II. Proliferation/Stammzellen WS 2008/2009. Identität embryonaler neuraler Vorläuferzellen.

II. Proliferation/StammzellenWS 2008/2009

Identität embryonaler neuraler Vorläuferzellen

Proliferation neuroepithelialer Zellen

Aus neuroepithelialen Zellen entstehen Radiale Gliazellen

Radiale Gliazellen sind neuronale Vorläuferzellen

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P/Psymmetrisch

P/Nasymmetrisch

Zellteilungsmuster der radialen Gliazellen

Neuronen enstehen in der VZ und wandern entlang von radialen Gliazellen zur Cortex

Wie können Neuronen entlang radialer Gliazellen wandern wenn radiale Gliazellen sich teilen?

Wie teilen sich radiale Gliazellen?

TuJ1/GFP

Asymmetrische Zellteilung radialer Gliazellen und Wanderungder neuronalen Tochterzelle







Innere Kortex (4-6)durch VZ-Proliferation

Äussere Kortex (1-3)durch SVZ-Proliferation

P/Psymmetrisch

P/Nasymmetrisch

N/Nsymmetrisch

Zellteilungsmuster ändern sich während der Entwicklung

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Zellzykluslänge vergrößert sich während der Entwicklung



Hypothese: Die Veränderung des Zellteilungsmusters (P/P vs P/N vs N/N) wird durch Zellzykluslänge (G1-Phase) gesteuert

Fakt: In neurogenen P werdenFaktoren exprimiert,die den Zellzyklus verlangsamen(Tis21, BM88)

Modell: Neuronale Zell-Fate-Determinanten werdenasymmetrisch auf dieTochterzellen vererbt.Wirksamkeit von G1-Länge abhängig!

Wo und wie lange findet Zellproliferation während der Entstehung des Nervensystems

statt?

Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating)

Methode:

Pulsmarkierung durch 3H-Thy oder BrdU

während der Neurogenese

- wird in DNA eingebaut.

Histologische Analyse unmittelbar nach

Pulsmarkierung - identifiziert Zellen in S-Phase

Histologische Analyse im adulten Gewebe- identifiziert Zellen, die sich zum Zeitpunkt

der Pulsmarkierung zum letzten Mal ge-

teilt haben. - sich weiter teilenden Zellen werden nicht markiert

wg. Ausverdünnung von BrdU/3H-Thy

Proliferation im Nervensystem: Analyse durch 3H-Thymidinmarkierung oder BrdU-Markierung (birthdating)

Ergebnisse:

• Neurale Zellen entstehen in Proliferationszonen (VZ, SVZ)• Es entstehen zunächst Nervenzellen (VZ), dann Gliazellen

(SVZ).• Die verschiedenen Nervenzellen werden in bestimmter

Reihenfolge in den Proliferationszonen gebildet• Nervenzellen entstehen ausschließlich während der

Embyronalentwicklung, aber...

Externe Körnerschicht

Ventrikulärzone

Ventrikulärzone

Ventrikulärzone

Subventrikulärzone

Proliferationszonen

Inside-out Muster der Neurogenese im Cortex

P. Rakic

Proliferation im adulten ZNS

• Riechepithel

• Proliferation und Apoptose von Nervenzellen im Singzentrum beim Vogel

• Subventrikulärzone (SVZ), Vorläufer von Neuronen im olfaktorischen Bulbus

• Hippokampus (Gyrus dentatus), Subgranulärzone produziert Körnerzellen im Gyrus dentatus

Proliferation im adulten CNS: SVZ

30 000 Zellen/Tag

Proliferation im adulten CNS: SVZ

Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus von Säugern incl. Primaten

150 Zellen/Tag

Proliferation im adulten ZNS: Hippokampus beim Menschen

SVZ (Maus)

-30 000 Zellen/Tag

- Ersatz von absterbenden Zellenim olfaktorischen Bulbus

- 60% der Zellen werden ersetztinnerhalb von 18 Monaten

DG (Maus)

-150 Zellen/Tag

- Zusätzliche Zellenim Gyrus Dendatus

- 10% der Zellen zusätzlichinnerhalb von 18 Monaten

Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen?

Stammzelleigenschaften (Hämapoietisches System)

1. proliferieren während der gesamten Lebensdauer der Organismus

2. produzieren identische Nachkommen (selbstreplizierend).

3. produzieren eine grosse Anzahl von unterschiedlichen Nachkommen (multipotent) durch Progenitor/Vorläufer-Zellen (transient amplifying cells), die nur eine bestimmte Zahl von Zellteilungen durchlaufen und ein eingeschränktes Entwicklungspotential besitzen.

4. Multipotenz bleibt erhalten während der Lebensdauer des Organismus.

5. Eine einzelne Stammzelle kann das gesamte Gewebe regenerieren.

Eine selbstreplizierende Zelle die mindestens zwei unterschiedliche Nachkommen produziert (Temple).

Eigenschaften der proliferierenden neuronalen Vorläufer im adulten CNS - handelt es sich um Stammzellen?

- kontinuierliche Produktion von Neuronen- Selbstreplikation in klonalen Kulturen (Neurosphären)

Stammzellkulturen aus dem ZNS

FGF/EGF

FGF/EGF

Entfernung vonProliferationsfaktorenZugabe von Differenzierungs-Faktoren (CNTF-Astrozyten)

Klonale Kulturen

Differenzierung in vitro Differenzierung in vivo

Nach Implantierung in embryonales oder adultes Nervengewebe

Abnahme ‚früher‘und

Zunahme ‚später‘

Stammzellen in

Neurosphärenkulturen

≠ adulte Stammzellen

in Stammzell-Nische

Identifizierung/Charakterisierung adulter neuraler Stammzellen

SVZ Stammzellen und Vorläuferzellen

GFAP promotor-abhängige- virale Infektion oder - GFP-expression oder

GFAP+ GFAP- GFAP-

Dbx+ Dbx+

PSA-NCAM

Vergleichbare Eigenschaften der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der

neurogenen Zone beim Zebrafinken

Hippocampus Neurogene region im Vogelgehirn

GFAP-promotor dependentinfection




are needed to see this picture.SVZ

Hippocampus

Seminar

Vergleichbare Umgebung der Stammzellen in der Subgranulärzone im Hippokampus und in der SVZ:

‚Stammzell-Nische‘

SVZ Stammzell-Nische



B-Zelle (ca 6000/LV)

Blutgefäß

A-Zelle

Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Zebrafink HVC

Neuron im HVC antwortet auf akkustische Stimuliund ist 3H-Thymidin-markiert

Neu produzierte Neuronen im adulten CNS sind funktionell - Hippokampus

Zusammenfassung

• Aus der SVZ (B-Zellen) können Neurosphären gewonnen werden, die über lange Zeiträume passagiert werden können und somit selbst-replizierend sind

• Klonale Neurosphären enthalten pluripotente Zellen

• Diese Zellen bleiben im adulten Tier erhalten

• Somit sind also GFAP+ SVZ ( B-Zellen) neurale Stammzellen

Was ist die Funktion der Neurogenese im adulten

Gehirn?

Die Produktion neuer Neuronen im HVC ist für das Erlernen neuer Lieder beim Zebrafink/Canary

erforderlich

Neuronen werden ersetzt

Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis

(Hippocampus-abhängiges räumliches L.)

• Anregende Umgebung (‚enriched environment‘) und Laufen erhöht Neurogenese, Lernvermögen und LTP

• Maus-Stämme mit erhöhter hippokampaler Neurogenese (C7Bl6) zeigen besseres räumliches Lernverhalten als Maus-Stämme mit niedriger Neurogenese (DBA/2)

Adulte Neurogenese im Hippocampus ist wichtig für Lernen und Gedächtnis

BrdU-labeled cellsControl 1,409 ± 132Runners 3,746 ± 800*

Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (I) - sind für Geruchsdiskrimination

wichtig

Gheusi et al., 1999

Neue olfactorische Neuronen aus der SVZ (II)‚neue‘ Neuronen reagieren besser auf unbekannte olfaktorische Stimuli, (Macklis, unpublished; single cell analysis)

Neue olfaktorische Neuronen aus der SVZ (III)Zahl der Neuronen nimmt zu in Umgebung mit olfaktorischen Stimuli - bessere Geruchsdifferenzierung(Rochefort et al., 2002)

Kontrolle adulter Neurogenese -

• Genetische Unterschiede-Maus-Stämme

• Enriched environment• Running• Hormone (Stress)• Wachstumsfaktoren (FGF, EGF)

• Läsion (e.g. Hirnschlag) - spielt Neurogenese eine Rolle bei

Regeneration??

Neurale Stammzellen und Stammzell-Therapie

A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis)

B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.

Implantierung von Neurospären-Zellen in das adulte CNS- im Hippokampus und SVZ: Neuronen- in andere Gehirnregionen: Glia

Stammzell-Nische

Implantierung von Stammzellen inadultes CNS

- in Regionen mit Läsion, apoptotischem Zelltod (II/III): Neuronen

- in Regionen ohne Läsion:Gliazellen

Implantierte immature Neuronen differenzieren zu glutamatergen Neuronen und innervieren die korrekte

Zielregion

Läsion in Cortex-Schicht VI

Endogene Stammzellen differenzieren zu Neuronen nach Läsion in Schicht VI

Neurale Stammzellen und Zell-Therapie

A: Aktivierung endogener Stammzellen (Macklis)

B: Injektion exogener Stammzellen oder aus Stammzellen gewonnener Zellen.

Modelle neuronaler Degeneration

Parkinsonsche Krankheit

• Degeneration dopaminerger Neuronen der Substantia nigra, (projizieren zum Striatum)

• Verbesserung des klinischen Befunds durch Implantierung von Zellen aus der fötalen Substantia nigra. Korrelation mit Überleben der implantierten Zellen und Innervation des Striatums.

• In vitro Vermehrung von Zellen aus der S. nigra - Test im Tiermodell

Parkinsonsche Krankheit

Parkinsonsche Krankheit:Tiermodell

Implantierung von Vorläuferzellen aus der S. Nigra in Striatum-Läsion

Funktioniert im Prinzip, aber Problem der Zellgewinnung ungelöst!

Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) - die optimale neurale

Stammzelle?

Embryonale Stammzelle (ES-Zelle)

Most protocols involve ‚embryoid body‘ aggregate cultureas initial step and then sequence of different factors

Strategien um spezifische Neuronen aus Stammzellen

zu differenzieren (e.g dopaminerge N.)

Versuch und Irrtum Embryologischer Ansatz Verbesserter Embryolog.Ansatz

Stem cell

Patterning signalsMorphogens,Fate specifying transcription factors

Select committed progenitors usingreporter gene (GFP)

Implantation of ES cell-derived differentiated dopaminergic cells into animal model of Parkinson‘s

disease

Also better in more specific motor tasks

Modified from Marín et al. Dev. Dynamics 234:709-717, 2005

Pax6DlxIsl1

En1/2LmxNurr1Pitx3

Pax6Nurr1GABA Nkx2.1

MsxGABA

Probleme und Potential von ES Zell-Therapien

Undifferenzierte ES Zellen werden zu Teratoma (Tumoren) - 100% der implantierten Zellen müssen differenzierte Neuronen sein.

Alternative: Reprogrammierung oder adulte endogene Stammzellen

Dopaminerge Neuronen und Motoneuronen aus iPS Zellen, aber auch dort Teratoma-Problem

•Wenn differenzierte ES Zellen xenotransplantiert werden (Maus in Ratte)• wird eine sehr geringe Tumorrate beobachtet.•Sehr hohe Tumorrate bei homologen Transplantationen, •selbst wenn die Zellen vor-differenziert wurden (Erdö et al., 2003).

Demyelinisierungs-Erkrankungen (Multiple Sklerose)

Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosisNature 422, 688 - 694 (2003);

Radiale Gliazellen produzieren Neuronen in vivo (Cortex)

lacZGlut/NeuN

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