Klinische Chemie und LaboratoriumdiagnostikVorlesung: Chromatographie und Massenspektrometrie

Dr. rer. nat. Frank Kannenberg

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Universitätsklinikum Münster Albert‐Schweitzer‐Campus 1

48149 MünsterTel.: 0251 83‐47227Fax: 0251 83‐47225

kannenberg@uni‐muenster.de www.klichi.uni‐muenster.de

- 1 -Sommersemester 2022

Gliederung

1. Chromatographie, Geschichte, Prinzip2. DC (Dünnschicht-Chromatographie)3. HPLC (Flüssig-Chromatographie)4. GC (Gas-Chromatographie)5. Massenspektrometrie und MS-Kopplungen

- 2 -

• Chromatographie: „mit Farbe schreiben“

• Tswett 1903: Auftrennung von Chlorphyll

M.Tswett 1903

f

- 3 -

SäulenchromatographiePetroleum ether

CaCO3

Chlorophyll-Extrakt

Farbe“chroma”schreiben

“graphein”

- 4 -

Was ist Chromatographie?Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen

• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und darin durch eine stationäre Phase transportiert.

• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte unterschiedlich in ihnen verteilen.

• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.

- 5 -

Trennprinzip

StationärePhase

mobile Phase

Zeit

Säulenanfang Säulenende• Stoffgemisch• Komponenten

wechseln ständigzwischen mobilerund stationärerPhase

• Gleichgewicht(Verteilung,Adsorption)

• Trennung- 6 -

TrennprinzipIInjektor

SSäule

DDetektor

CChromato-gramm - 7 -

Klassifikation der Chromatographie

• Planare Chromatographie:– Papierchromatographie– Dünnschichtchromatographie (DC)

• Säulenchromatographie:– gepackte Säulen– Flüssigchromatographie

(LC, HPLC, IEC, GPC)– Gaschromatographie

(GC, GLC, GSC)– Chromatographie mit

überkrit. Fluiden (SFC), z.B CO2- 8 -

Dünschichtchromatographie (DC)

• stationäre Phase:– z.B. Kieselgel (polar) auf

Glasplatte oder Alufolie• mobile Phase:

– Laufmittel, z.B. Ethanol• DC-Chromatogramm:

– Auftragen (man./autom.)– Entwickeln („DC-Lauf“)– Trocknen, Detektieren

(ggf. Anfärben)• Polaritäten beachten!

- polare (hydrophile) Analyten „laufen“ auf Kieselgel nicht

- 9 -

Retentionsfaktor (Rf –Wert)

1 2

Laufstrecke Substanz

Laufstrecke LösungsmittelRf =

Eintauch-tiefe

Rf 0.3

Rf 0.5

• Substanzspezifisch (bei gleichen chromat. Bedingungen)

- 10 -

Normal-/Umkehrphasen-Chomatographie• „Normalphase“:

Kieselgel (SiO2) polar (hydrophil) für hydrophobe Analyten Laufmittel unpolar

(z.B. Heptan)• RP-Phase

(„reversed phase“): Kieselgel (SiO2) mit

unpolaren Gruppen unpolar (hydrophob) Trennung hydrophiler

Analyten möglich Laufmittel polarer

(z.B. Acetonitril/Wasser)- 11 -

HPLC (HighPerformanceLiquidChromatography)

Eluent

Pumpe

Einspritzventil

Trennsäule

Detektor

Pumpe

Säulennofen

- 12 -

HPLC-Säule• Spezifikationen

CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ

Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------Muster-ChromatographieTel., Fax, mail

Herstellername des Kieselgels

Porengröße (Angström)

Modifizierung des Kieselgels

Korngröße in µm

Säulendimension (Länge x ID)

Flussrichtung

- 13 -

RP-HPLC: Medikamentenanalyse

• Detektion + Quantifizierung– Photometrie

(„UV-/vis Detektor“)– auch andere

Detektoren• Peak

– Retentionszeitsubstanzspezifisch

– Höhe, Fläche proportional zur Konzentration

– Kalibration– Quantifizierung

- 14 -

Schnelle HPLC (FAST- HPLC)• kurze Säulen ca. 3 cm (statt 30 cm)

• sehr kleine Partikel ca. 1,5 µm (statt 5 µm)

• Vorteile:– erheblich kürzere

Analysendauer– weniger Lösungsmittel

• Nachteile:– schneller Detektor notw.– nicht alle Trennungen mögl.– höhere Drucke

- 15 -

HPLC: „Sensorische Verkostung“

• menschl. Geschmackals Detektor

• Eluat wird „verkostet“• Aroma-Analytik• „LC-Taste“

(Abb. Fa. Symrise)

- 16 -

Gaschromatographie: Vgl. HPLC• HPLC: Mobile Phase flüssig (Laufmittel)

– z.B. Methanol/Wasser, Acetonitril/Wasser• GC: Mobile Phase gasförmig (Trägergas)

– Stickstoff, Wasserstoff, Helium– Vorteile GC:

• Trennleistung (v.a. kleine, unpolare Moleküle)• Empfindlichkeit

– Nachteile GC:• Verbindungen müssen flüchtig oder leicht

verdampfbar sein (ggf. Derivatisierung)• Apparativer Aufwand (Gasleitungen)

- 17 -

GC: Schematischer Aufbau

Gasflaschemit Vorreinigung

Reservoir fürmobile Phase

InjektorAutosamplerHeadspace-Aufgabe

Probenaufgabe

gepackte SäuleKapillarsäule

Chromatogr.Trennsäule

FIDWLDMSDAEDNPDECD

DetektorSchreiber, EDV

- 18 -

Gaschromatograph

InjektorDetektor

Autosampler

GC-Ofen Bedienungsfeld

- 19 -

Quarzglas-Kapillaren im GC-Ofen

• GC-Säule aus Glas• Polyimidbeschichtung

(Flexibilität)• 10-100 m Länge• 0,1-0,5 mm

Innendurchmesser• 0,1-1,2 µm Beschichtung

stationäre Phase• dreidimesional vernetzt• verschiedene Polaritäten

- 20 -

Split-/Splitless-Injektor

• Injektion mit Spritze durch Septum (etwa 1 µl)

• Heißes Rohr (Liner)Verbindung zur Trennsäule

• Probe verdampft• Splitventil auf oder zu• Trägergas nimmt Probe mit

auf die Säule

- 21 -

Flammenionisationsdetektor (FID)• GC-Detektor universell

für org.Verbindungen• Pyrolyse in der Luft/

Wasserstoff-Flamme• Ionen + Elektronen• Spannung zwischen

Brennerende und Sammelelektrode:

• Strom• analoges Signal• digitales Signal (PC) - 22 -

GC: Olfaktometrische Detektion („Sniffer“)

Quelle: http://www.ak-hoffmann.chemie.uni-mainz.de/pdf/script/script2.pdf - 23 -

GC-Anwendung: Toxikologie Blutalkohol, Methanol-Vergiftung

Peak Identification1 . Acetaldehyde2 . Acetone3 . Methanol4 . 2-Propanol5 . Ethanol

Blood Alcohols

Column: Econo-Cap™ EC-WAX , 30m x 0.32mm x 0.25um Temp: 50°C Carrier: Helium at 1.08mL/min (22.5 cm/sec) Detector: FID at 300°C

Methanol (Methylalkohol)

- 24 -

Dr. F. Kannenberg

Methanol-Vergiftung, Behandlung

Ethanol =ADH=> Acetdehyd =langsam=> Essigsäure (==>Citratzyclus CO2, H2O)Methanol =ADH=> Formaldehyd =schnell=> Ameisensäure (metabolische Acidose)Isopropanol =ADH=> Aceton

Therapie:• Ethanol oder anderer ADH-

Inhibitor (z.B. 4-Methylpyrazol;kompetitve Hemmung von ADH)

• Hämodialyse (Gifte eliminieren)• Folsäure (Abbau Ameisensäure)• Na-Hydrogencarbonat (Azidose)

- 25 -

Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLO-S)Häufige Missbildungen

• Schädeldeformierung (Mikrozephalie)• breite Nasenwurzel• hoher Gaumen• abnorm kleiner Oberkiefer (Mikrognathie)• Herabhängen der Lidspalten (Ptosis)• Verwachsungen an Fingern + Zehen (Syndaktylie)• Minderwuchs• geistige Retardierung• Muskelschwäche• Entwicklungsanomalie der Genitalien

- 26 -

GC-Anwendung: StoffwechseldiagnostikSmith-Lemli-Opitz Syndrom

• SLO-Syndrom– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese– schwere Missbildungen– Cholesterin stark erniedrigt– 7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC stark

erhöht (Marker)• Analytik

– Routine Cholesterin-Analytik ungeeignet– GC zur Quant. von Cholesterin, 7-DHC, 8-DHC– 24 Fälle seit 1995 hier entdeckt, davon 2 pränatal

- 27 -

SLO: GC-Chromatogramm

GC-Chromatogramm der Plasma-Neutralsterolfraktion eines SLO-Patienten.

0 10 20 30

0

20

40

60

80wl200195

8-D

ehyd

roch

oles

tero

l

7-D

ehyd

roch

oles

tero

l

Cho

lest

erol

Inte

rner

Sta

ndar

d

Res

pons

e in

mV

Retentionszeit in min

- 28 -

Cholesterinvorläufer & Defekte• Endogenes Cholesterol

Biosynthese (Leber)• Precurser

– Lanosterol, Cholestenol, Lathosterol, 7-DHC, 8-DHC

– Desmosterol• Enzymdefekte

– hereditär– schwere Erkrankungen

• Marker für die Cholesterolsynthese

- 29 -

Gliederung1. Chromatographie, Geschichte, Prinzip2. DC (Dünnschichtchromatographie)3. HPLC (Flüssigchromatographie)4. GC (Gaschromatographie)5. Massenspektrometrie und MS-Kopplungen

a) GC/MS (Gaschromatographie/Massenspektrometrie)b) LC/MS (HPLC/Massenspektrometrie)c) MS/MS (Tandem-Massenspekrometrie)d) MALDI-MS („Weiche Ionisierung“, Proteomics)

- 30 -

GC/MS-Kopplung• GC

– Chromatographische Gemisch-Trennung

• MS– Detektor– Ionisation durch

Elektronenstoß (EI)– Massenspezifische

Trennung– Massenspektrum

substanzspezifisch

Quelle der Animation: Trace GC. Thermo-Finnigan, 2002

- 31 -

Warum GC (oder HPLC) + MS?• alle GC-Methoden (FID) auch GC/MS tauglich

– vielfältige Anwendungsbereiche– Medizin, Lebensmittel, Umwelt, Industrie, Gericht

• höhere Empfindlichkeit– mind. Faktor 100 im Vergleich zu GC (FID)

• NWG Dioxin: 1967 GC-FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0,005 pg• z.B. Drogennachweis in Haaren („Drogenkarriere“ über Jahre)

• qualitativ besseres Messergebnis – mehr Informationen (Massenspektrum)– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung

(z.B. Doping-Kontrolle)– Analyse unbekannter Verbindungen

(Spektren-Bibliotheken)

- 32 -

CEC Model 21-103 Sector Field Mass Spectrometer (1950)

DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG

GC/MS 50er Jahre

- 33 -

DIE 70ER JAHRE - EXTRATERRESTRISCHE MASSENSPEKTROMETRIE

VIKING MISSION ZUM MARS: VIKING LANDER MIT GC/MS ZUR UNTERSUCHUNG DER

MARS-ATMOSPHÄRE (NASA 1975)

PIONEER 13 MISSION ZUR VENUS

MIT GC/MS (NASA 1979)

1969-1972: SECHS MISSIONEN ZUM MOND MIT GC/MS

KEINE BEWEISE FÜR LEBEN

MINIATURISIERTE MASSENSPEKTROMETER AN BORD VON SATELLITEN ZUR UNTERSUCHUNG

DER ÄUSSEREN ERDATMOSPHÄRE (SEIT 1961))

- 34 -

GC/MS heute

GCMS-System „QP2010Ultra“; Abb.: Fa. Shimadzu, 2010

- 35 -

Grundprizip der MS• geladene Teilchen (Ionen) können unter Vakuum

in einem Magnetfeld von ihrer Flugbahn abgelenkt werden

• Abhängig von– Masse (m)– Ladung (z)– Geschwindigkeit– Magnetfeldstärke

• massenabhängige Selektion von Ionen m/z

- 36 -

GC/MS: schematischer Geräteaufbau

• Verbindung zum GC:Interface, Transfer Line

• Ionenerzeugung:Quelle, Ionisierungskammer

• massenspezifische Trennung der Ionen:MS-Analysator, Magnetfeld

• Detektion der Ionen:Detektor, Multiplier

• Datenaufnahme und Auswertung:PC, EDV

Quelle der Animation: T.G. Chasteen 1996 (www.shsu.edu)

- 37 -

Auswertung: „Chromatogramm“

• „Summe aller Massenspektren“

• Totalionenstrom– Entspricht GC-

Chromatogramm

- 38 -

Auswertung: Massenspektren• Massenspektrum• M+ Fragmentierung

(EI-Ionisierung 70 eV)• substanzspezifisch;

„Fingerabdruck“• bekannte Substanzen:

eindeutige Identifizierung• unbek. Substanzen:

– Strukturmerkmale– Referenzspektren– Spektrenbibliotheken

• PMW > 6000 Pharmatka, Drogen, Gifte

• NIST > 190000 Substanzen

M+-15

M=638

M+-90

M+-2x90

M+-3x90M+-3x90-115

Basispeak=100%

- 39 -

GC/MS: Dopingkontrolle

Urin Isolierung GC/MS-Analyse

GC/MS-Gerät

LaborAnalyse

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

2.382.392.402.412.422.43

Time ->

Amphetamin

CoffeinInterner

x 10 6Standard

Positiver Dopingbefund

Quelle: „Doping im Sport“; W. Schänzer; Institut für Biochemie, DSHS Köln, 2000

- 40 -

Sitosterolämie (Phytosterolämie)• Klinik:

– Xanthome, Xanthelasmen– Gelenkschmerzen, Arthritis– frühe Arteriosklerose + KHK

• Serum:– Cholesterin norm bis leicht ↑– Phytosterine↑↑ (pflanzl.Kost)

bes. Sitosterin, Capesterin– CAVE! Cholesterinsenkende

Margarine u.ä. Produkte (falsch positives Ergebnis)

• Nachweis:– GC, GC/MS– Gen-Sequenzierung

• genetischer Defekt:– autosomal rezessiv– Mutation ABC G5, ABC G8 Quelle : www.meded.ucsd.edu - 41 -

LC/MS• HPLC (LC)

– Chromatographische Trennung

• MS– Problem: Lösungsmittel– Ionisation: Elektrospray (ESI)– Massenspezifische Trennung– „Sanfte Ionisierung“

• Analyse großer Moleküle und Proteine

Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004

- 42 -

MASSENANALYSATOR

10-2 mbar 10-5 mbar

DETEKTORSPRAY

5000 V

TROCKNUNGSGAS

ATMOSPHÄRENDRUCK

Verdampfen des Lösungsmittels

Desorption mehrfach geladener Ionen durch selbst erzeugtes elektrisches Feld

Rayleigh-Grenze Coulomb-Explosion

+ ++

+++

+++ +

++

+

++

++

++

++

+ +++ +

++

++

++++

++++

+

+

+

+

+

+Protonen auf Tropfen-Oberfläche

LCMS:Elektrospray-Ionisierung (ESI)

Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”; Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004

LCMS_ESI.avi

- 43 -

Tandem-Massenspektrometrie

• Kopplung von Massenspektrometern (MS)• „mehrdimensionale Massenspektrometrie“• Tandem-Massenspektrometrie = MS/MS• MS1: massenspezifisches „Clean up“

– Substanzgemisch– Matrix (Blut, Serum, Urin)

• MS2: Detektion der Analyten

- 44 -

MS/MS: Prinzip

- 45 -

GCMS/MS: Drogen in Haaren• Nachweis von Drogen in Haaren

– GC/MS (SIM)– Signal: Analyt (Konzentration)– S/N durch „clean up“ besser

• höhere Empfindlichkeit• qualitativ besseres Messergebnis

– Informationsgehalt 1000x höherim Vergleich zu GC/MS

– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung(z.B. Doping-Kontrolle)

– Analyse unbekannter Verbindungen(Spektren-Bibliotheken)

- 46 -

Isotopen-Verdünnungs-Analyse (ID/MS)

• Zugabe eines isotopenmarkierten Standards (gleiches Verhalten wie Analyt)

• Extrem hohe Richtigkeit/Präzision

• Referenzmethode für Kreatinin, Cholesterin, Testosteron, Glucose, Harnsäure, Harnstoff, Medikamente.....

- 47 -

LCMS/MS: Immunsuppressiva• Kontrolle nach

Organtransplantationen– Enges therapeutisches Fenster– Zu niedrig: Organ-Abstoßung– Zu hoch: Nebenwirkungen (z.B.

Nierenversagen)• hohe Empfindlichkeit• qualitativ bessere Messergebnisse

im Vergleich zu Immunoassays– Bestimmung der „Muttersubstanz“– Metaboliten: keine Kreuzreaktivität

(Abb. LCMS/MS, Fa. Shimadzu)

- 48 -

MS/MS: Neugeborenen-Screening

• Phenylketonurie (PKU)• Ahornsirupkrankheit (Leu, Ile, Val) • Homocystinurie • Glutarsäure Acidämie• Methylmalonsäure Acidämie• Propionsäure Acidämie• Tyrosinämie• Nicht-ketotische Hyperglyzinämie• Argininbernsteinsäure-Krankheit• Hyperprolinämie• Hypermethioninämie

- 49 -

140 160 180 200 220 240 260 280

Gly

Ala

Val

Leu

MetCit

Phe

Tyr

GluGly

Ala

Ser

Pro

Val

Leu + Ile

GlnTyr

Phe

GluAsp

140 160 180 200 220 240 260 280

GlyAla

Val

Leu

MetCit

Phe

TyrGlu

Gly

Ala

Ser

Pro

Val

Leu + Ile

Gln

Tyr

Phe

GluAsp

m/z

Kontrolle

PKU

interner, isotopen-markierter Standard

Präparation und MS/MS-Analyse• Blutspot auf Filterpapier (3 mm )

Mikrotiterplatte

• Zugabe von Methanol plus isotopen-markierter interner Standard

• Butylierung aller Aminisäuren (AS)• Injektion und Ionisierung der Probe

keine Chromatographie !

• MS/MS-Analyse der AS-Produkte(Neutralverlust-Analyse)

• Quantifizierung der AS durch Standard

Neugeborenen-Screening: PKU

- 50 -

Protein Zelle

DNA

GenomeProteome

DNA fingerprint

3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)

2117.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]

4424

.2

9476

.2

4861

.0

8823

.5

5897

.8

6271

.2

8054

.3

6629

.0

7424

.9

1227

1.4

4738

.6

6984

.6

8383

.8

6786

.7

6533

.3

9075

.2

3132

.3

6137

.3

7209

.8

8903

.3

8610

.6

1011

0.8

4765

.4

1097

5.2

4026

.9

4535

.6

3311

.8

1049

3.9

3491

.4

9611

.5

massfingerprint

SpeziesDefinition & Bestimmung

„Proteomics & Genomics“

- 51 -

• Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry• entwickelt in den 1980‘s von Karas & Hillenkamp und Tanaka et al.

• Nobelpreis für Chemie an Koichi Tanaka im Jahr 2002 (Fa. Shimadzu, Japan)

Historisches: MALDI-TOF-MS, Münster & Nobelpreis

- 52 -

MALDI-TOF MS:Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

ion detector

+

+ +

+

++

template

matrix/analytecrystals

accelerationzone

field-freedrift range

grid electrode

Desorption

Ionisierung

Beschleunigung

Trennung

Detektion

- 53 -

automated spectrum acquisition ~60 sec

ionisation of intact proteins and molecular weight measurement

3000 5000 7000 9000 11000 13000Mass (m/z)

1648.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3

3775

7075

8074

8744

1093

9

9453

9994

7980

1034

7

5015

7863

1157

2

7092

5931

9654

3581

6837

9330

7367

1022

6

8450

1060

8

1190

6

MALDI-TOF-MS Analyse

(Abb. : Fa. Shimadzu)

- 54 -

• Spektrenbibliotheken• Identifizierung des

Stammes und der Spezies

• z.B. auch „EHEC“ (enterohämorrhagischeEscherichia coli)

Mikobiologie: Identifizierung von Keimen

- 55 -

ENDE

Herzlichen Dank fürs Zuhören!

- 56 -