Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Michael R. KoblischkaMichael R. Koblischka

FR Experimentalphysik, Universität des SaarlandesFR Experimentalphysik, Universität des Saarlandes

Konfokale LaserKonfokale Laser--ScanningScanning MikroskopieMikroskopie3D3D--Darstellung Darstellung dicker dicker Proben mit SubmikrometerProben mit Submikrometer--AuflösungAuflösungin in Reflektion Reflektion und und FluoreszenzFluoreszenz

PrinzipPrinzip::LaserLaser--MikrostrahlMikrostrahl

Strahl wird beugungsbegrenzt fokussiert Strahl wird beugungsbegrenzt fokussiert ((ObjektivObjektiv))Spotdurchmesser Spotdurchmesser 200 nm 200 nm –– 500 nm500 nm

ScanningScanning--EinheitEinheitStage scan Stage scan –– Beam scanBeam scanHöchstgeschwindigkeitHöchstgeschwindigkeit: 3 : 3 BilderBilder/s/szz--Verstellung Verstellung in 40 nmin 40 nm--Schritten möglichSchritten möglich

KonfokaleKonfokale DetektionDetektionPinhole (Pinhole (LochblendeLochblende))outout--ofof--focus focus Signale werden nicht detektiertSignale werden nicht detektiert

Konfokales Konfokales Scanning Scanning MikroskopMikroskop

Marvin Marvin Minsky Minsky (MIT)(MIT)Studium Studium in Harvard und Princetonin Harvard und Princeton((MathematikMathematik, , NeurophysiologieNeurophysiologie, , EmbryologieEmbryologie, , NeuroanatomieNeuroanatomie,,PyschologiePyschologie, , MechanikMechanik))

PostPost--Doc in Harvard:Doc in Harvard:Studium der Hirnfunktion Studium der Hirnfunktion ((imim LymanLyman--PhysiklaborPhysiklabor))

ProblemProblem Keine optische Keine optische 3D3D--DarstellungDarstellung vonvon gefärbtengefärbtenNeuronen möglich infolge MehrfachNeuronen möglich infolge Mehrfach--StreuungStreuung

LösungLösung KonfokaleKonfokale Abbildung Abbildung ((AbrasternAbrastern derder Probe)Probe)LichtquelleLichtquelle: : BogenlampeBogenlampe, , ObjektscanningObjektscanning: : RoboterarmRoboterarmBrief Brief vom vom 18.11.195518.11.1955 mit Apparaturmit Apparatur--BeschreibungBeschreibungan an seinen Schwager seinen Schwager ((PatentanwaltPatentanwalt))

Patentanmeldung Patentanmeldung 7.11.1957, 7.11.1957, Erteilung Erteilung 19.12.196119.12.1961

Konfokales Konfokales Laser Scanning Laser Scanning Mikroskop Mikroskop (CLSM, LSCM)(CLSM, LSCM)

1. Laser (1. Laser (PunktquellePunktquelle))Gaslaser Gaslaser (He(He--NeNe, , ArAr+, +, ArAr+/Kr+)+/Kr+)Festkörperlaser Festkörperlaser ((NdNd:YAG):YAG)

2. x,y2. x,y--ScanningScanning--EinheitEinheitBeamBeam--ScanningScanning

kHzkHz--GalvanospiegelGalvanospiegel, , RotationsspiegelRotationsspiegelPiezoablenkerPiezoablenker, AO, AO--AblenkerAblenker

ObjektObjekt--ScanningScanningTischverstellung Tischverstellung ((SchrittmotorSchrittmotor))

3. Pinhole (3. Pinhole (BlendeBlende))kreisförmigkreisförmig, , rechteckigrechteckig> 50 µm, > 50 µm, variabelvariabel, , vor Detektorvor Detektor

LaserLaser--ScanningScanning--MikroskopMikroskop

GrundgerätGrundgerät: : Aufrechtes oder umgekehrtes ForschungsmikroskopAufrechtes oder umgekehrtes ForschungsmikroskopVerfahrenVerfahren::

-- konventionell konventionell ((mit Okularbeobachtungmit Okularbeobachtung))TransmissionTransmissionReflektionReflektionFluoreszenzFluoreszenzübliche Kontrastverfahrenübliche Kontrastverfahren: : PhakoPhako, DIC, DIC

-- LSMLSM--ModusModusTransmissionTransmissionReflektionReflektion//FluoreszenzFluoreszenzconfocal confocal ((mitmit pinhole)pinhole)

Kosten für ein solchesKosten für ein solchesSystem:System:

ca. 150000 €ca. 150000 €

3D3D-- MikroskopieMikroskopiemechanical sectioningmechanical sectioning

ZerschneidenZerschneiden derder Probe in Probe in DünnschnitteDünnschnitteUltradünnschnittUltradünnschnitt: 25 nm < d < 100 nm: 25 nm < d < 100 nmSemiSemi--Dünnschnitt Dünnschnitt 0.1 µm < d < 1 µm0.1 µm < d < 1 µmNormalschnittNormalschnitt: 1 µm < d < 100 µm: 1 µm < d < 100 µm

MikrotomMikrotom: 1 µm < d < 30 µm x n: 1 µm < d < 30 µm x nVibratomVibratom: 10 µm < d < 2 mm: 10 µm < d < 2 mmKryostatKryostat: 1 µm < d < 210 µm: 1 µm < d < 210 µm

optical sectioningoptical sectioningAbbildenAbbilden von zvon z--Ebenen der Ebenen der intaktenintakten ProbeProbe

SchnittdickeSchnittdicke: 40 nm < d < : 40 nm < d < ProbendickeProbendickeBegrenzungBegrenzung: : Lichteindringtiefe Lichteindringtiefe –– SignalaustrittstiefeSignalaustrittstiefezz--VerstellungVerstellung: : Probentisch oder ObjektivProbentisch oder Objektiv

Neue EntwicklungenNeue Entwicklungen und und AusblickAusblick

-- SNOM (Scanning NearSNOM (Scanning Near--field Optical Microscopefield Optical MicroscopeAbstand Abstand d << d << Wellenlänge Wellenlänge (nm(nm--BereichBereich))Glasfaser als SondeGlasfaser als Sonde, , Analogie zu Analogie zu RasterRaster--TunnelTunnel--MikroskopieMikroskopie

-- MultiphotonenmikroskopieMultiphotonenmikroskopiebesbes. 2 . 2 --Photonenanregung im Photonenanregung im NIRNIRFluoreszenz im SichtbarenFluoreszenz im Sichtbaren

-- 4D4D--MikroskopieMikroskopiezeitliche Auflösung im zeitliche Auflösung im 3 D3 D-- RaumRaum

LSM LSM BilddarstellungBilddarstellungEinzelbildEinzelbild

einkanalig einkanalig T, R, FlT, R, Flmehrkanaligmehrkanalig: : Überlagerung Überlagerung T, R, Fl (T, R, Fl (bisbis 5 5 KanäleKanäle))

Bildsequenzen Bildsequenzen ((SchnittstapelSchnittstapel) und ) und deren Darstellung alsderen Darstellung alsGalleryGallery

3D3D--BilderBilderFarbFarb--Höhenkarte Höhenkarte ((FalschfarbenzuordnungFalschfarbenzuordnung))Schnitte Schnitte xx--y (z = const.)y (z = const.)

xx--z (y = const.)z (y = const.)yy--z (x = const.)z (x = const.)

ZeitfunktionenZeitfunktionenZeitserienZeitserien

Time scan (Time scan (entlang einer Linie entlang einer Linie --FluoreszenzabklingzeitFluoreszenzabklingzeitTime spot (zTime spot (z--Richtung bei PunktanregungRichtung bei Punktanregung))

LSM LSM BildverarbeitungBildverarbeitung, , BildbearbeitungBildbearbeitung

MessfunktionenMessfunktionen

AbständeAbstände, , FlächenFlächen, , WinkelWinkelFalschfarbendarstellungFalschfarbendarstellungHistogrammauswertungHistogrammauswertungMessungen Messungen in ROIin ROI

Speichern Speichern und Laden vonund Laden von Bildern oder SerienBildern oder Serien(PC(PC--SchnittstelleSchnittstelle))

Bildbearbeitung ist Bildbearbeitung ist äusserst wichtigesäusserst wichtiges Hilfsmittel fürHilfsmittel für die LSCMdie LSCM--UntersuchungenUntersuchungen..

Problem: Problem: Datensätze sind recht Datensätze sind recht gross!gross!

Was Was kann kann manman mit konfokaler Mikroskopie messenmit konfokaler Mikroskopie messen??

BeispieleBeispiele::IdentifizierungIdentifizierung vonvon StoffwechselmetabolitenStoffwechselmetabolitenNachweisNachweis von Proteinvon Protein--ProteinProtein--Interaktionen Interaktionen (FRET)(FRET)Visualisierung subzellulärer ProteinverteilungVisualisierung subzellulärer ProteinverteilungBeobachtungBeobachtung vonvon Zellteilungszyklen oderZellteilungszyklen oder

cytoplasmotischer Ionenverteilungen cytoplasmotischer Ionenverteilungen (lifetime)(lifetime)Intrazelluläre Messung physiologischer Intrazelluläre Messung physiologischer Parameter (pH, Parameter (pH, pCapCa, pO, pO22,etc.),etc.)

Beispiele für EinsatzgebieteBeispiele für Einsatzgebiete::BiopharmazieBiopharmazie

BakterienBakterien in in GesteinGesteinQualitätssicherungQualitätssicherung vonvon DruckpapierDruckpapier

HalbleiterforschungHalbleiterforschung

LSCM LSCM –– Menschliche ArterieMenschliche Arterie

Bilder bestehen aus Bilder bestehen aus 81 81 individuellen Schnittenindividuellen Schnitten, , jeder Schnitt jeder Schnitt 1 MB1 MBGesamter DatensatzGesamter Datensatz: 81 MB: 81 MBProbleme bei der Bildbearbeitungin EchtzeitProbleme bei der Bildbearbeitungin Echtzeit

LSCMLSCM--Abbildung derAbbildung der Arterie einer RatteArterie einer Rattein in drei unterschiedlichen Abbildungsmodendrei unterschiedlichen Abbildungsmodena.) a.) maximale Intensitätmaximale Intensitätb.) rendering, b.) rendering, Aufsicht im hohen WinkelAufsicht im hohen Winkelc.) c.) nur Oberfläche betontnur Oberfläche betontd.) d.) Blick innerhalb der Oberfläche Blick innerhalb der Oberfläche in den in den DatensatzDatensatz

von c.)von c.)

Zeitaufgelöste Beobachtung einer Tetrahymena-Zelle

Zeitabstand: 125 msLaserlicht 488 nm

grüne und rote Fluoreszenz in der Zellekann beobachtet werden

Auge Auge des des WasserflohsWasserflohs

a.) a.) idealeideale konfokalekonfokale KonfKonf..b/c/d.) b/c/d.) Bildbearbeitung Bildbearbeitung undund

Öffnen der IrisblendeÖffnen der Irisblende

Saccharomyces cervisiaeSaccharomyces cervisiaeim Hopfenim Hopfen

Z = 568 µmZ = 568 µm

Netzartiges ImplantatNetzartiges Implantat

unbehandeltunbehandelt min3 min3 modifiziertmodifiziert