Inaugural-Dissertation - docserv.uni-duesseldorf.de · Abbildung 3: Dreidimensionale Struktur der...

Entwicklung eines rekombinanten Ganzzellsystems--

Klonierung, Coexpression und Mutagenese der Phenylalanin-Dehydrogenase

aus Rhodococcus sp. M4 und des malic enzymes aus E.coli K12

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Heinrich-Heine-Universität

vorgelegt von

Shukrallah Na’amnieh

aus Düsseldorf

Jülich 2002

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 1998 bis März 2002 am Institut für

Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf im Forschungszentrum Jülich

unter der Leitung von Herrn Priv. Doz.- Dr. W. Hummel durchgeführt.

Die Arbeit wurde von Degussa AG und Minerva Stiftung der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften gefördert.

Gedruckt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Referent: Priv.- Doz. Dr. W. Hummel Korreferent: Prof. Dr. Cornelis P. Hollenberg

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................................................................................. 1 1.1 BEDEUTUNG VON ENZYMEN ................................................................................................................... 1 1.2 ENZYME IN DER INDUSTRIE .................................................................................................................... 2 1.3 DIE PHENYLALANIN DEHYDROGENASE AUS RHODOCOCCUS SP. M4 ....................................................... 4 1.3.1 Malic enzyme aus E. coli K12............................................................................................................... 8 1.3.2 L-Phenylalanin-Synthese unter Coenzymregeneration ........................................................................... 8 1.3.3 Expression rekombinanter Proteine ....................................................................................................... 9 1.4 PROTEIN-DESIGN.................................................................................................................................. 11 1.4.1 Gezielte Mutagenese........................................................................................................................... 11 1.4.2 Zufallsmutagenese.............................................................................................................................. 13 1.5 HOCHZELLDICHTE-FERMENTATION (HZD) ......................................................................................... 14 2 Problemstellung und Zielsetzung........................................................................................................... 15 3 Material .................................................................................................................................................. 17 4 Methoden................................................................................................................................................ 20 4.1 MOLEKULARBIOLOGIE ......................................................................................................................... 20 4.1.1 Isolierung der genomischen DNA ....................................................................................................... 20 4.1.2 Auftrennung von DNA-Fragmenten über Elektrophorese .................................................................... 21 4.1.3 Ethanolfällung.................................................................................................................................... 21 4.1.4 Polymerase Ketten Reaktion [PCR] .................................................................................................... 22 4.1.5 Berechnen der Schmelztemperatur der Primer ..................................................................................... 23 4.1.6 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen ........................................................................... 23 4.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA................................................................................. 24 4.1.8 Ligation.............................................................................................................................................. 24 4.1.9 Herstellung kompetenter Bakterienzellen ............................................................................................ 25 4.1.10 Transformation................................................................................................................................. 26 4.1.11 Schnellisolierung von Plasmid-DNA aus E.coli (modifiziert nach Birnboim und Doly) ...................... 26 4.1.12 Plasmidisolierung [Biorad] ............................................................................................................... 27 4.1.13 Plasmidisolierung [Qiagen]............................................................................................................... 27 4.1.14 Restriktion........................................................................................................................................ 28 4.1.15 Sequenzierung.................................................................................................................................. 28 4.1.16 Gezielte Mutagenese......................................................................................................................... 28 4.1.17 Zufallsmutagenese ............................................................................................................................ 29 4.1.18 Sättigungsmutagenese....................................................................................................................... 31 4.2 BIOCHEMISCHE METHODEN ................................................................................................................. 32 4.2.1 Zellaufschluß und Rohextraktgewinnung ............................................................................................ 32 4.2.2 Aktivitätstest für die Phenylalanin Dehydrogenase .............................................................................. 33 4.2.3 Screening und Aktivitätstest in Titerplatten......................................................................................... 34 4.2.4 Aktivitätstest für das NAD-abhängige malic enzyme........................................................................... 35 4.2.5 Gekoppelte enzymatische Synthese..................................................................................................... 35 4.2.6 Bestimmung des L-Phenylalanin mittels HPLC................................................................................... 35 4.2.7 Bestimmung der Acetatkonzentration.................................................................................................. 36 4.2.8 Ganzzell Biotransformation ................................................................................................................ 36 4.2.9 Proteinaufreinigung ............................................................................................................................ 36 4.2.10 Proteinbestimmung nach Bradford .................................................................................................... 37 4.2.11 Entsalzen von Proteinlösungen.......................................................................................................... 37 4.2.12 Konzentrierung von Proteinlösungen................................................................................................. 37 4.2.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).......................................................................... 38 4.2.14 Färbung............................................................................................................................................ 39 4.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN ........................................................................................................ 40 4.3.1 Verwendete Organismen..................................................................................................................... 40 4.3.2 Anzuchtbedingungen und Medien....................................................................................................... 40 4.3.3 Plattenkulturen ................................................................................................................................... 41 4.3.4 Schüttelkolbenkulturen ....................................................................................................................... 41 4.3.5 Konservieren von mikrobiologischen Stämmen................................................................................... 41 4.3.6 Fermentation der rekombinanten PheDH in Hochdichte Medium (HZD) ............................................. 41 4.3.7 Bestimmung der optischen Dichte....................................................................................................... 44 5 Ergebnisse .............................................................................................................................................. 45 5.1 KLONIERUNG DER PHENYLALANIN DEHYDROGENASE (PHEDH).......................................................... 45 5.1.1 Präparation genomischer DNA............................................................................................................ 45 5.1.2 Klonierung des PheDH-Gens mittels PCR........................................................................................... 46 5.1.3 Klonierung des PheDH Gens in den pUC-18....................................................................................... 47 5.1.4 Sequenzierung des phedh-Gens........................................................................................................... 49

5.1.5 Expression des recPheDH-Gens in E.coli ........................................................................................... 50 5.1.5.1 Klonierung der PheDH im Expressionsvektor PET16b ..................................................................... 50 5.1.5.2 Expression der PheDH im PET-System............................................................................................ 52 5.1.5.3 Klonierung des PheDH-Gens in pkk223-3........................................................................................ 53 5.1.5.4 Expression der recPheDH im pKK223-3 .......................................................................................... 56 5.1.6 Optimierung der Induktionsparameter................................................................................................. 57 5.1.7 Reinigung der recPheDH aus E. coli JM105........................................................................................ 60 5.1.8 Substratspektrum und KM-Werte......................................................................................................... 62 5.1.9 Temperaturstabilität............................................................................................................................ 63 5.1.10 Temperaturoptimum ......................................................................................................................... 64 5.1.11 pH-Optimum .................................................................................................................................... 64 5.2 HOCHZELLDICHTE FERMENTATION (HZD).......................................................................................... 66 5.2.1 Zuführung von Nährstoffen, Nebenproduktbildung und Wachstum...................................................... 66 5.2.2 Bestimmung des Induktionszeitpunkts ................................................................................................ 68 5.3 KLONIERUNG DES MALIC ENZYMES ...................................................................................................... 70 5.3.1 Präparation genomischer DNA............................................................................................................ 70 5.3.2 Genisolierung und Klonierung des malic enzymes im recPhe-pKK-223-3............................................ 70 5.4 KONSTRUKTION EINES EXPRESSIONSVEKTORS MIT HETEROLOGER EXPRESSION................................. 75 5.4.1 Coexpression der PheDH und des malic enzymes................................................................................ 77 5.4.2 Optimierung der Aktivität................................................................................................................... 78 5.4.3 Km-Wertbestimmung ......................................................................................................................... 81 5.4.4 Gekoppelte L-Phenylalanin Synthese unter Regeneration des Coenzyms NADH ................................. 81 5.5 GANZZELLUMSETZUNG ........................................................................................................................ 85 5.6 GEZIELTE MUTAGENESE ...................................................................................................................... 87 5.6.1 Mutation des Lysin 66 ........................................................................................................................ 88 5.6.2 Sequenzierung der K66I ..................................................................................................................... 94 5.6.3 Expression der PheDH-Mutante K66I ................................................................................................. 94 5.6.4 Herstellung weiterer Muteine.............................................................................................................. 96 5.6.5 Mutation von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 zu Isoleucin .............................................................. 97 5.6.6 PCR der K66R- Mutanten und deren Klonierung................................................................................. 98 5.6.7 Aktivitätsnachweis des PheDH-Muteins K66R und K78I .................................................................... 99 5.7 ZUFALLSMUTAGENESE ....................................................................................................................... 101 5.8 ENTWICKLUNG EINES FARBTESTES ALS SCREENINGSMETHODE ......................................................... 102 5.8.1 K66R –Muteine................................................................................................................................ 104 5.8.2 Biochemische Charakterisierung des K66R-8-Muteins ...................................................................... 107 5.8.3 Synthese von Phenyllactat mit dem Mutein K66R-8.......................................................................... 109 5.8.4 Austausch K66I................................................................................................................................ 112 6 Diskussion............................................................................................................................................. 114 7 Zusammenfassung................................................................................................................................ 127 8 Literaturverzeichnis............................................................................................................................. 131

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Industriell genutzte Enzyme, ihr Ursprungsorganismus, aus dem sie isoliert werden und mögliche Verwendungszwecke................................................................................................................................. 2

Tabelle 2: PCR-Zyklen ................................................................................................................................... 46 Tabelle 3: PCR Protokoll zur Amplifizierung des PheDH-Gens. Variiert wurde die Konzentration der Template-

DNA....................................................................................................................................................... 46 Tabelle 4: Ligationsansatz zur Klonierung der PheDH im pUC18-Vektor ........................................................ 48 Tabelle 5: Expressionsresultate der rekombinanten E.coli Stämme. Die Aktivitäten wurden im Rohextrakt „30

%iger Aufschluss“ gemessen................................................................................................................... 57 Tabelle 6: Zusammenfassung der Reinigung der recPheDH aus E.coli-Rohextrakt........................................... 61 Tabelle 7: Untersuchte Substrate der Rec-PheDH. ........................................................................................... 62 Tabelle 8: Kinetische Parameter für die Rec-PheDH........................................................................................ 62 Tabelle 9: PCR Protokoll zur Amplifizierung des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18-Plasmid.

Variiert wurden die Konzentrationen der Template-DNA......................................................................... 76 Tabelle 10: Aktivitätsbestimmung der exprimierten Enzyme in einem 10 L Fermenter mit LB-Medium als batch-

Fermentation........................................................................................................................................... 78 Tabelle 11: Aktivitätsvergleich in Abhängigkeit des Aufschlusspuffers ........................................................... 79 Tabelle 12: Proteinbestimmung beider exprimierten Enzymen, PheDH und malic enzyme, nach Variation der

Aufschlusszeit. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30Sekunden abgekühlt. ........................................................................................................................... 81

Tabelle 13: Aufreinigung des rekombinanten malic enzymes........................................................................... 81 Tabelle 14: Vergleich der PheDH- bzw. der malic enzyme-Aktivität in verschiedenen Reaktionspuffern. Die

Aktivitäten sind in Prozent vom Optimalen zu sehen................................................................................ 84 Tabelle 15: Möglichkeiten zur Substratumsetzung nach einer Mutagenese. Durch den Austausch des Lysins in

Isoleucin (neutrale Aminosäure) könnte die Methylgruppe des Ketons akzeptiert werden und somit das Keton zum Amin umsetzen. Es wird eine direkte Hydrierung der Ketosäure zur Hydroxysäure bei einer Mutagense des Lysin 66 in Arginin erwartet. ........................................................................................... 88

Tabelle 16: Zusammenfassung der hergestellten Mutanten und deren neue Eigenschaften . (O) getestet aber keine Aktivität, ( -) nicht getestet. Die Restaktivität bezieht sich auf der rec-PheDH. ....................................... 100

Tabelle 17: Km-Werte des Muteins K66R-8. Untersucht wurde Phenylpyruvat sowohl bei einer reduktiven Aminierung als auch bei einer Reduktion ohne Ammoniumionen........................................................... 108

Tabelle 18: Vergleich der Reaktionsmechanismen verschiedener Muteine. Die 3 Mutationen wurden einzeln rückgängig mutiert. Die drei Mutationen sind als Kombination für die neue Eigenschaft der PheDH verantwortlich. Die Substitution der einzelnen Mutationen in die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der LDH-Aktivität. ............................................................................................................ 111

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Reaktionsschema der Phenylalanin Dehydrogenase. ..................................................................... 4 Abbildung 2: Reaktionsmechanismus zur Aminierung von Ketosäuren und die dabei beteiligten Aminosäuren in

der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase. .................................................................................. 5 Abbildung 3: Dreidimensionale Struktur der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus

sp. M4. Dargestellt ist das Enzym mit dem Substrat Phenylpyruvat ohne Coenzym und Inhibitor. Die Pfeile zeigen auf die Aminosäure Lysin 66, die im aktiven Zentrum beteiligt ist, sowie auf das Substrat im Substratkanal. Die tiefe Spalte ist ein typischer Substratkanal für Aminosäure Dehydrogenasen. ................ 6

Abbildung 4: Die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrum der PheDH. Die Aminosäure Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Phenylpyruvat ............................................................................... 7

Abbildung 5: Schema zur Synthese von L-Phenylalanin unter Regeneration des Coenzyms NADH mittels Formiat Dehydrogenase............................................................................................................................. 9

Abbildung 6: Protein-Design Zyklus zur gezielten Mutagenese eines Enzyms.................................................. 12 Abbildung 7: Prinzip der gezielten Mutagenese mittels überlappender Fragmente............................................ 29 Abbildung 8: Vorgehensweise der Zufallsmutagenese ..................................................................................... 31 Abbildung 9: Schema zum Screeningsvorgang ................................................................................................ 34 Abbildung 10: genomische DNA aus Rhodococcus sp. M4 nach Elektrophorese im 0.5 %igem Agarosegel ..... 45 Abbildung 11: Ergebnis der PCR Reaktionen, die Abbildung zeigt ein Fragment mit einer Größe von etwa 1100

bp, als Marker wurde die Gibco KB-Leiter verwendet. Von den PCR-Ansätze wurden 7 µl auf ein 0.8 % Agarosegel aufgetragen, 1-3 entsprechen den Ansätze in Tabelle 2 .......................................................... 47

Abbildung 12: Vektorkarte des pUC18 -PheDH .............................................................................................. 48 Abbildung 13: DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 mit zwei Stopcodons.

............................................................................................................................................................... 49 Abbildung 14: Fließschema zur Klonierung des recPheDH-Gens in die Expressionsvektoren PET11a oder PET

16b ......................................................................................................................................................... 51 Abbildung 15: Agarose-Gel zur Überprüfung der Restriktion der recpET-16b-und 11a-Vektoren. Bei einer Größe

von etwa 1100bp tritt eine Bande des geschnittenen Inserts auf Bahn 2 pET-16b und Bahn 5 pET-11a. Als Marker wurde eine KB-Leiter (Gibco) verwendet Bahn 1. Der Ansätze wurden mit NdeI/BamHI behandelt............................................................................................................................................................... 51

Abbildung 16: SDS-Gel zur Überprüfung der Expression. Bei einer Größe von etwa 39 kDa tritt eine Bande auf. Bahn 1: Rohextrakt aus dem rec-pET16b in E. coli BL21 das Rohextrakt wurde nicht abzentrifugiert. Bahn 2: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET16b in E. coli BL21. Bahn 3: Rohextrakt aus dem rec-pET11a in E. coli BL21. Bahn 4: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET11a in E. coli BL21. 5: Marker........................................................................................................................... 52

Abbildung 17: Vektorkarte des pKK-223-3recPheDH. Das PheDH-Gen wurde an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK-223-3 mit einem Abstand zur Ribosomenbindungsstelle von 14bp ligiert............ 54

Abbildung 18: rec-pKK223-3-PheDH verdaut mit EcoRI. 1: KB-Marker, 2-6 recPhe-pKK223-3 verdaut mit EcoRI (verschiedene Konzentrationen). Nach einer Restriktionsanalyse taucht eine Bande mit der erwarteten Größe von ca. 800bp auf......................................................................................................... 56

Abbildung 19: Variation der IPTG-Konzentration bei der Induktion von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen zwischen 0 und 3 mM induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen............................................................................... 58

Abbildung 20: Wachstumsverhalten für E. coli nach der Induktion .................................................................. 59 Abbildung 21: Variation des Induktionszeitpunktes in Expressionskulturen von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die

Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit 1 mM IPTG induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen. .............................................................................................................. 60

Abbildung 22: SDS-PAGE (12.5 %, Silberfärbung) zur Überprüfung der Reinheit der recPheDH nach DEAE-Sepharose FF –Chromatographiegel. 1 Marker, 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF, 4 Rohextrakt aus E. coli ..................................................................................................................................................... 61

Abbildung 23: Temperaturstabilität der rec-PheDH im Vergleich zur WT-PheDH im Rohextrakt..................... 63 Abbildung 24: Temperaturoptimum der recPheDH im Vergleich zur WT-PheDH, Enzym-präparate aus dem

Rohextrakt JM105. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 270 U/mg, und im WT-PheDH 24 U/mg. ....... 64 Abbildung 25: pH-Optimum der rec-PheDH für die reduktive Aminierung. 100 % bei der rec-PheDH

entsprechen 190 U/mg, und im WT-PheDH 16 U/mg. Die Messung wurde bei 30°C durchgeführt. .......... 65 Abbildung 26: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK-223-3-PheDH] bei

linearer Erhöhung der Glucosezufuhr in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C. Die Acetatbildung wurde mittels HPLC bestimmt................................................................................................................. 66

Abbildung 27: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK223-3-PheDH] in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C und exponentieller Erhöhung der Glucosezufuhr ....................... 67

Abbildung 28: Entwicklung der PheDH-Volumenaktivität in Abhängigkeit vom Induktionszeitpunkt während der Zufütterungsphase ............................................................................................................................. 68

Abbildung 29: 0.8 %iges Agarosegel zum Nachweis der Konzentrationszunahme an rec-pKK-223-3 bei Induktion 1h nach Beginn der Glucose-Zuführung während der Fermentation.......................................... 69


Abbildung 30: Zu- und Abnahme der Plasmidkopienzahl bei Induktion 5 h nach Beginn der Glucosezuführung69 Abbildung 31: Neue PCR-Strategie zur Amplifikation des malic enzymes. Es wurde ein Einzelstrang

amplifiziert, der als Template für eine zweite PCR dient .......................................................................... 71 Abbildung 32: DNA-Sequenz des malic enzymes aus E. coli K12 ................................................................... 72 Abbildung 33: Proteinsequenz des malic enzymes aus E. coli K12 abgeleitet von der DNA-Sequenz ............... 73 Abbildung 34: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener malic enzymes. NADP- Salmonella enterica

subsp. enterica serovar Typhi (Parkhill et al., 2001), Mdh Pasteurella multocida (May et al., 2001), NAD-Brucella melitensis (DelVecchio et al., 2002), NADP-E.coli (Blattner et al., 1997). ................................. 75

Abbildung 35: Konstruktion des Plasmids für eine heterologe Expression zur L-Phe Synthese mittels Ganzzellumsetzung ................................................................................................................................. 75

Abbildung 36: PCR-Ausbeute des malic enzyme-Gens bei verschiedenen Konzentrationen an Template-DNA (rec-pUC18)............................................................................................................................................ 76

Abbildung 37: Vektorkarte des rec-pKK-223-3 PheDH-Malic. Malic enzyme wurde 3’ zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle mit eigener Ribosomenbindungsstelle kloniert. ................................................. 77

Abbildung 38: Stabilitätsbestimmung der PheDH bzw. des malic enzymes nach verschiedenen Aufschlusszeiten mittels Ultraschalls. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30 Sekunden abgekühlt. ............................................................................................................................... 80

Abbildung 39: pH-Optimum von malic enzyme und der PheDH. Die Aktivität beider Enzymen nimmt bei Zunahme des pH-Wertes zu. Die Messungen wurden mit partiell gereinigtem Enzym durchgeführt. Für die Phenylalanin Dehydrogenase wurde die reduktive Aminierung gemessen................................................. 82

Abbildung 40: Temperaturoptimum. Die Messungen wurden bei pH 8,5 und in 0,1M Hepes-Puffer durchgeführt................................................................................................................................................................ 83

Abbildung 41: HPLC-Analytik zur Nachweis von in situ Regenerationsystems gildeten L-Phenylalanin .......... 84 Abbildung 42: Bildungskinetik für L-Phe. Die Bildung von L-Phe wurde in situ durchgeführt. ........................ 85 Abbildung 43: Produktnachweis nach einer 5 stündigen Umsetzung mit ganzen rekombinanten E. coli Zellen . 86 Abbildung 44: Ganzzellumsetzung zur Produktion von L-Phe. Die Bestimmung von L-Phe erfolgte mittels

HPLC ..................................................................................................................................................... 86 Abbildung 45: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylalanin mittels PheDH............... 87 Abbildung 46: Schema zur Mutagenese mittels PCR nach der Methode der „overlapping extension“,

ausgetauscht wurde das Lysin66 gegen Isoleucin ..................................................................................... 89 Abbildung 47: Klonierungsstrategie zur Einführung der Mutation PheDHK66I. Im ersten Schritt wurden zwei

Fragmente amplifiziert, die die gleiche Mutation tragen; beim zweiten Schritt hybridisierten sie zum ganzen Gen. Somit konnte das amplifizierte Gen in den Expressionsvektor ligiert werden.................................... 90

Abbildung 48: Agarosegelanalyse der PCR zur K66I- Mutagenese. Spur 1: kb-Leiter; Spur 2 unspezifische Amplifikation der Teilfragmente; Spur 3 und 4 sind gewünschte Amplifikate nach einer Optimierung der PCR- Bedingungen mit einer Größe von ca. 200 bp bzw. 900 bp.............................................................. 93

Abbildung 49: Sauberes PCR-Produkt nach der Fusion der beiden Fragmente (Abbildung 48; Bahn 3+4) mit einer Größe von 1.1 kb ............................................................................................................................ 93

Abbildung 50: Gensequenz des K66I- Muteins................................................................................................ 94 Abbildung 51: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin66 durch den Austausch in Isoleucin. (A)

Wechselwirkung zwischen Lysin66 und der Carboxylgruppe des Substrates in der PheDH, (B) Mutein K66I, Lysin wurde gegen Isoleucin ausgetauscht, das keine Wasserstoffbindung zur Carboxylgruppe des Substrates bildet. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. ................................................................. 95

Abbildung 52: Reaktionsmechanismus der reduktive Aminierung von Phenylaceton....................................... 95 Abbildung 53: Klonierungsstrategie der PheDH-Mutanten am Beispiel der PheDH-K66R. Das ganze

rekombinante Plasmid wird mittels Mutagenese-Primer amplifiziert und in E.coli-Zellen transformiert ... 98 Abbildung 54: Reaktionsmechanismus zur Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat zur Hydroxysäure

Phenyllactat. ........................................................................................................................................... 99 Abbildung 55: Reaktionsschema zum Verlauf des Farbtests........................................................................... 103 Abbildung 56: Farbtest auf Agarplatten mit ganzen Zellen. Die gelben Zellen enthalten PheDH-Aktivität...... 103 Abbildung 57: Bestimmung der Aktivität der K66R-Muteine. Gezeigt werden einige Muteine mit den restlichen

Aktivitäten im Vergleich zur Wt-PheDH. Bei zwei Muteinen (Mutein 2 und 8) konnte der natürliche Reaktionsmechanismus verändert und somit neue Eigenschaften erzielt werden..................................... 104

Abbildung 58: Aminosäurensequenz des Mutein K66R-8 im Vergleich zur PheDH-AS-Sequenz. 3 Mutationen K66R, T208A, E225D sind in diesem Mutein für die neue Aktivität verantwortlich................................ 105

Abbildung 59: Dreidimensionale Struktur des K66R-8-Mutein. Gezeigt sind die durch die Mutagenese ausgetauschten Aminosäuren. Die Mutationen K66R, T208A und E225D sind hervorgehoben. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. .......................................................................................... 106

Abbildung 60: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin66 durch den Austausch in Arginin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin66 und der Carboxylgruppe des Substrates, (B) Arginin wird anders orientiert und geht keine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe des Substrates ein. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt. .......................................................................................... 107


Abbildung 61: Reaktionsschema des K66R-8-Mutein.................................................................................... 107 Abbildung 62: pH-Optimum des Muteins K66R-8 im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Der Aktivitätstest

(Reduktion des Phenlpyruvat ohne Ammoniumionen) wurde bei verschiedenen pH-Werten zwischen pH 5 und pH 10 gemessen ............................................................................................................................. 108

Abbildung 63: Temperaturoptimum des K66R-8-Muteins im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Die Ansätze enthielten Tris/HCl Puffer (100 mM pH 8.0 + Phenylpyruvat und NADH) wurden auf den jeweiligen Meßtemperaturen (25-50°C) in der Küvette temperiert und gemessen .................................................... 109

Abbildung 64a: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach zweistündiger Inkubation. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM NAD+, 2 mM MgCl2, 20 U K66R-8 und 30 U Formiat Dehydrogenase. ....................................................................... 110

Abbildung 65: Einfluss der Mutationen K66R, T208A und E225D, auf die Enantioselektivität der Reduktion von Phenylpyruvat (30 mM) in Abhängigkeit von der Zeit..................................................................... 111

Abbildung 66 Produktnachweis nach einer 9 stündigen Umsetzung mit dem Mutein K66I. Zur Regenerierung des Coenzyms NADH wurden 40 U Formiat Dehydrogenase eingesetzt. Die reduktive Aminierung erfolgte mit (NH4)2SO4 und 30 mM Phenylpyruvat als Substrat. (L-Phe = 23 min; der Peak bei 29 min ist nicht identifiziert). ......................................................................................................................................... 113

Abbildung 67: Alignment der Aminosäurensequenzen der Wt-PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Brunhuber et al., 1994) mit der LDH aus Bifidobacterium longum (Iwata et al., 1994) und der Mutante K66R-8. Rot: Identische Aminosäuren; grün: ähnliche Aminosäuren; Durch Fettdruck hervorgehoben: Mutationen; blaue Pfeile: wichtige Reste zur Bildung der Rossmann fold. .......................................................................... 125

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ALF Automated Laser Fluorescent Sequencer

Amp Ampicillin

APS Ammoniumpersulfat

ATP Adenosintriphosphat

BSA Bovine serum albumine

C-Quelle Kohlenstoffquelle

CTAB N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid

C-Terminus Carboxy-Terminus

Da Dalton

DEAE Diethylaminoethyl

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FDH Formiatdehydrogenase

FF Fast Flow

h Stunde

IB-L-C N-Iobutyryl-L-Cystein

IEF Isoelektrische Fokussierung

IEP Isoelektrischer Punkt

IPTG Isopropylthiogalactosid

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

Kpi Kaliumphosphatpuffer

Km Michaelis-Menten Konstante

L Liter

LB Luria Bertani

min Minute

M molar


mM Millimolar

MOPS 3-N-Morpholino-propansulfonsäure

NAD Nicotinamidadenindinukleotid (oxidierte Form)

NADH Nicotinamidadenindinucleotid (reduzierte Form)

N-Terminus Amino-Terminus

OD optische Dichte

OPA o-Phtaldialdehyd

PAA Polyacrylamid

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR Polymerase chain reaction

PEG Polyethylenglycol

PheDH Phenylalanin Dehydrogenase

Rec-PheDH rekombinante wt-PheDH

SDS Natriumlaurylsulfat

TBE Tris-Borsäure-EDTA Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

TEA Triethanolamin

TEMED N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin

Tris N-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

U Unit (Enzymeinheit)

Upm Umdrehung pro Minute

UV Ultraviolett

Vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit

v/v Volumenanteil pro Volumenanteil

w/v Gewichtsanteil pro Volumenanteil

w/w Gewichtsanteil pro Gewichtsanteil

WT Wildtyp

Einleitung 1

1 Einleitung 1.1 Bedeutung von Enzymen

In den meisten Publikationen über die Biokatalyse findet man die Aussage, dass die

chemische Industrie durch die Biokatalyse inhärent bessere Verfahren zu erwarten hat. Dabei

sollte allerdings nicht übersehen werden, dass seit 200 Jahren verschiedenste Verbindungen

von Arzneimitteln bis zu Haushaltsreinigern ohne Biokatalysatoren effizient hergestellt

werden. Daher besteht kein Grund zu der Annahme, dass die Chemie in den nächsten

Jahrhunderten nicht ebenso erfolgreich sein wird. Die großen Vorteile chemischer Verfahren

sind Einfachheit, Geschwindigkeit (gesteigert durch den Einsatz von Hitze und Druck) und

niedrige Kosten, warum also sollten Biokatalysatoren interessant sein? Die genannten

Vorteile der chemischen Verfahren kommen manchmal nicht zum Tragen, wenn für das

gewünschte Produkt regio- oder stereospezifische Reaktionen erforderlich sind, wenn Edukte

oder das Produkt instabil sind oder wenn Verunreinigungen durch Nebenreaktionen ein ernst-

haftes Problem sind. Biokatalysatoren sind attraktiv, weil zu ihren Eigenschaften Chemo-,

Regio- und Stereoselektivität, eine beeindruckende Katalyseeffizienz und die Fähigkeit zur

Reaktion in wässrigen Medien gehören.

So besitzen Enzyme eine hohe Chemo- und Regioselektivität, die Voraussetzungen für die

Steuerung der komplexen Vorgänge in einer Zelle sind. Enzyme beschleunigen Reaktionen

um Faktoren von wenigstens einer Million. Ohne sie würden die meisten Reaktionen in

biologischen Systemen nicht in wahrnehmbarem Umfang ablaufen.

Eine erhebliche Bedeutung hat die Biotechnologie in der Qualitätsverbesserung von

Nahrungsmitteln in Bezug auf Struktur und Geschmack (Uhlig, 1991) sowie in der

Herstellung von Aminosäuren erlangt. Aufgrund der hohen Spezifität und Selektivität werden

Enzyme in zunehmendem Maße in die klassische Organische Chemie integriert. Für

Pharmaka und Agrochemikalien sind enantiomerenreine Wirkstoffe zunehmend gefordert, um

unerwünschte Nebenwirkungen auszuschließen, wie im bekanntesten Fall beim Contergan,

bei dem das (R)-Enantiomer beruhigend, das (S)-Enantiomer aber teratogen wirkt (Faber,

1997). Die Synthese von enantiomerenreinen Verbindungen ist daher von besonderem

Interesse.

Dass Enzyme nicht immer bei industriellen Prozessen zum Einsatz kommen, liegt

hauptsächlich daran, dass Enzyme unter harten industriellen Bedingungen eingesetzt werden

sollten, die zu deren Denaturierung führen. Dazu gehören vor allem hohe Temperaturen und

die Anwesenheit organischer Lösungsmittel. Dennoch haben biotechnologische Verfahren es

ermöglicht, einige klassische chemische Prozesse zu ersetzen.

Einleitung 2

1.2 Enzyme in der Industrie

Wegen der strengen Umweltauflagen für die chemische Industrie suchen die Groß-Industrien,

aber auch mittelständige Betriebe nach umweltfreundlichen Methoden. Dadurch entwickeln

sich biotechnologische Verfahren rasch und es werden immer mehr Enzyme in der Industrie

eingesetzt.

Die Pharmaindustrie hat enorme Aufwendungen in die Herstellung enantiomerenreiner

Wirkstoffe gesteckt, um pharmakologisch wirksame Substanzen in der geforderten Reinheit

zu erhalten. Mittlerweile wird die Forderung nach enantiomerenreinen Wirkstoffen auch für

die Entwicklung neuer Agrochemikalien intensiv geprüft (Ernst&Young, 1998). Zu erwarten

ist, dass dieses Qualitätskriterium eingehalten werden muss, sobald der Stand der Technik

dies zulässt.

Industriell genutzte Enzyme sind z.B. die bei der Fruchtsaftklärung verwendeten Pektinasen

oder die als enzymatische Wirkstoffkomponenten in Waschmitteln und in der

Textilverarbeitung zum Einsatz kommenden Lipasen, Proteasen, und Cellulasen (Tabelle 1)

(Jaag, 1968).

Tabelle 1: Industriell genutzte Enzyme, ihr Ursprungsorganismus, aus dem sie isoliert werden und mögliche Verwendungszwecke

Enzym Isoliert aus Nutzung bei

? -Amylase Bacillus subtilis, Aspergillus niger

Aspergillus oryzae

Stärkeprodukte, Textilverarbeitung,

Brotherstellung, Fruchtsäfte, Sirup,

Gemüsesäfte

Bromelain Ananas comosus

Ananas bracteatus

Fruchtsaftklärung,

Fleischzartmacher

Cellulasen Aspergillus niger

Trichoderma reesei

Glucoseherstellung,

Papierverarbeitung

Glucose-Isomerase Streptomyces spec

Bacillus coagulans

Herstellung von Zuckersirup

Glucose-Oxidase Aspergillus niger Antioxidans

Auch in der organischen Synthese gewinnen Enzyme zunehmend an Bedeutung (Zaks, 2001).

Innerhalb der industriell genutzten Biokatalysatoren kommt den Dehydrogenasen dabei in den

letzten Jahren, trotz des erforderlichen Zusatzes von Coenzymen, eine stärkere Bedeutung zu.

Einleitung 3

(Carrea et al., 1996). Da Coenzyme kostenintensiv sind, wenn sie in äquimolaren Mengen in

der enzymatischen Synthese im industriellen Maßstab eingesetzt werden, wurden eine Reihe

von Verfahren entwickelt, die Coenzyme in situ zu regenerieren (Kometani et al., 1994;

Leonida et al., 1998). Dabei stellen enzymatische Verfahren die effizienteste Methode zur

Coenzymregenerierung dar.

So stellen Dehydrogenasen ideale Biokatalysatoren für asymmetrische Synthesen chiraler,

enantiomerenreiner Substanzen aus prochiralen Vorstufen dar (Hummel & Kula, 1989).

Einsatzgebiete sind derzeit vor allem die Produktion von Pharmazeutika, Feinchemikalien und

Lebensmittelzusatzstoffen (Drauz et al., 1994). Kommerziell gehandelte Enzyme wie zum

Beispiel Alkohol Dehydrogenasen, Phenylalanin Dehydrogenase (Hummel, 1997), D- oder L-

Lactat Dehydrogenasen oder D-Hydroxyisocapronsäure Dehydrogenasen (Lerch et al., 1989),

wurden für die Präparation von optisch aktiven Substanzen mit Erfolg eingesetzt (Hanson et

al., 2000).

Am Beispiel der Synthese von enantiomerenreinen Aminosäuren durch die enzymatische

reduktive Aminierung prochiraler ? -Ketosäuren werden Aminosäure Dehydrogenasen wie die

Leucin Dehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus sp. (Bommarius & Drauz, 1994; Bommarius et

al., 1995; Wichmann et al., 1981) und die Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus

Rhodococcus sp. M4 mit Erfolg eingesetzt (Hummel et al., 1987).

Eine Vielzahl neuer aliphatischen und aromatischen ? -Aminosäurederivate, kann aufgrund

der breiten Substratspektren der LeuDH und der PheDH mit hoher Enantioselektivität

hergestellt werden (Krix et al., 1997). Erfolgreich wurde die NAD-abhängige Leucin

Dehydrogenase aus Bacillus sp. für die Synthese optisch aktiver Aminosäuren mit

ungewöhnlichen Resten wie (S)-tert.-Leucin eingesetzt (Bommarius et al., 1995). Das meist

breite Substratspektrum dieser für die chemische Synthese einsetzbaren Enzyme wirkt sich

vorteilhaft aus, da meistens die Enzyme für mehr als ein Substrat verwendbar sein sollten.

Das bei Dehydrogenasen notwendige Coenzym beeinträchtigt die Synthese nicht, da NAD+

über einen längeren Zeitraum stabil (Janssen et al., 1987; Oppenheimer & Kaplan, 1974;

Wong & Whitesides, 1981) und durch die Regenerierung mit Formiat kostengünstig

einsetzbar ist.

Einleitung 4

1.3 Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4

Die Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp. M4 katalysiert die oxidative

Desaminierung von L-Phenylalanin zum Phenylpyruvat und Ammonium, dabei wird das

Coenzym NAD+ zum NADH reduziert (Abbildung 1) (Hummel et al., 1987).

O C COOH

CH 2

H2NHC COOH

CH 2PheDH+ NH4

+ + NADH + NAD+ + H20

Phenylpyruvat L-Phenylalanin

Abbildung 1: Reaktionsschema der Phenylalanin Dehydrogenase.

Das Enzym benötigt NAD+ als natürliches Coenzym und wurde bei einigen gram-positiven,

aeroben Bakterien gefunden. Anfänglich wurde die PheDH in Brevibacterium sp (Hummel et

al., 1984) und später in anderen Bakterienstämmen wie Bacillus, Sporosarcina (Asano et al.,

1987), Nocardia (de Boer et al., 1989), Thermoactinomyces (Ohshima et al., 1991), und

Rhodococcus (Hummel et al., 1987) gefunden. Die Phenylalanin Dehydrogenase gehört zu

einer großen Aminosäure-Dehydrogenasen-Familie, zu der die Glutamat Dehydrogenase,

Alanin Dehydrogenase, Leucin Dehydrogenase, und die selten vorkommende Lysin-

Dehydrogenase gehören. Die PheDH kann für die Synthese von optisch aktivem L-

Homophenylalanin, einem Baustein vom Angiotensin, für die Behandlung von Bluthochdruck

(Hypertension) und Herzfehlern (Abrams et al., 1984; Ondetti & Cushman, 1981) und

ebenfalls für die Herstellung von Allysin als Vasopeptidase Inhibitor (Hanson et al., 2000)

sowie zur industriellen Synthese von L-Phenylalanin als Komponente von Aspartam

(Wichmann et al., 1981) verwendet werden. Ebenso kann das Enzym für den Nachweis der

Phenylketonurie (Centerwall & Centerwall, 2000) mittels eines Biosensors eingesetzt werden

(Wendel et al., 1991; Wendel et al., 1990).

Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 ist im Gegensatz zu den octameren

Phenylalanin Dehydrogenasen aus Bacillus sphaericus (Okazaki et al., 1988) und

Sporosarcina urea (Asano et al., 1987) ein Tetramer von 39.5 kDa pro Monomer (Brunhuber

et al., 1994). Die Phenylalanin Dehydrogenase aus Thermoactinomyces liegt als Hexamer vor

(Takada et al., 1991). In Abbildung 2 ist der Reaktionsmechanismus der Phenylalanin

Dehydrogenase dargestellt (Brunhuber et al., 2000). Die reduktive Aminierung des Phenyl-

Einleitung 5

pyruvats erfolgt über die Bildung von Iminophenylpyruvat, das in einem weiteren Schritt zu

L-Phenylalanin reduziert wird.

Abbildung 2: Reaktionsmechanismus zur Aminierung von Ketosäuren und die dabei beteiligten Aminosäuren in der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase.

Einleitung 6

Die Kristallisation und Aufklärung der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 wurde durch

Vanhooke et al (Vanhooke et al., 1999) ermöglicht. Basierend auf den Daten der

dreidimensionalen Struktur konnte die PheDH mittels 3D-Programm (Swiss PDB Viewer)

modelliert werden (Abbildung 3). Hervorgehoben sind die Aminosäure Lysin an Position 66

im aktiven Zentrum, die Lage des Substrates Phenylpyruvat und das Coenzym NAD+.

Abbildung 3: Dreidimensionale Struktur der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4. Dargestellt ist das Enzym mit dem Substrat Phenylpyruvat ohne Coenzym und Inhibitor. Die Pfeile zeigen auf die Aminosäure Lysin 66, die im aktiven Zentrum beteiligt ist, sowie auf das Substrat im Substratkanal. Die tiefe Spalte ist ein typischer Substratkanal für Aminosäure Dehydrogenasen.

Lysin 66

Phenylpyruvat

NAD+

Einleitung 7

Zur Veranschaulichung sind die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrums mit den

Wasserstoffbindungen zum Substrat und Coenzym (NAD) in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 4: Die beteiligten Aminosäuren im aktiven Zentrum der PheDH. Die Aminosäure Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Phenylpyruvat

NAD+

Phenylpyruvat Lysin 66

Lysin 78

Einleitung 8

1.3.1 Malic enzyme aus E. coli K12

Das NAD abhängige malic enzyme ist in der Natur weit verbreitet und katalysiert die

oxidative Decarboxylierung von L-Malat. Dieses Enzym gehört zur Klasse der

Oxidoreduktasen und kann für die kolorimetrische Bestimmung von Malat und ebenfalls für

die NADH-Regenerierung im Enzymreaktor eingesetzt werden (Nakamura et al., 1986).

Das malic enzyme wurde sehr umfangreich in verschiedenen Organismen, in Bakterien

(Sulfolobus solfataricus (Iwakura et al., 1978), Clostridium thermocellum (Lamed & Zeikus,

1981), Bacillus subtilis (Diesterhaft & Freese, 1973), Pseudomonas fluorescens (Knichel &

Radler, 1982), in Pflanzen Zea mays, Solanum tuberosum (Hausler et al., 1987; Willeford &

Wedding, 1987), und ebenfalls in höheren Organismen, Rattenleber (Bagchi et al., 1987;

Magnuson et al., 1986; Winberry et al., 1983) untersucht.

Das in dieser Arbeit klonierte NAD abhängige E. coli K12 malic enzyme zeigt Ähnlichkeit im

Molekulargewicht (50 kDa) zum malic enzyme aus Bacillus stearothermophilus (Kobayashi

et al., 1989) aber einen Unterschied zum NADP-abhängigen malic enzyme aus E. coli (62

kDa) (Nakamura et al., 1986).

1.3.2 L-Phenylalanin-Synthese unter Coenzymregeneration

Verschiedene Wege führen zur Produktion der Aminosäure L-Phenylalanin. Man kann dies

durch chemische Synthesen, Extraktion von Protein-Hydrolysaten, fermentative oder

enzymatische Methoden erreichen. Eine direkte Fermentation zur Produktion von L-

Phenylalanin ist mit Corynebacterium glutamicum (Nakayama et al., 1978) oder Bacillus

subtilis (McEvoy & Joyce, 1974) beschrieben. Dennoch konnten mittels der Phenylalanin

Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 in einem Enzym-Membran-Reaktor 456 g L-1·d-1

L- Phenylalanin erzielt werden (Hummel et al., 1987). Die Synthese des L- Phenylalanins

wurde durch die PheDH unter Regeneration des Coenzyms NADH mit der Formiat

Dehydrogenase (FDH) katalysiert. Phenylpyruvat wird in diesem System durch reduktive

Aminierung mit Hilfe von PheDH in L-Phenylalanin umgewandelt. Gleichzeitig sorgt die

FDH für die Regenerierung des NADH durch Formiat (Abbildung 5) (Hummel et al., 1987).

Für die Regenerierung des NADH im industriellen Maßstab wird bis dato die NAD-abhängige

Formiat Dehydrogenase eingesetzt (Kula & Wandrey, 1987; Shaked & Whitesides, 1980).

Das Verfahren konnte großtechnisch angewandt werden (Kragl et al., 1992).

Einleitung 9

Abbildung 5: Schema zur Synthese von L-Phenylalanin unter Regeneration des Coenzyms NADH mittels Formiat Dehydrogenase.

1.3.3 Expression rekombinanter Proteine

Die Möglichkeit, Proteine, die normalerweise entweder gar nicht oder nur in extrem geringen

Mengen verfügbar waren, in großen Mengen herzustellen, beeindruckte Wissenschaftler,

Ärzte und Geschäftsleute gleichermaßen. Im Jahre 1976 hielt die Gentechnik Einzug in die

Biotechnologie. Erstmals wandte man die Verfahren der DNA-Klonierung, Oligonucleotid-

synthese und Genexpression in einem einzelnen Experiment an, bei dem man ein

menschliches Protein durch die Expression einer rekombinierten DNA gewann. Es handelte

sich um den aus 14 Aminosäuren bestehenden Peptidneurotransmitter Somatostatin (Itakura et

al., 1977). Das Gen des entsprechenden Proteins wurde in einem Plasmid kloniert und in E.

coli exprimiert. Wenig später gelang die Expression des menschlichen Insulins (Nossal,

1980), das zur Behandlung des Diabetes dient und zum ersten kommerziell genutzten Produkt

der Gentechnik wurde.

Solche Meisterleistungen beruhten auf Erfolgen in allen Bereichen der Molekularbiologie,

unter anderem der Oligonucleotidsynthese, der Isolierung der DNA-spaltenden und

verknüpfenden Enzyme, der Charakterisierung bakterieller Plasmide und der Erforschung der

Genexpression.

Eine Vielfalt an Expressionsplasmiden ist kommerziell erhältlich. Die Minimal-Ausstattung

solcher Plasmide besteht aus einem Promotor, einer Ribosomenbindungsstelle, dem Origin of

Replication, und einem Selektionsmarker. Dennoch führt der Abbau oder die chemische

Modifizierung des Antibiotikums durch das Produkt des Resistenzgens oder den Wirtsstamm

oft zur Reduktion der Plasmidkopienzahl in der Zelle und begünstigen die Entstehung

heterogener Organismenpopulationen (Bentley et al., 1993).

Formiat

CO2

NAD +

NADH

L-Phenylalanin + H 2O

Phenylpyruvat + NH4+

PheDHFDH

Regeneration des Coenzymes NADH

Einleitung 10

Für die Verbesserung solcher Systeme wurden spezielle DNA-Sequenzen bezüglich

Plasmidstabilität, mRNA-Stabilität, effizienter Translationsinitiation, und rechtszeitiger

Transkriptionstermination entwickelt (Balbas & Bolivar, 1990). Beispiele solcher Sequenzen

bilden Repressorgene, Terminatoren, Antiterminatoren, Sekretionsgene und Reportgene

(Stader, 1995). Die Stabilität des Fremdgens oder Plasmids (Segregationsstabilität), wird

durch hohe Kopienzahl, par-Sequenzen und Selektionsmarker gefördert (Balbas & Bolivar,

1990). Durch die Einführung einer par-Sequenz kann die Segregationsstabilität eines

Expressionsvektors erhöht werden (Zurita et al., 1984). Einfluß üben außerdem die

Transkriptionsaktivität des Fremdgens und die genetischen Eigenschaften des

Wirtsorganismus (Stader, 1995) sowie die Zusammensetzung des Kulturmediums aus (Mason

& Bailey, 1989).

Die Klonierung des Gens der cDNA eines Proteins ist nur der erste von vielen Schritten, um

gentechnisch ein Protein für medizinische oder industrielle Anwendungen herzustellen. Der

nächste Schritt besteht darin, das Gen in eine Wirtszelle einzuschleusen und es darin zu

exprimieren. Die bekanntesten Expressionssysteme sind die Bakterien E.coli und Bacillus

subtilis, die Hefe, sowie kultivierte Insekten- und Säugetierzellen. Welches System geeignet

ist, hängt von den Projektzielen und den Eigenschaften des zu produzierenden Proteins ab.

Bakterienzellen sind einfache Systeme mit kurzer Generationszeit, hoher Ausbeute und

niedrigen Kosten. Die Zellen, insbesondere von B. subtilis, lassen sich induzieren und

schleusen das Produkt in das Kulturmedium aus, was die Reinigung des Proteins

außerordentlich vereinfacht. Allerdings haben prokaryotische Zellen auch einige Nachteile.

Manche Proteine werden zwar extrem stark exprimiert (sie können mehr als 20 % der Masse

aller Bakterienproteine ausmachen), aber oft falten sie sich nicht korrekt, und bilden dann

unlösliche Einschlusskörper (inclusion bodies) (Hibino et al., 1994). Diese Proteine kann man

zwar durch Extraktion gewinnen, sie sind allerdings in aller Regel biologisch inaktiv. Kleine

Proteine lassen sich unter Umständen in ihre aktive Form überführen (Babbitt et al., 1990;

Huang et al., 1993), bei großen Produkten ist das jedoch normalerweise nicht möglich. Ein

zweites Problem ist, dass Fremdproteine für Bakterien manchmal toxisch sind wie z.B.

Aminosäure-Oxidasen, sodass Kulturen, die das Protein herstellen, nicht in hoher Dichte

wachsen können. Diese Schwierigkeit lässt sich oft durch einen induzierbaren Promotor

umgehen. Wenn die Kultur dicht gewachsen ist, schaltet man den Promotor an, der daraufhin

mit der Transkription des Gens für das toxische Fremdprotein beginnt.

Einleitung 11

Drittens fehlen den Bakterien jene Enzyme, die Proteine in Eukaryotenzellen nach der

Translation modifizieren, indem sie ihnen beispielsweise Phosphatgruppen oder Zuckerreste

anhängen. Derartige chemische Modifikationen sind häufig notwendig, damit die Proteine

Aktivität zeigen. Eine Möglichkeit zur posttranslationalen Modifikation besteht darin, die

modifizierenden eukaryotischen Enzyme zu reinigen und mit ihnen bakteriell exprimierte

Proteine nachträglich abzuwandeln.

1.4 Protein-Design

1.4.1 Gezielte Mutagenese

Die Nutzung von Mikroorganismen und der daraus gewonnenen Enzyme erhalten neue

Aspekte durch die Gentechnik, mit denen sowohl neue Produkte herstellbar werden, als auch

erhebliche Verbesserungen in Ausbeute und Qualität bei konventionellen Produkten zu

erwarten sind.

Mittels NMR-Techniken und Röntgenstrukturanalyse wurde die Ermittlung der

dreidimensionalen Struktur eines Proteins ermöglicht, und durch den Einsatz von

Computertechnik gezielt Veränderungen vorgenommen.

Über die gezielte Verknüpfung dieser Strukturaufklärung mittels Computertechnik mit den

neuen Kenntnissen der Biochemie und der Molekularbiologie können wirtschaftlich

interessante Enzyme untersucht und modifiziert werden. So wurden Enzymvarianten

hergestellt, die sich durch überlegene Eigenschaften, wie z.B. höhere Aktivität, bessere

Stabilität, erweitertes Substratspektrum oder Coenzymspezifität auszeichnen (Galkin et al.,

1997; Slusarczyk et al., 2000). Einige veränderte Enzyme können so technisch interessante

Chemikalien bis zu 10000x besser umsetzen, als die natürliche Form des Enzyms (Wilkinson

et al., 1984). Statt tausender von Proteinen auf mögliche Wirksamkeit zu testen, versucht man

mit Hilfe des Protein-Designs eine neue maßgeschneiderte Struktur am Computer zu

entwerfen. Diese neumodifizierten Enzyme werden dann mit molekularbiologischen

Methoden hergestellt und hinsichtlich Struktur und neuer Eigenschaften untersucht. Für den

Einsatz eines erfolgreichen rationalen Designs müssen vorab tiefgehende Informationen über

Struktur und Reaktionsmechanismus vorliegen. Abbildung 6 zeigt den Zyklus, wie er

normalerweise durchgeführt wird.

Einleitung 12

W ild ty p

D N A -Is o la t io n

G e n b a n k

K lo n ie ru n g

E x p re s s io n

P ro te in

P r im ä rs tru k tu r

D N A -S y n th e s e

P ro te in is o lie ru n g

N M R

m o le k u la re s M o d e ll

K r is ta llis a t io n

R a u m s tru k tu r

R K S A

E ig e n s c h a f te n

M o d if ik a t io n

Abbildung 6: Protein-Design Zyklus zur gezielten Mutagenese eines Enzyms

(RKSA = Röntgenstrukturanalyse)

Die Überlegung, dass durch die Senkung der Entfaltungsentropie mittels ausgewählter

Aminosäurensubstitutionen die Konformation des T4-Lysozyms stabilisiert werden kann,

haben Mathews et al. (Matthews et al., 1987) durch die Erzeugung einer Doppelmutante

nachgewiesen und somit die Thermostabilität dieses Proteins erhöht. In einer folgenden

Arbeit wurde durch die Einführung von zwei Disulfidbrücken an definierten Stellen im

Lysozym, das heißt Austausch von vier Aminosäuren, die strukturell günstig für eine

Ausbildung lagen, die Thermostabilität von 41°C auf 58°C erhöht, wobei das neu entstandene

Enzym die volle Aktivität besaß (Matsumura et al., 1989).

Vacca et al. (Vacca et al., 1995) konnten durch den Austausch von Tryptophan 140 gegen

Histidin mittels gezielter Mutagenese die Reaktions- bzw. Substratspezifität der

Aspartataminotransferase verändern. Dadurch kann Alanin siebenmal schneller als durch das

Wildtypenzym racemisieren, während die Aktivität des Muteins gegenüber Alanin sechsfach

abnahm.

Die benötigte exakte Aufklärung der Struktur eines Enzyms ist ein Nachteil der gezielten

Mutagenese, da sich die Strukturen bekannter Proteine nicht auf andere mit ähnlichen

Sequenzmotiven übertragen lassen.

Einleitung 13

1.4.2 Zufallsmutagenese

Die Methode der „Zufallsmutagense“ (random mutagenesis), bei der ein großer Pool an

Veränderungen in ein Enzym eingeführt wird, ist eine gute Alternative zum rationalen

Protein-Design. Um das Screening der durch die Zufallsmutagenese hergestellten

Enzymvarianten- Bibliothek ermöglichen zu können, sind geeignete und effektive

Selektionsmechanismen notwendig. Mit geeigneten Methoden können die gewünschten

Eigenschaften detektiert werden. Es wird eine Art künstlicher Evolution herbeigeführt

(Arnold & Moore, 1997), bei der man den Selektionsdruck zur Verbesserung der

Eigenschaften zu Hilfe nimmt (Bornscheuer et al., 1998; Bornscheuer et al., 1999).

Diese Methode wurde zur Erhöhung der Temperaturstabilität (Bryan et al., 1986) bzw. der

pH-Stabilität (Cunningham & Wells, 1987) von Enzymen oder zur Erhöhung der Resistenz

(Oliphant & Struhl, 1989) erfolgreich angewandt. Durch den Austausch von Asparagin 218

gegen Serin konnte die Thermostabilität der Serin-Protease Subtilisin aus Bacillus

amyloliquefaciens im Vergleich zum Wildtyp um das vierfache gesteigert werden (Bryan et

al., 1986). Hier erfolgte die Mutagenese durch Zugabe von Natriumbisulfit, das zur

Desaminierung von Cytosin zu Uracil führte. Das Screening nach diesem Mutein erfolgte

über ein geeignetes Subtilisinsubstrat und einen pH-Indikator auf Agarplatten, so dass beim

Abbau des Substrates eine pH-Senkung stattfand und sich somit die Farbe des Indikators

änderte. Zhou et al. verwendeten für die Erhöhung der Thermostabilität des Subtilisins die

Polymerase- Ketten- Reaktion (PCR) (Zhou et al., 1996), konnten damit allerdings die

gleichen Punktmutationen wie Bryan et al. nachweisen. In einer anschließenden gezielten

Mutagenese wurde eine weitere Aminosäure substituiert und somit eine Doppelmutante

erzeugt, die sowohl thermostabil als auch oxidationsresistent ist. Arnold et al. bewirkte eine

Verbesserung der Thermostabilität der Bacillus subtilis-Protease – Subtilisin E und erhielten

somit eine ähnliche Thermostabilität wie bei der Thermoactinomyces vulgaris- Thermitase

(Zhao & Arnold, 1999). Mit der „error-prone“ Methode konnte ebenfalls die Aktivität vom

Subtilisin E auf das 16 fache erhöht werden (You & Arnold, 1996).

Die gerichtete Evolution als erfolgreiches Konzept zeigen die folgenden Beispiele:

p-NB-Esterase: 3 Mutationen / höhere Aktivität in org. Lösungsmittel (Moore et al., 1997)

Subtilisin E: 8 Mutationen / 1000 x höhere Halbwertszeit bei 65°C (Zhao et al., 1998)

Einleitung 14

Die Zufallsmutagenese hat folgende Vorteile:

1. keine Strukturinformation nötig

2. schnellerer Optimierungsprozeß

3. mehrere unspezifische Mutationen/Generationen sind möglich

1.5 Hochzelldichte-Fermentation (HZD)

Um die durch kontinuierliche Zuführung ein oder mehrerer Nährstoffe während der

Fermentation auftretende Katabolit-Repression und Anreicherung toxischer Substanzen

vermeiden zu können, erfolgt die Kultivierung rekombinanter Mikroorganismen in der Regel

mittels der fed-batch-Technologie.

Die HZD-Fermentation dient zur Verbesserung der Produktivität mikrobieller Systeme, der

Reduktion von Produktions- Investitionskosten und Kulturvolumina (Knorre et al., 1991).

Ebenso können Sauerstoffverbrauch und die Wärmeentwicklung durch die Limitierung der

Wachstumsrate kontrolliert werden (Riesenberg, 1991). Dennoch führen die

Substratlimitation und -inhibition, Limitierung der Sauerstoffversorgung und Wärmetransfer,

CO2 –Konzentration sowie die Bildung metabolischer Nebenprodukte zu Problemen bei der

HZD-Fermentation (Riesenberg et al., 1991).

Metabolische Nebenprodukte: Die Bildung von Nebenprodukten hängt von der

Zusammensetzung des Mediums, dem Wirtsstamm und der spezifischen Wachstumsrate ab

(Pan et al., 1987). Unvollständig oxidierte Nebenprodukte wie Acetat, Lactat, Pyruvat,

Ethanol und Isobutyrat werden von E. coli Kulturen, deren Dichte über 40 g Biomasse pro

Liter Medium beträgt, akkumuliert (Landwall & Holme, 1977; Paalme et al., 1990). Dieser

Effekt ist durch die Bildung von Salzen im Medium zu beobachten (Jensen & Carlsen, 1990).

Nach Lee et al. führt insbesondere das Nebenprodukt Acetat zur Inhibition des Wachstums,

infolgedessen wird die Produktion des heterologen Proteins vermindert (Lee, 1996).

CO2-Konzentration: Verminderte Wachstumsrate sowie die Bildung metabolischer

Nebenprodukte können bei CO2-Partialdrücke oberhalb 0,3 atm beobachtet werden (Pan et

al., 1987).

Einleitung 15

Sauerstofftransfer: Da das Wachstum rekombinanter E.coli-Zellen unter aeroben

Bedingungen erfolgt, sollte der Sauerstoff-Partialdruck nicht unter 10 % sinken. Dennoch

wächst das Problem der Sauerstoff-Transferrate bei großen Fermentervolumina aufgrund der

Löslichkeit von Sauerstoff in Wasser, die auf maximal 200 mmol O2 pro Liter limitiert ist

(Riesenberg, 1991).

Substratinhibition: Die Inhibierung des Wachstums wird durch Substratkonzentrationen

oberhalb bestimmter Grenzwerte verursacht. Hefeextrakt oder Pepton, die komplexe

Verbindungen darstellen, sind nur in geringer Konzentration löslich (Riesenberg & Guthke,

1999).

Fermenter-Durchmischung: Bei mangelhafter Durchmischung großer Fermenter sind Zellen,

die sich nahe der Nährstoff-Injektionsstelle befinden, erhöhten Nährstoffkonzentration

ausgesetzt, während an anderen Stellen Nährstoffmangel herrschen kann. Sowohl der Mangel

als auch der Überschuss bewirken eine Verringerung der Zellausbeute (Neubauer et al., 1995)

2 Problemstellung und Zielsetzung Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, sowohl die NAD-abhängige Phenylalanin

Dehydrogenase (PheDH) aus Rhodococcus sp. M4 als auch das malic enzyme aus E.coli K12

zu klonieren. Die Klonierung dieser zwei Enzyme im gleichen Plasmid sollte die Grundlage

für die reduktive Aminierung von ? -Ketosäuren und gleichzeitig die Regeneration des

Coenzyms mittels Ganzzell-Biotransformation ermöglichen. Ein weiteres Ziel war die

Erweiterung des Substratspektrums der PheDH durch Mutagenese.

Der Faktor, der die Effektivität der NADH-Regeneration im Produktionsprozeß herabsetzt, ist

die schwache Aktivität und die mangelnde Stabilität des üblicherweise verwendeten

Regenerationsenzym Formiat-Dehydrogenase (FDH). Die erforderliche Nachdosierung des

Coenzyms während des Prozesses erhöht die Produktionskosten signifikant. Um die

Wirtschaftlichkeit des Verfahren zu erhöhen, wird in dieser Arbeit das malic enzyme aus E.

coli K12 als eine Alternative zur FDH für die Regeneration kloniert und überprüft.

Die Klonierung des zweiten Enzyms – die rec-PheDH - soll eine Grundlage für die

Mutagenese schaffen. Die Erweiterung des Substratspektrum der PheDH, wird mittels

gezielter Mutagenese bzw. Zufallsmutagenese durchgeführt. Die Sequenz der PheDH wird

mit bekannten Aminosäurensequenzen verglichen und die Bindungsstellen sowie die

Einleitung 16

Interaktionen zwischen den Aminosäurenresten im aktiven Zentrum der PheDH zum Substrat

bestimmt. Mit Hilfe der Kristalllisationsdaten der PheDH wird die PheDH modelliert und ein

Proteindesign durchgeführt.

Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war, Einblicke in den Reaktionsmechanismus der

PheDH und Aufschluss über die Struktur–Funktionsbeziehungen dieses Enzyms zu gewinnen.

Hierbei sollte das aktive Zentrum der PheDH mit dem der Lactatdehydrogenase verglichen

und eventuelle Mutagenese durchgeführt werden.

Für die Erweiterung des Substratspektrums werden Mutationen in der PheDH mit Hilfe

verschiedener Methoden eingeführt, um somit die Konstruktion einer neuen Amin-

Dehydrogenase für die Herstellung von aromatischen Aminen aus aromatischen Ketonen zu

erreichen.

Material

17

3 Material Geräte

Analytik-Apparaturen

Gaschromatograph Shimadzu

HBLC-System Gynkotek (Germering)

GC-9A Shimadzu (Düsseldorf)

NMR-ARX500 Bruker

Robocycler Stratagene

Bildverarbeitung

Eagle Eye II, Videosystem Stratagene (Heidelberg)

Fraktionssammler Frac 100 (Pharmacia)

Disintegration

Schwingkugelmühle (Retsch)

Disintegrator S IMA

Ultraschallgerät Branson

Dialyse und Ultrafiltration

Ultrafiltrationskammer 8050, 8010 Amicon

Fermentation

20 L-Bioreaktor Biostat Braun

Contifuge 300 MD Heraeus Christ

Elektrophorese

Gel elektrophorese GNA 100 Pharmacia (Freiburg)

Gelelektrophorese Horizon 11.14 Life Technologies (Eggenstein)

Prep Cell Biorad

Küvetten

Mikroküvetten (50 µl), Quarzglas Hellma (Müllheim/Baden)

Halbmikroküvetten (1 ml), optisches Glas Hellma (Müllheim/Baden)

Fluoreszenzhalbmikroküvetten(1 ml), Quarzglas Hellma (Müllheim/Baden)

Photometer

UV/Vis-Spektralphotometer 16 A Shimadzu (Duisburg)

UV/Vis-Spektralphotometer DU 650 Beckmann (Düsseldorf)

Fluoreszenzphotometer LS 50 B Perkin Elmer (Düsseldorf

Material

18

Zentrifugen

Eppendorf-Zentrifuge 5415 C Eppendorf (Hamburg)

Kühlzentrifuge Sorvall RC-5B Du Pont Instruments

(Bad Homburg)

Vacuumzentrifuge (Univapo 150 H)

+Kühlfalle (Unicryo MC1L)

Chemikalien

Alle nicht aufgeführten Chemikalien für Lösungen und Puffer waren mindestens von

analytischer Qualität (p.a.) und wurden in der Regel von Fluka, Sigma, Roth oder Merck

bezogen.

Nährmedienbestandteile waren von Merck oder Difco, die Coenzyme von Bts.

Enzyme für die Molekularbiologie wurden von NEB, Pharmacia, Biozym, Stratagene oder

Roche bezogen. Die Chemikalien für molekularbiologische Untersuchungen waren von

höchster Qualität. Die genannten Chemikalien wurden in „ultra pure“ Qualität eingesetzt.

Acetonitril Applied biosystems

(Weiterstadt)

EDTA Pharmacia (Freiburg)

Acrylamid Biorad (München)

Bis-Acrylamid Biorad (München)

APS Biorad (München)

Nucleotide/Nucleinsäuren

dATP, dGTP, dTTP, dCTP Pharmacia (Freiburg)

DNA-Molekulargewichtsmarker:

A. DNA-Marker IV [Boehringer]

B. DNA-Marker VI [Boehringer]

C. DNA-Marker VII [Boehringer]

D. DNA-Leiter [Gibco]

Material

19

Enzyme

BamHI, NcoI StuI, EcoRI, HindIII,pStI, NdeI, SmaI Biolabs

RNaseA Roth (Karlsruhe)

Taq-DNA-Polymerase (10 U/µl) Finnzyme

Ligase Roche

Alkalische Phosphatase Promega (Heidelberg)

Mikroorganismen

E. coli BL21 [hsdS gal (? cIts857 ind1Sam7 nin5 lacUV5)]

E. coli DH5? [supE44 ? lacU169 ? 80lacZ? M15) hsdR17 recA1 gyrA96 thi-

1relA1]

E. coli HB101 [supE44 hsdS20 (rB- mB-) recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2

rpsL20xyl-5mtl-1]

E. coli JM105 [subE endA sbcB15 hsdR4 rpsL(strr) thi ? (lac-proAB)

F(traD36proAB+ lacIq lac? ZM15)]

E. coli JM109 [recA1 sup E44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi ? (lac-proAB

F’(traD36proAB+ lacIq lacZ? M15)]

E. coli XL1-Blue [supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 lac- F’[proAB+ lacIq

lacZ? M15 Tn10(tetr)]

Vektoren

pKK223-3 [4,584kb, ColE1-Replicon, Ptac, Ampr]

pTRC99a [4,176 kb, ColE1-Replicon, Ptrc, lacIq, AmpR]

pUC18 [2,686 kb, ColE1-Replicon, lacZ’, lacI, AmpR]

pET-16b [5,711 kb, His.Tag, T7, Amp]

Kits für die Molekularbiolgie

Sure clone Kit Pharmacia

Plasmid Präparation Qiagen

DNA Extraktion Qiagen

Auto Read Sequencing Kit Pharmacia

Rapid DNA Ligation Kit Roche

Methoden

20

4 Methoden 4.1 Molekularbiologie

4.1.1 Isolierung der genomischen DNA

Sowohl die genomische DNA von Rhodococcus sp. M4 für die Isolierung der Phenylalanin

Dehydrogenase als auch die des E. coli K12 für malic enzyme, wurden nach van Soolingen et

al. isoliert (van Soolingen et al., 1991). Dafür wurden Kulturen mit einer einzelnen Kolonie

angeimpft und bei 30°C und 120 rpm bis zu einer optischen Dichte OD600 ca. 0.7 wachsen

gelassen. Die Kultur wurde für 30 min bei 80°C erhitzt und dann abzentrifugiert. Das Pellet wurde in

10 ml TE-Puffer resuspendiert. Nach dem Resuspendieren wurden die Zellen mit 0.5 ml

Lysozym (10 mg/ml) behandelt, und für 30 min bei 37°C inkubiert.

1.5 ml 10 %iges SDS und 120 µl Protease K (10 mg/ml) wurden zugefügt und für 10 min bei

65°C inkubiert. Durch diese Behandlung konnten die Proteine denaturiert und ausgefällt

werden. Um die restlichen Proteine und Lipide zu fällen, wurde die Lösung mit 1 ml 5 M

NaCl und 1.5 ml N-Cetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid/NaCl, (4.1 g NaCl, 10 g N-

cetyl-N,N,N-trimethylammonium Bromid in 100 ml H2O), versetzt. Der ganze Ansatz wurde

gut vermischt und für 20 min bei 65°C inkubiert.

Die DNA wurde durch ein äquivalentes Volumen von CHCl3 / Isoamyl Alkohol (24:1) nach

Zentrifugation extrahiert. Der Vorgang wurde zweimal durchgeführt, um die DNA vollständig

zu isolieren.

Die DNA aus der wässrigen Phase konnte durch 0.6 Vol. Isopropanol bei -20°C für 30 min

gefällt werden. Danach wurde sie abzentrifugiert und das erhaltene DNA-Pellet mit 2 ml

70%igem kalten Ethanol gewaschen.

Da Ethanol spätere Reaktionen inhibieren könnte, wurde die DNA durch Zentrifugation im

Vakuum (vacuum speed univapo) getrocknet.

Zum Nachweis der Reinheit der DNA können zwei Methoden eingesetzt werden:

1. Absorption bei 260 und 280 nm

2. durch Gelelektrophorese ( 0.5 % Agarose)

Methoden

21

4.1.2 Auftrennung von DNA-Fragmenten über Elektrophorese

Die Agarose wurde durch Aufkochen in der gewünschten Konzentration (0,8-1.2 %) in

1xTBE-Puffer gelöst und nach dem Abkühlen auf ca. 60°C mit 1/20000 Volumen an

Ethidiumbromid (10 mg/ml) versetzt und in horizontale Kammern gegossen. Die Proben

wurden vor dem Auftragen mit 1/6 Volumen Probenpuffer gemischt. Die Elektrophorese

erfolgte in einer mit 1xTBE-Puffer gefüllten Kammer. Die Ethidiumbromidfluoreszenz wurde

im UV-Durchlicht (312 nm) mit dem Videosystem „Eagle Eye II“ (Stratagene) aufgezeichnet.

6X Probenpuffer: 30 % Glycerin, 0,25 % Bromphenolblau

TBE-Puffer: 90 mM Tris-HCL, 90 mM Borsäure, 2 mM EDTA, pH8,2

Als Größenstandard für die DNA- Gelelektrophorese wurde die kB-Leiter der Fa. Gibco

benutzt.

10X TBE-Puffer:

Tris 121.12 g

Borsäure 51.32 g

EDTA 3.72 g

Probenvorbereitung:

Die zu trennende DNA-Lösung wurde mit einfach DNA-Probenpuffer [Endkonzentration] pH

8.0 versetzt.

DNA-Probenpuffer [6fach]:

6xTBE; 50 % (v/v) Glycerin; 0.25 % (w/v) Bromphenolblau

4.1.3 Ethanolfällung

Zur Konzentrierung und Reinigung von DNA-Lösungen wurden diese mit 2 Vol. Ethanol und

1/10 Vol. 3 M Natriumacetat, pH 4.8 versetzt, 30 min. bei –20°C inkubiert und 20 min. bei

4°C und 13000 rpm abzentrifugiert. Die sedimentierte DNA wurde zweimal mit 70 % Ethanol

(v/v) gewaschen, in einer Vakuumzentrifuge getrocknet und in Aq. bidest oder TE-Puffer,

pH8.0 (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA) resuspendiert.

Methoden

22

4.1.4 Polymerase Ketten Reaktion [PCR]

Die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) bietet die Möglichkeit, gezielt spezifische DNA-

Fragmente zu amplifizieren. Durch entsprechende Geräte [Robocycler, Stratagene] ist die

Reaktion komplett automatisiert. Durch Zugabe von genomischer DNA oder Plasmiden

zusammen mit für ein DNA-Stück spezifischen Primern wird dieses DNA-Stück durch die

Taq-Polymerase [Thermus aquaticus] amplifiziert. Da die Taq-Polymerase die hohen

Denaturierungstemperaturen von 94°C übersteht und diese Temperatur für die Aufspaltung

der doppelsträngigen DNA benötigt wird, ist es möglich, über viele Zyklen eine

Amplifikation zu erreichen. Innerhalb jedes Zyklus erhöht sich exponentiell die Zahl des

Template, da jedes neu gebildete Template Ausgangsmaterial für das nächste wird. Ein

Zyklus besteht aus einem Denaturierungsschritt [94°C], einem Annealingschritt, in dem die

Primer an das Template binden [Temperaturvariabel] und einem Amplifizierungsschritt

[72°C], bei dem die Polymerase aktiv ist.

Der Reaktionsansatz aus:

10 mM Tris pH 8.3

50 mM KCl

1.5 mM MgCl2

jeweils 200 µM dATP, dCTP, dTTP, dGTP

20-40 pmol jedes Oligonucleotid-Primers

2.5 U Taq-Polymerase pro 100 µl Ansatz

10 ng Plasmid-DNA als PCR-Template

Die PCR Amplifikation wurde auf einem automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler,

Fa. Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt.

??5 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms 1x)

??1.2 min Annealingsschritt, in dem die Primer an das Template binden

??1.5 min Extension (Verlängerung der Primer durch die Taq-Polymerase) bei 72°C

[Temperaturvariabel].

??1 min Denaturierung bei 95°C

??Zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25-30x)

??5 min Extension (nach Abschluß der PCR, um eine vollständige Verlängerung

eventuell vorher abgebrochener DNA-Produkte zu gewährleisten)

Methoden

23

4.1.5 Berechnen der Schmelztemperatur der Primer

Die Schmelztemperatur Tm der Primer wurde nach Thein und Wallace (Thein & Wallace,

1988) abgeschätzt:

Schmelztemperatur Tm[°C] = 2x(Basenzahl A+T)+3x(Basenzahl G+C)

Diese Bezeichnung gilt für Primerlängen ? 24 bp.

Für Primerlängen ? 14 bp gilt [MWG-Biotech]:

Schmelztemperatur Tm [°C] = 69.3°C + 0.41 x (GC-Gehalt [%]) – 650 / Primerlänge

Annealingtemperatur Ta [°C] = Tm + 3°C

4.1.6 Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen

Die aus dem Gel ausgeschnittenen DNA-Banden können auch über spezielle Membransäulen

aus dem Gel eluiert werden. Das dreifache Volumen des Gelstückgewichts an Puffer QX1

[keine Herstellangaben] wird hinzugegeben, und die Probe unter einmaligem Schütteln 10min

bei 50°C inkubiert. Die Lösung wird auf eine Qiaquick-Zentrifugationssäule gegeben und

60sec bei 13000 rpm zentrifugiert. Das Filtrat wird verworfen und die Säule durch erneute

Zentrifugation mit 0.75 ml Puffer PE gewaschen und durch nochmalige Zentrifugation Reste

des Puffers von der Membran der Säule entfernt. Abweichend von den Herstellerangaben

wurde jedoch zur Elution 50 µl H2O (pH 8.0) verwendet. Die eluierte DNA wurde über

Einengen in der Vakuumzentrifuge auf die gewünschte Konzentration gebracht und

weiterverarbeitet. Eine zweite Methode zur Isolierung der DNA- Fragmente erfolgte ebenso

nach einem Qiagen Kit, mit dem man die komplette PCR-Lösung mit fünffachem Puffer PB

[keine Herstellungsangaben] verdünnt und in eine Qiaquick Säule pipettiert. Die Säule wird

zusammen mit einem Auffanggefäß 60 sec bei 13000 rpm zentrifugiert. Die DNA kann nun

mit 0.75 ml PE-Puffer [Ethanol] gewaschen. Dabei werden durch nochmalige Zentrifugation

(60 sec., 13000 rpm) sämtliche Reste des PE entfernt. Anschließend wird die DNA mit 50µl

1mM Tris bzw. H2O pH 8.0 [1min, 13000 rpm] von der Säule eluiert und über

Vakuumzentrifugation auf das gewünschte Volumen zur Weiterverarbeitung eingeengt.

Methoden

24

4.1.7 Dephosphorylierung linearisierter Plasmid-DNA

Linearisierte Plasmide, deren Religationsrate aufgrund des Vorliegens komplementärer Enden

besonders groß war, wurden unter Verwendung Alkalischer Phosphatase an ihren 5’-Termini

dephosphoryliert. Dazu wurden 40µl des Restriktionsansatzes mit 1U alkalischer Phosphatase

aus Shrimps (Shrimp Alkaline Phosphotase, SAP, Boehringer Mannheim) versetzt, mit dem

zugehörigen, Zn2+-haltigen Reaktionspuffer und Aq. bidest. auf ein Endvolumen von 50µl

gebracht und 30 min. bei 37°C inkubiert. Eine weitere Unit des Enzyms wurde nach Ablauf

dieser Periode zugefügt und die Inkubation um zusätzliche 30 min. verlängert. Das Enzym

wurde mit einem Vol. Phenol-Isoamylalkohol-Chloroform (25:24:1; v/v/v) aus dem Ansatz

extrahiert und die dephosphorylierte Vektor-DNA durch Ethanolfällung gereinigt.

4.1.8 Ligation

Die Ligation der geschnittenen und isolierten Gene erfolgte sowohl mit Hilfe der T4-DNA-

Ligase der Firma Roche als auch mit dem „sure clone kit“ der Fa. Pharmacia. Je nach

Schnittenden wurde für Ligationen mit überhängenden Enden (sticky-ends) ein molares

Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:3 bzw. glatten Enden (blunt-end) von 1:5 gewählt.

Nach vorschriftmäßiger Reaktion mit Klenowenzym und Phosphonucleotidkinase (zur

Auffüllung und Phosphorylierung der PCR-Enden) wurden die Fragmente von den Proteinen

mittels Agarosegel aufgereinigt.

Genfragment 1-16 µl [50-200 ng]

Klenow-Fragment 1 µl

10 x Puffer 2 µl

Polynucleotidkinase 1 µl

Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert, dann ein äquivalentes Volumen an Phenol-

Chloroform zugegeben, intensiv vermischt [Vortex] und zur Phasentrennung bei 13000 rpm

2min abzentrifugiert. Die obere Phase wurde abgenommen und auf ein Agarosegel auf-

getragen. Das Genfragment wurde aus dem Gel isoliert. Anschließend wurde eine Ligation

der glatten Enden durchgeführt.

Ligation nach „sure clone kit Pharmacia“

Genfragment 50-200 ng

pUC18 Vektor 50 ng

2 x Ligationspuffer 10 ng

DTT 1 µl

Methoden

25

T4-Ligase 1 µl

H2O ad 20 µl

Das Reaktionsgemisch wurde für 4 h bei 16°C inkubiert und dann kompetente E.coli Zellen

[verschiedene Stämme] mit dem ligierten Plasmid transformiert.

Ligation nach “rapid ligation kit Roche”

Genfragment 6 µl (200 ng)

Plasmid (geschnitten) 2 µl (50 ng)

Dilution Puffer (keine Herstellerangaben) 2 µl

Ligation Puffer (keine Herstellerangaben) 10 µl

T4-Ligase 1 µl

Das Reaktionsgemisch wurde für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann kompetente

E. coli Zellen [verschiedene Stämme] mit dem ligierten Plasmid transformiert.

4.1.9 Herstellung kompetenter Bakterienzellen

Die Herstellung kompetenter E. coli XL1 Blue und JM 105 sowie HB101 erfolgte nach der

Methode von Hanahan (Hanahan, 1983). Die Lagerung erfolgte bei –80°C.

Aus dem konservierten E. coli Stamm, wurden 5 ml LB-Medium 5 % angeimpt und über

Nacht wachsen gelassen. 200 µl davon werden in 300 ml LB-Medium überimpft, das dann bis

zu einer OD550 0.5 bei 37°C inkubiert wird. Die Kultur wird dann in eine SS34-

Zentrifugenbecher überführt, 15 min auf Eis gekühlt und dann bei 4°C abzentrifugiert. ( 5000

rpm, 10 min. ).

Die Zellen werden mit einer Lösung von 100 mM RbCl, 50 mM MnCl2, 30 mM Kalium-

Acetat pH 5.8, 10 mM CaCl2, 15 % (v/v) Glycerin resuspendiert und erneut für 1h auf Eis

gestellt. Anschließend werden die Zellen nochmals abzentrifugiert und in einer Lösung von

10 mM MOPS pH 7.0, 10 mM RbCl, 15 mM CaCl2, 15 % (v/v) Glycerin aufgenommen und

15 min auf Eis inkubiert. Diese Zellsuspension wird dann in Aliquots von 100 µl schock-

gefroren (flüssiger Stickstoff) und bei -80°C aufbewahrt.

Methoden

26

4.1.10 Transformation

Die Standardtransformation wurde nach dem Protokoll von Hanahan (Hanahan, 1983)

durchgeführt. Hierzu wurden 100-200 µl kompetenter E. coli –Zellen auf Eis aufgetaut und 40

ng DNA aus dem Ligationsansatz zugegeben. Die Plasmidzellsuspension wurde 30 min auf

Eis gekühlt und anschließend für 90 sec auf 42°C erwärmt und sofort wieder auf Eis gekühlt.

Nach Zugabe von 300 µl LB - Medium wurden die Zellen zur Regeneration etwa 45 min bei

37°C inkubiert. Anschließend wurden 200 µl dieser Kultur auf einer Antibiotikahaltigen LB-

Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

4.1.11 Schnellisolierung von Plasmid-DNA aus E.coli (modifiziert nach

Birnboim und Doly)

Für die Schnellisolierung von Plasmiden werden die Zellen einem osomotischen Schock

ausgesetzt und die Proteine danach ausgefällt, wobei die Zellen mit osmotischen Lösungen

behandelt werden, die zum Platzen der Zellen führen (Birnboim & Doly, 1979).

1.5ml einer Übernachtkultur werden abzentrifugiert und mit 100µl Lsg. A + 100 µg/ml RNase

sowie 200 µl Lsg. B versetzt (für 5 ml ÜN-Kultur werden alle Mengen bis zur Isopropanol-

Fällung vervierfacht).

Der Ansatz wird dann 5 min auf Eis gelegt, gefolgt von 150 µl Lsg. C. Nach der Zugabe von

Lsg. C wird der Ansatz wieder auf Eis für 15 min inkubiert und anschließend für 10 min bei

13000 rpm abzentrifugiert.

Der Überstand (400µl) wird mit 260µl Isopropanol versetzt und bei -20°C für 30min absetzen

gelassen. Danach wird der Ansatz für 5 min bei 13000 rpm abzentrifugiert und 2x mit

70%igem kaltem Ethanol gewaschen. Über der Speedvacuumzentrifuge werden die Plasmide

getrocknet und in 50 µl TE-Puffer resuspendiert und bei -20°C aufbewahrt.

Lsg. A: 50 mM Glucose

10 mM EDTA

2.5 mM Tris pH 8.0

Lsg. B: 0.2 M NaOH

1 % SDS

Lsg. C: 3 M NaAC pH 8.0 (mit HCl titriert)

Methoden

27

4.1.12 Plasmidisolierung [Biorad]

Für die saubere Plasmidreinigung wurde das Quantum Prep? (Plasmid Miniprep kit [Biorad])

verwendet. Die bindende Matrix ist ein Silicon dioxid exoskeleton aus Diatome.

Für die Reinigung der Plasmide wurden 2 ml transformierte Zellen bei 13000 rpm für 30 sec.

abzentrifugiert und den Überstand entfernt. Dazu wurden 200µl Cell-Resuspension zu-

pipettiert und gut resuspendiert (Vortex).

Auf die Zellsuspension wurden 250 µl Cell-Lysis-Solution zugegeben und gut vermischt.

Nach der Behandlung mit der Lyse-Lösung wurden 250 µl „Neutralization Solution“

zugegeben und vorsichtig vermischt (nicht vortexen).

Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (5 min bei 13000 rpm).

Die wäßrige Phase wurde entfernt und mit 200 µl Matrix-Suspension vermischt. Die Lösung

wurde dann in einen Spin-Filter angebracht und bei 13000 rpm für 5’ abzentrifugiert.

Der Bodensatz wurde entfernt und der Ansatz (im Spin-Filter) wurde mit 500µl „Wash-

Solution“ durch Zentrifugation gewaschen. Der Waschvorgang wurde 2x wiederholt.

Der Bodensatz wurde wieder entfernt und die Plasmid-DNA mit 56°C heißem deionisiertem

H2O durch Zentrifugation für 30 sek. eluiert.

Die Plasmid-DNA wurde bei -20°C aufbewahrt.

4.1.13 Plasmidisolierung [Qiagen]

Um die Plasmide aus den Bakterienzellen zu isolieren, wurde der Plasmid-Präparations-Kit

der Fa. Qiagen verwendet. Dieser beruht auf dem Prinzip der alkalischen Lyse in Verbindung

mit einer Anionenaustauschchromatographie. Zur Vermeidung der Kopräzipitation störender

Salze wurde die anschließende Isopropanol- Fällung bei Raumtemperatur durchgeführt und

auch das 2 malige Ethanolwaschen (70 %) erfolgte bei Raumtemperatur. Nach der Trocknung

in der Speed-Vac wurde das erhaltene Pellet in 10 µl 1 mM Tris, pH 8.0 aufgenommen. Die

genaue Konzentration wurde mittels Restriktion eines 1µl Aliquots gelelektrophoretisch

bestimmt.

Methoden

28

4.1.14 Restriktion

Analytische Restriktionen erfolgten in einem Volumen von 30 µl, präparative in einem

Volumen von 50µl. Die für die einzelnen Restriktionsenzyme nötigen Puffer-Konzentrationen

folgten den Herstellerempfehlungen. Die DNA-Menge für den präparativen Verdau lag in

einem Bereich von 3-4 µg/Ansatz. Die Vektoren wurden noch zusätzlich 1h mit 5 Units

alkalischer Phosphatase bei 37°C inkubiert, um die 5’-Phosphatgruppe zu entfernen und so

die Religation des Vektors zu verhindern.

4.1.15 Sequenzierung

Die DNA- Sequenzierung erfolgte per Auftrag durch die Firma SequiServe, Vaterstetten, oder

mittels eines Automated Laser Fluoreszenz- (A.L.F.) Sequenzierautomaten (Fa. Phasrmacia )

in einem 6 %igen Polyacrylamidgel. Die Sequenzreaktion nach Sanger et al. (Sanger et al.,

1977) mittels T7- DNA-Polymerase wurde gemäß Herstellerangaben durchgeführt [AutoRead TM Sequencing Kit, Fa. Pharmacia]. Pro Sequenzierung wurden 7 µg hochreine Plasmid-DNA

benötigt. Sie erfolgten mit den im Kit enthaltenen vektorspezifischen Primern (pUC universal

und reversal). Die Daten der Sequenz wurden mit dem Programm DNAsis ausgewertet.

4.1.16 Gezielte Mutagenese

Die gezielte Mutagenese erfolgte nach dem Prinzip der überlappenden PCR (Ho et al., 1989).

Hierbei werden Primer verwendet, die zwei DNA- Fragmente mit überlappenden Enden

erzeugen. In einer zweiten PCR hybridisieren diese Fragmente. Das überlappende 3’-Ende

jeden Stranges dient als Primer für die Synthese des Gegenstranges. Werden nun in die

Oligonucleotiden Mutationen eingeführt, finden sich diese auch 100 % im Produkt wieder.

In einer zweiten PCR hybridisieren diese Fragmente, das überlappende 3’-Ende jeden

Stranges dient als Primer für die Synthese des Gegenstranges.

Das resultierende Fusionsprodukt wurde durch weitere PCR mit den „äußeren“ Primern, die

den gesamten Bereich einschließen, amplifiziert.

Vorteil dieser Methode ist, dass weder auf das Vorhandensein einer Restriktionsschnittstelle

geachtet werden muss, noch das gesamte Plasmid amplifiziert wird. Das Prinzip der PCR-

Mutagenese ist in Abbildung 7 dargestellt.

Methoden

29

5'

5'

5'Templat-DNA

*

* 5'P1'

K66

P1P2

P2'

2.Produkt

1.Produkt ** 5'

5'PCR mit den PrimernP2+P2'

PCR mit denPrimern P1+P1'

PCR mit denPrimern P1+P2'und Produkt 1+2als Templat

* 5'

5'

Abbildung 7: Prinzip der gezielten Mutagenese mittels überlappender Fragmente.

4.1.17 Zufallsmutagenese

Für die Herstellung verbesserter Enzymvarianten existieren zwei Strategien:

1. Asexuelle Evolution (Kuchner & Arnold, 1997), dabei wird durch zufällige

Mutagenese, die möglichst auf das für das gewünschte Protein codierende

Ausgangsgen beschränkt wird, eine Enzymbibliothek hergestellt und anschließend auf

verbesserte Eigenschaften durchmustert. Die in der ersten Generation gefundenen

besten Enzyme können in folgenden Mutationsrunden optimiert werden. Dies setzt

jedoch eine weitere Verbesserung der Varianten der ersten Generation durch

Einführung neuer und Deletion sich als negativ erweisender Mutationen voraus.

2. Die sexuelle Evolution hingegen geht von einem Pool homologer Ausgangsgene aus.

Diese können aus einer asexuellen Evolution hervorgegangen oder nah verwandten

natürlichen Sequenzen sowie Enzymvarianten abgeleitet sein, die durch rationales

Design hergestellt wurden. Das Prinzip dieses DNA shuffling oder gene shuffling

(Stemmer, 1994) basiert auf einem partiellen DNAseI-Verdau und einer

nachfolgenden Rekombination der Bruchstücke durch eine Polymerasekettenreaktion

Methoden

30

(PCR). Nachteilig sind die nicht immer gegebenen Verfügbarkeiten homologer Gene,

die Kontrolle des DNAse-Verdaus zur Herstellung von Bruchstücken optimaler Größe

und Probleme mit der Ligationseffizienz bei der PCR (Bornscheuer et al., 1998).

Die wohl wichtigste Methode zur asexuellen Evolution ist die Fehlerhafte Polymerase-

kettenreaktion (error-prone PCR) (Rice et al., 1992).

Durch Einstellung nicht-optimaler Reaktionsbedingungen in der PCR kann die Fehler-

häufigkeit der Polymerase gesteigert werden

??Die Einflußgrößen in der „error prone PCR“ sind:

??Fehlerrate der Taq- Polymerase

??Konzentration der Taq-Polymerase

??molare Verhältnisse der Desoxynukleotide

??Konzentration der Ziel- DNA (Template)

??PCR- Zyklenzahl

??c [MgCl2]

??c [MnCl2]

Methoden

31

Die Vorgehensweise der asexuellen Evolution ist in

beschrieben.

Abbildung 8: Vorgehensweise der Zufallsmutagenese

4.1.18 Sättigungsmutagenese

Der ausgewählte Aminosäurerest wird gegen mögliche andere Aminosäuren ausgetauscht,

dafür werden die Mutageneseprimer so synthetisiert, dass theoretisch alle Triplettkombination

möglich sind (Derbyshire et al., 1986).

PCR-Protokoll:

10 mM Tris pH 8.3

50 mM KCl

1.5 mM MgCl2


Erzeugen von Diversität durch Zufallsmutagenese

Zielgen

Screnning der „random library“

Gene selektierter Klone

Neue Varianten durch in vitro Rekombination

Screening der „library

Gene selektierter

Klone

Methoden

32

20-40 pmol jedes Mutagenese-Primers

2.5 U Polymerase-pfu – Stratagene pro 100 µl Ansatz

20 ng Plasmid-DNA als PCR-Template

Die PCR-Amplifikation wurde auf einen automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler,

Fa Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt.

??3 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms 1x)

??1 min Annealingsschritt, in dem die Primer an das Template binden.

??Extension bei 72°C (Zeit hängt von der Größe des Plasmids ab. 1 min/ kb)


??Zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25x)

??6 min Extension (nach Abschluß der PCR)

4.2 Biochemische Methoden

4.2.1 Zellaufschluß und Rohextraktgewinnung

Da das Protein in kleinen Mengen für den qualitativen Nachweis gebraucht wurde, wurden

die Zellen durch eine Schwingkugelmühle aufgeschlossen [Retsch]. Dafür wurde ein

Verhältnis von Zellen zum Aufschlußpuffer [ 0.1 M Kpi pH 7.0, 1 mM MgCl2 , 10 Tropfen

Ucolup/L) von 1:3 eingesetzt, und 1,2g Glasperlen (0.3 ? ) pro 600 µl dieser Lösung zu-

gegeben.

Die Eppendorfgefäße wurden in die Schwingkugelmühlenzylinder gestellt und dann die

Zellen in der Schwingkugelmühle für 10 min. disintegriert. Anschließend wurden die Proben

5 min. auf Eis abgekühlt und danach 3 min. bei 13000 rpm abzentrifugiert.

Der Überstand wurde abpipettiert. Der Aufschluß wurde ein zweites Mal wiederholt, indem

die Aufschlußpuffer auf die Eppendorfgefäße verteilt und die restlichen, nicht

aufgeschlossenen Zellen durch die Schwingkugelmühle disintegriert worden sind.

Um die große Zahl an Mutanten schnell und effektiv zu überprüfen, wurden die Kolonien in

kleinem Maßstab (1,2 ml) angezüchtet und mit der unten geschilderten Methode

aufgeschlossen.

Die Transformanten der Zufallsmutagenese wurden einzeln mit Zahnstochern abgepickt und

in 150 µl LB-amp angeimpft. Das Wachstum der Vorkultur erfolgte über Nacht. 50 µl aus

dieser Vorkultur wurden in 1,2 ml LB-amp als Hauptkultur angeimpft und nach einem

Methoden

33

Wachstum von etwa 5 h (OD600 0,7) wurden die Kulturen mit 1 mM IPTG induziert, um die

Expression zu starten.

Die Zellen werden nach dem folgenden Protokoll geerntet:

??1,2 ml Kultur abzentrifugieren

??600 µl Überstand wegwerfen und den Rest resuspendieren

??50 µl Lysis-Puffer dazu und noch mal resuspendieren

??30-45’ bei 37°C schütteln

??Aus dem Ansatz der lysierten Zellen werden 50µl zur photometrischen

Messung benötigt

Lysis-Puffer:

0,2 % Triton X-100 10 ml

20 mM EDTA 40 ml

200 mM Kpi-Puffer 50 ml pH 7.0

4.2.2 Aktivitätstest für die Phenylalanin Dehydrogenase

Die Bestimmung der enzymatischen rekombinanten PheDH erfolgte mittels photometrischer

Tests anhand der Extinktionsabnahme bei 340 nm. Dies basiert auf dem Verbrauch von

NADH im Zuge der Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat (Hummel et al., 1987)

Phenylpyruvat + NADH + NH4+ L-Phe + NAD+ + H2O

Die Extinktsionsabnahme bei 340nm wurde über 1min verfolgt. Die Berechnung der Aktivität

als U/ml (U entsprecht 1 µmol Substratumsatz/min) erfolgte über das Lambert-Beersche

Gesetz. Der Aktivitätstest wurde bei 30°C und bei pH 8.5 durchgeführt

Der Testansatz setzte sich wie folgt zusammen:

Tris/HCl 0.1 M

(NH4)2SO4 0,15 M

Phenylpyruvat 3 mM

NADH 0.3 mM

Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µl Enzym gestartet.

Methoden

34

4.2.3 Screening und Aktivitätstest in Titerplatten

Die Aktivitätbestimmung der hergestellten Muteine in Bezug auf Phenylaceton bzw

Phenylpyruvat wurde photometrisch in Titerplatten durchgeführt.

Dafür wurden Mutanten durch eine schnelle Methode isoliert (4.2.1) und auf Aktivität

überprüft.

Vorkultur im 150µl-Maßstab

Hauptkultur und Expression im 1 ml- Maßstab

Zellernte und Permeabilisierung

Bestimmung der Aktivität

Selektion aktiver Mutanten

Abbildung 9: Schema zum Screeningsvorgang

Reaktionsansatz:

120 µl Substratansatz

50 µl Rohextrakt

Messung bei 340 nm

Substratansatz:

100 mM (NH4)2SO4

100 mM (Tris-Puffer) pH-Wert 8.5

3 mM Phenylpyruvat bzw. Phenylaceton

0,3 mM NADH

Für die Reaktion wurden 120 µl davon verwendet und mit 50 µl Rohextrakt gestartet.

Methoden

35

4.2.4 Aktivitätstest für das NAD-abhängige malic enzyme

HEPES pH 7.5 0.1 M

L-Malat 2 mM

NAD+ 0.5 mM

Enzym (Rohextrakt) 10 µl

4.2.5 Gekoppelte enzymatische Synthese

Das Reaktionsmedium für die kontinuierliche Produktion des L-Phenylalanin wurde

folgendermaßen zusamenpipettiert:

0,1 M (NH4)2SO4

0,1 M Hepes (pH 8.0)

30 mM Phenylpyruvat

60 mM Malat

2 mM MgCl2

1,5 g/l BSA

2 mM NAD+

Das gesamte Volumen des Reaktionsmediums beträgt 10 ml und wurde mit 50 U PheDH und

70 U malic enzyme gestartet. Die L-Phenylalaninkonzentration wurde zu unterschiedlichen

Reaktionszeiten mittels HPLC bestimmt.

4.2.6 Bestimmung des L-Phenylalanin mittels HPLC

Die Derivatisierung der Proben für die HPLC-Analytik wurde wie folgt durchgeführt:

OPA-Derivatisierungsansatz: 140 µl Na-Borat-Puffer + 40 µl Probe bzw. Standard + 20 µl

OPA/IBLC-Reagenz. Die Mischung wurde sofort kräftig gerührt.

OPA/IBLC oder IBDC: 260 mM IBLC oder IBDC + 170 mM OPA werden in Na-Borat-

Puffer ( 0,1 M, pH 10,5) gelöst.

Na-Borat-Puffer: 0,1 M Na2B4O7 ·10 H20 in Wasser gelöst und mit NaOH auf pH 10,5

eingestellt.

Methoden

36

4.2.7 Bestimmung der Acetatkonzentration

Die Bestimmung der Acetatkonzentration in Fermenterlösungen erfolgte über HPLC auf einer

Aminex HPX 87 H Säule (Biorad) mit einem Fluß von 0,5 ml/min unter Verwendung von

0,2N Schwefelsäure als Laufmittel. Das Injektionsvolumen betrug 100 µl und die Temperatur

40°C, die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 215nm. Die absoluten Acetat-

konzentrationen der Proben, aus denen die Biomasse durch Zentrifugation abgetrennt worden

war, wurden anhand einer Eichung mittels Acetatlösung ermittelt.

4.2.8 Ganzzell Biotransformation

In 200 ml Reaktionsansatz wurden 1 g rekombinante Zellen für die Produktion von L-Phenyl-

alanin verwendet.

Reaktionsansatz für L-Phenylalanin-Synthese:

0,1 M (NH4)2SO4

0,1 M HEPES-Puffer pH8.5

0,1 M Malat

2 mM MgCl2

2 mM NAD+

40 mM Phenylpyruvat

Die Synthese erfolgte bei 30°C unter langsamen Rühren. Für kleinere Ansätze wurden die

Zellmengen entsprechend abgewogen.

4.2.9 Proteinaufreinigung

Das durch den Aufschluß erhaltene Rohextrakt wurde auf eine DEAE-Sepharose-FF Säule

(Volumen 7.1 ml, Fluß 1 ml/min.) aufgetragen. Die Säule wurde vorher mit 5 fachem Säulen-

volumen eines 0.1 M Kpi-Puffers (8.94 g K2HPO4 + 0.21 g KH2PO4) gespült. Anschließend

wurde die Konzentration von NaCl über einen linearen Gradienten bis auf 100 % zum

Eluieren erhöht.

Dadurch wurden die Proteine aufgrund ihrer unterschiedlichen anionischen Bindungsstärke

bei verschiedenen Natriumchloridkonzentrationen eluiert und in Fraktionen aufgefangen. Die

Fraktionen wurden anhand des Aktivitätstests auf PheDH-Aktivität überprüft. Diejenigen mit

der höchsten Aktivität wurden vereinigt, und für weitere Untersuchungen aufbewahrt.

Methoden

37

4.2.10 Proteinbestimmung nach Bradford

Der Proteingehalt wurde photometrisch nach Bradford (Bradford, 1976) bestimmt.

Diese Methode beruht auf der Farbverschiebung des Farbstoffes im Gegenwart von Proteinen.

Es bildet sich ein blau gefärbter Komplex, der bei 595 nm detektiert werden kann.

Die Proteinbestimmung nach Bradford ist sehr empfindlich und für geringe Proteinmengen

geeignet. Das in der Reaktion eingesetzte Bradfordreagenz wurde selbst hergestellt:

100 mg Coomassie Brillant Blue G-250 wurden mit 50 ml Ethanol versetzt und über Nacht

gerührt. Danach erfolgte die Zugabe von 100 ml 85 %iger Phosphorsäure, und anschließend

wurde die Lösung auf 1 L mit Wasser aufgefüllt. Die fertige Lösung wurde einige Zeit

gerührt, anschließend filtriert und unter Lichtabschluß aufbewahrt.

Testansatz:

900 µl Bradfordreagenz

100 µl Proteinlösung

Die Proben wurden 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 595 nm

gemessen.

4.2.11 Entsalzen von Proteinlösungen

Die Entsalzung von Proteinen erfolgte entweder über Gelfiltration oder Ultrafiltration. Hierbei

wurden 2.5 ml der Proteinlösung auf eine vorher mit dem gewünschten Puffer äquilibrierte

PD10 Sephadex G 25 Säule [Pharmacia] aufgetragen. Die Proteine wurden anschließend

durch Elution der PD10 mit 3.5 ml des gewünschten Puffers wiedergewonnen und damit

umgepuffert.

4.2.12 Konzentrierung von Proteinlösungen

Die Enzympräparate wurden, je nach Bedarf, mittels Ultrafiltration aufkonzentriert. Es

wurden entweder YM20-Membranen in Rührzellen [Fa. Amicon] oder Zentrifugations-

röhrchen [Fa. Centricon] verwendet.

Methoden

38

4.2.13 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gehört zu den in der biochemischen Analytik

meistverwendeten Elektrophoresemethoden. Sie verwendet als Träger polymerisiertes und

quervernetztes Acrylamid, dessen Porengröße in einem weiten Bereich variierbar ist.

Diese Methode liefert scharf getrennte Banden und dient bei entsprechender Eichung zur

Bestimmung der molaren Masse bzw. des stoke’schen Radius von nichtglobulären

Makromolekülen.

Die Geldichte, auch Gelkonzentration genannt, wird durch die Größen T und C bestimmt. T

ist gleich dem Prozentanteil an Acrylamid und Methylen-bis-Acrylamid am Gesamtvolumen,

C ist der prozentuale Anteil von N,N,-Methylen-bis-acrylamid (dem quervernetzenden

Agens). Die Gele wurden nach Laemmli (Laemmli, 1970) gegossen.

Verwendete Stammlösungen:

Trennpuffer 1.5 M Tris/HCl pH 8.8

Sammelgelpuffer 0.5 M Tris/HCl pH 6.8

SDS 10 % (w/v)

Glycerin 85 % (w/v)

APS 10 % (w/v)

Sammelgelzusammensetzung:

Sammelgelpuffer 0.125 M

Acrylamid 5 %

SDS 0.10 % (w/v)

APS 0.02 % (w/v)

TEMED 0.25 % (w/v)

Elektrophoresepuffer pH 8.0

Tris 0.025 M

Glycerin 0.192 M

SDS 0.1 % (w/v)

Methoden

39

Probenpuffer:

Glycerin 10 % (v/v)

SDS 2 % (w/v)

Tris/HCl pH 6.8 0.063 M

Bromphenolblau 0.1 % (w/v)

? -Mercaptoethanol 10 % (v/v)

Um eine Denaturierung zu erreichen, wurden die Proben mit 20 µl Probenpuffer versetzt und

4 min bei 95°C aufgekocht. Anschließend wurden die Proben auf Eis abgekühlt.

4.2.14 Färbung

Silberfärbung von Proteinen (Blum et al., 1987):

Das Gel wurde in eine Fixierlösung überführt und unter ständigem Schütteln (3x30 min.)

fixiert. Nach der Fixierung wurde das Gel 10 min mit 20 % (v/v) Ethanol inkubiert und direkt

10 min mit Millipore Wasser gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Gel silbergefärbt.

Um das Gel zu färben und sichtbar zu machen, wurde es für 1min in der Sensitivierungs-

lösung (0.02 % (w/v) Natriumthiosulfat x H2O) geschüttelt, dann kurz mit Wasser gespült und

anschließend 20-30 min in der Färbelösung [2 % (v/v) AgNO3 , 750 µl/L (v/v) 37 % HCHO]

inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurde das Gel wieder kurz mit Wasser gespült und dann

entwickelt [6 %(w/v) Na2CO3, 500 µl/l (v/v) 37 % HCHO, 0.0005 % (w/v) Natriumsulfat x

H2O].

Die Fixierreaktion wurde abgestoppt, sobald die Banden sichtbar waren.

Fixierlösung

40 %(v/v) Ethanol, vergällt (Methylethylketon)

10 %(v/v) Essigsäure konz.

Coomassie Färbung:

Färbelösung 0.1 % Coomassie blue R-250 (w/v)

40 % Ethanol, vergällt [Methylethylketon] (v/v)

10 % Essigsäure (v/v)

Entfärber 40 % Ethanol, vergällt [Methylethylketon] (v/v)

10 % Essigsäure (v/v)

Methoden

40

Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel für 20 min in der Färbelösung inkubiert und

anschließend die Banden mit Hilfe des Entfärbers [mehrmals wechseln] unter Schütteln

sichtbar gemacht. Um einen klaren Hintergrund zu erzielen, konnte das Gel nach Einsatz des

Entfärbers über Nacht in 0.5 M NaCl oder Wasser inkubiert werden.

4.3 Mikrobiologische Methoden

4.3.1 Verwendete Organismen

In der vorliegenden Arbeit wurde mit dem Stamm Rhodococcus sp. M4, sowie mit E.coli

XL1-blue, E.coli k12, HB101, JM105, SG13009, UT5600 und BL21 gearbeitet.

4.3.2 Anzuchtbedingungen und Medien

Rhodococcus sp. M4

Für den Rhodococcus sp. M4 wurde das M4-Medium (Hummel et al., 1987) nach folgender

Zusammensetzung verwendet:

KH2PO4 4 g

L-Phenylalanin 10 g

Hefeextrakt 1 g

HVK 2 ml

Thiamin/HCl (nach dem Autoklavieren) 200 µg add 1L H2O

Der pH-Wert des Mediums wurde auf 7.5 mit NaOH eingestellt.

Als Vorkultur wurden 200ml dieses Mediums mit einer einzelnen Kolonie des Rhodococcus

sp. M4 angeimpft. Die Zellen wurden für 48h bis zur stationären Phase unter aeroben Beding-

ungen (Kolben mit Schikanen) bei 120 rpm und 30°C kultiviert.

Davon wurde die Hauptkultur 5 %ig angeimpft und unter gleichen Bedingungen kultiviert.

E. coli

Für den E. coli wurde das LB-Medium (Luria-Bertani) nach folgender Zusammensetzung

verwendet:

Bacto-Trypton 1 %

Bacto-Yeast Extrakt 0.5 %

NaCl 0.5 % pH 7.5

Methoden

41

Für feste Nährböden wurde 1.5 % Bactoagar (Difco) zugesetzt. Der Selektionsdruck wurde

durch Zugabe von Ampicillin (100 µg/ml) nach dem Autoklavieren eingestellt.

Die Anzucht von E. coli erfolgte bei 37°C als Schüttelkultur in den entsprechenden Medien.

Vorkulturen wurden in Reagenzgläsern, größere Kulturen in Schüttelkolben mit Schikanen

inkubiert.

4.3.3 Plattenkulturen

Die Inkubation fester Medien erfolgte aerob bei 37°C, bis Einzelkolonien erkennbar waren.

Bewachsene Platten wurden bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert.

4.3.4 Schüttelkolbenkulturen

Flüssigmedien wurden mit Einzelkolonien, Glycerin-Stocks oder 0,1-10 Vol.-% anderer

Flüssigkulturen beimpft und auf einem Rundschüttelgerät mit einer Frequenz von 110-160

rpm bei geeigneter Temperatur inkubiert.

4.3.5 Konservieren von mikrobiologischen Stämmen

Von allen Stämmen wurden 1 ml einer stationären Kultur mit 5 % DMSO [steril] versetzt und

in entsprechenden, sterilen Kryoröhrchen (Nunc) bei -80°C konserviert.

4.3.6 Fermentation der rekombinanten PheDH in Hochdichte Medium (HZD)

5 L bzw. 20 L HZD-Medium wurden mit 1 % exponentiell wachsender HZDamp Flüssigkultur

beimpft und bei 37°C inkubiert. Rührerdrehzahl und Sauerstoffeintrag wurden so angepasst,

dass ein Sauerstoffpartialdruck von 20 % nicht unterschritten wurde. Die maximalen Werte

betrugen 800 rpm Rührerdrehzahl und 5 L·min-1 Lufteintrag. Bei Bedarf wurde ein Überdruck

von bis zu 1 bar angelegt. Die Einstellung des pH-Werts auf 7.0 erfolgte unter Verwendung

von 25 %igem Ammoniakwasser und 1 N Phosphorsäure. Sobald die vorgelegte C-Quelle

erschöpft war, wurde Feedlösung computergesteuert zugesetzt. Die Induktion der Expression

erfolgte innerhalb der Feedphase durch IPTG. War der Sauerstoffpartialdruck irreversibel

unter 20 % gesunken, wurde die Fermentation abgebrochen.

Methoden

42

Batch-Medium-Zusammensetzung

Nr. Lösung Substanz Endkonz. V End

(g/l) (ml)

Konz.- V Stamm m

Faktor (ml) (g)

1 HZD-Grundlsg.

pH= 6,9

NH4Cl

(NH4)2SO4

KH2PO4

K2HPO4

NaH2PO4-H2O

0,2 10000

2 10000

13 10000

10 10000

6 10000

10 1000 2

10 1000 20

10 1000 130

10 1000 100

10 1000 60

2 Glucose-Lsg. Glucose-1H2O 6 10000 80 125 60

3 MgSO4-Lsg. MgSO4-7H2O 1 10000 200 50 10

4 Hefeextrakt-Lsg. Hefeextrakt 3 10000 100 100 30

5 Na2-EDTA-Lsg. Na2-EDTA 0,0084 10000 5000 2 0,084

6 Vitamin-Lsg. 428 DSM

pH=7

erst Folsäure bei pH=7

lösen, dann die anderen bei

pH=12 lösen

Riboflavin(Vit. B2)

Thiamin-HCl(Vit.B1)

Nicotinsäure

PyridoxinHCl(VitB6)

Ca-Panthotenat

Biotin

Folsäure

Cyanocobalamin(B12

0,0005 10000

0,05 10000

0,0025 10000

0,0025 10000

0,0025 10000

0,000005 10000

0,00001 10000

0,00005 10000

200 50 0,005

200 50 0,5

200 50 0,025

200 50 0,025

200 50 0,025

200 50 0,00005

200 50 0,0001

200 50 0,0005

7

Spurenelemente-Lsg.

In 5 N HCl

CaCl2-2H2O

ZnSO4-7H2O

CuCl2-2H2O

MnSO4-1H2O

CoCl2-6H2O

H3BO3

AlCl3-6H2O

Na2MoO4-2H2O

FeSO4-7H2O

0,04 10000

0,002 10000

0,001 10000

0,01 10000

0,007 10000

0,0005 10000

0,01 10000

0,002 10000

0,04 10000

250 40 0,4

250 40 0,02

250 40 0,01

250 40 0,1

250 40 0,07

250 40 0,005

250 40 0,1

250 40 0,02

250 40 0,4

8 Thiamin-Lsg. Thiamin-HCl(Vit.B1) 0,1 10000 2000 5 1

9 Ampicillin-Lsg. Ampicillin 0,1 10000 2000 5 1

10 IPTG-Lsg. IPTG

(Endkonz.=0,5 mM

0,119145 10000 1000 10 1,191

Methoden

43

Fed-Batch-Medium- Zusammensetzung

Nr. Lösung Substanz Endkonz. V End

(g/l) (ml)

Konz. V Stamm m

faktor (ml) (g)

1 HZD-Grundlsg. Stammlsg von Batch 4000 10 400

2 Glucoselsg. Glucose 600 4000 1,28 3124 2400

3 MgSO4-Lsg. Stammlsg von Batch 12 4000 16,6666 240 48

4 Hefeextrakt-Lsg. Stammlsg von Batch 18 4000 16,6666 240 72

5 Vitaminlsg428DSM Stammlsg von Batch 4000 200 20

6 Spurenelemente-Lsg. Stammlsg von Batch 4000 250 16

7 Thiamin-Lsg. Thiamin-HCl (Vit.B1 1 4000 40 4

Batch-Medium: Im Fermenter

HZD-Grundlsg. 1000 ml

Glucose-Lsg. 125 ml

MgSO4-Lsg. 50 ml

Hefeextrakt-Lsg. 100 ml

Na2-EDTA-Lsg. 1 ml

Vitamin-Lsg. 428 (DSM) 50 ml

Spurenelemente-Lsg. 40 ml

Thiamin-Lsg. 5..ml

Ampicillin-Lsg. 5 ml

IPTG-Lsg. 10 ml

Antischaum 4 ml

Inokulum 100 ml

ad Aqua dest 8510 ml

Gesamt 10000

Fed-Batch-Medium: Im Fermenter

HZD-Grundlsg. 400 ml

Glucose-Lsg. 3044 ml

MgSO4-Lsg. 240 ml

Hefeextrakt-Lsg. 240 ml

Vitamin-Lsg. 428 (DSM) 20 ml

Methoden

44

Spuremelemente-Lsg. 16 ml

Thiamin-Lsg. 40 ml

Gesamt 4000 ml

Die rekombinaten Zellen wurden bei einer OD600 von 60 mit 1 mM IPTG induziert. Unter

Sauerstoff- sowie pH-Regulation sind die Zellen bis zu einer OD600 von 170 gewachsen.

4.3.7 Bestimmung der optischen Dichte

Mikrobielle Zellen, die in einen Lichtstrahl gebracht werden, bewirken einen

Intensitätsverlust, der unter Berücksichtigung des Lambert-Beer’schen Gesetzes beschrieben

werden kann (Bergter, 1983): E=? .c.d. Bei konstanten Extinktionskoeffizienten (? ) und

konstanter Küvettenschichtdicke (d) besteht für definierte Bereiche eine direkte proportionale

Beziehung zwischen Extinktion und Zellkonzentration (c) (Bursch et al., 1970).

Innerhalb einer Population wachsende Zellen kann über spektrophotometrische Messung der

Extinktion im Wellenlängenbereich von 550 nm bis 610 nm die zeitabhängige Zunahme der

Zellkonzentration bestimmt werden. Dies erleichtert die Reproduzierbarkeit wachstums-

abhängiger Versuchsergebnisse, erfordert jedoch konstante Versuchsbedingungen, da der

jeweilige Extinktionskoeffizient von Größe, Form, Brechungsindex und Wachstums-

bedingungen der untersuchten Spezies abhängig ist. Aussagen über absolute Zell-

konzentrationen sind unter mikroskopischer Bestimmung der Zellzahl erstellt worden.

Bei jeder OD 600 wurden die Zellsuspensionen durch Zugabe vom Medium soweit verdünnt,

dass die Extinktion unterhalb von 0,5 lag. Darüber besteht keine lineare Beziehung mehr

zwischen Extinktion und Konzentration.

Ergebnisse

45

5 Ergebnisse 5.1 Klonierung der Phenylalanin Dehydrogenase (PheDH)

5.1.1 Präparation genomischer DNA

Das phedh-Gen aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987) wurde mittels PCR mit

genomischer DNA als Templat amplifiziert. Die genomische DNA wurde nach der Methode

von van Soolingen (van Soolingen et al., 1991) aus dem Stamm Rhodococcus sp. M4 isoliert.

Diese Methode beinhaltet die enzymatische Vorbehandlung der Zellwand mit Lysozym und

die Fällung der Proteine mit CTAB und Proteinase K als Denaturierungsmittel. Die Zugabe

von CHCl3/Isoamylalkohol (23:1) führt zur Abtrennung der genomischen DNA.

Das DNA-Pellet wurde mit kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen und in TE-Puffer bei 4°C

aufbewahrt. (bei –20°C Lagerung würde die DNA beim Auftauen durch die Scherkräfte

gespalten).

Die Reinheit sowie die Ausbeute der DNA wurde durch ein 0.5 %iges Agarose Gel mit

Ethidiumbromid überprüft. Aus Abbildung 10 geht hervor, dass die nach dieser Methode

präparierte genomische DNA hochmolekular und intakt war.

Abbildung 10: genomische DNA aus Rhodococcus sp. M4 nach Elektrophorese im 0.5 %igem Agarosegel.

genom. DNA 1µl = 70 ng

9 kb 5 kb

Ergebnisse

46

5.1.2 Klonierung des PheDH-Gens mittels PCR

Die benötigten Primer für die 5’- und 3’-Enden des zu klonierenden phedh-Gens wurden aus

der veröffentlichten DNA-Sequenz (Brunhuber et al., 1994) abgeleitet.

5’Primer (5’Phe-for)

5’ ATG AGT ATC GAC AGC GCA CTG AAC

3’Primer (5’Phe-rev)

5’ CTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT

An den 3’Primer wurden hinter die letzte Aminosäure des C-Terminus 2 Stopcodons

angefügt, um eine effiziente Termination der Transkription zu gewährleisten.

Für die PCR wurde eine Verdünnungsreihe des DNA-Templates durchgeführt, um die

optimale Ausgangskonzentration zu bestimmen. Dafür wurden zwei Versuchsreihen

angesetzt. Die PCR-Ansätze wurden 7 min bei 94°C denaturiert, anschließend wurden 30

Zyklen wie aus Tabelle 2 ersichtlich durchgeführt. Die verwendeten Ansatzgrößen sind in

Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 2: PCR-Zyklen

Zyklusschritt Zeit [min] Temperatur [°C]

Annealing 2 65

Polymerisation 1.5 72

Denaturierung der Stränge 2 94

Tabelle 3: PCR Protokoll zur Amplifizierung des PheDH-Gens. Variiert wurde die Konzentration der Template-DNA.

Template DNA 5’-ende 3’-ende dNTP Puffer Taq-Polymerase DMSO H2O

100 ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 3 81µl



Durch die Verwendung der obengenanten Primer (5’Phe-for und 5’Phe-rev), die aus der N-

terminalen bzw. C-terminalen Sequenz abgeleitet wurden, konnte ein spezifisches 1.1 kb-

Fragment bei einer Annealing-Temperatur von 65°C amplifiziert werden (Abbildung 11). Um

eventuelle Fehler, die bei Verwendung der Taq-Polymerase auftreten können zu minimieren,

Ergebnisse

47

wurde zur Klonierung des PheDH-Gens in der PCR eine DNA-Polymerase mit ‚proof

reading’-Funktion (high fidelity®- Polymerase) (Roche), Fehlerrate 1.3*10-6 verwendet.

Abbildung 11: Ergebnis der PCR Reaktionen, die Abbildung zeigt ein Fragment mit einer Größe von etwa 1100 bp, als Marker wurde die Gibco KB-Leiter verwendet. Von den PCR-Ansätze wurden 7 µl auf ein 0.8 % Agarosegel aufgetragen, 1-3 entsprechen den Ansätze in Tabelle 2.

5.1.3 Klonierung des PheDH Gens in den pUC-18

Das phedh- Gen wurde in die „multiple cloning site“ des pUC18-Vektors über glatte Enden

an der SmaI- Restriktionsschnittstelle (CCCGGG) kloniert. Das Verhältnis zwischen Vektor

und Insert lag bei 1:3. Für eine erfolgreiche Ligation wurden 200 ng DNA eingesetzt.

Der Vektor wurde an der SmaI -Schnittstelle geschnitten und um eine Religation des linearen

Plasmids zu verhindern, wurden die 5'-Phosphatgruppen abgespalten. Die Dephosphory-

lierung wurde durch alkalische Phosphatase (SAP, Shrimp Alkaline Phosphatase)

durchgeführt, und in die Ligation eingesetzt (Abbildung 12).

1.0 kb

1.6 kb

1 2 3

Ergebnisse

48

Abbildung 12: Vektorkarte des pUC18 -PheDH

Der Vektor enthält folgende Strukturelemente:

??ein regulierbares Promotor/Operator Element bestehend aus dem tac-Promotor und

einer lac Operon Sequenz lac Z’, die das Gen für die ß-Galactosidase komplementiert

??ein Gen für die ß-Lactamase, die dem plasmidenthaltenden Stamm Ampicillinresistenz

gewährt

??eine multiple cloning site, die das Einklonieren von Fremd-DNA [hier PheDH] erlaubt

??den Replikationsursprung ori

Tabelle 4: Ligationsansatz zur Klonierung der PheDH im pUC18-Vektor

Genfragment 50-200 ng 10 µl

pUC18-Vektor 50 ng

2X Ligationspuffer 10 µl

DTT 1 µl

T4-Ligase 1 µl

H2O ad 20

Das PCR-Fragment wurde 5’-phosphoryliert und der 3’ Überhang mittels Klenow-Fragment

ergänzt, so dass glatte Enden entstanden. Nach Reinigung der DNA aus dem Enzymansatz

ori

Ergebnisse

49

wurde eine Ligation durchgeführt und in kompetente E. coli XL1 Blue Zellen transformiert.

Nach Ausplattierung auf einer LBamp Agarplatte wurden ca. 150 Kolonien erhalten.

5.1.4 Sequenzierung des phedh-Gens

Von den durch die Transformation erhaltenen Kolonien wurden exemplarisch 20 Kolonien

ausgewählt und über Nacht in 5ml LBamp Medium inkubiert. Aus der hochgewachsenen

Kultur wurde eine Schnellisolierung der Plasmid-DNA durchgeführt. Mit der isolierten

Plasmid-DNA wurde eine Restriktionsanalyse mit SacI und BamHI durchgeführt, die auf

einem 0.8 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurde.

Die Sequenz der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 ist in Abbildung 13 dargestellt.

Abbildung 13: DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 mit zwei Stopcodons.

ATGAGTATCGACAGCGCACTGAACTGGGACGGGGAAATGACGGTCACCCGATTCGACCGGGAGACTGGTGCCCATTTCGTCATTCGACTCGATTCGACCCAACTCGGACCGGCGGCCGGAGGCACCAGAGCCGCACAGTACTCACAGCTGGCGGACGCCCTCACCGACGCCGGCAAATTGGCGGGGGCGATGACGTTGAAGATGGCAGTGAGCAACCTTCCGATGGGCGGGGGCAAATCCGTCATTGCGCTTCCTGCGCCGCGTCATTCGATCGATCCGAGCACGTGGGCACGCATCCTCCGAATCCACGCCGAGAACATCGACAAGTTGTCCGGCAACTACTGGACCGGACCGGACGTCAACACCAATTCGGCAGACATGGATACTCTGAACGACACCACCGAGTTCGTGTTCGGACGGTCGCTCGAACGCGGCGGCGCGGGTTCGAGCGCGTTCACCACCGCCGTTGGCGTGTTCGAGGCGATGAAGGCGACCGTCGCGCACCGTGGGCTGGGCTCACTCGACGGTTTGACGGTCCTGGTCCAAGGACTGGGGGCAGTCGGAGGATCATTGGCATCCCTGGCCGCCGAAGCGGGTGCGCAACTCCTGGTGGCAGACACCGACACCGAGCGAGTAGCGCACGCTGTTGCGTTGGGCCACACAGCGGTTGCCCTCGAGGACGTTCTGTCCACCCCGTGTGATGTCTTCGCACCCTGCGCAATGGGCGGCGTCATCACCACCGAGGTGGCGCGAACACTCGACTGTTCCGTCGTGGCCGGTGCCGCCAACAACGTCATCGCCGACGAGGCCGCCTCGGACATCCTGCACGCACGCGGAATTCTGTACGCTCCCGACTTCGTGGCCAACGCCGGCGGTGCCATCCACCTCGTAGGCCGGGAGGTTCTCGGTTGGTCCGAGTCGGTTGTCCACGAACGAGCAGTTGCCATAGGCGACACCCTGAATCAGGTCTTCGAGATCTCCGACAACGACGGCGTCACCCCGGACGAGGCCGCCCGCACTCTCGCTGGACGGCGCGCCCGCGAGGCCTCGACAACGACAGCGACTGCCTAGTAA

Ergebnisse

50

5.1.5 Expression des recPheDH-Gens in E.coli

5.1.5.1 Klonierung der PheDH im Expressionsvektor PET16b

Zur Klonierung des recPheDH-Gens in einen Expressionsvektor wurden durch

entsprechendes Primerdesign Restriktionsschnittstellen an beiden Enden des Gens eingeführt.

Diese Vorgehensweise ermöglicht eine Klonierung des Gens in der gewünschten Orientierung

downstream des Promotors. Außerdem kann durch die Wahl der Restriktionsschnittstelle am

5’-Ende des Gens der Abstand des Startcodons ATG zum Promotor und damit auch zur

Ribosomenbindungsstelle auf dem Plasmid beeinflusst werden. Die verwendeten

Expressionsvektoren pET11a und pET16b tragen eine Nde1 Restriktionstelle vor dem

Startcodon des lacZ-Gens. Daher wurde an das 5’-Ende des recPheDH-Gens eine Nde1-

Restriktionsschnittstelle eingefügt. An das 3’-Ende des Gens wurde eine BamHI-Restriktions-

schnittstelle hinter dem Stopcodon angehängt.

Der pET16b-Vektor enthält neben einem starken Promotor einen His-Tag upstream der MCS.

Durch die Klonierung der PheDH über die Schnittstellen NdeI/BamHI wird der His-Tag am

3’-Ende des Gens angefügt, sodass die exprimierte PheDH einen His-Tag am N-Terminus

besitzt. Dafür wurden folgende Primer für eine PCR konstruiert:

5’-For NdeI-Schnittstelle

CGGCATATGAGTATCGACAGCGCACTG

5’-Rev BamHI-Schnittstelle

GCGGATCCCTACTAGGCAGTCGCTGTC

Mit den konstruierten Primern wurde das Insert aus dem rec-pUC18 amplifiziert und in die

Expressionsvektoren pET-16b und pET-11a an der NdeI/BamHI ligiert. Die Strategie zur

Expression der PheDH ist in Abbildung 14 dargestellt.

Ergebnisse

51

Abbildung 14: Fließschema zur Klonierung des recPheDH-Gens in die Expressionsvektoren PET11a oder PET 16b

Nach der Vermehrung der rekombinanten Vektoren (pET-16b und pET-11a) im BL21-Stamm

wurde eine Schnellisolierung des Plasmids durchgeführt und dieses mit NdeI/BamHI zum

Nachweis des PheDH-Gens verdaut. Das Ergebnis ist in Abbildung 15 dargestellt.

Abbildung 15: Agarose-Gel zur Überprüfung der Restriktion der recpET-16b-und 11a-Vektoren. Bei einer Größe von etwa 1100 bp tritt eine Bande des geschnittenen Inserts auf Bahn 2 pET-16b und Bahn 5 pET-11a. Als Marker wurde eine KB-Leiter (Gibco) verwendet Bahn 1. Der Ansätze wurden mit NdeI/BamHI behandelt.

1.6 kb

1.0 kb

PCR zur Einführung der Restriktionsschnittstellen Nde1 und BamH1 an das 5’- und 3’-Enden des PheDH-Gens

„Blunt-end“-Klonierung in den Klonierungsvektor pUC18 zur Amplifizierung

des recPheDH-Gens

Restriktion der recPheDH mit Nde1 und BamH1 aus pUC18

Ligation des recPheDH-Nde1/BamH1-Fragments in den Expressionsvektor pET16b-Nde1/BamH1 und pET11a-Nde1/BamH1

Transformation in E.coli Xl1Blue, BL21

Überprüfung der Expression in einer 100 ml-Kultur

1 2 3 4 5 6

1: KB-Leiter 2: rec-pET16b-Plasmide mit einem Insert von ca. 1.1 kb verdaut mit NdeI/BamHI 3+4+5 rec-pET11a verdaut mit NdeI und BamHI 6: PET16b verdaut nur mit NdeI

PheDH-Gen 1068 bp

Ergebnisse

52

5.1.5.2 Expression der PheDH im PET-System

Die Induktion der rekombinanten Stämme erfolgte bei einer OD600 sowohl mit 0.5 als auch

1.5 mM IPTG bei 37°C. Das SDS-Gel (Abbildung 16) zeigte eine breite Bande bei 39 kDa,

die der PheDH entspricht. Es wurde aber keine Enzymaktivität nachgewiesen. Eine Analyse

des exprimierten Proteins auf einem SDS-Gel (12.5 %ig) zeigte die Bildung von

Einschlusskörpern (inclusion bodies).

Abbildung 16: SDS-Gel zur Überprüfung der Expression. Bei einer Größe von etwa 39 kDa tritt eine Bande auf. Bahn 1: Rohextrakt aus dem rec-pET16b in E. coli BL21 das Rohextrakt wurde nicht abzentrifugiert. Bahn 2: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET16b in E. coli BL21. Bahn 3: Rohextrakt aus dem rec-pET11a in E. coli BL21. Bahn 4: Überstand des abzentrifugierten Rohextrakts aus rec-pET11a in E. coli BL21. 5: Marker

Um die Bildung von inclusion bodies zu minimieren, wurde das PheDH-Gen in weitere

Plasmide ohne His-Tag (pTRC99a, pBtac, pKK223-3) kloniert. Auch die Klonierung in diese

Vektoren führte zu inclusion bodies. Die Induktion der rekombinanten Zellen durch

niedrigere IPTG-Konzentrationen bzw. die Anzucht bei erniedrigten Temperaturen (bis 25°C)

konnte dieses Problem nicht lösen. Ein weiterer Ansatzpunkt war die Manipulation auf

genetischer Ebene. Inclusion bodies könnten durch eine schwächere Transkription bzw.

Translation verhindert oder zumindest minimiert werden. Diesem Gedanken folgend wurde

die PheDH einerseits in einen anderen Expressionsvektor mit schwächerem Promotor

97.400 Da

39.200 Da

66.200 Da

1 2 3 4 5

26.600 Da

14.400 Da

Ergebnisse

53

umkloniert. Andererseits wurde der Abstand zwischen dem Startcodon und der

Ribosomenbindungsstelle variiert.

5.1.5.3 Klonierung des PheDH-Gens in pkk223-3

Die optimale Expression eines Enzyms erreicht man normalerweise, wenn das Startcodon des

dazugehörigen Gens zwischen 7 und 9 bp von der Ribosomenbindungsstelle entfernt ist

(Esipov et al., 1999; Tedin et al., 1997). Diese Klonierungsstrategie wurde für die PheDH in

dieser Arbeit auch mit mehreren Vektoren, pTRC99A, pET16b, pET11a und pBtac,

durchgeführt. Die Klonierungen führten in allen Fällen zu einer starken Expression des

Proteins, das aber, wie oben dargestellt, in unlöslicher Form (inclusion bodies) vorlag.

Unlösliche Proteine können durch eine zu schnelle Expression gebildet werden, die den

Proteinen nicht genügend Zeit und Raum zur Faltung lässt. Für die Vermeidung der Bildung

von unlöslichen Proteinen wurden physikalische bzw. biochemische Methoden (Temperatur,

Induktion, Schüttelgeschwindigkeit) (Shin et al., 1997; Xu et al., 1994; Yang et al., 1997)

während des Wachstums variiert. Dafür wurden die rekombinanten Zellen bei 25°C bzw.

30°C inkubiert sowie eine Inkubation bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 80 rpm, die

eindeutig niedriger liegt als üblicherweise mit 140 rpm, durchgeführt. Durch diese Parameter

konnte das Wachstum negativ beeinflusst werden, das aber nicht zur Vermeidung der

„inclusion bodies“ führte. Eine Induktion mit verschiedenen IPTG- Konzentrationen (0,1mM-

1,5 mM) erzielte ebenso keine positiven Ergebnisse.

Wie bereits oben angedeutet kann durch entsprechende Manipulation auf genetischer Ebene

eine schwächere Transkription bzw. Translation erreicht werden, was zu einer langsameren

und schwächeren Expression führt. Diesen bleibt dann genug Zeit und Raum zur Faltung und

man erhält zwar weniger, dafür aber aktives Enzym. Um dies zu erreichen, erfolgte die

Klonierung an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK223-3 mit einer „nicht

optimalen“ Entfernung von 14 bp des Startcodons zur Ribosomenbindungsstelle. Dadurch ist

die Translation schwächer mit dem bereits oben erklärten Effekt. Zusätzlich dazu besitzt das

verwendete Plasmid pKK223-3 einen schwächeren Promotor als beispielsweise die oben

verwendeten pET Systeme, was zu einer weiteren Abschwächung der Expression führt. In

Abbildung 17 ist die Vektorkarte dargestellt.

Ergebnisse

54

Abbildung 17: Vektorkarte des pKK-223-3recPheDH. Das PheDH-Gen wurde an der SmaI-Schnittstelle im Expressionsvektor pKK-223-3 mit einem Abstand zur Ribosomenbindungsstelle von 14bp ligiert.

Der Vektor enthält folgende Strukturelemente:

??ein regulierbares Promotor/Operator Element bestehend aus dem tac-Promotor.

Dadurch kann die Expression über IPTG, das den Repressor des lac-Operons

inaktiviert, induziert werden

??abwärts der Klonierungsstelle den rrnB Transkriptionsterminator, der das Ende der

Transkription signalisiert

??eine „multiple cloning site“ für die Insertion von Fremd-DNA [hier rec-PheDH],

dadurch wird das lacZ-Gen inaktiviert und eine blau-weiß-Selektion rekombinanter

Klone ermöglicht

??den Replikationsursprung [Ori] und das Gen für die ? -Lactamase, die die

Ampicillinresistenz bereitstellt

??die lacZ Ribosomenbindungsstelle

Ergebnisse

55

Um die Klonierung des PheDH-Gens an einer „nicht optimalen“ Entfernung des Startcodons

zur ribosomalen Bindungsstelle durchführen zu können, wurde das recPheDH-Gen in die

„multiple cloning site“ des pKK223-3 Expressionsvektors über glatte Schnittstellen an der

SmaI Restriktionsschnittstelle [CCCGGG] ligiert. Dabei wurde zunächst der Vektor mit dem

Restriktionsenzym SmaI geschnitten und anschließend mit einer alkalischen Phosphatase

inkubiert, um eine 5’-Dephosphorylierung zu erreichen. Das amplifizierte recPheDH-Gen

wurde mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und mittels Agarosegelsauftrennung gereinigt.

Die benötigten Primer für die 5’- und 3’-Enden sind:

5’Primer (5’Phe-for)

5’ ATG AGT ATC GAC AGC GCA CTG AAC

3’Primer (5’Phe-rev)

5’ CTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT

An den 3’-Primer wurden hinter die letzte Aminosäure des C-Terminus 2 Stopcodons

angefügt, um eine effiziente Termination der Translation zu gewährleisten.

Die Vektor-DNA konnte über Phenol/Chloroform Fällungen wiedergewonnen werden und

wurde für die Ligation mit dem aufgereinigten recPheDH-Gens eingesetzt. Für die

anschließende Transformation wurden kompetente E. coli HB101 bzw. JM-105 Zellen

hergestellt (Hanahan, 1983) und verwendet.

Einige der Transformanden wurden über Nacht in 5 ml LBamp inkubiert, und aus der

hochgewachsenen Kultur Plasmid-DNA isoliert. Mit den durch Schnellisolierung

gewonnenen Plasmiden wurde eine Restriktionsanalyse mit EcoRI durchgeführt. 5 µL des

Ansatzes wurden auf einem Agarosegel (0,8 %) elektrophoretisch aufgetrennt (Abbildung

18).

In der „multiple cloning site“ des pKK223-3-Vektor befindet sich vor der SmaI-Schnittstelle,

über die die PheDH kloniert wurde, eine EcoRI-Schnittstelle. Da sich im Gen an Position 821

ebenfalls eine EcoRI-Schnittstelle befindet, führt ein Verdau mit EcoRI zu einem Fragment

von etwa 830 bp.

Ergebnisse

56

Abbildung 18: rec-pKK223-3-PheDH verdaut mit EcoRI. 1: KB-Marker, 2-6 recPhe-pKK223-3 verdaut mit EcoRI (verschiedene Konzentrationen). Nach einer Restriktionsanalyse taucht eine Bande mit der erwarteten Größe von ca. 800bp auf.

5.1.5.4 Expression der recPheDH im pKK223-3

Das beschriebene Expressionssystem wurde zunächst in weitere E. coli Stämme (Tabelle 5)

transformiert und hinsichtlich ihrer Expressionsrate sowie der nachweisbaren spezifischen

Aktivität im zellfreien Rohextrakt untersucht. Das Ergebnis der Expressionsuntersuchung ist

in Tabelle 5 dargestellt. Es wurden zwei weitere Stämme ausgewählt [JM105 und UT5600]

und in 100 ml Kulturen [+amp] kultiviert. Beim Erreichen einer OD600 von 0.5 wurden sie mit

1 mM IPTG induziert. Nach 7 h wurde die Expression abgebrochen und die Zellen mittels

Ultraschall aufgeschlossen. Aus den Daten wird ersichtlich, dass in allen untersuchten

Stämmen eine Expression der NAD-abhängigen Phenylalanin Dehydrogenase aus

Rhodococcus sp. M4 nachzuweisen war. Die höchsten spezifischen Aktivitäten im zellfreien

Rohextrakt konnten mit dem E. coli JM105 erzielt werden. Infolgedessen wurde dieser

Stamm für alle weiteren Untersuchungen und für die Klonierung und Expression der

Mutanten verwendet.

1 2 3 4 5 6

PKK-223-3

Fragment aus dem PheDH-Gen ca.800 bp

3 kb

1 kb

Ergebnisse

57

Tabelle 5: Expressionsresultate der rekombinanten E.coli Stämme. Die Aktivitäten wurden im Rohextrakt „30 %iger Aufschluss“ gemessen.

Aktivität U/ml

Rohextrakt

Spez.Aktiv U/mg

im Rohextrakt

Rhod.sp. M4 100 U/ml 7

UT5600 420U/ml 46

HB101 550 U/ml 61

JM105 2000 U/ml 250

5.1.6 Optimierung der Induktionsparameter

Zur Optimierung der Expression der recPheDH in E. coli wurden neben der Auswahl eines

geeigneten Vektor-Wirt-Systems die Induktionsparameter variiert, um eine effiziente

Proteinexpression zu erzielen.

Einerseits wurde die Induktorkonzentration zwischen 0 und 3 mM IPTG (? -D-Isopropylthio-

galaktosid) bei einem konstanten Induktionszeitpunkt (OD600= 0.6) variiert (Abbildung 19).

Die Untersuchung führte zu dem Ergebnis, dass mit einer IPTG-Konzentration zwischen

0.7mM und 1.2 mM eine optimale Expression zu erzielen war. In der Kontrollexpression ohne

IPTG-Induktion konnte nur geringe PheDH-Aktivität (35 U/ml) im Rohextrakt nachgewiesen

werden. Folglich unterdrückte der lac I-Repressor die Expression des PheDH-Gens im

nichtinduzierten Zustand fast vollständig. Dies ist von Vorteil, da die Expression des

Fremdproteins eine Belastung des Zellstoffwechsels bedeutet und zu einer erheblich

geringeren Zellausbeute führt.

Ergebnisse

58

0

50

100

150

200

250

300

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

IPTG-Konzentration (mM)

Spe

zifis

che

Akt

ivitä

t (U

/mg)

Abbildung 19: Variation der IPTG-Konzentration bei der Induktion von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden mit verschiedenen IPTG-Konzentrationen zwischen 0 und 3 mM induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen.

Darüberhinaus wurde der Zeitpunkt der Induktion nach Inokulation variiert, wobei alle

Kulturen mit 1 mM IPTG induziert worden sind. Die Zellen wurden 24 h nach Inokulation

geerntet und die spezifischen Aktivitäten in den zellfreien Rohextrakten bestimmt. Die

Ergebnisse der Induktionsuntersuchungen sind in Abbildung 20 und Abbildung 21 dargestellt.

Es zeigt sich, dass der Zeitpunkt der Induktion einen großen Einfluss auf das Wachstum der

Zellen hat.

Ergebnisse

59

0

1

2

3

4

1 2 3 4 5 6 7 8

Zeit nach der Inokulation (h)

OD

600

OD600 ohne IPTGOD600 mit IPTG

Abbildung 20: Wachstumsverhalten für E. coli nach der Induktion

Bei der Betrachtung des Verlaufs der OD600nm im untersuchten Zeitraum fällt auf, dass in der

Kultur, die zum Zeitpunkt der Inokulation mit 1 mM IPTG induziert worden ist, nur eine

geringe Zunahme der OD600nm zu betrachten war (Abbildung 20). Hingegen zeigt die

Kontrollkultur ohne IPTG eine deutliche Zunahme der Zelldichte.

Eine Variation des Induktionszeitpunktes für die Erzielung der maximalen Induktion wurde

durchgeführt (Abbildung 21). Aus Abbildung 21 ist zu entnehmen, dass die maximale

Induktion des pKK223-3-PheDH im E. coli JM105 3 ½ h von der Inokulation erzielt werden

konnte. Dieser Zeitpunkt entspricht einer OD600 von 0,5-0,55, d.h. die Zellen befanden sich

während der IPTG- Zugabe am Anfang der logarithmischen Wachstumsphase.

Ergebnisse

60

0

50

100

150

200

250

0 1 2 3 4 5 6 7

Induktionszeitpunkt (h)

Spe

zifis

che

Akt

ivitä

t (U

/mg)

Spezifische Aktivität

Abbildung 21: Variation des Induktionszeitpunktes in Expressionskulturen von pkk-223-3-PheDH/ JM105. Die Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit 1 mM IPTG induziert. Die spezifische Aktivität wurde im Rohextrakt gemessen.

5.1.7 Reinigung der recPheDH aus E. coli JM105

Die Reinigung der recPheDH aus E. coli-Rohextrakten erfolgte in Anlehnung an das

Reinigungsprotokoll der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987). Zunächst

wurden die Bakterienzellen durch Disintegration mit Glasperlen aufgeschlossen. Im Anschluß

daran erfolgte ein zusätzlicher Reinigungsschritt zu den Literaturangaben durch eine

Hitzedenaturierung der Begleitproteine in Gegenwart von 5 % (w/v) L-Phenylalanin und

Entfernung des L-Phenylalanin mittels Gelfiltrationschromatographie. Die nach dieser

Methode präparierte recPheDH-Fraktion konnte über Anionenaustauschchromatographie an

DEAE-Sepharose FF bis zur Homogenität gereinigt werden. Abbildung 22 (Bahn 1+2) zeigt

die Auftrennung der gereinigten recPheDH in einem SDS-Polyacrylamidgel nach

Silberfärbung.

Ergebnisse

61

Abbildung 22: SDS-PAGE (12.5 %, Silberfärbung) zur Überprüfung der Reinheit der recPheDH nach DEAE-Sepharose FF–Chromatographiegel. 1 Marker, 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF, 4 Roh-extrakt aus E.coli.

Mit dem vorliegenden Reinigungsprotokoll (Tabelle 6) konnte die recPheDH bis zur

Homogenität gereinigt werden. Im Gegensatz zur Reinigung der PheDH aus Rhodococcus sp.

M4 (Hummel et al., 1987) und PheDH aus Rhodococcus maris K-18 (Misono et al., 1989),

die 3 bzw. 8 Schritte erfordert, waren bei der Reinigung der rec-PheDH nur zwei Schritte

nötig.

Tabelle 6: Zusammenfassung der Reinigung der recPheDH aus E.coli-Rohextrakt

Reinigungsschritt Aktivität

[U/ml)

Proteingehalt

[mg/ml]

Spez. Aktivität

[U/mg]

Ausbeute

[%]

Reinigungs-

faktor

Rohextrakt 2000 8 250 100 1

Hitzedenaturierung

+ Sephadex G25

2300 6.6 348 86 1.4

DEAE-Sepharose FF 121 0,16 756 58 3

Aufkonzentrierung

(Centriprep 10)

4500 7 690 51 3

97.4 kDa

39.2 kDa

1 Marker 2+3 recPheDH nach DEAE-Sepharose FF 4 E. coli Rohextrakt mit recPheDH

1 2 3 4

66.2 kDa

20.0 kDa

Ergebnisse

62

5.1.8 Substratspektrum und KM-Werte

Die Phenylalanin Dehydrogenase katalysiert die oxidative Desaminierung von L-Phenylalanin

und mehrerer anderer L-Aminosäuren und die reduktive Aminierung von Phenylpyruvat und

P-Hydroxophenylpyruvat. Das Enzym benötigt NAD+ als natürliches Coenzym.

Verschiedene Aminosäuren und 2-Ketosäuren sind als Substrate für die Wildtyp-PheDH vom

Rhodococcus sp. M4 bekannt (Tabelle 7) (Hummel et al., 1987). In dieser Arbeit wurden die

biochemischen Eigenschaften (Tabelle 8) der Wildtyp-PheDH mit der Rec-PheDH verglichen

und eine 100 %ige Ähnlichkeit festgestellt. Das bedeutet, dass beide Enzyme identische

Eigenschaften besitzen.

Tabelle 7: Untersuchte Substrate der Rec-PheDH.

Substrat Vmax KM

Phenylpyruvat

p-Hydroxyphenylpyruvat

Indolpyruvat

2-Keto-4-methylmercaptobutyrat

100

5

3

33

1.6?10-4

2.3?10-3

7.9.10-3

2.1.10-3 A: Reduktive Aminierung: Der Wert des Vmax ist relativ zum Phenylpyruvat

als 100

Substrat Vmax KM

L-Phenylalanin

L-Tyrosin

L-Tryptophan

L-Methionin

100

12

2

4

7.2?10-4

3.4?10-3

1.7?10-2

4.8?10-4 B : Oxidative Desaminierung: Der Wert des Vmax ist relativ zum L-Phe

Tabelle 8: Kinetische Parameter für die Rec-PheDH

Reduktive Aminierung

KM (PPy)

KI (PPy)

KI (Phe)

KM (NADH)

KI (NAD+)

KM (NH4+)

0.13 mM

7.34 mM

2.96 mM

0.13 mM

1.27 mM

387 mM

Oxidative Desaminierung

Ergebnisse

63

KM (Phe)

KI (Phe)

KI (PPy)

KM (NAD)

KI (NADH)

0.87 mM

17.85 mM

0.07 mM

0.27 mM

0.002 mM

5.1.9 Temperaturstabilität

Es wurde eine Desaktivierungskinetik zur Ermittlung der Temperaturstabilität durchgeführt.

Die Proben wurden bei Temperaturen zwischen 20 und 50°C inkubiert und in bestimmten

Zeitintervallen (1 h, 2 ½ h, und 36 h) zur Bestimmung der Restaktivität Aliquots entnommen.

In Abbildung 23 ist die Bestimmung der Aktivität nach 36 h bei verschiedenen Temperaturen

dargestellt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60

Temperatur (°C)

Akt

ivitä

t (%

)

rec-PheDH

WT-PheDH

Abbildung 23: Temperaturstabilität der rec-PheDH im Vergleich zur WT-PheDH im Rohextrakt.

Nach 36 h konnten bei 37°C noch 90 % Restaktivität der rec-PheDH gemessen werden. Im

Vergleich dazu wurden nur noch 56 % Restaktivität bei einer 36 stündigen Inkubation der rec-

PheDH bei 50°C ermittelt. Die Wildtyp-PheDH zeigte nach 36h bei 30°C nur noch etwa 50 %

Restaktivität .

Ergebnisse

64

5.1.10 Temperaturoptimum

Die Reaktionstemperatur wurde direkt in der Küvette gemessen. Die Ansätze wurden auf die

jeweiligen Messtemperaturen (20-50°C) temperiert, anschließend das Enzym hinzugegeben

und die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit gemessen.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60

Temperatur (°C)

Akt

ivitä

t (%

)

rec-PheDHWT-PheDH

Abbildung 24: Temperaturoptimum der recPheDH im Vergleich zur WT-PheDH, Enzym-Präparate aus dem Rohextrakt JM105. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 270 U/mg, und im WT-PheDH 24 U/mg.

Die optimale Temperatur sowohl für die rec-PheDH als auch für WT-PheDH liegt bei 50°C,

die Enzymtests und Synthesereaktionen wurden jedoch aus Stabilitätsgründen bei 30°C

durchgeführt.

5.1.11 pH-Optimum

Die meisten Enzyme zeigen bei einem charakteristischen pH-Wert ihre maximale Aktivität,

oberhalb und unterhalb dieses Wertes nimmt die Aktivität ab.

Eine mögliche Erklärung für die Abhängigkeit der Enzymaktivität ist, dass saure und basische

Aminosäuren pH-Wert-abhängig ionisiert oder nicht ionisiert vorliegen. Ausserdem

beeinflusst die Protonenkonzentration bei Beteiligung von H+ an der Reaktion ihr

thermodynamisches Gleichgewicht. Für die Bestimmung des pH-Optimums der rec-PheDH

wurde der Enzymtest bei verschiedenen pH-Werten von 5.0-11 durchgeführt. Dabei wurde

Ergebnisse

65

der Tris/HCl-Puffer im Bereich von pH-Wert 7-10 mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Für

niedrige sowie extrem hohe pH-Werte wurde der Puffer Glycyl-Glycin benutzt. Dieser besitzt

in diesen Bereichen eine hohe Kapazität.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH-Wert

Akt

ivitä

t (%

)

rec-PheDH

WT-PheDH

Abbildung 25: pH-Optimum der rec-PheDH für die reduktive Aminierung. 100 % bei der rec-PheDH entsprechen 190 U/mg, und im WT-PheDH 16 U/mg. Die Messung wurde bei 30°C durchgeführt.

Ergebnisse

66

5.2 Hochzelldichte Fermentation (HZD)

5.2.1 Zuführung von Nährstoffen, Nebenproduktbildung und Wachstum

Der als konservierte 1 ml Kultur bei –80°C gelagerte rekombinante Stamm E. coli JM 105

wurde als Vorkultur in 400 ml LB amp-Medium bei 37°C 18 h inkubiert. Damit wurde ein

10L Fermenter (Hochzelldichte Medium) 4 %ig angeimpft.

Die Form der Nährstoffzuführung ist ein kritisches Parameter bei der HZD-Fermentation, da

nicht nur die maximal erreichbare Zelldichte, sondern auch die Zellproduktivität beeinflusst

wird (Lee, 1996). Denkbar sind sowohl konstante als auch kontinuierlich veränderbare

Fütterungsraten.

Beide Möglichkeiten der Nährstoff-Zuführung wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf

Wachstumsrate, erreichbare End-Zelldichte und Acetatbildung des PheDH- Produktions-

stammes E. coli JM105 (rec-pKK-223-3-PheDH) untersucht. Die Ergebnisse sind in den

Abbildung 26 und 27 dargestellt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zuführungszeit [Std.]

Feedlösung [g/std]OD 630Acetatkonzentration [mM]

Abbildung 26: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK-223-3-PheDH] bei linearer Erhöhung der Glucosezufuhr in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C. Die Acetatbildung wurde mittels HPLC bestimmt.

Ergebnisse

67

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zuführungszeit [Std.]

Feedlösung [g/std]

OD 630

Acetatkonzentration [mM]

Abbildung 27: Wachstumsverhalten und Acetatbildung durch E. coli JM105 [rec-pKK223-3-PheDH] in HZD-Medium mit Hefeextraktzusatz bei 30°C und exponentieller Erhöhung der Glucosezufuhr.

Anders als die erreichte End-Zelldichte während der Nährstoffzuführung über 14 Stunden,

waren unterschiedliche Konzentrationen des gebildeten Acetats bei den zwei verschiedenen

Zuführungssystemen zu beobachten. Während Acetat bei linearer Zuführung der C-Quelle

ständig gebildet wurde, war bei exponentieller Zuführungsstrategie kein Acetat nachweisbar.

Daher wurden weitere Experimente mit exponentieller Zuführung der C-Quelle durchgeführt.

Nach Literaturangaben von Riesenberg (Riesenberg, 1991) und Fieschko (Fieschko, 1989)

erfolgt die Bildung wachstumsinhibierender Nebenprodukte wie Acetat in komplexen

Medien, bei Wachstumsraten oberhalb von 0,2 h-1 (Riesenberg et al., 1991) und in definierten

Medien bei Wachstumsraten oberhalb von 0,35h-1. Mit abnehmender spezifischer

Wachstumsrate steigt die Expression des rekombinanten Proteins (Fieschko, 1989). Daher

war für die Kultivierung des Expressionsstammes JM105 eine spezifische Wachstumsrate von

0,2 h-1 angebracht.

Ergebnisse

68

5.2.2 Bestimmung des Induktionszeitpunkts

Abbildung 28 zeigt den Einfluss des Induktionszeitpunkts auf die Systemproduktivität. Dies

wurde mittels zweier Experimente abgeschätzt, die die Zunahme der Volumenaktivität an

PheDH und die Plasmidkopienzahl nach Induktion am Anfang bzw. in der Mitte der

Fütterungsphase bestimmten. Die Ergebnisse wiesen daraufhin, dass ähnlich zu Versuchen in

Schüttelkultur eine signifikante Abhängigkeit der recPheDH-Expression vom Induktions-

zeitpunkt besteht.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Vol

umen

aktiv

ität [

U/m

l]

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11Zuführungszeit [h]

Induktion nach 1hInduktion nach 5 h

Abbildung 28: Entwicklung der PheDH-Volumenaktivität in Abhängigkeit vom Induktionszeitpunkt während der Zufütterungsphase.

Die Entwicklung der Plasmidkopienzahl, erkennbar an der Zunahme der Plasmidmenge aus

Präparationen gleicher Zellkonzentration wurde im Agarosegel überprüft (Abbildung 29).

Ergebnisse

69

Abbildung 29: 0.8 %iges Agarosegel zum Nachweis der Konzentrationszunahme an rec-pKK-223-3 bei Induktion 1h nach Beginn der Glucose-Zuführung während der Fermentation.

Aus Abbildung 29 ist die Erhöhung der Plasmidkopienzahl zu entnehmen. Eine Abnahme der

Menge an Plasmiden war bei einer Induktion in der Mitte der Zufütterungsphase Abbildung 30

zu beobachten.

Abbildung 30: Zu- und Abnahme der Plasmidkopienzahl bei Induktion 5 h nach Beginn der Glucosezuführung.

2.0 kb 1.6 kb

3 h 5 h 8 h 10 h 11 h

Zeit nach Induktion (Std.)

0 h 2 h 4 h 6 h

2 kb

5 kb

Zeit nach Induktion (Std.)

Ergebnisse

70

5.3 Klonierung des malic enzymes

5.3.1 Präparation genomischer DNA

Das malic enzyme- Gen wurde mittels PCR mit genomischer DNA als Template amplifiziert.

Die genomische DNA aus E. coli K12 wurde durch enzymatische Vorbehandlung der

Zellwand mit Lysozym und Fällung der Proteine mit CTAB gewonnen. Die Reinheit der

DNA wurde durch ein 0.5 % Agarose Gel überprüft. Die präparierte genomische DNA war

hochmolekular und intakt.

Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer bei 4°C aufbewahrt.

5.3.2 Genisolierung und Klonierung des malic enzymes im recPhe-pKK-223-3

Für die Amplifikation des malic enzymes aus der genomischen DNA des E. coli K12, wurde

der 5’Forward-Primer aus der bekannten N-Terminus-Sequenz abgeleitet (Mahajan et al.,

1990; Stols & Donnelly, 1997). Da der C-Terminus des NAD-abhängigen malic enzymes aus

E. coli K12 (zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Arbeiten) nicht veröffentlicht war,

wurde mit Hilfe des 5’Forward Primers ein Einzelstrang ampilifiziert, und die genomische

DNA, die als Template im PCR-Ansatz vorlag, mit dem Restriktionsenzym DpnI verdaut.

Somit konnte der Einzelstrang erhalten und gewonnen werden, das dann für eine zweite PCR

verwendet werden konnte. Da die Taq-Polymerase ca. ein Kb pro Minute amplifiziert, wurde

eine Elongationszeit im PCR-Zyklus von 1,7 min gewählt. Somit konnte ein ca. 1,6-1,8 Kb

großer Einzelstrang, der der Größe des malic enzymes entspricht, amplifiziert werden. In

einer zweiten PCR wurden drei Ansätze vorbereitet, bei denen als Primer sowohl der 5’-

Forward-Primer als auch je ein 5’-Reverse-Primer (siehe unten) Verwendung fanden.

1: 5’-Forward: N’-Malic-pst

5’ CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTC 3’

2: 5’-Reverse A

TTATTATTATTATTA

3: 5’-Reverse B

CTACTACTACTACTA

4: 5’-Reverse C

TCATCATCATCATCA

Ergebnisse

71

Konzentration jeweils 100 pmol/µl

Die Primer für den C-Terminus wurden aus den Stopcodons abgeleitet. Da das Stopcodon des

malic enzymes zum Zeitpunkt der Klonierung nicht bekannt war, wurden 3 verschiedene

Primer, denen die 3 Stopcodons entsprechen, konstruiert (2-4). Mit einer Kombinationen aus

dem bekannten 5’-Forward-Primer (1) und je einem Reverse-Primer (5’-ReverseA-C) wurden

3 PCR-Ansätze durchgeführt (Abbildung 31).

Denaturierung 94°C

5'-ForwardAnnealing 59°C

5'-Rev A

5'-Rev B

5'-Rev C

Annealing 50°C

genom. DNA5' 3'

5'3'

5' 3'

5'3'

5' 3'

5' 3'

3'

3'

5'

5'

Amplifizierung 72°C 1,7 min

Verdau der genomischen DNA und Gewinnung des Einzelstranges

5' 3'

5' 3'Kein Produkt

Kein Produkt

malic enzyme

Abbildung 31: Neue PCR-Strategie zur Amplifikation des malic enzymes. Es wurde ein Einzelstrang amplifiziert, der als Template für eine zweite PCR dient.

Ergebnisse

72

Da das Triplett für die Stopcodons mehrmals im Gen vorkommt, wurden durch diese Methode

bei der Amplifikation des Einzelstranges entsprechend mehrere Fragmente amplifiziert.

Aufgrund der bekannten Größe des malic enzyme-Gens konnte ein Fragment aus dem Gel

isoliert und für die Ligation eingesetzt werden. Die restlichen Banden sind Teilfragmente vom

malic enzyme.

Mit dieser vollkommen neuen Methode konnte ein doppelsträngiges Fragment amplifiziert

werden, das dann an der SmaI-Schnittstelle im pUC18 blunt ends ligiert und sequenziert

wurde.

Abbildung 32: DNA-Sequenz des malic enzymes aus E. coli K12.

1 ATGGATATTC AAAAAAGAGT GAGTGACATG GAACCAAAAA CAAAAAAACA GCGTTCGCTT 61 TATATCCCTT ACGCTGGCCC TGTACTGCTG GAATTTCCGT TGTTGAATAA AGGCAGTGCC 121 TTCAGCATGG AAGAACGCCG TAACTTCAAC CTGCTGGGGT TACTGCCGGA AGTGGTCGAA 181 ACCATCGAAG AACAAGCGGA ACGAGCATGG ATCCAGTATC AGGGATTCAA AACCGAAATC 241 GACAAACACA TCTACCTGCG TAACATCCAG GACACTAACG AAACCCTCTT CTACCGTCTG 301 GTAAACAATC ATCTTGATGA GATGATGCCT GTTATTTATA CCCCAACCGT CGGCGCAGCC 361 TGTGAGCGTT TTTCTGAGAT CTACCGCCGT TCACGCGGCG TGTTTATCTC TTACCAGAAC 421 CGGCACAATA TGGACGATAT TCTGCAAAAC GTGCCGAACC ATAATATTAA AGTGATTGTG 481 GTGACTGACG GTGAACGCAT TCTGGGGCTT GGTGACCAGG GCATCGGCGG GATGGGCATT 541 CCGATCGGTA AACTGTCGCT CTATACCGCC TGTGGCGGCA TCAGCCCGGC GTATACCCTT 601 CCGGTGGTGC TGGATGTCGG AACGAACAAC CAACAGCTGC TTAACGATCC GCTGTATATG 661 GGCTGGCGTA ATCCGCGTAT CACTGACGAC GAATACTATG AATTCGTTGA TGAATTTATC 721 CAGGCTGTGA AACAACGCTG GCCAGACGTG CTGTTGCAGT TTGAAGACTT TGCTCAAAAA 781 AATGCGATGC CGTTACTTAA CCGCTATCGC AATGAAATTT GTTCTTTTAA CGATGACATT 841 CAGGGCACTG CGGCGGTAAC AGTCGGCACA CTGATCGCAG CAAGCCGCGC GGCAGGTGGT 901 CAGTTAAGCG AGAAAAAAAT CGTCTTCCTT GGCGCAGGTT CAGCGGGATG CGGCATTGCC 961 GAAATGATCA TCTCCCAGAC CCAGCGCGAA GGATTAAGCG AGGAAGCGGC GCGGCAGAAA 1021 GTCTTTATGG TCGATCGCTT TGGCTTGCTG ACTGACAAGA TGCCGAACCT GCTGCCTTTC 1081 CAGACCAAAC TGGTGCAGAA GCGCGAAAAC CTCAGTGACT GGGATACCGA CAGCGATGTG 1141 CTGTCACTGC TGGATGTGGT GCGCAATGTA AAACCAGATA TTCTGATTGG CGTCTCAGGA 1201 CAGACCGGGC TGTTTACGGA AGAGATCATC CGTGAGATGC ATAAACACTG TCCGCGTCCG 1261 ATCGTGATGC CGCTGTCTAA CCCGACGTCA CGCGTGGAAG CCACACCGCA GGACATTATC 1321 GCCTGGACCG AAGGTAACGC GCTGGTCGCC ACGGGCAGCC CGTTTAATCC AGTGGTATGG 1381 AAAGATAAAA TCTACCCTAT CGCCCAGTGT AACAACGCCT TTATTTTCCC GGGCATCGGC 1441 CTGGGTGTTA TTGCTTCCGG CGCGTCACGT ATCACCGATG AGATGCTGAT GTCGGCAAGT 1501 GAAACGCTGG CGCAGTATTC ACCATTGGTG CTGAACGGCG AAGGTATGGT ACTGCCGGAA 1561 CTGAAAGATA TTCAGAAAGT CTCCCGCGCA ATTGCGTTTG CGGTTGGCAA AATGGCGCAG 1621 CAGCAAGGCG TGGCGGTGAA AACCTCTGCC GAAGCCCTGC AACAGGCCAT TGACGATAAT 1681 TTCTGGCAAG CCGAATACCG CGACTACCGC CGTACCTCCA TCTAA

Ergebnisse

73

1 MDIQKRVSDM EPKTKKQRSL YIPYAGPVLL EFPLLNKGSA FSMEERRNFN LLGLLPEVVE

61 TIEEQAERAW IQYQGFKTEI DKHIYLRNIQ DTNETLFYRL VNNHLDEMMP VIYTPTVGAA

121 CERFSEIYRR SRGVFISYQN RHNMDDILQN VPNHNIKVIV VTDGERILGL GDQGIGGMGI

181 PIGKLSLYTA CGGISPAYTL PVVLDVGTNN QQLLNDPLYM GWRNPRITDD EYYEFVDEFI

241 QAVKQRWPDV LLQFEDFAQK NAMPLLNRYR NEICSFNDDI QGTAAVTVGT LIAASRAAGG

301 QLSEKKIVFL GAGSAGCGIA EMIISQTQRE GLSEEAARQK VFMVDRFGLL TDKMPNLLPF

361 QTKLVQKREN LSDWDTDSDV LSLLDVVRNV KPDILIGVSG QTGLFTEEII REMHKHCPRP

421 IVMPLSNPTS RVEATPQDII AWTEGNALVA TGSPFNPVVW KDKIYPIAQC NNAFIFPGIG

481 LGVIASGASR ITDEMLMSAS ETLAQYSPLV LNGEGMVLPE LKDIQKVSRA IAFAVGKMAQ

541 QQGVAVKTSA EALQQAIDDN FWQAEYRDYR RTSI

Abbildung 33: Proteinsequenz des malic enzymes aus E. coli K12 abgeleitet von der DNA-Sequenz.

Die Proteinsequenz des malic enzymes aus E.coli wurde mit verschiedenen Sequenzen aus

der Datenbank „National Center for Biotechnology Information“ verglichen (Abbildung 34)

und hohe Homologie festgestellt. Dabei konnten unterschiedliche Sequenzbereiche der

einzelnen Proteine in der Datenbank der „National Center for Biotechnology Information“ als

charakteristisch für malic enzyme identifiziert werden. Eine starke Homologie findet man in

der Coenzym-Bindungsstelle des malic enzymes verschiedener Ursprünge. 10 20 30 40 50 60 | | | | | | NADP_Salmonella ---------MDEQLKQSALDFHEFPVPGKIQVSPTKPLATQRDLALAYSPGVAAPCLEIE NADP_Ecoli ------------------------------------------------------------ Mdh_Pasteurella ---------MDAQLRQAALDFHEFPTPGKIEVTPTKSLATQRDLALAYSPGVAVPCLEIQ NAD_Brucella MTKKPSSPSTRSDFDEAALFFHRYPKPGKLEIQATKPLGNQRDLALAYSPGVAAPCLAIH NAD_Ecoli --------------------MDIQKRVSDMEPKTKK----QRSLYIPYAGPVLLEFPLLN 70 80 90 100 110 120 | | | | | | NADP_Salmonella KDPLAAYKYTARGNLVAVISNGTAVLGLGNIGALAGKPVMEGKGVLFKKFAGIDVFDIEV NADP_Ecoli ------------------------------------------------------------ Mdh_Pasteurella ADPAASYRYTSRGNLVAVISNGTAVLGLGNIGALAGKPVMEGKGVLFKKFAGVNVFDIEI NAD_Brucella DDPATAAEYTARGNLVAVVSNGTAVLGLGNIGALASKPVMEGKAVLFKKFADIDVFDIEI NAD_Ecoli KGSAFSMEERRNFNLLGLLP-----EVVETIEEQAERAWIQYQG--FKTEIDKHIYLRNI 130 140 150 160 170 180 | | | | | | NADP_Salmonella DELDPDKFINVVAALEPTFGGINLEDIKAPECFYIEQKLRERMNIPVFHDDQHGTAIIST NADP_Ecoli --------------------------------------------------DQHGTAIIST Mdh_Pasteurella DERDPDKLVDIIASLEPTFGGINLEDIKAPECFYIEQKLRERMKIPVFHDDQHGTAIISA NAD_Brucella DAHEINRIVDVVSALEPTFGGINLEDIKAPECFEVEEQLRERMNIPVFHDDQHGTAIIVA NAD_Ecoli QDTNETLFYRLVNNHLDEMMPVIYTPTVGAACERFSEIYRRSRGVFISYQNRHNMDDILQ ::*. *

Ergebnisse

74

190 200 210 220 230 240 | | | | | | NADP_Salmonella AAILNGLRVVEKNISDVRMVVSGAGAAAIACMNLLVALGMQKHNIVVCDSKGVIYKGREP NADP_Ecoli AAILNGLRVVEKNISDVRMVVSGAGAAAIACMNLLVALGLQKHNIVVCDSKGVIYQGREP Mdh_Pasteurella AAILNGLRIVKKDIAKVKLIASGAGAASIACLNLLVSLGLPRENIIVCDSKGVIFHGRDE NAD_Brucella SAVLNGLELAGKKIEEAKIVTSGAGAAALACLNLLVNLGAKRENIWVCDIEGVVYDGRNT NAD_Ecoli NVPNHNIKVIVVTDGERILGLGDQGIGGMGIPIGKLSLYTACGGISPAYTLPVVLDVG-- . :.:.: . : .. * ..:. : * .* . *: . 250 260 270 280 290 300 | | | | | | NADP_Salmonella NMAETKAAYAVDDSGKRTLDEVIDGADIFLGCSGPKVLTQEMVKKMARAPMILALANPEP NADP_Ecoli NMAETKAAYAVVDDGKRTLDDVIEGADIFLGCSGPKVLTQEMVKKMARAPMILALANPEP Mdh_Pasteurella RMDETKKLYAIEDNGKRTLAEVINDADIFLGCSAAGTLTQDMVKTMAANPLILALANPDP NAD_Brucella LMDRWKEVYAQKTD-ARTLADVIGGADVFLGLSAAGVLKPELLKQMAEKPLIMALANPKP NAD_Ecoli -----------------TNNQQLLNDPLYMGWRNPRITDDEYYEFVD--EFIQAVKQRWP * : : . :::* . : : : :* *: : * 310 320 330 340 350 360 | | | | | | NADP_Salmonella EILPPLAKEVRPDAIICTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVGATAINEEMKLAAVRAI NADP_Ecoli EILPPLAKEVRPDAIICTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVGATAINEEMKLAAVRAI Mdh_Pasteurella EILPPLAKAVRPDAIVCTGRSDYPNQVNNVLCFPFIFRGALDVSATAINEEMKLAAVHAI NAD_Brucella EIMPEEARAARADAMICTGRSDFPNQVNNVLCFPYIFRGALDVGATVINEEMKLAAVRAI NAD_Ecoli DVLLQFEDFAQKNAMPLLNR------YRNEICS---FNDDIQGTAAVTVGTLIAASRAAG ::: .: :*: .* .* :* *.. :: *:. : *: * 370 380 390 400 410 420 | | | | | | NADP_Salmonella AELAHAEQSEVVASAYGDQDLSFGPEYIIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMDSGVATRPIA NADP_Ecoli AELAHAEQSEVVASAYGDQDLSFGPEYIIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMESGVATRPIA Mdh_Pasteurella ADLALAEQSEVVTSAYGETELSFGPEYLIPKPFDPRLIVKIAPAVAKAAMDSGVATRPIK NAD_Brucella ASLAREEPSDVAARAYSGDTPTFGPDYIIPSPFDQRLILRIAPAVAKAAMETGVATRPIE NAD_Ecoli GQLSEKKIVFLGAGSAG---------------------CGIAEMIISQTQREGLSEEAAR ..*: : : : : . ** : . : *:: .. 430 440 450 460 470 480 | | | | | | NADP_Salmonella DFDAYIDKLTEFVYKTNLFMKPIFSQARKD--PKRVVLPEGEEARVLHATQELITLGLAK NADP_Ecoli DFDVYIDKLTEFVYKTNLFMKPIFSQARKA--PKRVVLPEGEEARVLHATQELVTLGLAK Mdh_Pasteurella DFDAYIEKLTQFVYKTNLFMKPVFAQAKQN--KKRVLLTDGEESRVLHAVQEIATLGIAT NAD_Brucella DMEAYLDRLNRFVFRSGLIMKPVFAAARTQGAPMRVIYADGEDERVLRAAQVVIEERIAA NAD_Ecoli QKVFMVDRFGLLTDKMPNLLP--FQTKLVQ---KRENLSDWDTDSDVLSLLDVVRN-VKP : :::: :. : :: * * .: : : : : : 490 500 510 520 530 540 | | | | | | NADP_Salmonella PILIGRPSVIEMRIQKLGLQIKAGVDFEIVNNESDPRFKEYWSEYYQIMKRRGVTQEQAQ NADP_Ecoli PILIGRPNVIEMRIQKLGLQIKAGVDFEIVNNESDPRFKEYWTEYFQIMKRRGVTQEQAQ Mdh_Pasteurella PILLGRPSVIAQKIKQLGLHIQEGRDFELVDIENNPYFEECYKTYHNLLKRKGITPAGAQ NAD_Brucella PILVGRPQVVETRLRRYGLKIRPGTDFELINPEDDPRYRDYVDLYLSYTGRQGVTPEAAR NAD_Ecoli DILIGVSGQTGLFTEEIIREMHKHCPRPIVMPLSNP------------------T----- **:* . .. .:: :: .:* * 550 560 570 580 590 600 | | | | | | NADP_Salmonella RAMIGNHTAIGAIMVQRGEADAMICGTIGDYHEHFSVVKAVFGYRDGVHTAGAMNALLLP NADP_Ecoli RALISNPTVIGAIMVQRGEADAMICGTVGDYHEHFSVVKNVFGYRDGVHTAGAMNALLLP Mdh_Pasteurella RKMLHNPTVIGATLLQLGKADAMLCGLVGPYASHLSNIKEVIGVQPCVPTPATVNGLVLP NAD_Brucella TIVRTNSTAIAALAVMRDEADAMICGLEGRFERHLRVVRQIIGKVPGIRDYSALSLLISQ NAD_Ecoli ----SRVEATPQDIIAWTEGNALVATGSPFNPVVWKDKIYPIAQCNNAFIFPGIGLGVIA . . : :.:*::. :. :. :

Ergebnisse

75

610 620 630 640 650 660 | | | | | | NADP_Salmonella SGNTFIADTYVNEDPTPEQLAEIAVMAAETVRRFGIEPKVALLSHSNFGSSNSLSASKMR NADP_Ecoli SGNTFIADTYVNDEPDAEELAEITLMAAETVRRFGIEPRVALLSHSNFGSSDCPSSSKMR Mdh_Pasteurella TGNLFITDTFVNHNPTAQELAEITIMAANEVSRFGIEPKVALVSHSNFGTFDDPSAVKMR NAD_Brucella RGALFLTDTYVNAEPDANEIAEMAVLAAREISRFGIEPKAALVSHSNFGSKESASAEKMR NAD_Ecoli SGASRITD-------------EMLMSASETLAQY---S-PLVLNGEGMVLPELKDIQKVS * ::* *: : *:. : :: . ::. ..: : . *: 670 680 690 700 710 720 | | | | | | NADP_Salmonella ETLERVRERAPDLMIDGEMHGDAALVESIRNDRMPDSPLKGAANILVMPNMEAARISYNL NADP_Ecoli QALELVRERAPELMIDGEMHGDAALVEAIRNDRMPDSSLKGSANILVMPNMEAARISYNL Mdh_Pasteurella EVLHLVKEKAPDLIIDGEMHCDVALNEKLRQDIMPDSPLKGAANLLVMPNMEAARISLNL NAD_Brucella QAAAILAEKAPDLESDGEMHGDAALSQTLRDRVFPNSRLKGEANLLVFPNLDAANITLNV NAD_Ecoli RAIAFAVGKMAQQQGVAVKTSAEALQQAIDDNFWQAEYRDYRRTSI-------------- .. : .: . ** : : : . . . : 730 740 750 760 770 | | | | | NADP_Salmonella LRVSSSEGVTVGPVLMGVSKPVHVLTPIASVRRIVNMVALAVVEAQTTPL------ NADP_Ecoli LRVSSSEGVTVGPVLMGVAKPVHVLTPIASVRRIVNMVALAVVEAQTQPL------ Mdh_Pasteurella LQGTATP-ITVGPILMGMNKPVHILTSASSVRRIINMVAIAAANVEPTCK------ NAD_Brucella VKAVTDA-LHVGPILLGATRPAHILTPSVTSRGVVNMTALAVVEALQKNASNRRQN NAD_Ecoli --------------------------------------------------------

Abbildung 34: Alignment der Aminosäuresequenz verschiedener malic enzymes. NADP- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi (Parkhill et al., 2001), Mdh Pasteurella multocida (May et al., 2001), NAD-Brucella melitensis (DelVecchio et al., 2002), NADP-E.coli (Blattner et al., 1997).

5.4 Konstruktion eines Expressionsvektors mit heterologer Expression

Aus der Sequenz des amplifizierten Fragmentes (Abbildung 32) wurden Primer mit

integrierten Restriktionsschnittstellen und ein Codon für die ribosomale Bindungsstelle

konstruiert. Nach der Amplifikation des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18

wurde das PCR-Fragment in den rekombinanten recPhe-pKK-223-3-Expressionsvektor hinter

der PheDH-Sequenz an der PstI und HindIII-Restriktionsschnittstellen kloniert (Abbildung 35

und Abbildung 37).

Abbildung 35: Konstruktion des Plasmids für eine heterologe Expression zur L-Phe Synthese mittels Ganzzellumsetzung.

RBS ATG PheDH TAG RBS ATG ME TAA

PstI HindIII

Ptac

Ergebnisse

76

5’-Forward: N’-Malic-pst

5’ CTGCAGAGCCCAGGGATGGATATTCAAAAA 3’

Konzentration 100 pmol/µl

5’-Reverse: C’-Malic-Hin

5’ AAGCTTTTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTC 3’

Konzentration 100 pmol/µl

In Tabelle 9 sind die Konzentrationen aufgeführt, die für die Isolierung des malic enzyme-

Gens erforderlich sind.

Tabelle 9: PCR Protokoll zur Amplifizierung des malic enzymes aus dem rekombinanten pUC18-Plasmid. Variiert wurden die Konzentrationen der Template-DNA.

Template DNA

recpUC18

N’-Malic-pst

Prim 1

C’-Malic-Hin

Prim 2

dNTP Puffer Taq-Polymerase H2O

50ng/µl 1µl 1µl 2µl 10µl 1µl 83µl



Ein Zyklus besteht aus:

Denaturierungsschritt : 94°C

Annealingschritt: 59°C

Amplifizierungsschritt: 72°C

Abbildung 36: PCR-Ausbeute des malic enzyme-Gens bei verschiedenen Konzentrationen an Template-DNA (rec-pUC18).

1 2 3 1.6kb 1 kb

1: 10ng Template 2: 25 ng Template 3: 50 ng Template

Ergebnisse

77

Abbildung 37: Vektorkarte des rec-pKK-223-3 PheDH-malic. malic enzyme wurde 3’ zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle mit eigener Ribosomenbindungsstelle kloniert.

Das neue Konstrukt des rekombinanten Plasmids wurde in kompetente E. coli-Zellen JM 105

bzw. HB 101 transformiert.

Mit der Klonierung des malic enzyme 3’ zur PheDH an der Pst1- und HindIII-Schnittstelle

mit eigener ribosomalen Bindungsstelle konnte eine Expression beider Enzyme gleichzeitig

erfolgen.

5.4.1 Coexpression der PheDH und des malic enzymes

Von den positiven Klonen wurden einige zur Expression ausgewählt. Eine Einzelkolonie der

jeweiligen Klone wurde in 5 ml LBamp –Medium überimpft, und nach Erreichen von OD580 =

0,6 mit 1 mM IPTG induziert. Die Induktion erfolgte über Nacht und die geernteten Zellen

wurden mit Ultraschall aufgeschlossen.

pstI

Ergebnisse

78

Der rekombinante Stamm HB101 zeigt eine malic enzyme- Aktivität von 100 U/ml und

ebenso eine PheDH –Aktivität von 130 U/ml. Die Aktivität beider Enzyme im rekombinanten

Stamm JM 105 ist eindeutig höher und liegt bei ~ 600 U/ml für malic enzyme und ~1200

U/ml für die PheDH.

Die beiden rekombinanten Stämme wurden im 10 L Fermenter kultiviert und die Aktivität

beider Enzyme bestimmt.

Tabelle 10: Aktivitätsbestimmung der exprimierten Enzyme in einem 10 L Fermenter mit LB-Medium als batch-Fermentation.

Aktivität PheDH Aktivität malic enzyme

(U/ml) (U/mg) (U/ml) (U/mg)

E. coli HB101 400 33 220 22

E. coli JM105 1300 118 640 71

Aus den Daten der Expression (Tabelle 10) ist zu entnehmen, dass der E. coli Stamm JM 105

deutlich bessere Aktivität für beide Enzyme zeigt, daher wurden alle weiteren Versuche mit

diesem Stamm durchgeführt.

Die Qualität der Expression hängt unter anderem vom Alter der kompetenten Zellen ab, die

dafür eingesetzt werden. Ebenso spielt die Behandlung in der Herstellung von kompetenten

Zellen eine große Rolle bei der Expression. Beide kompetente Stämme, sowohl JM 105 als

auch HB 101, wurden gleichzeitig hergestellt. Daher sind Fehler, die auf o.g. Faktoren

zurückzuführen sind, ausgeschlossen.

5.4.2 Optimierung der Aktivität

Um die maximale Aktivität der erhaltenen Rohextrakte ausschöpfen zu können, wurden

mehrere Parameter untersucht und variiert.

Beide heterolog exprimierten Enzyme zeigen bei unterschiedlichen Bedingungen beste

Stabilitätseigenschaften. Von Interesse war es, die optimalen Eigenschaften für beide Enzyme

im gleichen System zu ermitteln. Die nachfolgenden Versuche wurden mit Blick auf diese

Tatsache durchgeführt.

Ergebnisse

79

??Optimierung des Aufschlusspuffer

1 g Zellen JM105 wurde in 0,1 M Tris- bzw. 0,1 M Kpi-Puffer mit/ohne BSA (1,5 g/l) 30 %ig

aufgeschlossen. Der Aufschluss erfolgte mit Ultraschall bei 70 cont. Cycles. Zusätzlich zu den

Puffern wurden 1,5 g/l BSA zur Stabilisierung der Enzyme zugegeben.

Tabelle 11: Aktivitätsvergleich in Abhängigkeit des Aufschlusspuffers

0,1M Tris 0,1M Kpi

- BSA + BSA - BSA + BSA

PheDH 520 U/ml 610 U/ml 730 U/ml 1100 U/ml

malic enzyme 430 U/ml 720 U/ml 320 U/ml 610 U/ml

Der Zusatz an BSA führte in beiden Fällen zu einer Steigerung der Aktivität. Ebenso

beeinflusste der Aufschluß-Puffer die Aktivitäten. Hierbei war zu beobachten, dass der

geeignete Aufschluß-Puffer für die einzelnen Enzyme verschieden war. Der Kpi-Puffer war

für die PheDH besser geeignet als für das malic enzyme, da aber die Aktivitätsabnahme des

malic enzymes im Kpi-Puffer relativ gering war, wurden die rekombinanten Zellen nach der

heterologen Expression weiterhin in diesem Puffer aufgeschlossen.

??Aufschlussdauer zur Untersuchung der Stabilität

Ebenso wurde die Aufschlussdauer überprüft und der kritische Punkt zur Stabilität der

Enzyme während dieses Vorganges bestimmt. Aus den Daten in Abbildung 38 ist die

optimale Aufschlussdauer zu entnehmen.

Ergebnisse

80

0

400

800

1200

1600

60secx2 30secx4 30secx8

Aufschlusszeit (Sec)

Akt

ivitä

t (U

/ml)

PheDH

Malic enzyme

Abbildung 38: Stabilitätsbestimmung der PheDH bzw. des malic enzymes nach verschiedenen Aufschlusszeiten mittels Ultraschalls. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30 Sekunden abgekühlt.

Für diesen Versuch wurde folgende Suspension verwendet:

1 g rekombinante Zellen (JM105)

3 ml Kpi-Puffer 0,1 M

Bei längerer Behandlung der Zellen mit Ultraschall nimmt die Aktivität der PheDH drastisch

ab, wogegen die Aktivität des malic enzymes erhalten bleibt. Die idealen Aufschluss-

bedingungen für einen 25 %igen Aufschluß von 1 g rekombinantem E. coli JM105 sind daher

4 x 30 s Ultraschallbehandlung mit zwischenzeitlich 3 x 30s Abkühlung im Eisbad.

Bei längeren Behandlungen mit Ultraschall wird die Probe erhitzt, was zu einer Denaturierung

der Enzyme führen kann. Die Proteinmenge wurde bei diesem Versuch bestimmt und ist aus

Tabelle 12 zu entnehmen.

Ergebnisse

81

Tabelle 12: Proteinbestimmung beider exprimierten Enzymen, PheDH und malic enzyme, nach Variation der Aufschlusszeit. Die Zellen wurden nach einer 60-, 30-sekundigen Behandlung zwischenzeitlich 30Sekunden abgekühlt.

60sec x 2

Spez. Aktivität: U/mg

30sec x 4


30sec x 8


PheDH 30 105 16

malic enzyme 20 90 110

Bei einer Reinigung des malic enzymes bis zur Homogenität konnte eine spezifische Aktivität

von 466 U/mg erreicht werden. Die Reinigungsschritte sind in Tabelle 13 zusammengefasst.

Tabelle 13: Aufreinigung des rekombinanten malic enzymes

Volumen(ml) Aktivität(U) Protein(mg) Spez.Aktivität(u/mg) Ausbeute(%) Faktor

Ultrazentrifugation 0.6 820 13 63 100 1

Hydroxyapatit 9 470 5 94 57 1.49

Q-Sepharose 7 496 2.1 236 60 3.74

Phenylsepharose 1.9 280 0.6 466 34 7.39

5.4.3 Km-Wertbestimmung

Für das Substrat und das Coenzym des malic enzymes wurden die KM-Werte bestimmt. Die

KM-Werte wurden an homogenen oder partiell gereinigten rec-malic enzyme Proben

bestimmt.

L-Malat: 0,29 mM

NAD+ 0,14 mM

5.4.4 Gekoppelte L-Phenylalanin Synthese unter Regeneration des Coenzyms

NADH

Wichtige Faktoren für eine gekoppelte Reaktion sind das pH-Optimum sowie die

Temperaturstabilität der beiden Enzymen. Zusätzlich zu der Stabilität der Enzyme spielen

weitere Faktoren wie z.B. der Einfluss der verschiedenen Substrate auf die Enzyme eine

Rolle.

Ergebnisse

82

In Bezug auf das pH-Optimum wurde eine Kinetik durchgeführt und die pH-Abhängigkeit der

Synthese bestimmt. In Abbildung 39 ist die Zunahme der Aktivität bei steigendem pH-Wert

zu entnehmen, wobei für die Synthese aus Gründen der Coenzymsstabilität ein pH-Wert von

8.0 ausgewählt wurde, in dem beide Enzyme zwar nicht die höchste Aktivität zeigen, aber bei

dem das Coenzym stabil bleibt.

pH-Optimum

0102030405060708090

100

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5

pH-Wert

Akt

ivitä

t (%

)

malic enz.PheDH

Abbildung 39: pH-Optimum von malic enzyme und der PheDH. Die Aktivität beider Enzyme nimmt bei Zunahme des pH-Wertes zu. Die Messungen wurden mit partiell gereinigtem Enzym durchgeführt. Für die Phenylalanin Dehydrogenase wurde die reduktive Aminierung gemessen.

Ergebnisse

83

Ein zweiter Faktor für die gekoppelte Enzymreaktion ist die geeignete Temperatur

(Abbildung 40), bei der beide Enzyme für längere Zeit stabil erhalten bleiben. Daher wurde

ein weiterer Versuch zur Bestimmung des Temperaturoptimums durchgeführt.

Temperatur-Optimum

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

20 25 30 35 40 45 50

Temperatur(°C)

Akt

ivitä

ten

(%) malic enz.

PheDH

Abbildung 40: Temperaturoptimum. Die Messungen wurden bei pH 8,5 und in 0,1M HEPES-Puffer durchgeführt.

Wie aus Abbildung 40 zu entnehmen ist, liegt das Temperaturoptimum beider Enzyme bei

50°C. Bei 30°C beträgt die gemessene Aktivität nur 60 % davon.

Das malic enzyme ist für längere Zeit bei 45°C stabil. Da die PheDH aber bei diesem

Temperaturwert instabil wird (Abbildung 23), wurden die Synthesen bei 30°C durchgeführt,

damit die Stabilität beider Enzyme sowie des Coenzyms über längere Zeit gewährleistet

werden konnte.

Enzyme erreichen ihre optimale Aktivität im jeweils geeigneten Puffer. Beide Enzyme

wurden mit zwei verschiedenen Puffern in je einem Reaktionsansatz getestet (Tabelle 14).

Ergebnisse

84

Tabelle 14: Vergleich der PheDH- bzw. der malic enzyme-Aktivität in verschiedenen Reaktionspuffern. Die Aktivitäten sind in Prozent vom Optimalen zu sehen.

0,1M HEPES-Puffer (pH 8.0) 0,1M Tris-Puffer (pH 8.0)

PheDH 84 % 100 %

malic enz. 100 % 42 %

Da die Aktivität der PheDH in HEPES-Puffer nicht erheblich abnimmt, wurde die gekoppelte

Enzymreaktion in diesem Puffer durchgeführt.

Mit der Bestimmung der Puffer-, pH- und Temperatur-Werte konnten geeignete Bedingungen

und Medien für die Synthese von Phenylalanin durch eine gekoppelte Enzymreaktion mit

Regeneration des Coenzyms ausgewählt werden.

Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM Ammoniumsulfat, 100 mM HEPES-

Puffer, 70 mM L-Malat, 2 mM NAD+, 2 mM Mg 2+, 25U PheDH (partiell gereinigt) und 30U

malic enzyme. Die Proben werden mittels HPLC analysiert (Abbildung 41).

Abbildung 41: HPLC-Analytik zur Nachweis von in situ Regenerationsystems gebildeten L-Phenylalanin.

Die Synthese wurde über mehrere Stunden verfolgt (Abbildung 42). Nach 4 h waren ca. 50 %

des eingesetzten Substrates Phenylpyruvat zu L-Phenylalanin umgesetzt.

L-Phenylalanin

Ergebnisse

85

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Inkubationszeit (h)

L-P

he (

%)

bezo

gen

auf K

onz.

Phe

Pyr

Abbildung 42: Bildungskinetik für L-Phe. Die Bildung von L-Phe wurde in situ durchgeführt.

5.5 Ganzzellumsetzung

Ein wesentlicher Vorteil der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation,

möglicherweise Reinigung der Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet

werden kann. Als neue Parameter, die bei ganzen Zellen berücksichtigt werden müssen,

kommen jetzt allerdings Transportprozesse durch die Zellmembran hinzu. Ein weiterer zu

beachtender Faktor im Vergleich zur Verwendung isolierter Enzyme betrifft die

Metabolisierung von Substraten.

Als Standard- Ansatz für die Ganzzellumsetzung wurde folgendes Medium verwendet:

0.1 M HEPES-Puffer (pH 8.0)

40 mM Phenylpyruvat

0.1 M L-Malat

0.1 M Ammoniumsulfat

2 mM MgCl2

Die Umsetzung erfolgte bei 30°C und mit 1g rekombinanten E.coli-Zellen. Das gebildete

Phenylalanin wurde mittels HPLC nachgewiesen (Abbildung 43).

Ergebnisse

86

-2,5

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 42,0

mV

min

OPA-IBC #86 0,2 Sd Int_Chan_1

1 - 5,190

2 - L-Phe - 22,302

3 - 29,334

4 - 30,402

5 - 32,240

6 - 33,157

Abbildung 43: Produktnachweis nach einer 5 stündigen Umsetzung mit ganzen rekombinanten E. coli Zellen.

Die Bildung von L-Phe durch rekombinante E.coli –Zellen wurde über 20 h verfolgt und die

Ausbeute bestimmt (Abbildung 44).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Inkubationsszeit (h)

L-P

he B

ildun

g (%

)

Abbildung 44: Ganzzellumsetzung zur Produktion von L-Phe. Die Bestimmung von L-Phe erfolgte mittels HPLC.

L-Phenylalanin

Ergebnisse

87

Eine Metabolisierung des entstandenen Produktes L-Phe konnte nach 20h Inkubation nicht

nachgewiesen werden.

5.6 Gezielte Mutagenese

Im Rahmen der Dissertation sollten weiterhin PheDH- Mutanten erzeugt werden, die ein

deutlich verändertes Substratspektrum als das der PheDH aufweisen.

Als Ausgangsgen für eine Mutagenese zur Amin- bzw. Lactat- Dehydrogenase wurde das

Phenylalanin Dehydrogenase - Gen aus den folgenden Gründen ausgewählt:

??Gen ist verfügbar

??gutes Expressionsystem verfügbar

??Enzym zeigt eine hohe Aktivität (>2000 U/ml, 250 U/mg)

??Raumstruktur bekannt

??breites Substratspektrum

??Ergebnisse übertragbar auf LeuDH, AlaDH, GluDH

In Abbildung 45 ist der Reaktionsmechanismus der PheDH katalysierten reduktiven

Aminierung von Phenylpyruvat dargestellt.

COOH

O

NH4+

PheDH

NADH +

COOH

NH2

H2O

NAD+Phenylpyruvat L-Phenylalanin

Abbildung 45: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylalanin mittels PheDH.

Für die Durchführung einer gezielten Mutagenese wurde die räumliche Struktur der PheDH

mittels Computereinsatz modelliert und die Position des Substrates bestimmt (Abbildung 3).

Ziel ist die Erweiterung des Substratspektrums durch den Austausch von Lysin 66 durch

weitere Aminosäuren, die sowohl in Größe, Hydrophobizität als auch Ladung variieren.

Durch eine gezielte Mutagenese von Lysin 66 gegen Isoleucin bzw. Arginin sowie Lysin 78

gegen Isoleucin wurde versucht, der Phenylalanin Dehydrogenase neue Aktivitäten auf

weitere Substrate (Tabelle 15) zu verleihen. Die Lysinreste an Position 66 und 78 sind im

Ergebnisse

88

aktiven Kanal der PheDH lokalisiert. Interessant ist dieses, da Lysin 66 die Bindungsstelle für

die Carboxylgruppe und Lysin 78 für die Ketogruppe im Substrat sind (Vanhooke et al.,

1999). Für die Umsetzung ähnlicher Substrate, welche aber eine Methylgruppe anstatt

Carboxylgruppe besitzen, könnte der Austausch des basischen Lysins gegen eine neutrale

Aminosäure wie z.B. Isoleucin zum Erfolg führen.

Tabelle 15: Möglichkeiten zur Substratumsetzung nach einer Mutagenese. Durch den Austausch des Lysins in Isoleucin (neutrale Aminosäure) könnte die Methylgruppe des Ketons akzeptiert werden und somit das Keton zum Amin umsetzen. Es wird eine direkte Hydrierung der Ketosäure zur Hydroxysäure bei einer Mutagense des Lysin 66 in Arginin erwartet.

Substrat Produkt

Keton = Substrat

CH3

O

Reduktive Aminierung des Phenylacetons

Amin

CH3

NH2

Ketosäure = Substrat

COOH

O

Reduktion der Ketosäure Phenylpyruvat

Hydroxysäure

COOH

OH

5.6.1 Mutation des Lysin 66

Um eine veränderte Phenylalanin Dehydrogenase herstellen zu können, musste die Sequenz

auf DNA-Ebene verändert werden. Die gezielte Mutagenese erfolgte nach dem Prinzip der

überlappenden PCR (Ho et al., 1989). Hierbei wurden Primer verwendet, die zwei DNA-

Fragmente mit überlappenden Enden erzeugten. In einer zweiten PCR hybridisierten diese

Fragmente, wobei das überlappende 3’-Ende jedes Stranges als Primer für die Synthese des

Gegenstranges diente (Abbildung 46). Die Mutationen, die in die Oligonucleotid-Primer

eingeführt wurden, fanden sich zu 100 % im Produkt wieder. Das resultierende Fusions-

produkt wurde durch weitere PCR mit den „äußeren“ Primern, die den gesamten Bereich

einschließen, amplifiziert.

Ergebnisse

89

5'

5'

5'Templat-DNA

*

* 5'P1'

K66

P1P2

P2'

2.Produkt

1.Produkt ** 5'

5'PCR mit den PrimernP2+P2'

PCR mit denPrimern P1+P1'

PCR mit denPrimern P1+P2'und Produkt 1+2als Template

* 5'

5'Fusionsprodukt

Abbildung 46: Schema zur Mutagenese mittels PCR nach der Methode der „overlapping extension“, ausgetauscht wurde das Lysin 66 gegen Isoleucin.

Mittels dieser Technologie wurde die Aminosäure Lysin 66 gegen Isoleucin ausgetauscht.

Das erhaltene mutierte DNA-Fragment wurde „blunt ends“ in den pKK-223-3 an der SmaI-

Schnittstelle kloniert (Abbildung 47). Die Auswahl dieses Plasmids und die Klonierung an der

SmaI- Schnittstelle, die etwa 13 bp von der Ribosomenbindungsstelle entfernt ist, wurde zur

Vermeidung von inclusion bodies gewählt, da bei Klonierungen der PheDH in anderen

Plasmiden solche aufgetreten sind (5.1.5.3).

Ergebnisse

90

pKK-PheDHStop

K66

PheDH

PCR der Teilfragmente/überlappendePCR

* Mutation K66I

Stop

SmaI

SmaIpUC18 SmaI 2.8 kb

Ligation und Transformationin E.coli Xl1-blueIsolierung des PlasmidsSequenzierung

SmaI

SmaIpKK223-3 SmaI 4.8kb

Mutation K66I

Stop*Ligation

pKK-PheDH-K66I

Stop

K66I

PheDH-K66I

2.Produkt

1.Produkt **

5' K66I

K66I

Zweites PCR mit den äußeren Primern

Bluntends

Restriktion mit EcoRI/BamHIIsolierung des Fragmentesund der Behandlung mit Klenow

5' 3'

Abbildung 47: Klonierungsstrategie zur Einführung der Mutation PheDHK66I. Im ersten Schritt wurden zwei Fragmente amplifiziert, die die gleiche Mutation tragen; beim zweiten Schritt hybridisierten sie zum ganzen Gen. Somit konnte das amplifizierte Gen in den Expressionsvektor ligiert werden.

Ergebnisse

91

Auswahl der Primer

Dass Codons, die für die gleiche Aminosäure codieren, in den einzelnen Spezies

unterschiedlich häufig verwendet werden, liegt an der unterschiedlichen Basenzusammen-

setzung in den DNAs verschiedener Organismen (Sharp et al., 1988). Selbst innerhalb eines

Organismus existieren zum Teil beträchtliche Unterschiede zwischen der Codonnutzung in

Genen, die stark exprimiert werden, und solchen, die weniger häufig exprimiert werden.

Diese Unterschiede können zur Genregulierung genutzt werden. Es gibt z.B. für selten

genutzte Codons in der E. coli-Zelle auch nur geringere Mengen der passenden tRNA. Das

hat zur Folge, dass mRNA von Genen mit vielen „seltenen“ Codons auch verzögert

translatiert wird (Grantham et al., 1981). Dies ist bei mutierten Proteinen, die überexprimiert

werden sollen, nicht erwünscht.

Die ausgesuchten Codons wurden hinsichtlich dieses Kriteriums, wie oft dieses Codon in der

Wt-PheDH genutzt wird, überprüft.

Für den Austausch von Lysin in Isoleucin wurde das Codon ATT unter Berücksichtigung der

Codon-Usage von E. coli verwendet.

Mutagenese-Primer

P1': GCT CAC TGC CAT AAT CAA CGT CAT CGC CCC

P2 : GGG GCG ATG ACG TTG ATT ATG GCA GTG AGC

Äußere Primer

P1 : ATC AAG GGG TAC ATC ATG AGT ATC GAC AGC

P2': TTA CTA GGC AGT CGC TGT CGT TGT CGA GGC

Bei der Herstellung der beiden Teilfragmente der PheDH, die die gewünschten Mutationen

tragen, bestand der Reaktionsansatz aus:

10 mM Tris pH 8.3

50 mM KCl

1.5 mM MgCl2


20-40 pmol jedes Oligonucleotid-Primers

2.5 U Taq-Polymerase pro 100 µl Ansatz

Ergebnisse

92

10 ng Plasmid-DNA als PCR-Template (pKK-223-PheDH)

Die PCR Amplifikation wurde auf einem automatischen DNA-Thermal-Cycler (Robocycler,

Fa. Stratagene) nach folgendem Programm durchgeführt:

??3 min Denaturierung bei 94°C (zu Anfang des Programms)


??1 min Annealing der Primer bei 65°C

??1 min Extension (Verlängerung der Primer durch die Taq-Polymerase) bei 72°C

??zyklisches Wiederholen der letzten drei Schritte (25 x)

??5 min Extension (nach Abschluss der Zyklen, um eine vollständige Verlängerung

eventuell vorher abgebrochener DNA-Produkte zu gewährleisten)

Nach der PCR wurden die erhaltenen Fragmente gelelektrophoretisch aufgetrennt und isoliert

(Abbildung 48). Die zweite PCR zur Überlappung der Fragmente enthielt equimolare Mengen

beider Fragmente, wobei von dem kürzeren ca. 60ng eingesetzt wurden (die Menge des

größeren Fragmentes wurde dementsprechend berechnet). Die Annealing- Temperatur richtete

sich nach der Schmelztemperatur der resultierenden Überlappungsregion. Somit konnte ein

großes Fragment von 1,1 kb amplifiziert werden (Abbildung 49).

Alle hergestellten Muteine wurden sequenziert und die Mutationen bestimmt. Die gezielte

Mutagenese nach Ho et al. (Ho et al., 1989) führte in den meisten Fällen sowohl zu niedriger

Ausbeute des gewünschten Produktes als auch zu unerwünschten Mutationen. Nach einer

Optimierung des PCR-Ansatzes in Bezug auf das Verhältnis der zu fusionierenden

Fragmenten sowie der dNTP- Konzentrationen konnten sowohl gute Ausbeuten als auch

gewünschte Mutationen erreicht und unerwünschte Mutationen vermieden werden.

Zur Einführung der Mutationen wurde nicht das ganze PheDH-Gen (1068 bp) amplifiziert,

sondern nur ca. 891 bp bzw. 213 bp große Fragmente und dann hybridisiert und amplifiziert.

Ergebnisse

93

Abbildung 48: Agarosegelanalyse der PCR zur K66I- Mutagenese. Spur 1: kb-Leiter; Spur 2 unspezi-fische Amplifikation der Teilfragmente; Spur 3 und 4 sind gewünschte Amplifikate nach einer Optimierung der PCR- Bedingungen mit einer Größe von ca. 200 bp bzw. 900 bp.

Abbildung 49: Sauberes PCR-Produkt nach der Fusion der beiden Fragmente (Abbildung 48; Bahn 3+4) mit einer Größe von 1.1 kb.

Die nach der zweiten PCR erhaltenen DNA-Fragmente, die die Mutation K66I enthalten

sollten, wurden in den SmaI geschnittenen pUC18 bzw. pKK223-3 kloniert und vollständig

sequenziert.

3 kb

1 kb

1,1 kb-Fusionsprodukt

1 2 3 4

3 kb

1 kb

Ergebnisse

94

Die rekombinanten Klone wurden mittels Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein und die

richtige Orientierung des Inserts geprüft. Mit einem positiven Klon wurde anschließend der

Expressionsstamm JM105 transformiert und das PheDH-Mutein exprimiert.

5.6.2 Sequenzierung der K66I

Das neukonstruierte Mutein wurde sequenziert und den Austausch des Lysin 66 zu Isoleucin

bestimmt.

ATGAGTATCGACAGCGCACTGAACTGGGACGGGGAAATGACGGTCACCCGATTCGACCGGGAGAC

TGGTGCCCATTTCGTCATTCGACTCGATTCGACCCAACTCGGACCGGCGGCCGGAGGCACCAGAGC

CGCACAGTACTCACAGCTGGCGGACGCCCTCACCGACGCCGGCAAATTGGCGGGGGCGATGACGT

TGATTATGGCAGTGAGCAACCTTCCGATGGGCGGGGGCAAATCCGTCATTGCGCTTCCTGCGCCGC

GTCATTCGATCGATCCGAGCACGTGGGCACGCATCCTCCGAATCCACGCCGAGAACATCGACAAGT

TGTCCGGCAACTACTGGACCGGACCGGACGTCAACACCAATTCGGCAGACATGGATACTCTGAACG

ACACCACCGAGTTCGTGTTCGGACGGTCGCTCGAACGCGGCGGCGCGGGTTCGAGCGCGTTCACCA

CCGCCGTTGGCGTGTTCGAGGCGATGAAGGCGACCGTCGCGCACCGTGGGCTGGGCTCACTCGACG

GTTTGACGGTCCTGGTCCAAGGACTGGGGGCAGTCGGAGGATCATTGGCATCCCTGGCCGCCGAAG

CGGGTGCGCAACTCCTGGTGGCAGACACCGACACCGAGCGAGTAGCGCACGCTGTTGCGTTGGGC

CACACAGCGGTTGCCCTCGAGGACGTTCTGTCCACCCCGTGTGATGTCTTCGCACCCTGCGCAATG

GGCGGCGTCATCACCACCGAGGTGGCGCGAACACTCGACTGTTCCGTCGTGGCCGGTGCCGCCAAC

AACGTCATCGCCGACGAGGCCGCCTCGGACATCCTGCACGCACGCGGAATTCTGTACGCTCCCGAC

TTCGTGGCCAACGCCGGCGGTGCCATCCACCTCGTAGGCCGGGAGGTTCTCGGTTGGTCCGAGTCG

GTTGTCCACGAACGAGCAGTTGCCATAGGCGACACCCTGAATCAGGTCTTCGAGATCTCCGACAAC

GACGGCGTCACCCCGGACGAGGCCGCCCGCACTCTCGCTGGACGGCGCGCCCGCGAGGCCTCGAC

AACGACAGCGACTGCCTAGTAA

Abbildung 50: Gensequenz des K66I- Muteins.

5.6.3 Expression der PheDH-Mutante K66I

Da E. coli JM-105 sich als geeigneter Stamm für die Expression der PheDH erwiesen hat,

wurde das neuhergestellte PheDH-Mutein „pKK-223-K66I“ in diesen Stamm transformiert

und zur Expression eingesetzt. Die Anzucht erfolgte in 250 ml LB-amp, induziert wurde mit

1mM IPTG bei einer OD590 von 0,6. Der Aktivitätstest dieses Muteins erfolgte sowohl mit

Phenylpyruvat (um die Restaktivität der PheDH zu überprüfen) als auch für die gewünschte

Aktivität mit Phenylaceton als Substrat.

Erwartungsgemäß besitzt das Mutein keine Aktivität mehr gegenüber Phenylpyruvat als

Substrat. Da die Bindungsstelle Lysin66 im aktiven Zentrum der PheDH zur Carboxylgruppe

Ergebnisse

95

des Phenylpyruvats (Abbildung 51a) durch eine Aminosäure mit neutraler Seitenkette

„Isoleucin“ ausgetauscht (Abbildung 51b) wurde, verlor die PheDH die Aktivität auf

reduktive Aminierung des Phenylpyruvats.

(A) (B)

Abbildung 51: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin 66 durch den Austausch in Isoleucin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin 66 und der Carboxylgruppe des Substrates in der PheDH; (B) Mutein K66I, Lysin wurde gegen Isoleucin ausgetauscht, das keine Wasserstoffbindung zur Carboxylgruppe des Substrates bildet. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt.

Die Aktivität des neukonstruierten Muteins wurde auf eine Aminierung des Phenylacetons

überprüft. In Abbildung 52 ist der Mechanismus der reduktiven Aminierung dargestellt.

CH3

O

+ NH4+

PheDH-Mut

NADH +

CH3

NH2

H2O

NAD++Phenylaceton L-Phenylpropylamin

Abbildung 52: Reaktionsmechanismus der reduktiven Aminierung von Phenylaceton.

Lys78

Ile66

Lys78

Lys66

Phenylpyruvat

NAD+

Ergebnisse

96

Eine Aktivität bezüglich des Phenylacetons konnte nicht nachgewiesen werden. Durch diesen

Austausch konnte zwar die Ladung der Bindungsstelle zum Substrat verändert werden, aber

für die Akzeptanz eines neuen Substrates, könnten neben der Mutagenese von Lysin 66 noch

weitere Aminosäurenaustausche notwendig sein. Da die räumliche Struktur ähnlicher Amin

Dehydrogenasen wie die der gewünschten nicht bekannt sind, war es nicht möglich die

weitere Optimierung durch gezielten Aminosäurenaustausch durchzuführen.

Das Mutein K66I trägt die gewünschte Mutation (5.6.2), trotzdem konnte keine Aktivität

bezüglich Phenylaceton festgestellt werden. Dies könnte konformationsbedingt sein, was zu

der Überlegung führte, die Sequenz dieses Muteins ungezielt mittels Zufallsmutagenese

(directed evolution) zu verändern. Daher wurde dieses Mutein als Template benutzt und für

die weitere Optimierung eingesetzt.

5.6.4 Herstellung weiterer Muteine

Aufgrund der Überlegung, basische Aminosäuren durch neutrale auszutauschen, um eine

Aminosäure Dehydrogenase in eine Amin Dehydrogenase umzuwandeln (zu diesem Zeit-

punkt war die Kristallstruktur noch unbekannt), wurden die Muteine R210I bzw. R140I

hergestellt.

Bei der Expression der Mutante R210I konnte kein aktives Protein nachgewiesen werden. Da

Arginin bei dem benutzten pH-Wert eine positive Ladung aufweist und dadurch Interaktionen

mit anderen Aminosäuren hervorruft, kann ein Abstoßungseffekt bei Austausch gegen eine

neutrale Aminosäure (Isoleucin) auftreten.

Es wurde eine verminderte PheDH-Aktivität (83 % der urprünglichen PheDH-Aktivität gegen

Phenylpyruvat) bei dem exprimierten Protein der Mutante R140I beobachtet. Durch diesen

Austausch konnte die Proteinfaltung verlangsamt und dadurch ein proteolytischer Abbau

begünstigt werden. Vereinfacht: Das Mutein ist für Proteasen angreifbarer. Die gewünschte

Amin Dehydrogenase Aktivität gegenüber Phenylaceton war nicht nachzuweisen.

Das Mutein PheDH-R210I zeigt keine Aktivität, weder die ursprüngliche PheDH Aktivität

noch eine neue Amin Dehydrogenase Aktivität. Obwohl Arginin 210 nicht im aktiven

Zentrum beteiligt ist, führt eine Deletion bzw. Substitution zum Verlust der PheDH-Akitivität.

Ergebnisse

97

5.6.5 Mutation von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 zu Isoleucin

Ein Austausch von Lysin 66 gegen Arginin könnte theoretisch eine direkte Reduktion der

Ketogruppe von Phenylpyruvat verursachen und somit eine Ähnlichkeit zum Lactat

Dehydrogenase-Mechanismus führen (Hart et al., 1987).

Dieser Fall einer direkten Reduktion der Ketogruppe ist bei Lactat-Dehydrogenasen zu

beobachten. Um einen ähnlichen Mechanismus wie bei der Lactat-Dehydrogenase und damit

eine Reduktion der Ketogruppe des Phenylpyruvats durch die PheDH zu erreichen, wurden

die Bindungsstellen zum Substrat beider Enzymen verglichen. In der Lactat Dehydrogenase

ist Arginin für die Bindung der Carboxylgruppe verantwortlich (Luyten et al., 1989),

wogegen in der PheDH wie bei allen Aminosäure-Dehydrogenasen Lysin diesen Part

übernimmt.

Ein weiterer Unterschied ist, dass eine direkte Reduktion der Ketogruppe im Phenylpyruvat

nicht stattfinden kann, weil die Entfernung zwischen dem C4 des Nicotinamidrings und der

Ketogruppe am C? des Phenylpyruvat größer als 6 Å ist. Diese Entfernung wird durch die

Bindung von Lysin 78 sowie Lysin 66 an die Ketogruppe bzw. an die Carboxylgruppe des

Substrates, das dann umorientiert und von NADH entfernt wird, verursacht. Der dadurch

vergrößerte Abstand verhindert einen direkten Hydridtransfer. Infolgedessen entsteht im

ersten Schritt ein Imin, das erst im nächsten Schritt reduziert werden kann (Vanhooke et al.,

1999). Anders als bei der PheDH ist bei der Lactat-Dehydrogenase für die Bindung zur

Ketogruppe des Substrates Histidin verantwortlich. Luyten et al. haben postuliert, dass durch

den Autausch der Aminosäure Arginin 171 (Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Substrat)

in der Lactat-Dehydrogenase gegen eine neutrale Aminosäure, die Reduktion des Substrates

vermieden werden kann. Dieser Austausch Arginin 171 gegen Tyrosin bzw. Tryptophan

führte nicht zur Verlust der LDH –Aktivität. Überraschenderweise war die Aktivität in diesen

zwei Muteinen höher als in einem Mutein mit dem Austausch der basischen Aminosäure

Arginin gegen das basische Lysin (Luyten et al., 1989).

Es besteht eine Ähnlichkeit in der PheDH zur LDH in Bezug auf die Bindung zur

Carboxylgruppe bzw. Ketogruppe des Substrates. Sowohl in der LDH als auch in der PheDH

sind die beteiligten Aminosäuren basisch. Da nach Luyten et al. der Austausch der basischen

Aminosäure (Bindungsstelle für die Carboxylgruppe im Substrat) keinen Einfluss auf die

Orientierung brachte, wurde in dieser Arbeit ebenso die Bindung zur Ketogruppe untersucht.

Durch die Mutation des Lysin 78 gegen Isoleucin könnte obiger Abstand verringert und die

Umorientierung des Substrates verhindert werden, so das eine Hydrierung der Ketogruppe

stattfinden könnte.

Ergebnisse

98

5.6.6 PCR der K66R- Mutanten und deren Klonierung

Zur Klonierung der PheDH Mutante K66R wurde das gesamte Ursprungsplasmid (pKK-223-

3-PheDH-Gen; Abbildung 53) mittels PCR amplifiziert (Deng & Nickoloff, 1992).

pKK-PheDHStop

K66

PCR des gesamtenPlasmids mit Mutagenese-primern

K66R PheDH-GenStop

PheDH

Verdau der methyliertennicht-mutagenisierten parentalenDNA mit DpnIund Transformation der nicked-dsDNAin kompetente E.coliXl1-blue

**

pKK-PheDH-K66R

Stop

K66

Abbildung 53: Klonierungsstrategie der PheDH-Mutanten am Beispiel der PheDH-K66R. Das ganze rekombinante Plasmid wird mittels Mutagenese-Primer amplifiziert und in E.coli-Zellen transformiert.

Ergebnisse

99

Beide Primer beinhalten die gewünschte Mutation.

P1: GCT CAC TGC CAT TCT CAA CGT CAT CGC CCC

P2: GGG GCG ATG ACG TTG AGA ATG GCA GTG AGC

Im Anschluß an die PCR wird die parentale Template-DNA mit dem Restriktionsenzym DpnI

abgebaut. DpnI erkennt ausschließlich methylierte DNA. Die verbliebene mutierte DNA wird

in kompetente E. coli Xl1 Blue bzw. JM105 transformiert, wobei eventuelle Einzel-

strangbrüche vom bakteriellen Reparatursystem behoben werden. Der Anteil mutierter

Plasmide ist ? 80 % (Stratagene).

Positive Klone wurden sequenziert und ein fehlerfreies mutiertes Plasmid zur Expression

eingesetzt.

5.6.7 Aktivitätsnachweis des PheDH-Muteins K66R und K78I

Die Muteine PheDH-K66R und K78I wurden in 200 ml Maßstab kultiviert und die Ex-

pression erfolgte ausschließlich in E. coli JM105. Während die Expression der rec-PheDH

(pKK223-3-PheDH) in E. coli JM105 zu einem Anteil von ca. 13 % PheDH des löslichen

Gesamtproteins führte, beträgt der Anteil der PheDH-K66R nur 10 % und der K78I etwa 4 %

des löslichen Zellproteins.

Das natürliche Substrat der wt-PheDH ist Phenylpyruvat, das mit Zusatz von

Ammoniumionen durch eine reduktive Aminierung zum Phenylalanin umgesetzt wird. Bei

der Aktivitätsbestimmung des Muteins PheDH-K66R bzw. K78I wurde neben der reduktiven

Aminierung auch ein Parallelversuch ohne Ammoniumzusatz durchgeführt, um zu prüfen, ob

eine direkte Reduktion stattfinden kann, was auf einen Reaktionsmechanismus analog der

Lactat Dehydrogenase hinweisen würde.

COOH

O

NADH

PheDH-K66R

COOH

OH

Abbildung 54: Reaktionsmechanismus zur Umsetzung der Ketosäure Phenylpyruvat zur Hydroxysäure Phenyllactat.

Eine Veränderung der PheDH durch den Austausch des Lysin 66 in Arginin führte nicht zur

drastischen Abnahme der PheDH-Aktivität. Bei diesem Mutein K66R waren etwa 90 % der

PheDH Aktivität noch nachweisbar. Die gewünschte Erweiterung des Substratspektrum durch

Ergebnisse

100

gezielte Mutagenese, konnte nicht erreicht werden. Das basische Lysin wurde zwar durch die

Mutagenese durch die basische Aminosäure Arginin ausgetauscht, dies hat aber nicht zu

einem geänderten Reaktionsablauf (Reduktion statt reduktiver Aminierung) geführt.

Durch den Austausch der basischen Aminosäure Lysin gegen eine neutrale Aminosäure im

Mutein K78I, ist die ursprüngliche PheDH- Aktivität verloren gegangen. Die gewünschte

Aktivität mit einem direkten Hydridtransfer konnte ebenso durch diesen Austausch nicht

erreicht werden.

Tabelle 16: Zusammenfassung der hergestellten Mutanten und deren neue Eigenschaften . (O) getestet aber keine Aktivität, ( -) nicht getestet. Die Restaktivität bezieht sich auf der rec-PheDH.

Mutante Reduktive Aminierung

Phenylpyruvat

Reduktion

Phenylpyruvat

Reduktion

Phenylaceton

K 78 I O O -

K 66 R 90 % Restaktivität O O

K 66 I O - O

R 210 I O - O

R 140 I 83 % Restaktivität O O

Ergebnisse

101

5.7 Zufallsmutagenese

In dieser Arbeit wurde bereit die gezielte Mutation der K66I, K66R und K78I beschrieben.

Diese Austausche führten zu keiner Erweiterung des Substratspektrums bzw. detektierbaren

Expression eines aktiven Enzyms. Da die gezielte Mutagenese nicht zu den gewünschten

Aktivitäten geführt hat, wurde eine Zufallsmutagenese durchgeführt. Als Template wurden

sowohl die rekombinante PheDH als auch in einer zweiten Versuchsreihe die Muteine K66I

und K66R als DNA-Template eingesetzt.

Die error-prone PCR-Methode für die Zufallsmutagenese wurde für die Erzeugung der

Mutanten verwendet. Dafür wurde das folgende PCR-Protokoll verwendet:

10 µl 10x Mutagenese Puffer inkl. MgCl2

10 µl 10x Mutagenese-dNTP-mix

0-10 µl 5 mM MnCl2 (0-0.5 mM Endkonz.)

2 fmol Template-DNA (ca. 7.5 ng eines 5.7 kb Plasmid)

je 40 pmol upstream and downstream primer

1µl Taq- Polymerase

ad 100µl Millipor- A-dest

Mit Mineralöl überschichten

Mutagenese Puffer:

70 mM MgCl2

500 mM KCl

100 mM Tris-HCl, pH 8.3 bei 25°C

0,1 %(W/V) Gelatine

Mutagenese dNTP-mix (10x):

2 mM dGTP

2 mM dATP

10 mM dTTP

10 mM dCTP

Mit der Optimierung des PCR-Protokolls und dem Einsatz bestimmter Konzentrationen an

dNTPs bzw. MnCl2 konnten 2-4 Mutationen eingeführt werden. Falsche Konzentrationen an

MgCl2 führten bei der PheDH-Amplifikation aufgrund des GC-Gehaltes zu unkontrollierter

Zahl an Mutationen.

Ergebnisse

102

Es wurden etwa 12.000 Kolonien aus der Zufallsmutagenese sowohl gegen Phenylaceton als

auch Phenylpyruvat getestet. Die Aktivität gegen Phenylpyruvat wurde sowohl bezüglich

reduktiver Aminierung (mit (NH4)2SO4) als auch bezüglich einfacher Reduktion ohne

(NH4)2SO4 überprüft. Aufgrund der hohen Zahl an erzeugten Muteinen wurde ein schneller

Farbtest zum Screening der Klone entwickelt.

5.8 Entwicklung eines Farbtestes als Screeningsmethode

Bei der Zufallsmutagenese produziert man eine große Zahl an Enzymvarianten, die einzeln

auf Aktivität getestet werden müssen. Eine einfache Methode ist eine Überprüfung der

Enzymaktivität direkt in den Zellen. Dafür wurde ein Farbtest entwickelt.

Er beruht auf der Aufnahme und Umsetzung von Farbstoffen durch ganze lebende

Mikroorganismen. Das Ausstreichen bzw. Sprühen von Farbstofflösungen auf Agarplatten mit

Bakterienkolonien führt zur Aufnahme dieses Farbstoffes, der dann umgesetzt wird. Durch

den Farbumschlag, der durch die folgende Umsetzung verursacht wird, können positive

Zellen erkannt werden.

NAD+ bzw. NADP+ -abhängige Enzyme sind durch diese Methode nachweisbar.

Eine Mischung aus INT und PES (siehe unten) wird auf eine Agarplatte, die die zu

untersuchenden Bakterien enthält, gegeben. Das Substrat befindet sich im Agar. Für die

Induktion ist IPTG erforderlich. Nach Zugabe der Farbstofflösung wurde die Agarplatte mit

Öl beschichtet (um die Re-Oxidation des gebildeten reduzierten Tetrazoliums zu vermeiden)

und für 4 Stunden bei 30°C inkubiert. Der Farbstoff wird dadurch aufgenommen und um-

gesetzt. Der Farbumschlag ist ein Nachweis für die Aktivität des Enzyms.

Substrat (L-Phenylalanin) 20 mM

INT (oder TNBT) 25 mg

PES 2 mg/ 100ml Puffer

TEA pH 7.0 50 mM

Ergebnisse

103

Produkt

Edukt

PheDH

NAD+

NADH PES

PESH2

Formazan

INT (Tetrazolium)

Abbildung 55: Reaktionsschema zum Verlauf des Farbtests.

Abbildung 56: Farbtest auf Agarplatten mit ganzen Zellen. Die gelben Zellen enthalten PheDH-Aktivität

Zum Auffinden der gewünschten Mutanten wurde Phenylalanin als Donor zur Reduktion des

Coenzyms NAD+ eingesetzt. Da die in dieser Arbeit hergestellten Mutanten unter anderem

auf Amin-Dehydrogenase Aktivität überprüft werden sollten, konnte diese Methode nicht

eingesetzt werden, da das einzusetzende Substrat Phenylpropylamin nicht kommerziell

erhältlich und die Synthese dieses Substrates nicht etabliert ist.

Die Screeningsmethode wurde für den Nachweis der K66R-Muteine mit Phenyllactat und L-

Phenylalanin als Substrate verwendet.

Ergebnisse

104

5.8.1 K66R –Muteine

Etwa 20.000 durch die Zufallsmutagenese hergestellten Kolonien wurden untersucht und

ca.75% der Kolonien zeigten Expression einer aktiven PheDH. Die neuen Muteine behielten

haben die PheDH-Aktivität und zwei Muteine davon zeigten zusätzlich die gewünschte

Aktivität auf Reduktion von Phenylpyruvat. Die neuen positiven Muteine wurden auf die

Reduktion des Phenylpyruvats ohne Ammoniumionen überprüft, wodurch eine Hydroxysäure

als Produkt entsteht. Einige positiv gescreenten Muteine sind in Abbildung 57 dargestellt.

Phe

DH

Mut

ein1

Mut

ein2

Mut

ein3

Mut

ein4

Mut

ein5

Mut

ein6

Mut

ein7

Mut

ein8

Mut

ein9

Mut

ein1

0

Mut

ein1

1

Phenylpyruvat

Phenylpyruvat+NH4

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

Positive Klone

Phenylpyruvat Phenylpyruvat+NH4

Aktivität (%)

Abbildung 57: Bestimmung der Aktivität der K66R-Muteine. Gezeigt werden einige Muteine mit den restlichen Aktivitäten im Vergleich zur Wt-PheDH. Bei zwei Muteinen (Mutein 2 und 8) konnte der natürliche Reaktionsmechanismus verändert und somit neue Eigenschaften erzielt werden.

Das Mutein K66R-8 (hier Mutein 8) zeigt eine Aktivität von 12 U/ml auf Reduktion des

Phenylpyruvat zur Phenyllactat. Die Bestimmung der Aktivität erfolgte photometrisch durch

Detektion der Abnahme der Absorption des NADH bei 340 nm. Das rekombinante Plasmid

wurde sequenziert und die Mutationen bestimmt. Zusätzlich zur Mutation an Position 66

(Austausch Lysin gegen Arginin), das bei der gezielten Mutagenese eingeführt worden ist,

wurden zwei neue Mutationen T208A und E225D gefunden (Abbildung 58).

Ergebnisse

105

10 20 30 40 50 60 | | | | | | Wt_PheDH MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL PheDH_K66R MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL ************************************************************ 70 80 90 100 110 120 | | | | | | Wt_PheDH AGAMTLKMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV PheDH_K66R AGAMTLRMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV ******:***************************************************** 130 140 150 160 170 180 | | | | | | Wt_PheDH NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL PheDH_K66R NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL ************************************************************ 190 200 210 220 230 240 | | | | | | Wt_PheDH VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDTERVAHAVALGHTAVALEDVLSTPCDVFAPCA PheDH_K66R VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDAERVAHAVALGHTAVALDDVLSTPCDVFAPCA ****************************:****************:************** 250 260 270 280 290 300 | | | | | | Wt_PheDH MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE PheDH_K66R MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE ************************************************************ 310 320 330 340 350 | | | | | Wt_PheDH VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREASTTTATA PheDH_K66R VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREAS-TTATA ************************************************** *****

Abbildung 58: Aminosäurensequenz des Muteins K66R-8 im Vergleich zur PheDH-AS-Sequenz. 3 Mutationen K66R, T208A, E225D sind in diesem Mutein für die neue Aktivität verantwortlich.

Basierend auf den Daten der dreidimensionalen Struktur der PheDH wurden die neuen

Mutationen mittels 3D-Programm (Swiss PDB Viewer) modelliert. Abbildung 59 verdeutlicht

die Lage der ausgetauschten Aminosäuren in der PheDH.

Ergebnisse

106

Abbildung 59: Dreidimensionale Struktur des K66R-8-Muteins. Gezeigt sind die durch die Mutagenese ausgetauschten Aminosäuren. Die Mutationen K66R, T208A und E225D sind hervorgehoben. Wasser-stoffbindungen sind grün dargestellt.

Die Aminosäure Asparaginsäure, wurde durch Glutaminsäure mittels Zufallsmutagenese an

Position 225 substituiert und zeigt keine Wechselwirkung mit dem Coenzym bzw. mit den am

Coenzym bindenden Aminosäuren (Asp 205). Aus Abbildung 59 ist eine Wechselwirkung

zwischen Ala 208 zum Asp 205 bzw. zum Asp 207 ersichtlich. An einer direkten Wechsel-

wirkung zum Coenzym ist diese zweite Mutation T208A nicht beteiligt, dennoch geht sie eine

Wasserstoffbindung mit Asparaginsäure 205 ein. Asp 205 zeigt eine Wasserstoffbindung zum

Coenzym (Abbildung 59).

Die Modellierung der 3D-Struktur der Wt-PheDH zeigt eine Wasserstoffbindung zwischen

Lysin 66 zur Carboxylgruppe des Substrates (Phenylpyruvat) (Abbildung 60a). Nach dem

Austausch von Lysin 66 gegen Arginin konnte keine Wechselwirkung mehr festgestellt

werden (Abbildung 60b).

Ala 208

Asp 225

Arg 66

Asp 205 Thr 206

Asp 207

NAD+

Phenylpyruvat

Ergebnisse

107

Abbildung 60: Das aktive Zentrum der PheDH und der Effekt des Lysin 66 durch den Austausch in Arginin. (A) Wechselwirkung zwischen Lysin 66 und der Carboxylgruppe des Substrates, (B) Arginin wird anders orientiert und geht keine Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe des Substrates ein. Wasserstoffbindungen sind grün dargestellt.

5.8.2 Biochemische Charakterisierung des K66R-8-Muteins

Das neuhergestellten Mutein, das die drei o.g. Mutationen trägt, zeigt eine neue Aktivität von

13 U/ml gegen Phenylpyruvat, das zu Phenyllactat reduziert wird.

COOH

O+ NADH

Mutein K66R COOH

OH+ NAD+

Abbildung 61: Reaktionsschema des K66R-8-Muteins.

Das breite Substratspektrum der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 wurde bereits von Hummel

et. al. (Hummel et al., 1987) eingehend untersucht. Die Mutagenese des PheDH-Gens führte

zur Erweiterung des Substratspektrums und zu einer Eigenschaftsveränderung hinsichtlich der

Reduktion von Phenylpyruvat zu Phenyllactat. Von einigen Substraten (Tabelle 17) wurde

hier der Km-Wert bestimmt. Hierfür wurden partiell gereinigte Mutein-Extrakte eingesetzt.

A B

Lys78

NADH

Lys66

Lys78

Arg66

Lys78

Ergebnisse

108

Tabelle 17: Km-Werte des Muteins K66R-8. Untersucht wurde Phenylpyruvat sowohl bei einer reduktiven Aminierung als auch bei einer Reduktion ohne Ammoniumionen.

Substrat Km (mM)

(WT-PheDH)

Km (mM)

(K66R)

Phenylpyruvat (reduktive Aminierung)

Phenylalanin (oxidative Desaminierung)

Phenylpyruvat (Reduktion zum Phenyllactat)

0.13

0.87

0.17

0.7

18

Es wurde ebenso überprüft, ob die neuen Mutationen in der PheDH Einfluss auf die

Temperatur- bzw. pH-Optima haben. Daher wurde der Aktivitätstest bei verschiedenen pH-

Werten von 5-10 (Abbildung 62) und Temperaturen zwischen 20 und 50°C (Abbildung 63)

durchgeführt. Dabei wurde ein Tris/HCl Puffer (100 mM) im Bereich von pH-Wert 7-10 mit

NaOH bzw. HCl eingestellt. Für niedrige pH-Werte wurde der Puffer Glycyl-Glycin (100

mM) benutzt, da er eine größere Pufferkapazität besitzt.

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12pH-Wert

Akt

ivitä

t (%

)

WT-PheDHK66R-Mutante

Abbildung 62: pH-Optimum des Muteins K66R-8 im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Der Aktivitätstest (Reduktion des Phenlpyruvats ohne Ammoniumionen) wurde bei verschiedenen pH-Werten zwischen pH 5 und pH 10 gemessen.

Ergebnisse

109

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60

Temperatur (°C)

Akt

ivitä

t (%

)WT-PheDHK66R-Mutante

Abbildung 63: Temperaturoptimum des K66R-8-Muteins im Vergleich zur Wildtyp-PheDH. Die Ansätze enthielten Tris/HCl Puffer (100 mM pH 8.0 + Phenylpyruvat und NADH) wurden auf den jeweiligen Meßtemperaturen (25-50°C) in der Küvette temperiert und gemessen.

5.8.3 Synthese von Phenyllactat mit dem Mutein K66R-8

Mit den eingeführten 3 Mutationen wurde der Reaktionsmechanismus geändert, das

Substratspektrum der PheDH erweitert und somit ein ähnlicher Mechanismus wie der der

Lactat-Dehydrogenase, also eine Reduktion des Eduktes ohne Zusatz von Ammoniumionen

erreicht. Für den Nachweis des gebildeten Produktes wurde eine Synthese mit gekoppelter

Enzymreaktion unter Regeneration des Coenzyms mit Formiat-Dehydrogenase durchgeführt.

Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM

NAD+, 2 mM Mg 2+, 20U K66R-8 und 30U Formiat Dehydrogenase.

Das durch das Mutein K66R-8, das die 3 Mutationen K66R, T208A und E225D trägt,

gebildete Produkt Phenyllactat wurde mittels GC-Analyse nachgewiesen.

Die ersten Ansätze zur Synthese wurden nach 2 h und nach 13 h gestoppt. Bei der GC-

Analyse fiel auf, dass kein enantiomerenreines Phenyllactat hergestellt wurde. Nach 2h wurde

ein ee-Wert von 82 % zu Gunsten von L-Phenyllactat gemessen (Abbildung 64a). Nach 13h

Synthese wurde vollständige Racemisierung festgestellt (Abbildung 64b).

Ergebnisse

110

Abbildung 64a: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach zweistündiger Inkubation. Eingesetzt wurden 30 mM Phenylpyruvat, 100 mM HEPES-Puffer, 100 mM Formiat, 2 mM NAD+, 2 mM MgCl2, 20 U K66R-8 und 30 U Formiat Dehydrogenase.

Abbildung 64b: GC-Chromatogramm des Syntheseansatzes der K66R-8 nach 13 h Inkubation.

Für die Bestimmung des Zeitpunktes der Racemisierung wurde ein weiterer Test mit

zwischenzeitlicher Entnahme und GC-Analyse einer Probe aus der Umsetzung durchgeführt.

In den ersten 4 Stunden der Umsetzung wurde L-Phenyllactat im Überschuß gebildet. Nach

etwa 8 Stunden konnte die Bildung eines Racemats an D- bzw. L-Lactat beobachtet werden

(Abbildung 65).

D-Phenyllactat L-Phenyllactat

L-Phenyllactat

Ergebnisse

111

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 20 25

Zeit (h)

ee (%

)

Abbildung 65: Einfluss der Mutationen K66R, T208A und E225D, auf die Enantioselektivität der Reduktion von Phenylpyruvat (30 mM) in Abhängigkeit von der Zeit.

Die Ergebnisse deuteten auf eine Racemase. Um dies nachzuweisen wurde als Substrat 30mM

L-Phenyllactat mit Rohextrakten aus sowohl E. coli JM105 als auch Mutein K6R-8 eingesetzt

und die Reaktion über 20 h verfolgt. Dabei konnte keine Racemisierung des L-Phenyllactat

zum D-Phenyllactat beobachtet werden.

Aufgrund der Ergebnisse bei der Umsetzung mit dem neuen Mutein K66R-8 und der

schlechten Enantioselektivität wurden die 3 Mutationen genauer untersucht und eine gezielte

Rückmutagenese durchgeführt. Dabei wurden die 3 Mutationen rückgängig gemacht und

deren Einfluss auf Enantioselektivität und das Substratspektrums untersucht. In Tabelle 18

werden die verschiedenen Muteine verglichen und deren Einfluss auf die Aktivität erläutert.

Tabelle 18: Vergleich der Reaktionsmechanismen verschiedener Muteine. Die 3 Mutationen wurden einzeln rückgängig mutiert. Die drei Mutationen sind als Kombination für die neue Eigenschaft der PheDH verantwortlich. Die Substitution der einzelnen Mutationen in die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der LDH-Aktivität.

Mutein PheDH-Aktivität (U/mg) Phenyllactat-DH-

Aktivität

R66K, T208A, E225D 70 -

K66R, A208T, E225D 63 -

K66R, T206A, D225E 82 -

Ergebnisse

112

Aus Tabelle 18 ist zu entnehmen, dass die drei Mutationen im Mutein K66R-8 als

Kombination für die neue Aktivität der PheDH verantwortlich sind. Die Substitution der

einzelnen Mutationen zu den ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der

LDH-Aktivität.

5.8.4 Austausch K66I

Neben der Mutante K66R ist eine weitere durch gezielte Mutagenese erzeugt worden, bei der

das Lysin 66 gegen Isoleucin (K66I) ausgetauscht worden ist. Auch dieses Mutein ist als

Template für eine Reihe ungerichteter Mutationen verwendet worden.

Mit diesem Template wurde eine Muteinbank von ca. 32000 Varianten konstruiert. Eine

weitere Muteinbank wurde mit der wt-PheDH-DNA konstruiert und überprüft. Alle

konstruierten Muteine wurden auf neue Aktivität gegen Phenylaceton mittels Schnelltest in

Titerplatten überprüft.

Die neu konstruierten Muteine aus der K66I-Enzymvariantenbank zeigten keine neue

Aktivität gegenüber Phenylaceton. Zusätzliche Mutationen zur K66I konnten die Akzeptanz

des Phenylacetons als Substrat nicht positiv beeinflussen. Da das Hauptinteresse an der

Umsetzung von Ketonen zu Aminen bestand, wurde die neukonstruierte Enzymbank nicht auf

neue Eigenschaften gegen weitere Substrate überprüft. Es ist aber von Interesse, diese

Enzymbank zum weiteren Screening zu verwenden und nach Muteinen für neue Umsetzungen

zu suchen.

Etwa 60 % der Muteine aus der zweiten Enzymvariantenbank, die mit der wt-PheDH als

Template hergestellt wurden, zeigten PheDH-Aktivität. Die Einführung der Mutationen in das

PheDH-Gen hat keinen Einfluss auf die Enantioselektivität. Bei der Umsetzung von

Phenylpyruvat (Abbildung 66) war der ee-Wert von dem der PheDH nicht zu unterscheiden

und lag bei >99 %.

Ergebnisse

113

Abbildung 66: Produktnachweis nach einer 9 stündigen Umsetzung mit dem Mutein K66I. Zur Regene-rierung des Coenzyms NADH wurden 40 U Formiat Dehydrogenase eingesetzt. Die reduktive Aminierung erfolgte mit (NH4)2SO4 und 30 mM Phenylpyruvat als Substrat. (L-Phe = 23 min; der Peak bei 29 min ist nicht identifiziert).

In allen untersuchten Muteinen waren keine neuen Aktivitäten bezüglich der Umsetzung von

Phenylaceton nachweisbar. Diese neukonstruierte Enzymbank wird in weiteren Arbeiten auf

neue Eigenschaften und neue Umsetzungen von gewünschten Substraten Verwendung finden.

L-Phe

Diskussion

114

6 Diskussion Klonierung und Expression der PheDH aus Rhodococcus sp. M4

Das Gen der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 (Hummel et al., 1987) ist

wie die meisten Gene in Organismen der Actinomyces- Familie (Corynebacteria,

Mycobacteria, und Nocardia) (Watts et al., 2001) hoch GC-reich (Anteil: 65 %) . Das führte

zur Bildung von Sekundärstrukturen (Choi et al., 1999), was die Amplifizierung des PheDH-

Gens mittels PCR erschwert. Durch Zugabe von DMSO (3%) und die Variation der

Annealingstemperatur konnten Amplifikate gewonnen und kloniert werden. Die Klonierung

führte anfänglich zur Bildung von „inclusion bodies“ (Hibino et al., 1994). Der Versuch zur

Vermeidung dieses Problems mittels Klonierungen in verschiedenen Vektoren, pTRC99a,

pET16b, pET11a, führte nicht zur Expression eines aktiven Proteins. Das exprimierte Protein

wurde mittels SDS-Gel-Elektrophorese als „inclusion bodies“ analysiert. Nach

Literaturangaben könnten unlöslichen Proteine durch physikalische bzw. biochemische

Methoden (Temperatur, Induktion, Schüttelgeschwindigkeit) (Shin et al., 1997; Xu et al.,

1994; Yang et al., 1997; Zhang et al., 1995) entfaltet werden, was aber bei der exprimierten

PheDH nicht zu positiven Ergebnissen führte.

Unlösliche Proteine werden durch eine zu schnelle Expression gebildet (Camacho et al.,

2002), die den Proteinen nicht genügend Zeit und Raum zur Faltung lässt. Optimale

Expression eines Enzyms erreicht man normalerweise, wenn das Startcodon des

dazugehörigen Gens mit einem Abstand zwischen 7 und 9 bp von der Ribosomenbindungs-

stelle kloniert wird (Esipov et al., 1999; Vellanoweth & Rabinowitz, 1992).

Da die Klonierung nach dieser Strategie zu inclusion bodies geführt hat, wurde die PheDH an

der SmaI- Schnittstelle im Expressionsvektor pKK223-3 mit einer „nicht optimalen“

Entfernung von 14 bp des Startcodons zur Ribosomenbindungsstelle kloniert. Aufgrund

dieses Abstandes konnte eine schwächere Translation erreicht werden, was zu einer

langsameren und schwächeren Expression führte. Dem gebildeten Enzym bleibt dann genug

Zeit und Raum zur Faltung und man erhält zwar weniger, dafür aber aktives Enzym.

Zusätzlich dazu besitzt das verwendete Plasmid pKK223-3 einen schwächeren Promotor als

beispielsweise die oben verwendeten pET-Systeme, was zu einer weiteren Abschwächung der

Expression führt. Durch die Auswahl eines geeigneten Expressionsstammes E. coli JM105

konnte die Aktivität mit dem gleichen Plasmidkonstrukt auf das 3-fache im Vergleich zum

E.coli -HB101 erhöht werden.

Diskussion

115

Die Charakterisierung zeigt eine stabile rekombinante PheDH, die nach 36 h bei 30°C noch

etwa 95 % Restaktivität besitzt. Eine Denaturierung erfolgt erst bei höhere Temperaturen von

50°C. Nach 36 h konnten bei 37°C noch 90 % Restaktivität der rec-PheDH gemessen werden.

Im Vergleich dazu zeigte die Wildtyp-PheDH nach 36 h bei 30°C nur noch etwa 50 % Rest-

aktivität. Da die Sequenz der Wt-PheDH und die der rec-PheDH gleich sind, kann eine

falsche Faltung des Proteins ausgeschlossen werden. Die schlechte Stabilität der PheDH im

Wildtyp beruht wahrscheinlich auf vorhandenen Proteasen, die das Enzym nach Aufschluss

der Zellen abbauen(De Mot et al., 1998). Durch die Expression der PheDH aus Rhodococcus

sp. M4 in E. coli -JM105 und somit der Vermeidung von PheDH-spezifischen Proteasen,

konnte die Stabilität des Enzyms erhöht werden.

Die optimale Temperatur für eine Enzymreaktion liegt sowohl für die rec-PheDH als auch für

WT-PheDH bei 50 °C, die Enzymtests und Synthesereaktionen wurden jedoch aus Stabilitäts-

gründen bei 30 °C durchgeführt.

In einer ersten Arbeit, in der das Vorkommen der PheDH Rhodococcus sp. M4 beschrieben

wurde, ist eine partielle Reinigung für dieses Enzym bereits veröffentlicht worden (Hummel

et al., 1987). Die Reinigung der recPheDH aus E. coli- Rohextrakten erfolgte in Anlehnung

an dieses Protokoll. Für die Reinigung bis zur Homogenität konnte allerdings ein zusätzlicher

Reinigungsschritt zu den Literaturangaben durch eine Hitzedenaturierung der Begleitproteine

in Gegenwart von 5 % (w/v) L-Phenylalanin eingefügt werden. Die Entfernung des L-Phenyl-

alanins wurde mittels Gelfiltrationschromatographie durchgeführt.

Optimierung und Fermentation der PheDH

Neben der Auswahl eines geeigneten Vektor-Wirt-Systems wurden weitere Optimierungen,

wie Induktionsparameter, variiert, um eine effiziente Proteinexpression zu erzielen. Einerseits

wurde die Induktorkonzentration zwischen 0 und 3 mM IPTG (? -D-Isopropylthiogalaktosid)

bei einem konstanten Induktionszeitpunkt (OD600= 0.6) variiert. Die Untersuchung führte zu

dem Ergebnis, dass mit einer IPTG-Konzentration von 0.7 mM eine optimale Expression zu

erzielen war. In der Kontrollexpression ohne IPTG-Induktion konnte nur geringe PheDH-

Aktivität (35 U/ml) im Rohextrakt nachgewiesen werden. Folglich unterdrückte der lac I-

Repressor die Expression des PheDH-Gens im nicht induzierten Zustand fast vollständig (van

den Bogaard et al., 2000). Dies ist von Vorteil, da die Expression des Fremdproteins eine

Belastung des Zellstoffwechsels bedeutet und zu einer erheblich geringeren Zellausbeute

Diskussion

116

führt. Eine hohe Konzentration an IPTG kann das Wachstum der Zellen hemmen (Rhee et al.,

1997).

Andererseits wurde der Zeitpunkt der Induktion nach Inokulation variiert, wobei alle Kulturen

mit 1 mM IPTG induziert worden sind. Die Zellen wurden 24 h nach Inokulation geerntet und

die spezifischen Aktivitäten in den zellfreien Rohextrakten bestimmt. Es zeigt sich, dass der

Zeitpunkt der Induktion einen großen Einfluss auf das Wachstum der Zellen hat. Der Einfluss

des Induktionszeitpunkts auf die Systemproduktivität wurde mittels zweier Experimente

abgeschätzt, die die Zunahme der Volumenaktivität an PheDH nach Induktion am Anfang

bzw. in der Mitte der Fütterungsphase bestimmten. Die Ergebnisse, die in Abbildung 21

dargestellt sind, wiesen daraufhin, dass, ähnlich zu Versuchen in Schüttelkultur, eine

signifikante Abhängigkeit der recPheDH- Expression vom Induktionszeitpunkt besteht. Eine

zu frühe Induktion kann die Zellen unter Stressfaktoren setzen, was zu einer Störung des

Expressionsapparats führen kann (Donovan et al., 2000). Eine Induktion in der stationären

Phase, in der die Wachstums- und Sterberate gleich sind, kann nicht zu einer produktiven

Expression führen.

Nach Riesenberg (Riesenberg, 1991) und Fieschko (Fieschko, 1989) erfolgt die Bildung von

wachstumsinhibierender Nebenprodukte wie Acetat in komplexen Medien bei Wachstums-

raten oberhalb von 0,2 h-1 (Riesenberg et al., 1991) und in definierten Medien bei

Wachstumsrate oberhalb von 0,35 h-1. Mit abnehmender spezifischer Wachstumsrate steigt

die Expression des rekombinanten Proteins (Fieschko, 1989). Da in dieser Arbeit die

Kultivierung in komplexen Medien erfolgte, war für die Kultivierung des Expressions-

stammes JM105 eine spezifische Wachstumsrate von 0,2 h-1 angebracht.

Die Form der Nährstoffzuführung war ein kritischer Parameter bei der HZD-Fermentation;

dadurch kann sowohl die Zelldichte als auch Zellproduktivität beeinflusst werden (Lee, 1996).

Möglich waren konstante als auch kontinuierliche Fütterungsraten. Konstante Fütterungsraten

wurden für das Expressionssystem E. coli JM105 nicht in Erwägung gezogen, da dies nach

Lee et al. zur Verminderung der Wachstumsrate führt (Lee, 1996) und damit zur Vermin-

derung von Produktbildung des Expressionssystems führt (Riesenberg, 1991).

Die Wachstumsrate, Acetatbildung und End-Zelldichte wurden sowohl bei konstanter als auch

linearer Zufütterungsrate untersucht. Nach Paalme et al. kann eine konstante Wachstumsrate

durch eine exponentiell gesteigerte Zuführung der C-Quelle erreicht werden (Paalme et al.,

1997). Eine lineare Erhöhung der Nährstoffzuführung ist mit geringeren Schwankungen der

Wachstumsrate verbunden (Yee & Blanch, 1992).

Diskussion

117

Die Untersuchungen in dieser Arbeit zeigten, dass Acetat bei linearer Zuführung der C-Quelle

ständig gebildet wurde und im Gegensatz hierzu kein Acetat bei exponentieller Zuführung

nachweisbar war. Daher wurden weitere Experimente mit exponentieller Zuführung

durchgeführt.

In der HZD-Fermentation wird zwar eine hohe Biomasse erzielt, dies wurde aber durch eine

geringe spezifische Aktivität erkauft. Durch die Zugabe von Vitaminen, Spurenelementen und

optimiertem Medium mit Nährstoffen können die Zellen schnell wachsen und eine hohe

optische Dichte erreichen. Somit werden die Zellen aber unter Stress gesetzt, so dass die

Expression nicht ideal verläuft, was sich auf die spezifische Aktivität niederschlägt.

Bei einer ersten Fermentation der PheDH im Batch war die spezifische Aktivität geringer als

bei der Anzucht im Kolben. Der Grund für die schwächere Aktivität lag möglicherweise im

späten Erntezeitpunkt, da die Lyse der Zellen zur Desaktivierung der Enzyme führen kann.

Erwartet war eine bessere Aktivität als im Kolben aufgrund der besseren Sauerstoff-

versorgung sowie der pH-Regulierung.

Coexpression der PheDH und des malic enzymes

Das in dieser Arbeit klonierte NAD abhängige E. coli malic enzyme zeigt Ähnlichkeit im

Molekulargewicht (50 kDa) zum malic enzyme aus Bacillus stearothermophilus (Kobayashi

et al., 1989), aber einen Unterschied zum NADP-abhängigen malic enzyme aus E.coli

(62kDa) (Nakamura et al., 1986). Da der C-Terminus des NAD-abhängigen malic enzymes

aus E. coli zum Zeitpunkt der Klonierung nicht zugänglich war, wurde mit Hilfe des 5’-

Forward Primers ein Einzelstrang ampilifiziert. Mit der Gewinnung des Einzelstranges konnte

eine zweite PCR durchgeführt und ein doppelsträngiges Fragment amplifiziert werden. Mit

dieser vollkommen neuen Methode war das gesamte Gen amplifizierbar. Die Klonierung von

Genen ist somit wesentlich schneller und vereinfacht. Schwierigkeiten bei dieser Methode

haben sich in GC-reichen Sequenzen ergeben. Ein Vergleichsversuch mit der PheDH ist

anfänglich gescheitert, dennoch konnte durch Zusatz von DMSO im PCR-Ansatz eine

vollständige Amplifikation GC-reicher Sequenzen erreicht werden. Hier sollte beachtet

werden, dass Einzelstränge nicht stabil sind und daher der Umgang mit Einzelsträngen

schonend durchgeführt werden muß.

Für die Klonierung des malic enzymes 3’ zur PheDH an der PstI- und HindIII-Schnittstelle

war eine eigene Ribosomenbindungsstelle notwendig, da am C-Terminus der PheDH ein

Stopcodon angehängt war. Somit konnte eine Expression beider Enzyme gleichzeitig

Diskussion

118

erfolgen. Interessant wäre, aus den zwei Enzymen (PheDH / malic enzyme) ein Fusions-

protein herzustellen. Dies kann durch die Deletion des Stopcodons am C-Terminus der

PheDH sowie der Ribosomenbindungsstelle vor dem malic enzyme erreicht werden. Eine

katalysierte Reaktion der PheDH kann theoretisch erfolgen, da das aktive Zentrum nicht am

C-Terminus der PheDH liegt (Vanhooke et al., 1999). Somit kann sowohl die Umsetzung des

Substrates als auch die Regeneration des Coenzyms im gleichen fusionierten Protein erfolgen.

Da keine Kristallstruktur vom malic enzyme aus E. coli K12 vorliegt und noch nicht bekannt

ist, wo das aktive Zentrum sich befindet, wäre eine erfolgreiche Umsetzung durch ein

Fusionsprotein nur hypothetisch. Fraglich ist dabei auch, mit welcher Struktur die beiden

Enzyme als Fusionsprotein exprimiert werden.

Die Aktivität beider rekombinanten Enzyme im E. coli- Stamm JM 105 ist höher als im

HB101 und liegt bei 300 U/ml für malic enzyme und 400 U/ml für die PheDH. Die Aktivität

des malic enzymes in diesem Konstrukt mit einer exprimierten PheDH ist eindeutig niedriger

als ein homolog exprimiertes malic enzyme allein. Es liegt daran, dass der Haushalt an

Aminosäuren während der Translation auf mehrere Enzymen verteilt ist, sodass in dem Fall

weniger Enzymmenge hergestellt wird als wenn die Aminosäuren einem exprimierten Enzym

allein zur Verfügung ständen.

Ganzzell-Umsetzung

Als neue Parameter, die bei ganzen Zellen berücksichtigt werden müssen, kommen jetzt

allerdings Transportprozesse durch die Zellmembran hinzu (Andersen et al., 2001; Sanden et

al., 2002). Ein Versuch zur Immobilisierung der Zellen mit CTAB, um sie durchlässig zu

machen, führte nicht zu Steigerung des Umsatzes. Das liegt daran, dass eine Aufnahme des

Substrates Phenylpyruvat ohne Immobilisierung der Zellwand möglich war. Die Überlegung,

dass die Substrate Phenylpyruvat und Phenylalanin als C-Quelle metabolisiert werden

könnten, hat sich nicht bestätigt. Es konnten zwar nach der Umsetzung nur 90% des

erwarteten Produktes L-Phenylalanin festgestellt werden, das ist aber nicht unbedingt auf

Metabolisierung zurückzuführen ist. Ursache könnten die Reaktionsbedingungen sein, da die

Reaktion im Batch Ansatz durchgeführt wurde und das Produkt nicht der Reaktion entzogen

worden ist.

Eine weitere Überlegung war, dass L-Malat über eine E. coli eigene Malat-Dehydrogenase

metabolisiert wird. Aus diesem Grund wurde L-Malat im Überschuss zugegeben und somit

dieses Problem vermieden. Im Vergleich zur Umsetzung mit isolierten Enzymen war es

allerdings wahrscheinlich, dass Pyruvat, das durch die Umsetzung von L-Malat für die NADH

Diskussion

119

Regenerierung entsteht, als leicht verwertbare C-Verbindung in den Primärstoffwechsel

einfließt und nicht mehr als störendes Nebenprodukt, wie bei der Verwendung isolierter

Enzyme vorliegt. Bei E. coli und anderen Bakterien wird Pyruvat durch Phosphoenolpyruvat-

Synthetase direkt phosphoryliert und fließt somit in den Stoffwechsel der Zellen ein (Geerse

et al., 1989).

Pyruvat + ATP + H2O Phosphoenolpyruvat + AMP + Pi

PEP-Synthetase

Der Vorteil der Formiat Dehydrogenase, die sich bis dato für die Regenerierung des

Coenzyms NADH in situ durchgesetzt hat, liegt darin, dass bei der Regeneration durch

Formiat nur CO2 und keine weiteren Nebenprodukte entstehen (Schütte et al., 1976). Da aber

in dieser Arbeit nachgewiesen wurde, dass das malic enzyme ein durchaus erfolgreiches

System darstellt und im Ganzellsystem keine Nebenprodukte das gewünschte Produkt

verunreinigen, könnten solche in dieser Arbeit entwickelten Konstrukte technisch und

wirtschaftlich interessanter sein. Dazu kommt der wirtschaftliche Faktor, da L-Malat im

Vergleich zum Na-Formiat vergleichbar kostengünstig ist. Ein weiterer wesentlicher Vorteil

der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation, möglicherweise Reinigung der

Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet werden kann.

Für eine gekoppelte Reaktion zweier Enzyme wurden bestimmte Parameter für die Stabilität

der beiden Enzymen untersucht, um optimale Verhältnisse zu schaffen. Wichtige Faktoren

sind das pH-Optimum sowie die Temperaturstabilität der beiden Enzyme. Zusätzlich zu der

Stabilität der Enzyme spielen weitere Faktoren, wie z.B. der Einfluss der verschiedenen

Substrate auf die Enzyme eine Rolle (Brunhuber et al., 2000; Solovjeva & Kochetov, 1999).

Die PheDH könnte durch Malat inhibiert werden bzw. malic enzyme durch das

Phenylpyruvat. In Bezug auf diese Coexpression der Phenylalanin Dehydrogenase aus

Rhodococcus sp. M4 und des malic enzymes aus E. coli konnte keine Inhibierung festgestellt

werden. Vor der Übertragung dieser Technik auf weitere Enzyme sollte aber eine

Untersuchung bezüglich der Inhibierung durchgeführt werden.

Es wurde für einen wirtschaftlichen Einsatz der Ganzzell-Umsetzung untersucht, ob das malic

enzyme durch D- Malat inhibiert wird. Eine Inhibierung war nicht festzustellen, daher ist es

von wirtschaftlicher Bedeutung, das kostengünstigere racemische D,L- Malat für die

Regenerierung des Coenzyms einzusetzen.

Diskussion

120

Bei einer in situ Regenerierung führte der Zusatz an BSA zu einer Steigerung der Aktivität.

Ebenso beeinflusste der Aufschluß-Puffer die Aktivitäten. Hierbei war zu beobachten, dass

der geeignete Aufschluß- Puffer für die einzelnen Enzyme unterschiedlich war. Der Kpi-

Puffer war für die PheDH besser geeignet als für das malic enzyme, da aber die

Aktivitätsabnahme des malic enzyme im Kpi-Puffer nicht drastisch war, wurden die

rekombinanten Zellen nach der heterologen Expression weiterhin im Kpi-Puffer

aufgeschlossen.

Dieses Konstrukt mit dem malic enzyme als Regenerationssystem eröffnet neue Möglich-

keiten für Coexpressionen mit weiteren Dehydrogenasen und damit Ganzzell-Umsetzungen

von verschiedenen Substraten.

Entwicklung einer Screeningsmethode

Um das Screening der durch die Zufallsmutagenese hergestellten Enzymvarianten- Bibliothek

ermöglichen zu können, sind geeignete und effektive Selektionsmechanismen notwendig. Mit

geeigneten Methoden können die gewünschten Eigenschaften detektiert werden. Zahlreiche

erfolgreiche Screeningsmethoden wurden bereits entwickelt. Beispielsweise wurden pH-

Indikatoren auf Agarplatten eingesetzt, so dass beim Abbau des Substrates eine Abnahme des

pH-Wertes stattfand und sich die Farbe des Indikators dadurch ändert (Zhou et al., 1996). Da

aber bei vielen Umsetzungen (unter anderem bei reduktiver Aminierung) die Änderung des

pH-Wertes nicht detektierbar wäre und man auf die Isolierung des Enzyms für photometrische

Tests angewiesen ist, wurde in dieser Arbeit eine effektivere Screeningsmethode für den

direkten Nachweis der positiven Klone entwickelt. Die neue Methode beruht auf dem

Farbumschlag von Tetrazolium. Die Reduktion von Tetrazolium führt zur Veränderung seines

Absorptionsspektrums, was eine schnelle Detektierung positiver Kolonien ermöglicht. Für die

Evaluierung dieser Methode, wurde Phenylalanin als Donor zur Reduktion des Coenzyms

NAD+ eingesetzt. Anfänglich haben sich alle Klone durch den Luftsauerstoff gefärbt. Die

Vermeidung dieses Problems erfolgte durch die Überschichtung der Zellen mit Öl bzw. mit

Agar. Dass die neue Methode nicht direkt für das Screening nach Muteinen, die Amin

Dehydrogenase Aktivität zeigen, eingesetzt wurde, liegt am Mangel des einzusetzenden

Substrates Phenylpropylamin. Phenylpropylamin ist nicht kommerziell erhältlich und seine

Synthese noch nicht etabliert.

Diese neue Screeningsmethode ist zum Screening von Dehydrogenasen soweit optimiert und

somit eine schnelle und effektive Methode.

Diskussion

121

Mutagenese

Die Klonierung der PheDH aus Rhodococcus sp. M4 war die Voraussetzung für die gezielte-

bzw. Zufallsmutagenese, um neue Enzymvarianten für die Herstellung von Aminen und

Hydroxysäuren zu konstruieren.

Zum Zeitpunkt der Planung der Mutagenese war die 3D-Struktur der Phenylalanin

Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4 noch nicht aufgeklärt. Die PheDH sollte in dieser

Arbeit zu diesem Zweck kristallisiert werden, aber gleichzeitig während der Vorbereitung zur

Kristallisation der PheDH wurden auch einige Mutationen durchgeführt. Die Postulierung,

dass die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe des Substrates eine basische sein sollte, beruhte

auf Literaturangaben zum Mechanismus (Clarke et al., 1986; Pasquo et al., 1998). Nach

Literaturangaben kommen Arginin oder Lysin in Lactat Dehydrogenasen bzw. Aminosäuren

Dehydrogenasen (Baker et al., 1995; Baker et al., 1997) im aktiven Zentrum vor. Um die

Akzeptanz einer Methylgruppe anstelle der Carboxylgruppe im Substrat zu ermöglichen,

sollte daher eine basische Aminosäure in eine neutrale Aminosäure umgewandelt werden

(Nicholls et al., 1994). Da aber in der PheDH etwa zwanzig Arginine und fünf Lysine

vorkommen, ist eine gezielte Mutagenese zur Erweiterung des Substratspektrums in diesem

Falle nicht praktikabel und eine Zufallsmutagenese deutlich effektiver. Doch aus wissen-

schaftlichen Gründen wurden einige Versuche zur Substitution von Arginin in weitere

neutrale Aminosäuren wie beispielsweise Isoleucin durchgeführt, um den Einfluss der

Substitution von Arginin gegen neutrale Aminosäure zu untersuchen.

Zwei Muteine R210I und R140I wurden konstruiert und auf Aktivität untersucht.

Es wurde eine verminderte Expression und etwa 83 % Restaktivität der PheDH bei der

Mutante R140I beobachtet. Durch diesen Austausch konnte die Proteinfaltung verlangsamt

und dadurch ein proteolytischer Abbau begünstigt werden (Jiang et al., 2001). Vereinfacht:

Das Mutein ist für Proteasen angreifbarer. Die gewünschte Amin Dehydrogenase Aktivität

gegenüber Phenylaceton war nicht nachzuweisen.

Keine Expression konnte bei der Mutante R210I festgestellt werden. Ein Grund dafür könnte

die Ladung des Arginins sein. Da Arginin bei dem benutzten pH-Wert eine positive Ladung

aufweist und dadurch Interaktionen mit anderen Aminosäuren hervorruft, kann ein

Abstoßungseffekt bei Austausch gegen eine neutrale Aminosäure (Isoleucin) auftreten. Das

Mutein PheDH-R210I hat durch diesen Austausch die ursprüngliche Aktivität der PheDH

verloren, zeigt aber keine neue Amin Dehydrogenase- Aktivität.

Zu diesem Zeitpunkt wurde die Strukturaufklärung der PheDH durch Vanhooke (Vanhooke et

al., 1999) durchgeführt und die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren bestimmt.

Diskussion

122

Anhand der 3D-Struktur-Daten konnte das Enzym mittels Computereinsatz modelliert und die

Mutationen simuliert werden.

Dass es bei der PheDH nicht zu einem direkten Hydridtransfer auf die Ketogruppe kommen

kann, liegt an der Entfernung zwischen dem C4 des Nicotinamidrings und C? des

Phenylpyruvat, die mehr als 6 Å beträgt. Dieser Abstand kommt dadurch zustande, dass die

Ketogruppe des Substrates eine Bindung zum Lysin 78 eingeht und somit das Substrat vom

NADH weggezogen wird (Vanhooke et al., 1999). Eine weitere Bindung zum Substrat wird

durch Lysin 66 verursacht. Durch die Simulierung der Substitution dieser Aminosäuren

mittels Computereinsatzes konnte festgestellt werden, dass durch den Austausch von Lysin 66

gegen Isoleucin bzw. gegen Arginin keine Wechselwirkung mehr zur Carboxylgruppe des

Substrates stattfinden kann. Um die Akzeptanz von Ketonen, die dem Phenylpyruvat struktur-

ähnlich sind, und deren Umsetzung zu Aminen zu ermöglichen, wurde Lysin 66 gegen die

neutrale Aminosäure Isoleucin substituiert. Weitere Muteine, die sich im Mechanismus von

der PheDH unterscheiden und einen direkten Hydridtransfer verursachen, wurden durch den

Austausch von Lysin 66 zu Arginin und Lysin 78 gegen Isoleucin konstruiert.

Die Durchführung der einzelnen Substitutionen erfolgte nach dem Prinzip der überlappenden

PCR „overlap extension“ (Ho et al., 1989). Dafür wurde das in dieser Arbeit klonierte

PheDH- Gen als Template verwendet. Die Ausbeute der Hybride mittels dieser Technologie

war anfänglich sehr gering. Es ist aus dem Literatur (Ho et al., 1989) zu entnehmen, dass man

equimolare Mengen beider Fragmente einzusetzen hat, was aber in allen Fällen zu niedriger

Ausbeute geführt hat. Das liegt daran, dass dadurch vier Fusionen entstehen können, wobei

nur eine gewünscht ist. Daher erfolgte die Optimierung dieser Methode durch die Ampli-

fikation der zur Hybridisierung gewünschten Einzelstränge aus den jeweiligen beiden Frag-

menten, die dann in einer weiteren PCR eingesetzt wurden. Somit konnte die Ausbeute auf

das 3 fache gesteigert werden.

Im Gegensatz zur Expression der rec-PheDH betrug der Anteil des Muteins K66R nur 10 %

und der K78I etwa 4 % des löslichen Zellproteins, wobei bei der rec-PheDH etwa 13 % des

löslichen Gesamtproteins nachzuweisen waren. Ein Grund dafür könnte eine schlechte, durch

die Mutagenese verursachte, Proteinfaltung sein.

Eine Veränderung der PheDH durch den Austausch des Lysin 66 gegen Arginin führte nicht

zur drastischen Abnahme der PheDH-Aktivität. Bei diesem Mutein K66R waren etwa 90 %

der PheDH Aktivität noch nachweisbar. Die gewünschte Aktivität, ein direkter Hydridtransfer

konnte durch diesen Austausch nicht erreicht werden. Das Lysin wurde zwar durch die

Mutagenese gegen Arginin ausgetauscht, hat aber nicht zum gewünschten Mechanismus

Diskussion

123

geführt. Das deutet darauf hin, dass noch weitere Aminosäuren an dem gewünschten

Mechanismus beteiligt sind und ebenso substituiert werden müssen.

Durch den Austausch der basischen Aminosäure Lysin gegen eine neutrale Aminosäure im

Mutein K78I, ist die ursprüngliche PheDH- Aktivität verloren gegangen, da Isoleucin keine

Wechselwirkung mit der Ketogruppe des Phenylpyruvats mehr eingeht und somit die

reduktive Aminierung nicht mehr stattfinden kann. Ähnliche Mutation wurde durch Sekimoto

et al. (Sekimoto et al., 1994) bei der Leucin Dehydrogenase aus Bacillus stearothermophilus

durchgeführt, wo Lysin 68 im aktiven Zentrum der LeuDH gegen Alanin bzw. Arginin

ausgetauscht wurde. Dadurch verlor die LeuDH ihre Aktivität aufgrund fehlender Bindung

zum Coenzym.

Trotz der erzielten Vermeidung der Wechselwirkung zwischen der Ketogruppe des Substrates

und der Aminosäure und des dadurch bei der PheDH vorhandenen Abstands zwischen dem

C4 des Nicotinamidrings und C? des Phenylpyruvats, konnte der gewünschte Reaktions-

mechanismus und der direkte Hydridtransfer nicht erzielt werden. In diesem Fall spielen nicht

nur die Ladung und die Größe der Aminosäuren für neue Umsetzungen eine Rolle, sondern

auch die räumliche Struktur der PheDH, die wahrscheinlich durch Substitution einzelner

Aminosäuren für eine Erweiterung des Substratspektrums nicht stark genug beeinflusst

werden konnte. Da die räumliche Struktur ähnlicher Amin Dehydrogenasen, wie die

gewünschte nicht bekannt ist, war es nicht möglich, eine Optimierung durch einen gezielten

Aminosäurenaustausch durchzuführen.

Die Muteine K66R und K66I wurden als Templates in der Zufallsmutagenese verwendet,

wobei das K66R für die Herstellung von neuen Varianten mit Phenyllactat Dehydrogenase-

Eigenschaften (Hydridtransfer), und das K66I zur Hersllung von Amin Dehydrogenase-

Varianten vorgesehen waren. Da die vorhandenen Austausche theoretisch wirksam sein

könnten, und an unbekannten Positionen weitere Aminosäurenaustausche für eine

Konformationsänderung notwendig sein könnten, war es durch Zufallsmutagenese möglich,

weitere Mutationen an neuen Positionen einzuführen und gleichzeitig die Veränderung an

Position 66 zu erhalten.

Die durch die „error prone“ Methode neukonstruierten Muteine - ca. 32000 Varianten aus der

K66I-Template - zeigten keine neue Aktivität gegen Phenylaceton. Zusätzliche Mutationen

zur K66I konnten die Akzeptanz des Phenylacetons als Substrat nicht positiv beeinflussen. Da

das Hauptinteresse an der Umsetzung von Ketonen zu Aminen bestand, wurde die neu-

konstruierte Enzymbank nicht besonders umfassend auf andere neue Eigenschaften gegen

weitere Substrate überprüft. Es ist aber von Interesse, in zukünftigen Arbeiten diese

Diskussion

124

Enzymbank für weitere Screenings zu verwenden und nach Muteinen für neue Umsetzungen

zu suchen.

Die Kombination aus zwei verschiedenen Methoden, sowohl der gezielten als auch der

ungezielten Mutagenese, zeigte sich aber als Erfolgskonzept beim K66R- Template, und

führte zu der gewünschten Aktivität. Das neu hergestellte Mutein trägt zwei Mutationen

T208A, E225D zusätzlich zum K66R und setzt Phenylpyruvat zum Phenyllactat um.

Aufgrund der Ergebnisse bei der Umsetzung mit diesem neuen Mutein (K66R-8) und der

schlechten Enantioselektivität wurden die drei Mutationen genauer untersucht und mittels

gezielter Mutagenese einzeln zurück mutiert zu den ursprünglichen Codons der PheDH, um

festzustellen, welche der o.g. drei Mutationen für die Enantioselektivität bzw. für die

Erweiterung des Substratspektrums verantwortlich ist. Die Substitution der einzelnen

Mutationen gegen die ursprünglichen Codons der PheDH führte zum Verlust der neuen LDH-

Aktivität. Aufgrund dessen, sind die drei Mutationen in diesem Mutein (K66R-8) zusammen

als Kombination für die neue Aktivität der PheDH verantwortlich.

Obwohl die zwei neuen Mutationen T208A und E225D nicht am aktiven Zentrum beteiligt

sind, kam es zu Veränderung des PheDH- Mechanismus. Die Aminosäure Alanin wurde

gegen Threonin an Position 208 ausgetauscht, so daß eine Wechselwirkung mit der

benachbarten Asparaginsäure 205 möglich ist, die wiederum eine starke Wechselwirkung zum

Coenzym besitzt. Die Substitution dieser Aminosäure zum ursprünglichen Threonin führte

zum Verlust der neuen Eigenschaft, wobei Threonin keine Wechselwirkung zum Asp 205 ein-

geht.

Eine Suche in den Datenbanken Genbank, Swissprot und Blast-NCBI ergab eine hohe Homo-

logie des K66R-8-Muteins mit der Lactat Dehydrogenase (LDH) aus Bifidobacterium longum

(Iwata et al., 1994). Wie aus dem Sequenzvergleich hervorgeht, zeigen das Mutein K66R-8

und die LDH aus Bifidobacterium longum eine hohe Homologie in den Sequenzen für die

Bildung von charakteristischen Sekundärstrukturen (Abbildung 67). Zwei der drei ein-

geführten Mutationen, nämlich R 66 und A 208, findet man in der LDH aus Bifidobacterium

longum wieder. An der Stelle der Asparaginsäure 225 in der K66R-8-Mutante kommt in der

LDH allerdings ein Alanin vor.

Diskussion

125

10 20 30 40 50 60 | | | | | | Wt_PheDH MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL K66R-8 MSIDSALNWDGEMTVTRFDRETGAHFVIRLDSTQLGPAAGGTRAAQYSQLADALTDAGKL LDH_Bifid ----------------------------PTKLAVIGAGAVGS-TLAFAAAQRGIAREIVL . : :*..* *: : :: .:: * 70 80 90 100 110 120 | | | | | | Wt_PheDH AGAMTLKMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV K66R-8 AGAMTLRMAVSNLPMGGGKSVIALPAPRHSIDPSTWARILRIHAENIDKLSGNYWTGPDV LDH_Bifid EDIAKERVEAEVLDMQHGSSFYPTVSIDGSDDPEICR------DADMVVIT----AGPRQ . . :: .. * * *.*. . : * **. :: :: :** 130 140 150 160 170 180 | | | | | | Wt_PheDH NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL K66R-8 NTNSADMDTLNDTTEFVFGRSLERGGAGSSAFTTAVGVFEAMKATVAHRGLGSLDGLTVL LDH_Bifid KPGQSRLELVGATVNILKAIMPNLVKVAPNAIYMLITNPVDIATHVAQK-LTGLPENQIF :...: :: :. *.::: . : ....*: : : : **:: * .* :: 190 200 210 220 230 240 | | | | | | Wt_PheDH VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDTERVAHAVALGHTAVALEDVLSTPCDVFAPCA K66R-8 VQGLGAVGGSLASLAAEAGAQLLVADTDAERVAHAVALGHTAVALDDVLSTPCDVFAPCA LDH_Bifid GSGTNLDSARLRFLIAQQ-TGVNVKNVHAYIAGEHGDSEVPLWESATIGGVPMSDWTPLP .* . .. * * *: : : * :..: ... . : ..* . ::* . 250 260 270 280 290 300 | | | | | | Wt_PheDH MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE K66R-8 MGGVITTEVARTLDCSVVAGAANNVIADEAASDILHARGILYAPDFVANAGGAIHLVGRE LDH_Bifid GHDPLDADKREEIHQEVKN-AAYKIINGKGATNYAIGMSGVDIIEAVLHDTNRILPVSSM . : :: . :. .* ** ::* .:.*:: . . : : * : . * *. 310 320 330 340 350 | | | | | Wt_PheDH VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREASTTTATA--- K66R-8 VLGWSESVVHERAVAIGDTLNQVFEISDNDGVTPDEAARTLAGRRAREAS-TTATA--- LDH_Bifid LKDFHG--ISDICMSVPTLLNR--QGVNNTINTPVSDKELAALKRSAETLKETAAQFGF : .: : : .::: **: : :* ** . . * :*: *: **:

Abbildung 67: Alignment der Aminosäurensequenzen der Wt-PheDH aus Rhodococcus sp. M4 (Brunhuber et al., 1994) mit der LDH aus Bifidobacterium longum (Iwata et al., 1994) und der Mutante K66R-8. Rot: Identische Aminosäuren; grün: ähnliche Aminosäuren; Durch Fettdruck hervorgehoben: Mutationen; blaue Pfeile: wichtige Reste zur Bildung der Rossmann fold.

Nach Rosssmann et al. besteht die nukleotidbindende Domäne selbst aus zwei gleichartigen

Abschnitten, die sich im Verlauf der Evolution aus einem gemeinsamen Vorfahr entwickelt

Diskussion

126

haben. Die einzelnen Dehydrogenasen (LDH: Lactatdehydrogenase, GAPDH: Glycerin-

aldehydphosphatdehydrogenase, ADH: Alkoholdehydrogenase) unterscheiden sich durch ihre

Substratspezifität. Die wiederum beruht auf der Verknüpfung der nukleotidbindenden

Domänen mit zusätzlichen Abschnitten am C- oder N-terminalen Ende (Eventoff et al., 1976;

Ruzheinikov et al., 2001). Alanin 208 ist nicht direkt an der „Rossmann fold“ beteiligt, liegt

aber angrenzend dazu und geht eine Wechselwirkung mit Asparaginsäure 205 ein, die

wiederum an der Rossmann fold beteiligt ist.

Dass die rückgängige Substitution der Mutation Asparaginsäure 225 zum Verlust der neuen

Aktivität geführt hat, war nicht zu erklären, da die Position 225 nicht an einer Wechsel-

wirkung zum Coenzym bzw. zu benachbarten Aminosäuren oder auch zum Substrat beteiligt

ist.

Unerwarteterweise zeigen die HPLC-Chromatogramme des durch die Dreifach-Mutante

gebildeten Phenyllactats, das die Reduktion nicht stereoselektiv erfolgt. L-Phenyllactat wird

zwar deutlich bevorzugt, aber nicht ausschließlich gebildet. Zusätzlich verändert sich der ee-

Wert noch im Verlauf der weiteren Umsetzung bis hin zum Racemat. Die HPLC-

Chromatogramme zeigen, dass diese nachträglich Veränderung des Enantiomeren-

verhältnisses wahrscheinlich durch einen sekundären Abbau des L-Phenyllactats durch eine E.

coli-eigene Lactat-Dehydrogenase bedingt ist. Auffallend ist aber die schwache Stereo-

selektivität des neuen Muteins. Diese konnte nicht durch Variation der Mutationen verändert

werden, da durch die Rücksubstitutionen gezeigt wurde, dass alle drei Mutationen eine Rolle

für die neue Eigenschaft spielen und die Deletion bzw. Substitution zum Verlust der Aktivität

führte. Eine Erklärung für die schwächere Stereoselektivität wäre, dass Arginin 66, das gegen

Lysin ausgetauscht wurde und im Gegensatz zum Lysin keine Wechselwirkung zur

Carboxylgruppe im Substrat hat, dafür verantwortlich sein könnte. Durch die Bindung von

Lysin 66 zur Carboxylgruppe im Substrat konnte ursprünglich das Substrat fixiert werden und

in der richtigen Orientierung in der Reaktion umgesetzt werden. Da aber im neuen Mutein die

Carboxylgruppe nicht mehr an Arginin bindet, könnte eine Reduktion nicht enantioselektiv

erfolgen.

Zusammenfassung

127

7 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden zwei NAD-abhängige Enzyme, Phenylalanin Dehydro-

genase (PheDH) aus Rhodococcus sp M4 und das malic enzyme aus E. coli K12 im gleichen

Expressionsvektor kloniert und deren Coexpression durchgeführt. Eine weitere Zielsetzung

dieser Arbeit war die Mutagenese der Phenylalanin Dehydrogenase, die sowohl mittels

Protein Design als auch durch Zufallsmutagenese (“directed evolution”) durchgeführt wurde.

Die Mutagenese diente zur Erweiterung des Substratspektrums der PheDH und um Einblicke

in deren Reaktionsmechanismus sowie Aufschluss über die Struktur – Funktionsbeziehungen

dieses Enzyms zu gewinnen.

Die Coexpression der PheDH und des malic enzymes diente der Ganzzellbiotransformation

zur reduktiven Aminierung von aromatischen Ketosäuren. Somit können Ketosäuren

umgesetzt und eine gleichzeitige Regenerierung des Coenzyms NADH mittels malic enzyme

durchgeführt werden.

Durch die Entwicklung einer neuen Klonierungsstrategie konnte das malic enzyme

erfolgreich amplifiziert, 3’ zur PheDH an der PstI- und HindIII- Schnittstelle kloniert und eine

Coexpression beider Enzyme ermöglicht werden. Mithilfe des bekannten N-Terminus des

malic enzymes konnten Einzelstränge amplifiziert und in weiteren PCR-Ansätze

komplementär verlängert werden.

Die PheDH und das malic enzyme wurden biochemisch umfassend charakterisiert und das

neue Plasmid-Konstrukt in E. coli JM105 für eine Ganzzellbiotransformation zur reduktiven

Aminierung von aromatischen Ketosäuren erfolgreich eingesetzt. Neben der Auswahl eines

geeigneten Vektor-Wirt-Systems wurden weitere Optimierungen, beispielsweise Induktions-

parameter, variiert, um eine effiziente Proteinexpression zu erzielen. Eine Hochzelldichte-

Fermentation führte zwar zu hoher Biomasse, dies wurde aber durch geringere spezifische

Aktivitäten erkauft.

Der Vorteil der Formiat Dehydrogenase, die sich bis dato für die Regenerierung des

Coenzyms NADH in situ durchgesetzt hat, liegt darin, dass bei der Regeneration durch

Formiat nur CO2 und keine weiteren Nebenprodukte entstehen. Da aber in dieser Arbeit nach-

gewiesen wurde, dass das malic enzyme ein durchaus erfolgreiches System darstellt und im

Ganzellsystem keine Nebenprodukte das gewünschte Produkt verunreinigen, könnten solche

in dieser Arbeit entwickelten Konstrukte technisch und wirtschaftlich interessanter sein. Das

L- Malat ist im Vergleich zum Na-Formiat vergleichbar kostengünstig. Ein weiterer

wesentlicher Vorteil der Ganzzellumsetzung liegt darin, dass auf die Präparation, möglicher-

weise Reinigung der Enzyme sowie den Zusatz an freiem Coenzym verzichtet werden kann.

Zusammenfassung

128

Zur Erweiterung des Substratspektrums der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp

M4, wurde die aufgeklärte Kristallstruktur mittels Computereinsatz modelliert und die am

aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren genauer für die Planung der Mutagenese

untersucht. Lysin 66 ist die Bindungsstelle zur Carboxylgruppe im Substrat (Phenylpyruvat

bzw. Phenylalanin). Für die Akzeptanz von Methylgruppen in Ketonen wurde der Austausch

des basischen Lysins 66 gegen eine neutrale Aminosäure mittels gezielter Mutagenese

postuliert. eine weitere Überlegung betraf die Änderung des Reaktionsmechanismus der

PheDH von einer reduktiven Aminierung zu einer Reduktion vom Typ einer Lactat

Dehydrogenase. Hierbei wurden Strukturen von Lactat-Dehydrogenasen verglichen und

Arginin als eine charakteristische Bindungsstelle zu Carboxylgruppe identifiziert, das dann an

der Stelle von Lysin 66 in der PheDH eingeführt worden ist.

Beide Versuche führten mittels gezielter Mutagenese zu negativen Ergebnissen. Durch den

Austausch der basischen Aminosäure Lysin 66 gegen das neutrale Isoleucin, verlor die

PheDH ihre ursprüngliche Aktivität. Beim zweiten Versuch, die Mutation des Lysin 66 gegen

Arginin und somit die Konstruktion einer Phenyllactat Dehydrogenase zu ermöglichen, ist die

PheDH-Aktivität aufgrund des Austausches einer basischen Aminosäure gegen eine basische

Aminosäure erhalten geblieben.

Für die Erweiterung des Substratspektrums war eine Änderung der Ladung im Falle K66I

nicht ausreichend. Daher wurden beide Mutanten, K66I und K66R, als Template in der

Zufallsmutagenese („directed evolution“) eingesetzt. Durch eine Zufallsmutagenese mittels

Variation der Konzentration an MgCl2 bzw. MnCl2 und dNTPs, konnte eine große Bank an

Enzymvarianten mit unterschiedlichen Mutationen hergestellt werden. Ein Screening nach der

gewünschten Phenyllactat Dehydrogenase erfolgte sowohl mittels einem in dieser Arbeit

entwickelten Verfahren als auch photometrisch durch die Absorption des Coenzyms NADH.

Sieben Mutanten aus ca. 20.000 Varianten zeigten Phenyllactat Dehydrogenase Aktivität

wobei nur die aktivste Mutante näher untersucht und zwei Mutationen T208A und E225D

zusätzlich zum K66R festgestellt wurden.

Die Kombination aus zwei verschiedenen Methoden, sowohl der gezielten als auch der

ungezielten Mutagenese, zeigte sich an diesem Beispiel als Erfolgskonzept und kann bei

zukünftigen Arbeiten in Betracht gezogen werden.

Anhang

129

DNA-Sequenz der Phenylalanin Dehydrogenase aus Rhodococcus sp. M4

1 ATGAGTATCG ACAGCGCACT GAACTGGGAC GGGGAAATGA CGGTCACCCG ATTCGACCGG 61 GAGACTGGTG CCCATTTCGT CATTCGACTC GATTCGACCC AACTCGGACC GGCGGCCGGA 121 GGCACCAGAG CCGCACAGTA CTCACAGCTG GCGGACGCCC TCACCGACGC CGGCAAATTG 181 GCGGGGGCGA TGACGTTGAA GATGGCAGTG AGCAACCTTC CGATGGGCGG GGGCAAATCC 241 GTCATTGCGC TTCCTGCGCC GCGTCATTCG ATCGATCCGA GCACGTGGGC ACGCATCCTC 301 CGAATCCACG CCGAGAACAT CGACAAGTTG TCCGGCAACT ACTGGACCGG ACCGGACGTC 361 AACACCAATT CGGCAGACAT GGATACTCTG AACGACACCA CCGAGTTCGT GTTCGGACGG 421 TCGCTCGAAC GCGGCGGCGC GGGTTCGAGC GCGTTCACCA CCGCCGTTGG CGTGTTCGAG 481 GCGATGAAGG CGACCGTCGC GCACCGTGGG CTGGGCTCAC TCGACGGTTT GACGGTCCTG 541 GTCCAAGGAC TGGGGGCAGT CGGAGGATCA TTGGCATCCC TGGCCGCCGA AGCGGGTGCG 601 CAACTCCTGG TGGCAGACAC CGACACCGAG CGAGTAGCGC ACGCTGTTGC GTTGGGCCAC 661 ACAGCGGTTG CCCTCGAGGA CGTTCTGTCC ACCCCGTGTG ATGTCTTCGC ACCCTGCGCA 721 ATGGGCGGCG TCATCACCAC CGAGGTGGCG CGAACACTCG ACTGTTCCGT CGTGGCCGGT 781 GCCGCCAACA ACGTCATCGC CGACGAGGCC GCCTCGGACA TCCTGCACGC ACGCGGAATT 841 CTGTACGCTC CCGACTTCGT GGCCAACGCC GGCGGTGCCA TCCACCTCGT AGGCCGGGAG 901 GTTCTCGGTT GGTCCGAGTC GGTTGTCCAC GAACGAGCAG TTGCCATAGG CGACACCCTG 961 AATCAGGTCT TCGAGATCTC CGACAACGAC GGCGTCACCC CGGACGAGGC CGCCCGCACT 1021 CTCGCTGGAC GGCGCGCCCG CGAGGCCTCG ACAACGACAG CGACTGCCTA GTAG

Anhang

130

DNA-Sequenz des malic enzymes aus E.coli K12

1 ATGGATATTC AAAAAAGAGT GAGTGACATG GAACCAAAAA CAAAAAAACA GCGTTCGCTT 61 TATATCCCTT ACGCTGGCCC TGTACTGCTG GAATTTCCGT TGTTGAATAA AGGCAGTGCC 121 TTCAGCATGG AAGAACGCCG TAACTTCAAC CTGCTGGGGT TACTGCCGGA AGTGGTCGAA 181 ACCATCGAAG AACAAGCGGA ACGAGCATGG ATCCAGTATC AGGGATTCAA AACCGAAATC 241 GACAAACACA TCTACCTGCG TAACATCCAG GACACTAACG AAACCCTCTT CTACCGTCTG 301 GTAAACAATC ATCTTGATGA GATGATGCCT GTTATTTATA CCCCAACCGT CGGCGCAGCC 361 TGTGAGCGTT TTTCTGAGAT CTACCGCCGT TCACGCGGCG TGTTTATCTC TTACCAGAAC 421 CGGCACAATA TGGACGATAT TCTGCAAAAC GTGCCGAACC ATAATATTAA AGTGATTGTG 481 GTGACTGACG GTGAACGCAT TCTGGGGCTT GGTGACCAGG GCATCGGCGG GATGGGCATT 541 CCGATCGGTA AACTGTCGCT CTATACCGCC TGTGGCGGCA TCAGCCCGGC GTATACCCTT 601 CCGGTGGTGC TGGATGTCGG AACGAACAAC CAACAGCTGC TTAACGATCC GCTGTATATG 661 GGCTGGCGTA ATCCGCGTAT CACTGACGAC GAATACTATG AATTCGTTGA TGAATTTATC 721 CAGGCTGTGA AACAACGCTG GCCAGACGTG CTGTTGCAGT TTGAAGACTT TGCTCAAAAA 781 AATGCGATGC CGTTACTTAA CCGCTATCGC AATGAAATTT GTTCTTTTAA CGATGACATT 841 CAGGGCACTG CGGCGGTAAC AGTCGGCACA CTGATCGCAG CAAGCCGCGC GGCAGGTGGT 901 CAGTTAAGCG AGAAAAAAAT CGTCTTCCTT GGCGCAGGTT CAGCGGGATG CGGCATTGCC 961 GAAATGATCA TCTCCCAGAC CCAGCGCGAA GGATTAAGCG AGGAAGCGGC GCGGCAGAAA 1021 GTCTTTATGG TCGATCGCTT TGGCTTGCTG ACTGACAAGA TGCCGAACCT GCTGCCTTTC 1081 CAGACCAAAC TGGTGCAGAA GCGCGAAAAC CTCAGTGACT GGGATACCGA CAGCGATGTG 1141 CTGTCACTGC TGGATGTGGT GCGCAATGTA AAACCAGATA TTCTGATTGG CGTCTCAGGA 1201 CAGACCGGGC TGTTTACGGA AGAGATCATC CGTGAGATGC ATAAACACTG TCCGCGTCCG 1261 ATCGTGATGC CGCTGTCTAA CCCGACGTCA CGCGTGGAAG CCACACCGCA GGACATTATC 1321 GCCTGGACCG AAGGTAACGC GCTGGTCGCC ACGGGCAGCC CGTTTAATCC AGTGGTATGG 1381 AAAGATAAAA TCTACCCTAT CGCCCAGTGT AACAACGCCT TTATTTTCCC GGGCATCGGC 1441 CTGGGTGTTA TTGCTTCCGG CGCGTCACGT ATCACCGATG AGATGCTGAT GTCGGCAAGT 1501 GAAACGCTGG CGCAGTATTC ACCATTGGTG CTGAACGGCG AAGGTATGGT ACTGCCGGAA 1561 CTGAAAGATA TTCAGAAAGT CTCCCGCGCA ATTGCGTTTG CGGTTGGCAA AATGGCGCAG 1621 CAGCAAGGCG TGGCGGTGAA AACCTCTGCC GAAGCCCTGC AACAGGCCAT TGACGATAAT 1681 TTCTGGCAAG CCGAATACCG CGACTACCGC CGTACCTCCA TCTAA

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An dieser Stelle möchte ich mich bei allen recht herzlich bedanken, die durch Rat und Tat zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, insbesondere danke ich Herrn Priv.- Doz. Dr. Werner Hummel für die Überlassung des Themas, seine vielfältigen konstruktiven Anregungen, seine stete Diskussionsbereitschaft und für die kritische Durchsicht der Arbeit, Herrn Prof. Dr. Cornelis P. Hollenberg für die Übernahme des Korreferats, Frau Prof. Dr. M. –R. Kula für die Möglichkeit, diese Dissertation am Institut für Enzymtechnologie durchführen zu können und für die sehr guten Arbeitsbedingungen an ihrem Institut, Herrn Dipl. Chem. Frank Schneider für die kritische Durchsicht der Arbeit, allen Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe und allen anderen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts, die mir mit fachlichen Ratschlägen zur Seite standen.

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