Histomorphometrische Untersuchung zur gerichteten ...

Aus der der Universitätsklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde

der

Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

Abteilung Klinik für Mund, Kiefer- und Gesichtschirurgie

Histomorphometrische Untersuchung

zur gerichteten Nervendistraktion

anhand des Nervus facialis der Ratte

Inaugural - Dissertation zur

Erlangung des Zahnmedizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2003

von Bettina Maria Kriesche

geboren in Villingen-Schwenningen

Dekan: Prof. Dr. Josef Zentner

1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Nils-Claudius Gellrich

2. Gutachter: Frau PD Dr. Petra Ratka-Krüger

Jahr der Promotion 2004

Meinen Eltern gewidmet

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von April 2000 bis März 2003 in der

Klinik und Poliklinik für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg im Breisgau angefertigt.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. Dr. N.-C. Gellrich für die Vergabe

des Themas der Dissertation und für seine Unterstützung bei ihrer Durchführung.

Des Weiteren möchte ich mich bei all jenen sehr herzlich bedanken, die mir

während dieser Dissertationsarbeit zur Seite gestanden haben:

Herrn Dr. Dr. M. Nilius danke ich für die Anleitung zur Durchführung der

klinischen Arbeiten,

Frau Hübner für Ihre Hilfe bei der Anfertigung und Aufarbeitung der

histologischen Präparate,

Frau Bächle für Ihren Rat und die Bereitstellung des Computerprogramms

analySIS ®,

Frau Neubacher von der Ruhr-Universität Bochum für ihre Beratung während

der Anfertigung und Aufarbeitung der Präparate,

Herrn Hartmann für seine stetige Hilfe bei PC Problemen

sowie meinen Freunden für Ihr Verständnis und Ihren Beistand.

Ein besonderes Dankeschön möchte ich meiner Mutter für ihre große

Unterstützung und ihr Verständnis aussprechen.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.......................................................................................................1 1.1 Geschichte der traumatischen Schädigung peripherer Nerven...............2 1.2 Anatomische Grundlagen ........................................................................3 1.2.1 Aufbau eines peripheren Nerven ........................................................4 1.2.2 Der Verlauf des Nervus facialis ...........................................................6 1.3 Schädigung des Nervus facialis...............................................................9 1.3.1 Symptome der Facialisparese.............................................................9 1.3.2 Pathophysiologie der Nervenläsion...................................................11 1.3.3 Diagnostik..........................................................................................14 1.4 Möglichkeiten der Rekonstruktion..........................................................15 1.5 Ziel der Arbeit ........................................................................................18

2 Material und Methode ................................................................................19 2.1 Versuchstiere.........................................................................................19 2.2 Materialien .............................................................................................19 2.3 Methoden...............................................................................................21 2.3.1 Operationen.......................................................................................21 2.3.2 Distraktion des Ramus buccalis n. facialis ........................................26 2.3.3 Entnahme der Nervenproben............................................................26 2.3.4 Histologische Aufarbeitung der Präparate ........................................27 2.3.5 Epoxideinbettung ..............................................................................29 2.3.6 Herstellung der Semi-Dünnschnitte ..................................................30 2.3.7 Brechung der Glasmesser ................................................................31 2.3.8 Kontraststeigerung mit para-Phenylendiamin ...................................31 2.3.9 Histomorphometrische Auswertung mittels Lichtmikroskopie ...........32 2.3.10 Histologische Auswertung der Präparate..........................................35 2.3.11 Quantitative Auswertung des Nervenquerschnitts ............................35 2.3.12 Statistische Auswertung....................................................................36

3 Ergebnisse...................................................................................................37 3.1 Histologische Auswertung .....................................................................37 3.2 Auswertung der histomorphometrischen Ergebnisse ............................50 3.2.1 Normalwerte des Ramus buccalis.....................................................50 3.2.2 Der Ramus buccalis nach Distraktion ...............................................51 3.3 Quantitative Auswertung der Axonanzahl .............................................59

4 Diskussion ...................................................................................................62 4.1 Methodenkritik .......................................................................................64 4.2 Morphologische und histomorphometrische Ergebnisse.......................66

5 Zusammenfassung.....................................................................................73

6 Literaturverzeichnis ....................................................................................74

7 Lebenslauf ...................................................................................................90

1

Einleitung

1 Einleitung

In den letzten Jahren hat die Mikronervenchirurgie wesentlich an Bedeutung

zugenommen. Aufgrund der technischen Möglichkeiten und der klinischen

Erfahrung können unter Beachtung der korrekten Indikationsstellung besonders

auf dem Gebiet der Mund-Kiefer- und Gesichtschirurgie gute Ergebnisse erzielt

werden.

Verschiedene Hirnnerven sind im Rahmen der Tumorchirurgie, der

Traumatologie und durch Infektionen gefährdet, so auch der Nervus facialis in

seinem extratemporalen Verlauf. Betroffen können auch sensible Äste des

Nervus trigeminus sein, wie der Nervus alveolaris inferior, der Nervus lingualis

und der Nervus infraorbitalis. Gerade den beiden genannten Trigeminusästen

kommt in der rekonstruktiven Chirurgie klinische Bedeutung zu, da diese auch bei

zahnärztlichen Maßnahmen beschädigt werden können (Girod und al. 1989). Der

Nervus glossopharyngeus, der Nervus vagus und der Nervus phrenicus sind

dagegen selten betroffen (Grobe und Raithel 1978).

Im Gegensatz zu Knochen- und Weichteilverletzungen müssen

Nervenverletzungen nicht unbedingt primär rekonstruiert werden. Da die

Regenerationsfähigkeit von Nerven lange erhalten bleib, besteht die Möglichkeit

einer frühen sekundären Wiederherstellung nach 3-4 Wochen oder einer

sekundären Rekonstruktion nach mehreren Monaten.

In vielen Fällen führen die bisherigen Rekonstruktionsmöglichkeiten dennoch

nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Daher ist das Bestreben vieler

Arbeitsgruppen darauf ausgerichtet, neue Methoden zu entwickeln, um ein

besseres funktionelles Ergebnis zu erzielen und den Leidensdruck der Patienten

zu vermindern.

2

Einleitung

1.1 Geschichte der traumatischen Schädigung peripherer Nerven

Die erste Erwähnung einer akuten Nervenverletzung kann etwa 3500 Jahre

zurückdatiert werden und findet sich bereits in der Bibel. In dem bekannten

Bericht des Alten Testaments erlitt Jakob im Kampf mit Gott eine Verletzung des

Nervus ischiadicus und eine traumatische Hüftdislokation (Genesis 32: 23-33)

(Cornwell 2000).

Über erste Versuche, durchtrennte Nervenenden durch einen einfachen

Wundverschluss wieder zusammenzuführen, berichtete Paul von Aegina

(625-690) (Novak et al. 2002).

Als Pionier der chirurgischen Versorgung peripherer Nerven kann Gabriele

Ferrara (1543-1672) angesehen werden. Er war der erste Chirurg, der die

Technik beschrieb, verletzte Nervenenden durch eine Naht zusammenzufügen.

Seine Methode beinhaltete die präzise Identifizierung der Nervenstümpfe und ihr

vorsichtiges Vernähen, wie auch die Desinfektion von Nadel und Faden mit

einem Gemisch aus Rotwein, Rosmarin und Rosenblättern. Im Grundsatz wird

ein ähnliches chirurgisches Vorgehen auch heute noch praktiziert (Artico et al.

1996).

1850 schilderte August Waller die absteigende Nervendegeneration.

Hueter (1871, 1873) stellte das Konzept der epineuralen Nervennaht vor (Sharon

und Fishfield 2002). 1876 erörterte Albert die Überbrückung von Nervendiastasen

durch Transplantation.

Die Erfahrungen mit Kriegsverletzungen während des Ersten und Zweiten

Weltkriegs lieferten wichtige Informationen über die Beurteilung und Behandlung

von Nervenverletzungen (Sharon und Fishfield 2002). Fortschritte in der

Entwicklung neurochirurgischer Instrumente und verbesserte Diagnoseverfahren

haben zu guten Ergebnissen in der Versorgung akuter Nervenverletzungen

geführt (Artico et al. 1996). Allerdings konnte eine entscheidende, klinisch

fassbare Verbesserung der funktionellen Ergebnisse auch in den letzten Jahren

nicht erreicht werden (Trumble et al. 2000).

3

Einleitung

1.2 Anatomische Grundlagen In dieser Arbeit wird die Reaktion eines gesunden peripheren Nervenastes auf

eine moduliert gerichtete und gesteuerte primäre Nervendistraktion untersucht.

Aufgrund seiner günstigen anatomischen Verhältnisse bietet sich der Ramus

buccalis der Ratte für die Durchführung derartige Experimente an.

Bei den höher entwickelten Lebewesen sorgen Nerven für die

Informationsübertragung im Organismus. Die Gesamtheit des Nervengewebes,

welches Reize aufnimmt, sie weiterleitet, im Zentralnervensystem verarbeitet und

eine Antwort in den peripheren Empfängern auslöst, bildet das Nervensystem.

Dieses und die damit verbundenen Organe machen es möglich, rasch auf

unterschiedliche Reize zu reagieren.

Es wird unterschieden zwischen dem Zentralen Nervensystem (Gehirn und

Rückenmark) und dem peripheren Nervensystem (Rückenmarksnerven,

Hirnnerven und periphere Ganglien). In verschiedener Hinsicht ähneln die

Hirnnerven den Spinalnerven des Rückenmarks. Letztere versorgen Rumpf und

Extremitäten, während die Hirnnerven überwiegend den Kopf innervieren.

Im Gegensatz zu den Rückenmarksnerven enthalten die Hirnnerven jedoch nicht

alle nervösen Faserarten in fast gleicher Zusammensetzung, sondern jeweils nur

Fasern aus einzelnen Terminalkernen mit spezieller Funktion.

Der Nervus facialis (siebenter Hirnnerv) versorgt in erster Linie die mimische

Muskulatur des Gesichtes und des Halses. Er enthält jedoch auch

Geschmacksfasern und parasympathische Faserbündel. Diese sind in der Regel

als gesonderter Nerv anzutreffen (Nervus intermedius).

Patienten, die einen permanenten Verlust der Fazialis-Funktion erleiden, haben

nicht nur Funktionsstörungen beim Essen und Sprechen. Vielmehr führt die

Parese der mimischen Muskulatur, die mit dem Verlust der emotionellen

Ausdrucksmotorik und einer morphologischen Entstellung einhergeht, zu nicht zu

unterschätzenden psychischen und psychosozialen Konsequenzen. Der

Rehabilitation dieser Patienten ist somit eine hohe Priorität zuzuordnen.

4

Einleitung

1.2.1 Aufbau eines peripheren Nerven

Ein genaues Verständnis von Aufbau und Physiologie eines peripheren Nerven

ist die Vorbedingung für die chirurgische Rekonstruktion von Nervenverletzungen

(Battista und Lusskin 1986) und unabdingbar für die morphologische Bewertung

von Nervenpräparaten. Die Überprüfung auf Abweichungen der

Nervenmorphologie dient in dieser Arbeit als Grundlage für die Beurteilung einer

vorhandenen Schädigung eines Nerven nach primärer Distraktion.

Eine Nervenzelle lässt sich in Perikaryon (Zellleib), Nervenzellfortsätze,

Dendriten und das Axon (Neurit, Achsenzylinder) gliedern. Mehrere Dendriten

bilden die afferente Komponente der Nervenzelle. Das Axon ist die efferente

Struktur. Es leitet die Erregung in die Peripherie und kann beim Menschen bis zu

1 m lang sein. Im Gegensatz zu den Dendriten, deren Durchmesser variieren,

besitzt es einen konstanten Durchmesser von 15-20 µm.

Sowohl die einzelnen peripheren Nervenfasern als auch die Faszikel, zu denen

sie zusammengefasst sind, und der Nerv in seiner Gesamtheit verlaufen

wellenförmig. So wird bei Bewegung eine geringfügige Verlängerung der

Strukturen möglich, ohne dass eine Überdehnung der Nervenfasern eintritt

(Sunderland 1990).

Je nach Differenzierung der Hülle kann man zwischen markscheidenhaltigen

oder markscheidenlosen Nervenfasern unterscheiden (Kuczynski 1980).

Der untersuchte Nervus facialis enthält wie die meisten peripheren Nerven

markscheidenhaltige Fasern.

Die Markscheidenreifung beginnt durch die Einsenkung eines Axons in die

Vertiefungen von hintereinander angeordneten Schwann´schen-Zellen. In der

entstehenden Rinne lagern sich Membranen der Schwann´schen-Zelle

aneinander und bilden das Mesaxon. Dieses wickelt sich mehrfach um das Axon.

Diese Wicklungen und Verschmelzungen der benachbarten Zellmembrananteile

bilden die Markscheide, welche einen lamellaren Bau aufweist. Die eigentliche

Substanz dieser Schicht, die der elektrischen Isolierung dient, ist das Myelin.

Dieses besteht zu 70% aus Lipiden (Phospholipide, Cholesterin und Glycolipide).

5

Einleitung

Zu 30% ist Myelin aus einer Anzahl verschiedener Proteine zusammengesetzt,

darunter Protein 0 (P0), P2, peripheres Myelinprotein 22 (PMP 22), myelin-

assoziiertes Glycoprotein (MAG) und Connexin 32 (CX32) (Snipes und Suter

1995). Diese Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Bildung, Erhaltung und

Degeneration der Myelinscheiden (Quarles 2002).

Zwischen dem Durchmesser des Axons und der zugehörigen Markscheide

besteht in der Regel eine positive Korrelation (Morell und Norton 1980).

Die Myelinscheide wird außen von einer Hülle aus Zytoplasma umgeben, dem

Neurolemm.

Eine Schwann´sche-Zelle umhüllt das Axon auf einer Länge von 0,2 bis 1,5 mm.

Zwischen benachbarten Zellen befindet sich ein Interzellularspalt, der als

Ranvier´scher-Schnürring bezeichnet wird. In diesen Spalten ist die Isolierung

geringer. Auf diese Weise wird eine saltatorische Erregungsleitung mit erhöhter

Leitgeschwindigkeit ermöglicht.

Durch Bindegewebsstrukturen sind die Nerven untereinander und mit ihrer

Umgebung verbunden.

1) Das Endoneurium ist eine Bindegewebsschicht, die jede Nervenfaser

umgibt und zarte kollagene Fasern, eine geringe Anzahl elastischer

Fasern und retikuläre Fasern enthält. Zur Nervenfaser hin schließt sie

mit einer Basalmembran ab.

2) Das Perineurium ist ein straffes Bindegewebe aus Kollagen- und

dickeren elastischen Fasern. Es schließt mehrere Nervenfasern zu

Faszikeln zusammen. Außerdem dient es als Diffusionsbarriere

zwischen Endo- und Epineuralraum (Martin 1964; Rechtland 1987).

3) Das Epineurium fasst die einzelnen Faszikel zu einem peripheren Nerv

zusammen und vermittelt einen beweglichen Einbau in seine Umgebung.

Der Anteil elastischer Fasern ist relativ gering. Es kann daher davon

ausgegangen werden, dass die Eigenelastizität eines peripheren Nerven primär

auf Kollagenfasern zurückzuführen ist (Tassler et al. 1994).

In der Anordnung der Faszikel können drei Grundtypen unterschieden werden:

monofaszikulär, oligofaszikulär und polyfaszikulär. Der Faszikelanordnung kommt

für die Technik der Nervenkoaptation große Bedeutung zu (Hausamen und

Schmelzeisen 1996).

6

Einleitung

1.2.2 Der Verlauf des Nervus facialis

Ein Vergleich zwischen dem Verlauf des menschlichen Nervus facialis und dem

Verlauf dieses Nerven bei der Ratte soll dargestellt werden.

Der Nervus facialis ist der siebente der 12 Hirnnerven und gehört

entwicklungsgeschichtlich zum zweiten Kiemenbogensegment. Er hat drei

Ursprungskerne, welche die motorischen, sensiblen, sensorischen und

parasympathischen Qualitäten wiederspiegeln.

Der Nucleus originis n. facialis ist der motorische Ursprungskern. Er besteht aus

einem Hauptkern für die mimische Muskulatur und den Musculus stylohyoideus,

sowie aus zwei akzessorischen Kernen.

Nach Szentágothai (1949) ist der Nucleus dorsalis das Kerngebiet des Venter

posterior des Musculus digastricus. Man nimmt an, dass der zweite Kern, der

Nucleus accessorius ventralis, an der Innervation des Musculus stapedius

beteiligt ist (Chouard et al. 1972).

Für die parasympathischen Anteile ist der Nucleus salivatorius superior

verantwortlich. Tränendrüse, Nasen-Gaumen- und Unterzungendrüsen wie auch

Orbita, Mund- und Nasenhöhle werden von diesen Anteilen versorgt.

Die afferenten Geschmacksfasern aus der Chorda Tympani enden im Nucleus

tractus solitarii.

Die sensiblen und parasympathischen Faserbündel bilden den Nervus

intermedius und verlassen den Hirnstamm getrennt vom motorischen

Hauptstamm (Banfai 1976). Der N. facialis verlässt gemeinsam mit dem N.

vestibulocochlearis den Hirnstamm im Kleinhirnbrückenwinkel. Er tritt in den

Meatus accusticus internus ein und erreicht dort den Canalis facialis des

Felsenbeins. Durch eine fast rechtwinklige Biegung an der vorderen

Felsenbeinwand nach dorsal bildet er das Geniculum n. facialis. Bogenförmig

zieht der Nervus facialis um das Tympanon nach kaudal. Es besteht hier eine

enge topographische Beziehung mit dem Sinus sigmoideus (Aslan et al. 2001).

7

Einleitung

Noch im Canalis facialis zweigen vom N. facialis folgende Nerven ab:

der N. stapedius, der den gleichnamigen Muskel versorgt, die Chorda tympani

sowie der Ramus communicans cum plexu tympanico. Dieser nimmt aus dem

Plexus tympanicus des Nervus glossopharyngeus und dem Ramus auricularis

nervi vagi sensible Afferenzen auf. So ist er an der sensiblen Innervation der

Schleimhaut der Paukenhöhle und der Haut des äußeren Gehörgangs beteiligt

(Eshraghi et al. 2002).

Durch das Foramen stylomastoideum verlässt der siebte Hirnnerv den Canalis

facialis. Kurz nach dem Austritt gibt er den N. auricularis posterior nach dorsal ab

und versorgt die Muskeln der inneren Ohrmuschel. Nach kaudal gibt er den

Ramus stylohyoideus und den Ramus digastricus ab, sie versorgen die

gleichnamigen Muskeln.

Der N. facialis tritt in die Parotis ein und bildet dort den Plexus parotideus, der die

Ohrspeicheldrüse in einen oberflächlichen und tiefen Teil teilt. Unter der Fascia

masseterica strahlt er am vorderen Rand des Musculus masseter, in einer

topographischen Schicht liegend, fächerförmig in die oberflächliche mimische

Gesichtsmuskulatur ein (Becker 1999).

Über den Jochbogen ziehen die Rami temporales zum Venter frontalis des

Musculus occipito-frontalis sowie zum Musculus orbicularis oculi. Die Rami

zygomatici versorgen die Umgebung der unteren Lidspalte, der Nasen- und der

oberen Lippenregion.

Der Musculus buccinator wie auch der Musculus orbicularis oris werden von den

Rami buccales innerviert. Parallel zum Unterkiefer verläuft der Ramus marginalis

mandibulae, der die Muskulatur der unteren Mundspalte versorgt. Die oben

genannten Rami bilden Anastomosen mit dem Nervus trigeminus (Paturet 1964).

Eine Innervation des Platysmas erfolgt durch den Ramus colli und den

Nervus transversus colli aus dem Plexus cervicalis, die ebenfalls Anastomosen

bilden.

8

Einleitung

Verglichen mit den oben beschriebenen menschlichen anatomischen

Verhältnissen des Nervus facialis verläuft der Nervus facialis der Ratte unterhalb

der Ohrspeicheldrüse und kann leicht von dieser mobilisiert werden

(Felix und Mattox 1987).

Während die Gabelung des Nervus facialis beim Menschen in der Parotis liegt,

teilt sich der Fazialisstamm der Ratte ca. 6 mm nach seinem Austritt aus dem

Foramen stylomastoideum an einer anatomisch sichtbaren Furkation.

Hier erfolgt die Trennung in die beiden Hauptäste, den Ramus

zygomaticobuccalis und den Ramus marginalis mandibulae (Lay 1999). Ebenfalls

teilen sich der Ramus temporalis und der Ramus cervicalis ab. Aufgrund ihrer

geringen Größe sind sie jedoch meist anatomisch nicht darstellbar (Abb. 1).

Erst distal der Furkation erfolgt die Aufgliederung des Ramus zygomaticobuccalis

in seine Endäste (Martin et al. 1977; Mattox und Felix 1987).

Abb. 1: Schematische Darstellung des Nervus facialis der Ratte nach Mattox und Felix (1987).

Der Hauptstamm des Nerven tritt aus dem Foramen stylomastoideum aus. Die Teilung in

seine Endäste erfolgt im Wesentlichen an einer Furkation.

9

Einleitung

1.3 Schädigung des Nervus facialis

Neben der traumatischen Läsion einzelner Fazialis-Äste oder des Fazialis-

Stammes bei tiefreichenden Verletzungen der lateralen Gesichtsregion kommen

hauptsächlich maligne, teilweise aber auch benigne Neoplasien der

Ohrspeicheldrüse mit nachfolgender radikaler Resektion des Tumors als Ursache

eines Funktionsverlustes des Nervus facialis in Frage.

Akustikusneurinome können aufgrund der anatomischen Variabilität des N.

facialis nach einer Resektion ebenfalls zu einer Facialisparese führen (Samii und

Matthies 1997). Auch entzündliche Erkrankungen stellen eine Bedrohung für die

Fazialisfunktion dar. Als Ursachen stehen hier die Borreliose oder der Zoster

oticus (reaktivierte Varizella-Zoster Infektion) im Vordergrund.

Ebenso kommen Hirntumoren oder vaskuläre Prozesse als Grund einer Störung

in Frage. Sie führen zu einer zentralen Störung des Nervus facialis.

1.3.1 Symptome der Facialisparese

Als Leitsymptom entwickelt sich eine Lähmung der mimischen Muskulatur. Diese

betrifft in den meisten Fällen nur eine Gesichtshälfte, nämlich die Seite der

Nervenschädigung. Schmerzen hinter dem Ohr können die ersten Zeichen sein.

Als Folgesymptome zeigen sich (Tab. 1):

• Erweiterte Lidspalte

• Lidspaltendifferenz

• Positives Bell-Phänomen (unvollständiger Augenschluss, beim Versuch des

Lidschlusses wird die physiologische Aufwärtsbewegung des Bulbus oculi

nach oben sichtbar)

• Verstrichene Stirn- und Nasolabialfalte

• Beeinträchtigte Aussprache der betroffenen Patienten

• Verlust der Ausdrucksmotorik

10

Einleitung

Zusätzlich können noch auftreten:

• Geschmacksstörungen im Bereich der vorderen zwei Drittel der Zunge

• Hyperakusis

• Störungen der Tränen- und Speichelsekretion

Während bei der zentralen Störung eher die mimische Muskulatur des

Mundbereiches betroffen ist, ist ein Stirnrunzeln nach einer peripheren Läsion

des Nervus facialis nicht mehr möglich.

Das Moebius-Syndrom, eine angeborene bilaterale Aplasie verschiedener

Hirnervenkerne, führt zu einer Parese beider Gesichtshälften.

Internationales Schema zur Einteilung der Fazialisparesen

Befund in Ruhe Aktive Bewegung für

Beschreibung Stirn Lidschluss Mund

I Normal Normal Normal Normal Normal Normal

II Leichte Parese

Schwäche/Synkinesie nur bei genauer

Beobachtung erkennbar Normal Reduziert Fast normal Gering

III Mäßige Parese

Offensichtliche Seitendifferenz,

Synkinesie, Kontraktur Normal Noch

vorhanden Vollständig Gering reduziert

IV Mäßigstarke

Parese

Entstellende Asymmetrie Normal Keine Inkomplett Asymmetrie

V Starke Parese

Noch geringe Restbewegung

erkennbar Asymmetrie Keine Inkomplett Asymmetrie

VI Paralyse Keine Restbewegung erkennbar Tonusverlust Keine Keine Keine

Tabelle 1: Internationales Schema zur Einteilung von Fazialisparesen nach

House und Brackmann (1985)

11

Einleitung

1.3.2 Pathophysiologie der Nervenläsion

Die Neurapraxie ist durch eine Markscheidenschädigung mit Ödembildung

innerhalb der Markscheide gekennzeichnet. Die Axone bleiben dagegen intakt.

Während die Axonotmesis mit Degeneration sowohl der Markscheide als auch

der Axone einhergeht, die bindegewebigen Mantelstrukturen des Nerven aber

unversehrt sind, charakterisiert das Verletzungsmuster der Neurotmesis eine

vollständige Unterbrechung der Nervkontinuität (Seddon 1943, Menger 1992).

Klinisch sind Axonotmesis und Neurotmesis anfänglich schwer zu differenzieren.

In beiden Fällen liegt eine Parese der beteiligten Muskulatur vor. Das

Elektromyogramm zeigt eine vollständige Unterbrechung der Nervenleitung mit

verlangsamter Muskelkontraktion. Distal der Nervenläsion tritt die von August

Waller 1850 beschriebene sekundäre Degeneration (Waller´sche Degeneration)

auf, bei der es gleichzeitig zu De- und Regenerationsvorgängen kommt

(Fawcett und Keynes 1990).

Während der Degeneration sind histologisch betrachtet Form und Durchmesser

der Myelinscheiden unregelmäßig. Es resultiert eine Quellung und Invagination

der Myelinscheiden mit einer Aufsplitterung der äußeren Lamellen. Binnen einer

Woche zerfallen die Markscheiden. Durch Lysophosphatide erfolgt schließlich die

Auflösung der Axone. Der weitere Prozess beinhaltet die Entmischung und

Verklumpung des Axoplasmas, eine diffuse Granulierung der axonalen

Mitochondrien, die Aufnahme von Markfragmenten in die Schwann´sche Scheide

und das Auftreten von Fettkörnchenzellen. Es kommt zur Markballenbildung

(Lahoda 1988; Tackman 1989).

Eine massive Makrophageninvasion mit CD8-Expression und eine

T-Zellinfiltration schließen sich an (Jander et al. 2001). Die Myelin-Fragmente

werden abgebaut, und es wird ein Milieu geschaffen, in dem der Prozess der

Regeneration stattfinden kann (Kury et al. 2001). Durch Proliferation der

Schwann´schen-Zellen und Bildung feiner Fibrillen vom Axon des proximalen

Nervenstumpfes aus beginnt die Regeneration. Die durchschnittliche

Geschwindigkeit beträgt hierbei 1-2 mm/Tag (Quaan und Bird 1999).

12

Einleitung

Allerdings kann der Regenerationsprozess bei einer Neurotmesis zu einer

ungeordneten Aussprossung der Axone (Neurom) führen, da hier auch die

bindegewebigen Leitstrukturen durchtrennt sind, die sonst als Schiene für die

Wiedereinsprossung dienen.

Im Jahre 1951 wurden Nervenverletzungen von Sunderland detailliert

unterschieden und in fünf Kategorien aufgeteilt:

• Erster Grad: Die Kontinuität des Axons ist erhalten. Es besteht ein

vorübergehender Verlust der Leitfähigkeit am Ort der Schädigung. Es

kommt zu einer Demyelinisierung, nicht aber zur Waller´schen

Degeneration.

• Zweiter Grad: Die Kontinuität des Axons ist unterbrochen, das Endoneurium

und die bindegewebigen Mantelstrukturen des Nerven bleiben erhalten.

Waller´sche Degeneration tritt auf. Distal der Läsion ist eine elektrische

Stimulation der Erfolgsorgane nicht mehr möglich, doch durch

Wiedereinsprossung entlang der endoneuralen Leitschienen kommt es nach

Monaten zu einer völligen Regeneration.

• Dritter Grad: Hierbei handelt es sich um eine intrafaszikuläre Läsion. Die

äußere Struktur der Faszikel ist zwar intakt, aber die Kontinuität von Axon

und Endoneuralscheide ist unterbrochen. So kommt es zum Zerfall der

Axone und zu axonaler Degeneration, wobei Blutungen, Ödeme, Ischämie,

Neuroinflammation und eine Fibrose des Endoneuriums auftreten können.

Durch die Unterbrechung der Endoneuralscheide ist während der

Regeneration die geordnete Wiedereinsprossung der Axone nicht mehr

gewährleistet. Es verbleibt oft ein Verlust der motorischen und/oder

sensorischen Qualität.

• Vierter Grad: Die Struktur der Faszikel ist zerstört. Die äußere Hülle des

Nerven wird lediglich durch unstrukturiertes Gewebe erhalten. Das

traumatisierte Segment wird durch Narbengewebe ersetzt, welches aber

eine Einsprossung neuer Axone verhindert. Die Wahrscheinlichkeit, dass die

Funktion ohne chirurgischen Eingriff wiederkehrt, ist äußerst gering.

13

Einleitung

• Fünfter Grad: Hier ist die Kontinuität der kompletten Nervenbahn

unterbrochen. Das Ereignis dieser Verletzung ist meist auf pathologische

Prozesse zurückzuführen. Aufgrund der großen Unterbrechung tritt ein

kompletter Verlust der sensorischen, motorischen und autonomen

Funktionen auf. Das klinische Bild weist eine Rötung durch Vasodilatation in

dem betroffenen Gebiet auf. Nach wenigen Wochen wirkt die Region infolge

von Vasokonstriktion blass und kühl. Auch das Auftreten trophischer

Störungen der Haut ist möglich. Selbst nach einem chirurgischen Eingriff ist

die völlige Wiederherstellung der Funktion nicht gewährleistet.

Seddon Sunderland Pathologie

Neurapraxie 1 Segmentale Demyelinisierung ,reversibler Leitungsblock, keine axonale Degeneration

Axonotmesis 2 Axonale Degeneration, Endoneurium intakt

Axonotmesis 3 Axonale Degeneration, Zerreißung des Endoneuriums, Perineurium intakt

Axonotmesis 4 Axonale Degeneration, endoneurale und perineurale Zerreißung, Epineurium intakt

Neurotmesis 5 Komplette axonale Degeneration, Zerreißung aller verbindenden Gewebestrukturen

Tabelle 2: Vergleich der Einteilung von Nervenverletzungen zwischen Seddon (1943)

und Sunderland (1951)

14

Einleitung

1.3.3 Diagnostik

Einer der wichtigsten Punkte im Rahmen der klinischen Diagnostik ist die

Befragung des Patienten. Die Kenntnis von dem Zeitpunkt und der Art der

Verletzung haben einen entscheidenden Einfluss auf die therapeutische

Vorgehensweise und die Vorhersagbarkeit des Ergebnisses.

Zu den einfachen Möglichkeiten der Funktionsdiagnostik zählen die Überprüfung

der Hautsensibilität, der motorischen Willkürbewegungen, die Druck- und

Temperaturempfindungen sowie das Tinel-Hoffmann-Zeichen, welches bei

Perkussion eines geschädigten Nerven Schmerzen in dem betroffenen Hautareal

hervorruft. Der Verlust der Wahrnehmung von Bewegung und Lage,

augenscheinliche Muskelatrophien, das Ausbleiben der Schweißsekretion sowie

die Hautfarbe und -beschaffenheit können einen Hinweis auf die Verletzung

motorischer und/ oder sensorischer Nerven geben.

Weitere klinische Untersuchungen werden mittels Neurographie,

Computertomographie (Nemeth und Cigic 1999; Martin-Duverneuil 1999) und

Magnetresonanztomographie durchgeführt. Letztere erscheint bei Läsionen im

extratemporalen Bereich des N. facialis als sehr geeignet (Sutherland et al. 1997;

Kumar et al. 2000). Es können ebenfalls verschiedene elektrophysiologische

Untersuchungen durchgeführt werden, die die Stimulation motorischer Neurone

mit Ableitung evozierter Potentiale (Gellrich et al. 1995), die Elektromyographie

und die Elektroenzephalographie einschließen.

15

Einleitung

1.4 Möglichkeiten der Rekonstruktion

Je nach Ausmaß der Verletzung werden bisher verschiedene

Rekonstruktionsverfahren eingesetzt, die entweder die Kontinuität des Nerven

und seine elektrophysiologische Leitfähigkeit wiederherstellen oder funktionell die

Aufgabe des Nervus facialis übernehmen und ersetzen sollen (Abb. 2). Darüber

hinaus können dynamische Muskeltransplantate der mimischen Muskulatur

eingesetzt werden.

Abb. 2: Vergleich zwischen dem entstandenen Nervendefekt und der Distanz von proximalem

und distalem Ende der Nervenstümpfe. Die Distanz entspricht dem Defekt oder

vergrößert sich, falls die Nervenenden nach der Verletzung auseinander gezogen

worden sind (Mackinnon 1989).

Nur in umschriebenen Fällen gelingt eine End-zu-End-Anastomose. Eine

spannungsfreie Adaptation der Nervenstümpfe ist nur bei einer scharfen

Durchtrennung ohne wesentliche Traumatisierung der Nervenenden möglich.

Sowohl im Rahmen der Traumatologie als auch in der Tumorchirurgie wird sehr

viel öfter die Indikation zur Überbrückung der entstandenen Nervendefekte

gestellt.

16

Einleitung

Um die Nervendiastase zu überbrücken, werden autogene Interponate

unterschiedlicher Herkunft zur Wiederherstellung der Nervenkontinuität

verwendet (Abb. 3 und Abb. 4). Dafür haben sich freie Transplantate aus dem

Plexus cervicalis, dem Nervus suralis oder Ästen des Nervus medianus als

besonders gut geeignet herausgestellt (Hagan 1981; Stephanian et al. 1992;

Haller et al: 1997). Das Verfahren der fazio-fazialen Anastomose mit Interposition

autologer Nervensegmente hat ansprechende funktionelle Ergebnisse gezeigt

(Anderl 1982; Monballiu 1982).

Wenn eine direkte Versorgung des Nervus facialis nicht möglich ist, kann eine

Fremdnervenanastomose zur Rehabilitation der distalen Funktion des Nervus

facialis beitragen. Hierfür kommen verschiedene Spendernerven in Frage

(Hoffmann 1992). Durchgesetzt hat sich vor allem eine Anastomose aus dem

Nervus hypoglossus und dem Nervus facialis (Kunhirio et al. 1991).

Im Gegensatz zu sensiblen Nerven, bei denen eine Rekonstruktion der

Nervenkontinuität zeitlich nicht strikt limitiert ist, sollte die Wiederherstellung der

Nervenkontinuität bei motorischen Nerven innerhalb eines Jahres erfolgen, da

das Erfolgsorgan Muskel ohne Innervation unweigerlich atrophiert und nach

dieser Zeitspanne die Aussichten einer funktionellen Rehabilitation erheblich

sinken.

In Fällen einer länger bestehenden Paralyse des Nervus facialis müssen

umfangreiche Rekonstruktionsmaßnahmen ergriffen werden, die auf eine

Wiederherstellung der muskulären Transposition abzielen. In Frage kommen

hierbei neurovaskulär reanastomosierte Muskeltransplantate des Musculus

gracilis (Guelinckx und Sinsel 1996, Schmelzeisen et al. 1996), des

Musculus latissimus dorsi (Harii et al. 1998), des Musculus masseter und des

Musculus temporalis (Hoffmann 1992) sowie des Musculus rectus abdominis

(Koshima et al. 1997).

17

Einleitung

Abb.3: Darstellung des Fazialisstammes (links) nach radikaler Parotidektomie infolge eines

Plattenepithelkarzinoms (Gellrich)

Abb. 4: Rekonstruktion des Nervus facialis (links) nach radikaler Parotidektomie infolge eines

Plattenepithelkarzinoms mit einem autologen sensiblen Nerventransplantat des

Nervus auricularis magnus (Gellrich)

18

Ziel

1.5 Ziel der Arbeit

Die vorliegende Arbeit dient der Etablierung eines neuen Modells der gesteuerten

Nervenregeneration mittels primärer Nervendistraktion. Als

Grundlagenuntersuchung ist der Nachweis wichtig, dass ein physiologisch

intakter Nerv oder einzelne Äste eines Nerven in ihrer Länge aktiv verändert

werden können. Untersuchungen der Distraktionsosteogenese haben gezeigt,

dass eine sekundäre Distraktion peripherer Nerven unter definierten Ausmaßen

der Längenveränderung zu einer wenig veränderten Struktur des Nerven führen

(Battison et al. 1992; Block et al. 1993; Hu et al. 2001; Wang et al. 2002).

Auch Verlängerungen mittels Gewebeexpandern zeigten gute Ergebnisse

(Manders et al. 1987; Wood et al. 1991; Hall et al. 1993; Van der Wey et al. 1995;

Van der Wey et al. 1996). Nur eine langsame Dehnung des Nerven mittels

Expander geht ohne einen Funktionsverlust einher, ähnlich dem Verhalten

peripherer Nerven bei langsam wachsenden, benignen Tumoren

(Mackinnon 1989; Anand 1997).

In unserem Modell wird mit einem Zugschraubensystem, welches am Jochbogen

fixiert ist, der Ramus buccalis des Nervus facialis primär distrahiert.

Histologisch aufbereitete Präparate des distrahierten Segments sowie der nicht-

behandelten Gegenseite werden auf lichtmikroskopisch sowohl quantitativ

(anhand von Axonzahl, Myelinscheidendicke und Durchmesser) als auch

qualitativ (im Hinblick auf das Degenerationsverhalten im Vergleich zur gesunden

Seite) ausgewertet.

19

Material und Methode

2 Material und Methode

2.1 Versuchstiere

Die Versuche wurden mit 16 weiblichen Albinoratten der Gattung Wistar

durchgeführt, deren Gewicht zwischen 271g und 437g betrug (durchschnittliches

Gewicht 300g). Das durchschnittliche Alter der Tiere lag bei 1 Jahr. Die Züchtung

und Haltung erfolgte durch das Tierzentrum am Klinikum der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg im Breisgau.

Eine Genehmigung der Experimente durch die Ethik-Kommission und das

Regierungspräsidium Freiburg lag selbstverständlich vor.

2.2 Materialien

Operationsinstrumente und -materialien

Handbohrer mit Hudson-Ansatz Aesculap AG & Co. KG, D-Tuttlingen

Minischraube Synthes GmbH & Co. KG, D-Umkirch

Ethilon® Ethicon, Johnson & Johnson, B-Brüssel

Prolene® Ethicon, Johnson & Johnson, B-Brüssel

Vicryl® Ethicon, Johnson & Johnson, B-Brüssel

Cyanoacyralat-Kleber Renfert GmbH, D-Hilzingen

Chemikalien und Reagenzien

Isopropanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-Sinsheim

Methanol Merck KgaA, D-Darmstadt

Ethanol Merck KgaA, D-Darmstadt

Aceton Merck KgaA, D-Darmstadt

3-Aminopropyltriethoxy-Silane Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-Sinsheim

para-Phenylendiamin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-Sinsheim

Osmiumtetraoxidlösung 2% Merck KgaA, D-Darmstadt

Cacodylat-Puffer Carl Roth GmbH, D-Karlsruhe

Durucrupan ACM® Fluka Chemie AG, CH-Buchs

De Pex®,Brechungsindex 1,52 Serva Electrophoresis GmbH, D-Heidelberg

20


Geräte

Operationsmikroskop Carl Zeiss Jena GmbH, D-Jena

Mikrotom Supercut 2065 Leica Instruments GmbH, D-Nussloch

7800B Knife Maker LKB-Produkter AB, S-Bromma

Glasstreifen Leica Instruments GmbH, D-Nussloch

Objektträger 76x26 mm Langenbrinck, D-Emmendingen

Probegläschen Kummer, D-Freiburg i.Br

Deckgläser 25x27, Langenbrinck, D-Emmendingen

Inversionsoel Carl Zeiss Jena GmbH, D-Jena

Axioskop Carl Zeiss Jena GmbH, D-Jena

3-Chip-Farbkamera AVT Horn, D-Aalen

Heizplatte Medax, D-Kiel

Computer Software

Axio Vision® 3.0 Carl Zeiss Vision GmbH, D-Eching

analySis® Soft Imaging System GmbH, D-Münster

Excel 2000® Microsoft Corporation, USA-Redmond, WA

SPSS®, Version 10.0 SPSS Inc., USA-Chicago, IL

21


2.3 Methoden

Albinoratten der Gattung Wistar weisen einen ausreichend dicken Fazialisstamm

auf, dessen Verlauf und Zusammensetzung bezüglich der Faszikel dem der

Menschen sehr ähnlich ist. Während des ersten operativen Eingriffs wurde bei den 16 Albinoratten eine

punktuelle, mikroskopgestützte, perineurale Anschlingung des Ramus buccalis

des Nervus facialis vorgenommen. Die Fixation des Fadens erfolgte an einer

Minischraube (ø 1mm) (Synthes GmbH & Co. KG, D-Umkirch), welche sich im

Jochbeinmassiv befand. Täglich wurde der Nerv insgesamt 10 Tage lang um eine

viertel Umdrehung der Schraube distrahiert. Im Idealfall würde dies einem

täglichen Längengewinn des Nerven von 0,785 mm entsprechen ( π×= dU ).

In einem zweiten Eingriff erfolgten die Entnahme des distrahierten

Nervensegmentes und eines entsprechenden Nervensegmentes der nicht

behandelten Gegenseite zur Kontrolle. Nach der histologischen Aufarbeitung

wurden die Präparate histomorphometrisch mit Hilfe eines Lichtmikroskops

(Axioskop Carl Zeiss Jena GmbH, D-Jena) und mittels der Software Axio Vision®

3.0 (Carl Zeiss Vision GmbH, D-Eching) und analySis®

(Soft Imaging System GmbH, D-Münster) computerassistiert auf Zeichen einer

Degeneration des Nerven nach Distraktion ausgewertet.

2.3.1 Operationen

Die Tiere wurden mit 5,4 Vol% Isofluran auf 6 Liter Sauerstoff für ungefähr 2 min.

in einer Narkosevorrichtung prämediziert. Die Anästhesie erfolgte mit

4 mg Chloralhydrat/100g Körpergewicht, welches intraperitoneal injiziert werden

musste (Gellrich 1995). Bei nicht ausreichender Wirkung des Anästhetikums

wurde entsprechend nachinjiziert.

22


Chloralhydrat führt zu einer Allgemeinanästhesie der betroffenen Ratte. Dies hat

den Vorteil, dass es im Gegensatz zu Barbituraten, Halotan oder Stickoxiden

weder die Hämodynamik noch den Metabolismus im Kortex negativ beeinflusst

(Ueki et al. 1988). Eine Intubation zur Beatmung des Tieres ist daher nicht

notwendig.

Zur Darstellung des Nervus facialis wurde das Tier für die Dauer des Eingriffs in

einer Mikrohalterung adjustiert (Gellrich 1995). Der Schädel der Ratte wurde

hierzu beidseitig durch einen Metallstift am Meatus accusticus externus in der

stereotaktischen Halterung fixiert. Die folgenden Schritte konnten nun mit Hilfe

des Operationsmikroskops (Carl Zeiss GmbH, D-Jena) durchgeführt werden. Es

wurde immer die linke Gesichtsseite als Distraktionsseite gewählt, während die

rechte Seite als Kontrollseite diente.

Der operative Zugang erfolgte präaurikulär durch eine mediansagittale Inzision.

Die Kopfhaut wurde unter Umgehung einer Orbitotomie abpräpariert, bis sich

distal der Stamm des Nervus facialis mit seinen Aufzweigungen und proximal das

Jochbein mit der dort ansetzen Muskulatur darstellen ließ.

Der aufgesuchte Ramus buccalis wurde nach proximal in seinem Verlauf

freipräpariert, bis sich seine Endaufzweigungen in der mimischen Muskulatur

verloren. Unter Verdrängung der Muskulatur wurde anschließend mit einem

Handbohrer (Aesculap AG & Co. KG, D-Tuttlingen) die Vorbohrung zur

Aufnahme der Distraktionsschraube (Synthes GmbH & Co. KG, D-Umkirch) in

das Jochbeinmassiv durchgeführt. Anschließend wurde die Minischraube mit

einem Durchmesser von 1 mm und einer Länge von 6 mm oder 8 mm mit einem

Mikroschraubenzieher (Handbohrer mit Hudson-Ansatz, Aesculap AG & Co. KG,

D-Tuttlingen) eingebracht. Der ausreichende Halt im Jochbein wurde überprüft.

Darauf folgte die perineurale Anschlingung des Ramus buccalis n. facialis mittels

eines Polyacrylamidfadens (Ethicon, B-Brüssel) der Stärke 10/0 oder 9/0.

Unterschiedliche Nahtmaterialien und Nadelformen waren zuvor erprobt worden,

wobei sich die gebogenen Nadelformen als am geeignetsten erwiesen. Die

beiden Enden der Naht wurden um die Schraube geschlungen und

festgebunden. Eine zusätzliche Fixierung wurde durch Aufbringen eines

Methacrylat-Klebers (Renfert GmbH, D-Hilzingen) mittels einer Minisonde

erreicht.

23


Der Faden wurde durch Drehen an der Schraube auf Primärspannung gebracht.

Zur Überprüfung der Längenveränderung des Nerven diente eine Markierung in

Form einer Naht mit Vicryl® 4/0 (Ethicon, B-Brüssel), die auf der proximalen Seite

der Anschlingung angebracht war. Der Abstand zum Distraktionsfaden wurde

gemessen und protokolliert (Abb. 5).

Die abpräparierte Gesichtshaut wurde anschließend zurückadaptiert. Mittels einer

Stichinzision wurde die Schraube durch die Gesichtshaut geführt. Der primäre

Wundverschluss erfolgte durch eine Naht mit Vicryl® 4/0.

Anschließend wurden die Tiere den Tierpflegern übergeben, die das Erwachen

und die postoperative Heilungsphase kontrollierten. Im Falle postoperativer

Wundschmerzen erfolgte die Medikation mit Paracetamol oder Acetylsalicylsäure.

Zu jedem Tier wurde ein Operations- und Versuchsprotokoll erstellt (Abb. 6).

Abb. 5: Schematische Darstellung des Zugschraubensystems zur Distraktion des

Ramus buccalis. Die Drehung der Schraube erfolgte täglich um eine viertel

Umdrehung nach rechts.

24


Abb. 6: Versuchsprotokoll

25


Tier

Nr.

OP-

Datum

OP-

Dauer

Gewicht

(g)

Chloral-

hydrat

(ml) (4%)

Nach-

injiziert

(ml) (4%)

Nadel-

Typ Naht

Schraube

(6/8mm)

Distanz

Distraktions-

faden

intraoperativ

(mm)

1 16.03.00 60 min 301 6 (2%) 3(2%) GS13

Spatula Prolene

9/0 8 5,2

2 25.03.00 90 min 390 8(2%) 2(2%) GS13

Spatula Prolene

9/0 6 5,3

3 26.03.00 45 min 380 6(2%) 4(2%) GS13

Spatula Prolene

9/0 6 4,1

4 28.03.00 90 min 365 5 - GS13

Spatula Ethilon

10/0 6 5,5

5 27.03.00 65 min 282 4 - GS13

Spatula Ethilon

10/0 8 4,6

6 28.03.00 60 min 365 6(2%) 3(2%) GS13 Spatula

Ethilon 10/0 6 2,0

7 13.07.00 80 min 301 2 1+1 GS9

Spatula Prolene

10/0 8 4,9

8 13.07.00 60 min 271 2 1 STC6

Spatula Prolene

10/0 8 5,2

9 11.07.00 Tot 230 3 - - - - -

10 18.07.00 45 min 290 2,5 1,5 STC6

Spatula Prolene

10/0 8 4,8

11 18.07.00 50 min 343 5 - GS9

Spatula Prolene

10/0 8 6,1

12 27.07.00 80 min 317 4 - STC6

Spatula Prolene

10/0 4,3

13 08.04.01 75 min 443 5 4 GS9

Spatula Prolene

10/0 8 7,3

14 08.04.01 65 min 404 8 - GS9

Spatula Prolene

10/0 8 5,2

15 08.04.01 60 min 404 7 - GS9

Spatula Prolene

10/0 8 8,2

16 08.04.01 45 min 437 8 - GS9

Spatula Prolene

10/0 8 4,9

Tabelle 3: Auflistung der Tiere aus dem Operationsprotokoll.

Die Tabelle entspricht den Operationsprotokollen aller in dieser Untersuchung

behandelter Tiere. Die Spalte „Distanz des Distraktionsfadens“ entspricht der Distanz

Distraktionsfaden - Markierung vor einer Dehnung des Nerven durch die gesteuerte

primäre Distraktion.

26


2.3.2 Distraktion des Ramus buccalis n. facialis

Zur Distraktion des Ramus buccalis war die im Jochbein fixierte Schraube täglich

um eine viertel Umdrehung (0,785 mm) im Uhrzeigersinn zu bewegen (Abb. 5).

Die Dauer der Distraktion wurde auf 10 Tage festgelegt.

Um den Tieren keine zusätzlichen Schmerzen zuzufügen und die Schraube ohne

Störung drehen zu können, wurden die Ratten in einer dafür vorgesehenen

Kammer einer Kurznarkose unterzogen. Die Narkose erfolgte mit Isofluran

(5,4 Vol%), welches mit 6 l/min Sauerstoff in die Narkosekammer geleitet wurde.

Nach ungefähr zwei Minuten waren die Tiere narkotisiert. Anschließend erfolgte

die Drehung der Schraube mittels eines Mikroschraubenziehers. Nachdem die

Ratten aus der Narkose erwacht waren, wurden sie den Tierpflegern übergeben.

2.3.3 Entnahme der Nervenproben

In einer zweiten Operation wurden die Nervenproben entnommen. Die Tötung

der Tiere erfolgte vor der Operation in einer CO 2 -Kammer. Auf der linken Seite

wurde der ehemalige Operationszugang erneut eröffnet. Nach Freilegung des

Ramus buccalis und Aufsuchen der Anschlingung konnte ein 1,5 cm langes

Segment des Nervus facialis entnommen werden. Aufgrund seiner

ausreichenden Länge war später eine Einteilung in je drei Probenstücke möglich.

Die Schraube wurde ebenfalls entfernt.

27


Zur Entnahme der Kontrollpräparate auf der rechten, nicht-behandelten Seite

wurde präauriculär eine winkelförmige Inzision vorgenommen. Die Gesichtshaut

wurde abpräpariert, bis der Stamm des Nervus facialis dargestellt werden konnte.

Der Ramus buccalis wurde aufgesucht und freipräpariert. Anschließend war auch

hier ein 1,5 cm langes Segment zu entnehmen. Die Proben wurden danach in

Probegläschen mit einer 4%-igen Formalinlösung gelegt und dort bis zur

histologischen Aufarbeitung aufbewahrt. Die Mindestverweildauer betrug 24

Stunden.

2.3.4 Histologische Aufarbeitung der Präparate

Das in 4 % Formaldehydlösung primär fixierte Gewebe wurde mit 0,9 % Natrium-

Chlorid-Lösung zwei Stunden lang gespült. Die Lösung musste währenddessen

dreimal gewechselt werden.

Die Nervensegmente wurden in drei Teile getrennt, um eine genaue

Lokalisierung eventueller Schäden vornehmen zu können. Die Einteilung erfolgte

in ein proximales, mittleres und distales Drittel. Proximal entspricht dabei „in

Richtung Nervenstamm“, während als distal das Nervensegment bezeichnet wird,

welches peripherwärts auf die Distraktionsnaht folgt.

Die proximalen und distalen Anteile wurden etwa auf eine Länge von 0,4 cm

gebracht, während das mittlere Stück, an welchem der Distraktionsfaden fixiert

war, ungefähr eine Länge von 0,7 cm aufwies (Abb. 7).

Für die Kontrastierung und Fixierung des Myelins ist die Methode der Osmierung

sehr geeignet. Durch Osmiumtetraoxid werden ungesättigte Lipide und

ungesättigte Fettsäuren von Proteinen fixiert und durch Oxidation schwarz

eingefärbt.

28


Abb. 7: Einteilung der Nervensegmente in drei Teilstücke

Die Proben wurden zur Nachfixierung für 3 bis 4 Stunden in eine gekühlte 2%-ige

Osmiumtetraoxidlösung (Merck KgaA, D-Darmstadt) in 6%-iger Cacodylatpuffer

(pH 7,6) (Carl Roth GmbH, D-Karlsruhe), eingelegt worden

(Holländer et al. 1968).

Es erfolgte eine Zwischenspülung mit 2,4%-iger NaCl-Lösung, die während 1½

Stunden dreimal gewechselt wurde. Im Anschluss folgte die Dehydrierung der

Proben in einer aufsteigenden Alkoholreihe, beginnend mit 10%-igem Ethanol.

Die Konzentration wurde alle zehn Minuten um 10% erhöht, bis 100% Ethanol

erreicht waren. Zur gänzlichen Entwässerung verblieben die Proben für eine

Stunde in reinem Ethanol, welches nach 30 Minuten nochmals ausgetauscht

wurde. Die Dehydrierung wurde mit Aceton abgeschlossen, das während einer

Einwirkzeit von 30 Minuten dreimal gewechselt wurde.

29


2.3.5 Epoxideinbettung

Die Einbettung der Nervenproben erfolgte in einem Epoxyharz

(Bridge et al. 1994). In der vorliegenden Arbeit wurde Durucrupan ACM® (Fluka

Chemie, CH-Buchs) verwendet, welches auf Araldit-Basis hergestellt wird.

Durucrupan-ACM® besteht aus vier Stammlösungen (Stammlösung A:

M-Epoxyharz, Stammlösung B: Härter, Stammlösung C: Beschleuniger,

Stammlösung D: Weichmacher). Diese vier Komponenten ergeben bei korrekter

Anwendung ein sehr hartes Einbettmaterial für histologische Proben. Zunächst

wurden jeweils 25 ml Lösung A und B gut vermischt. Es folgte die Zugabe von 1

ml Stammlösung C. Am Ende wurden noch 0,5 ml Lösung D hinzugegeben.

Die Proben mussten für eine halbe Stunde bei 37°C in der Aralditlösung belassen

werden. Nach Austausch des Araldits wurden die Proben bei 0°C über Nacht im

Kühlschrank gelagert und am nächsten Tag nochmals auf 37°C erwärmt. Darauf

folgten ein weiterer Austausch des Araldits und eine nochmalige Erwärmung auf

37°C.

Nach drei Stunden konnten die Nervenproben entnommen werden. Sie wurden in

beschriftete Silikon-Formen gegeben und darauf mit Araldit ausgegossen.

Anschließend erfolgte die Polymerisation der Proben bei 75°C für 48 Stunden.

Es wurden von jedem Tier sechs Präparate-Blöcke hergestellt, drei der

distrahierten linken Seite und je drei der Kontrollseite.

Sie waren jeweils in ein distales, ein mittleres und ein proximales Drittel eingeteilt

und mit einer numerischen Kennzeichnung versehen. Insgesamt wurden neunzig

Probe-Blöcke weiter verarbeitet (Tab. 4).

30


Tier Nr. Datum der Entnahme

Proben Nr. Distraktion

Proben Nr. Kontrolle

1 05.04.00 11 12 2 13.04.00 13 14 3 13.04.00 15 16 4 13.04.00 17 18 5 13.04.00 21 22 6 13.04.00 19 20 7 01.08.00 1 2 8 01.08.00 3 4

10 01.08.00 5 6 11 01.08.00 7 8 12 09.08.00 9 10 13 22.04.01 23 24 14 22.04.01 25 26 15 22.04.01 27 28 16 22.04.01 29 30

Tabelle 4: Histologische Nummerierung der Proben nach der Entnahme der Nervensegmente.

Die Einteilung erfolgte nach Distraktionsseite (ungerade Zahlen) und Kontrolle

(gerade Zahlen). Alle Proben wurden in ein proximales, ein mittleres und ein distales

Drittel unterteilt.

Beispiel: Tier Nr. 1, Seite der Distraktion Proben Nr. 11, Segment distal = 11 distal

2.3.6 Herstellung der Semi-Dünnschnitte

Mit Hilfe des Mikrotoms (Leica Instruments, D-Nussloch) wurden Semi-

Dünnschnitte von 1,5 µm Dicke angefertigt (Holländer et al. 1968). Ein Mikrotom

ermöglicht es, mittels eines Glas- oder Diamantmessers von einem Einbettblock

Schnitte in einer vorgegebenen Stärke anzufertigen. Die Epoxidblöcke wurden in

die dafür vorgesehene Halterung eingespannt. Manuell erfolgte das Heranführen

der zukünftigen Schnittfläche an das hier verwendete Glasmesser. Danach wurde

auf maschinelle Bearbeitung umgestellt. Der Schneidevorgang basiert auf einer

Auf- und Abbewegung des Epoxidblocks, der dabei während der absteigenden

Bewegung senkrecht auf die Schneide des Glasmessers trifft. Die mit

3-Aminopropyltriethoxy-Silan (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-Sinsheim)

beschichteten Objektträger (Langenbrinck, D-Emmendingen) wurden mit je 10

Wassertropfen benetzt. Mittels einer Pinzette wurden die Schnitte auf die

Wassertropfen des Objektträgers gestreckt. Die Trocknung erfolgte auf einer

Heizplatte (Medax, D-Kiel). Pro Probe wurden 5 Objektträger mit je 10 Semi-

Dünnschnitten angefertigt.

31


2.3.7 Brechung der Glasmesser

Die Herstellung der Glasmesser (Knife Maker, LKB, S-Bromma) erfolgte durch

Brechung. Aus einer Glasstange (Leica Instruments GmbH, D-Nussloch) wurde

durch Ritzung mit einer scharfen Stahlklinge und nachfolgender Brechung durch

Druck erst ein Quadrat hergestellt. In einem Winkel von 45° wurde das Quadrat

ebenfalls zuerst durch Ritzung die Sollbruchstelle markiert und durch den

aufgebrachten Druck gebrochen. Die unscharfe Glashälfte wurde verworfen.

2.3.8 Kontraststeigerung mit para-Phenylendiamin

Der Kontrast durch Osmiumtetraoxid allein ist nicht ausreichend, um Semi-

Dünnschnitte qualitativ und quantitativ auswerten zu können. Es wäre nur eine

Groborientierung möglich.

Mit para-Phenylendiamin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-Sinsheim) werden

osmophile Strukturen dargestellt, während basophile Gewebe nicht gezeigt

werden (Böck 1984). So ist es hier möglich, nur das Myelin hervorzuheben. Die

ideale Dicke der Semi-Dünnschnitte für die Färbung liegt zwischen 1,5 und 2,5

µm (Holländer und Vaaland 1968).

Die Objektträger mit den aufgebrachten Präparaten wurden auf einer Heizplatte

(Medax, D-Kiel) bei 37°C getrocknet und anschließend für 5 Minuten in eine 1% -

ige Lösung von para-Phenylendiamin in Methanol und Isopropanol

(Verhältnis 1:1) eingebracht. Es folgte eine kurze Spülung der Präparate in

Methanol und Isopropanol und ihre anschließende Trocknung.

Das Eindecken der Präparate wurde mit De Pex (Serva, D-Heidelberg)

vorgenommen.

32


2.3.9 Histomorphometrische Auswertung mittels Lichtmikroskopie

Degenerationsvorgänge peripherer Nerven nach einer Verletzung sind in der

Literatur bekannt und vielfach beschrieben. Es gibt definierte histologische

Bewertungskriterien, die beachtet werden müssen. Wichtige Parameter hierfür

sind: die Anzahl und der Durchmesser der Axone, sowie die Myelinscheidendicke

(Zemp et al. 1981; Gillespie und Stein 1983; Bridge et al. 1994;

O´Sullivan et al. 1998; Lindmuth et al. 2002).

Mit einem Lichtmikroskop (Axioskop, Zeiss, D-Jena), an dem eine Kamera

(AVT, D-Aalen) angeschlossen war, wurde das Bild eines Nervenquerschnitts auf

den Computer übertragen. Zur verbesserten Ansicht wurden die Präparate mit

einem Tropfen Dispersionsöl (Carl Zeiss GmbH, D-Jena) bedeckt.

Die Messungen erfolgten mit Hilfe der Computersoftware analySis®

(Soft Imaging, D-Münster).

Der Querschnitt des Nerven wurde bei 200-facher Vergrößerung in vier

Quadranten eingeteilt (Abb. 8). Durch die Quadranten 1 und 3 wurden die

Messungen in der äußeren, durch die Quadranten 2 und 4 in der inneren Hälfte

vorgenommen. Es wurde beurteilt, ob Zentrum und Peripherie unterschiedliche

Reaktionen auf die Distraktion zeigen.

Abb. 8: Einteilung des Gesamtquerschnitts in 4 Quadranten

33


In 1000-facher Vergrößerung wurde ein Rahmen von 760 x 572 Pixel

(82,8 x 62,3 µm) gesetzt, um einen definierten Quadrantenabschnitt zu erhalten,

der allen Messungen zugrunde liegt (Abb. 9).

Angeschnittene Axone wurden nicht in die Messung einbezogen.

Abb. 9: Ausschnitt des gesetzten Rahmens von 82,3 x 62,3 µm

Die erste Messung bezog sich auf die Myelinscheidendicke. An vier Punkten

wurde die Markscheidendicke in 3-, 6-, 9-, 12- Uhrposition gemessen

(Funktion analySis®: Messen/beliebiger Abstand) und in eine Excel® Tabelle

(Miccrosoft Coperation, USA-Redmond, WA) übertragen (Abb.10).

Abb. 10: Messung der Myelinscheidendicke an vier Punkten der Myelinscheide

34


Anschließend wurde der Umfang der Myelinscheiden im selben Abschnitt

gemessen (Funktion analySis®: Messen/beliebiger Umfang/ beliebige Fläche)

und ebenfalls in eine Excel® Tabelle übertragen worden (Abb. 11).

Abb. 11: Messung des Umfangs der Myelinscheiden

Um den folgenden festgelegten Quadranten zu erfassen, wurde dieser zunächst

in 200-facher Vergrößerung eingestellt und in die 1000-fache Vergrößerung

übertragen.

Der mittlere Außendurchmesser von Axon und Myelinscheide wurde aus der

gemessenen Fläche errechnet: πAD = x 2 (Abb.12)

Die Entscheidung der mathematischen Berechnung basiert auf der Beobachtung,

dass eine direkte Messung schwierig gewesen wäre, da Axon und Myelinscheide

meist nicht kreisrund sind. Mit den errechneten Werten können Messfehler

vermieden und ein objektiver Vergleich angestellt werden.

Abb. 12: Berechnung des Durchmessers aus der Fläche

35


2.3.10 Histologische Auswertung der Präparate

Die Betrachtung der histologischen Präparate erfolgte ebenfalls in 1000-facher

Vergrößerung mit Dispersionsöl. Folgende Merkmale wurden als

Degenerationszeichen gewertet:

• Atrophie von Axon und Myelinscheide, Ablösen des Axons von der

Myelinscheide (Abe et al 1996)

• Kapillarverdichtung, dünn myelinisierte große Axone (Bridge et al 1994)

• Fibrosierung des Endoneuriums und weit auseinanderliegende Axone

(Manders et al. 1987)

• Schwellung der Myelinscheiden (Logroscino et al. 1980) und die

Aufsplitterung der Myelinscheiden in ihre Lamellen (Lahoda 1988; Tackman

1989)

• Unregelmäßigkeit der Form von Axon und Myelinscheide (Gillespie und

Stein 1983)

• Abnahme der Anzahl von Axonen (Carter und Linsey 1987; Holland und

Robinson 1990)

2.3.11 Quantitative Auswertung des Nervenquerschnitts

Um die Anzahl der Axone zwischen distrahierter und nicht-distrahierter Seite

vergleichen zu können, wurden die Axone des gesamten Nervenquerschnitts

gezählt.

Über das Axioskop (Zeiss, D-Jena) und der daran angekoppelten

3-Chip-Farbkamera (AVT, D-Aalen) konnten in 200-facher Vergrößerung die

Bilder der Nervenquerschnitte mit Hilfe des Computerprogramms Axio Vision®

(Zeiss Vision, D-Eching) übertragen, ausgedruckt und von Hand ausgezählt

werden.

Die Werte wurden tabellarisch zusammengefasst. Die Kontrollseite des Tieres

Nummer 15 konnte nicht bewertet werden, da der entnommene Faszikel dem

kleinen Ramus zygomaticus mit einer wesentlich geringeren Axonanzahl

entspricht. Somit wurde dieser nicht in den Vergleich miteinbezogen.

36


2.3.12 Statistische Auswertung

Die Statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels der Software

SPSS® (USA-Chicago, IL)

Durch eine Varianzanalyse für mehr als zwei unabhängigen Stichproben

(einfaktorielle ANOVA) und dem nachfolgenden Test auf Gruppenbildung (nach

Duncan) wurde festgestellt, ob eine Korrelation zwischen den Quadranten

vorliegt. Ebenso wurden mit diesem Verfahren die Unterschiede zwischen den

Sektionen (proximal, mitte, distal) und den Ouadranten (1, 2, 3, 4) der

verschiedenen Seiten verglichen.

Anhand des t-Tests zweier unabhängiger Stichproben

(van der Wey et al. 1996) wurde der Einfluss der Distraktion auf die

Messparameter (Myelinscheidendicke, Umfang, Fläche, mittlerer

Außendurchmesser) im Vergleich zu der Kontrollseite statistisch überprüft. Durch

diesen Test können die Gleichheit der Varianzen (Standardfehler im Quadrat)

und die Irrtumswahrscheinlichkeit p der zu vergleichenden Mittelwerte

(Signifikanz) ermittelt werden. Die Vorrausetzung zur Durchführung eines t-Tests

ist das Vorliegen einer Normalverteilung. Dies war bei allen zu vergleichenden

Proben der Fall.

Die oben genannten Messparameter der distrahierten Seite wurden mit

Parametern der nicht-behandelten Seite verglichen.

Aus den Einzelwerttabellen der gemessenen Parameter wurden in der Computer-

Software Excel® (Microsoft USA, Redmond, WA) das Maximum, das Minimum,

der Mittelwert und die Standardabweichung ermittelt. So war es möglich, den

mittleren Innendurchmesser (Innendurchmesser D= Außendurchmesser D - 2x

Myelinscheidendicke) und die G-Ratio zu berechnen. Die G-Ratio ist ein wichtiger

Faktor für die Nervenleitgeschwindigkeit und beschreibt das Verhältnis zwischen

Axondurchmesser ohne Myelinscheide und Axondurchmesser mit Myelinscheide.

Der optimale theoretische Wert liegt bei 0,6 (Rushton 1951,

De Jong et al. 1991). Aufgrund der Errechnung aus Mittelwerten wird für die

beiden letztgenannten Werte nur eine Tendenz angegeben.

37

Ergebnisse

3 Ergebnisse Von den insgesamt 16 Tieren verstarb ein Tier während der Narkose. Der

Distraktionsfaden des Tieres Nr. 8 war während der Verlängerung des Nerven

gerissen, der Zeitpunkt der Divulsion konnte nicht bestimmt werden.

Anhand von zwei Stichproben wurde der Längengewinn des Ramus buccalis

nach der moduliert gerichteten primären Distraktion überprüft. Diese führte bei

Tier Nr. 7 zu einer Verlängerung von 5,1 mm, bei Tier Nr. 15 zu einer

Verlängerung von 8 mm.

3.1 Histologische Auswertung

Die Anzahl der zu untersuchenden Präparate betrug auf Seiten der Distraktion

N=45 und auf der Kontrollseite N=42. Das Kontrollpräparat des Tieres 16 konnte

nicht in die Auswertung einbezogen werden, da der Faszikel des kleinen Ramus

zygomaticus mit einer sehr geringen Axonanzahl entnommen wurde.

Das erste Präparat mit der ungeraden Probennummer entsprach der distrahierten

Seite des Tieres, darauf folgte mit der geraden Nummerierung die entsprechende

Kontrollseite des Tieres.

Bei zwei Tieren waren die Präparate der distrahierten Seite und ihre

Kontrollseiten völlig degeneriert. Dies ist auf einen Fehler in der Lagerung oder in

der histologischen Aufbereitung der Präparate zurückzuführen.

Das Gesamtergebnis der histologischen Untersuchung erwies, dass in allen

Segmenten (proximal, mitte, distal) degenerative Veränderungen der

Myelinscheiden als Folge der primären Distraktion der Nervus facialis auftraten.

Starke Degenerationserscheinungen waren vermehrt im distalen Drittel der

entnommenen Nervenproben zu erkennen (Tab. 5).

38

Ergebnisse

Proben Nr. der distrahierten Seite

Grad der Degeneration

Proben Nr. der Kontrolle

Grad der Degeneration

1 proximal + 2 proximal 0 1 mitte + 2 mitte 0 1 distal + 2 distal + 3 proximal + 4 proximal + 3 mitte + 4 mitte 0 - + 3 distal +++ 4 distal 0 5 proximal ++ 6 proximal + 5 mitte 0 6 mitte 0 5 distal 0 6 distal 0 7 proximal + 8 proximal 0 7 mitte ++ 8 mitte 0 7 distal ++ 8 distal 0 9 proximal - distal ++++ 10 proximal - distal ++++ 11 proximal - distal ++++ 12 proximal - distal ++++ 13 proximal +++ 14 proximal + 13 mitte +++ 14 mitte + 13 distal +++ 14 distal + 15 proximal ++ 14 proximal ++ 15 mitte +++ 16 mitte + 15 distal +++ 16 distal + 17 proximal - distal ++ 18 proximal - distal + 19 proximal ++ 20 proximal + 19 mitte ++ 20 mitte 0 19 distal +++ 20 distal 0 21 proximal +++ 22 proximal 0 - + 21 mitte +++ 22 mitte + 21 distal +++ 22 distal 0 23 proximal ++ 24 proximal + 23 mitte ++ 24 mitte 0 23 distal +++ 24 distal 0 25 proximal + 26 proximal 0 25 mitte ++ 26 mitte 0 25 distal + 26 distal 0 27 proximal 0 28 proximal 0 27 mitte 0 28 mitte 0 27 distal ++ 28 distal 0 29 proximal 0 29 mitte 0 29 distal +

Tabelle 5: Einteilung der Präparate anhand der beobachteten Degenerationszeichen

0 = keine Veränderung,

+ = geringe Veränderung (Myelinscheidenschwellungen),

++ = mäßige Veränderung (vereinzelte Aufsplitterungen der Myelinscheiden),

+++ = starke Veränderung (Aufsplitterungen der Myelinscheiden),

++++ = vollständige Degeneration

39

Ergebnisse

Beschreibende Ergebnisse der Histologie:

Abkürzungen: proximal= prox, mitte= mitt, distal = dist

1prox, 1mitt: Auffällige Zeichen axonaler Degeneration sind nicht zu

beobachten.

1dist: Die Myelinscheiden in diesem Präparat sind häufig längs

angeschnitten in diesen Abschnitten ist die Differenzierung

aufgeschwollener Myelinscheiden schwierig; in den quer

angeschnittenen Bereichen sind vereinzelt aufgeschwollene

Myelinscheiden zu erkennen.

2prox, 2mitt: Myelinscheiden und Axone sind intakt (Abb. 13).

2dist: Der Nerv weist Degenerationszeichen auf, bei einzelnen

Myelinscheiden ist eine Aufspaltung der Myelinlamellen

erkennbar, der Abstand zwischen den Axonen ist etwas

vergrößert.

Abb. 13: Präparat 10 proximal

3prox, 3mitt: Außer verdickten Myelinscheiden können fast keine

Degenerationszeichen festgestellt werden.

40

Ergebnisse

3dist: Besonders im ersten Quadranten zeigen sich Zeichen einer

Degeneration: Formveränderungen der Axone und ihrer

Myelinscheiden, Schwellung und Aufsplitterung in Myelinlamellen

(Abb.14).

Abb. 14: Präparat 3 distal

4prox: Das Präparat ist sehr dunkel eingefärbt, es ist wenig

Degeneration im klassischen Sinn vorhanden. Es sind kleine,

dicht gepackte Axone zu erkennen.

4mitt: Außer geringen Formabweichungen der Myelinscheiden sind

wenige Veränderungen zu beobachten. Einzelne untergegangene

Axone sind in den Quadranten 1 und 2 zu sehen.

4dist: Es fallen keine Degenerationszeichen auf, die Axone sind relativ

regelmäßig geformt, die kleinen Axone haben verhältnismäßig

dünne Myelinscheiden.

5prox: Einzelne Axone fallen durch geschwollene oder aufgesplitterte

Myelinscheiden auf, die Nervenfasern erscheinen sehr klein, eine

Häufung aufgeschwollener Myelinscheiden befindet sich im

Quadranten 3.

5prox, 5dist: Es sind keine Anzeichen von Degeneration zu erkennen.

41

Ergebnisse

6prox, 6mitt: Die äußere Form der Faszikel dieser Präparate ist sehr

unregelmäßig, sonst sind sie intakt. Es sind längs angeschnittene

Myelinscheiden vorhanden.

6dist: Faszikel, Axone und Myelinscheiden sind unversehrt.

7prox-7dist: In diesen Präparaten sind vereinzelt angeschwollene

Myelinscheiden zu sehen.

8prox: Das Präparat ist unauffällig.

8mitt: Längs angeschnittene Myelinscheiden in diesem sonst

unversehrten Querschnitt zu beobachten.

8dist: Vereinzelte Axone zeigen aufgeschwollene Myelinscheiden.

9prox: Die axonale Degeneration ist fortgeschritten, aufgeschwollene

Myelinscheiden und die Aufsplitterung in Myelinlamellen sind bei

den meisten Markscheiden zu sehen. Bei 1/3 der Myelinscheiden

ist keine Dicke messbar.

Abb. 15: Präparat 9 mitte

42

Ergebnisse

9mitt, 9dist: Das Präparat zeigt auffällige Abweichungen, die Myelinscheiden

sind aufgesplittert. Es dominieren zu 2/3 Markballen.

(Abb. 15 und 16).


10prox-10dist: Diese Nervenpräparate sind durch starke Degeneration

gekennzeichnet. Zu 50% ist eine Bildung von Markballen sichtbar.

Die restlichen Myelinscheiden sind aufgesplittert, was

wahrscheinlich auf einen Fehler während der Aufbewahrung oder

der Aufbereitung der Präparate zurückzuführen ist (Abb.17).

Abb. 17: Präparat 10 mittel

11prox: Markballen und aufgesplitterte Myelinlamellen sowie

auseinandergerissene Axone mit fibrösem endoneuralen

Zwischengewebe bestimmen das Bild.

43

Ergebnisse

11mitt: Fast alle Myelinscheiden weisen eine Aufsplitterung der Lamellen

auf.

11dist: Die Hälfte der Axone lässt eine Aufsplitterung der Lamellen

erkennen.

12prox-12dist: Wie in Präparat 18 ist wahrscheinlich ein Fehler in der

Verarbeitung oder der Aufbewahrung für das degenerative

Erscheinungsbild verantwortlich (Abb. 18).

Abb. 18: Präparat 12 mitte

13prox: Die Myelinscheiden sind aufgeschwollen, ebenso kann

Markballenbildung beobachtet werden.

13mitt: Nur wenig myelinisierte Axone mit viel Zwischensubstanz sind

dargestellt, wobei die vorhandenen Axone einen intakt sind. Es

fallen viele kleine Nervenfasern auf, deren Myelinscheiden etwas

dünner als im Kontrollpräparat wirken.

13dist: Es sind wenig intakte myelinisierte Axone in großem Abstand

zueinander zu sehen, allerdings befinden sich außerordentlich

kleine Nervenfasern im dritten Quadranten; dies könnte auf einen

Regenerationsprozess hindeuten (Abb. 19).

44

Ergebnisse


14prox: Die Axone liegen dicht beieinander, die Myelinscheiden sind

unversehrt.

14mitt, 14dist: Vereinzelt sind die Markscheiden geschwollen und

Aufsplitterungen in Lamellen können beobachtet werden.

15prox: Die einzelnen Nervenfasern liegen dicht gedrängt, ihre

Myelinscheiden sind angeschwollen und teilweise untergegangen

(Abb. 20).

Abb.20: Präparat 15 proximal

45

Ergebnisse

15mitt, 15dist: Es sind weit auseinandergerissene Axone zu sehen, und

Markfragmente untergegangener Axone treten in Erscheinung,

das weitere Bild wird durch sehr wenig intakte Axone mit

ausreichender Myelinscheidendicke und gleichmäßiger Form

geprägt (Abb. 21).


16prox-16dist: Die Axone liegen dicht beisammen, und es zeigen sich einzelne

Axone mit aufgeschwollenen Myelinscheiden.

17prox-17dist: Die Nervenfasern haben einen etwas größeren Abstand

zueinander als im Kontrollpräparat, die Myelinscheiden wirken

partiell angeschwollen, Schollenbildung der Myelinscheiden

lässt sich erkennen (Abb. 22).


46

Ergebnisse

18prox: Viele Axone sind längs angeschnitten, deutliche

Degenerationszeichen sind erkennbar, die Markscheiden sind

eher kugelförmig geschwollen.

18mitt: Kugelförmige Schwellungen der Markscheiden sind zu

beobachten.

18dist: Die Myelinscheiden sind sehr dünn. Einige zeigen eine

Aufsplitterung der Myelinlamellen.

19prox: Auch in diesem Präparat können viele längs angeschnittene

Axone mit kugelförmiger Degeneration der Myelinscheiden

wahrgenommen werden. Es fallen dichte Abstände der

Nervenfasern zueinander auf.

19mitt, 19dist: Die Axone liegen relativ nahe beieinander; die Markscheiden sind

vereinzelt aufgeschwollen (Abb. 23).


20prox-20dist: Vereinzelt sind degenerierte Axone mit aufgeschwollenen

Myelinscheiden zu beobachten.

47

Ergebnisse

21prox: Die Axone liegen dicht beieinander, sie zeigen keine

Formabweichungen, Ödeme der Myelinscheiden und viele kleine

Axone sind sichtbar (Abb. 24).


21mitt: Die Qualität des Präparates ist fraglich, da die meisten

Nervenfasern längs angeschnitten sind; es fallen kugelförmige

Myelinscheidenverdickungen auf (vor allem in den Quadranten 3

und 4).

21dist: Die Anzahl der Axone mit geschwollenen Myelinscheiden hat im

Vergleich zum proximalen und mittleren Drittel dieses

Nervensegmentes zugenommen, kugelförmige

Markscheidenverdickung sowie Aufsplitterung des Myelins zeigen

sich.

22prox-22dist: Das Präparat ist unauffällig, vereinzelt sind aufgeschwollene

Myelinscheiden zu erkennen.

23prox: Die Axone liegen etwas weiter auseinandergedrängt, die

Markscheiden sind sehr dick, doch sie zeigen keine Zeichen von

Aufsplitterung oder Kugelbildung. Leichte Formveränderungen

sind zu bemerken.

48

Ergebnisse

23mitt: Größtenteils sind die Nervenfasern längs getroffen, relativ dicke

Myelinscheiden und verhältnismäßig große Axone fallen auf.

23dist: Die Axone haben eine gleichmäßige Form und wirken etwas

auseinandergedrängt, die Myelinscheiden sind nicht geschwollen.

Im zweiten Quadranten befinden sich auffällig kleine

Nervenfasern, was auf einen die auf Regenerationsprozess

hindeutet (Abb.25).


In der Abbildung rechts sind Anzeichen von Regeneration zu sehen.

24prox-24dist: Die Form der Markscheiden ist gleichmäßig, es sind viele kleine

Axone vorhanden.

25prox: Schwellungen der Markscheiden sind vereinzelt zu beobachten.

25mitt, 25dist: Die myelinisierten Axone sind intakt, sie weisen etwas größere

Abstände zueinander auf als in ihrem Kontrollpräparat.

26prox-26dist: Die Axone sind unversehrt, die Myelinscheiden wirken drall, aber

nicht geschwollen.

49

Ergebnisse

27prox-27dist: Die Axone sind in Form und Größe unauffällig, im distalen

Präparat sind vereinzelt Axone mit aufgeschwollenen

Myelinscheiden feststellbar.

28prox-28dist: Es sind fast keine Degenerationszeichen zu sehen, nur Präparat

36 dist zeigt mehr aufgeschwollene Markscheiden als die

Kontrollpräparate 35 prox-dist.

29prox: Es sind keine Verdickungen, aber starke Formabweichungen der

Myelinscheiden in diesem Präparat zu beobachten, die

Nervenfasern liegen dicht gedrängt, und ihre Größe ist gering.

29mitt, 29dist: Es ist keine Waller´sche Degeneration zu erkennen (Abb. 26).


50

Ergebnisse

3.2 Auswertung der histomorphometrischen Ergebnisse

3.2.1 Normalwerte des Ramus buccalis

Die morphometrischen Ergebnisse der Präparate der Kontrollseite dienten zur

Ermittlung der durchschnittlichen Normalwerte (Referenz). Sie wurden aufgrund

der histologischen Endergebnisse ausgewählt. Ausgeschlossen wurden

Präparate, die morphologische Zeichen zunehmender Degeneration aufwiesen.

Die Normalwerte wurden für Myelinscheidendicke und -umfang, den mittleren

Durchmesser der Myelinscheiden und den Durchmesser der Axone ermittelt

(Tab. 6).

Maximum Minimum Mittelwert Standard-abweichung Gültige N

Myelinscheidendicke (µm) 1,504 0,843 1,209 ± 0,148 116

mittl. Durchmesser Myelinscheide (µm) 8,423 6,012 6,850 ± 0,458 116

Axondurchmesser (µm) 5,567 3,589 4,433 ± 0,332 116

Fläche Myelinscheide (µm) 59,620 29,936 39,257 ± 5,289 116

Umfang Myelinscheide (µm) 30,544 20,627 23,972 ± 1,860 115

Anzahl der Axone gesamt 2053 825 1583 ± 302 116

Tabelle 6: Normalwerte des Ramus buccalis. Die Standardabweichung ist auf die Mittelwerte

zu beziehen. Gewertete Präparate Zahl N = 29 von insgesamt N = 87.

51

Ergebnisse

3.2.2 Der Ramus buccalis nach Distraktion

Als Grundlage für die Bewertung der Auswirkung der Distraktion auf den Ramus

buccalis wurden bei den statistischen Tests nicht die oben genannten Idealwerte

benutzt. Sie dienen nur zur Übersicht.

Die Untersuchungen basieren auf einem intraindividuellen Seitenvergleich

zwischen distrahierter und Kontrollseite der gemessenen Werte eines jeden

Tieres.

Myelinscheiden

Die Dicke wurde an vier Punkten der Myelinscheiden gemessen. Es standen

117.665 Einzelwerte für den Vergleich zur Verfügung, wobei die Distraktionsseite

60.860 und die Kontrollseite 58.848 Werte enthielten.

Präparat Nr. 29 ist nur in der Gesamtwertung, nicht im Seitenvergleich vertreten.

Der Vergleich innerhalb der Quadranten und Sektionen (einfaktorielle ANOVA)

und der Test auf Untergruppen (Duncan) wurde vor dem t-Test durchgeführt, um

festzustellen, ob eine Korrelation der Quadranten vorliegt. Da dies nicht der Fall

ist, konnte ein Seitenvergleich aller Werte eines Tieres vorgenommen werden.

Das Ergebnis wird aus methodischen Gründen erst später erläutert.

Gesamtwertung:

Der Vergleich der Mittelwerte zeigt einen höchst signifikanten Unterschied

zwischen den beiden Seiten. Dabei ist der Mittelwert auf der distrahierten Seite

geringer als in der Kontrolle.

Es kann die Aussage getroffen werden, dass in der Gesamtuntersuchung die

Myelinscheidendicke auf der distrahierten Seite abnimmt.

Einzelwertung:

In den Vergleichen zwischen Distraktion und Kontrolle eines jeden Tieres stellt

man bei 4 Tieren eine Zunahme der Myelinscheidendicke auf der distrahierten

Seite fest.

52

Ergebnisse

Diese erhöhten Werte in den 4 Präparaten deuten auf ein generelles

Anschwellen der Myelinscheiden als Reaktion auf die Distraktion hin.

(Tab. 7). Bei der histologischen Betrachtung dieser Präparate ist dies nur bei

Probe Nr. 19 deutlich zu sehen.

Probe Varianz Signifikanz Ab-/Zunahme

Gesamt *** *** (-) 1/2 ns *** (-) 3/4 *** *** (-) 5/6 *** ns (+) 7/8 *** *** (-)

9/10 ns * (+) 11/12 ns *** (-) 13/14 *** *** (-) 15/16 *** *** (-) 17/18 *** *** (-) 19/20 *** *** (+) 21/22 ns *** (=) 23/24 *** *** (-) 25/26 ns ns (+) 27/28 ns *** (-)

Tabelle 7: Myelinscheidendicke im Seitenvergleich

(-) = Abnahme der Myelinscheidendicke auf der distrahierten Seite

(+) = Zunahme der Myelinscheidendicke auf der distrahierten Seite

nicht signifikant p>0,05 (ns) sehr signifikant p<=0,01(**)

signifikant p<=0,05 (*) höchst signifikant p<=0,001 (***)

Quadranten:

Die Messungen wurden in zwei Quadranten zentral und in zwei Quadranten

peripher vorgenommen. Das Ergebnis der einfaktoriellen ANOVA, deren Post-

Hoc-Test Untergruppen aufzeigt, lässt folgenden Schluss zu:

Es bilden sich im Test Untergruppen mit höchst signifikantem Unterschied, doch

weder auf der Kontrollseite noch auf der Seite der Distraktion ist eine einheitliche

Reaktion von Zentrum und Peripherie mit signifikantem Unterschied festzustellen.

Somit wird die Annahme nicht bestätigt, dass Zentrum und Peripherie

unterschiedlich auf die Distraktion reagieren.

53

Ergebnisse

Segmente

Mit der Varianzanalyse von mehr als 2 unabhängigen Stichproben (einfaktorielle

ANOVA) sollte geprüft werden, in welchem der Segmente die Veränderungen

bezüglich der Myelinscheidendicken nach Distraktion am deutlichsten waren.

Für den Vergleich zwischen den unterschiedlichen Segmenten des

entnommenen Nervenstückes, die in ein proximales, mittleres und distales Drittel

eingeteilt sind, ergibt der Post-Hoc-Test folgendes Ergebnis:

Auf der Kontrollseite bilden sich 3 Untergruppen mit einem signifikanten

Unterschied der Mittelwerte. Der geringste Wert der Myelinscheidendicke ist im

proximalen Segment vorzufinden.

Auf der distrahierten Seite sind nur 2 Gruppen mit signifikant unterschiedlichen

Mittelwerten zu sehen. Hier ist der geringste Wert für die Dicke im distalen

Segment zu finden, welches einer Gruppe entspricht. Das proximale und das

mittlere Drittel bilden die zweite Gruppe.

Vergleicht man die Werte der distrahierten Seite mit denen der Kontrolle, so zeigt

sich die größte Abnahme der Myelinscheidendicke im distalen distrahierten

Segment. Im mittleren Drittel nimmt die Dicke nach Distraktion ebenfalls ab.

Proximal ist zwischen behandelter und unbehandelter Seite kein Unterschied

festzustellen (Tab. 8).

Sektion Distraktion Dicke (µm) N Kontrolle

Dicke (µm) N

Proximal 1,164 21568 1,171 20034

Mitte 1,171 18785 1,212 19530

Distal 1,116 18462 1,193 19284

Tabelle 8: Vergleich der Myelinscheidendicke zwischen distrahierter Seite und Kontrollseite

54

Ergebnisse

Durchmesser

Betrachtet man das Ergebnis des t-Testes für die Gesamtheit des mittleren

Durchmessers, so nimmt dieser auf der distrahierten Seite ab.

Die mittlere Differenz beträgt dabei minus 0,1 µm, wobei sich die Anzahl N der

untersuchten Werte von 15.639 der Kontrollseite auf 16.249 auf der

Distraktionsseite erhöht. Proximal steigt die Anzahl N der zu vergleichenden

Werte am stärksten an, was auf einen Regenerationsprozess durch

ausprossende Axone von proximal zurückzuführen ist.

Bei den einzelnen Seitenvergleichen (N=14) der Tiere, kann in 10 Fällen eine

Abnahme und in 4 Fällen (Proben-Nr.: 11, 23, 27, 33) eine Zunahme des

Durchmessers festgestellt werden (Abb. 27).

Zwischen proximal, medial und distal ist ein höchst signifikanter Unterschied der

Mittelwerte zu erkennen, im distalen Segment nimmt der Durchmesser mit

0,209 µm am meisten ab.

Anhand der Überprüfung der Quadranten kann die Aussage getroffen werden,

dass in der Reaktion auf die Distraktion kein Unterschied zwischen Zentrum und

Peripherie erkennbar ist.

Seite proximal Untersuchte Einzelwerte

N mitte

Untersuchte Einzelwerte

N distal

Untersuchte Einzelwerte

N Distraktion 6,39 5959 6,83 5118 6,51 5172

Kontrolle 6,49 5391 6,80 5044 6,73 5204

Tabelle 9: Vergleich der Mittelwerte des Durchmessers

Anzahl der untersuchten Präparate: Seite der Distraktion N = 90,

Seite der Kontrolle N= 87.

55

Ergebnisse

Abb. 27: Mittelwerte des Durchmessers der Axone mit ihrer Myelinscheide :

Der Unterschied der Werte des mittleren Durchmessers ist

mit p < 0,001 im Seitenvergleich höchst signifikant.

56

Ergebnisse

Umfang der Myelinscheiden

Die statistische Auswertung ergibt eine Abnahme der Werte des Umfangs von

Axon und Myelinscheide (p = 0,001) auf Seiten der Distraktion, die allerdings bei

einem durchschnittlichen Umfang von 23,5 µm mit 0,233 µm gering ist (Abb. 28).

Eine Einteilung in drei Gruppen, die den proximalen, mittleren und distalen

Nervensegmenten entsprechen, ist bei den distrahierten Proben und der

Kontrolle zu sehen. Im Verhältnis zur Kontrollseite ist nach der Distraktion im

mittleren und distalen Segment eine Zunahme des Umfanges von circa 0,48 µm

zu beobachten, proximal nimmt er geringfügig ab.

Die Überprüfung der Reaktion von Zentrum und Peripherie auf die Distraktion

zeigt, dass in Quadrant 1 eine Zunahme des Umfanges erfolgte, während in

Quadrant 3 der Umfang abnahm. Diese Quadranten stehen in der Arbeit für

Messungen, die zentral vorgenommen wurden. Es kann nicht davon

ausgegangen werden, dass eine einheitliche Reaktion des Zentrums auf die

Distraktion entstanden ist.

Abb. 28: Boxplot der Mittelwerte des Umfangs. Die X-Achse entspricht

der OP-Seite: 1= distrahiert und 2= Kontrolle

57

Ergebnisse

Axondurchmesser

Der Axondurchmesser wurde aufgrund der Kontrastierung mit para-

Phenylendiamin als Innendurchmesser der Myelinscheiden kalkuliert und aus den

Mittelwerten berechnet:

Innendurchmesser D= Außendurchmesser D - 2 x Myelinscheidendicke

Im Seitenvergleich ist kein signifikanter Unterschied der Durchmesser

feststellbar. (Abb. 29)

Abb. .29: Boxplot der Mittelwerte des errechneten Innendurchmessers.

Die X-Achse entspricht OP-Seite 1= distrahiert, OP-Seite 2= Kontrolle

ein signifikanter Unterschied ist nicht zu erkennen

58

Ergebnisse

G-Ratio

Die G-Ratio ist ein Parameter für die Nervenleitgeschwindigkeit. Sie kann Werte

zwischen 0 und 1 annehmen. Der ideale Wert der G-Ratio liegt bei 0,6. Als

Reaktion auf eine Zunahme der Myelinscheidendicke folgt eine Abnahme der G-

Ratio.

Vergleicht man die Mittelwerte im t-Test, so liegen sie mit 0,642 ± 0,042 auf der

Kontrollseite und 0,650 ± 0,037 auf der distrahierten Seite im idealen Bereich

(Abb. 30). Die Minimal- und Maximalwerte der G-Ratio auf der distrahierten Seite

und der Kontrollseite sind Tabelle 10 zu entnehmen.

Abb. 30: Mittelwerte der G-Ratio: Die meisten Werte für die G-Ratio liegen bei 0,65.

Der Minimalwert liegt bei 12 proximal zu sehen.

OP Seite (li1/re2) Probennummer Wert

Maximum 1 dist 0,73 1

Minimum 15 prox 0,53

Maximum 10 dist 0,78 G-Ratio

2 Minimum 12 prox 0,47

Tabelle 10: Minimal- und Maximalwerte der G-Ratio auf der Distraktions- und Kontrollseite

1= Distraktion, 2= Kontrolle

59

Ergebnisse

3.3 Quantitative Auswertung der Axonanzahl Im Vergleich der Mittelwerte ist eine Abnahme der myelinisierten Axone von

-13,32 auf Seiten der Distraktion zu beobachten (Tab. 11).

Es ergibt sich eine Heterogenität der Varianzen zwischen Seite 1 und 2. Dennoch

erweist sich die Differenz der Mittelwerte als statistisch nicht signifikant.

Proben Nr. gedehnt Anzahl Proben Nr.

Kontrolle Anzahl Unterschied (+ gedehnt mehr als Kontrolle)

1 prox 1721 2 prox 1673 + 48 1 mitte 1810 2 mitte 1962 -152 1 dist 1849 2 dist 1917 - 68 3 prox 1755 4 prox 1511 +244 3 mitte 1494 4 mitte 1764 -270 3 dist 1478 4 dist 1497 - 19 5 prox 1783 6 prox 1390 +393 5 mitte 1759 6 mitte 1373 +386 5 dist 1638 6 dist 1636 + 2 7 prox 1163 8 prox 825 +338 7 mitte 1165 8 mitte 808 +357 7 dist 1082 8 dist 1346 -264 9 prox 1489 10 prox 1744 -255 9 mitte 1458 10 med 1583 -125 9 dist 1012 10 dist 1553 -541

11 prox 1714 12 prox 1737 - 23 11 mitte 1378 12mitte 1448 - 70 11 dist 1387 12 dist 1550 -163 13 prox 1558 14 prox 1407 +151 13 mitte 1448 14 mitte 1483 - 35 13 dist 1451 14 dist 1461 - 10 15 prox 1581 16 prox 1912 -331 15 mitte 1591 16 mitte 1691 -100 15 dist 1562 16 dist 1826 -264 17 prox 1571 18 prox 1506 + 65 17 mitte 1358 18 mitte 1304 + 54 17 dist 1343 18 dist 1168 +175 19 prox 1781 20 prox 1785 - 4 19 mitte 1528 20 mitte 1683 -155 19 dist 1319 20 dist 1801 -482 21 prox 1386 22 prox 1704 -318 21 mitte 1436 22 mitte 1558 -120 21 dist 1373 22 dist 1542 -169 23 prox 1667 24 prox 1002 + 65 23 mitte 1825 24 mitte 977 +848 23 dist 2001 24 dist 1044 +957 25 prox 1758 26 prox 2053 -295 25 mitte 1652 26 mitte 1866 -214 25 dist 1587 26 dist 1664 - 77 27 prox 2011 28 prox 1837 +174 27 mitte 1638 28 mitte 1775 -137 27 dist 1758 28 dist 1503 +255 29 prox 1323 30 prox (191) nicht auszuwerten 29 mitte 1387 30 mitte nicht auszuwerten 29 dist 1276 30 dist nicht auszuwerten

Tabelle 11: Anzahl der Axone im intraindividuellen Seitenvergleich

60

Ergebnisse

Bei einer Gesamtzahl von 45 Vergleichswerten, die 100% entsprechen würden,

ergibt sich aus der Gegenüberstellung von distrahierter und nicht behandelter

Seite in 31,1% eine höhere Axonanzahl auf der distrahierten Seite. In 57,8 % ist

die Anzahl der Axone im Vergleich zur Kontrollseite erniedrigt (Abb. 31). Bei 7,7%

konnte keine Auswertung vorgenommen werden, da Präparat 38 dem Faszikel

des kleinen Ramus zygomaticus entspricht (Anzahl der Axone 191) und so ein

objektiver Vergleich nicht möglich ist.

Abb. 31: Der Vergleich der Mittelwerte bezogen auf die Anzahl der Axone im gesamten

Nervenquerschnitt: Die linke Seite zeigt die Kontrolle, während rechts die Werte der

Distraktion dargestellt sind. Maximal- und Minimalwert entsprechen in der Graphik

UCL (= upper control limit) und LCL (= lower control limit)

TEIL distrahiert Kontrolle

dist Mittelwert 1474,40 1536,29 N 15 14 Standardabweichung 268,89 239,91 Varianz 72302,114 57554,835

med Mittelwert 1528,47 1519,64 N 15 14 Standardabweichung 184,49 325,51 Varianz 34036,124 105959,478

prox Mittelwert 1617,40 1577,57 N 15 14 Standardabweichung 213,90 339,44 Varianz 45751,829 115222,264

Insgesamt Mittelwert 1540,09 1544,50 N 45 42 Standardabweichung 227,92 298,31 Varianz 51946,992 88987,378

Insgesamt ist die Abnahme der Anzahl

myelinisierter Axone mit -4,41 auf der

distrahierten Seite der Tiere gering.

Prüft man die unterschiedlichen Werte

innerhalb der Segmente, erkennt man, dass

eine leichte Abnahme der myelinisierten

Axone im distalen Drittel. In den Proben des

proximalen und mittleren nimmt dagegen

Axonanzahl leicht zu.

Tabelle 12: Betrachtung der Mittelwerte Anzahl von Axonen in einem Nervenquerschnitt

bezüglich der Einteilung in die Segmente poximal, medial und distal.

61

Ergebnisse

Zusammenfassung der Ergebnisse

Bei sämtlichen untersuchten Parametern ist infolge der Distraktion eine Abnahme

der Mittelwerte von Myelinscheidendicke, Umfang, mittlerem Durchmesser,

Innendurchmesser, G-Ratio und Anzahl zu verzeichnen. Am deutlichsten macht

sich die Verringerung der gemessenen Werte im distalen Segment bemerkbar.

Betrachtet man die Maximal- und Minimalwerte der distrahierten Seite und der

Kontrollseite, so fällt auf, dass auf Seiten der Distraktion die Maximalwerte bei

allen Parametern zunehmen, während die Minimalwerte abnehmen. Die

Zunahme der Standardabweichung der Mittelwerte auf Seiten der Distraktion

bestätigt diese Tendenz. Der Wert der Nervenleitgeschwindigkeit, als G-Ratio

bezeichnet, liegt im Bereich von ± 0,6. Der Vergleich der Axonanzahl zwischen

distrahierter und nicht behandelter Seite zeigt keinen statistisch signifikanten

Unterschied. Es zeigt sich jedoch eine geringe Abnahme der Axonanzahl im

distalen Drittel sowie eine leichte Zunahme der Anzahl im mittleren und

proximalen Drittel.

Maximum Minimum Mittelwert Standard

abweichung Gültige N

Myelinscheidendicke 1,635 0,444 1,177 ± 0,192 180

mittl. Durchmesser 9,541 3,193 6,710 ± 0,806 180

Axondurchmesser 6,679 2,291 4,356 ± 0,564 180

Fläche 74,872 9,562 38,210 ± 8,643 180

Umfang 37,165 11,345 23,826 ± 3,177 180

G-Ratio 0,732 0,532 0,650 ± 3,707 180

Anzahl gesamt 2011 1012 1540,09 ± 226,00 180

Tabelle 13: Werte des distrahierten Ramus buccalis. Die Standardabweichung ist auf die

Mittelwerte zu beziehen. Berücksichtigte Anzahl N = 45 von einer Gesamtanzahl

N = 87 der Präparate

In den einzelnen distrahierten Präparaten finden sich neben fokalen

Schwellungen des Myelins auch dünn myelinisierte Axone, zum Teil

Faserverluste und Muster regenerierender Nervenfasern.

62

Diskussion

4 Diskussion Zahlreiche Studien beschreiben die Abläufe der sekundären Nervendegeneration

nach einer Verletzung. Die Neurotmesis nach Seddon (1943) oder die

Nervenläsion des Grades vier/fünf nach Sunderland (1951) stellen die

schwerwiegendste Art einer Nervenverletzung dar. Beide Einteilungen stehen für

eine komplette Durchtrennung des peripheren Nerven mit einer Parese der

beteiligten Muskulatur. Im Sinne der Waller´schen Degeneration kommt es zur

Axiolyse und Myelinolyse distal der Nervenläsion (Lundborg 1987).

Schwann´sche-Zellen des distalen Nervenstumpfes proliferieren und bilden das

Haken-Büngener-Band, einen kompakten Strang, der als Leitschiene für die

proliferierenden Nervenfasern dient (Son und Thompson 1995). Experimentelle

Studien belegen, dass die Regeneration des proximalen Stumpfes und die

Degeneration der axonalen Reste zeitlich synchron verlaufen (Fawcett und

Keynes 1990). Die Wachstumsgeschwindigkeit der regenerierenden Axone liegt

dabei zwischen 0,6 mm/Tag und 4,2 mm/Tag. Beim Menschen kann ein

Mittelwert von 1 mm/Tag angenommen werden (Seddon et al. 1943; Jasper

1946; Sunderland 1946; Guth 1956; Isch et al. 1968; Thomas 1988; Seeburger

und Springer 1993; Lewis et al. 1993). Trotz dieser Regenerationsfähigkeit

peripherer Nerven ist die Möglichkeit einer Rückkehr der Funktion ohne

chirurgische Intervention bei einer gravierenden Nervenverletzung nicht möglich.

Eher bilden sich schmerzhafte Neurome, die die zu überbrückende Lücke der

Nervenstümpfe nach einer Resektion noch vergrößern.

Zur Wiederherstellung der Nervenkontinuität besteht die Möglichkeit der

Verwendung autogener Nerventransplantate oder neurovaskular-

reanastomosierter Muskeltransplantate. Im Bereich der Mund-, Kiefer- und

Gesichtschirurgie werden oft sensible Nerven wie der Nervus suralis und der

Nervus auricularis magnus als Ersatz für motorische Nerven genutzt

(Hagen 1981; Stephanian et al. 1992). Transplantate bringen aber unweigerlich

Nachteile mit sich: Es ist ein zweiter operativer Eingriff an der Entnahme- oder

Spenderstelle erforderlich. Eine erhöhte Morbidität im Bereich der

Entnahmeregion ist zu erwarten.

63

Diskussion

Falls eine primäre Reanastomose nicht möglich ist, muss mit einem Ausfall des

vom Spendernerv versorgten Gebiets gerechnet werden.

Ebenso besteht bei Nerven, die mit Interponaten rekonstruiert wurden, das Risiko

einer inadäquaten Funktionsrehabilitation sowie einer aberranten Regeneration

(Mackinnon 1989). Ob unterschiedliche Nervenqualitäten zwischen Spender- und

Empfängernerven dafür verantwortlich sind, ist bisher nicht bekannt. Auch ein

Vorliegen unterschiedlicher Faszikelanordnungen (Sunderland 1990) und die

Tatsache, dass die Nervenregeneration über zwei Anastomosestellen schwieriger

zu erreichen ist (Manders et al. 1987), könnten für einen partiellen oder totalen

Misserfolg verantwortlich sein.

Um diese Nachteile zumindest teilweise zu umgehen, wurden einige

Untersuchungen zur Nervenverlängerung mittels eines Gewebeexpanders

durchgeführt, die erfolgreich waren (Manders et al. 1987; Wood et al. 1991;

Hall et al. 1993; van der Wey et al. 1995; Van der Wey et al. 1996).

Während die genannten Studien also die sekundäre Dehnung des Nerven

behandelten, wurden bislang noch keine morphologischen und

histomorphometrischen Untersuchungen über die primäre Distraktion eines

Nerven durchgeführt. Die vorliegende Arbeit erforscht diese Parameter erstmals.

Als Grundlage für die Überprüfung, ob ein Nerv aktiv in seiner Länge verändert

werden kann, dienten folgende Fragen:

1) Welche morphologischen Abweichungen können beobachtet werden?

2) Treten Veränderungen bezüglich Myelinscheidendicke, -durchmesser und

-umfang nach der Distraktion auf, die als Hinweis auf zu erwartende

Veränderungen der elektrischen Nervenleitgeschwindigkeit dienen

können?

3) Unterscheiden sich Peripherie und Zentrum des Nervenquerschnitts

bezüglich ihrer Reaktion auf die Distraktion?

4) Erfolgt eine Zu- oder Abnahme der Anzahl myelinisierter Axone?

Anhand dieser Punkte wird die Hauptfrage erörtert werden, ob es nach der

gesteuerten primären Distraktion zu einer Degeneration des Nervus facialis

kommt, und wenn ja, in welchem Ausmaß.

64

Diskussion

4.1 Methodenkritik Tiermodell In den Experimenten zu dieser Arbeit wurden ausschließlich weibliche Tiere

benutzt, da Testosteron das Überleben der Motoneurone im Hirnstamm nach

Axotomie der entsprechenden Nerven verstärkt und die Regeneration peripherer

Nerven fördert (Drengler et al. 1997; Kinderman et al. 1998; Bodjanac et al. 2000;

Larowski et al. 2000). Es wurde festgestellt, dass geschlechtsspezifische

Unterschiede bezüglich des Verlustes an Nervenfasern und der Regeneration

nach Nervenverletzungen zu beobachten sind (Yu und McGinnis 2001).

Als klinisch übertragbarer Versuchsansatz wurde zur Distraktion des Nervus

buccalis in unseren Versuchen ein Schraubensystem verwendet (Abb. 5). Mittels

einer perineuralen Anschlingung des Ramus buccalis, deren Fadenenden an

einer am Jochbogen fixierten Schraube befestigt waren, wurde die tägliche

Distraktion vorgenommen. Für die Anwendung dieses Verfahrens spricht, dass

das Perineurium ein straffes Bindegewebe aus Kollagenfasern und dickeren

elastischen Fasern ist. Es schließt mehrere Nervenfasern zu Faszikeln

zusammen und dient außerdem als Diffusionsbarriere zwischen Endo- und

Epineuralraum. (Martin 1964; Rechtland 1987). Durch scharfe Gegenstände

können Hernien peripherer Nerven entstehen. Dieser Mechanismus wird als

perineurales Fenster beschrieben. Sugimoto et al. (2002) untersuchten die

Auswirkungen eines solchen perineuralen Fensters und vermuten, dass

neurologische Symptome und Nervendegeneration eher durch den Austritt der

Nervenfasern aus dem Perineurium hervorgerufen werden, als durch die

Unterbrechung der endoneuralen Homöostase.

Ein Austritt von Nervenfasern wurde bei der Entnahme der Nervenproben in

unseren oben geschilderten Untersuchungen nicht beobachtet und kann nahezu

ausgeschlossen werden. Es ist also davon auszugehen, dass der Einfluss der

Distraktionsnaht auf das Degenerationsverhalten des Ramus buccalis im

Verhältnis zu der eigentlichen Dehnung des Nerven kaum eine Rolle spielte.

65

Diskussion

Histologische und histomorphometrische Methodik

Bei der Herstellung der Präparate wurde darauf geachtet, schnittbedingte

morphologische Veränderungen der zu untersuchenden Parameter durch

senkrecht zur Längsachse des Nervenstammes angelegte Schnitte zu

vermeiden. Dennoch befanden sich aufgrund des wellenförmigen Verlaufes des

Nerven (Sunderland 1990) Längsschnitte in den Präparaten.

Die Präparate wurden mit Osmiumtetraoxid fixiert; weil eine normale Fixierung zu

einer Schrumpfung der wasserreichen Achsenzylinder führen würde.

Die Schnittdicke mit 1,5 µm wurde für diese Untersuchung als ideal angesehen

(Holländer und Vaaland 1968).

Die hier angewandte Kontrastierung mit para-Phenylendiamin zur Erfassung der

wichtigen Parameter hat sich laut vieler vorangegangener Arbeiten

bewährt (Böck 1984; Colman und Stockert 1983; Gellrich et al. 2002 b, 2002 c).

Auf eine elektronenmikroskopische Untersuchung wurde verzichtet, da diese bei

stärkerer Degeneration keine zusätzliche Information liefert, es kann lediglich

unterschieden werden, ob ein Nerv leicht oder gar nicht verletzt wurde (Gellrich et

al. 2002 a).

Die Untersuchung des Axondurchmessers und der G-Ratio wurde als Tendenz

angegeben, weil para-Phenylendiamin nur osmophile Strukturen anfärbt

(Böck 1984). Die Axone können also mit dieser Kontrastierung nicht eindeutig

identifiziert werden.

Die unbehandelte rechte Seite der Tiere diente als Kontrolle.

Aus einer Studie von Mattox und Felix (1987) ist bekannt, dass der Stamm des

Nervus facialis der Ratte zwischen rechter und linker Seite lediglich eine

Seitendifferenz von 2,1% aufweist. Mit 13,7 % ist diese im Ramus buccalis zwar

höher, liegt für die vorliegende Untersuchung aber durchaus in einem Bereich,

mit dem ein Vergleich der Seiten möglich ist.

66

Diskussion

4.2 Morphologische und histomorphometrische Ergebnisse

De- und Regenerationsvorgänge

Zwischen völliger Degeneration und der partiellen Verletzung eines Nerven liegt

ein breites Spektrum degenerativer Vorgänge, abhängig von Schweregrad,

Dauer und Typ der Verletzung (Gellrich et al. 2002 c). Untersuchungen zu der

moduliert gerichteten Quetschung des Nervus opticus ergaben ein lineares

Verhalten zwischen angewandter Kraft und axonaler Degeneration

(Klöcker et al. 2001; Gellrich et al. 2002 b). Erst beim Überschreiten der

kritischen Grenzen ist eine Veränderung der vorhandenen Schädigung nicht

mehr zu beobachten (Gellrich et al. 2002 b, 2002 c). Die Anzahl der

regenerierenden Axone ist ebenfalls von der Art der Verletzung abhängig

(Gutman und Sanders 1943; Shawe 1955; Evans und Murray 1956;

Jenq und Coggeshall 1985). Nach einem Crush (Quetschung) ist die

Wiederaussprossung der Axone weniger ausgeprägt als bei Axotomie mit oder

ohne Nervennaht. Überdies wird der Normalwert der Axonanzahl früher erreicht

(Jenq und Coggeshall 1985). Je größer die Diastase zwischen proximalem und

distalem Nervenstumpf ist, desto mehr nimmt die Ausprossung der Axone in den

distalen Stumpf ab (Jenq und Coggeshall 1985).

Die experimentelle Studie von 6 verschiedenen Verletzungsmustern anhand des

Nervus facialis (Cai et al. 1998) zeigte:

• Freilegung und Kompression des Nerven rufen eine Neurapraxie hervor.

• Quetschung und Dehnung führen zu einer Axonotmesis.

• Axotomie und Nervennaht nach Axotomie fallen unter das Verletzungsmuster

der Neurotmesis. Es entwickelt sich keine völlige Regeneration innerhalb von

sechs Monaten.

Eine wichtige Aufgabe dieser Studie war, zu bestimmen, welchem Schweregrad

die Degenerationserscheinungen zuzuordnen sind. Durch die moduliert

gerichtete Dehnung des Nerven wurde bei den Experimenten versucht, die oben

festgestellte Axonotmesis zu vermeiden.

67

Diskussion

Aus der Abnahme der Myelinscheidendicke in dieser Untersuchung ist zu

schließen, dass eine De- und Remyelinisierung der Axone vorliegt. Dabei waren

in einzelnen Präparaten Ödeme der Myelinscheiden feststellbar. Der Verlust der

Myelinscheidendicke war im distalen Segment am deutlichsten. Ein ähnliches

Ergebnis zeigte die Analyse des mittleren Durchmessers und des Umfangs der

Myelinscheiden. Der Vergleich der Mittelwerte der Axonanzahl weist mit einem

nicht signifikanten Unterschied noch weniger auf eine Axonotmesis hin als die

oben genannten Werte. Erst bei der genauen Beobachtung der Einzelwerte fällt

auf, dass in einigen Präparaten entweder eine erhöhte Zu- oder Abnahme der

Werte vorliegt. Tabelle 12 zeigt in der Gesamtübersicht eine geringe

Verminderung der Anzahl im distalen Segment, während im proximalen und

mittleren Drittel eine leichte Erhöhung der Axonanzahl sichtbar wird. Das Defizit

der Axonanzahl ist auf die Waller´sche Degeneration im distalen Nervenstumpf

zurückzuführen. Unterdessen deutet ein Zuwachs an Axonen auf einen

beginnenden Regenerationsprozess der Nerven von proximal. Zum besseren

Verständnis soll im Folgenden nochmals auf die De- und Regenerationsvorgänge

eingegangen werden.

Eine Unterbrechung der Axone durch Axotomie oder Crush / Stretching führt zu

einer absteigendenden Degeneration. Ein typisches Kennzeichen ist der Zerfall

der Myelinscheiden im distalen Nervenstumpf (Gellrich et al. 2002 c).

Eingewanderte Makrophagen phagozytieren die Axonreste und schaffen so ein

Milieu, in dem der Prozess der Regeneration stattfinden kann (Kury et al. 2001).

Untersuchungen zur Regeneration des Zentralen Nervensystems ergaben, dass

die dafür wesentlichen Informationen im degenerierenden Nervenende peripherer

Nerven zu finden sind, da deren Transplantation auch im Zentralen

Nervensystem eine Regeneration hervorrufen (Stoll und Müller 1999). Dagegen

erzielten Versuche, die Regeneration des Nervus opticus durch fetale

Transplantate aus Strukturen des Zentralen Nervensystems zu fördern, keinen

positiven Effekt auf dessen Regenerationsfähigkeit (Gellrich et al. 1994). Im

Gegensatz zum distalen Nervenstumpf wird das proximale Membranleck

verschlossen, und die Axone bleiben erhalten (Lay 1999).

68

Diskussion

Als „regenerating unit“ (Mackinnon et al.1991) werden aussprossende Axone

bezeichnet, die vom letzten proximalen Ranvier-Knoten entlang der Innenfläche

der Basalmembran innerhalb eines Stranges formierter Schwann´scher-Zellen

(Haken-Büngener-Band) in Richtung des distalen Nervenstumpfes einwachsen.

Eine solche Einheit kann mehrere myelinisierte Axone enthalten. Daraus

resultiert ein Anstieg der Axonanzahl in der Regenerationsphase, der den

Normalwert um ein Vielfaches überschreiten kann. Neuromuskuläre

Verbindungen in der Peripherie werden wiederhergestellt.

Axone, die diese funktionellen Verbindungen nicht aufbauen, werden einem

degenerativen Prozess unterworfen. Es kommt zum „die back"

(Rückwärtssterben), gleichzeitig wird eine weitere Ausprossung der Axone

verhindert (Lay 1999).

Die Hoffnung, durch die moduliert gerichtete Verlängerung (0,79 mm/d) nur das

Verletzungsmuster der Neurapraxie zu erhalten, hat sich in unserem Versuch

nicht erfüllt. In etwa 60% der Präparate musste anhand der Axonanzahlen und

der histologischen Befunde festgestellt werden, dass es sich um eine

Axonotmesis handelt (Tab. 11). Dabei erscheint hier die Einteilung von

Sunderland passender, da ein Verletzungsmuster des Grades II vorliegt. Ähnlich

der Neurapraxie (Grad I) folgt eine vollständige Regeneration (Sunderland 1990).

Drei Nerven (Abb.19, Abb. 21) zeigten deutliche Merkmale einer Regeneration.

Histologisch waren hier extrem kleine Axone erkennbar.

Bei Präparat 23 (Abb. 25) zeigte sich zusätzlich eine deutlich erhöhte Anzahl von

Axonen, was auf eine Wiederaussprossung der Axone von proximal

zurückzuführen ist. Die Entnahme dieser Nerven erfolgte etwa eine Woche nach

Beendigung der Distraktion. Der verhältnismäßig zeitnahe Beginn der

Regeneration mit einer relativ geringen Anzahl an überschießenden Axonen in

den einzelnen Nervenpräparaten sowie der statistisch nicht signifikante

Unterschied zwischen der distrahierten Seite und den Kontrollpräparaten in ihrer

Gesamtheit bestätigt die Annahme einer Verletzung von Grad II nach

Sunderland (1951).

69

Diskussion

Vergleich der Distraktionsarten Mit der Untersuchung der Reaktion des intakten Nervus facialis auf eine aktive

Längenveränderung sollte eine Grundlage geschaffen werden, die es ermöglicht,

das Modell später in den klinischen Einsatz zu übertragen. Die vorliegenden

Ergebnisse werden von vorangegangenen Studien zur Distraktion eines

peripheren Nerven gestützt und sollen mit ihnen verglichen werden.

In Anlehnung an Gavriel A. Ilizarov (1951) wurde die Distraktionsosteogenese

auch in den Bereich der Kiefer- und Gesichtchirurgie übertragen. Im Vordergrund

standen dabei jedoch knöcherne Korrekturen des Unterkiefers und des

zygomatico-maxillären Bereichs. Gerade bei Korrekturen des Unterkiefers spielt

die Toleranz des Nervus alveolaris inferior gegenüber Dehnung eine große Rolle.

Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Längenveränderung bei einem

definierten Ausmaß von 1 mm/d zu guten Ergebnissen führt (Battison et al. 1992;

Block et al. 1993; Hu et al. 2001; Wang et al. 2002).

Bei einem Längengewinn des Nervus alveolaris von 7 mm wurden bei 25 % von

insgesamt 381 myelinisierten Axonen Degenerationserscheinungen wie

Demyelinisierung, axonale Schwellung festgestellt. Ebenso erfolgte eine

Verdunkelung des Axonplasmas, die auf eine ischämische Schädigung der

Axone hinweist (Block et al. 1993). Diese Veränderungen können entweder auf

die mechanische Einwirkung oder auf eine Ischämie der Vasa nervorum aufgrund

einer Kompression zurückgeführt werden (Block et al. 1993). Das

Verletzungsmuster entspricht einer Neurapraxie, ähnlich den Nervenläsionen

nach Kompression.

Hu et al. (2001) beobachten nach einer Verlängerung des Nervus alveolaris

inferior mittels Distraktionsosteogenese von 10 mm ebenfalls axonale

Schwellungen, Demyelinisierung, eine Verdunkelung des Axonplasmas und eine

Abnahme der Anzahl von Axonen. Dabei ist das Bild einer Degeneration bei einer

täglichen Distraktion von 1 mm weniger ausgeprägt als bei einer täglichen

Verlängerung von 2 mm.

Durch Gewebeexpander ist die selektive Distraktion peripherer Nerven möglich.

Beobachtungen bestätigen, dass eine Dehnung peripherer Nerven während

eines langsamen benignen Tumorwachstums ohne einen Verlust der Funktion

einhergeht (Mackinnon 1989; Anand 1997).

70

Diskussion

Malis et al. (1995) erzielten bei der Distraktion des Nervus facialis des Schweins

mittels Expander innerhalb von 43 Tagen einen Längengewinn des Nerven von

20 bis 54 mm. Die Dehnung wurde vor und während der Versuche

elektromyographisch kontrolliert. Ein Funktionsverlust konnte nicht festgestellt

werden. Das histologische Bild ergab jedoch eine mittlere bis schwere

Degeneration der betroffenen Nerven wie auch ihrer Kontrollseiten.

Dagegen erzielten Manders et al. (1987) wie auch van der Wey et al. (1995;

1996) einen Längengewinn mit weniger auffälligen histologischen Befunden. Es

werden Myelinscheidenschwellung, dünn myelinisierte Axone oder Axone ohne

Myelinscheide und Axondegeneration beschrieben.

Ya et al. (2000) stellten nach Elongation des Nervus facialis histologisch eine

Läsion des Grades III (Sunderland 1951) fest, wobei, wie bereits von Malis et al.

geschildert, ein Funktionsverlust nicht festzustellen war.

Da in de vorliegenden Untersuchungen keine elektromyographischen Befunde

erhoben wurden, stützt sich der Vergleich nur auf die histologischen Ergebnisse:

Ödeme der Myelinscheiden und dünn myelinisierte Axone waren am häufigsten

zu beobachten. Auch die Aufsplitterungen der Myelinscheiden in Lamellen und

der Verlust von Fasern waren zu sehen (Tab. 5). Die beiden letztgenannten

Beschreibungen stellen ein Zeichen Waller´scher Degeneration dar, was zu der

Schlussfolgerung führt, dass es sich in manchen Präparaten mindestens um eine

Verletzung des Grades II handeln muss.

Die Anzeichen der Degeneration waren trotz allem relativ mild, und die zeitnahe

Regeneration spricht ebenfalls eher für eine Verletzung des Grades II als des

Grades III. (Abb. 17und Abb. 19).

Zwei Tiere wiesen eine komplette Degeneration der Axone und Markscheiden mit

Markballenbildung auf. Da aber die Kontrollseite in gleichem Maße davon

betroffen war, ist anzunehmen, dass ein Fehler in der Aufbereitung der Präparate

dafür verantwortlich war.

Bei der kritischen Betrachtung der soeben geschilderten Resultate zeigt es sich,

dass hier ähnliche histologische Ergebnisse erzielt wurden wie in den

Untersuchungen der oben genannten Studien.

71

Diskussion

Die Berechnung der G-Ratio (Parameter für die Nervenleitgeschwindigkeit) ist

zwar als Tendenz angegeben, weist jedoch mit 0,650 ± 0,037 auf der

distrahierten Seite einen Wert auf, der nahe dem Idealwert von 0,6 liegt. Ein

starker Funktionsverlust kann auf jeden Fall ausgeschlossen werden, da bei

Malis et al. (1995) die Funktion des Nervus facialis trotz extremer histologischer

Veränderung nicht eingeschränkt war.

Aufgrund dieser Feststellungen ist davon auszugehen, dass die moduliert

gerichtete und gesteuerte primäre Nervendistraktion im Vergleich zu anderen

Methoden der Nervenverlängerung keine Nachteile aufweist. Dagegen verspricht

sie den Vorteil, dass eine übermäßige Dehnung der umliegenden Gewebe

vermieden werden kann. Die Methode der primären Distraktion dürfte daher im

klinischen Einsatz ein für den Patienten nutzbarer Ansatz sein, da mit

zunehmendem Alter und bei starker Beanspruchung die Elastizität der Haut und

der Muskelgewebe nachlässt. Eine Überdehnung der Haut und der Muskeln,

welche zu einer ästhetischen Einbuße des sonst erfolgreichen Ergebnisses

führen könnte, tritt bei diesem Behandlungsverfahren nicht ein.

72

Diskussion

Schlussfolgerung

1) Die Verlängerung eines Nerven mittels der gesteuerten primären

Distraktion ist möglich.

2) Es wurden bei der primären Nervendistraktion ähnliche Ergebnisse erzielt

wie in vorrangegangenen Studien, die die Verlängerung eines Nerven

mittels Distraktionsosteogenese oder Gewebeexpandern untersuchten.

Jedoch wird in der vorliegenden Untersuchung das umliegende Gewebe

während der Distraktion nicht beeinträchtigt.

3) Als morphologische Veränderungen werden Schwellungen der

Myelinscheiden, dünn myelinisierte Axone, eine Abnahme der Faseranzahl

und lamellenförmige Aufsplitterungen der Myelinscheiden beobachtet.

4) Der Vergleich der Mittelwerte der gemessenen Parameter deutet auf eine

Abnahme der Myelinscheidendicke, des Durchmessers und des Umfangs

hin. Die stärkste Abnahme der Markscheidendicke und des Durchmessers

erfolgt distal.

5) Peripherie und Zentrum zeigen keine nachweisbar unterschiedliche

Reaktion auf die Distraktion des Ramus buccalis.

6) Im Vergleich der Mittelwerte nimmt die Anzahl der Axone leicht ab, am

auffälligsten im distalen Segment.

Die primäre Distraktion des Ramus buccalis führt bei ca. 60% der distrahierten

Nerven zu einer Verletzung des Grades II nach Sunderland (1951).

Mit einer vollständigen und zeitnahen Regeneration der Verletzung ist zu

rechnen. Dies kann als positives Ergebnis für die Untersuchung gewertet werden.

73

Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Ziel der Arbeit ist die Etablierung eines auf den Menschen übertragbaren Modells

der selektiven, moduliert gerichteten und gesteuerten primären Nervendistraktion

bei der Ratte. Unter Ausnutzung der bei der Nervendegeneration und ihrer

Regeneration bisher gewonnenen Ergebnisse sollten die Technik zur

Durchführung und der Grad der degenerativen Veränderungen des Nerven nach

der moduliert gerichteten Nervenverlängerung erarbeitet werden.

Im Tiermodell wurde bei weiblichen Wistar-Ratten (N=15) mit einem

Zugschraubensystem die Distraktion des Ramus buccalis vorgenommen. Die

unbehandelte Kontralateralseite diente als Kontrolle. Täglich wurde der Nerv

durch die am Jochbogen befestigte Schraube um 0,785 mm gedehnt. Nach 10

Tagen war die Distraktion abgeschlossen. Die Sakrifikation der Tiere erfolgte

nach weiteren 20 Tagen in einer CO 2 -Kammer. Nach der Entnahme des

distrahierten Segmentes und des entsprechenden Nervensegments der

Gegenseite zur Kontrolle folgte die lichtmikroskopische Untersuchung der Proben

auf morphologische Zeichen einer Degeneration des distrahierten Nerven. Mit

Hilfe des Bildanalysesystems analySIS® (Soft Imaging, D-Münster) wurden

Myelinscheidendicke, Durchmesser und Umfang der Myelinscheiden

morphometrisch ermittelt. Die Axonanzahl wurde anhand von Bildern ausgezählt.

Die statistische Auswertung der ermittelten Daten erfolgte durch die

Statistiksoftware SPSS® (SPSS Inc., USA-Chicago, Illinois).

Als wichtigstes Ergebnis ist festzustellen, dass die Verlängerung des Nervus

facialis von 0,79 mm/d mittels der gesteuerten primären Nervendistraktion

möglich ist. Das Resultat der morphologischen und histomorphometrischen

Analyse ergab als Folge der gesteuerten primären Distraktion in 60% der

untersuchten Proben eine Nervenverletzung des Grades II nach Sunderland

(1951). Die restlichen der Präparate wiesen auf eine Verletzung des Grades I hin

(fokale Schwellungen der Myelinscheiden und dünn myelinisierte Axone). Eine

Regeneration der Nerven ist bei diesen Verletzungsmustern zu erwarten.

Auf dem Weg, die bisherigen Rekonstruktionsmöglichkeiten zu ergänzen und zu

verbessern, bietet die hier dargestellte Methode eine überzeugende Alternative,

die zu weiteren Forschungen ermutigt.

74

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Lebenslauf

7 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Kriesche Vorname: Bettina Maria Geburtsdatum: 29. Dezember 1971 Geburtsort: Villingen - Schwenningen Familienstand: ledig Eltern: Prof. Dipl.-Ing. Josef Kriesche Dr. Marianne Kriesche Staatsangehörigkeit: deutsch Anschrift: Lehenerstr. 152 79106 Freiburg

Schulische Ausbildung 1978-1982 Grundschule Erbsenlachen VS - Villingen 1982-1991 Gymnasium am Hoptbühl VS - Villingen 1991 Allgemeine Hochschulreife 1991-1992 Freiwilliges Soziales Jahr Städtisches Krankenhaus Überlingen Abteilung für Allgemeine Chirurgie

Hochschulstudium 1993 Studium der Zahnmedizin an der Albert- Ludwigs- Universität, Freiburg i Br. 1999 Staatsexamen Zahnmedizin

Beruflicher Werdegang 2000 Approbation zur Zahnärztin Feb. 2001- Sept. 2001 Ausbildungsassistentin Praxis Dr. F. Grunert, Lörrach Okt. 2001-Juli 2003 Ausbildungsassistentin Praxis Dr. W. Polozcek,

Freiburg Seit Aug. 2003 Assistenzzahnärztin im Zentrum für Zahnmedizin der

Universität Basel, Abteilung für Rekonstruktive Zahnmedizin und Myoarthropathien Klinikvorsteher Prof. Dr. C.P. Marinello

Histomorphometrische Untersuchung zur gerichteten ...

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