Kombinatorische Ansätze im rational drug design

4. Vorlesung Modern Methods in Drug Discovery WS04/05 1

Kombinatorische Ansätze im rational drug design

Automatisierte Tests von >1000 Verbindungen an einem target erfordern besonders effektive Synthese- und screening Strategien:• Syntheseroboter• High Throughput screening

Ursprüngliche Idee: Je mehr Verbindungen getestet werden, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, eine Leitstruktur zu entdecken.


Eigenschaften kombinatorischer Bibliotheken

Je nach Anwendungszweck werden auch kombinatorsiche Bibliotheken maßgeschneidert:

Random libraries drug-like / diverse scaffolds

Focused libraries lead-like / möglichst komplett für bestimmte Familie von Enzymen

Targeted libraries bestimmtes Enzym /möglichst diverse Substituenten

Chemogenomics


Aufbau von Substanzbibliotheken für das High thoughput screening (I)

Die Synthese einer Vielzahl von Verbindungen ausgehend von einer Leitstruktur erforderte einen Paradigmenwechsel.

Bis in die späten 80‘ Jahre wurden die zu testenden Substanzen jeweils einzeln und speziell synthestisiert.

Die Anforderungen an das High Troughput Screeningerfordern jedoch eine andere Herangehensweise.

„If you are looking for the needle in the haystack, it is best not to increase the size of the haystack.“


Klassische und kombinatorische Synthese

1 Edukt * 1 Edukt = 1 Produkt

Kombinatorische Synthese:

CH3

NH2

Cl

O

OMe CH3

NH

O

OMe

+

Klassische Synthese:

R1 NH2Cl

O

R2 NH

O

R2R1

+

z.B: 50 Edukte * 20 Edukte = 1000 Produkte

Bei mehreren Stufen z.B: 50 * 20 * 20 = 20 000 Produkte


Synthesemethoden zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken (I)

N N

S

R1

R2

H

H

R3

O

Cl

H R4 N

S

N

R1

R2

R4

R3+

H2O, HCl+

Ziel ist es mit derselben chemischen Reaktion möglichst viele Verbindungen zu erhalten.

Parallele Synthese (diversity orientiented)

Problem: Viele Reaktionsgefäße notwendig, v.a. wenn die Synthese über mehrere Schritte erfolgt

Lösungsansatz: Multikomponentenreaktionen


Historische Meilensteine (I)

A.Strecker (1850)

A.R. Hantzsch (1890)

P. Biginelli (1893)

R

C

NH2

N

NH3 + HCN + RCHO

R1

Cl

O

R2

H OR

O O N

H

R1

R2 COOR

NH3 + +

NH2

O

NH2R2

OR3

N

NH

O

R1

R2 R3

H

R1-CHO + +


Historische Meilensteine (II)

C. Mannich (1912)

M. Passerini (1921)

H.T. Bucherer (1934)

R1

NHR2

R3

R4

O

H N H

O

R4R3

R1

R2

CH2O + +

NH NH

O

O R

HCN + NH3 + CO2 + RCHO

R3 O

O R2

N

O

H

R1R1NC + R2CHO + R3COOH


Historische Meilensteine (III)

F. Asinger (1958)

I. Ugi (1959)

R1

O

R2 R3

O

SH

R4

N

S

R2

R1R4

R3

NH3 + +

R4 N

O R2

N

O

H

R3

R1

R1NH2 + R2CHO + R3NC + R4COOH


Synthesemethoden zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken (II)

N N

S

R1

R2

H

H

R3

O

Cl

H R4 N

S

N

R1

R2

R4

R3+

H2O, HCl+

Ziel ist es mit derselben chemischen Reaktion möglichst viele Verbindungen zu erhalten.

Parallele Synthese (diversity orientiented)

Eines der größten Probleme ist die Abtrennung der Produkte aus der Reaktionsmischung, insbesondere bei nicht kristallinen Stoffen und kleinen Mengen.

Lösungsansatz: Temporäre Fixierung an einen festen Träger


Festphasensynthese (I)Fixierung an ein funktionalisiertes Polymerharz (Polystyrolkügelchen) = bead

Quervernetztes Polystyrol (1-1.5% Divinylbenzol)

Ph Ph Ph Ph

PhPh

Cl

Cl

Cl

=


Festphasensynthese (II)Ursprünglich entwickelt um langkettige Polypeptide zu erzeugen.

Fixierung des Peptids an Polystyrolkügelchen.

Lit. R. B. Merrifield J.Am.Chem.Soc. 85 (1963) 2149.

Ansatz von Merrifield:

NH2

R1

O

O

Cl

ONH2

R1

O

+H2O

-Cl-

1. C-terminale AS

ONH2

R1

ON

R2

O

OH

O

O

H

N C N

ON

R1

O

N

R2

O

O

O

H

H

+

2. AS N-geschützt mit Boc


Festphasensynthese (V) weitere Linker

Merrifield resin

Wang resin

Cl

OOH

Rink acid linker

OHOMe

OMe

NHFmocOMe

OMe

Fmoc geschützter Rink amine linker


Festphasensynthese(VI) Catch linkers

S O R

stabil

S O R

O O

labil

S

O O

+ ROHBase

NH O

SN

R

O

Produkt

OO

R=H ist stabil

Kenner safety linker

1. CH2N2 / Et2O / acetone

R=CH3 ist labil

2. NH3

R1NH

R2OH-

Produkt-COOH Produkt-CONR1R2


Festphasensynthese (VII)

Abwandlung: split-and-pool strategy

Ausgehend von einem Grundgerüst kann so durch splitting in jedem neuen pool das Substitutionsmuster variiert werden

Technische Lösung der Abtrennung:

magnetic beads


Synthese von Peptid-Bibliotheken

Die Aufteilung der Produkte ermöglicht eine effiziente parallele Synthese, beispielsweise zum Aufbau von orthogonalen Bibliotheken:

Systematisches variieren der Aminosäure an der X-ten Position eines Proteins. Erforderlich bei der Epitop-Kartierung an Antikörpern

Sukzessives Einschränken der aktivesten Aminosäuren-sequenz (split-and-mix)

Ac-DVXXXX-NH2 204 Peptide

Ac-DVPXXX-NH2 203 Peptide

Ac-DVPDYA-NH2


Festphasensynthese (VIII)split-and-mix strategy zum Aufbau von Peptidbibliotheken

Erzeugung von Peptiden mit jeweils gleichem Ende in einer Mischung

A B C

AB

C

split

combine

AA

A

BA

CA

B

C

split

AB CA

BB

CB

CB

CC


Festphasensynthese (IX)

Erzeugung von Peptiden mit jeweils gleichem Ende in einer Mischung

AA

combine

A

BAA

CAA

A

ABA

BBA

CBA

CAA

CBA

CCA

AAB AAC

B

C

split

BAB

CAB

ABB

BBB

CBB

CAB

CBB

CCB

BAC

CAC

ABC

BBC

CBC

CAC

CBC

CCC


Synthesemethoden zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken (II)

Für die parallele Synthese zum Aufbau von Substanz-Bibliotheken sind zuverlässige Syntheseschritte erforderlich, die auch von Syntheserobotern ausgeführt werden können, z.B.

Reduktive Aminierung

Acylierung

Hantzsch-Synthese von 2-Aminothiazolen

Suzuki-Kopplung (Aufbau einer C-C Bindung)

Ugi-Kondensation (Di-Peptide)


Peptidsynthese / Abfangen an fester Phase (I)Ugi-4-Komponenten Kondensation

Die Reaktion eines Isocyanats mit einer Carboxylgruppe und einem Keton führt zu einem -acyloxy-amid (Passerini Reaktion). Wird zusätzlich ein Amin zugegeben, dann ensteht das entsprechene Bisamid.

R1 COOH

R2 NH2

R3 CHO

R4 N C*

R1 NC*

O

R2

R3

O

N

H

R4-H2O

Nachteil: Es gibt nur wenig käufliche Isocyanate

Lösung: Verwenden eines universellen Isocyanates, das als Precursor für weitere Produkte dient


Peptidsynthese / Abfangen an fester Phase (II)Cyclohexenimid als universelles Isocyanid für die Ugi-Kondenation

Ermöglicht eine Reihe von Produkten, sowie das Abfangen an einem Harz (resin capture) :

Keating & Armstrong J.Am.Chem.Soc. 118 (1996) 2574

OC N

N H

O

HN

CNaCN / NH4Cl

Et2O /H2O

HCOOH

Ac2O

61% 44%

tBuOK

THF

Triphosgen

DABCO, CH2Cl2

50% in 2 Stufen

NR1 N

O

R2

R3

O

H

R1 N

O

R2

R3

O

OMe

R1 N

O

R2

R3

O

OR1 N

O

R2

R3

O

OHOH

AcCl

MeOH

HCl / THF CH2Cl2

20% TFA


Peptidsynthese / Abfangen an fester Phase (III)Cyclohexenimid als universelles Isocyanid für die Ugi-Kondenation

Weitere Umsetzungsmöglichkeiten der Ugi-Produkte:

Keating & Armstrong J.Am.Chem.Soc. 118 (1996) 2574

NR1 N

O

R2

R3

O

H

R5 R6

N

R5 R6

R2

R3R1HCl / Toluene

-CO2

NN

O

R2

R3

O

H

NH2R1 R1

N

O R2

N

HO

R3

1,4-Benzodiazepine-2,5-dione


Anwendungen der Ugi-Kondensation (I)Synthese von lokalen Anesthetica (Morphochem, Munich)

NC

H H

O

NH N

H

O

N+ +

Lidocaine

N

H

O

N

COOH

COOHN

H

O

N

N

Cl H

O

N

H

N

Cl H

O

NN

COOMe

N

H

O

N N

H

O

N

Lidofenin Pyrrocaine

Butanilicaine Clodacaine

Tolycaine Trimecaine


Anwendungen der Ugi-Kondensation (II)Synthese von Thrombin InhibitorenInsgesamt 15 360 Produkte aus 12 Aminen, 80 Aldehyden und 16 Isonitrilen

Lit: K. Illgen Chem. Biol. 7 (2000) 433

NH2

NH2

NH2

OH

NH NH2 NH NH2

NH2

NH2

NH NH2

NH

NH2

NH2

NH

NH2

NH2

COOH


Kominatorische Dihydropyridine Bibliothek

Lit: K.C. Nicolaou et al. in Handbook of Combinatorial Chemistry, VCH Wiley (2000) pp. 659-660

NH2

split

10 lots

R2O

O O

R1 R2O

O R1

NH10 synthons

combine

pool of 10 enamines

R3

O O

R4split

30 lots 3 synthons +Ar-CHO (10 synthons)

ArO

R3

OR4

O

OR2

R1NH

Ar O

R3

R4

O

OR2

R1 NH

TFA

100 products

COOMe

Me

O

Me NH

FO

OiPr

screening

deconvolution

IC50 (calcium channel) = 14 nM


Angiotensin converting enzyme (ACE)-Hemmer Bibliothek

Lit: M.M. Murphy et al. J.Am.Chem.Soc, 117 (1995) 7029

CH2ClO

O

R

NH2

AAs:

GlyAlaLeuPhe

+

R1

O

H

O

O

R

N Ar+

Ar-CHO:

R1:HMeOMeOSiMe2tBu

Cl Thio

O

O

O

R

N Ar

Y

ThioO

+ Thio:CH2SAcCH2CH2SAcCH(Me)CH2SAc

N

O

CH3

OH

OSH

COOMeKi (ACE) = 160 pM

CN

COOMe

COMe

COOtBu

COOMe

O

O

R

NH

Ar

Y

Y:

+


Tamoxifen Synthese

BO

O

B O

O

I O NMe2

B O

O

O

Me2N

PdCl2(PPh3)2

Suzuki-Kopplung

I

NH

O

O

Me2N

NH2O

PdCl2(PPh3)2

TFA

Tamoxifen


Reaktionen an stationärer Phase Abfangen von Überschuß an stationärer Phase

Analog anwendbar zum Abfangen von Nebenprodukten

A + excess B A-B + BX

X BA-B +

Häufig werden dazu Ionenaustauschersäulen benutzt

NH2 R NH3

+R

SO3-

Amberlite resinSO3

-Produkt +

+ ProduktNH2 R

NH3 / MeOHSO3

-

-

Polymer-assisitierte Reinigungsverfahren:

J.J. Parlow et al. Current Opin. Chem. Biol. 3 (1999) 320


Synthesestrategien (I)

2. Spaltung an strategischen Bindungen unter Anwendung von Retrosynthetischen Prinzipien

3. Konvergente anstatt Sequenzieller Synthese

1. Verwendung von Templaten die einfach funktionalisiert werden können


Multifunktionelle Template (I)

N OBoc

O

O

N

O

R3

O

NR1

O

NR2

COOH

N

COOH

Boc

NBoc

COOH

O

NR1

R1NH2

NBoc

O

NR1

O

NR2

R2NH2 HCl / dioxan

R3COOH


Multifunktionelle Template (II)

N OBoc

O

O

N

O

R3

O

NR1

O

NR2

Lit: S. Cheng et al. J.Am.Chem.Soc. 118 (1996) 2567

NH2

NH2

NH2

NH2

O NH2

NH2

COOH

COOH

COOH

R1NH2 R2NH2 R3COOH


Synthesestrategien (II)





Spaltung an strategischen Bindungen (I)

NNNS S

N NH2

NNH S

N NH2

NN S

N NH2

RX

a) RCOCl (200)b) RSO2Cl (80)c) RNCO (80)

a) X: C=Ob) X: NHC=Oc) X: SO2

S

N NH2

I

NX HR

NX S

N NH2

R

a) X=N, R=Alkyl, Aryl, Heteroarylb) X=C, R=Alkyl, Aryl; OR1, NHR2

(80)


Spaltung an strategischen Bindungen (II)

NNNS S

N NH2

Lit: C.N. Selway et al. Bioorganic Med.Chem. 4 (1996) 645

NNB(OH)2

NS

N

NO2Br

R

NNNS

N

NO2

R

R=Aryl, Cl

Suzuki-Kopplung

NN S

N NH2

S

O

O

Ph

N S

N NH2

N

NH

O

Screening against herpes simplex virusHelicase ATPase

IC50 6.0 M

IC50 1.1 M


Suzuki Kopplung (I)

Lit: A. Suzuki Organomet.Chem. 576 (1999) 147

B(OH)2CHOBr CHO+

Pd(OAc)2

PPh3

Na2CO3

H2O / i-PrOH 86%

Selbst primäre Alklygruppen lassen sich mit speziellenPd-Katalysatoren transferieren

B CH2 C N8

O

BrMeMe

O

MeMe

CH2 C N8

Ph2P

Pd

Cl

ClPh2P+81%

K2CO3

DMF, THF


Suzuki Kopplung (II)

Lit: H.C. Brown et al. Organomet. 2 (1983) 1316

Synthese der Organobor Verbindungen:

Li B(O-iPr)2

1. B(Oi-Pr)3

Et2O

2. HCl / Et2O

84%

H B(Oi-Pr)2

1. n-BuLi Et2O

2. B(Oi-Pr)3

3. HCl / Et2O95%


Spaltung an strategischen Bindungen (III)

N

CH3

O

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl

HN

CH3

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl

XN

CH3

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl

R



N

CH3

O

N

Ph

NH2

Cl

Cl

N

CH3

O

N

Ph

N

H

XR

Cl

Cl




Spaltung an strategischen Bindungen (IV)

N

CH3

O

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl


N

CH3

O

Cl

Cl

O S

O

O

CH3

NX H

R1

R2

N

CH3

O

N

X

R1

R2

Cl

Cl

(80)

X: C, N

HN

Ph

N

H

CH3

O

N

Ph

N

H

CH3

O

XR




Spaltung an strategischen Bindungen (V)


Neurokinin-2 Rezeptor Antagonisten

N

CH3

O

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl

IC50 3.1 nM

N

CH3

O

N

Ph

N

H

CH3

O

Cl

Cl

F

F

IC50 2.5 nM

Lead compound of library

Best compound found


Synthesestrategien (III)





Konvergente Synthese

Sequentielle Synthese

Konvergente Synthese

A90%

B90%

C90%

D90%

E Total: 65%

A90%

B

F90%

G

90%D

90%E Total: 73%

Ziele: Optimierung der GesamtausbeuteVerkleinerung der AnsatzvoluminaErmöglicht kombinatorische Bibliotheken


Retrosynthese (I)

Konzept: Sukzessives Spalten von Bindungen an der Zielverbindung liefert potentielle Zwischenprodukte und schließlich alle denkbaren Edukte

NNNS S

N NH2


Retrosynthese (II)

Ansatz ist nicht wie bei der üblichen Synthese die Frage, welche Reaktionen können mit meiner Verbindung stattfinden, sondern

Wie müssen meine Reaktanden beschaffen sein um die gewünschte Verknüpfung (Bindung) zu ermöglichen ?

Bsp: Knüpfung einer C-C Einfachbindung mittels Suzuki-Kopplung

CHO B(OH)2CHOBr+


Retrosynthese (III)

Eine weitere Anforderung an die Edukte ist deren Verfügbarkeit und Preis

Bei Zielverbindungen mit Stereozentren ist es zudem vorteilhaft diese möglichst selektiv über entsprechende Edukte einzubringen oder zu induzieren

„Chiraler Pool“

OH

OHOH

OH

O

O

OH

OHO

O

R

Ar Ar

Ar Ar

(R, R)-Weinsäure


Weiterführende Literatur

Stuart Warren „Organic Synthesis – The Disconnection Approach “ John Wiley & Sons

Ca. 39 €

Workbook, Ausleihbar über LIBERO in SULB


Synthesestrategien (IV)




4. Auswahl diverser Komponenten für die zu synthetisierende Substanzbibliothek


Substanzauswahl (I)Praktisches Problem:

Die Reaktion von 7622 Carbonsäuren mit 1761 Aldehyden würde mehr als 1.3 x 107 Verbindungen ergeben.

Welches sind die vielversprechensten ?

Zunächst trifft man eine Vorauswahl anhand folgender Kriterien:

• Sind die potentiellen Produkte schon einmal im Screening gewesen ?

• Kommerzielle Verfügbarkeit und Preis der Edukte

• Chemische Diversität - Clustering


Komponentenauswahl für dasHigh Throughput Screening (HTS)

N R3

R1 R2

Typischer eADME Filter


Substanzauswahl für das HTS (II)

Um die Diversität eines Datensatzes bzw. einer erstellten Substanzbibliothek zu berurteilen, muß man die enthaltenen Verbindungen zu Clustern gruppieren

Die Zuteilung der Moleküle erfolgt anhand ihrer gegenseitigen Ähnlichkeit (Similarität).

Verwerfen ungeeigneter Cluster

Ein Molekül aus jedem Cluster für HTS

Erzeugen weiterer Verbindungen im selben Cluster


Virtual Screening (I)

Anhand des chemischen Profils einer Verbindungsklasse kann man natürlich auch in vorhandenen Datenbanken nach ähnlichen Verbindungen suchen

Die entsprechende Suche ist prinizipiell dasselbe wie eine Substruktursuche in CAS-online

Bsp: Carbonic Anhydrase InhibitorenSuche unter 90000 Verbindungen lieferte 3314 Moleküle

S

O O

NH2

O

NH2

Startstruktur

N

S

O O

NH2

NO2

OS

O O

NH2

SX

S

X=S, SO2

Lit: S. Grüneberg et al. J.Med.Chem. 45 (2002) 3588


Virtual Screening (II)

In erweiterter Definition schließt das virtual screening auch weitere computerbasierte Verfahren ein wie,

• ADME-Filter (siehe Vorlesung 7) und

• Docking

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