U.Albrecht BC1

Hämoglobin: Proteinfunktion und Mikrokosmos (Voet Kapitel 9)

1. Funktion des Hämoglobins

2. Struktur und Mechanismus

3. Anormale Hämoglobine

4. Allosterische Regulation

U.Albrecht BC1

Strukturaufklärung des Pottwal-Myoglobinswurde 1959 von John Kendrew gemacht. Später wurde die Struktur verschiedener Spezies und auch von Hb Mutationen durchgeführt. Das Hämoglobin wurde zum besterforschten Proteinüberhaupt.

Myoglobin aus 8 Helices (A-H). ellipsoidHelices zwischen 7 und 26 AS langmeistens α-HelicesEnden der Helices A, C, E und G bilden 310-Helix

Bezeichnung von Resten:B5 = 5. AS in B-Helix (N-term nach C-term)FG3= 3. AS im Interhelicalen Segment zw. F u. GNA = nicht helicales aminoterminales SegmentHC= nicht helicales carboxyterminales Segment

A. Struktur von Myoglobin

Manchmal auch kombinierte Bezeichnung Glu EF6(83)= Glu 83 im interhelicalen Segment EF 6. AS.

U.Albrecht BC1Räumliche Darstellung des OxyMb

Häm in hydrophobe Tasche einge-bettet.

proximales His

distalesHis

H-Brücke

DesoxyMb -> sechste koord. Stellevon Fe(II) unbesetzt. Fe(II) rückt auch weiter aus Porphyrinebene

Distales His senkt Autooxidationsrateund erhöht Sauerstoffaffinität -> nicht ersetzbar durch andere ASFe durch O2 Bindung vor Oxidation ge-schützt -> paradoxOxidation von Häm-Fe in Desoxyformjedoch Säurekatalysiert. Protonen werdendurch Fe reduziert und diese reduzieren O2 zu Superoxid.Das distale His wirkt als Protonenfalle und schützt somit Fe vor oxitation.

Die Sauerstoffsättigung verändert dieKonformation von Mb nur geringfügig.Struktur von Oxy und Desoxy Mb gleich.

U.Albrecht BC1B. Struktur von Hämoglobin

Hämoglobin = sphäroides Tetramer, besteht aus αβ−Protomeren. 2 zählige Rotationsachse. Untereinheiten besetzen die Ecken eines Tetraeders -> verzerrte D2-Symmetrie.

α und β Untereinheiten (UE) sind strukturell sehr ähnlich (auch zu Mb)obwohl nur 18% AS identisch

α1

α2β1

β2

Nicht identische UE im Hb aus-geprägte Wechselwirkungen

α1−β1 Kontakt 35 AS

α1−β2 Kontakt nur 19 AS

αβ-Heterodimere -> hydrophobe WW

Homodimere -> keine WW da durch Flüssigkeit gefüllten Kanal getrennt

(see Model 1HBB Deoxy, 1BBB Oxyfilm)

U.Albrecht BC1Unterschiedliche Quartärstruktur von Desoxy- und Oxy- Hämoglobin

Desoxy-Form = T-Zustand Oxy-Form = R-Zustand

r-ZustandTertiärstrukturUE

t-ZustandTertiärstrukturUE

DesoxyHb Kristall zerplatzt an der Luft

α1−β2 Kontakt nur 19 AS dagegen α1−β1 Kontakt 35 AS -> stärkerer Kontakt unverändert d.h.Veränderung entlang α1−β2 Kontakt -> Verdrehung von α1−β1 Dimer um ca. 15° gegen α2−β2Dimer

β2β2α1

α1

β1β1

α2 α2

Oxygenierung verengt Kanal

U.Albrecht BC1

Blick von rechts auf vorherige Darstellung ->α1−β1 Dimer gefärbt dargestelltα2−β2 Dimer nur Umriss

Durch Oxygenierung verschieben sich die 2α−β Dimere gegeneinander

OxyHb ist kompakter als DesoxyHb

Beachte:

Lage von His FG4(97)β (schwarz) relativ zugelb markierten AS.

U.Albrecht BC1C. Mechanismus der Kooperativität bei der Sauerstoffbindung

Sauerstoffbindung an ein Häm beeinflusst Bindungsaffinität von Sauerstoff an anderen Häm Gruppenim Hämoglobin. Häm Gruppen zu weit voneinander entfernt -> keine direkte Beeinflussung -> WWwird über den Proteinteil vermittelt.Basierend auf Röntgenstrukturanalysen -> Perutz-Mechanismus

Häm-Gruppe und Umgebung inα−Untereinheit.

in β-Untereinheit versperrt ValE11 die O2-Bindungsstelleaber nicht in α−Untereinheiten.

t-ZustandproximalesHis

distales His

F-Helix

U.Albrecht BC1

Einwandern von Fe(II) in Porphyrin-Ebene löst T-> R Transformation aus

t-Zustand Fe(II) 60 pm aus Porph. Ebene.-> pyramidale durchgebogen

O2-Bindung ändert Elektr.konfig. vonFe -> Fe-N porph.-Bindung kontrahiert-> Fe in Phorphyrinebene und O2

Bindung

F-Helix muss Lage verändern, damit HisF8 dem Porphyrinring nicht zunahe kommt. Dadurch wird Fe- O2-Bindung stabilisiert.

U.Albrecht BC1

Desoxy-Form = T-Zustand Oxy-Form = R-Zustand

Die α1−β2 und α2−β1 Kontakte haben zwei stabile Positionen

α1α1β2β2

U.Albrecht BC1

Versetzen von 3 Seitenketten. Äquivalenter Satz von H-Brücken. Wie ein Schalter, nur2 Zustände.

Netzwerk von ionischen WW und H-Brücken am Carboxy-ende der α und β Untereinheiten.

Alle diese Bindungen werden beim T-> R Übergang geöffnet

deprotoniert beiBohr effekt

T-Zustand durch Ionenbindungen stabilisiert, brechen auf bei Übergang zu R-Zustand

U.Albrecht BC1

R-Zustand durch Bindung von Sauerstoff stabilisiert.Warum T-Zustand aber stabiler als R-Zustand?

C-terminale AS sind im R-Zustand flexibel im T-Zustandaber nicht, sie sind über Ionenbrücken stabilisiert.

U.Albrecht BC1

Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ergibt sich aus dem T -> R Übergang

Bindung von Sauerstoff erfordert eng abgestimmte Molekülbewegungen:

1) Fe(II) gleitet nur in Porphyrinringebene wenn gleichzeitig sich die räumliche Orientierung vom proximalen His sich ändert.

2) Das proximale His ist fest mit Nachbarn verbunden -> Neuorientierung nur möglich wenn sich F-Helix über Porphyrinebene bewegt.

3) F-Helix kann sich nur dann bewegen wenn α1-β2 und α2-β1 Kontakte sich um eine Windung verschieben

4) Die Unbeweglichkeit der α1-β1 und α2-β2 Kontakte erzwingt die Konformationänderung in 3)

-> Untereinheiten oder Dimere können Konformation nicht unabhängig voneinander ändern. Da nur 2 stabile α1-β2 (bzw. α2-β1) Kontakte möglich -> Quartärstruktur von Hb nur in 2 ZustandsformenWas heisst Kooperativität? 1. UE bindet O2 muss aber in t-Zustand verharren da andere UE ohne O2 imt-Zustand. Je mehr O2 gebunden desto höher O2 Affinität da UE im r-Zustand.

U.Albrecht BC1Sigmoidale O2-Bindungskurve von Hbist Überlagerung der Kurven von R- und T-Zustand

Freie Enthalpie des Hb in R- und T- Zustand als Funktiondes Sättigungsgrades (YO2)

Sättigungsgrad in Abhängigkeit des SauerstoffPartialdruckes.

D. Untersuchung des Perutz Mechanismus

Umwandlung von T zu R-Zustand kann nicht „gefilmt“ werden. -> Perutz-Mechanismus nicht bewiesen. Es gibt jedoch gute experimentelle Hinweise das der Mechanismus stimmt.

1) Verändert man AS am Carboxyende der Untereinheiten die an Ionenbindungen beteiligt sind so wird der T-Zustand instabil. Kristallisiert man ein solch midifiziertes DesoxyHb hat es eine Konformation wie OxyHb.

2) Inositolhexakisphosphat (IHP) bindet stärker als BPG an DesoxyHb und stabilisiert T-Zustand -> es zieht also das proximale His von Porphyrinebene weg. Dagegen bindet NO stärker an OxyHb als O2 -> NO zieht Fe stark in Porphyrinringebene.

Werden nun gleichzeitig IHP und NO an Hämoglobin gebunden -> Entgegengesetzte Kräfte ziehen an His -Fe Bindung die grösser sind als normal -> Bindung bricht, was spektorskopisch Nachgewiesen werden kann.

U.Albrecht BC1

E. Ursprung des Bohr-EffektesU.Albrecht BC1

Bohr-Effekt= Abspaltung von H+ aus Hb bei Bindung von Sauerstoff.

Reaktion von Cyanat mit Aminogruppen:

Läuft nur ab bei terminalen Aminogruppen die pK von 8haben. Bei physiol. pH Lys pK von 10.8 reagiert nicht.Carbamyloirung destabilisiert T-Form

T-Form bindet mehr Protonen weil Chlorid Polarität derN-terminalen Aminogruppe erhöht -> pK steigt

F. Strukturvoraussetzungen für die BPG-BindungU.Albrecht BC1

BPG senkt Sauerstoffaffinität des Hb

verbindet b UE über Salzbrücken und stabilisiertsomit T-Form

Bei Übergang in R-Form wird BPG herausge-drückt da sich Kanal verengt.

Fötales Hb (HbF) hat anstelle von HisH143 einungeladenes Serin. BPG kann DesoxyHb nichtstabilisieren im Fötus -> höhere Sauerstoff-affinität.

Salz- und H-Brücken