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Isolierung, Charakterisierung und Lokalisierung

der ATP-Synthasen der archaeellen Genera

Ignicoccus und Nanoarchaeum

DISSERTATION

ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES

DER NATURWISSENSCHAFTEN (DR. RER. NAT.)

DER FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND VORKLINISCHE MEDIZIN

DER UNIVERSITÄT REGENSBURG

vorgelegt von

Lydia Juliane Kreuter

aus Starnberg

im Jahr 2014

Das Promotionsgesuch wurde eingereicht am: 13.11.2014

Die Arbeit wurde angeleitet von: Prof. Dr. Reinhard Rachel

Prüfungsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. R. Wirth

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Rachel

2. Gutachter: Prof. Dr. V. Müller

3. Prüfer: Prof. Dr. C. Ziegler

Unterschrift:

Für meinen Vater, Dr. med. Bernhard Kreuter,

und meinen Opa, Dr. med. Franz Kreuter,

die diese Arbeit leider nie werden lesen können.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ..................................................................................................................... 1

2 Material und Methoden ............................................................................................ 11

2.1 Verwendete Substanzen und Materialien ........................................................ 11

2.1.1 Chemikalien, Biochemikalien und Lösungsmittel........................................ 11

2.1.2 Gase ............................................................................................................. 12

2.1.3 Molekularmassenstandards ........................................................................ 12

2.1.4 Reaktionskits, Membranen und Filtereinheiten ......................................... 13

2.1.5 Indikatoren für physiologische und zellbiologische Untersuchungen ........ 13

2.1.6 Antikörper.................................................................................................... 13

2.2 Sterilisation ........................................................................................................ 14

2.3 Mikroskopie ....................................................................................................... 15

2.3.1 Lichtmikroskopie ......................................................................................... 15

2.3.2 Transmissionselektronenmikroskopie ........................................................ 15

2.4 Verwendete Organismen und Kultivierung ....................................................... 16

2.4.1 Verwendete Stämme ................................................................................... 16

2.4.2 ½ SME Ignicoccus Medium .......................................................................... 16

2.4.2.1 Zusammensetzung (Huber et al., 2000; Paper et al., 2007) ................ 16

2.4.2.2 Herstellung in Serumflaschen .............................................................. 16

2.4.2.3 Herstellung für Großanzuchten im Fermenter .................................... 17

2.4.3 Kultivierung ................................................................................................. 18

2.4.3.1 Kultivierung in Serumflaschen ............................................................. 18

2.4.3.2 Kultivierung im Fermenter ................................................................... 18

2.4.3.3 Zellernte nach Kultivierung im Fermenter ........................................... 18

2.5 Zellaufschluss ..................................................................................................... 19

2.5.1 Puffer ........................................................................................................... 19

2.5.2 French Press ................................................................................................ 19

2.6 Membranpräparation ........................................................................................ 20

2.6.1 Differentielle Zentrifugation........................................................................ 20

2.6.2 Dichtegradienten-Zentrifugation ................................................................ 20

2.6.2.1 Herstellung der Auftragssuspension .................................................... 20

2.6.2.2 Saccharosegradient .............................................................................. 21

2.7 Solubilisierung ................................................................................................... 21

2.8 Chloroform/Methanol-Extraktion ..................................................................... 22

2.8.1 Puffer und Lösungen ................................................................................... 22

2.8.2 Durchführung .............................................................................................. 22

2.9 Chromatographische Enzymreinigung .............................................................. 23

2.9.1 Puffer ........................................................................................................... 23

2.9.2 Säulen .......................................................................................................... 24

Inhaltsverzeichnis

II

2.9.3 Durchführung .............................................................................................. 24

2.10 Proteinfällung .................................................................................................... 25

2.10.1 Probenvorbereitung .................................................................................... 26

2.10.2 Fällung mit PEG 6000 .................................................................................. 26

2.11 Vernetzung und Fixierung von Proteinen ......................................................... 26

2.11.1 Crosslinking ................................................................................................. 27

2.11.2 GraFix .......................................................................................................... 27

2.12 Bestimmung der Proteinkonzentration ............................................................ 27

2.12.1 BCA-Test ...................................................................................................... 27

2.12.2 Nanodrop 280 nm ....................................................................................... 28

2.13 Messung der Enzymaktivität ............................................................................. 28

2.13.1 Nachweis der ATP-Hydrolyseaktivität ......................................................... 28

2.13.1.1 ATPase In-Gel-Assay ............................................................................. 28

2.13.1.2 ‚Quicktest’, ‚Longtest’ und Hemmstofftest ......................................... 29

2.13.1.2.1 Puffer und Lösungen ..................................................................... 29

2.13.1.2.2 Durchführung ................................................................................ 29

2.13.2 Nachweis der Hydrogenaseaktivität ........................................................... 31

2.13.2.1 Hydrogenase In-Gel-Assay ................................................................... 31

2.13.2.2 Qualitativer Hydrogenasenachweis ..................................................... 31

2.14 Gelelektrophoretische Verfahren ..................................................................... 32

2.14.1 Gelelektrophorese ....................................................................................... 32

2.14.1.1 SDS-PAGE nach Lämmli, 1970 .............................................................. 32

2.14.1.1.1 Puffer ............................................................................................. 32

2.14.1.1.2 Durchführung ................................................................................ 32

2.14.1.2 SDS-PAGE nach Schägger, 2006 ........................................................... 33

2.14.1.2.1 Puffer ............................................................................................. 33

2.14.1.2.2 Durchführung ................................................................................ 33

2.14.1.3 Clear Native Elektrophorese (CNE) ...................................................... 34

2.14.1.3.1 Puffer ............................................................................................. 34

2.14.1.3.2 Durchführung ................................................................................ 34

2.14.1.4 2D-Native/SDS-PAGE ........................................................................... 35

2.14.2 Färben von Gelen ........................................................................................ 35

2.14.2.1 Coomassie-Färbung ............................................................................. 35

2.14.2.2 Silberfärbung ........................................................................................ 36

2.14.2.2.1 Durchführung ................................................................................ 36

2.14.2.2.2 Entfärben ....................................................................................... 37

2.15 Proteinidentifikation ......................................................................................... 37

2.15.1 Massenspektrometrische Methoden: MALDI-TOF MS/MS ........................ 37

2.15.2 Immunologische Methoden: Western-Blot ................................................ 38

2.15.2.1 Wetblot ................................................................................................ 38

2.15.2.2 Dotblot ................................................................................................. 39

2.15.2.3 Immundetektion .................................................................................. 39

2.15.2.3.1 Puffer und Lösungen ..................................................................... 39

2.15.2.3.2 Durchführung ................................................................................ 40

2.15.3 N-terminale Sequenzierung ........................................................................ 40

2.16 Bioinformatische Analysen................................................................................ 41

Inhaltsverzeichnis

III

3 Ergebnisse.................................................................................................................. 42

3.1 Versuche zur Reinigung der ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis im Tris-

Puffersystem bei pH 8,0 .................................................................................... 42

3.1.1 Bestimmung der optimalen Ionenkonzentration ........................................ 42

3.1.1.1 Einfluss der Ionenkonzentration auf die Aktivität ............................... 42

3.1.1.2 Einfluss der Ionenkonzentration auf die Stabilität .............................. 43

3.1.2 Reinigung der ATP-Synthase/ATPase .......................................................... 44

3.1.2.1 Saccharose-Dichtegradient .................................................................. 44

3.1.2.2 Chromatographische Reinigung und Analyse der Subkomplexe ......... 45

3.1.2.3 Identifizierung von Untereinheiten der ATP-Synthase/ATPase ........... 47

3.2 Versuche zur Reinigung des Gesamtkomplexes der ATP-Synthase/ATPase

von I. hospitalis im AMPSO-Puffersystem bei pH 9,0 ....................................... 49

3.2.1 Methodische Vorarbeiten ........................................................................... 49

3.2.1.1 Saccharose-Dichtegradient .................................................................. 49

3.2.1.2 ATPase-Aktivitätstest und Hemmstofftest .......................................... 49

3.2.2 Chromatographische Reinigung .................................................................. 52

3.2.2.1 Anionenaustausch- und Gelfiltrationschromatographie ..................... 52

3.2.2.2 Analyse der gereinigten Proteinkomplexe ........................................... 54

3.2.2.3 Versuche zur Stabilisierung des Gesamtkomplexes ............................ 59

3.2.3 Reinigung durch Fällung mit PEG 6000 ....................................................... 61

3.2.3.1 Reinigung aus bei 90°C gezüchteten Zellen ......................................... 61

3.2.3.2 Reinigung aus bei 75°C gezüchteten Zellen ......................................... 65

3.3 Isolierung und Charakterisierung der Untereinheit c der ATP-Synthase/

ATPase von I. hospitalis ..................................................................................... 67

3.3.1 Biochemische Analyse ................................................................................. 67

3.3.2 Bioinformatische Analyse ............................................................................ 68

3.4 Versuche zur Reinigung der ATP-Synthasen/ATPasen von I. pacificus und

I. islandicus ........................................................................................................ 69

3.4.1 Die ATP-Synthase/ATPase von I. pacificus .................................................. 69

3.4.1.1 Interpretation der Genomdaten .......................................................... 69

3.4.1.2 Versuche zur Reinigung ........................................................................ 69

3.4.2 Die ATP-Synthase/ATPase von I. islandicus ................................................. 71

3.4.2.1 Interpretation der Genomdaten .......................................................... 71

3.4.2.2 Versuche zur Reinigung ........................................................................ 72

3.4.3 Vergleich der ATP-Synthasen/ATPasen verschiedener Ignicoccus-Spezies 73

3.5 Versuche zur Reinigung und Charakterisierung der ATP-Synthase/ATPase

von N. equitans .................................................................................................. 75

3.5.1 Versuche zur Reinigung der ATP-Synthase/ATPase von N. equitans im Tris-

Puffersystem bei pH 8,0 .............................................................................. 75

3.5.1.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ....................................... 76

3.5.1.2 Analyse der Membranproteine ............................................................ 76

3.5.1.3 Chromatographische Reinigung ........................................................... 78

3.5.1.4 Versuche zur Natriumionen-Abhängigkeit der ATP-Synthase/ATPase

von N. equitans .................................................................................... 80

3.5.2 Versuche zur Reinigung der ATP-Synthase/ATPase von N. equitans im HEPES-

Puffersystem bei pH 7,0 .............................................................................. 82

3.5.2.1 Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ....................................... 83

Inhaltsverzeichnis

IV

3.5.2.2 Chromatographische Reinigung........................................................... 83

3.5.2.3 Analyse der Membranproteine............................................................ 85

3.6 Nachweis der Untereinheit c der ATP-Synthase/ATPase von N. equitans ....... 87

3.6.1 Biochemische Analyse ................................................................................. 88

3.6.2 Bioinformatische Analyse ............................................................................ 89

4 Diskussion .................................................................................................................. 90

4.1 Die ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis ....................................................... 90

4.2 Die ATP-Synthase/ATPase innerhalb der Gattung Ignicoccus .......................... 98

4.3 Die ATP-Synthase/ATPase von N. equitans ..................................................... 101

5 Zusammenfassung................................................................................................... 106

6 Literaturverzeichnis ................................................................................................. 107

7 Anhang .................................................................................................................... 116

A Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 116

B Abbildungsverzeichnis ..................................................................................... 119

C Tabellenverzeichnis ......................................................................................... 120

D Auflistung relevanter Proteine aus I. hospitalis, I. pacificus, I. islandicus und

N. equitans ........................................................................................................... 121

E Daten aus Analysen mittels MALDI-TOF MS/MS ............................................ 126

F Publikationen .................................................................................................. 128

G Danksagung ..................................................................................................... 129

Einleitung

1

1 Einleitung

‚All enzymes are beautiful, but the ATP synthase is one of the most beautiful

as well as one of the most unusual and important.’

(Paul D. Boyer: The ATP synthase – a splendid molecular machine)

Die Schönheit dieses ATP synthetisierenden Enzyms liegt in seiner asymmetrischen

dreidimensionalen Struktur. Ungewöhnlich ist es aufgrund seiner Komplexität und seines

Reaktionsmechanismus. Als wichtig kann die ATP-Synthase allein aufgrund der Schätzung

bezeichnet werden, dass ein aktiver Doktorand pro Tag mehr als sein/ihr Körpergewicht an

ATP synthetisiert (Boyer, 1997). ATP (Adenosintriphosphat) wird aus ADP

(Adenosindiphosphat) und anorganischem Phosphat gebildet und gilt als die universelle

Energiewährung der Zelle (Ballmoos et al., 2009).

Die Bedeutung der ATP-Synthase/ATPase wird durch die Tatsache unterstrichen, dass sie in

allen drei Domänen des Lebens (Woese et al., 1990) vorkommt und die jeweiligen Enzyme

große strukturelle und funktionale Ähnlichkeit besitzen (Hilario & Gogarten, 1993).

Grundsätzlich sind sie in der Lage, ATP sowohl zu synthetisieren als auch zu hydrolysieren. In

der Domäne der Bacteria findet sich der sog. F-Typ von ATP-Synthasen/ATPasen, der in der

Cytoplasmamembran der Bakterienzelle, aber auch in der inneren Mitochondrienmembran

und in der Thylakoidmembran von Chloroplasten vorkommt (Capaldi & Aggeler, 2002). Bei

den Eukarya gibt es die V-Typ ATPasen, die meist in intrazellulären Membranen wie bei

Endosomen, Lysosomen, Vesikelabschnürungen des Golgi-Apparates oder sekretorischen

Vesikeln, aber auch in der Cytoplasmamembran verschiedener Zelltypen (u.a. Nierenzellen,

Osteoklasten und Makrophagen) lokalisiert sind und in vivo als ATP-getriebene

Protonenpumpen fungieren (Cipriano et al., 2008). Innerhalb der Archaea finden sich

dagegen ATP-Synthasen/ATPasen des A-Typs (Müller & Grüber, 2003). Es wird

angenommen, dass sich die verschiedenen Typen der ATP-Synthasen/ATPasen aus einem

gemeinsamen Vorgängerenzym entwickelt haben. Heute bilden sie separate Cluster, die gut

mit der Einteilung der Organismen in die jeweiligen Domänen nach 16S rRNA-Genanalysen

übereinstimmen. Es gibt jedoch Ausnahmen, die vermutlich durch horizontalen Gentransfer

entstanden sind: Die Bakterien Thermus thermophilus und Entercoccus hirae besitzen ATP-

Synthasen/ATPasen des A-Typs, wobei diese in E. hirae nur bei alkalischem pH-Wert

zusätzlich zur F-Typ ATP-Synthase/ATPase exprimiert wird (Müller & Grüber, 2003). Bei den

methanogenen Archaeen Methanosarcina barkeri und Methanosarcina acetivorans wurden

zusätzlich zur A-Typ ATP-Synthase/ATPase Gene für ATP-Synthasen/ATPasen den F-Typs

gefunden (Müller & Grüber, 2003; Saum et al., 2009). Zumindest für M. acetivorans konnte

Einleitung

2

allerdings durch Deletionsversuche gezeigt werden, dass der Mikroorganismus auch ohne

diese Gene für eine F1FO ATP-Synthase/ATPase uneingeschränkt lebensfähig ist. Deren Zweck

bleibt also unklar (Saum et al., 2009).

Schematische Abbildungen der Untereinheitenzusammensetzung der verschiedenen ATP-

Synthase/ATPase-Typen verdeutlichen ihre strukturelle Ähnlichkeit (Abb. 1.1). Sie bestehen

zum einen aus einem membrangebundenen FO-/VO-/AO-Subkomplex, der als Ionenkanal

fungiert, und zum anderen aus einem löslichen F1-/V1-/A1-Subkomplex, der die katalytische

Funktion der ATP-Synthese bzw. -Hydrolyse innehat. Verbunden sind die beiden Teile durch

einen zentralen und einen oder zwei periphere Stiele (Grüber et al., 2001b; Müller & Grüber,

2003).

Abb. 1.1 Modelle der drei verschiedenen ATP-Synthase/ATPase-Klassen (aus Mayer & Müller, 2013)

Die Unterschiede zwischen den ATP-Synthase/ATPase-Typen beruhen in erster Linie auf

einer variierenden Anzahl an akzessorischen Untereinheiten im Bereich des zentralen und

peripheren Stiels. Während die F-Typ ATP-Synthase/ATPase lediglich einen peripheren Stiel

aus einem Homodimer (b2) und einen zentralen Stiel aus einer einzigen Untereinheit γ

besitzt, finden sich bei der V-Typ ATPase zwei periphere Stiele aus unterschiedlichen

Untereinheiten sowie mehrere Untereinheiten, die am Aufbau des zentralen Stiels beteiligt

sind (Abb. 1.1). Insbesondere die Untereinheiten C und H haben keine Homologe in

bakteriellen oder archaeellen ATP-Synthasen/ATPasen (Müller et al., 2005b) und sind an

dem für V-Typ ATPasen spezifischen Regulationsmechanismus durch reversible Dissoziation

in Subkomplexe beteiligt (Kane & Smardon, 2003). In der A-Typ ATP-Synthase/ATPase sind

sowohl Merkmale der F- als auch der V-Typ ATP-Synthasen/ATPasen zu finden. Einerseits

zeigen insbesondere die katalytischen Untereinheiten große Sequenzhomologien zu denen

Einleitung

3

der V-Typ ATPase, andererseits sind die ATP-Synthasen/ATPasen des A-Typs in ihrer Funktion

der ATP-Synthese mit denen des F-Typs vergleichbar (Schäfer & Meyering-Vos, 1992).

Zur Aufklärung der detaillierten Struktur der A-Typ ATP-Synthase/ATPase gab es in der

Vergangenheit verschiedene Ansätze. Die Struktur einzelner Untereinheiten konnte mittels

Röntgenkristallographie (Schäfer et al., 2006; Maegawa et al., 2006; Kumar et al., 2010;

Balakrishna et al., 2010; Balakrishna et al., 2012) oder NMR Spektroskopie (Kish-Trier et al.,

2008; Kish-Trier & Wilkens, 2009; Raghunathan et al., 2010; Gayen & Grüber, 2010) geklärt

werden. Der A1-Subkomplex konnte ebenfalls mittels Röntgenkristallographie (Grüber et al.,

2001a) sowie im Elektronenmikroskop (Wilms et al., 1996; Coskun et al., 2004) strukturell

untersucht werden. Eine kristallographische Analyse des AO-Subkomplexes ist bis heute nicht

gelungen (Lau & Rubinstein, 2011), jedoch konnte der c-Ring alleine detailliert untersucht

werden (Murata et al., 2005; Meier, 2005; Toei et al., 2007). Es war auch schon mehrfach

möglich, den gesamten ATP-Synthase/ATPase-Komplex im Elektronenmikroskop sichtbar zu

machen und so Aufschluss über dessen Struktur zu erhalten (Wilms et al., 1996; Lingl et al.,

2003; Vonck et al., 2009; Lau & Rubinstein, 2011).

Insgesamt ergibt sich für eine typische A1AO ATP-Synthase/ATPase eine

Untereinheitenstöchiometrie von A3B3CDE2FH2acx (Grüber et al., 2014). Der A1-Subkomplex

besteht aus jeweils drei Untereinheiten A und B, die abwechselnd zu einer

pseudohexameren Struktur angeordnet sind (Müller & Grüber, 2003), welche einen

Durchmesser von etwa 10 nm aufweist (Walker, 2013). Wie bei den V-Typ ATPasen ist die

Untereinheit A die katalytisch aktive, die die Walker-Motive A und B für die Bindung von

Nukleotiden enthält. Die Untereinheit B ist zwar auch fähig, Nukleotide zu binden, hat aber

vor allem eine regulatorische Funktion (Grüber et al., 2014). Der zentrale Stiel besteht aus

den Untereinheiten C, D und F (Abb. 1.1). Untereinheit D hat eine lange, linksgängige coiled-

coil-Struktur und ragt in das Zentrum des A/B-Hexamers. Sie kann durch Crosslinker an die

Untereinheit A gekoppelt werden, was auf eine enge Interaktion hindeutet (Coskun et al.,

2002). Gemeinsam mit der Untereinheit F, die wiederum an Untereinheit B gekoppelt

werden kann, bildet sie den Rotorschaft (Grüber et al., 2014). Untereinheit C, die eine

trichterförmige Struktur aufweist, stellt eine Verbindung zwischen den Untereinheiten D/F

und dem in die Membran eingebetteten c-Ring dar. Der D/F-Komplex ragt in den Trichter

hinein, der mit seinem schmalen Ende den Kontakt mit dem c-Ring herstellt (Lau &

Rubinstein, 2011). Die peripheren Stiele, von denen eine typische ATP-Synthase/ATPase des

A-Typs zwei besitzt, bestehen aus jeweils einer Untereinheit E und H (Grüber et al., 2014).

Eine Verbindung mit dem A/B-Hexamer erfolgt zwischen den Untereinheiten B und E (Lau &

Rubinstein, 2011). Auf der gegenüberliegenden Seite ist keine der beiden Untereinheiten E

oder H in der Membran verankert wie der periphere Stiel in der F-Typ ATP-Synthase/ATPase

(Grüber et al., 2014). Vielmehr gehen sie eine Verbindung mit dem hydrophilen Teil der

Untereinheit a (I) ein (Lau & Rubinstein, 2011). Die Untereinheit a bildet zusammen mit dem

aus c (K)-Untereinheiten aufgebauten Ring den AO-Subkomplex. Die N-terminale Domäne

Einleitung

4

der Untereinheit a ist hydrophil und bildet an der Membraninnenseite eine Art

Kragenstruktur aus, die wie bereits erwähnt mit den Untereinheiten der peripheren Stiele

verbunden ist (Grüber et al., 2014). Die C-terminale Domäne ist in die Membran eingebettet

und besitzt in einer typischen archaeellen ATP-Synthase/ATPase 7 – 8 Transmembranhelices.

Gemeinsam mit dem c-Ring ist sie für die Ionentranslokation zuständig, wofür sie in

unmittelbarem Kontakt mit zwei c-Untereinheiten steht (Grüber et al., 2014). Aufgrund der

Tatsache, dass diese Kontaktstelle so klein ist, werden die beiden Komponenten vermutlich

in erster Linie durch die peripheren Stiele zusammen gehalten (Lau & Rubinstein, 2011), die

damit entscheidend zur Stabilität des Enzymkomplexes beitragen. Der N-terminale Bereich

der c-Untereinheit ist hinsichtlich seiner Sequenz sehr variabel und kann unterschiedliche

Funktionen erfüllen (Zhang et al., 2013). Der C-terminale Bereich dagegen ist stark

konserviert und besteht bei vielen Archaeen aus zwei Transmembranhelices mit einer

Ionenbindestelle, wie es von F1FO ATP-Synthasen/ATPasen bekannt ist. Bei

Methanothermobacter thermoautotrophicus und einigen anderen Vertretern der

Methanogenen jedoch hat eine c-Untereinheit vier Transmembranhelices mit zwei

Ionenbindestellen, und bei den Gattungen Pyrococcus, Thermococcus, Desulfurococcus,

Staphylothermus und Ignisphaera findet sich bei vier Transmembranhelices lediglich eine

Bindestelle. Darüber hinaus gibt es beispielsweise bei Methanocaldococcus jannaschii und

Methanococcus maripaludis c-Untereinheiten mit sechs Transmembranhelices und jeweils

zwei Ionenbindestellen. Einen Extremfall stellt die c-Untereinheit von Methanopyrus kandleri

dar, die aus 26 Transmembranhelices mit 13 Ionenbindestellen besteht (Müller et al., 2005b;

Grüber et al., 2014). Es wird vermutet, dass diese speziellen Formen der c-Untereinheit

durch Genduplikation bzw. –vervielfältigung und anschließende Fusion entstanden sind

(Müller et al., 2005b).

Der Verlust einer Ionenbindestelle in einer c-Untereinheit mit vier Transmembranhelices wie

beispielsweise bei Pyrococcus furiosus bedeutet, dass nur noch halb so viele Ionen

transloziert werden können, was für die ATP-Synthese nicht mehr ausreichend wäre (Lau &

Rubinstein, 2011; Mayer et al., 2012b). In diesem Fall konnte jedoch gezeigt werden, dass

der c-Ring von P. furiosus aus zehn Monomeren besteht und somit deutlich größer ist als der

einer typischen F-Typ ATP-Synthase/ATPase. Dies resultiert in einem Verhältnis von 3,3

Ionen pro ATP, welches für die ATP-Synthese ausreichend ist (Vonck et al., 2009; Mayer et

al., 2012b).

Die Ionenbindestelle ist in der Regel spezifisch für H+- oder Na+-Ionen. Für die ATP-

Synthase/ATPase von Methanosarcina acetivorans konnte jedoch gezeigt werden, dass sie

sowohl H+- als auch Na+-Ionen binden und über die Membran transportieren kann (Schlegel

et al., 2012). Die meisten ATP-Synthasen/ATPasen von Archaeen (und auch von Bakterien)

sind protonenabhängig. Die Bindung erfolgt an einer konservierten Carboxylseitenkette der

Aminosäure Glutamat oder Aspartat der Untereinheit c (Grüber et al., 2014). Die Bindung

von Na+-Ionen ist komplexer und wurde bei P. furiosus und Ilyobacter tartaricus detailliert

Einleitung

5

untersucht (Mayer et al., 2012b; Meier, 2005). Die Aminosäuren Glutamat/Glutamin in der

einen Helix sowie Glutamat und Threonin/Serin in der benachbarten Helix gelten als

minimale Voraussetzung und werden als Na+-Bindemotiv bezeichnet (Grüber et al., 2014;

Dimroth & Ballmoos, 2008). Dieses findet sich bei allen methanogenen und halophilen

Archaeen sowie bei Vertretern der Gattungen Pyrococcus, Thermococcus, Desulfurococcus,

Ignisphaera, Staphylothermus und Nanoarchaeum (Grüber et al., 2014).

Unabhängig davon, welches Ion gebunden wird, ist der Funktionsmechanismus der ATP-

Synthase der gleiche. Ein Ion diffundiert von außen, der Seite mit der höheren

Ionenkonzentration, in den Eintrittskanal, der von der Untereinheit a gebildet wird. Es

neutralisiert die negative Ladung der Carboxylseitenkette an der Ionenbindestelle einer c-

Untereinheit, so dass diese in den hydrophoben Bereich der Membran eintreten kann. Dafür

gelangt an der anderen Seite der a/c-Kontaktstelle eine c-Untereinheit mit gebundenem Ion

in den Bereich des Austrittskanals der Untereinheit a und das Ion verlässt die Bindestelle.

Diese wird dann vermutlich durch eine konservierte Arginin-Seitenkette in der Untereinheit

a stabilisiert (Dimroth & Ballmoos, 2008; Grüber et al., 2014). Die so angetriebene Rotation

des c-Rings wurde durch Kopplung eines fluoreszierenden Actinmoleküls an die c-

Untereinheit experimentell dargestellt (Pänke et al., 2000). Aufgrund der festen Verbindung

des c-Rings mit dem zentralen Stiel ist dieser auch zur Rotation gezwungen, was ebenfalls

mittels fluoreszierender Actinmoleküle veranschaulicht werden konnte, die an die

Untereinheiten γ (Noji et al., 1997) bzw. ε (Kato-Yamada et al., 1998) der bakteriellen ATP-

Synthase/ATPase gekoppelt wurden. Während der ATP-Synthese wird die

Rotationsgeschwindigkeit auf 100 – 150 Umdrehungen/s geschätzt (Walker, 2013).

Untereinheit γ entspricht der Untereinheit D, die durch die Rotation innerhalb der

hexagonalen Struktur des A/B-Komplexes Konformationsänderungen der katalytischen

Untereinheiten hervorruft. Diese selbst werden durch die Verbindung mit den peripheren

Stielen an der Rotation gehindert (Ballmoos et al., 2009). Die drei katalytischen

Untereinheiten A befinden sich also in unterschiedlichen Konformationen, die im Modell des

‚binding change mechanism‘ als loose, tight und open bezeichnet werden. In ersterem

Zustand werden ADP und Phosphat lose gebunden. Im tight-Zustand erfolgen eine feste

Bindung und die Bildung von ATP durch Abspaltung von Wasser. Schließlich wird im open-

Zustand ATP freigesetzt (Boyer, 1993). In umgekehrter Richtung funktioniert die ATP-

Synthase/ATPase als Ionenpumpe, die unter Verbrauch von ATP einen Ionengradienten

aufbaut. Es wird angenommen, dass dies die physiologische Funktion der ATP-

Synthase/ATPase von E. hirae ist. Für die ATP-Hydrolyse des A1-Subkomplexes wurde hier

eine Rotationsgeschwindigkeit von etwa 73 Umdrehungen/s ermittelt. Die Rotation erfolgte

in drei Schritten von jeweils 120° und ohne die von bakteriellen ATP-Synthasen/ATPasen

bekannten Zwischenschritte (Minagawa et al., 2013). Dies weist auf einen bedeutenden

Unterschied im Funktionsmechanismus der ATP-Synthasen/ATPasen des A-Typs und des F-

Typs hin (Grüber et al., 2014).

Einleitung

6

Die meisten strukturellen Informationen über A1AO ATP-Synthasen/ATPasen stammen

entweder aus Untersuchungen der Enzyme aus den Bakterien T. thermophilus (Lau &

Rubinstein, 2011) und E. hirae (Arai et al., 2013) oder aus den Euryarchaeoten P. furiosus

(Vonck et al., 2009) und M. jannaschii (Lingl et al., 2003). Über crenarchaeelle ATP-

Synthasen/ATPasen ist dagegen wenig bekannt. Keiner der Versuche zur Reinigung des

Enzyms aus Sulfolobus acidocaldarius (Wakagi & Oshima, 1985; Lübben & Schäfer, 1987),

Sulfolobus solfataricus (Hochstein & Stan-Lotter, 1992) und Pyrodictium abyssi (Dirmeier et

al., 2000) führte zur Anreicherung einer gekoppelten A1AO ATP-Synthase/ATPase.

Crenarchaeota werden oft als die ursprünglichsten Vertreter der Archaea angesehen und

umfassen viele hyperthermophile Organismen (Woese et al., 1990).

Ignicoccus hospitalis, der bislang einzige bekannte Wirt für Nanoarchaeum equitans, ist ein

solcher Organismus. Er wurde aus einem Hydrothermalsystem bei Kolbeinsey Ridge (Island)

isoliert und wächst optimal bei 90°C, 1,4 % NaCl und pH 5,5 mit einer minimalen Teilungsrate

von 1 Stunde. Die Zellen von I. hospitalis sind kokkoid und haben eine Größe von 1 – 4 µm

(Paper et al., 2007). Ihre Zellhülle besteht aus zwei Membranen und nicht, wie bei vielen

anderen Crenarchaeota, aus einer Cytoplasmamembran und einem S-Layer (Paper et al.,

2007; Rachel et al., 2002; Abb. 1.2). I. hospitalis hat Zellanhänge, die als Fibers bezeichnet

werden, da sie sich deutlich von archaeellen Flagellen oder Fimbrien unterscheiden. Sie

haben einen Durchmesser von 14 nm und eine Länge von bis zu 20 µm und bestehen aus

dem Protein Igni_0670 (Müller et al., 2009). Es wurde gezeigt, dass die Fibers einen Typ IV-

Pili-ähnlichen Aufbau besitzen (Yu et al., 2012) und über eine bislang einzigartige Struktur

innerhalb der inneren Membran verankert sind (Meyer et al., 2014).

I. hospitalis wächst obligat anaerob und chemolithoautotroph. Seine einzige Energie

liefernde Reaktion ist die Reduktion von elementarem Schwefel mit molekularem

Wasserstoff zu Schwefelwasserstoff (H2S) (Paper et al., 2007). Kohlenstoffdioxid (CO2) stellt

eine Kohlenstoffquelle dar und wird über einen bislang nur bei I. hospitalis bekannten CO2-

Fixierungsweg, den sog. Dicarboxylat/4-Hydroxybutyratzyklus, assimiliert (Jahn et al., 2007;

Huber et al., 2008). Kürzlich wurde im Phylum der Thaumarchaeota ein ähnlicher CO2-

Fixierungsweg beschrieben, wobei davon ausgegangen wird, dass sich die beiden Wege

unabhängig voneinander entwickelt haben (Könneke et al., 2014). Des Weiteren werden von

I. hospitalis unter anderem auch Acetat und Pyruvat aufgenommen, wobei der weitere

Metabolismus noch unklar ist (Jahn et al., 2007).

Die limitierte Stoffwechselvariabilität von I. hospitalis lässt sich durch das stark reduzierte

Genom erklären. I. hospitalis besitzt ein einziges zirkuläres Chromosom von ca. 1,3 Mbp

Länge. Damit ist es eines der kleinsten bekannten Genome von frei lebenden Organismen.

Lediglich etwa 1400 für Proteine kodierende Gene wurden aufgrund der Annotation

vorhergesagt und in Proteomanalysen zu einem sehr hohen Prozentsatz (> 80 %) verifiziert

(Giannone et al., 2011; Giannone et al., 2014). Darunter befinden sich eine vollständige A1AO

Einleitung

7

ATP-Synthase/ATPase, zwei Typen von Schwefelreduktasen, eine Hydrogenase sowie einige

wenige Transporter und die Komponenten des Sec- und des Tat-Systems für den

Proteintransport innerhalb der Zelle (Podar et al., 2008).

Der Proteintransport muss in I. hospitalis ein gut koordinierter Vorgang sein, da

sichergestellt sein muss, dass ein Protein an seinen Zielort in der inneren bzw. äußeren

Zellmembran bzw. in dem entsprechenden Kompartiment gelangt. Wie bereits erwähnt,

besitzt I. hospitalis zwei Membranen (Abb. 1.2), von denen die innere das Cytoplasma

umgibt, in welchem DNA und Ribosomen lokalisiert sind (Küper et al., 2010). Sie besteht aus

Di- und Tetraetherlipiden (Archaeol und Caldarchaeol; Jahn et al., 2004) und obwohl davon

ausgegangen werden muss, dass sie Transporter für verschiedene Metaboliten beherbergt

(Giannone et al., 2011), konnten bislang keine entsprechenden Proteine identifiziert oder

lokalisiert werden. Dies ist jedoch Teil der aktuellen Forschung (laufende Doktorarbeiten von

Stefanie Daxer und Pia Wiegmann). Es gibt

Hinweise auf eine membrangebundene

Pyrophosphatase, die möglicherweise die

innere Membran für Transportprozesse

energetisiert. Allerdings sind noch keine

Antikörper gegen dieses Protein verfügbar,

so dass bislang keine Lokalisierungsstudien

vorgenommen werden konnten (Daxer,

2011). Zwischen der inneren und der

äußeren Zellmembran befindet sich das sog.

Intermembrankompartiment (IMC) (Huber

et al., 2012; Abb. 1.2). Anfangs wurde

angenommen, dass das IMC ein dem

Periplasma von Gram-negativen Bakterien

ähnliches ‚Kompartiment‘ darstellt, das

zahlreiche Vesikel enthält (Rachel et al., 2002). In den letzten Jahren konnte jedoch gezeigt

werden, dass dort verschiedene metabolische Prozesse stattfinden (Küper et al., 2010;

Mayer et al., 2012a) und dass die Vesikel meist nicht frei vorkommen, sondern Teil eines

endogenen Membransystems aus Röhren sind. Darüber hinaus gibt es Filamentstrukturen im

IMC, die möglicherweise eine Art Cytoskelett bilden (Heimerl, 2014). Nach außen hin ist das

IMC von der sog. äußeren Zellmembran (outer cellular membrane – OCM; Abb. 1.2)

abgegrenzt, deren Name bereits auf die funktionellen und strukturellen Unterschiede zur

äußeren Membran von gramnegativen Bakterien hinweist (Huber et al., 2012). Sie besteht

im Gegensatz zur inneren Membran nur aus Dietherlipiden (Archaeol; Jahn et al., 2004)

sowie dem Protein Ihomp1 in sehr großer Anzahl (früher Imp1227; Burghardt et al., 2007;

Rachel et al., 2002). Ihomp1 hat eine Masse von 6,23 kDa und bildet in der OCM

homodekamere, porenähnliche Komplexe. Diese haben einen Durchmesser von 7 nm und

Abb. 1.2 Ultradünnschnitt einer I. hospitalis-Zelle. Cy: Cytoplasma, IM: innere Membran,

IMC: Intermembrankompartiment, OCM: äußere

Zellmembran, Cap: Cellulosekapillare (aus Huber et al.,

2012)

Einleitung

8

weisen nach Negativkontrastierung eine mit dem Kontrastmittel gefüllte ‚Pore‘ von 2 nm

auf. Ob die ‚Pore‘ in vivo existiert und offen ist, ist genauso wenig geklärt wie die Funktion

dieses über die gesamte äußere Zellmembran verteilten Proteinnetzes. Da Ihomp1 jedoch

nur bei I. hospitalis und nicht bei anderen Vertretern der Gattung Ignicoccus zu finden ist,

wird vermutet, dass es eine zentrale Rolle bei der Interaktion mit N. equitans spielt

(Burghardt et al., 2007; Huber et al., 2012). Dass Ihomp1 tatsächlich eine offene Pore

ausbildet, die einen Ionenfluss durch die Membran möglich macht, ist nahezu

ausgeschlossen, da die äußere Zellmembran von I. hospitalis energetisiert ist und ein

Ionengradient aufrechterhalten werden muss. Durch Immunmarkierungsversuche an

Ultradünnschnitten und an ganzen Zellen konnte gezeigt werden, dass die OCM sowohl die

ATP-Synthase/ATPase (die sekundäre Ionenpumpe) als auch die Schwefelreduktase (die

primäre Ionenpumpe) sowie die Acetyl-CoA-Synthetase (ACS – ein ATP-verbrauchendes

Enzym) beherbergt (Küper et al., 2010; Mayer et al., 2012a). Es gibt also eine räumliche

Trennung von DNA-Replikation sowie Proteinbiosynthese im Cytoplasma und

Energiegewinnung im IMC (Küper et al., 2010; Huber et al., 2012). Die Lokalisation weiterer

ATP-verbrauchender Stoffwechselreaktionen neben der ACS wie beispielsweise von

Schritten des CO2-Fixierungsweges ist Gegenstand aktueller Forschung (laufende

Doktorarbeit von Jennifer Flechsler).

Die anderen bekannten Vertreter der Gattung Ignicoccus (I. islandicus, I. pacificus und das

Isolat MEX13A) weisen bezüglich Physiologie und Zellstruktur große Ähnlichkeiten zu

I. hospitalis auf. Sie haben alle eine Zellhülle aus zwei Zellmembranen und wachsen

chemolithoautotroph auf elementarem Schwefel (Huber et al., 2000; Lange, 2009). Bei dem

Isolat MEX13A konnte die Dynamik der vesikulären/tubulären Strukturen im IMC anschaulich

dargestellt werden (Lange, 2009; Heimerl, 2014). Ansonsten ist über diesen Stamm noch

recht wenig bekannt, was unter anderem daran liegt, dass es bisher nicht möglich war, ihn

im Großmaßstab zu züchten (Information von Dr. H. Huber und C. Wartner) und somit nicht

genügend Zellmaterial für biochemische Untersuchungen zu Verfügung steht. Bei

I. islandicus und I. pacificus wurde von Zellanhängen berichtet (Huber et al., 2000), die bei

I. pacificus näher charakterisiert und zum einen als ‚IPEPs‘ (I. pacificus extracellular particles)

und zum anderen als ‚Flagellen‘ bezeichnet wurden (Meyer, 2007). Letztere konnten über

ihre N-terminale Sequenz als Homologe zu den Fiberproteinen von I. hospitalis identifiziert

werden (Meyer, 2010). Immunmarkierungsversuche mit ganzen Zellen der drei bekannten

Ignicoccus-Arten zur Lokalisation der an der Energiegewinnung beteiligten Enzymkomplexe

zeigten, wie bei I. hospitalis, Signale an der äußeren Zellmembran (Daxer, 2011).

Markierungen an Ultradünnschnitten waren diesbezüglich jedoch nicht eindeutig. Während

bei I. pacificus und MEX13A keine spezifische Markierung erreicht werden konnte, wurde bei

I. islandicus eine schwache aber eindeutige, gleichmäßige Markierung der äußeren

Zellmembran sowie des Cytoplasmas detektiert (Flechsler, 2010).

Einleitung

9

Ein Grund, weshalb bislang der Fokus der Forschung vornehmlich auf I. hospitalis lag und

über seine nächsten Verwandten noch verhältnismäßig wenig bekannt ist, liegt wohl darin,

dass I. hospitalis der einzige bekannte Wirt für Nanoarchaeum equitans ist (Huber et al.,

2002). Diese Assoziation zweier Archaeen galt lange Zeit als einmalig, jedoch wurden

mittlerweile weitere Vertreter der Nanoarchaeota in verschiedenen Ökosystemen entdeckt

und beschrieben (Hohn et al., 2002; Podar et al., 2013) und vor kurzem auch kultiviert

(Mitteilung von Dr. Mircea Podar).

N. equitans-Zellen sind kleine Kokken mit einem Durchmesser von 350 bis 500 nm (Huber et

al., 2002). Sie zeigen bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen ein dicht gepacktes

Cytoplasma, das von einer Membran umgeben ist (Junglas et al., 2008; Abb. 1.3). Diese weist

eine nahezu identische Zusammensetzung

wie die innere Membran von I. hospitalis auf

(Jahn et al., 2004). Nach einem etwa 20 nm

breiten periplasmatischen Spalt folgt ein S-

Layer – eine gleichmäßige Proteinschicht aus

Glycoprotein (Junglas et al., 2008; Abb. 1.3).

Die optimalen Wachstumsbedingungen von

N. equitans sind denen von I. hospitalis sehr

ähnlich (Jahn et al., 2008; Paper et al., 2007).

Hier zeigte N. equitans eine minimale

Verdopplungszeit von 45 Minuten (Jahn et

al., 2008). Für das Wachstum von

N. equitans ist ein direkter Zellkontakt mit

I. hospitalis notwendig (Huber et al., 2002).

Die Kontaktstelle zwischen den beiden Zellen ist sehr klein (40 – 170 nm im Durchmesser),

was eine detaillierte Untersuchung schwierig macht (Junglas et al., 2008). Es wurde jedoch

gezeigt, dass N. equitans-Zellen oftmals am ‚Cytoplasma-Pol‘ einer I. hospitalis-Zelle

anheften, wo die innere und die äußere Zellmembran direkt übereinander liegen (Junglas et

al., 2008; Heimerl, 2014). Neueste elektronentomographische Analysen lassen hier einen

direkten Kontakt der Cytoplasmen erkennen, wobei der S-Layer von N. equitans an dieser

Stelle degeneriert zu sein scheint. Filamentöse Strukturen scheinen die Verbindung zu

stabilisieren (Heimerl, 2014). Eine solche Verbindung würde den Metabolit-Transport von

I. hospitalis zu N. equitans erleichtern, der für Lipide, Aminosäuren und einige Proteine

bereits nachgewiesen wurde (Jahn et al., 2004; Jahn et al., 2008; Giannone et al., 2011;

Heimerl, 2014). Im Genom von N. equitans fehlen viele Gene für verschiedene Stoffwechsel-

und Biosynthesewege, was den Import weiterer Stoffwechselprodukte von I. hospitalis

wahrscheinlich macht (Waters et al., 2003). Das Genom besteht aus nur 0,49 Mbp in einem

zirkulären Chromosom und ist somit eines der kleinsten bislang bekannten Genome.

Nichtsdestotrotz enthält es alle notwendigen Gene für Replikation, Transkription,

Abb. 1.3 Schicht aus Tomogramm einer N. equitans-Zelle (aus Heimerl, 2014)

Einleitung

10

Translation, DNA-Reparatur und Zellzyklus (Waters et al., 2003). Das S-Layer-Protein NEQ300

sowie das S-Layer-assoziierte Protein NEQ236 wurden in Proteomanalysen als äußerst

abundant eingestuft. Hier konnten auch die Untereinheiten A, B, D und a der A1AO ATP-

Synthase/ATPase von N. equitans nachgewiesen werden. Vermutlich aufgrund seiner starken

Hydrophobizität war die Untereinheit c in diesen Proteomanalysen nicht vertreten

(Giannone et al., 2011). Ob die fünf im Genom von N. equitans annotierten Untereinheiten

einer ATP-Synthase/ATPase für ein stabiles, funktionsfähiges Enzym kodieren und ob dieses

Enzym ATP synthetisieren oder lediglich hydrolysieren kann, konnte bis heute nicht geklärt

werden (Waters et al., 2003; Küper, 2010).

Neben der Reinigung und Charakterisierung der ATP-Synthase/ATPase von N. equitans und

somit der Beantwortung der Frage, ob N. equitans selbst ATP synthetisieren kann, sollte in

dieser Arbeit auch die ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis weitergehend untersucht

werden. Bislang wurden neben den Lokalisierungsstudien (Küper et al., 2010) auch Versuche

zur Reinigung des Enzyms durchgeführt, die jedoch nicht in einem isolierten Gesamtkomplex

resultierten (Röhl, 2010; Küper, 2010; Kreuter, 2010). Der A1-Subkomplex konnte zwar

gereinigt und dessen Stöchiometrie zu A3B3EF bestimmt werden, jedoch blieben

Kristallisationsexperimente erfolglos und auch mittels elektronenmikroskopischer

Untersuchungen konnte die Struktur, die mit nur einem peripheren Stiel für eine archaeelle

ATP-Synthase/ATPase sehr ungewöhnlich wäre, nicht verifiziert werden (Küper, 2010). In

dieser Arbeit sollten bestehende Reinigungsprotokolle optimiert und ggf. neue Protokolle

entwickelt werden, so dass eine Reinigung des Gesamtkomplexes der ATP-Synthase/ATPase

gelingt. Die erarbeiteten Methoden sollten auch auf die Reinigung der entsprechenden

Enzymkomplexe aus I. pacificus und I. islandicus angewendet werden, um vorhandene

Unterschiede und Gemeinsamkeiten der ATP-Synthasen/ATPasen dieser nah verwandten

Arten zu erkennen und zu beschreiben.

Da in der Vergangenheit Versuche zur Reinigung der ATP-Synthase/ATPase von N. equitans

aufgrund der geringen Massen von angereicherten N. equitans-Zellen nahezu unmöglich

waren, sollten diese mit Zellen der Cokultur von I. hospitalis und N. equitans durchgeführt

werden. Die bereits gesammelten Erkenntnisse über die ATP-Synthase/ATPase von

I. hospitalis sollten es möglich machen, die beiden Enzyme während der Reinigung zu

differenzieren.

Zudem sollten die jeweiligen c-Untereinheiten der ATP-Synthasen/ATPasen von I. hospitalis

und N. equitans, die bislang in Proteomstudien nicht repräsentiert waren, isoliert und

charakterisiert werden.

Material und Methoden

11

2 Material und Methoden

2.1 Verwendete Substanzen und Materialien

2.1.1 Chemikalien, Biochemikalien und Lösungsmittel

Substanz Hersteller

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Acetonitril J. T. Baker, Deventer, NL

Acrylamid 2x, research grade Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Acrylamid 4x, analytical grade Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Acrylamid 30 % (Rotiphorese Gel 30) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Adenosin-5’-Triphosphat, Dinatriumsalz Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Adenosin-5’-Triphosphat, Dinatriumsalz, ultrapur Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Adenosin-5’-Triphosphat, Magnesiumsalz 95 % Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Albumin Fraction V (BSA) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat (APS) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Ammoniumhydrogencarbonat Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Bacto Hefeextrakt BD, Heidelberg

Benzylviologen Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Bis(tributyltin)oxid (TBT-Oxid) Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

BisTris Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

β-Mercaptoethanol Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Coomassie Brilliant Blue R250 Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Diethylstilbestrol (DES) Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

DNase I Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

ε-Aminocapronsäure Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Ethanol absolut Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Glutaraldehyde solution, Grade I, 25 % Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Glycerin, 86 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Imidazol, ACS Reagenz 99 % Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Isopropanol J. T. Baker, Deventer, NL

Methylenblau Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Natriumcarbonat Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Natriummetabisulfit (Na2S2O5), ACS Reagenz 97+ % Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Natriumthiosulfat (Na2S2O3) Riedel-de Haen, Seelze


12

N-(1,1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)-3-amino-2-

hydroxypropansulfonsäure (AMPSO) Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)

(HEPES) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid (DDM) Anatrace Inc., Maumee, OH, USA

N,N’-Dicyclohexylcarbodiimid (DCCD) Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

N,N’-Methylenbisacrylamid 2x Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

n-Octyl-β-D-glucopyranosid (OG) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Polyethylenglykol (PEG) 6000 Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Ponceau S Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg

Resazurin Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Schwefel Riedel-de Haen, Seelze

Serva Blue G Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Silbernitrat Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Tricin Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Tris-(hydroxylmethyl)aminoethan USB Corporation, Cleveland, OH, USA

Triton X-100 Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Trypsin,sequencing grade Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Tween 20 Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

Alle übrigen, hier nicht aufgeführten Chemikalien und Biochemikalien wurden von der Firma

VWR (Darmstadt) bezogen. Die Qualität betrug, falls nicht anders angegeben, p.a. (zur

Analyse).

2.1.2 Gase

Alle verwendeten Gase wurden von der Firma Linde Technische Gase GmbH in

Höllriegelskreuth bezogen.

2.1.3 Molekularmassenstandards

Molekularmassenstandard Hersteller

High Molecular Weight Calibration Kit

for Electrophoresis GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK

PageRuler Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot


13

2.1.4 Reaktionskits, Membranen und Filtereinheiten

Artikel Hersteller

BCA Protein Assay Kit Pierce, Rockford, IL (USA)

Faltenfilter, Ø 270 mm bzw. 320 mm Schleicher & Schuell, Dassel

Immobilon-P™ Transfermembran Millipore, Bedford, MA (USA)

Lumi-Light™ Western Blotting Substrate Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Spritzenaufsatzfilter (Celluloseacetat), 0,2 µm/ 0,45 µm VWR, Darmstadt

Vivaspin™ (Polyethersulfan), MWCO 100 000 Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen

Whatman Membranfilter (Cellulosemischester), 0,2 µm GE Healthcare, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK

Whatman Chromatography Paper (3MM Chr) GE Healthcare, Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK

2.1.5 Indikatoren für physiologische und zellbiologische Untersuchungen

Indikator Hersteller

Blei(II)-Acetatpapier Machery-Nagel, Düren

pH-Indikatorpapier VWR, Darmstadt

DAPI Sigma Aldrich GmbH, Taufkirchen

SYTO®9 nucleic acid stain Invitrogen, Eugene, USA

Live/Dead® BacLight™ Bacterial Viability Kit Invitrogen, Eugene, USA

2.1.6 Antikörper

Primärantikörper Ursprung des Antigens Hersteller

rabbit anti-atp A1 Ignicoccus pacificus Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp A1 Ignicoccus hospitalis Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp a (rec) Ignicoccus hospitalis Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp c (syn) Ignicoccus hospitalis GenScript, Piscataway, USA

rabbit anti-atp B Methanocaldococcus jannaschii Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp C Methanocaldococcus jannaschii Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp D Methanocaldococcus jannaschii Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp E Methanocaldococcus jannaschii Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-atp F Methanocaldococcus jannaschii Davids Biotechnologie, Regensburg

rabbit anti-SRed Pyrodictium abyssi TAG 11 Uni Regensburg (Dirmeier, 1998)

anti-Thermosom Ignicoccus hospitalis Davids Biotechnologie, Regensburg

anti-S-Layer Nanoarchaeum equitans Davids Biotechnologie, Regensburg


14

Die Antikörper gegen den A1-Subkomplex von I. hospitalis sowie gegen die ATP-Synthase-

Untereinheiten a und c entstanden im Rahmen der Promotion von Ulf Küper (Küper, 2010)

am Lehrstuhl für Mikrobiologie. Der Antikörper gegen die H2:Schwefel-Oxidoreduktase

(SRed) von P. abyssi TAG 11 wurde von Reinhard Dirmeier während seiner Promotion am

Lehrstuhl für Mikrobiologie generiert (Dirmeier, 1998). Der Antikörper gegen den S-Layer

von N. equitans entstand im Rahmen der Diplomarbeit von Thomas Menzel am Lehrstuhl für

Mikrobiologie (Menzel, 2007) und der Antikörper gegen das Thermosom von I. hospitalis

während der Diplomarbeit von Florian Mayer (Mayer, 2008). Die Antikörper gegen die

Untereinheiten der ATP-Synthase von M. jannaschii wurden freundlicherweise von Prof. Dr.

Volker Müller von der Goethe Universität in Frankfurt/Main zur Verfügung gestellt.

Für die Gewinnung des Antikörpers gegen den A1-Subkomplex der ATP-Synthase von

I. pacificus wurde der Komplex gereinigt, in einer nativen Gelelektrophorese aufgetrennt und

der Firma Davids Biotechnologie in Regensburg übergeben, wo der Proteinkomplex aus dem

Gel extrahiert und einem Kaninchen injiziert wurde.

Sekundärantikörper Hersteller

goat anti-rabbit IgG + DyLight 650 Thermo, Rockford, USA

goat anti-rabbit IgG + HRP Sigma, St. Louis, USA

2.2 Sterilisation

Glaswaren (Schott Glaswerke, Mainz), Spatel und Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen

(Sarstedt, Nümbrecht) und Spritzen (Ersta, Maersk, DK und BD, Drogheda, IE) wurden 40

Minuten bei 121°C und 200 kPa Druck bei feuchter Hitze sterilisiert (Autoklav von Wolf

SANOclav, Geislingen). Anschließend wurden die Materialien im Trockenschrank (Heraeus,

Hanau) bei 60°C getrocknet.

Glaspipetten wurden über Nacht bei 140°C und trockener Hitze sterilisiert.

Puffer, insbesondere Chromatographiepuffer und andere Waschlösungen für

Chromatographiesäulen, wurden über Whatman Membranfilter mit einer Porengröße von

0,2 µm steril filtriert.


15

2.3 Mikroskopie

2.3.1 Lichtmikroskopie

Für lichtmikroskopische Untersuchungen wurde mit einem Olympus BX 60

Phasenkontrastmikroskop (Olympus, Hamburg) gearbeitet. Standardmäßig wurde ein Okular

mit 10facher Vergrößerung in Kombination mit einem Ölimmersionsobjektiv (100x / 1.30 Oil

Ph3) eingesetzt. Zur Dokumentation wurden eine EOS D 60 Spiegelreflexkamera (Canon,

Tokyo, Japan) und die EOS Utility Steuerungssoftware verwendet.

Die Aufnahmen wurden mit dem Programm Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San

José, USA) bearbeitet.

Für die Zellzahlbestimmung wurde eine Thoma-Zählkammer (Marienfeld, Lauda-

Königshofen) eingesetzt. Unter Verwendung eines Luftobjektivs (40x / 0.75 Ph2) wurden die

Zellen entsprechend den Herstellerangaben gezählt und die Zellzahl berechnet. Eine Zelle

pro Kleinstquadrat entsprach 2 x 107 Zellen/ml.

2.3.2 Transmissionselektronenmikroskopie

Die Durchführung von elektronenmikroskopischen Untersuchungen erfolgte durch Frau

Jennifer Flechsler und Prof. Dr. Reinhard Rachel an einem Philips CM12

Transmissionselektronenmikroskop (FEI, Eindhoven, NL) mit LaB6-Kathode und einer

digitalen Slow-Scan-CCD-Kamera (TEM-1000; TVIPS, Gauting) sowie an einem JEOL JM-2100F

(JEOL Ltd., Tokyo, JP) mit Feldemissionskathode und 4k x 4k CMOS Kamera (TemCam-F416;

TVIPS, Gauting).

Die Aufnahmen wurden mit dem Programm Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., San

José, USA) bearbeitet.

Für elektronenmikroskopische Untersuchungen von Proteinlösungen wurden negativ

kontrastierte Suspensionspräparate hergestellt. Ein mit Kohlefilm belegtes Kupfernetzchen

(G 2200C: 200 Square Mesh, Plano, Wetzlar) wurde in einem Plasma Cleaner (Plasma

Cleaner PDC-XG, Harrick Plasma, Ithaca, USA) hydrophilisiert. Anschließend wurde es mit

dem Kohlefilm nach unten für 10 bis 30 Sekunden auf einen Tropfen der Proteinlösung (20 –

50 μg/ml) gelegt. Die Lösung wurde mit einem Filterpapier abgezogen und das Präparat

einmal mit bidestilliertem Wasser gewaschen. Anschließend erfolgte die

Negativkontrastierung für etwa 30 Sekunden. Die Kontrastierlösung wurde abgezogen und

das Kupfernetzchen luftgetrocknet. Als Kontrastierlösung diente Uranylacetatlösung (2 %,


16

w/v), Phosphorwolframsäure (2,5 %, w/v) oder Ammoniummolybdat (2 %, w/v). Die Analyse

erfolgte im TEM unter Low-Dose-Bedingungen.

Parallel wurden sowohl Proteinlösungen als auch präparierte Kupfernetzchen an Dr. Janet

Vonck vom Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt/Main übergeben, die ebenfalls

elektronenmikroskopische Analysen durchführte.

2.4 Verwendete Organismen und Kultivierung

2.4.1 Verwendete Stämme

Organismus Stamm Herkunft Hinterlegung Literatur

Ignicoccus hospitalis Kin4/I Kolbeinsey Rücken DSM 18386 Paper et al., 2007

Ignicoccus hospitalis +

Nanoarchaeum equitans Kin4/M Kolbeinsey Rücken BBR 17/10/4 Huber et al., 2002

Ignicoccus islandicus Kol8 Kolbeinsey Rücken DSM 13165 Huber et al., 2000

Ignicoccus pacificus LPC33 Ostpazifischer Rücken DSM 13166 Huber et al., 2000

2.4.2 ½ SME Ignicoccus Medium

2.4.2.1 Zusammensetzung (Huber et al., 2000; Paper et al., 2007)

½ SME Medium

Synthetisches Meerwasser

KH2PO4 0,5 g NaCl 27,70 g

(NH4)2SO4 0,25 g MgSO4 x 7 H2O 7,00 g

NaHCO3 0,16 g MgCl2 x 6 H2O 5,50 g

Synthetisches Meerwasser 500 ml CaCl2 x 2 H2O 0,75 g

Resazurin (0,1 %) 1,0 ml KCl 0,65 g

H2OMillipore ad 1000 ml H3BO3 0,03 g

S0 10 g NaBr 0,10 g

Na2S 0,5 g SrCl2 x 6 H2O 15 mg

KJ-Lösung (1 mg/ml) 50 µl

H2OMillipore ad 1000 ml

2.4.2.2 Herstellung in Serumflaschen

Synthetisches Meerwasser wurde separat hergestellt und bei 4°C gelagert. Für die

Herstellung des Mediums stand es als Stammlösung zur Verfügung. Die übrigen


17

Medienbestandteile bis auf Schwefel und Natriumsulfid wurden darin gelöst und

anschließend mit H2OMillipore auf 1 l aufgefüllt. Die entsprechende Menge Schwefel wurde

dem Medium in einer Duranglasflasche (Schott, Mainz) zugegeben und dieser mit Hilfe eines

Ultraturrax T 25 basic (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen) fein zerkleinert. Anschließend

wurde das Medium mit N2/CO2 (80/20, v/v) unter Druckausgleich durchgast und so

Sauerstoff weitgehend ausgetrieben. Durch Zugabe von Natriumsulfid wurde der

verbliebene Sauerstoff chemisch reduziert. Danach wurde der pH-Wert überprüft und ggf.

mit H2SO4 auf pH 5,5 – 6,0 eingestellt. Das Abfüllen in 120 ml Serumflaschen

(Natronkalksilikatglas, Stute GmbH, Rheinbreitbach) bzw. 1 l Druckflaschen (Borsilikatglas,

Müller und Krempel AG, Büllach, CH) erfolgte in einer Anaerobenkammer (COY Laboratory

Products Inc., Grass Lake, MI, USA). Die mit je 20 ml Medium befüllten Serumflaschen

wurden mit Butylsepten (Ochs, Bovenden) verschlossen und diese mit

Aluminiumbördelkappen (WICOM, Heppenheim) gesichert. Die mit je 250 ml Medium

befüllten Druckflaschen wurden mit Gummistopfen und Metallschraubkappen verschlossen.

An einer Gasstation wurden die Serum- bzw. Druckflaschen dreimal evakuiert und ein

Gasgemisch von H2/CO2 (80/20, v/v) aufgepresst, wobei für Serumflaschen ein Überdruck

von 200 kPa (2 bar) und für Druckflaschen von 80 kPa (0,8 bar) eingestellt wurde.

Die Flaschen mit Medium wurden bei 110°C, 200 kPa und feuchter Hitze für 60 Minuten

sterilisiert (Autoklav von Wolf SANOclav, Geislingen) und konnten danach bei

Raumtemperatur gelagert werden.

2.4.2.3 Herstellung für Großanzuchten im Fermenter

Alle Medienbestandteile bis auf Resazurin, Schwefel und Natriumsulfid wurden in

entsprechender Menge abgewogen und in einem Fermenter mit 300 l Gesamtvolumen (Typ

HTE, Pfaudler-Werke AG, Schwetzingen) in 250 l H2OMillipore gelöst. Anschließend wurde das

Medium 1 Stunde bei 121°C autoklaviert und gleichzeitig durch Durchgasung mit N2/CO2

(80/20, v/v) der Sauerstoff weitgehend ausgetrieben.

Natriumsulfid wurde separat abgewogen, in H2OMillipore gelöst und für 20 Minuten bei 121°C

autoklaviert. Ebenso wurde mit Hefeextrakt verfahren, der für mixotrophe

Kultivierungsbedingungen in einer Endkonzentration von 0,1 % zugegeben wurde. Der

Schwefel wurde mit H2OMillipore versetzt und mit Hilfe eines Ultraturrax (TP 1842, Janke &

Kunkel, Staufen) homogenisiert. Anschließend wurde er für 1 Stunde bei 110°C sterilisiert.

Schwefel, Natriumsulfid und ggf. Hefeextrakt wurden direkt vor dem Animpfen zugegeben.

Nach Zugabe aller Medienzusätze wurde der pH-Wert mit ca. 50 ml H2SO4 (1:2) auf pH 5,5 –

6,0 eingestellt.


18

2.4.3 Kultivierung

2.4.3.1 Kultivierung in Serumflaschen

Die Kultivierung in Serum- bzw. Druckflaschen erfolgte strikt autotroph. Serumflaschen

wurden mit je 0,2 ml, Druckflaschen mit je 2 ml gut bewachsener Vorkultur angeimpft, was

einer Animpfdichte von ca. 105 Zellen/ml entsprach. Die Inkubation erfolgte bei 90°C in

Wärmeschränken (Heraeus, Hanau bzw. Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold)

mit Schütteleinsatz (Mechanikwerkstatt Biologie, Universität Regensburg). Das Wachstum

wurde lichtmikroskopisch überprüft.

2.4.3.2 Kultivierung im Fermenter

Der Fermenter (Typ HTE, Pfaudler-Werke AG, Schwetzingen) mit 250 l Medium wurde mit 3 l

Vorkultur aus Druckflaschen angeimpft, was zu einer Anfangszellzahl von 4,5 x 104 bis 1 x 105

Zellen/ml führte. Bei strikt autotrophen Kultivierungen wurde mit ca. 2 g gefrorenen,

ebenfalls autotroph gezüchteten Zellen angeimpft. Die Kultivierung erfolgte anaerob mit

einer Gasphase von H2/CO2 (80/20, v/v) und einem Druck von 300 kPa bei 90°C unter

Rührung (100 UpM). Ab einer Zelldichte von ca. 3 – 6 x 106 Zellen/ml wurde mit einem

Gemisch aus N2/H2/CO2 (65/15/20, v/v/v) mit einer Flussrate von 60 l/min durchgast. Das

Wachstum wurde etwa alle 1,5 Stunden durch Auszählen mit einer Thoma-Zählkammer

kontrolliert.

2.4.3.3 Zellernte nach Kultivierung im Fermenter

Für die Zellernte von Ignicoccus-Reinkulturen aus dem Fermenter wurde die Zellsuspension

zunächst über einen Gegenstromkühler (Feichtenschlager Edelstahl-Industrieanlagen,

Neusäss) auf 4°C abgekühlt, damit der Zellstatus zum Zeitpunkt der Ernte weitestgehend

erhalten blieb. Die Kultur wurde in einem sterilisierten Tank (Gresser, Regensburg)

zwischengelagert, in dem nicht verbrauchter Schwefel sedimentierte und anschließend

abgelassen werden konnte. Die Zellen wurden über eine Durchlaufzentrifuge (Typ Z416,

Padberg, Lahr) bei einer Flussgeschwindigkeit von ca. 15 l/min geerntet. Das Zellsediment

wurde in dem im Rotor verbliebenen Medium suspendiert und nochmals in einer Jouan-

Zentrifuge (Jouan KR 422, Rotor C-60) bei 4300 UpM und 4°C für 45 Minuten sedimentiert.

Anschließend wurden die Zellen sofort verarbeitet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren

und bei -80°C gelagert.


19

Bei der Ernte der Co-Kultur von I. hospitalis und N. equitans wurde zunächst wie oben

beschrieben vorgegangen. Um freie N. equitans-Zellen mittels differentieller Zentrifugation

von I. hospitalis-Zellen mit noch anhaften N. equitans-Zellen abtrennen zu können, wurde

das Zellsediment aus der Durchlaufzentrifuge sehr sorgfältig im Medium suspendiert.

Anschließend wurde für 45 Minuten bei 4300 UpM und 4°C in einer Jouan-Zentrifuge (Jouan

KR 422, Rotor C-60) zentrifugiert. Das Zellpellet, bestehend aus I. hospitalis-Zellen mit

anhaftenden N. equitans-Zellen, wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die im Überstand

enthaltenen freien N. equitans-Zellen wurden für 1 Stunde bei 13000 UpM und 4°C

sedimentiert (Sorvall RC 5C Plus, Rotor GSA). Das Zellpellet wurde in 10 ml schwefelfreiem

½ SME Ignicoccus Medium aufgenommen und die Suspension nochmals für 30 Minuten bei

13000 UpM und 4°C zentrifugiert (Sorvall RC 5C Plus, Rotor SS34). Die auf diese Weise

aufkonzentrierten N. equitans-Zellen konnten sofort verwendet oder in flüssigem Stickstoff

eingefroren und bei -80°C gelagert werden.

2.5 Zellaufschluss

2.5.1 Puffer

Tris Lysepuffer, pH 8,0

(eingestellt mit HCl)

‚FfM‘ Lysepuffer, pH 8,0

(eingestellt mit HCl)

Tris 25 mM Tris 25 mM

MgCl2 10 mM MgCl2 5 mM

PMSF 0,1 mM oder PMSF 0,1 mM oder

AMPSO Lysepuffer, pH 9,0

(eingestellt mit NaOH)

HEPES Lysepuffer, pH 7,0

(eingestellt mit NaOH)

AMPSO 25 mM HEPES 50 mM

MgCl2 10 mM MgCl2 10 mM

PMSF 0,1 mM oder PMSF 0,1 mM

Es wurden ca. 0,1 – 0,5 g Zellen/ml im jeweiligen Puffer gelöst und die Suspension mit

DNase I versetzt.

2.5.2 French Press

Eine French Press Zelle (French Pressure Cell Press von American Instrument Company, Silver

Spring, MD, USA) wurde zunächst einmal mit 70 %igem Ethanol und zweimal mit H2OMillipore,


20

welches mit 0,1 mM PMSF versetzt war, gespült. Anschließend wurde mit dem jeweiligen

Lysepuffer equilibriert.

Eine Zellsuspension wurde durch dreimalige Passage bei einem Druck von 500 – 600 PSI

(3,5 – 4,1 MPa) und der Einstellung ‚high‘ aufgeschlossen. Die Aufschlusseffizienz wurde

lichtmikroskopisch kontrolliert.

2.6 Membranpräparation

2.6.1 Differentielle Zentrifugation

Nach dem Zellaufschluss wurde das Lysat einer differentiellen Zentrifugation unterzogen, um

grobe Zellbestandteile und nicht aufgeschlossene Zellen zu entfernen. Diese erfolgte in einer

Beckmann Avanti J-25 mit dem Rotor JLA 16.250 (Beckmann Coulter, Palo Alto, CA, USA) bei

4°C und 8500 bzw. 11000 g für jeweils 15 Minuten. Anschließend wurden mittels

Ultrazentrifugation (Beckmann Optima LE-80K, Rotor 70Ti von Beckmann Coulter, Palo Alto,

CA, USA) bei 4°C und 45000 UpM (150000 g) für 2 Stunden die Membranen sedimentiert.

2.6.2 Dichtegradienten-Zentrifugation

Bei der Dichtegradientenzentrifugation bilden Teilchen der gleichen Größe, Form und Dichte

separate Zonen in einem Gradienten (Pertoft, 2000), was eine Auftrennung der Probe nach

diesen Parametern ermöglicht. In dieser Arbeit wurden Saccharosegradienten von 20 – 70 %

(w/v) sowie von 50 – 80 % (w/v) und 10 – 30 % (w/v) eingesetzt.

2.6.2.1 Herstellung der Auftragssuspension

Vorbereitend für die Auftrennung im Saccharosegradienten wurde das Lysat einem

Zentrifugationsschritt unterzogen, bei dem lösliche Proteine (‚Cytoplasma‘) abgetrennt

wurden. Dieser erfolgte in einer Beckmann Avanti J-25 mit dem Rotor JA 25.50 (Beckmann

Coulter, Palo Alto, CA, USA) bei 4°C und 60000 g für 1 Stunde. Die sedimentierten

Membranen und Zelltrümmer (‚Pellet‘) wurden mit ca. 5 ml Lysepuffer in einen

Gewebehomogenisator (Wheaton, Millville, NJ, USA) überführt und auf Eis einige Minuten

sanft (‚loose’-Stößel) suspendiert.


21

2.6.2.2 Saccharosegradient

Die linearen Saccharosegradienten wurden mit Hilfe eines Gradientenmischers (Eigenbau

der Mechanikwerkstatt Biologie, Universität Regensburg) hergestellt. Hierfür wurden pro

Gradient 4,6 ml der niedriger konzentrierten Saccharoselösung (in Lysepuffer) in die linke

Kammer des Gradientenmischers und 4,6 ml der höher konzentrierten Saccharoselösung (in

Lysepuffer) in die rechte Kammer des Gradientenmischers pipettiert. Anschließend wurde

unter ständigem Rühren der beiden Lösungen (Magnetrührer MR3001 von Heidolph Elektro

GmbH & Co. KG, Kelheim) der Saccharosegradient direkt in einem Zentrifugenröhrchen

(Beckmann UltraClear, 14 x 89 mm von Beckmann Coulter, Palo Alto, CA, USA) von unten

nach oben aufgebaut.

Von der Auftragssuspension wurden etwa 1,5 ml pro Gradient aufgetragen, woraufhin in

einer Ultrazentrifuge (Beckmann Optima LE-80K, Rotor SW41, Beckmann Coulter, Palo Alto,

CA, USA) für 3,5 – 4 Stunden bei 40500 UpM (210000 g) und 4°C zentrifugiert wurde. Bei

Gradienten von 50 – 80 % (w/v) wurde die Temperatur auf 10°C erhöht, um ein

Kristallisieren der Saccharose zu verhindern. Das Ergebnis wurde mit einer Digitalkamera

(EOS D 60 Spiegelreflexkamera, Canon, Tokyo, Japan) dokumentiert, die Banden mit einer

sterilen 3 ml Spritze (Henke Sass Wolf, Tuttlingen) entnommen und der Rest verworfen. Die

erhaltenen Fraktionen wurden mikroskopiert und mit dem ‚Longtest‘ (Kap. 2.13.1.2) die ATP-

Hydrolyseaktivität bestimmt.

2.7 Solubilisierung

Die Solubilisierung von Membranproteinen erfolgte mit dem Detergenz DDM in einer

Konzentration von 1 mg DDM/mg Protein. Das Protein-Seife-Verhältnis (PSV) betrug somit 1.

Die Suspension mit einer Endkonzentration von etwa 0,5 % DDM wurde in Aliquots von je

1 ml für 2 Stunden bei Raumtemperatur sanft (25 UpM) geschüttelt (Überkopfschüttler RM-

2L, ELMI, Riga, Lettland).

Nach erfolgter Solubilisierung wurden mittels Ultrazentrifugation die Membranen (‚MnS‘)

sedimentiert und so von den nun gelösten Proteinen (‚Solubilisat‘) abgetrennt. Dies erfolgte

in einer Ultrazentrifuge (Beckmann Optima LE-80K) mit dem Rotor 70.1Ti für 1,5 Stunden bei

40000 UpM (110000 g) und 4°C.


22

2.8 Chloroform/Methanol-Extraktion

Kleine, extrem hydrophobe Membranproteine können statt mit Detergenzien auch mit

organischen Lösungsmitteln solubilisiert werden. Die membrangebundene Untereinheit der

ATP-Synthase/ATPase von Escherichia coli beispielsweise wurde bereits erfolgreich mit

Chloroform/Methanol aus der Membran extrahiert (Fillingame, 1976), ebenso wie die c-

Untereinheit der ATP-Synthase/ATPase von P. furiosus (Mayer, 2014).

2.8.1 Puffer und Lösungen

Puffer

Lösungen

I 25 mM Tris pH 7,5 III Chloroform/Methanol 2/1 (v/v)

II 20 mM MES + 1 % OG pH 5,5 IV Chloroform/Methanol/ H2OMillipore 3/47/48 (v/v/v)

2.8.2 Durchführung

40 g Zellen wurden in 80 ml ‚FfM‘ Lysepuffer gelöst, mit einer French Press aufgeschlossen

und einer differentiellen Zentrifugation unterzogen (Kap. 2.6.1). Die Membranen wurden

nach der Ultrazentrifugation mit einem geringen Volumen (ca. 5 ml) Puffer I in eine 250 ml

Duranglasflasche (Schott, Mainz) überführt. Das 20fache Volumen Lösung III wurde

zugegeben und die Suspension für 20 – 24 Stunden auf Eis gerührt. Nach Filtration durch

einen Faltenfilter, bei der bräunlich gefärbte Membranreste im Filter zurückblieben, wurde

das geklärte Filtrat mit dem 0,2fachen Volumen H2OMillipore versetzt und nochmals für 20 – 24

Stunden auf Eis gerührt. Anschließend wurde, um die Phasentrennung zu beschleunigen, für

10 Minuten bei 4000 g und 4°C zentrifugiert (Beckmann Avanti J-25, Rotor JLA 16.250 von

Beckmann Coulter, Palo Alto, CA, USA). Die organische, untere Phase wurde in einen 250 ml

Scheidetrichter (Brand, Wertheim) überführt und mit dem 0,5fachen Volumen Lösung IV

gewaschen. Nach erfolgter Phasentrennung wurde dieser Vorgang wiederholt. Anschließend

wurde die organische Phase in einem Rundkolben (Lenz Laborglas, Wertheim) auf Eis mit

dem gleichen Volumen Chloroform versetzt und tropfenweise Methanol zugegeben, bis die

Lösung klar war. Die Lösungsmittel wurden mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (Büchi

Labortechnik, Essen) im lauwarmen Wasserbad verdampft und der Rückstand in 1,5 ml

Lösung III aufgenommen.

Alternativ fand für angereicherte N. equitans-Zellen ein modifiziertes Protokoll Anwendung,

bei welchem geringere Zellmassen eingesetzt werden konnten. 1 – 2 g Zellen wurden in

30 ml ‚Ffm‘ Lysepuffer gelöst und nach dem Aufschluss mit der French Press für 15 Minuten


23

bei 4°C und 5000 g zentrifugiert (Beckmann Avanti J-25, Rotor JA 25.50 von Beckmann

Coulter, Palo Alto, CA, USA), um grobe Zellbestandteile abzutrennen. Anschließend wurden

die Membranen in einer Ultrazentrifuge (Beckmann Optima LE-80K, Rotor 70Ti von

Beckmann Coulter, Palo Alto, CA, USA) bei 45000 UpM (150000 g) und 4°C für 2 Stunden

sedimentiert. Die Membranen wurden in insgesamt 2 ml Puffer I aufgenommen und in

einem konischen 15 ml-Zentrifugenröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) ad 8 ml mit Lösung III

aufgefüllt. Daraufhin wurde für 20 – 24 Stunden bei 4°C in einem Überkopfschüttler (RM-2L,

ELMI, Riga, Lettland) inkubiert. Nach Filtration durch einen Faltenfilter wurde das Filtrat mit

dem 0,2fachen Volumen H2OMillipore versetzt und nochmals für 20 – 24 Stunden bei 4°C

inkubiert. Zur beschleunigten Phasentrennung wurde für 15 Minuten bei 4°C und 2000 g

zentrifugiert (Beckmann Avanti J-25, Rotor JA 10 mit Einsatz für konische 50 ml-

Zentrifugenröhrchen von Beckmann Coulter, Palo Alto, CA, USA). Die organische, untere

Phase wurde mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (Büchi Labortechnik, Essen) im

lauwarmen Wasserbad eingedampft und der Rückstand in 300 µl Lösung III aufgenommen.

Zur Abtrennung von in der Lösung verbliebenen Lipiden sowie zur Aufkonzentrierung der

Proteine wurden diese mit Diethylether gefällt. Hierzu wurde der Extrakt mit dem 4fachen

Volumen Diethylether versetzt und über Nacht auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation für

15 Minuten bei 10000 UpM und -9°C (Biofuge fresco, Heraeus, Hanau) wurde der Überstand

verworfen und das Proteinpellet in einem kleinen Volumen (ca. 0,5 ml) Lösung III

suspendiert.

Für biochemische Analysen wurden die extrahierten Proteine in eine wässrige Phase

überführt. Der Extrakt wurde mit dem gleichen Volumen Puffer II versetzt und gemischt.

Anschließend wurde die organische Phase unter leichtem Stickstoffstrom verdampft bis die

Lösung klar war. Durch das im Puffer II enthaltene Detergenz blieben die Proteine in Lösung.

2.9 Chromatographische Enzymreinigung

2.9.1 Puffer

Gelfiltrationspuffer AEX-A AEX-B

Tris/AMPSO/HEPES 25 mM 25 mM 25 mM

MgCl2 10 mM 10 mM 10 mM

NaCl 200 mM - 1 M

Glycerin 10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v)

DDM 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v)

PMSF 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM


24

Je nach Anwendung wurden verschiedene Puffersubstanzen mit unterschiedlichen pH-

Werten eingesetzt. Tris-Puffer wurden mit konzentrierter HCl auf pH 8,0 eingestellt, AMPSO-

Puffer mit 5 M NaOH auf pH 9,0 und HEPES-Puffer mit 5 M NaOH auf pH 7,0.

AEX Step 1,

5,5 mS/cm

AEX Step 2,

9,0 mS/cm

AEX Step 3,

12,5 mS/cm

AEX Step 4,

16,0 mS/cm

Tris/AMPSO/HEPES 25 mM 25 mM 25 mM 25 mM

MgCl2 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM

NaCl ca. 60 mM ca. 100 mM ca. 175 mM ca. 220 mM

Glycerin 10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v) 10 % (v/v)

DDM 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v) 0,05 % (w/v)

PMSF 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM 0,1 mM

Die Leitfähigkeit (in mS/cm) wurde mit Hilfe eines Leitfähigkeitsmessgerätes (WTW LF 530,

Wissenschaftlich-Technische Werkstätten, Weilheim) bei definierter Umgebungstemperatur

(18°C) eingestellt. Die Puffer AEX-A und AEX-B wurden zunächst über Nacht auf die

Umgebungstemperatur equilibriert und dann zur Einstellung der Leitfähigkeit gegeneinander

titriert.

2.9.2 Säulen

Alle Säulen wurden vorgepackt von der Firma GE Healthcare (Little Chalfont,

Buckinghamshire, UK) bezogen. Gemäß den Herstellerangaben wurden sie jeweils vor und

nach dem Gebrauch mit 1 M NaCl und H2OMillipore oder 0,5 M NaOH und H2OMillipore

gewaschen. Vor dem Auftrag der Probe wurden die Säulen mit dem jeweiligen Puffer (AEX-A

für Anionenaustauschersäulen und Gelfiltrationspuffer für Gelfiltrationssäulen) equilibriert.

Die Säulen wurden in 20 % Ethanol gelagert.

Anionenaustauscher Volumen Gelfiltration Volumen Trennbereich

HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 320 ml 10 – 1500 kDa

HiTrap Q HP 5 ml Superdex 200 10/300 GL 24 ml 10 – 600 kDa

Superose 6 10/300 GL 24 ml 5 – 5000 kDa

2.9.3 Durchführung

Die chromatographische Reinigung der ATP-Synthase/ATPase wurde mit Hilfe des ÄKTA

Chromatographiesystems (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) nach den

Angaben des Herstellers durchgeführt. Das System wurde mit der Software Unicorn


25

gesteuert. Es wurde bei 4°C mit der Anlage ÄKTA purifier gearbeitet, welche mit einer UV-

Messzelle, einer Leitfähigkeitsmesszelle, einem Frac950-Fraktionssammler und einer P960-

Probenpumpe ausgestattet war.

Für den Auftrag auf eine Anionenaustauschersäule wurde die Probe mit Auftragspuffer (AEX-

A) 1:10 verdünnt, um die Saccharose- bzw. Salzkonzentration herabzusetzen, und filtriert

(Porengröße 0,45 µm), um Schwebstoffe zu entfernen. Vor dem Auftrag auf eine

Gelfiltrationssäule wurde die Proteinlösung auf bis zu 10 mg/ml aufkonzentriert, so dass das

Auftragsvolumen maximal 1 % des Säulenvolumens betrug.

Während der Chromatographie wurde die Absorption in der UV-Messzelle bei 280 nm

gemessen, wodurch ein Rückschluss auf die Proteinkonzentration möglich war.

Bei der Anionenaustauschchromatographie mit der Säule HiTrap Q HP wurde nach einem

spezifisch für die Reinigung der ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis entwickelten Schema

vorgegangen (Küper, 2010), welches im Verlauf dieser Arbeit hinsichtlich der Leitfähigkeit

der Puffer optimiert wurde (Abb. 2.1). Nach Probenauftrag mit einem 50 ml Superloop und

einem Waschschritt zur Entfernung von nicht gebundenem Protein wurde zur Elution die

Leitfähigkeit der Puffer stufenweise erhöht. Hierzu wurden die Puffer manuell gewechselt,

während der Gradient von AEX Step 3 auf AEX-B programmiert wurde.

Abb. 2.1 Probenauftrags- und Elutionsprofil der Anionenaustauschchromatographie

2.10 Proteinfällung

Um die ATP-Synthase/ATPase von I. hospitalis anzureichern, wurde die Tatsache genutzt,

dass Proteine durch lineare Polymere wie Polyethylenglykol (PEG) ohne Denaturierung

reversibel gefällt werden können. Zur Fällung diente hierbei PEG mit einer


26

durchschnittlichen Molekülmasse von 6000 (PEG 6000), da dieses als gut geeignet für die

Fällungsreaktion beschrieben wurde (Polson et al., 1964).

2.10.1 Probenvorbereitung

Vorbereitend für die Fällung wurden die Membranen aus dem Saccharosegradienten

(Kap. 2.6.2.2) einmal gewaschen, um die Saccharose zu entfernen. Dazu wurde die Probe mit

AMPSO Lysepuffer mindestens 1:5 verdünnt und die Membranen bei 45000 UpM (150000 g)

und 4°C für 2 Stunden sedimentiert (Beckmann Optima LE-80K, Rotor 70Ti, Beckmann

Coulter, Palo Alto, CA, USA). Nach Homogenisierung der Membranen in Lysepuffer erfolgte

die Solubilisierung wie in Kapitel 2.7 beschrieben. Um überschüssiges DDM aus der Probe zu

entfernen, wurde das Solubilisat in einem Vivaspin Zentrifugenröhrchen auf etwa 1/10 des

Ausgangsvolumens aufkonzentriert, wobei die DDM-Mizellen mit einer Größe von etwa

70 kDa bei einem MWCO (molecular weight cut-off) von 100 kDa im Durchlauf zu finden sein

sollten. Daraufhin wurde das Konzentrat mit AMPSO Lysepuffer wieder 1:10 verdünnt.

2.10.2 Fällung mit PEG 6000

Es wurde eine Stammlösung von 50 % (w/v) PEG 6000 in AMPSO Lysepuffer hergestellt und

der pH-Wert mit 5 M NaOH wieder auf pH 9,0 titriert. Bei Raumtemperatur wurden in der

Proteinlösung in einem 5 ml-Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) Konzentrationen

zwischen 2 und 15 % (v/v) PEG 6000 eingestellt. Die Zugabe erfolgte tropfenweise, wobei das

Reaktionsgefäß nach jeder Zugabe sorgfältig gemischt wurde. Nach 30-minütiger Inkubation

bei Raumtemperatur wurde für 30 Minuten bei 10000 g und 20°C zentrifugiert (Centrifuge

5430R, Rotor FA-45-16-17, Eppendorf, Hamburg). Der Überstand (Ü) wurde abgenommen

und für weitere Fällungen oder biochemische Analysen herangezogen. Das sedimentierte

Protein (Pellet, P) wurde in AMPSO Lysepuffer gelöst und ebenfalls biochemisch analysiert.

2.11 Vernetzung und Fixierung von Proteinen

Gereinigte Proteinkomplexe wurden mit den chemischen Fixierungsmitteln Formaldehyd

bzw. Glutaraldehyd versetzt. Die dadurch entstehenden kovalenten Bindungen zwischen

Crosslinker und Protein sollen die Proteinkomplexe stabilisieren und einer Dissoziation in

Subkomplexe vorbeugen.


27

2.11.1 Crosslinking

Die Probenlösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml eingestellt. 200 µl der

Proteinlösung wurden mit 10 µl Glutaraldehydlösung (2,5 % (v/v) in H2OMillipore) versetzt, was

einer Endkonzentration von ca. 0,125 % (v/v) entsprach. Nach Inkubation für 5 Minuten bei

37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl 1 M Tris, pH 9,0 gestoppt und die Probe bei

4°C kalt gestellt.

2.11.2 GraFix

Bei der so genannten GraFix-Methode (Kastner et al., 2007; Stark, 2010) werden

Proteinkomplexe schonend fixiert, indem sie langsam in einen Dichtegradienten mit

steigender Konzentration eines Crosslinkers einwandern. Dadurch wird eine Aggregatbildung

und intermolekulare Vernetzung verhindert.

Mit Hilfe eines Gradientenmischers (Eigenbau der Mechanikwerkstatt Biologie, Universität

Regensburg) wurden Saccharosegradienten von 10 – 30 % (w/v), 50 – 80 % (w/v) und 20 –

70 % (w/v) hergestellt. Die höher konzentrierte Saccharoselösung wurde dabei mit jeweils

0,1 % (v/v) Glutaraldehyd bzw. Formaldehyd versetzt, so dass im Dichtegradienten ein

Konzentrationsgefälle von 0 – 0,1 % (v/v) entstand. Zusätzlich wurde zur Kontrolle ein

Gradient hergestellt, der keinen Crosslinker enthielt. Die Gradienten wurden mit je ca.

100 µg Protein beladen und für 18 – 21 Stunden bei 35000 UpM (90000 g) und 4°C in einer

Ultrazentrifuge (Beckmann Optima LE-80K, Rotor SW41, Beckmann Coulter, Palo Alto, CA,

USA) zentrifugiert. Bei Gradienten von 50 – 80 % (w/v) wurde die Temperatur auf 10°C

erhöht, um ein Kristallisieren der Saccharose zu verhindern. Nach erfolgter Zentrifugation

wurden die Gradienten mit Hilfe einer langen Kanüle und einer peristaltischen Pumpe von

unten nach oben zu je ca. 1 ml fraktioniert. V

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