Kazící mikroflora

biogenní aminy

Bakterie a kvasinky

Mikroflora působící kažení potravin

• Co to je mikrobiální kažení potravin

• Faktory ovlivňující kažení potravin

• Projevy mikrobiálního kažení

• Přehled kazících mikroorganismů (KM)

• Potraviny napadané mikroby

• Bakterie vyvolávající měkkou hnilobu ovoce a zeleniny

• Monitorování a detekce KM

• Mikrobiální indikátory kvality potravin

• Prevence kažení potravin

Projevy kažení

• Zkažená potravina má odlišné sensorické vlastnosti –

vizuální, čichové, chuťové apod.

• Kažení se může vyskytovat v kterékoli části potravního

řetězce.

• Kažení může vznikat po mechanickém ataku hmyzu,

fyzikálním poškozením, otlak, zmrznutím,vysušením

apod.

• Aktivita enzymů z vlastní potraviny

• Chemické změny

• Kažení je komplex biologických, fyzikálních,

chemických a biochemických změn.

Mikroorganismy působící kažení potravin

Gram negativní

tyčinky

Pseudomonas

Alteromonas

Potraviny bohaté na

bílkoviny při chladicích

teplotách

Gram negativní

tyčinky

Acetobacter, Acetomonas,

Gluconobacter

Alkoholické nápoje

Limonády

Gram negativní

tyčinky

Fer.:Enterobacteriaceae:

Escherichia coli

Většina potravin.

bílkovinných surovin

Gram negativní

tyčinky

Nefer.:Acinetobacter,

Xanthomonas

Většina potravin.

bílkovinných surovin

Gram pozitivní

nesporulující tyčinky

Koryneformní bakterie

Corynebacterium

Nakládané maso a párky,

čerstvé maso vakuuově

balené,zelenina

Gram pozitivní koky Aer.: Micrococcus Fak.aer.:

Staphylococcus

Mléčné výrobky, solené

maso

Gram pozitivní

nesporulující tyčinky

Homoferm a heteroferm.

Lactobacillus sp.

Mléko, mléčné výrobky,

ferment. mléč. výrobky,

maso a zelenina balená ve

vakuu

Nejčastější kazící mikroorganismy

• Gram pozitivní Gram negativní

Sporotvorné nesporulující, BMK Koliformní Pseudomonas

Bacillus Micrococcus Lactobacillus Citrobacter Acinetobacter

Clostridium Brocotrix Streptococcus Serratia Aeromonas

Leuconostoc Proteus Alcaligenes

Pediococcus Escherichia Moraxella

Enterobacter Altermonas

Erwinia Flavobacterium

Klebsiella

Hafnia

Potraviny napadané mikroby

• Zdroje kazících organismů pocházejí z půdy a vody,

rostlin a jejich produktů, prachu, gastrointestinální trakt

zvířat a lidí,

• Zkáze nejrychleji podléhají chlazené čerstvé potraviny

bohaté na proteiny (červené maso, drůbež, ryby,

mléčné výrobky). Všechny jsou vysoce výživné, mají

velký obsah vody – aw , relativně neutrální pH.

• Z dalších čerstvých potravin, které jsou napadané je to

ovoce a zelenina

Mikroorganismy působící kažení potravin

• Mesofilní aerobní a fak. anerobní bakterie

• Kvasinky a plísně

• Sporotvorné bakterie:

• - aerobní a fak. anaerobní

• - mesofilní

• - termofilní, anaerobní

• Psychrofilní a psychrotrofní

• Kyselinotvorné

• Proteolytické

• Lipolytické

• Slizotvorné halofilní, osmolifní, osmotolerantní

Přehled kazících mikroorganismů

• Gram negativní tyčinky: nejčastěji napadají čerstvé

chlazené potraviny, min růst T 0-3 oC, při 5-10 oC rostou

rychle. Nejvíce se vyskytuje Pseudomonas, Moraxella,

Acinetobacter, Aeromonas, Alteromonas,

Flavobacterium

• Koliformní tyčinky: poněkud vyšší T optimum, 8-15 oC

Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella,

Proteus. Serratia, Hafnia, Erwinia

Gram pozitivní tyčinky: sporulující Bacillus, Clostridium,

Alicyclobacillus

Přehled kazících mikroorganismů

• Bakterie mléčného kvašení: fermentují cukry za tvorbu

kys. mléčné, výsledkem je pokles pH. Vydrží až pH 3,6.

• Další Gram pozitivní bakterie: Brocothrix

thermosphacta na čerstvém mase, Micrococcus spp.

roste i přítomnosti NaCl

• Kyselinotvorné : Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Staphylococcus, Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium, čeleď Enterobacteriaceae, Acetobacter, plísně, kvasinky

• Lipolytické: Pseudomonas, Rhizopus, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium, Debaryomyces, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Yarrowia

• Proteolytické: Bacillus, Clostridium, Proteus, Serratia, Mucor, Thamnidium, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium

Sporotvorné bakterie

Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum

Důležité : spory přežívají 100oC

při pH nižším než 4 spory neklíčí

Základ stanovení : kultivace po usmrcení

vegetativních buněk

Aerobní a fakultativně anaerobní

termofilní

Rod Bacillus

Mesofilní: inaktivace 30 min. při 800 C

Termotolerantní: B.coagulans 8min. při 88-900 C

Inkubace při 300 C, pH 4,0-7,0, rozmnož.15-200 C

Termofilní: B. stearotermophilus

Inkubace při 550 C, pH více než 5,3

Plynuprosté kysání nekyselých konzerv

Chladový šok

Mesofilní sporotvorné

anaeroby

Proteolytické druhy rodu Clostridium

Cl.sporogenes, Cl. putrefaciens,

Cl.bifermentans – rozklad bílkovin za tvorby

merkaptánů, indolu, skatolu, kadaverinu,

putrescinu, CO2 , H2 = bombáž konzerv

Sacharolytické druhy

• V sýrařství – Cl. tyrobutyricum zkvašuje

laktát na máselnou kyselinu za silného

vývoje plynu, působí nežádoucí duření

sýrů

• Toxinogenní druhy – Cl. botulinum, Cl.

perfringens

• Kultivační teploty 10-50 0C,

Cl.putrefaciens 0-30 0C

Termofilní sporotvorné anaeroby

Cl. thermosaccharolyticum působí bombáž kyselých

konzerv obsahujících sacharidy a uchovávaných nad

teplotu 300C, nemá proteolytické enzymy, netvoří toxiny

Opt. pH 6,2-6,7, ale i pH 4,1-4,6, neroste pod 37 0C

Škrob, obiloviny, koření, sušení houby, sušené mléko,

konzervovaná zelenina, rajčatové výrobky

Důvod rozvoje = pomalé chlazení konzerv

Termofilní sporotvorné anaeroby

Desulfotomaculum nigricans

G- tyčinky, netvoří bombáže, tvoří H2S

ze síranů a cysteinu

Roste při 45 – 70 0C může se

rozmnožovat i při 30 – 37 0C, opt. tep.

55 0C, pH 6,2-7,8, ale pomalý růst při

pH 5,6

Nekyselé konzervy

Alicyclobacillus sp.

Termo-acidofilní bakterie, tvoří endospory,

aerobní, růst v rozmezí 30-60 0C, pH 3-6,

optimum 4 – 4,5

Některé rody jsou schopny produkovat spory při

pH nižším než 3,2 a je schopna produkovat

2,3-dibromfenol a 2,6 dichlorfenol, guajakol

A. pomorum, A.acidoterrestris, A. hesperidum,

A. cycloheptanicus, A. herbarius, A. sendaiensis

Psychrofilní mikroorganismy Psychrofilní - 0-10 0C, opt. teplota< 20 0C

Psychrotrofní – rostou ještě ve stejném rozmezí teplot, bez ohledu na jejich opt. Teplotu ( může být i 30 0C)

Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes některé druhy Bacillus, Clostridium, kvasinka Geotrichum, plísně Sporotrichum, Botrytis, Thamnidium, Mucor

Proteolytické, lipolytické vlastnosti

V pitné vodě patří mezi stanovené ukazatele, jejichž množství může být ze závažných důvodů překročeno

|Kyselinotvorné mikroorganismy

Kysání potravin

Bacillus, Clostridium, Streptococcus,

Pediococcus, Leuconostoc, Staphylococcus,

Lactobacillus, Propionibacterium,

Bifidobacterium, čeleď Enterobacteriaceae,

Acetobacter, plísně, kvasinky

Méčné bakterie - katalázový test

v mlékárenství, v pivovarství

Proteolytické mikroorganismy

Mikrobiální rozklad bílkovin vznik toxických

aminů a zápachu

Bacillus, Clostridium, Proteus, Serratia,

Mucor, Thamnidium, Geotrichum,

Aspergillus, Penicillium

Stanovení – půda s odstředěným mlékem,

kaseinem a CaCl2,

hydrolýza želatiny

Slizotvorné mikroorganismy

Leuconstoc (melasa, limonády, maso)

Bacillus (pečivo, strouhanka), Fusarium

Slizotvorná pouzdra na bázi polysacharidů a

polypeptidů

Stanovení: půda s 20% sacharosy (6-10

kolonií)

Slizotvorné mikroorganismy Bacillus subtilis a B. mesentericus jsou termofilní. Spory

těchto bakterií přečkávají teplotu pečení, která nepřekročí

100°C uvnitř chleba, za příznivých podmínek klíčí

Napadány bývají zejména výrobky vyšší hmotnosti a

z pšeničné mouky.

Nitkovitost je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto

bakterií společně s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu,

který po zcukření podporuje tvorbu pouzder. Střída chleba

začne druhý až třetí den po upečení vlhnout, maže se, je

lepivá, zbarvuje se dožluta a odporně hnilobně páchne.

Při doteku se vytahuje do dlouhých nití, což je patrné

zejména při rozlomení bochníku.

Lipolytické mikroorganismy

Hydrolýza a oxidace tuků

Pseudomonas, Rhizopus, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium, Debaryomyces, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Yarrowia

Smetana, máslo, majonézy, sýry, ořechy, čokoláda apod.

Základ stanovení půda s tukem a se síranem nilské modři

Halofilní bakterie

• - slabé – 2-5% NaCl

• Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter,

Flavobacterium – ryby, korýši

• halotolerantní – rostou i bez NaCl, ale

pro rozmnožování potřebují více než 5%

Microccocacea (Staphylococcus aureus),

Některé bacily a klostridia (Cl. botulinum,

Cl. perfringens

Halofilní bakterie

• - mírné – 5-20% NaCl

(Bacillus, Clostridium, Mikrokoky, Vibrio costiola) půda s 10% NaCl

lák naloženého uzeného masa, slanečci

- extrémní- 20-30% NaCl

- Halobacterium, Haloccocus půda s 25% NaCl

- Karotenoidní barviva, proteolytické vlastnosti, aerobní, sliz na mase, rybách

Přehled kazících mikromycet a

kvasinek

Kvasinky:

Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces,

Torulospora, Rhodotorula, Pichia

Plísně:

Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus,

Geotrichum, Botrytis, Cladosporium, Byssochlamys

Kažení vína • Kvasinky

• Bakterie mléčného kvašení

• Octové bakterie

• Kyselost – čím je pH nižší, tím je pro mikrorganismy těžší přežít

• Alkohol – inhibuje většinu mikrobů, včetně kvasinek, hlavně 15 –18%.

• Teplota – růst je obvykle nejrychlejší při 20-35°C a zpomalený při sklepních

teplotách (10-15°C)

• Oxid siřičitý – koncentrace od 20 mg/l inhibuje růst mikroorganismů

• Zbytkový cukr – přítomnost zkvasitelných cukrů zvyšuje riziko kažení –

obzvláště kvasinkami

• Růstové faktory – např. nutrienty jako aminokyseliny a vitaminy

• Vzduch (kyslík) – nezbytný pro růst aerobních octových bakterií

• Hygiena vinařství

Hlavní typy kazících kvasinek

Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii

Pichia anomala, Pichia membranifaciens, Pichia

fermentans, Pichia burtonii, Candida parapsilosis, Candida

zeylanoides subpelliculosa, Candida guilliermondii,

Candida albidus, Candida tropicalis, Torulaspora

delbrueckii, Issatchenkia orientalis, Zygosaccharomyces

bailii, Zygosaccharomyces bisporus, Cryptococcus spp.,

Zygosaccharomyces rouxii, Hansenula anomala,

Kluyveromyces marxianus,

Saccharomyces exiguus, Sporobolomyces roseus,

Trichosporon pullulans, Trichosporon cutaneum,

Hanseniapora uvarum

Vinařství Produkce 4-etylfenolu Brettanomyces/Dekkera spp. v

červených vínech je pokládaná za kažení pouze v

případě, že tento sekundární metabolit je přítomen v

množství větším než 620 μg/l.

• Méně než 400 μg/l, přispívá ke zlepšení komplexity vína

neboť podporuje aromatické znaky koření, kůže a další

aromata oceňovaná konsumenty.

• Nad 620 μg/l, vína jsou pro řadu konzumentů podřadná,

ale pro mnohé zůstavají příjemná.

•

Otázky spojené s kazícími kvasinkami

• (i) Co vlastně jsou kazící kvasinky?

• (ii) Má potravinářský průmysl dostatečné informace

aby mohl odpověďně řešit mikrobiologické problémy

potravin?

• (iii) Kde jsou zdroje kazících kvasinek v

potravinářském průmyslu?

• (iv) Má potravinářský průmysl vhodné zymologické

indikátory pro určení kvality potravin a pro zavedení

testů na kvalitu potravin a uzavírat čestné (fair) obchodní

smlouvy mezi maloobchody a velkoobchody?

Osmofilní kvasinky

Zygosacharomyces rouxii, Z. bailii

60% sacharozy, snáší EtOH a SO2 (víno),

odolná vůči konzervačním prostředkům

Wickerhamia fluorescens 50% sacharosy

Sirupy, med, čokoládové bonbony s

čokoládovou náplní – prýštění náplní

Osmofilní plísně

• Aspergillus glaucus, Penicillium

• Džemy, sušené ovoce a zelenina, obilí,

čokoládové bonbony, chléb, pečivo apod.

• Media s 8 event. 40% sacharozy

Faktory ovlivňující kazící

mikrofloru • 1. Počáteční množství všech mikrobů

• 2. Typ potraviny/vnitřní vlastnosti

• - pH

• - aw

• - Obsah živin

• - antimikrobiální látky

• - Eh Redox potenciál (oxidativně-redukční

• potenciál)

• - Biologické struktury

Procesní a skladovací podmínky

• - tepelné zákroky

• - okyselení (acidifikace)

• - snížení vodní aktivity

• - užití konservačních látek

• - skladování při nízkých teplotách

• - atmosféra skladování

• - kombinace shora uvedených

Projevy mikrobiálního kažení

Viditelný růst, pigmentové kolonie, hlavně plísně

Tvorba plynu

Sliz

Difuze pigmentů a enzymů

Zápach (off-odours)

Špatná chuť (off-flavors)

Produkce metabolitů: alkohol, estery,

ketony, sirné sloučeniny

fluoreskující pigmenty

organické kyseliny, diaminy

Projevy mikrobiálního kažení

• Kysnutí - mléčné výrobky, vakuově balené masné

výrobky, pivo, víno, ovocné šťávy

• Chem. příčina - kys. octová,mléčná, citronová,máselná

• Organismus – bakterie mléčného kvašení, Bacillus sp., Brochothrix thermosphacta,

- bakterie máselného kvašení, Acetobacter spp.,

příslušníci rodu Clostridium

, -

Projevy mikrobiálního kažení • Kvašení – ovocné šťávy, majonézy, saláty

• Chem. příčina – etanol

• Organismus – kvasinky

• Hnojový pach – zelenina

• Chem. příčina – p-kresol, indol, skatol

• Organismus – Erwinia sp. Clostridium sp.

• Sliz – maso, cukr,výrobky

• Chem. příčina – tvorba polysacharidů

• Organismus – Pseudomonas fragi, Leuconostoc

• mesenteroides, Bacillus subtilis

Projevy mikrobiálního kažení

• měknutí/hnití – ovoce a zelenina

• Chem. příčina – pektinasy, cellulasy, xylanasy

• Organismus – Erwinia, Clostridium, kvasinky, plísně

• Tvorba plynu - sýry, tvaroh, olivy,

• Chem. příčina – tvorba oxidu uhličitého

• Organismus - bakterie mléčného kvašení, kvasinky

• Tvorba biogenních aminů – ryby, sýry

Bakterie vyvolávající měkkou hnilobu

ovoce a zeleniny

• Erwinia carotovora subsp. atroseptica (většina ovoce a

• Erwinia carotovora subsp. carotovora zeleniny)

• Erwinia chrysanthemi (ananas)

• Pseudomonas marginalis zelenina

• Pseudomonas viridiflava Fazole

• Pseudomonas cichori čekanka, endive, zelí, salát

Monitorování a detekce KM

• Přímé mikrobiologické metody

• Chemické/ fyzikální/ fyzikálněchemické

metody

• Molekulárně biologické metody - PCR

• Kriteria „přijatelnosti“ potravin – sensorické

posouzení barvy, textury, vůně, chuti a

celkového vzhledu

POTRAVINY A SKUPINY POTRAVIN MIKROBIOLOGICKY NERIZIKOVÉ

• a) lihoviny (o obsahu etanolu nad 20% objemových)

• b) ocet

• c) potravinářská barviva a aromata

• d) přírodní a náhradní sladidla

• e) sůl kuchyňská a přípravky na bázi soli

• f) jedlé oleje

• g) tuky (s výjimkou směsných emulgovaných tuků)

• h) chléb a běžné pečivo

• i) trvanlivé pečivo

• j) nečokoládové cukrovinky

• k) káva pražená a kávoviny

POTRAVINY A SKUPINY POTRAVIN MIKROBIOLOGICKY NERIZIKOVÉ

• l) čaj pravý (fermentovaný, polofermentovaný, zelený)

• m) sušené náhrady mléka a smetany do teplých nápojů

• n) mouka, luštěniny, rýže a výrobky z nich (v suchém stavu)

• o) dehydrované sojové výrobky

• p) škrob, výrobky ze škrobu a výrobky z brambor (v suchém stavu)

• q) pivo, víno

• r) nealkoholické nápoje (včetně výrobků v prášku)

• s) hořčice

• t) sterilizované potraviny

• u) pasterované ovoce a zelenina, ovoce naložené v lihu, ovocné pomazánky

• v) doplňky stravy (bez složek rostlinného nebo živočišného původu

Biogenní aminy

• Biogenní aminy jsou přirozené antinutriční faktory a jsou významné z hygienického hlediska.

• Bývají spojovány s celou řadou případů otrav z potravin a jsou schopné iniciovat různé farmakologické reakce.

Histamin, putrescin, kadaverin, tyramin, tryptamin, β-fenyletylamin, spermin a spermidin jsou považovány za nejvýznamněší biogenní aminy vyskytující se v potravinách.

Engogenní a exogenní biogenní aminy

Endogenní aminy jsou tvořeny mnoha typy tkání (např.:

adrenalin v dřeni nadledvinek, histamin v mastocytech

(žírné buňky pojivové tkáně) a játrech. Aminy se šíří

místně nebo přes krevní systém.

Exogenní aminy se absorbují z jídla v zažívacím traktu.

Alkohol může zvýšit absorpční rychlost.

Monoaminoxidasa (MAO) rozkládá biogenní aminy a brání

přebytečné resorpci. MAO inhibitory (MAOI) se také

užívají jako medikace léčby depresí, aby zabránily MAO

v rozkladu aminů důležitých pro pozitivní účinky.

Biogenní aminy

• Histamin – látka odvozená z aminokyseliny histidinu, působí jako neurotransmiter zprostředkovájící přenos signálu, dále je signálem zánětlivých onemocnění.

• Histamin je také významným stimulantem sekrece HCl v žaludku, pomocí histamin H2 receptoů.

• Tyramin - látka nacházená v mnoha běžných potravinách, je spojován se zvýšným krevním tlakem a bolestmi hlavy.

histamin

Jako mediátor se uplatňuje i v patofyziologických procesech, zejména

při alergické reakci 1. typu a zánětlivé reakci. Dále má podíl při

některých mechanismech nauzey a zvracení. Při alergických reakcích

zastává histamin roli antigenu, který je uvolňován z mastocytů a

bazofilních granulocytů. Síťuje molekuly protilátek IgE na povrchu

mastocytů, čímž dochází k jeho exocytóze z buněk. Histamin uvolněný

do kůže způsobí zvýšení permeability kapilár, zčervenání kůže a

přispívá k tvorbě podlitin.

Serotonin

• Serotonin - neurotransmiter centrálního

nervového systému, odvozený z

aminokyseliny tryptofan – účastní se

regulace pochodů jako spánek, chuť k

jídlu a sexualita.

• Tryptamin - monoamin alkaloid nalezený

ve stopových množstvích v mozku savců,

a zdá se, že má roli jako neuromodulátor

nebo neurotransmitter.

Tři katecholaminové neuropřenašeče:

Norepinefrin (noradrenaline) - neurotransmiter

regulace spánku, únavy, nespavosti,

pozornosti a příjmu potravy, právě tak stresový

hormon uvolňovaný nadledvinkami, reguluje

nervovou dráhu sympatiku.

Epinefrin (adrenaline) - stresový hormon

nadledvinek, právě tak neurotransmiter

přítomný v nízké koncentraci v mozku.

Dopamin - neurotransmiter řídící motivaci,

závislosti, posilování chování a koordinaci

pohybů těla.

Detekce producentů biogenních aminů

• Detekce BA-produkujících bakterií pomocí

kultivačních technik je pomalá a nejistými

výsledky. Mnoho studií popsalo ztrátu

schopnosti tvorby BA u LAB po delším

skladování nebo po kultivaci izolovaných kmenů

na syntetických mediích.

• Metody založené na molekulární biologii jsou

rychlé, spolehlivé a nezávislé na kultivaci.

• Tyto metody dávají informace o potenciálním

riziku tvorby těchto látek.

Proč jsou nebezpečné

• Toxicita histaminu se zdá být zesilovaná přítomností ostatních aminů, jako je kadaverin, putrescin a tyramin.

Biogenní aminy mohou být také považované za karcinogeny, neboť mají schopnost reagovat s nitrity za tvorby potenciálně karcinogenních nitrosaminů.

Obsah biogenních aminů v různých potravinách a krmivech byl sledován a byly nalezeny v sýrech, rybách a masných výrobcích, vejcích a houbách.

Vznik biogenních aminů

• Potraviny připravené fermentačními procesy, nebo ty, které byly vystaveny mikrobiální kontaminaci během vyzrávání a skladování pravděpodobně obsahují aminy.

• Alkoholické nápoje jako pivo mohou obsahovat biogenní aminy, jako další fermentované potraviny např. kyselé zelí a potraviny ze soji.

• Aminy jsou také považované za endogenní rostlinné látky, některé druhy ovoce a zeleniny obsahují vysoké koncentrace různých aminů.

Limity obsahu biogenních aminů • Histamin- rybí výrobky z druhů spojovaných s

vysokým obsahem histidinu.

• To jsou čeledi: Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae,

Pomatomidae, Scombresosidae

• Vzorkovací plán : n (9), c(2), m 100mg/kg,

M 200mg/kg

• Dále rybí výrobky které prošly enzymovým zracím

ošetřením v nálevu a nejsou vyrobené z druhů

spojovaných s vysokým obsahem histidinu.

• Vzorkovací plán : n (9), c(2), m 200mg/kg,

M 400mg/kg

• Analytická metoda - HPLC