü c ken b i n d u ng a u s ~i l d e n . Die Wasserstoffbrückenbind ungen k ö n

l,e n i n te r m o lek u l a r : d a r a~ s r e s u l ti e r t die Faltbl-attst~~kt~,---

oder intramolekular, innerhalb einer Peptidkette, ausgebil

det werden.

~~!~_Q~~_~~~~~E~~!!~~_~~E~~~~_~~E_~~~~~~g!~!!~~~~!

Ei n e Haarsträ ne wird angefe uchtet und auf einen Lockenwickleraufgedreht, anschließend getrocknet und abgewic kelt, dasHaar ist gewellt.

Be i der Wa s s e r we l l e we rd e n IJla s s e r s t o f f b r ü c k enb i n ':- dungen

d urch Ko nk u r r e n z des Wa s s e r s gelöst. Be im Trock nen entsteh~n

der neuen Form entsprechende Wasserstoffbrücken.

Nach Pauling und Corey kom me n auf eine Windung der Peptidkette

3,7 Aminosäuren, das entspricht folgen der Was s e r s t o f f b r ü ck e n-O HI1 Icl1Jff-c.He-CO\~ -IJ-

R.

starren Pep tidbindung sind die Wi n d u ng e n nicht

sondern aus einzelnen geraden Strecken zusammenS.; l ..,/nl/r,• .,:.. d -:>..- .....~I : (I., 11"." l1h,1l"- .r"';,{/.I.

Aufgrund der

k r e i s f ö r mi g ,

ge s e t z t . -:!> ..

Die Ganghö he beträgt 5,44 A, so stehen sich immer die Carbo

nylgru pp a ~iner Peptidbindung und die Iminogruppc einer Pep

t idbindung der nächsten Wi n du ng g eg e nüber, der e r f o r d e r l i che

Abst and vor. 2,8 A für die Wasserstoffbrücke ~~~ damit gewähr

l evistet.

Oi e Hel ix k a n n li nks oder rer.htsg ängig s ein, l etztere ist bei

natü rlichen Proteinen stabiler,lda ~ e t t e n von [-AS.)

/ c: =0

ti-IJ'\ C--12./ ,~

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« -(l. -'c-

\c, '=- 0 IllHlliITm

/- 1.1

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- 23 - - 24 -

'r/o~o r~~llc.

~ - fA cf b-~'''' ( Fe..-tu pt'c-lc. ,'",,)

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8ei Dehnung des Haares werden die Helices gestreckt, schließ

lich erfolgt Umwandlung in die Faltblattstruktur dES ß-Keratins

Die elastische Rückstellung bewirken die überdehnten Disulfid

b rü c ke n , ( F\ \"l ~. 'YJl !:. )...~ ". ~.."\. (r J

wird durch die Disulfidbrücken gewährleistet. Es ist ein

Skleroprotein (Faserprotein) , das cl-Keratin entstanden_

~ S ~ e; .... o f<.Jre.-~ ITf -Ub'-"~F Ic «

(-1;( f~ 10J-l1!- lL1>'5<~<"'S~"'~)

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Versuchsdurchführung :Geräte: Becherglas, Rührer mit Rührfisch, 1ml Spritzen('-S).Zu 20ml einer 1~ Cysteinlsg gibt man nacheinander ca 6x 1ml5 ~.'J F e C1 3. Es tri t t k ur z z e i t i g t i e f bg.fl ue r Cys t ein 0 komp l e x auf,die F a r be verschwindet jedoch rasch; nach erneuter Zr rq a bevon FeC1 3 tritt diese erneut auf verschwindet jedoch immerlangsamer, allmählich tritt ein Niederschlag von Cystin auf.

1m c{;-Veratin I s t prozentual am meistem Cystin enthalten. Da

C~stin die rJimereförm von Cystein ist, soll im nächsten Versuch

demcnstriert werden, wie durch Oxidation des Cysteins Cystin

durch Ausbildung d or Disulfidbrücke e n t s te ht ,

3. Die Dlsulfjdbrücken----------------------

zwei Moleküle Cystein zum Cystin oxidiert. Diese Disulfidbin

dungen können im Organismus zur Verknüpfung mehrerer Peptid

ketten oder zur r~umlichen Struktuierung einer Kette dienen.

Ein analoger Vorganq findet in der Haarwurzel statt und wird

als Kcratinisierung des Haares bezeichnet. Dabei lagern sich

3 Helices zu einer Protofibrille zusammen, der Zusammenhalt

In der Zwischenzeit kann die Wellflüssigkeit und der Fixierer

auf ihre Wirkungsweise hin un t e r s uc l.t, werden, danach kann die

Dauerwelle sinnvoll interpretiert werden.

Oisulfidbrücken können durch Reduktion gelöst werden und

durch neue Oxidationvorgänge erneut geknüpft werden. Hierauf

beruht die Dauerwelle beim Friseur.

Versuchsdurchfür.ung :Eine Haarsträne wird gut durchfeuchtet und auf e Ls ne n 'u Lck I e raufgedreht, anschließend wird eine käufliche Wellflüssigkeitaufgetragen (Heimdauerwelle) und im Trockenschrank bei ca60°C eine 3/4 Std getrocknet. Die Wellflüssigkeit wird danachgut ausgespült, das Haar gut abgetrocknet und der Fixiereraufgetragen, der ca 5 Min einwirkwn muß, anschließend kanndas Haar entrollt werden oder abermals ausgespült werden, erneut aufwickeln und trocknen, dies richtet sich nach Angabendes Waschzettels für das jeweilig verwendete Präparat.

3.2. Die Dauerwelle, Versuch zur Tertiärstruktur--------------------~-----------~---------------

+:l.H i..__ JIh.:

COOfi COO'fI, I

~l~ lJ - C ft tI IJ - C ~I L I

PlC -}5"=S]-C HL

C"'lSt-:Ll (I~",,,;q s,J.!/}I,"<y)Fe 3+ bildet mit C~stein einen Cysteinoferra2 III-Komplex alsZu i s c he ns t uf e , Fe + wird anschließend zu Fe + reduziert, und

-)


- 26 -- 25 -

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benachbarten Cysteinmolekülen gebildet werden, die die neue

F 0 ..... rn des Haare s s tab i 1 i sie r ~ ,., • ." u s 5 ich e r he i t s 9 r ü n d:: ~ 1 ~- e 9 t

das Pe r ox id in gebunde ne r F arm vor. Der beschr fb~r.e Nach

weis kann daher in manchen Fällen negativ ausfallen !

Ae i der Dauerwell ewe r cir~ n k 0 v C] l,~ 11t e P,i nd u ngen ums t r uk t u i e r t

im Gegensatz zur Wasserwelle wo Nebenvalenzen dominieren.

}aher ist die Dauerwelle beständi~er als die Wasserwelle und

kann dadurch gut demonstriert werden, imdem man die wasse~

g '? 'J e I I te und die da uerg ewe 11 te HCo -.1 .3 t - ä ne kur z dur c h 5 Was 5 e r

zieht und tro~knen ltißt.

~iE~~~g~~~l~~~_~l~

a) Untersuchung der Wellflüssigkeit

Ger ~1 t e : 9 r RG ,Die ~8llotion wird mit KI .12 geprüft, es erfolgt ~ntfHr

bunge

~{ T. J + 1 e.- ,c;::::-' L< I t 2 I e (ru c1.«.lt. 1? ()lt )

- J- Z.( v c -{ l.) v (t,. \,.d.' ) f'- '" J, fD!

Iod wird zu Iodid reduziert, die We~otion wirkt reduzierend.

b ) Unte r s uc h un9 des Fix i e re r 5 ( ~ \'\ n ,. \:, I,' S. t.)~ .• \ 'l' t, 1 )Z u 5 rn1 ein e r (1, 0 1 r~ K2 Cr 2 07, die mit' 0 ,5 ml 1M '}f2 S04 versetztwurde, werden einige Tropfen Fixierer zugegeben, es entsteht eine blaue Chromverhindung, die Färbung geht sehrschnell in grün über, kann jedoch in Ether stabilisiertwerden.

t-(~Cr.L0"1 -l- ljl-Il.-0z. -+ ~lSO,/ "- :-, ('05 -t L<.2..s0~ .. 5t/LD.

~ I blaM

nies ist eine Nachweisreaktion auf H202,

cr2

07

2-geht in

das tiefblau gefärbte Chromperoxid über. Das erOS besitzt0, 'ft ..... 0

folgende I~oostitution : ~,C""<, '

Cr VI wird sehr bald zu er III reduzie~t (grUn), d~r gebundenen

Sauerstoff wird zu elementaren Sauerstoff oxidiert.

l.j [vOS + (;., ~(l S.Olj -'> a c. ~ (SO")3 -\ "Ilz 0 -f -:'J 0,2 l'fi rlAh

Die Stabilisierung in Ether erfolgt über eine Anlagerungsver-

b i.n dunq , bzw Clzoniumverbindung.

Der Fixierer wirkt also aufgrund seines Gehaltes an H202

oxidierend.

Das in der \l1cllflüssigkeit enthaltene -Re duk t Loris mi t t.e I istT h i orj 1 y k o 1 si j ur r!, 5 11- Cl/2 - C0 Cl}, 5 i e 1 ö s t red u k t iv die 0 i s u1 f i d-

b r Uc k n n rl: s I< e rat ins und wir d s e l b e r zur D i t h i 09 1 y k ol sä ure

o x i d i r~ r t • fJa die F f) S er pro te in e z uv 0 r mec ha n i s chi n ein e

neue Form gebrncht worden waren, k5nnen mit H202 der neuen

Form entsprnchcnd oxidativ neue DisulfidbrUcken zwischen 2


- 2B -

)

- 27 -

St a p f / Hr a de t z ky , Che mi s c he Schulversuche, Teil 3, org. Chemie,Harri-Deutsch-Verlag, Ffm 1975.

Fasman,G.D. Handboo k of Biochem. and Molecular Biology3 rd. Edn, Proteins Vol I, CRC Press, Clevel and, Dh i o 1976, P. 7B

Grimmer, Gernot, Bioch emie Bd.I. , HochschultaschenbücherMannheim 1969.

Bukatsch/Glöckner, Experimentelle Schulchemie, org. Chemie 11Bd.6/I, Deubner-Verlag.

Christen,Hans,Rudolf, Grundlagen der org. Chemie, Diesterweg/Salle, 4. Auf!. 1977.

Wenck /Blume,

Wol f , Andr eas,

Wü ns c h , K. H.

sowie,

Bausteine, Struktur und Eigenschaften derPr oteine: Biochemie im Unterricht, Teil IProteine, in Der Che mi e u n t e r r i c ht , 19BD,11 Jhg. Heft 3, s. 5- 7 5 . Kl e t t , Stuttgart.Dreidimensionale Dünnschichtchromatographievon Aminosäuren, in : Pra xis d. Na t u r wi s s e nschaf t en Chemie 1972, 21.Jhg.E i n f ü hr u ng in die Chemie d e r Na t u r s t o f f e ,VEB Deutscher Verlag der Wissenschaft,Berlin 19BD.Mi krochromatographische TrennUng und Na c hweis von Aminosäuren, unveröff. Ma n us k r i p t(masch) Uni-Marburg 197B(Pr aktikum Mikrochemie, Kl a mbe r g ) .

VI. literatur

Batzer, Hans,

Dose,K.

Einführung in die makromolekulare Chemie,Hüthig-Verlag, Heidelberg 195B

Biochemie, Eine Einführung, Springer-VerlagBerlin,Heidelberg 1980

Hünig /Mu6S0, Nachweis funkti oneller Gruppen in org. Verbindungen, Manuskript, Institut f. org. ChemieUni-Marburg 1975.

Ka r l s on , Pe t e r , Kur z e s Lehrbuch der Biochemie, Thieme-Verlag1D.Auf!. 1977.

Kr ü g e r , Ge r h a r d , Mikrochromatographischer Nachweis von Aminos äuren mit Hi l f e von Dansylchlorid, in :Pra x is der Na t u r wi sse ns c ha f t Chemie, 197B,27.Jhg, S. 2 9 3- 29 5 .

Lehninger,Albert,L. Bi o c hem i e , Verlag Che mie, Weinheim/N.V.1979, 2.Auf!.

Löwe,8.

Molzer,Hannes,

Morrison/8oyd,

Biochemie, Chemie für Gymn a sien, Bd.3, 1.Aufl.Buchners Verlag, Bamberg 1976.

Ermittlung einer Peptidsequenz in Schülerübungi n : Pr ax i s d er Naturwissenschaft Chemie1975, 24.Jhg, 5.154-158.Lehrbuch d er org. Chemie, Verlag Chemie,Weinheim 1978, 2.Aufl.

Weitere literatur s. Anhang.

Müssig,B. Oie Wasserstoffbrückenbindung, in : Praxis d.Natu r wi ssenschaft Che mi e , 1972, 21.Jhg.S. 128-132.

Pilhofer,Werner, Biochemische Gr u ndv e r s u c he , Praxis Schriftenr eihe Chemie Bd.25, Aulis-Deubner-Verlag &CoKG, Köl n 1978.

Pilhofer, Werner~ Versuche und Mo d e l l e zHrfKonfcrmation , in~ r a X 1S oer Naturw1 s s ensc a ten Lnem1e'1975,24.Jhg. Heft 7, S • ...,l:"~- /ly5


)- 29 -

- 30 -

VTI. P.nhang

~~~~E~~~~_l_~~~-~~!!~-~

Die Chiralittit der Aminosäuren kann dem Schüler mit Hilfe vcn~odellen einer L-u. O-AS verständlich gemacht werden.-Oie Chiralität der AS hat insofern eine große Beäeutung, da,wie schon erw~hnt natürlich vorkommende AS der L-Reihe angehören- D-As komme~ als seltene AS in Bakterien und Pilzen---vor.-AS die man durch eine Synthesereaktion, zB Streckersynthese,erhjlt sind optisch inaktiv, bestehen also aus einem Gemischvon L-uD-AS. Auch in Meteoriten wurden AS gefunden, diese sindebenfalls optisch inaktiv, hier schließt sich nun die Fragean I_ wie das Leben auf der Erde e n t s t aride n ist.' Durch Planspermi~~ oder eigenständig mit Hilfe von Energie auf der Erde.

Zur Evolution auf der Erde gibt es Schulversuche, die in abgewandelter Form den Miller-Versuch nachvollziehen.

Literatur :

Rukatsch/Glöckner

(.1. Cr i c k, Fra nc i s

v. Ditfurth, Hoimar

Experimentelle Schulchemie, Org.ChemieII8d 6/1, Aminosäuren aus anorg.Verbindungen, s , 174f.

Das Leben kam vom anderen Stern, in:Bild der Wissenschaft, 4/83, 5.118ff.

Im Anfang war der Wasserstoff, Knaur1975, Hamburg 1972.

~~~~!~~~~_1l_~~~_~~l!~_~In folgenden Versuchen können die funktionellen Gruppen derAS getrennt nachgewiesen werden.-Ql~_~gg~:~E~EE~l

Nachweis durch Wasserstoffentwicklung mit Metallen. 1M Glycinlösung wird mit einer Spatelspitze Magnesiumpulver versetzt.Die Entwicklung von Wasserstoff kann als Knallgasreaktionnachgewiesen werden.-Ql~_~~~:~E~EE~_l

Freie Aminogruppen und deren Derivaten lassen sich auch mit1,2-Naphthochinon-4-sulfonsäure (Folins Aminosäurereagenz)nachweisen. Es entsteht ein rotbrauner p-chinoider Farbstoff.

~~~=E~~~2 ~_~~~_~~!!~_1~

Schnell polymerisation von €Caprolactam (E~I1D~Q~~§1g11~D9)Man erhitzt 6g (Caprolactam mit 0,2g frisch geschnittenemmetallischen Natrium und läßt es einige Minuten lang im RGsieden. Hierbei entsteht eine viskose Schmelze, aus der manmit einem GlasstAb lange Fäden ziehen kann.-Dieser Versuch kann alternativ zur Nylondarstellung durchgeführt werden.~~!~~~l~~~~_~~~~E_~!~l~!!~~~~~Man trägt ein Eiklar in einen Erlenmeyerkolben in 150ml 0,9%ige Natriumchloridlösung ein, verschließt den Kolben undmischt durch schütteln. Eiweißlösungen müssen immer frischangesetzt werden, da sie sich bereits in wenigen Tagen zersetzen.

K.Oose, H.Rauchfuss Chemische Evolution und der Ursprunglebender Systeme, Stuttgart 1975.

In der Literatur findet man auch eine andere Definition fürsekundär- und Tertiärstruktur der Proteine. :Ye M nQ.c.~ ist c*.;c..Primärstruktur die Aminosäureseqenz, d;~

Sekundärstruktur die Disulfidbindung, ~:~

Tertiärstruktur die Wasserstoffbrückenbindung. ~iese Definitiongeht von den Bindungsstärken aus, im Gegensatz zu der im Vortrag gebrachten Definition, die von der Peptidbindung·und diedaraus folgenden räumlichen Bedingungen berücksichtigt.

~ ·U..s3e."'~~~~~E~~~~_~1_~E~_~~~!~_3~

Nachweis der SH-Gruppe von Cystein.Eiweißlösung wird-mit starker NaOH gekocht. Bei Zugabe vonB~eiacetat fälb~rRiaePt!M~~r Niederschlag aus, dessen Farbeslch belm Ansa , mitgefälltes PbOH)2 wi r d gelöst.

Follmann, Hartmut Chemie u , Biochemie. der EvolutionUTB Heidelberg 1981, Quelle & Meyer.

R.Schwanker, G.Sextl: Ein Beitrag zur Neufassung des StanleyMiller-Exoerimentes zur abiogenen Aminowsauresyn~nese in : PdNCh, 77/26JhgS.309r(-sowie in : Biologie in unserer Zeit,Heft 1 2/1980, 10.Jhg. "Das ExperimentAbiogene Bildung von Aminosäuren.

-~ . .2.'-1 r(.

Molzer, Hannes Einfacher Versuch zur molekularen Evo-lution in PdNCh 1976, 25~hg. 5.334.

Kotschua, Jürgen Zur Evolutionstheorie: Die Ursuppein : Praxis der Naturwissenschaft Chemie(PdNCh) 1975, 24Jhg, 5.329ff.

Kaplan, R.W. Der Ursprung des Lebens, Thieme, Stuttgart 1978, 2. Aufl.


- 3? -

- 31 -

Nachweis der SH-Gruppe mit AgN03Eine mit verdünnter H2 S n 4 angesöuerte Lösung von L-Cysteinwird mit einigen Tropfen ~ einer 0,' M AgN03versetzt, es fällt das gelblich-weiße Silbermercaptid aus.

~~~~E~~~~_~ll_~~~_~~~!~-~~Aufbau des Haares: Die Protofibrille des DlKeratins lagertsich zu einer Mikrofibrille (9+2) zusammen, die wiederum zueiner Makrofibrille kondensiert. Diese MakrofibrilJp ;~~ indie Matrix eingebettet und wird von der Rindenschicht umgebe~.

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R:\I\olt. (V\oI\~k", st.\:(.~~'

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.....-h~IA.ri11:b~d(.

3~L

50\l\sj)Der Fixierer muß sauer sein, da ~Nachweis als Chromperoxidne~~+:v tS{j ein Ansäuern reicht nicht aus.

Mittlerweile ist es sehr schwierig einen sauren Fixiererbeim Friseur zu erhalten, da die sogenannten "Sauren-Dauerwellen" veraltet sind. Der H

Z0 2- Na c hwe i s mit Titanweiß istebenfalls negativ.

~~~~E~~~2_1~2_~2~_2~2!~_jl

Arheitsanleitung für Oe-Chromatographie mit Oansylchlorid

2fJmg Proteine (Haare) werden mit 5ml 6M HCI versetzt und ineiner geschlossenen Glasampulle /24h lang bei 1000CJinkubiertTrockenschrank).Das braune Hydrolysat wird, um von noch vorhandenen größerenHaarTesten zu befreien, filtriert. Anschließend wird zur Vertreibung der HCI auf dem Wasserbad eingedampft.Jetzt zweimal mit je 1ml H2 0/ Ac e t o n 1:1 versetzt und erneuteingedampft, schließlich mlt 2ml H7 0/ Ac e t o n versetzt und,umweitere r~este abz u t r e nne nj f Ll t r I e r t ,Diese Aminosäurelösung wird erneut eingedampft und es werden3ml O,1 rn l\JaHCU 3 , die zuvor mit 1M NaOH auf einen pH von 10,0eingestellt wurde, zugegeben.1ml dieser vorbereiteten Aminosäurelösung werden mit 1mlDANS-Cl (27mg / 1[Jml Aceton) vermischt und im Wasserbad 60minbei 37 0 C i nk ub i e r t , hJ icht i gis t h i erb e i, daß die 0 ans y I i e run 9im Dunkeln 3bl~uft, ebenso, daß die dansylierten AS unterL.ichtfHJs~jr:t,lIJn ;lllfhe\.lJ;1hrt werden.Ans c hl i e nend gib t man n 0 c h 1- 2 Tr 0 p f e n Es s i gsä ure hinzu, die l~

so erhaltenen DANS-AS werden mit einer selbstgezogenen Kapill~

auf die UC-Karten aufgetragen.

Eine Aminos~iure-St8ndardlösungwird folgendermaßen angesetzt:Folgende AS werden verwendet, Leuein, Prolin, Alanin, Arginin.sowie Serin. 1ml Aminosäurelösung (6,5 umol in O,1M NaHC03 )und 1ml DANS-Cl (6mg/mIAceton) werden gemischt und über Nachtstehen gelassen. 8ml Aceton werden dann zur Fällung des NaHC0

3zugegeben. Nach der Zentrifugation oder Filtration der Lösungist diese gebrauchsfertig für die Chromatographie. Durch Zusammengeben gleicher Anteile der oben genannten Aminosäurenwird der Standard hergestellt.

Kleine Proben dieser Lösungen werden auf oC-Karten aufgetragen(Schleicher + Schüll, F 1700, Mikropolyamid, die 5x5 ausgestanzt wurden). Der Startpunkt sollte in einer Ecke ca 5mmvom f{and entfernt liegen und nicht größer als 1mm sein. Esfolgt nun die zweidimensionale Chromatographie; die OC-Kartenwerden in die erste Chromatographiekammer gestellt, die mitca 5m~ Fließmittel 1 gefüllt ist. Fließmittel 1 : H2 0/ HCOOH10 : n,3 v/v.Anschließend, nach etwa 6min Laufzeit,wird mit einem Föhngetrocknet, die Oe-Karte um 90 0 gedreht und in die zweiteLaufkammer gebracht. Das Fließmittel 2 ist ein Gemisch ausToluol/llflAC ~: 1, ebenfalls c a Srn L, Hier läuft das Chromatogramm ca 8min.Die Auswertung erfolgt unter der UV-Lampe, die fluoreszierendenSubsta~zf.ölecke~ werden gekennzeichnet und mit Hilfe des Standardes1n entlilZlert.


Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · Ninhydrin (Triketohydrinden) durch...

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