Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität zum ... · Korrelation von...

Korrelation von Replikationskapazität und Pathogenität

zum Resistenzmuster von HIV-1 Varianten

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Monika Tschochner

aus Erlangen

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissen-

schaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2007

Vorsitzender der Promotionskomission: Prof. Dr. E. Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. B. Fleckenstein

Zweitberichterstatter: PD Dr. R. Slany

INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1 ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................... 1 2 EINLEITUNG........................................................................................................................ 5 3 ZIEL DER ARBEIT ............................................................................................................. 15 4 MATERIAL UND METHODEN ........................................................................................ 16

4.1 Material ......................................................................................................................... 16 4.1.1 Eukaryotische Zelllinien ........................................................................................ 16 4.1.2 Bakterienstämme.................................................................................................... 17 4.1.3 Medien und Puffer ................................................................................................. 17 4.1.4 Nukleinsäuren........................................................................................................ 18 4.1.5 Enzyme .................................................................................................................. 21 4.1.6 Datensätze .............................................................................................................. 22

4.2 Methoden....................................................................................................................... 26 4.2.1 Nukleinsäuremethoden........................................................................................... 26 4.2.2 Generierung rekombinanter Viren ......................................................................... 29 4.2.3 Resistenz-Analysen................................................................................................ 29 4.2.4 Virale Quantifizierungsverfahren .......................................................................... 31 4.2.5 Zellkulturverfahren................................................................................................ 33 4.2.6 Klonale Analysen................................................................................................... 37 4.2.7 Statistik und computergestützte Analysen............................................................. 38

5 ERGEBNISSE...................................................................................................................... 42 5.1 Vergleich der Produktion von p24-Antigen und Infektiosität in Zellkultur.................. 42 5.2 Replikationskapazität rekombinanter Viren.................................................................. 44 5.3 Replikationskapazität von Volllänge-Viren.................................................................. 50 5.4 Charakterisierung der Datenbanken.............................................................................. 51 5.5 Identifikation Replikationskapazitäts-assoziierter Mutationen..................................... 57

5.5.1 Univariate Analyse................................................................................................. 57 5.5.2 Multivariate Analyse.............................................................................................. 61

5.6 Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps ....................................... 67 5.7 Analyse der Auswirkungen des wechselnden Selektionsdrucks in der CAT-Studie .... 70 5.8 Untersuchung von Viruslastveränderungen in der CAT-Studie ................................... 72 5.9 Die klinische Relevanz der RC ..................................................................................... 84

6 DISKUSSION ...................................................................................................................... 92 7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................... 107 8 LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................ 110 9 DANKSAGUNG................................................................................................................ 124 10 ANHANG........................................................................................................................... 125

ZUSAMMENFASSUNG

1

1 ZUSAMMENFASSUNG

HIV-Infektionen können heutzutage mit Kombinationen aus insgesamt 20 zugelassenen

antiretroviralen Substanzen behandelt werden. Doch immer wieder entzieht sich das Virus

einer anhaltend erfolgreichen Behandlung durch die Entwicklung von Medikamentenresistenz.

Diese Resistenz ist aber nicht immer nur von Vorteil für das Virus, sondern schränkt oft die

Fähigkeit zur viralen Replikation ein. Gerade für stark resistente Stämme wird die klinisch-

prognostische Relevanz einer solch verminderten Replikationskapazität seit einigen Jahren

diskutiert. Daher finden Methoden zur Bestimmung der Replikationskapazität von HI-Viren

zunehmend Anwendung. Dabei wird vornehmlich mit Zellkultursystemen und rekombinanten

Viren gearbeitet. Gängige Systeme beruhen zum einen auf der Koinfektion von nicht

resistentem Referenz-Virus und Patienten-abgeleiteten Virus innerhalb derselben Zellkultur.

Zum anderen werden Systeme eingesetzt, deren Prinzip auf der Erstellung von

Replikationskinetiken basiert. Wegen hoher Variabilität und unzureichender Vergleichbarkeit

der Testsysteme untereinander sollte in dieser Arbeit ein Test zur Bestimmung der

Replikationskapazität entwickelt werden, welcher die Problematik der initialen

Virusquantifizierung handhaben und zudem die meisten bekannten Resistenz- und

Replikations-assoziierten Mutationen erfassen konnte. Außerdem sollten mit Hilfe

bioinformatischer Methoden wichtige Replikations-assoziierte Mutationen identifiziert sowie

ein Vorhersagesystem erstellt werden, welches auf der Basis von Sequenzinformationen die

Replikationskapazität eines Virus errechnen kann. Abschließend sollte die klinische Relevanz

der Replikationskapazität anhand diagnostischer Proben beurteilt werden.

Durch parallele Infektion von Zellkulturen mit ansteigender Infektionsdosis je Virus und

anschließender Passagierung von zellfreiem viralen Überstand in frische Zellkulturen konnte

die Replikationskapazität von Viren bestimmt werden. Mittels Identifikation derjenigen

Zellkulturen mit optimaler viraler Replikationskinetik wurde dabei der Zugewinn an viraler

Aktivität vor und nach Passagierung bestimmt. Der hier vorgestellte Test zur Bestimmung der

Replikationskapazität verzichtet so auf die initiale Virusquantifizierung, wodurch geringere

Testvariabilität und schnelle Durchführbarkeit erzielt werden konnten. Durch Übertragung des

Testsystems auf eine andere Zelllinie war das Verfahren zudem geeignet, die

Replikationskapazität von Volllänge-Viren zu ermitteln. Im Zuge der Dissertation konnte ein

Datensatz aus 279 Sequenz-Replikationskapazitäts-Paaren erstellt werden, welcher als

ZUSAMMENFASSUNG

2

Grundlage für bioinformatische Analysen mit Support Vector Machines und

Entscheidungswäldern diente. Insgesamt wurden so Mutationen in der Protease in der reversen

Transkriptase sowie im gag-Gen identifiziert, die großen Einfluss auf die Replikationskapazität

besitzen. In Analogie zur Sequenz-basierten Vorhersage der phänotypischen Resistenz konnte

anschließend ein Modell zur Vorhersage der Replikationskapazität anhand der identifizierten

Mutationen in der Sequenz generiert werden.

Um Aussagen über die Anwendung der Replikationskapazität als klinisch-prognostischen

Parameter treffen zu können, wurden Plasmaproben von Patienten im longitudinalen Verlauf

untersucht. In einer klinischen Studie wurden Patienten mit hoch resistenten Viren einem

wechselndem Selektionsdruck von Protease-Inhibitoren und reverse Transkriptase-Inhibitoren

ausgesetzt. Im Plasma dieser Patienten waren Viren mit Mutationen nachweisbar, die mittels

konventioneller Sequenzanalyse nicht erfasst worden waren. Ein Einfluss dieser Mutationen

auf die Resistenz oder die Replikationskapazität war nicht nachweisbar, aber die Anzahl der

Mutationen korrelierte direkt mit der Veränderung der Viruslast über die Zeit. Dabei war diese

umso höher, je höher der Anstieg der Viruslast in zwei aufeinander folgenden Proben war. Im

Weiteren zeigte sich, dass der Verlauf der Replikationskapazität nicht mit der Entwicklung der

Viruslast, aber mit immunologischen Parametern korrelierte. Insgesamt scheint die Resistenz

einen höheren prädiktiven Stellenwert in Bezug auf das Therapie-Ansprechen einzunehmen als

die Replikationskapazität, die aber möglicherweise als Surrogatmarker dazu dienen kann, die

pathogenetischen Veränderungen des Virus darzustellen.

Durch die Etablierung eines reproduzierbaren, standardisierten Verfahrens zur Testung des

relativen Replikationsverhaltens für rekombinante HI-Viren und primäre HIV-Isolate

verschiedener Subtypen sowie der Identifikation von maßgeblich Replikationskapazität-

beeinflussenden Mutationen der Vorhersage der Replikationskapazität anhand der Sequenz,

und letztendlich der Analyse der klinischen Bedeutung der Replikationskapazität, leistet diese

Dissertation einen wesentlichen Beitrag zur Aufklärung der Virus-Wirtswechselwirkungen der

Humanen Immundefizienzviren Typ 1. Die hier vorgestellten Ergebnisse könnten als

Grundlage zur Erstellung von Therapie-Leitlinien für Patienten mit hoch resistenten Viren ohne

Therapie-Option dienen, die Viren mit geringer Replikationskapazität zur Folge haben.

ZUSAMMENFASSUNG

3

SUMMARY

Currently 20 drugs are available to treat HIV-1 infected patients. However, the virus is able to

escape successful therapy by developing resistance-associated mutations. But most of the

primary drug resistance mutations are accompanied by substantial losses of viral replicative

capacity. Therefore, an increasing number of tests to determine the viral replicative capacity is

in use. Cell culture based assays and recombinant viruses are most frequently used. Established

methods determine the replicative capacity by coinfection of a reference virus and a patient

derived isolate in the same cell culture. On the other hand, assays that involve comparison of

replication kinetics in separate cell cultures are broadly in use. All these assays are

characterised by high variability and insufficient comparability. Therefore, a new assay should

be developed to deal with the problem of initial viral quantification. The recombinant part of

the viruses should include the genes, known to be associated with drug resistance and

replicative capacity. Furthermore, novel important replication capacity associated mutations

should be identified with the help of bioinformatic methods. Additionally, a prediction model

to determine the replicative capacities of samples from their sequence information should be

developed. Finally, the clinical relevance of the replicative capacity of diagnostic samples

should be evaluated.

By infection of cultures with increasing infectious doses for each virus and by transferring cell

free viral supernatants in new cell cultures, the replication capacity could be determined. This

replicative assay achieved low assay variability and a fast performance by incorporating the

initial viral quantification into the assay procedure. By using a different cell line the assay was

modified to determine the replicative capacity of full-length viruses. In this thesis a dataset

consisting of 279 corresponding sequence and replicative capacity data was generated to

perform bioinformatic analyses using support vector machines and random forests. Altogether,

mutations in the protease, in the reverse transcriptase as well as mutations in the gag-gene were

identified to have major influence on replicative capacity. Likewise to the sequence-based

prediction of drug resistance, a system was generated to predict replication capacity from

sequence information.

To determine the predictive clinical value of RC, plasma samples of patients have been

evaluated longitudinally. In a clinical study, patients with highly drug resistant viruses were

ZUSAMMENFASSUNG

4

treated with a continuously alternating therapy of either protease or reverse transcriptase

inhibitors, causing different kinds of selection pressure. In the plasma of these patients, viruses

could be detected harbouring mutations that were not detected by conventional sequencing.

The number of these mutations correlated significantly with the changes in viral load over time.

The higher the increase in viral load of two follow-up samples was the more prevalent were

these mutations. However, no influence of the mutations on drug resistance or replicative

capacity could be detected. Detailed analyses of clinical data showed that the replicative

capacity did not correlate with the viral load, but with immunological parameters. Altogether,

drug resistance was more relevant to predict therapy success, however replicative capacity may

be used as a surrogate marker to indicate changes in pathogenity of viral strains.

By the development of a reproducible, standardised assay for the determination of replicative

capacity of HIV-1 recombinant and primary isolates of different subtypes as well as by the

identification of major replicative capacity-associated mutations and finally by the prediction

of replicative capacity, this thesis provides a substantial contribution to resolve the virus host

interactions of human immunodeficiency viruses type 1. The presented results of RC as an

indicator of viral pathogenity provide the basis for the development of therapeutic strategies for

patients harbouring highly drug resistant viral strains in order to drive the evolution of viral

quasispecies towards reduced replicative capacity.

EINLEITUNG 5

2 EINLEITUNG

Im Jahr 2006 lebten nach Schätzungen der UNAIDS / WHO weltweit 39,5 Millionen HIV-

infizierte Menschen, wobei sich die Zahl der Neuinfektionen im Jahr 2006 sich dabei auf ca.

4,3 Millionen belief (http://www.unaids.org/). Der Erreger der Immundefizienz konnte erstmals

1983 sowohl von Luc Montagnier als auch von Robert Gallo aus dem Blut Betroffener isoliert

und als neues Virus identifiziert werden (Barre-Sinoussi, 1996; Gallo et al., 1983). Das Virus

wurde in die Familie der Retroviridae, Genus Lentiviren (gr.: lenti: langsam) eingeordnet und

wird seit 1986 als Humanes Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) bezeichnet (Coffin, 1986).

Drei Jahre später wurde das eng verwandte humanpathogene Lentivirus HIV-2 isoliert (Clavel

et al., 1986). HIV-1 wird auf Grund von Sequenzhomologie in folgende drei Gruppen

unterteilt: M (engl.: main), N (engl.: new) und O (engl.: outliner) (Charneau et al., 1994; De

Leys et al., 1990). Die Gruppe M untergliedert man des Weiteren in die Subtypen: A - D, F –

H, J - K, sowie verschiedene rekombinante Formen wie z.B. CRF01_AE (engl.: circulating

recombinant form) (Leitner T, 2005). Einzelne Subtypen lassen sich größtenteils bestimmten

geographischen Regionen zuordnen.

Angriffspunkte antiretroviraler Therapie im viralen Replikationszyklus

Die Angriffspunkte antiretroviraler Therapie sind in Abb. 1 dargestellt. Bereits 1985 wurde das

Thymidinanalogon AZT (3’-Azido-3’-Deoxythymidin) erstmals zur Behandlung eingesetzt

(Mitsuya et al., 1985). Das Medikament wird der Gruppe der nukleosidischen reverse

Transkriptase-Inhibitoren (NRTI) zugeordnet und inhibiert durch Kettenabbruch das

Umschreiben des viralen RNS-Genoms in zunächst einzelsträngige DNS (Baltimore, 1992).

Seit 1995 stehen zwei weitere Stoffgruppen zur Verfügung: die nicht-nukleosidischen RT-

Inhibitoren (NNRTI) und die Protease-Inhibitoren (PI) (De Clercq und Balzarini, 1995;

Kageyama et al., 1994). NNRTI hemmen die reverse Transkriptase (RT) allosterisch. PI

verhindern die Reifung der viralen Partikel durch Verminderung der Spaltung der Gag / Pol-

Vorläufer-Proteine. Als neueste Stoffgruppe wurden in Deutschland im Jahr 2003 die Fusions-

Inhibitoren (FI) zugelassen. Sie wirken nach der Bindung des viralen Glykoproteins (gp)-120

an den zellulären CD4-Rezeptor und verhindern die Fusion von Virusmembran mit der

Zellmembran (Lawless et al., 1996; Wild et al., 1994). Zudem befinden sich zwei weitere

Stoffgruppen in klinischen Phase-II und -III-Studien: Die Korezeptor-Antagonisten, welche die

EINLEITUNG

6

Bindung von HIV an einen der beiden Korezeptoren CCR5 oder CXCR4 verhindern (Alkhatib

et al., 1996; Berson et al., 1996; Feng et al., 1996). CXCR4-Inhibitoren haben sich jedoch in

frühen klinischen Testungen als toxisch erwiesen. Eine weitere Stoffgruppe umfasst die

Integrase-Inhibitoren. Unter den Integrase-Inhibitoren scheinen die beiden Strangtransfer-

Inhibitoren MK-0518 und GS-9137 sehr vielversprechend zu sein. Die Hemmung des Einbaus

der viralen DNS des Präintegrationskomplexes in das Wirtsgenom führte in klinischen Studien

zu starken Viruslastsenkungen (Dayam et al., 2007; O'Neal, 2006).

Abb. 1: Schematische Darstellung der Angriffspunkte antiretroviraler Therapie im viralen Replikationszyklus nach Oette et al., 2003. Als Bestandteile antiretroviraler Therapie befinden sich nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren, Protease-Inhibitoren und Fusions-Inhibitoren im klinischen Einsatz. Korezeptor-Antagonisten und Integrase-Inhibitoren werden derzeit in klinischen Studien geprüft.

Einfluss verschiedener Faktoren auf den Krankheitsverlauf

Virale und patienteneigene Faktoren nehmen erheblichen Einfluss auf den Krankheitsverlauf.

Bereits die Art der Transmission und damit auch die Höhe der individuellen Infektionsdosis

besitzen Einfluss auf den Krankheitsverlauf (Little et al., 2007). Nach erfolgter Infektion kann

durch den Einsatz der hoch aktiven antiretroviralen Therapie (HAART), bei der eine

Kombination von mindestens drei Medikamenten aus mindestens zwei verschiedenen

Medikamentenklassen eingesetzt wird, die Viruslast (VL), d.h. die Menge der HIV-1-RNS / ml

Wirtszelle

reverse TranskriptionzelluläreDNA

CD4-Rezeptor

nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren

Integration

KnospungTranskription

viraleProteine

Spleißung

mRNS

genomischevirale RNS

Translation

Zusammen-bau

Reifung

zelluläres Protein

Fusions-Inhibitoren

Integrase-Inhibitoren

Protease-Inhibitoren

Korezeptor-Antagonisten

Zellkern

CXCR4/CCR5-Korezeptor

Wirtszelle

reverse TranskriptionzelluläreDNA

CD4-Rezeptor

nukleosidische und nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren

Integration

KnospungTranskription

viraleProteine

Spleißung

mRNS

genomischevirale RNS

Translation

Zusammen-bau

Reifung

zelluläres Protein

Fusions-Inhibitoren

Integrase-Inhibitoren


Korezeptor-Antagonisten

Zellkern

CXCR4/CCR5-Korezeptor

EINLEITUNG

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Plasma, anhaltend auf labortechnisch nicht nachweisbare Mengen (< 50 Kopien / ml) gesenkt

und dadurch die durch HIV ausgelöste Morbidität und Mortalität stark vermindert werden

(Palella, Jr. et al., 1998; Van Vaerenbergh, 2001). Unter subinhibitorischer Therapie entstehen

jedoch innerhalb kurzer Zeit medikamentenresistente Virusvarianten, die zu einem

Wiederanstieg der VL mit Krankheitsprogression führen (Masuhr et al., 2002; Quinones-Mateu

et al., 2000). Diese resistenten Varianten entstehen aus einer Population genetisch eng

verwandter viraler Varianten, der so genannten Quasispezies (Coffin, 1995; Goodenow et al.,

1989; Najera et al., 1995). Die Quasispezies entsteht durch die hohe Mutationsrate des Virus,

welche durch die hohen Fehlerraten der viralen RT und der zellulären DNS-abhängigen RNS-

Polymerase, der hohen viralen Replikationsrate und der kurzen Generationszeit bedingt wird

(Laakso und Sutton, 2006; Perelson et al., 1996). Auch die Wirts-Cytidin-Deaminase

APOBEC3G (engl.: apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G), ein

zellulärer antiretroviraler Abwehrmechanismus, der während der reversen Transkription im neu

gebildeten DNS-Strang G zu A-Austausche verursacht, trägt zur viralen Sequenzdiversität bei

(Barbour und Grant, 2005; Harris et al., 2003; Zhang et al., 2003).

Hinsichtlich der Resistenzentstehung unterscheidet man primäre Mutationen und sekundäre

Mutationen (Devereux et al., 1999). Primäre Mutationen vermitteln Resistenz und erlauben

dem Virus, trotz Therapie auf niedrigem Niveau zu replizieren (Mammano et al., 1998).

Sekundäre Mutationen können auch zur Resistenz beitragen, kompensieren aber vor allem die

mit der primären Resistenz einhergehenden Fitnessverluste, wodurch die Viruslast wieder

ansteigt. Daher werden sie oft auch als kompensatorische Mutationen bezeichnet. Ihr

Auftauchen geht deshalb normaler Weise mit einer hohen VL einher (Zhang et al., 1997).

Andererseits ist auch dikutiert worden, dass primäre Mutationen zwar Resistenz vermitteln,

aber ohne Kompensation keine hohe VL verursachen, da sie die virale Fitness zu stark

beeinträchtigen (Nijhuis et al., 1999). Insgesamt definieren verschiedene Autoren den Begriff

der viralen Fitness sehr unterschiedlich. So wird darunter die virale Pathogenität, die

Infektiosität oder ganz allgemein die Anpassung von HIV an seine Umgebung verstanden

(Barbour und Grant, 2004; Ometto et al., 2002; Quinones-Mateu und Arts, 2002; Shadan und

Villarreal, 1995). In Zusammenhang mit Resistenz wird aber zumeist von der viralen

Replikationskapazität (engl.: replication capacity) in einem medikamentenfreien in-vitro-

System gesprochen (Baliga und Sutton, 2004; Deeks, 2001). Das Phänomen des Fitnessverlusts

durch Resistenzentwicklung ist bereits vielfach beschrieben worden und primäre und sekundäre

EINLEITUNG

8

Mutationen sind im Hinblick auf ihren Einfluss auf Fitness untersucht worden (Martinez-

Picado et al., 2000; Nijhuis et al., 2001).

Goudsmit und Kollegen beschrieben bereits 1997, dass der Austausch der Aminosäure T zu Y

an Position 215 und M zu L an Position 41 der RT (RT:T215Y, RT:M41L) zu einer reduzierten

Fitness führte (Goudsmit et al., 1997). Resistenz-Mutationen in der RT können einerseits mit

einer verringerten reversen Transkription einhergehen, aber auch mit anderen Veränderungen

der enzymatischen Aktivität. So führt die Mutation RT:M184V, die Resistenz gegen

Lamivudine (3TC) vermittelt, nicht nur zu einer verminderten Bindungsaffinität und einer

geringeren Einbaurate von NRTI, sondern auch zu einer höheren Lesegenauigkeit der RT

(Hamburgh et al., 1998; Wainberg et al., 1996). Für den Mutationskomplex Q151M konnte

erstmals gezeigt werden, dass eine Anhäufung multipler NRTI-Medikamentenresistenz nicht

immer zu einer verminderten Replikationskapazität (RC) führt, sondern dass resistente

Varianten sogar schneller als der Wildtyp replizieren können (Kosalaraksa et al., 1999).

Auch für die PI-Resistenz wurde bereits 1996 beschrieben, dass stark resistente Viren kaum

noch replikationsfähig waren. Als Grund wurde eine verminderte Prozessierung des

Vorläuferproteins beschrieben, welche mit einer Reifungsstörungen des Virus sowie geringerer

Infektiosität der Partikel assoziiert werden konnte (Robinson et al., 2000; Shehu-Xhilaga et al.,

2001; Zennou et al., 1998). Veränderung der Fitness und Resistenz trat insbesondere bei

Mutationen auf, die im oder nahe des aktiven Zentrums der Protease (PR) lokalisiert waren

(Croteau et al., 1997). Diese Effekte auf die RC können Viren durch Veränderungen des Gag-

Pol-Vorläuferproteins, dem natürlichen Substrat der viralen PR teilweise kompensieren. Dabei

treten zusätzliche Mutationen in den Spaltstellen zumeist zwischen den gag-C-terminalen

Schnittstellen p1 / p6 und p7 / p1 auf (Doyon et al., 1996).

Bislang wird vor allem die Resistenz als Schlüsselfaktor für ein Therapie-Versagen angesehen

(Van Vaerenbergh, 2001). Dennoch ist die Resistenz nicht der einzige Faktor, der das

Therapie-Ansprechen beeinflusst. Weitere Faktoren sind die Erfahrung des behandelnden

Arztes, die Höhe der Medikamentenkonzentration in Plasma und Zellen, die wiederum

beeinflusst wird durch die Therapie-Treue (Adhärenz) des Patienten und die Pharmakokinetik

(Cingolani et al., 2002; Durant et al., 2000; Hirsch et al., 1998).

EINLEITUNG

9

Darüber hinaus nehmen genetische und immunologische Faktoren Einfluss auf den

Krankheitsverlauf. Beispielsweise kann eine Deletion von 32 Basenpaaren im CCR5-Gen, die

in 1 % der kaukasischen Bevölkerung homozygot und in 15 - 30 % heterozygot vorliegt, zu

einem verzögerten Krankheitsverlauf führen. Auch eine veränderte Chemokin-Expression der

natürlichen CCR5-Liganden (z.B. RANTES, MIP1a, MIP1ß) kann Einfluss nehmen (Berger et

al., 1999). Eine Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass eine geringe RC stark mit hoher Sensitivität

gegenüber der Inhibition durch das Chemokin RANTES korrelieren kann (Trkola et al., 2003).

Zudem wurde eine Korrelation zwischen verschiedenen HLA-assoziierten

(engl.: histocompatibility leucocyte antigen) CTL-Antworten (engl.: cytotoxic T-lymphocyte)

und dem Krankheitsverlauf gezeigt. Moore und Kollegen waren die ersten, die einen

Zusammenhang von Mutationen unter Selektionsdruck von HLA zeigen konnten (Moore et al.,

2002). In Patienten mit HLA-B*5101-Allel, auf dem ein Epitop über die Aminosäuren 128 -

135 der RT präsentiert wird, mutierte die Aminosäure Isoleucin des WT an Position 135

gehäuft. Zudem wurde eine Mutation an AS 135 mit geringer RC assoziiert (Barbour und

Grant, 2004). Auch treten die HLA-Gene B25, B35, DR1, DR3, DQ1 vermehrt bei

beschleunigter Krankheits-Progression, die HLA-Klasse-I-Gene A1, A2, B14, B17, B27 und

HLA-Klasse-II-Gene DR5, DR6 dagegen gehäuft bei stark verminderter Krankheits-

Progression auf (Karlsson et al., 2007; Müller et al., 2007; Walker und Korber, 2001).

In einer Studie konnte in Folge einer Umstellung des Therapie-Regimes ein geringfügiger

Abfall der CD4-Zellen beobachtet werden, wobei die CD4- und CD8-spezifische

Immunantwort jedoch stark erhöht war (Legrand et al., 2005). Die Rolle der Aktivierung des

Immunsystems auf den Krankheitsverlauf wird unvermindert kontrovers diskutiert. Eine

immunologische Verbesserung des Patienten ist natürlich wünschenswert, jedoch besteht bei

erhöhter CD4-Zellzahl auch vermehrt die Möglichkeit der Adaption von Seiten des Virus

(Deeks und Walker, 2004). Deeks und Kollegen zeigten bereits in 2002, dass eine geringe RC

einerseits mit geringerer CD4-T-Zell-Aktivierung assoziiert sein kann, andererseits aber eine

Folge von starken Immunantworten sein kann, die das Virus zwingen, sich zu adaptieren,

(Deeks et al., 2002b).

Auch ist bekannt, dass der Zelltropismus des Virus eine entscheidende Rolle spielt. CXCR4-

trope HIV-Isolate treten häufiger in späten Phasen des Krankheitsverlaufes auf, wohingegen

R5-Isolate in der asymptomatischen Phase überwiegen (Tersmette et al., 1988). Als weitere

Ursache verminderter Pathogenese wurde in Einzelfällen eine nef-Deletion beobachtet, die zu

EINLEITUNG

10

verstärkter CTL-Antwort führte (Pantaleo et al., 1995). Alle genannten Faktoren beeinflussen

gemeinsam und möglicherweise in Abhängigkeit voneinander den Krankheitsverlauf HIV-

infizierter Patienten.

Abb. 2: Modell über den Zusammenhang von VL, CD4, CD8, RC und RF im Therapie-Verlauf, verändert nach Coffin, 1996. A) primäre Infektion. B) Ersttherapie. C) Entstehung von Resistenz unter antiretroviraler Therapie. D) verschiedene Szenarien zum langfristigen Therapie-Versagen unter Zugewinn von Resistenz-assoziierten Mutationen mit oder ohne Kompensation der RC. Hier wird deutlich, dass die Zusammenhänge der verschiedenen Parameter in A, B und C einfacher zu prädizieren sind, als in D. RC: Replikationskapazität; RF: Resistenzfaktor; VL: Viruslast; ART: antiretrovirale Therapie; CD4: CD4-Zellzahl; CD8: CD8-Zellzahl. RC-verändernde Mutationen mit Therapieansprechen oder -Versagen koppeln könnten.

Abb. 2 soll die aktuelle Vorstellung der Zusammenhänge der klinisch eingesetzten

Surrogatmarker von VL und CD4-Zellzahl insbesondere im Kontext der RC während des

Infektionsverlaufes illustrieren.

(A) Bei der primären Infektion mit nicht-resistentem Virus geht eine Aktivierung des

Immunsystems (vermehrte CD8-Aktivität) mit einer CD4-Depletion und einem Anstieg von

RC und VL einher (Koup et al., 1994). Mellors und Kollegen zeigten in therapienaiven

Patienten bereits 1997, dass höhere Plasma-RNS-Level (VL) mit schnellerem CD4-Abfall

assoziiert sind und dass sowohl die VL als auch die CD4-Zellzahl prädiktiv für den weiteren

Krankeitsverlauf sind, wobei eine Kombination aus beiden Parametern aussagekräftiger war als

jeder Parameter für sich (Mellors et al., 1997).

VLRF

RC

CD8

CD4

VL

Zeit

RC

CD8

CD4

VL

RF

RC

CD8

CD4

VL

RF

RC

CD8

CD4

RF

DA CB

VLRF

RC

CD8

CD4

VL

Zeit

RC

CD8

CD4

VL

RF

RC

CD8

CD4

VL

RF

RC

CD8

CD4

RF

DA CB

EINLEITUNG

11

(B) Unter antiretroviraler Therapie kann die VL zunächst erfolgreich gesenkt werden,

einhergehend mit einer immunologischen Verbesserung durch einen Anstieg der

CD4-Zellzahlen und einer reduzierten Immunaktivierung (Hammer et al., 1997).

(C) Unter subinhibitorischer Therapie entstehen im Verlauf primäre Resistenzen, welche es

dem Virus erlauben, trotz Therapie zu replizieren, was seinerseits eine oft nur geringe

Depletion der CD4-Zellzahl und eine Aktivierung des Immunsystems mit sich bringt. Ohne

Kompensation ist die RC jedoch stark vermindert. Erfolgt kein Therapie-Wechsel sind

verschiedene Szenarien denkbar.

(D) Grundsätzlich scheinen jedoch die VL und die CD4-Zellzahl als Verlaufsparameter

geeignet zu sein, um die Zusammenhänge im weiteren Krankheitsverlauf zu beschreiben.

Zahlreiche Publikationen belegen den Zusammenhang zwischen VL, CD4-Zellzahl und

Therapie. Eine der ersten Korrelationen, die in diesem Zusammenhang publiziert wurden, ist

die inverse Korrelation von VL und CD4-Zellzahl (Daar et al., 2005; Hughes et al., 1997).

Bald nach der ersten Beschreibung der Zusammenhänge zwischen Resistenz und RC wurde

versucht, den Einfluss der RC des HI-Virus zusätzlich als maßgeblichen Parame ter im

Krankheitsverlauf in Modelle zu integrieren. Dies erwies sich jedoch als ungewöhnlich

schwierig. Eine Studie an 15 Patienten zeigte eine lineare Korrelation zwischen RC und VL

(Campbell et al., 2003). Dagegen konnte in einer anderen Studie keine Korrelation zwischen

den Veränderungen der VL und der RC gefunden werden. Obwohl die PI-Resistenz zunahm,

veränderte sich die RC nicht (Barbour et al., 2002). Übereinstimmend dazu konnte vielfach

belegt werden, dass primäre Mutationen mit verminderter RC einhergehen, die durch

Akkumulation sekundärer PR-Mutationen partiell kompensiert werden kann (Barbour und

Grant, 2004; Mammano et al., 1998; Nijhuis et al., 1999; Sarmati et al., 2004). In 2002

publizierten Deeks und Kollegen, dass Veränderungen der VL zu einem beliebigen Zeitpunkt

nach einer Therapie-Umstellung besser zum Verlauf der CD4-Zellzahl korrelieren, als die

absolute VL (Deeks et al., 2002a). Von einer anderen Arbeitsgruppe konnten signifikante

Zusammenhänge zwischen hohen CD4-Zellzahlen und geringer RC nachgewiesen werden,

bzw. dass geringe RC-Werte mit einer relativen Erhöhung der CD4-Zellzahlen einhergehen

(Barbour et al., 2004). Die Verläufe der Infektion während lang anhaltendem Therapie-

Versagens sind sehr unterschiedlich. Trotz hoher Resistenz liegt eine anhaltende antiretrovirale

Aktivität vor, die auf partiell resistente Quasispezies Einfluss nimmt und die VL senken kann.

Bislang konnte die RC in der Praxis nicht als prognostischer Marker einbezogen werden, da

EINLEITUNG

12

keine ausreichenden Studien vorliegen, die RC-verändernde Mutationen mit

Therapieansprechen oder -Versagen koppeln könnten.

Verfahren zur Bestimmung der Replikationskapazität

Normalerweise werden zur Bestimmung der Replikationskapazität in-vitro-Systeme und

rekombinante Viren verwendet. Sie erleichtern die Standardisierung, da sie auf

immortalisierten Zelllinien getestet werden können. Allerdings werden unter Verwendung

rekombinanter Viren möglicherweise entscheidende virale Gene nicht berücksichtigt (Simon et

al., 2003).

Basierend auf rekombinanten Viren werden derzeit drei Systeme am häufigsten zur

Bestimmung der RC verwendet (Bogner E. und Holzenburg A., 2006). Als „Goldstandard“

gelten die so genannten Koinfektions-Versuche (Kompetitions-Versuche) (Kosalaraksa et al.,

1999; Nijhuis et al., 1999). Sie basieren auf der Infektion zumeist primärer Zellen in fest

definierten Mischungen aus einem nicht resistenten Referenzvirus und einem Patienten-

abgeleiteten Virus. Anschließend wird die Verdrängung der einen Virusvariante durch das

replikationskompetentere Virus im zeitlichen Verlauf bestimmt (Quinones-Mateu et al., 2000;

Weber et al., 2003). Diese Verfahren können aber nur mit genetisch markierten Viren

durchgeführt werden, um eine Differenzierung der Replikation der koinfizierten Viren zu

ermöglichen. Daher ist die Bestimmung von primären Isolaten mit diesen Verfahren derzeit

nicht möglich. Als zweite Methode, RC zu messen, finden virale Replikationskinetiken

Verwendung (Connor und Ho, 1994; Maeda et al., 1998; Quinones-Mateu und Arts, 2002). Sie

zeichnen sich durch eine relativ einfache Versuchsdurchführung aus und besitzen die

Möglichkeit, auch Primärisolate testen zu können. Ihr wesentlicher Nachteil ist die geringe

Reproduzierbarkeit. Die dritte Methode ist eine Modifikation der zweiten und wurde

entwickelt, um möglichst effizient RC-Bestimmungen durchführen zu können. Es handelt sich

um Versuchsansätze die nur eine Replikationsrunde messen (engl.: one replication assays). Die

virale Replikation wird dabei über die Expression von Indikatorgenen gemessen, die z.B.

anstelle des nef-Gens ins virale Genom integriert wurden. Durch die Verwendung

pseudotypisierter Viren ist es möglich, gezielt nur eine virale Replikationsrunde zu messen,

was eine schnelle Versuchsdurchführung gewährleistet (Deeks et al., 2001; Mammano et al.,

1998; Petropoulos et al., 2000; Zennou et al., 1998). Ein wesentlicher Nachteil dieses

Verfahrens besteht darin, dass nicht der gesamte Replikationszyklus des Virus integriert ist.

EINLEITUNG

13

Dennoch ist dies bislang das einzige kommerziell erhältliche Testverfahren (PhenoSense

Assay, Virologic, San Francisco, USA).

Angesichts der weltweit zunehmenden Bedeutung von non-B-Subytpen, sowie dem zu

erwartenden Einsatz von Inhibitoren außerhalb der bisherigen Zielgene erscheint der Einsatz

von Methoden, die primäre Isolate testen können, unerlässlich (Bannister et al., 2006;

Buonaguro et al., 2004). Dennoch wirft die Verwendung von Primärisolaten zwei wesentliche

Probleme auf. Zur Gewinnung von Primärisolaten müssen diese normalerweise auf primären

Zellen (engl.: peripheral blood mononuclear cells: PBMC) passagiert werden. Bei der meist

langwierigen Passagierung ohne Medikamentendruck besteht die Möglichkeit, dass weniger

resistente HI-Viren wegen ihrer höheren RC präferenziell angezüchtet werden.

Trotz vereinzelter Ansätze konnte bislang kein geeignetes System für die Bestimmung der RC

in-vivo gefunden werden (Bonhoeffer et al., 2002; Goudsmit et al., 1996; Goudsmit et al.,

1997). Auch geeignete Tiermodelle würden Studien erheblich erleichtern, da sie Transmission,

Pathogenese, Immunantwort und antiretrovirale Strategien erfassen (Goffinet et al., 2007;

Keppler et al., 2001; Namikawa et al., 1988). Derartige Bestimmungsverfahren hätten zudem

den Vorteil, Volllänge-Viren in Gegenwart des Immunsystems testen zu könnten, was derzeit

als die beste RC-Testmöglichkeit diskutiert wird (Nicastri et al., 2004). So konnte in einem

Mausmodell festgestellt werden, dass die Mutationen PR:V82A und RT:M184V herabgesetzte

RC im Vergleich zum Wildtyp-HIV besitzen (Picchio et al., 2000). Durch hohe Virus-

Wirtsspezifität und hohen Zeit- und Kostenaufwand sind Tiermodelle aber bisher nur

eingeschränkt einsetzbar.

Ein großes Problem besteht bislang in der unzureichenden Vergleichbarkeit der RC-

Ergebnisse. So wurden nicht nur durch verschiedene Methoden unterschiedliche Ergebnisse

erzeugt, sondern auch bei sonst gleicher Methode durch Verwendung unterschiedlicher

Wildtyp-Stämme als Referenzviren (z.B. HXB2 oder NL4-3), verschieden großer

rekombinanter Anteile sowie verschiedener Zelltypen (PBMCs oder Zelllinien) und

Indikatorsysteme. Zudem erfolgt die Bestimmung der initialen Infektionsdosis nicht über eine

einheitliche Methode. Am geläufigsten sind die Bestimmung von p24-Antigen-Gehalt (p24-ag)

oder von infektiösen Einheiten (engl.: tissue culture infectious dose 50 %: TCID50) (Marozsan

et al., 2004). Sicher ist, dass mit jedem dieser Verfahren unterschiedliche virale Eigenschaften

mitbestimmt werden, die direkten von der viralen RC beeinflusst werden können. So ist

gezeigt, dass durch Punktmutationen Infektiosität, RT-Aktivität, PR-Aktivität, Virusreifung

EINLEITUNG

14

und daraus resultierende virale Replikation und Pathogenität verändert sein können (Bleiber et

al., 2001; Kaufmann et al., 2000; Martinez-Picado et al., 1999; Shehu-Xhilaga et al., 2001). Da

nicht bekannt ist, welche der Faktoren die veränderte Pathogenität verursachen, kann je nach

verwendeter Methode der Wert, der eigentlich bestimmt werden soll, unwissentlich in das

virale Quantifikationsverfahren mit eingehen und daher anschließend nicht mehr korrekt

bestimmt werden (Tschochner et al., 2007).

Am deutlichsten werden die Unterschiede der eingesetzten Verfahren, wenn man Publikationen

über den Einfluss einzelner Resistenzmutationen auf die RC vergleicht (Quinones-Mateu und

Arts, 2002). So wird beispielsweise das Replikationsverhalten von Viren, welche die RT-

Mutation Q151M tragen, einerseits als vermindert, verstärkt oder vergleichbar zum Wildtyp

beschrieben (Garcia-Lerma et al., 2000; Kosalaraksa et al., 1999; Maeda et al., 1998). In

einigen Studien wurde bereits auf dieses Problem hingewiesen und versucht, durch die

parallele Verwendung verschiedener Methoden zur Bestimmung der RC eine Vergleichbarkeit

zu erreichen (Martinez-Picado et al., 1999). Dennoch ist durch die Vielzahl an Publikationen

ohne hinlängliche Vergleichbarkeit eine Datenbank für RC-assoziierte Mutationen essenziell.

Erste Bestrebungen wurden dazu von der Firma Virologic durchgeführt, deren Arbeiten aber

überwiegend nicht publiziert und deren Daten nur in sehr begrenzten Mengen zugänglich sind.

ZIEL DER ARBEIT

15

3 ZIEL DER ARBEIT

Unter subinhibitorischer Therapie können Resistenzen in viralen Genen entstehen, die es dem

HI-Virus ermöglichen, in Gegenwart von Medikamenten zu replizieren. Dennoch schränkt das

Auftreten von Resistenz zumeist die Fähigkeit der viralen Replikation ein. Daher liegt die

Vermutung nahe, dass die virale Replikationskapazität, insbesondere beim Vorliegen

multiresistenter Stämme, für die klinische Relevanz eine entscheidende Rolle spielen kann.

In der hier vorgestellten Arbeit sollte eine Methode zur Bestimmung der Replikationskapazität

mittels viraler Replikationskinetiken entwickelt und die klinische Relevanz der

Replikationskapazität untersucht werden. Es sollte eine Möglichkeit gefunden werden, die

bereits durch die initiale Virusquantifizierung verursachte hohe Variabilität zu senken und

damit die Variabilität im Bestimmungsverfahren der Replikationskapazität zu minimieren.

Zudem sollte das Verfahren geeignet sein, Volllänge-Viren testen zu können. Des Weiteren

sollte anhand von Datenpaaren aus Replikationskapazität und viraler Sequenz mit Hilfe von

bioinformatischen Methoden ein Modell für die Vorhersage der Replikationskapazität von der

viralen Sequenz entwickelt werden, wie es von der Arbeitsgruppe bereits zuvor für die

Resistenz etabliert wurde. Dies sollte einerseits die Möglichkeit bieten, Mutationen zu

identifizieren, die einen maßgeblichen Einfluss auf die Replikationskapazität besitzen und

andererseits die Bestimmung der Replikationskapazität einfach und kostengünstig in den

klinischen Alltag zu integrieren. Mit Hilfe dieser Methoden sollte dann die bislang nur

unzureichend untersuchte klinische Relevanz der Replikationskapazität anhand diagnostischer

Proben im Zusammenhang von genotypischer und phänotypischer Resistenz, VL, CD4- und

CD8-Zellzahlverlauf und dem verwendeten Therapie-Regime untersucht werden.

MATERIAL UND METHODEN 16

4 MATERIAL UND METHODEN

4.1 Material

4.1.1 Eukaryotische Zelllinien

293T-Zellen:

Humane, embryonale, epitheliale Nierenzelllinie, die mit Adenovirus Typ 5 transformiert

wurde und zusätzlich ein temperatursensitives Gen, das große T-Antigen des SV40-Virus

(engl.: simian virus 40) exprimiert (Graham et al., 1977)

CEMx-174-Zellen:

Zellhybrid, welches aus einer humanen T-Zelllinie und einer B-Zelllinie hergestellt wurde.

Folgende Antigene werden exprimiert: HLA A2, Aw30, B5, Bw4, Bw6, DR7, CD7+, CXCR4

(Salter et al., 1985)

CEMx-174-SEAP-Zellen:

Humane Zelllinie, die das Gen der sezernierten alkalischen Phosphatase (SEAP) unter der

Kontrolle des SIV-LTR exprimiert. Wird diese Zelle mit SIV oder HIV infiziert, findet tat-

induziert die Expression des SEAP-Gens statt. Die hitzestabile alkalische Phosphatase wird in

den Überstand sezerniert und kann dort nachgewiesen werden (Means et al., 1997)

PM1-Zellen:

Klon von Hut78-Zellen (humane kutane T-Zelllinie (Lymphom)). Folgende Antigene werden

exprimiert: CD4, CXCR4, CCR5, CD31, CD41, CD82, CD261, HLA-DR1, IL-2 (Gootenberg

et al., 1981; Lusso et al., 1995)

MATERIAL UND METHODEN

17

4.1.2 Bakterienstämme

E. coli XL2-Blue Ultracompetent cells (lat.: Escherichia coli):

Die Bakterien sind durch folgendes genotypisches Profil charakterisiert: rec A1, end A1,

gyr A96, thi-1, hsdR17, sup E44, rel A1, lac [F‘proAB lacIq Z∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr] a,

Stratagene (Heidelberg), (Greener et al., 1996)

4.1.3 Medien und Puffer

Zellkulturmedien

DMEM (engl.: Dulbecco’s Modified Eagle Medium) ohne Zusätze:

ohne Natriumpyruvat, mit 4,5 g/l Glukose, mit Pyridoxin HCl

Fertigmedium der Firma Gibco BRL (Eggenstein)

DMEM (engl.: Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit Zusätzen:

Zugabe von 10 % FKS, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin / Streptomycin zu DMEM.

RPMI-1640-Medium:

Fertigmedium der Firma Gibco BRL (Eggenstein)

Zugabe von 10 % FKS, 1 % Glutamin, 1 % Penicillin / Streptomycin

Bakterienkulturmedien

Luria-Bertani-Medium (LB-Medium):

10 g/l Bacto-Trypton; 5 g/l Bactohefeextrakt; 8 g/l NaCl; 1 g/l Glukose, mit Wasser auf 1 l

auffüllen; pH 7,2 mit Natriumhydroxid eingestellt; Zugabe von 100 mg/l Ampicillin vor

Gebrauch (Gibco BRL, Eggenstein)

Luria-Bertani-Agarplatten (LB-Platten):

15 g Agar in 1 l LB-Medium gelöst und autoklaviert; Zugabe von 100 mg/l Ampicillin nach

Abkühlung auf 55 °C (Gibco BRL, Eggenstein)


18

SOC-Medium:

20 g/l Bacto-Trypton; 5 g/l Bacto-Hefeextrakt; 0,5 g NaCl in 950 ml Milliporewasser lösen;

10 ml 250 mM KCl-Lösung zugeben; pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,0 einstellen, mit Wasser

auf 1 l auffüllen und autoklavieren. Zugabe von 10 mM MgCl2 und 20 mM Glukose nach

Abkühlung auf Raumtemperatur

Lösungen und Puffer

1 x T4 DNS Ligase Puffer, New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein):

50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, pH 7,5 bei 25 °C, 25 µg/ml BSA

PBS o.-Puffer: (engl.: phosphat buffered saline ohne CaCl2 und MgCl2):

138 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,5 mM Na2 HPO4; 1,5 mM KH2PO4; in Milliporewasser lösen.

pH-Wert mit 1 N HCl auf 7,3 einstellen und steril filtrieren

TAE-Puffer (Tris Acetat-EDTA):

2,0 M Tris; 1,0 M NaAc; 50 mM EDTA II; pH-Wert mit Essigsäure auf 7,4 einstellen

1 x PCR Puffer II Applied Biosystems (Foster City, California, USA):

100 mM Tris-HCL (pH 8,3), 500 mM KCl

Puffer Rox-K:

6-Carboxyl-X-Rhodamin (Molecular Probes), gelöst in 10 x PCR Puffer II

4.1.4 Nukleinsäuren

Alle synthetisch hergestellten Oligonukleotide wurden von ARK Scientific GmbH Biosystems

(Darmstadt) oder Eurogentec (Seraing) bezogen.


19

Oligonukleotide

Tab. 1: Oligonukleotide für die Konstruktion von rekombinanten Viren

Name Sequenz

H3532a* 5’- TTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGGTCA -3’

H1980s 5’- TTGTGGCAAAGAAGGGCACAT -3’

H3454a 5’- AGTGCTAGCTCTGCTTCTTYTGTTAGTGGTA -3’

Eci-TA-H2135s 5’- TAACGGCGGAATTCGGCTTTCAGAGCAG -3’

Eci-TA-H2649a 5’- TAACGGCGGAATTCGGCTTAATGCTTTTATT -3’

Eci-H2146a 5’- ATTAGCGACGTCGGCGGAGTCTGCTCTGAAGAAAATTCC -3’

H2001s 5’- TGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTT 3’

Eci-H2639s 5’- ATTAGCGACGTCGGCGGAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTG -3’

H2852a 5’- TGTTTTAACCCTGCAGGATGTGG -3’

Eci-No-TA-H2649a 5’- TAACGGCGGAAATTTCTACAATGCTTTTATTTTTTCTTCTG -3’

Eci-No-TA-H2135s 5’- TAACGGCGGAGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCC -3’

T7 5’- GTAATACGACTCACTATAGGGC -3’

M13 5’- CAGGAAACAGCTATGACCATG -3’

Die Zahlenbeschriftung der Oligonukleotide bezieht sich auf die Position innerhalb der pNL4-3-Sequenz (GenBank accession number: U26942); Restriktionsendonukleasen-Erkennungssequenzen sind fett markiert; * Dieses Oligonukleotid wurde auch für die Generierung von cDNS verwendet; (s): Sinnstrang (engl.: sense); (a): Gegenstrang (engl.: antisense).

Tab. 2: Zur Sequenzierung verwendete Oligonukleotide

Name Sequenz

H2720a: 5’- TATTGTATGGATTTTCAGGCC -3’

H15564s: 5’- TCAGGTCACTCTTTGGCAAC -3’

H2589s: 5’- GCCAGGAATGGATGGCCC -3’

H3032a: 5’- TTTGGAATATTGCTGGTGATC C -3’

H2835s: 5’- GTTCAATTAGGAATACCACATCC -3’

H3330a:* 5’- ACTAAYTTCTGTATRTCATTGACAGTCCA -3’

* im Oligonukleotid enthaltene Wobble-Basen: Y = C / T, R = A / G; (s): Sinnstrang (engl.: sense); (a): Gegenstrang (engl.: antisense).


20

Tab. 3: Für die selektive, quantitative real-time-PCR verwendete Oligonukleotide

Name Sequenz

Int 4452 5’- GTAGCAGTTCATGTAGCCAGTG -3’

Int 4575a 5’- CTGGTGAAATTGCTGCCATTGTC -3’

M184 EP1 5’- AATCCAGACATAGTTATCTATC -3’

M184 EP2 5’- TTTTTTGTCTGGTGTGGTAAATC -3’

L90 EP1 5’- GAAGCTCTATTAGATACAGG -3’

L90 EP2 5’- TTTAAAGTGCAACAAATCTGAG -3’

K103 EP1 5’- CCCGCAGGGTTAAAAAAG -3’

K103 EP2 5’- CCTGTGGAAGCACATTG -3’

Pol 2981_unspezif 5’- CAGTACAATGTGCTTCCACAGG -3’

Pol IN 3002 für 103 5’- CTGTGGAAGCACATTGTACTG -3’

IN M184 5’- CCAGACATAGTTATCTATCAATAIA -3’

IN M184V 5’- CCAGACATAGTTATCTATCAATAIG -3’

Pol IN 3206_für 184 5’- TTTGTCTGGTGTGGTAAATCCCCAC -3’

IN K103 5’- CCGCAGGGTTAAAAAAGAIA -3’

IN K103N 5’- CGCAGGGTTAAAAAAGAIC -3’

IN L90 5’- TGCAACCAATCTGAGTCIA -3’

IN L90M 5’- TGCAACCAATCTGAGTCIT -3’

Pol IN 2316 für 90 5’- GCTCTATTAGATACAGGAGCAG -3’

verwendete Oligonukleotide; I: Inosin; PCR: engl.: polymerase chain reaction.

Tab. 4: Resistenz-assoziierte Mutationen der verwendeten Referenz-Expressions-vektoren (Plasmide)

Name Mutationen im PR Gen Mutationen im RT Gen

NL4-3° keine keine

N2D*° K20R, E35D, M36I, N37S, I54V, L63P, A71V, V82T

keine

N3L*° E35D, N37S, L63P, V77I keine

4lig7° K20I, E35D, M36I, M46I, I62V, L63P, A71V, I72M, G73S, I84V, L90M

M41L, E44D, V60I, T69D, K102Q, V108I, I135T, N175Y, M184V, K201M, E203K, H208Y, L210W, R211K, T215Y, K219R, K223Q, L228R, V245K, E248D, R284K, A288S, I293V, E297K

Quellenangaben zu den verwendeten Expressionsvektoren in Nijhuis* et al., 1999; Tschochner° et al., 2007; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; Resistenz-assoziierte Mutationen sind fett gedruckt (Johnson et al., 2006)


21

4.1.5 Enzyme

Restriktionsendonukleasen und deren Puffer

Die Restriktionsendonukleasen ApaI, BclI, EciI, MscI, NheI, XbaI und SbfI wurden von den

Firmen New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein) oder Gibco BRL (Eggenstein)

bezogen. Die zugehörigen Puffer wurden nach Angaben der Hersteller verwendet und

gegebenenfalls mit BSA versetzt.

sonstige Enzyme

Enzym Hersteller / Zusammensetzung

T4-DNS-Ligase: New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein)

Trypsin: aus Rinderpankreas Gibco / BRL, 0.15 % (Eggenstein)

Trypsin / EDTA:

0,25 % Lösung in 140 mM NaCl; 5 mM KCl; 0,65 mM Na2HPO4;

5 mM D(+) Glukose; 25 mM Tris / HCl; 0,01 % EDTA; Trypsin; 0,1 %ige Phenolrotlösung; pH-Wert mit 25 % HCl auf 7,5 - 7,6 einstellen und anschließend steril filtrieren.

Kommerzielle Reagenzsysteme (engl.: kits)

Reagenzsystem Hersteller

Big-Dye-Terminator-Kit Version 2 ABI (Weiterstadt) Expand High Fidelity PCR System Roche (Mannheim) Expand-Puffer (HF-Puffer, 10 x konz., ohne MgCl2) Roche (Mannheim) Expand-Taq Roche (Mannheim) Galacto-Light TM Applied Biosystems (Bedford) HIV-1 RNS 3.0 Assay (bDNS) Bayer (Leverkusen) Microcon YM-100 Millipore (Eschborn) Murex-HIV Antigen mAb (p24 ELISA) Abbott (Wiesbaden) Phosphalight Chemoluminiscent Reporter Assay Boehringer (Ingelheim) QIAamp Viral RNS Kit Qiagen (Hilden) Qiagen Plasmid-Mini-Kit Qiagen (Hilden) QIAquick Gelextraction Kit Qiagen (Hilden) QIAquick PCR Purification Kit Qiagen (Hilden) Rapid-DNS-Ligation-Kit Roche (Mannheim) Superfect Transfection Reagent Qiagen (Hilden)


22

weitere Reagenzien und Laborhilfsmittel

Reagenzien / Laborhilfsmittel Hersteller

Agarose Serva (Heidelberg)

Ampicillin Apotheke des Universitätsklinikums Erlangen

Ampuwa-Wasser Fresenius (Schweinfurt) Bromphenolblau Serva (Heidelberg)

β-Mercaptoethanol Sigma (München)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck (Darmstadt) dNTPs Roche (Mannheim)

Ethylendiamintetraazetat (EDTA) Sigma (München)

Ethanol Sigma (München) oder Merck (Darmstadt) Ethidiumbromid (EtBr) Sigma (München)

Isopropanol Merck (Darmstadt)

Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma (München) Milliporewasser Milli-Q-System

Multiscreen-Sephadex G50 ABI (Weiterstadt)

Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg) Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) (C H NO )

Roth (Karlsruhe)

Triton-X100 Sigma (München)

Wasser (H2O) Sigma (München) SYBR green Molecular Probes, Invitrogen (Karlsruhe)

Deutschland DNS-Längenstandard: Gene RulerTM MBI, Fermentas (St. Leon-Roth)

4.1.6 Datensätze

GenoRC-Datenbank

Die Datenbank enthält insgesamt 279 Datensätze aus 254 klinischen Isolaten und 25 Klonen.

Diese wurden zum einen von klinischen Proben abgeleitet, zum anderen durch Mutagenese

konstruiert. Bei den klinischen Isolaten handelt es sich um Proben aus der Routine-Testung für

HIV-1 geno- und phänotypische Analysen aus dem Virologischen Institut, Klinische und

Molekulare Virologie des Universitätsklinikums Erlangen. Die Daten wurden über einen

Zeitraum von 2003 - 2006 erhoben. Alter und Geschlecht der Patienten sowie der Status der

Therapie sind zufällig und nicht vorselektioniert. Einschlusskriterium war das Vorhandensein


23

eines replikationsfähigen rekombinanten Virusisolats. Die Klone wurden generiert, um den

Einfluss von ausgewählten Kombinationen von Mutationen auf die RC analysieren zu können.

Verwendete Volllängeviren Bei den verwendeten Volllängeviren handelte es sich um folgende Isolate: aus der Gruppe M

die Subtypen B (92TH026), C (92BR025), G (ARP173 / RU570), CRF01_AE (92TH022) und

aus der Gruppe O der Subtyp O2 (HIV-1 CA-9) sowie ein HIV-2 Isolat (Die Angaben in

Klammern entsprechen den GenBank Nummern). Um Volllänge-Isolate mit hohen Virustitern

zu erhalten, wurden Plasmaproben von HIV-positiven Patienten auf PBMCs oder PM1-Zellen

kultiviert. Diese Virusüberstände wurden aus dem Subtypen-Panel der Abteilung Diagnostik

des Universitätsklinikums in Erlangen zur Verfügung gestellt. (Quellenangabe: http://virologie-

uni-erlangen.de).

Die CAT-Datenbank

Diese Datenbank enthält klinische Proben von Patienten aus der CAT-Studie (engl.:

continuously alternating therapy). Bei der CAT-Studie (Phase IV) handelt es sich um eine

offene, prospektive, multizentrische Studie zur Überprüfung der Wirksamkeit und

Verträglichkeit sowie der virologischen, immunologischen und pharmakologischen

Auswirkungen von regelmäßigen Therapie-Umstellungen in Patienten mit multiresistenten HI-

Viren gegen mindestens drei Klassen (NRTI / NNRTI / PI). Von 22 Teilnehmern wiesen nach

initialer Genotypisierung 21 Teilnehmer weniger als drei virologisch wirksame Medikamente

für eine mögliche Therapie auf (in T20-therapienaiven Patienten galt T20 als wirksames

Medikament) und besaßen keine Therapie-Optionen mit Aussicht auf erfolgreiche

Virussuppression. Die aktuelle VL unter Therapie lag bei allen Patienten ≥ 1000 Kopien/ml

Plasma. Bei den internierenden Therapie-Regimes bestand das eine Regime ausschließlich aus

Substanzen, die die RT inhibieren, das andere Regime ausschließlich aus Substanzen, die die

PR inhibieren. Zwischen den Therapie-Regimes sollte immer dann gewechselt werden, wenn

die VL um mehr als Faktor drei anstieg. Ziel der Therapie war eine Selektion von suszeptiblen

Viren durch partielle Reversion multipel resistenter Viren zum Wildtyp. Verlaufsproben

wurden im zwei- bis vierwöchigen Abstand entnommen und folgende Parameter

bestimmt: CD4-Zellzahl, CD8-Zellzahl, VL, genotypische und phänotypische Resistenz, RC,

Triglyceride und Medikamenten-Plasmaspiegel. Für die klonalen Analysen wurden 28

Plasmaproben ausgewählt und von insgesamt 22 Proben Klone isoliert.


24

Tab. 5: Plasmaproben der CAT-Studie, die für klonale Analysen verwendet wurden.

Patient Plasmaprobe Datum ART VL CD4

1 KV64* 26.08.2002 APV+SQV+RTV 1040 140

1 KV66 09.09.2002 APV+SQV+RTV 6810 200

1 KV67 19.09.2002 APV+SQV+RTV 79000 160

1 KV83 15.08.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 39700 120

1 KV84 12.09.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 137600 100

1 KV85 26.09.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 72500 90

4 KV12 24.03.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 4750 260

4 KV13 09.04.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 7460 190

4 KV14 23.04.2003 AZT+3TC+ABC+TDV 6060 220

5 KL18 23.01.2004 LPV/r +SQV 388000 10

5 KL19 10.02.2004 LPV/r +SQV 690200 10

5 KL20 24.02.2004 LPV/r +SQV 361000 10

5 KL21 09.03.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 376800 15

5 KL22 23.03.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 282150 10

5 KL23 06.04.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 179900 20

5 KL24 20.04.2004 T-20+3TC+EFV+DDI+TDV 750000 10

8 KL63 05.01.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 378000 54

8 KL64 02.02.2004 LPV/r+IDV 261000 60

8 KL65 27.02.2004 LPV/r+IDV 56754 80

8 KL66 09.03.2004 LPV/r+IDV 21200 80

8 KL67 23.03.2004 LPV/r+IDV 262900 140

8 KL68 06.04.2004 LPV/r+IDV 94700 120

8 KL69 20.04.2004 LPV/r+IDV 133000 100

11 KL88 10.02.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 11100 190

11 KL89 25.02.2004 AZT+3TC+ABC+TDV 1270 220

11 KL90 09.03.2004 LPV/r +SQV 4210 270

11 KL91 23.03.2004 LPV/r +SQV 12100 220

11 KL92 06.04.2004 LPV/r +SQV 3040 230 VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; ART: antiretrovirale Therapie; Abkürzungen der Medikamente und Angaben zu CD-Zellzahl, CD8-Zellzahl, VL, RC und phänotypischer Resistenz der Patientenproben s. Anhang; * Die Bezeichnung der Plasmaproben folgte einem laborinternen Code.

EUResist Datensatz

Um die klinische Relevanz von RC und Resistenz als prognostischen Marker für Therapie-

Ansprechen zu prüfen, wurde ein Datensatz aus insgesamt 2044 Proben mit zugehörigen

Angaben von Genotyp, VL und Therapie untersucht. Dieser Datensatz wurde von Dr. Rolf


25

Kaiser aus der EUResist-Studiengruppe in Köln zur Verfügung gestellt. 1022 Patienten wiesen

in einem Zeitfenster von drei Monaten ein Therapie-Ansprechen auf, weitere 1022 Daten

dagegen ein Therapie-Versagen. Als Kennzeichen eines klinischen Ansprechens diente ein VL-

Abfall von > 2 log, oder ein Abfall der VL < 400 Kopien/ml (http://www.euresist.org). Es

wurde darauf geachtet, dass für jedes Therapie-Regime die gleiche Anzahl an erfolgreichen

und nicht erfolgreichen Therapien mit einbezogen wurde. Für jede Probe wurden anschließend

anhand der genotypischen Sequenz die Resistenfaktoren (RF) und RC-Werte vorhergesagt. Um

die gesamte Aktivität des Therapie-Regimes einzuschätzen, wurden die Einzel-RF-Werte eines

Therapie-Regimes (nur verabreichte Medikamente) multipliziert Für die Analyse zur Relevanz

des RC-Werts wurde der RC-Wert in dieses Produkt eingerechnet.

Kontrollgruppe für klonale Analysen

Als Kontrollen für die klonalen Analysen aus der CAT-Datenbank wurden Daten von sechs

Patienten mit insgesamt 14 Proben ausgewählt, bei denen die VL sowie bis auf vier

Ausnahmen die CD4-Zellzahlen bekannt waren (Tab. 6). Zudem war von fünf Patienten der

Therapie-Status bekannt.

Tab. 6: Plasmaproben der Kontrollgruppe, die für klonale Analysen verwendet wurden.

Patient Plasmaprobe Datum ART VL CD4

23 NZ7* 28.04.2005 ohne 34000 -

23 NZ8 14.07.2005 ohne 22000 363

23 NZ9 06.10.2005 ohne 82000 181

24 NZ12 08.03.2005 SQV+LPV/r 810 137

24 NZ13 16.06.2005 SQV+LPV/r 2200000 42

25 NZ14 10.11.2005 TDV+FTC+SQV/r 41000 24

25 NZ15 24.11.2005 ohne 640 73

26 AB24 15.11.2005 ohne 3700 n.d.

26 NZ16 22.11.2005 ohne 4300 375

26 NZ17 15.12.2005 ohne 3700 437

27 NZ18 06.10.2005 ohne 54000 361

27 NZ19 22.11.2005 ohne 32000 275

28 PK8 16.12.2004 nicht bekannt 30000 n.d.

28 PK9 04.02.2005 nicht bekannt 8900 n.d.

VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; ART: antiretrovirale Therapie; n.d.: nicht durchgeführt; Abkürzungen der Medikamente s. Anhang; * Die Bezeichnung der Plasmaproben folgte einem laborinternen Code.


26

4.2 Methoden

4.2.1 Nukleinsäuremethoden

DNS-Standardmethoden

• Polymerase-Kettenreaktion (PCR: engl.: polymerase chain reaction) zur Amplifikation

von DNS-Fragmenten (Saiki et al., 1988)

• Agarose Gelelektrophorese

• DNS-Isolierung aus Agarosegelen mit dem QIAquick Gel Extraction Kit der Firma

Qiagen (Hilden) nach Angaben des Herstellers

• Aufreinigung von PCR-Amplifikaten vor der Ligation mit dem

QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen (Hilden)

• Aufreinigung von PCR-Amplifikaten speziell für anschließende Sequenzierung mit

Microcon-Säulen der Firma Millipore (Eschborn)

• Plasmidpräparation mit dem Plasmid Mini Kit der Firma Qiagen (Hilden) nach

Angaben des Herstellers

• Photometrische Bestimmung von DNS-Konzentrationen in einem Spektralphotometer

der Firma Perkin Elmer (Cetus)

• Restriktionsanalysen nach Angaben der Hersteller: New England Biolabs (Schwalbach,

Traunstein) und Gibco BRL (Eggenstein)

• Aufreinigung von Vektoren über Geneclean II der Firma Qbio-gene (Mannheim)

Durchführung quantitativer und allelspezifischer real-time-PCR

Die quantitative, selektive real-time-PCR erlaubt die allelspezifische Amplifikation von

Sequenzvarianten, die sich in einem Nukleotid unterscheiden. Sie wurde im real-time-PCR-

Gerät ABI Prism 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) nach publizierter Methode

durchgeführt (Metzner et al., 2005). Getestet wurden die Positionen L90M in der PR

(Kodons: 90L: TTG, 90M: ATG), K103N in der RT (Kodons: 103K: AAA, 103N: AAC) und

M184V in der RT (Kodons: 184M: ATG, 184V: GTG). Die Nachweisgrenze für die

Erkennung der Wildtyp-Variante in Anwesenheit der Mutante RT:M184V-DNS beträgt 0,1 %,

sowie für PR:L90M-DNS oder RR:K103N-DNS jeweils 0,01 % (Metzner et al., 2005). Für

eine real-time-PCR wurden 10 µl einer Probe zu einem Ansatz aus 0,2 µM Puffer Rox-K,


27

0,4 x PCR-Puffer II, 3,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTPs, 0,2 x SYBR-Green I, je 0,4 µM der

entsprechenden Oligonukleotide und Taq DNS-Polymerase mit einem Endvolumen von 50 µl

gegeben. Die Kopienzahl wurde über eine Regressionskurve eines Standards über den Bereich

der Integrase berechnet (Metzner et al., 2007).

Konstruktion rekombinanter viraler DNS

Die Herstellung der rekombinanten Viren erfolgte nach (Walter et al., 1999) in der

Modifikation von (Schmidt et al., 2000) (Abb. 3).

Abb. 3.: Generierung rekombinanter Viren nach Schmidt et al., 2000 und Walter et al., 1999. Nach Extraktion der viralen RNS und reverser Transkription erfolgt die Teilamplifikation der viralen Gene gag, PR, RT. Diese werden anschließend in einen entsprechend deletierten viralen Vektor ligiert. Nach Transformation in E.coli wird die Gesamt-DNS isoliert und in 293T-Zellen transformiert. Nach Passagierung des viralen Überstandes auf CEMx-174-Zellen erfolgt eine drei - bis sechstägige Kultivierung mit anschließender Gewinnung des zellfreien viralen Überstandes. gag: engl.: group specific antigen; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; RNS: Ribonukleinsäure; DNS: Desoxyribonukleinsäure.

LTR

LTR

RNS-Extraktion+ RT-PCR

Patienten Plasma

3´env LTRgag pol

PCR

5´ LTR

gag PR RT Deletionsmutante? gag/PR/RT

LTR

LTR

gag PR RT Ligation

Transformation (E.coli)und Präparation der Gesamt-DNS

Transfektion: 293T-ZellenInfektion von CEMx-174-Zellen;Gewinnung des rekombinanten

Virusüberstandes

Amplifikation des N-terminalen Teils des gag-Gens, derkompletten viralen Protease und der ersten 300 Aminosäuren der reversen Transkriptase mittels PCR

cDNS

LTR

LTR

RNS-Extraktion+ RT-PCR

Patienten Plasma

3´env LTRgag pol

PCR

5´ LTR

gag PR RT Deletionsmutante? gag/PR/RT

LTR

LTR

gag PR RT Ligation

Transformation (E.coli)und Präparation der Gesamt-DNS

Transfektion: 293T-ZellenInfektion von CEMx-174-Zellen;Gewinnung des rekombinanten

Virusüberstandes

Amplifikation des N-terminalen Teils des gag-Gens, derkompletten viralen Protease und der ersten 300 Aminosäuren der reversen Transkriptase mittels PCR

cDNS


28

Nach der Extraktion von HIV aus Plasma erfolgte die reverse Transkription unter Verwendung

des Oligonukleotids H3532a. In zwei anschließenden PCRs wurden mit den Oligonukleotiden

H1980s und H3532a (Amplifikat-Bandengröße: 1.552 bp) und den Oligonukleotiden H2001s

und H3454a (Amplifikat-Bandengröße: 1.453 bp) der C-terminale Teil des gag-Gens (AS 428 -

500), die gesamte PR (AS 1 - 99) und den Beginn der RT (AS 1 - 300) amplifiziert.

Anschließend wurden die 1.453 bp PCR-Fragmente mit den Restriktionsendonukleasen ApaI,

NheI verdaut und in das über ApaI, XbaI linearisierte NL4-3 Plasmid ligiert. 10 - 20 ng der

rekombinanten HIV-1-Plasmide wurden anschließend in ultrakompetente Escherichia coli

(Stamm XL2-Blue) transformiert. 150 µl der transformierten Bakterien wurden jeweils in

5 ml LB-Medium überimpft, für weitere 14 h inkubiert mit anschließender Plasmidpräparation

nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden). Zur Gewinnung von Klonen wurden jeweils

150 µl der transformierten Bakterien auf LB-Agar-Platten, die Ampicillin enthielten,

ausgestrichen und für ca. 14 h im Brutschrank bebrütet. Nach Abschluss der Inkubationszeit

wurden die Bakterienkolonien gezählt und im Schnitt 10 - 30 Klone isoliert. Einige der so

generierten Klone wurden zusätzlich mittels positionsgerichteter Mutagenese an einigen

Positionen gezielt verändert (Wolf et al., 2003). Bei dieser Methode wurden je zwei PCRs mit

Oligonukleotiden durchgeführt, welche die zu mutierende Base enthielten. Dadurch konnten

Amplifikate gewonnen werden, welche jeweils im Sinn- und Gegenstrang die durch die

Oligonukleotide eingefügte Mutation enthielten. Die so gewonnenen Amplifikate überlappten

nur im Bereich der Mutations-tragenden Oligonukleotide. Um die so gewonnenen Amplifikate

in einen Vektor einfügen zu können, wurden bei geeigneter Lage von

Restriktionsendonuklease-Schnittstellen, Amplifikat und Vektor entsprechend gespalten und

ligiert. Lagen keine geeigneten Schnittstellen vor wurden diese entweder durch Mutagenese

zusätzlich eingefügt oder es wurde eine Elongations-PCR durchgeführt, um den Abstand bis

zur nächsten Schnittstelle zu überbrücken. Dabei dienten die überlappenden DNS-Fragmente

mit der enthaltenden Mutation als Oligonukleotide in der Elongations-PCR.

Die Klone N2D und N3L wurden von Monique Nijhuis (Eijkman-Winkler Institut, Utrecht,

Niederlande) in TA-Klonierungs-Vektoren zur Verfügung gestellt. Beide Proben wurden aus

demselben Patienten isoliert. N2D wurde am ersten Tag, N3L am 115. Tag unter Ritonavir-

Monotherapie isoliert. Die Klone enthielten die PR flankiert von zusätzlichen 115 bp des gag-

Gens und 100 bp des RT-Gens. Um daraus rekombinante virale Klone herzustellen, ohne auf

homologe Rekombination zurückgreifen zu müssen, wurden die einzelnen Fragmente mit

Oligonukleotiden amplifiziert, die gleichzeitig die Erkennungssequenz für die

Restriktionsendonuklease EciI einführen (Tschochner et al., 2007). Bei einer Spaltung mit dem


29

Restriktionsenzym EciI spaltet EciI seine eigene Erkennungssequenz aus dem Amplifikat. Alle

Amplifikate wurden mittels Expand High Fidelity PCR System (Boehringer, Mannheim,

Deutschland) mit einer um 5 °C steigenden Hybridisierungs-Temperatur der Oligonukleotide

nach den ersten 10 Zyklen generiert. Zuerst wurde das PR-enthaltende Amplikon 2 des TA-

Klonierungs-Vektors mit Hilfe der Oligonukleotide Eci-TA-H2135s und Eci-TA-H2649a

amplifiziert. In zwei anschließenden PCRs wurden die angrenzenden 5’- und 3‘-Regionen mit

Eci-H2146a und H2001s (Amplikon 1) sowie Eci-H2639s und H2852a (Amplikon 3)

amplifiziert. Nach der Spaltung der Fragmente mit EciI wurden die Amplikons 1 und 2 sowie

die Amplikons 2 und 3 ligiert und mit den Oligonukleotiden H2001s und Eci-No-TA-H2649a,

sowie Eci-No-TA-H2135s und H2852a amplifiziert. Beide PCR-Produkte wurden anschließend

mit BclI an der internen Restriktionsstelle gespalten. Nach der Aufreinigung der Fragmente

erfolgte die Ligation mit anschließender Amplifikation über die Oligonukleotide H2001s und

H2852a. Das resultierende PCR-Fragment wurde in das ApaI und SbfI gespaltene pNL4-3

ligiert. Die Klone wurden N2D und N3L benannt (Nijhuis et al., 1999; Tschochner et al.,

2007).

4.2.2 Generierung rekombinanter Viren

Zur Herstellung rekombinanter Virusüberstände wurden 5 µg präparierte Gesamt-Plasmid-

DNS in 2,5 x 106 293T-Zellen transfiziert (Abb. 3). Nach zwei Tagen wurde der Virus

enthaltende Überstand bei 1200 RPM 10 min zentrifugiert. Zur Gewinnung von hochtitrigen

Überständen erfolgte anschließend Passagierung von 1 ml Überstand auf 500.000 CEMx-174-

Zellen mit drei- bis sechstägiger Kultivierung. Alle gewonnenen Überstände wurden

abschließend bei – 80 °C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.

4.2.3 Resistenz-Analysen

Genotypische Resistenz -Analysen

Die Sequenzierung wurde teils mit dem kommerziellen HIV-1 Viroseq Kit ABI PRISM 3100

(ABI, Weiterstadt), teils mit dem kommerziellen Sequenziersystem von HIV-1 TrueGene™ Kit

(Visible Genetics) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Die resultierenden Sequenzen

wurden anschließend in der zugehörigen ABI-Software ViroSeqTM zusammengefügt. Da dieses

Programm die gag-Sequenzen nicht mit erfasst, wurden diese anschließend manuell angefügt


30

und die zusätzlichen Aminosäureaustausche im gag-Gen dokumentiert. Insgesamt wurden zur

Qualitätskontrolle 28 der mit TrueGeneTM bestimmten Proben parallel mit dem ViroSeq Kit

bestimmt. Die Aminosäuren-Austausche im Vergleich zum Referenzvirus HXB2, sowie die

Subtypen wurden mit Hilfe des frei zugänglichen Algorithmus geno2pheno 3.0. Drug

Resistance Database (http://www.genafor.org/) analysiert. Aus der Summe aller

Aminosäureaustausche wurden die Resistenz-assoziierten Aminosäurenaustausche nach

(Johnson et al., 2006) identifiziert.

Phänotypische Resistenz-Analysen

Die Quantifizierung der rekombinanten Virusüberstände, sowie die anschließenden

Phänotypisierung und deren Auswertung erfolgten nach Walter et al. 1999 im jeweils

dreifachen Ansatz (Walter et al., 1999). Als Maß der viralen Replikation in Gegenwart

ansteigender Medikamentenkonzentration, wurde die Induktion des zelleigenen tat-induzierten

Indikatorgens SEAP bestimmt. Anschließend wurde die Medikamentenkonzentration

errechnet, bei der das jeweilige Virus um 50 % inhibiert wird (engl. inhibitory concentration

IC50) (Garcia-Lerma et al., 2001; Garcia-Lerma und Heneine, 2001). Der jeweilige

Resistenzfaktor (RF) wurde durch Division der IC50 des Testvirus durch die IC50 des

Referenzvirus NL4-3 errechnet. Er beschreibt den Faktor, um den ein Patientenvirus mehr oder

weniger Medikament benötigt, um in der Replikation im gleichen Maß wie der Wildtyp

gehemmt zu werden (Abb. 4).

Abb. 4: Messung der abnehmenden HIV-Replikation eines suszeptiblen Referenzvirus und eines resistenten klinischen Isolates durch ansteigende Medikamenten-Konzentration, modifiziert nach Oette et al., 2003: RF: Resistenzfaktor; Ref.: Referenzvirus; klin.: klinisches Isolat; IC50: engl.: inhibitory concentration IC50.

0

25

50

75

100

125

0,01 0,1 1 10 100

Medikamentenkonzentration (log, µM)

Akt

ivit

ät (%

)

Referenzvirus

klinisches Isolat

RF

IC50 klin.IC50 Ref.0

25

50

75

100

125

0,01 0,1 1 10 100

Medikamentenkonzentration (log, µM)

Akt

ivit

ät (%

)

Referenzvirus

klinisches Isolat

RF

IC50 klin.IC50 Ref.


31

Benötigt das Patientenvirus weniger Medikament für die Inhibition als das Wildtyp-Virus,

spricht man von Hypersuszeptibilität. Des Weiteren wurde mit Hilfe des frei zugänglichen

Algorithmus geno2pheno 3.0. Drug Resistance Database (http://www.genafor.org/) die

phänotypische Resistenz von der Sequenz vorhergesagt.

4.2.4 Virale Quantifizierungsverfahren

SEAP-Reportergen-Analysen

Zur Bestimmung der SEAP-Aktivität in Zellkulturüberständen wurde der Phospha-LightTM

(Secreted Alkaline Phosphatase Reporter Gene Assay System)-Kit (ABI, Weiterstadt) mit

geringfügiger Modifikationen des Herstellerprotokolls verwendet. Nach Inaktivierung des

virushaltigen Zellkulturüberstandes und der zellulären alkalischen Phosphatasen bei 65 °C für

40 min erfolgte eine zehnminütige Abkühlung. Anschließend wurde zu den inaktivierten

Virusüberständen 22 µl Assay Buffer gegeben und nach mindestens fünfminütiger Inkubation

22 µl Reaction Buffer zugegeben. Abschließend wurde nach exakt zwölf Minuten die Aktivität

in einem Luminometer als RLU (engl.: relative light units) gemessen.

Quantifizierung der RNS-Kopienzahl

Die Viruslast-Bestimmung für Proben aus der Geno2RC-Datenbank wurde mit dem

RNS 3.0 Assay (bDNS) der Firma Bayer (Leverkusen) nach Angaben des Herstellers

durchgeführt. Bei Ergebnissen oberhalb des linearen Messbereichs (50 - 500000 Kopien/ml)

wurden die Proben in HIV-negativem Plasma verdünnt und die Messung wiederholt. Die VL-

Bestimmungen für alle Proben aus der CAT-Studie wurden im Rahmen einer Kooperation mit

dem Vivantes-Auguste-Viktoria-Klinikum Berlin durchgeführt. Dort wurde zur quantitativen

Bestimmung der HIV-1 RNS-Kopien im Plasma der Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Test,

Version 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers verwendet. Der

lineare Messbereich liegt nach Angaben des Herstellers bei 50 – 750000 Kopien/ml. Proben,

die einen höheren Wert als 750.000 Kopien/ml besitzen, eigens austitriert und

nachquantifiziert. Proben, die mit 750000 Kopien/ml angegeben wurden, liegen an der

Obergrenze des Messbereiches und es besteht daher die Möglichkeit, dass die reale VL in

diesen Proben höher ist als angegeben.


32

Quantifizierung des p24-Antigen (p24-ag)-Gehalts

Die p24-ag Reportergen-Analysen wurden mit dem Murex HIV Antigen Mab Kit der Firma

Abbott (Wiesbaden) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Proben einer Messung,

die oberhalb der Extinktion der Standardkurve lagen (Wellenlänge: 450 nm

/ Referenzwellenlänge: 630 nm), wurden verdünnt und erneut bestimmt.

Quantifizierung viraler Infektiosität

Virale Infektiosität wurde nach geringfügig modifizierter Methode von Johnson und Byington

über die Messung der TCID50 (engl.: tissue culture infectious dose 50 %) bestimmt (Johnson,

1990). Bei der Durchführung dieser Methode wurde im sechsfachen Ansatz 50 µl zellfreier

viraler Überstand vierfach seriell verdünnt und anschließend dazu verwendet, je 3 x 105 CEMx-

174-Zellen in einer 96-Vertiefungsplatte zu infizieren. Zwei Mal wöchentlich wurden die

Kulturen resuspendiert, 20 µl in frisches Medium enthaltende 96-Vertiefungsplatten überführt

und lichtmikroskopisch auf das Auftreten von zytopatischem Effekt hin überprüft. Die Menge

an Viren, die notwendig war, um 50 % der Zellkulturen zu infizieren, wurde über die Formel

von Reed und Münch berechnet und als IU (engl.: infectious units) angegeben (Reed und

Münch, 2007).

Quantifizierung der CD4- und CD8-Zellzahl

Der Nachweis von CD4- und CD8-Zellen erfolgte im Rahmen einer Kooperation mit der

Medizinischen Klinik III der Universität Erlangen-Nürnberg und dem Vivantes-Auguste-

Viktoria-Klinikum in Berlin. Zellen aus dem Blut HIV-positiver Patienten wurden mit

Antikörpern (Beckman, Coulter) gegen die Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gefärbt

und anhand von Durchflusszytometrie (Beckman, Coulter) quantifiziert (Carcelain et al., 2001).

Bestimmung der Medikamentenspiegel in Zellen und Plasma

Für 39 Proben aus der CAT-Studie wurden rückwirkend die Plasmaspiegel für die

Medikamente 3TC, ABC, TDV und FTC sowie IDV, SQV, RTV, APV und LPV im Labor des

Auguste-Victoria-Klinikums, Berlin bestimmt. Die Untersuchungen wurden nach einem

validierten Verfahren durchgeführt, welches auf der Flüssigkeitschromatographie und Tandem-

Massenspektroskopie beruht (Kurowski et al., 1999; Stocker et al., 2004). Da für keinen der


33

Spiegel der zeitliche Abstand zur Medikamenteneinnahme durch den Patienten bekannt war,

konnte es sich bei den gemessenen Spiegeln sowohl um Spitzen- als auch Talspiegel handeln.

Vergleich der Produktion von p24-ag und Infektiosität in Zellkultur

1 x 106 CEMx-174-SEAP-Zellen wurden mit 800 µl der rekombinanten viralen Zellkultur-

überstände NL4-3, 1G25 oder 4lig7 in einem Gesamtvolumen von 10 ml über neun Tage

kultiviert. Täglich wurde der Gehalt an viralem p24-ag und viraler Infektiosität (gemessen als

TCID50) in 500 µl zellfreiem Überstand bestimmt (Abb. 6).

4.2.5 Zellkulturverfahren

Kultivierung von Zelllinien

Eukaryotische Zellen wurden in Lux-, Nunc- bzw. Roux-Zellkulturflaschen der Firma

NucleonTM (Dänemark) bei 37 °C, 7 % CO2 und 80 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator bebrütet.

Neu aufgetaute Zellen wurden zwei Wochen passagiert, bevor sie in Experimente eingesetzt

wurden.

293T-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % FKS und 1 % SPG in Roux-

Zellkulturflaschen kultiviert und zur Passage zweimal pro Woche 1:10 vereinzelt: Zur

Ablösung der adhärent wachsenden Zellen wurde Trypsin verwendet. Für die Vorbereitung der

Zellen für transiente Transfektionen wurden 5 Mio Zellen in Nunc-Flaschen überführt, mit

7 ml DMEM-Medium aufgefüllt und 24 h bebrütet.

CEMx-174-Zellen, CEMx-174-SEAP-Zellen und PM1-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium

mit 10 % FKS und 1 % SPG in Roux- Zellkulturflaschen kultiviert. Zweimal pro Woche

wurden die Zellen zur Passage 1:10 verdünnt. Zudem wurden die Zellen alle 14 Tage in neue

Zellkulturflaschen überführt, um den Anteil von adhärent wachsenden Zellen möglichst gering

zu halten.

Identifikation von optimalen Zellkulturbedingungen bei der viralen Replikation

Eines der Ziele bei der Entwicklung eines Zellkultursystems ist die Gewährleistung optimaler

Zellkulturbedingungen. So wurden zunächst Versuche durchgeführt, um den Bereich der


34

Sättigung unseres Zellkultursystems herauszufinden. Dabei muss zwischen zwei Arten der

Sättigung unterschieden werden: (i) Die Limitierung der Zellzahl durch Virusreplikation, d.h.

es muss gewährleistet werden, dass auch bei schnell replizierenden Viren bis zum

Versuchsende ausreichend viele uninfizierte Zellen in der Kultur vorhanden sind, da

andernfalls die Virusproduktion gegen Versuchsende rückläufig werden würde. (ii) Die andere

Art der Sättigung der Zellkultur entsteht, wenn die Replikation durch eine zu hohe Zellzahl in

der Kultur limitiert wird, da proportional zur Anzahl der Zellen Medium verbraucht wird und

Stoffwechselprodukte in die Zellkultur abgeben werden. Es muss gewährleistet werden, dass

bis zum Versuchsende ausreichend frisches Medium zur Verfügung steht, andernfalls käme es

zu verminderter Zellteilung und damit auch indirekt zu verminderter Virusreplikation. Um

gesättigte Kulturen identifizieren zu können, wurde ein hochtitriger Virusüberstand des

resistenten Referenzvirus 4lig7 zehnfach verdünnt und die SEAP-Aktivität im Überstand,

angegeben in RLU, an den Tagen eins, zwei und drei nach Infektion bestimmt. Der

Verdünnungsfaktor zwischen den einzelnen Kulturen betrug 1,427. Die so verdünnten Kulturen

reichten über einen Bereich von 23-facher bis 582-facher Verdünnung des Originalüberstandes.

Je niedriger der Verdünnungsfaktor gewählt wurde, desto höher war gleichzeitig die

Infektionsdosis und desto höher war die SEAP-Produktion in dieser Kultur. Sättigung einer

Zellkultur trat ein, wenn die SEAP-Produktion trotz höherer Infektionsdosis gleich oder

niedriger war, als die nächst niedriger infizierte Kultur.

Test zur Bestimmung der relativen Replikationskapazität

Der Versuch wurde im 96-Vertiefungsplatten-Format durchgeführt. Die Infektion erfolgte am

Tag 0. Die Vorverdünnung der viralen Überstände erfolgte im sechsfachen Ansatz, wobei nur

die inneren 60 Vertiefungen der Platten verwendet wurden, um den Anteil an der Verdunstung

in den verwendeten Vertiefungen zu minimieren. Dazu wurden je Virusüberstand zunächst

70 µl 1640-Medium in drei 96-Vertiefungsplatten vorgelegt. Der virale Überstand wurde

anschließend über drei 96-Vertiefungsplatten mit einem Faktor von 1,39 verdünnt, indem

jeweils 180 µl in die Nachbarvertiefungen überführt wurden. Das Resultat waren 30

verschiedene Verdünnungen eines jeden viralen Überstandes, mit einem Verdünnungsfaktor

von 1,39 bis 19056–fach. Für die anschließende Infektion wurden drei 96-Vertiefungsplatten

mit 100 µl Zellsuspension aus CEMx-174-SEAP-Zellen in einer Konzentration von

1 x 105 Zellen/ml vorbereitet. Es folgte die Infektion dieser Zellen im sechsfachen Ansatz mit


35

allen 30 Virusverdünnungen (Abb. 5). Die Virusüberstände NL4-3 und 4lig7 wurden jeweils

als Referenz in jedem Versuch einzeln oder doppelt mitgeführt. Um der Zeitspanne des

Versuchs Rechnung zu tragen, wurden die Referenzviren jeweils zu Beginn und am Ende eines

Experimentes pipettiert. Nach der Infektion erfolgte die erste Inkubation im Brutschrank. An

Tag drei wurden aus jeder infizierten Vertiefung 15 µl Überstand entnommen und die SEAP-

Aktivität in den verschiedenen Verdünnungen bestimmt.

An Versuchstag drei erfolgte eine Passagierung von 1:25 verdünntem zellfreien Überstand auf

frische CEMx-174-SEAP-Zellen in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/ml im sechsfachen

Ansatz in drei 96-Vertiefungsplatten je Virus. Es folgte eine erneute Inkubation im

Brutschrank. An Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion) wurde abschließend die SEAP-

Aktivität in den verschiedenen Verdünnungen aus zellfreiem Überstand bestimmt.

Abb. 5: Vorgehensweise bei Durchführung einer viralen Verdünnungsreihe mit dem Verdünnungsfaktor 1,39 zur anschließenden Infektion von CEMx-174-LTR-SEAP-Zellen.

Die Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte mit Hilfe des Microsoft-Excel Programms.

Aus jeder SEAP-Sechsfach-Bestimmung an Tag drei und sechs wurden zunächst Mittelwert

und Standardabweichung gebildet. Die Ergebnisse der Mittelwerte wurden den jeweiligen

Verdünnungsfaktoren der entsprechenden Zellkultur zugeordnet und grafisch dargestellt.

Kulturen, die trotz hoher Infektionsdosis (geringe Verdünnung) weniger SEAP produzierten als

die nächst niedriger infizierte Kultur, wurden als gesättigt definiert.

Alle als gesättigt identifizierten Kulturen wurden aus der weiteren Berechnung ausgeschlossen

mit Ausnahme der Kultur, welche um Faktor 1,39 höher infiziert war als die erste ungesättigte

Kultur. Dadurch konnte über alle Mittelwerte der Sechsfachmessungen anschließend mit Hilfe

des Microsoft-Excel Solvers eine idealisierte Kurve extrapoliert werden (s. 4.2.7). Um die

137209878

512136872655

1376

19056

991

1911

7113

51437026619213899 72 37713

52 19 14 10 7,25,23,72,71,9

27

1,39

50µl

Verdünnung des viralen Überstandes mit dem Verdünnungsfaktor 1,39

137209878

512136872655

1376

19056

991

1911

7113

51437026619213899 72 37713

52 19 14 10 7,25,23,72,71,9

27

1,39

50µl

Verdünnung des viralen Überstandes mit dem Verdünnungsfaktor 1,39


36

Kultur mit optimaler Virusreplikation zu identifizieren, wurde der maximale SEAP-Wert der

extrapolierten Kurve durch zwei dividiert (VA50%: virale Aktivität 50%). Dadurch erhält man

einen Wert, der in der exponentiellen Phase der Kurvenfunktion liegt. Anhand der

extrapolierten Kurvenfunktion konnte anschließend die zugehörige Verdünnung bestimmt

werden, die notwendig war, um diese optimale Replikation zu gewährleisten. Nachdem für jede

Probe zwei zugehörige Verdünnungen bestimmt worden waren (Tag 3 und Tag 6), wurde der

Verdünnungsfaktor, der optimale virale Replikation für Tag drei gewährleistet hat, durch den

Wert der Verdünnung, der optimale virale Replikation für Tag sechs gewährleistet hat,

dividiert. Der resultierende Faktor gab den Anstieg der Produktion infektiöser Viren an.

Um von diesem Faktor auf die zugehörige RC eines Virusüberstandes schließen zu können,

wurde der resultierende Wert des Wildtyp-Virus (NL4-3) als 100 % definiert und anschließend

der Quotient aus dem Faktor der jeweiligen zu bestimmenden Probe mit dem Faktor für das

Wildtyp-Virus gebildet und in Prozent angegeben. Ein resultierender Wert größer 100 % weist

auf eine schneller replizierende Variante als NL4-3 hin, ein Wert kleiner als 100 % auf ein

replikationsinhibiertes Virus.

RC-Bestimmung von Volllänge-Viren verschiedener Subtypen auf PM1-Zellen

Fünf Subtypen und ein HIV-2-Isolat wurden verwendet und mit einer modifizierten Version

des RC-Protokolls getestet. Da bei der Verwendung von Volllänge-Viren der Tropismus der

Viren CXCR4 oder CCR5 zumeist unbekannt ist, die CEMx-174-SEAP-Zellen aber nur von

CXCR4-tropen Viren infiziert werden können, musste auf andere Zellen und einen anderen

Indikator viraler Aktivität zurückgegriffen werden. In vielen T-Zelllinien können nur

bestimmte HIV-1-Laborstämme und in der Regel keine HIV-1-Primärisolate replizieren (Lusso

et al., 1995). Daher wurde für die Infektion ein klonales Derivat der Hut78-Zellen verwendet,

das Suszeptibilität für ein außergewöhnlich breites Spektrum von Laborstämmen und

Primärisolaten aufweist. Da diese im Vergleich zu den CEMx-174-SEAP-Zellen langsamer

wachsen, wurde die virale Aktivität über das sehr stabile virale p24-ag in zellfreiem Überstand

an den Versuchstagen vier und acht bestimmt (s. 4.2.4). In jedem Versuch wurde 4lig7 als

resistentes Kontrollvirus mitbestimmt. Zudem wurde in jedem Versuch das rekombinante Virus

N2D, für das bereits RC-Ergebnisse vorlagen, bestimmt.


37

4.2.6 Klonale Analysen

Für die Analyse wurden 28 Proben von fünf Patienten (Pat.: 1, 4, 5, 8, 11) aus der CAT-Studie,

die einen auffälligen VL-Verlauf ohne offensichtliche genotypische Veränderungen aufwiesen,

und 14 diagnostische Kontrollproben von sieben verschiedenen Patienten, welche entweder

therapienaiv waren oder eine Ersttherapie erhielten (Pa.: 23-28), ausgewählt (Kontrollgruppe).

Anschließend wurden von 22 CAT-Proben und acht Kontrollproben molekulare Klone

generiert (s. 4.2.1.). Je Probe wurden bis zu zehn Klone isoliert und mittels oben genannter

PCR amplifiziert (s. 4.2.1.). Der untersuchte Genanteil betrug dabei 1035 bp und reichte von

PR: 1 bis RT: 246. Klone mit richtiger Bandengröße wurden sequenziert und auf

Aminosäureaustausche im Vergleich zum Wildtyp HXB2 untersucht. Anschließend wurden

lineare Regressionsanalysen zwischen der Anzahl an Mutationen, die nicht bei der

Sequenzierung der Plasmapopulation aufgefunden wurden, und der Veränderung in der VL

durchgeführt. Zudem wurden auch stumme Mutationen in den klonalen Sequenzen im

Vergleich zur Plasmapopulation untersucht. Diese sind gekennzeichnet durch Basenaustausche,

welche die resultierende Aminosäure nicht verändern.

Art der Basenaustausche in klonalen Sequenzen

Untersucht wurde, welche der vier Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin innerhalb eines

Genabschnitts von 1035 Basen im rekombinanten viralen Anteil aller Klone, beginnend bei der

AS 1 der PR bis zur AS 246 des RT-Gens, am häufigsten verändert war, in der zugehörigen

Plasmasequenz aber unverändert war. Da bekanntermaßen die Verteilung der vier Basen in

Retroviren nicht gleichmäßig ist, sondern mehr Adenin und Thymin im Vergleich zu Guanin

und Cytosin vorhanden sind, wurde zunächst der Anteil der vier Basen der Plasmasequenzen

unter Ausschluss von Mischungen bestimmt. Der resultierende Wert wurde anschließend mit

der Anzahl der isolierten Klone multipliziert und über Vier-Felder-Tafel-Analysen mit der

Anzahl der vorgefundenen absoluten Anzahl an Basenaustauschen in den Klonen verglichen.

Phylogenetische Analysen

Phylogenetische Analysen werden dazu verwendet, das Maß der Verwandtschaft mehrerer

Proben zueinander zu bestimmen. Die Analysen wurden für Proben der CAT-Datenbank und

diagnostische Kontrollproben durchgeführt. Die Verwandtschaft der Proben steigt dabei mit


38

der Anzahl an gleichen Basen und damit in der gleichen Verzweigung des phlogenetischen

Baumes. Sie wurde graphisch als Baum mit Hilfe des Programms Vektor NTI Version 5.5

dargestellt.

4.2.7 Statistik und computergestützte Analysen

Statistische Analysen

Statistische Analysen wurden mit der SPSS Statistik Software, Version 12.0 durchgeführt. Die

klinischen Korrelationen wurden mit Hilfe linearer Regressionsanalysen ausgewertet. Für

binomiale Variablen wurden Vier-Felder-Tafel-Analysen (Chi-Quadrat-Test) mit Hilfe der frei

zugänglichen Internetseite http://www.georgetown.edu/ durchgeführt, um signifikante

Unterschiede zwischen Basenaustauschen in CAT- und Kontrollklonen fest zu stellen. P-

Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen, p-Werte < 0,001 wurden als

statistisch hoch signifikant angesehen. Zur Korrektur von multiplen Analysen wurde die

Bonferroni-Korrektur angewandt.

Der Kolmogorov-Smirnov-Test wurde angewandt, um Proben auf Normalverteilung zu prüfen.

Dieser Test erreicht Signifikanz, wenn die untersuchten Werte nicht normalverteilt sind.

Computergestützte Auswertungen

Validierungskriterien der RC-Bestimmung

Die Bestimmung der RC erfolgte mit Hilfe der Solver-Funktion in Microsoft-Excel und wurde

anhand folgender Kriterien validiert:

• Kann die Funktion des Microsoft-Excel Solvers eine Kurve nicht extrapolieren, muss

der Virusüberstand als nicht validiert angesehen und erneut bestimmt werden.

• Der maximal gemessene SEAP-Mittelwert der Kurve muss an Tag drei mindestens

90 % des extrapolierten Maximalwerts betragen, an Tag sechs mindestens 80 %.

• Mindestens sechs SEAP-Mittelwerte müssen in die Kurve miteingehen, welche nicht im

Sättigungsbereich der Kuvenfunktion liegen.

• Mindestens drei SEAP-Mittelwerte müssen unter 50 % des Kurven-Maximums liegen.

• Die Infektion der Zellkulturen mit unverdünntem Überstand muss an Tag drei

mindestens 2.500 RLU und an Tag sechs mindestens 4.000 RLU im Mittel des


39

Sechsfachansatzes erzeugen, ansonsten muss der Versuch mit einem höhertitrigen

Überstand wiederholt werden.

Analysen zur klinischen Relevanz der RC

Um die klinische Relevanz der RC zu ermitteln, wurden zunächst die Veränderung (delta: d)

der CD4- und CD8-Zellzahlen sowie der VL zwischen Folgeproben ermittelt. Dazu wurde der

Wert der Folgeprobe, durch den Wert der Vorprobe dividiert. In anderen Analysen wurde von

allen Proben eines Patienten die Mittelwerte aller Einzelwerte eines Parameters errechnet. Um

Korrelationen zwischen verschiedenen Parametern festzustellen, wurden über diese Mittelwerte

aller Patienten lineare Regressionsanalysen durchgeführt. Dies gewährleistete die

Unabhängigkeit der Daten, die in die linearen Regressionsanalysen einbezogen wurden.

Bioinformatische Verfahren zur Prädiktion der RC

Univariate Analyse:

Die univariate Analyse wurde angewendet, um die Relevanz einzelner Mutationen in Bezug

auf die RC herauszufinden. Jeder Aminosäure-Austausch der zu untersuchenden Sequenz

wurde dazu mit HXB2 verglichen. Bei der Analyse wurden nur Mutationen berücksichtigt, die

mindestens fünfmal im Datenset vertreten waren, um Sequenzartefakte ausschließen zu

können. Anschließend wurden die Proben folgendermaßen verglichen: Alle Sequenzen, die

eine spezifische Mutation trugen, wurden einer Gruppe, alle Sequenzen, welche die

Referenzaminosäure trugen, einer zweiten Gruppe zugeteilt. Anschließend wurde für die

Gruppen 1 und 2 der Median aller RC-Werte der Sequenzen berechnet. Insgesamt wurden drei

Analysen durchgeführt: Positionen, die gemischte Aminosäure-Informationen aus Gruppe 1

und 2 tragen, wurden in die Analyse A) vollständig mit einbezogen, B) teilweise mit

einbezogen und C) von der Analyse ausgeschlossen.

Mit Hilfe des nicht parametrischen Wilcoxon Rangsummentest, konnten nach abgeschlossener

Analyse für jede Sequenzposition p-Werte berechnet und eine Rangliste der Mutationen erstellt

werden. Die ermittelten p-Werte wurden anschließend mit Hilfe der Benjamini-Hochberg-

Methode korrigiert, um falsch positive Ergebnisse zu identifizieren (Benjamini Y. und


40

Hochberg Y., 2005). Sehr niedrige p-Werte wiesen auf Mutationen hin, die mit entsprechend

hoher Wahrscheinlichkeit eine veränderte RC gegenüber dem Wildtyp-Virus NL4-3 aufweisen.

Multivariate Analyse:

Untersucht wurden 261 Proben aus der Geno2RC-Datenbank ohne Berücksichtigung von

Sequenzinformationen aus dem gag-Gen. Zudem wurde eine Subanalyse von 92 Daten

durchgeführt, für welche zusätzlich gag-Sequenzinformationen vorhanden waren (92mG),

welche mit den Sequenzinformationen desselben 92er Datensets ohne gag-Sequenzinformation

verglichen wurden (92oG). Bei der multivariaten Analyse wurde der Einfluss aller Mutationen

einer Probe im Kontext berücksichtigt. Es wurden nur Mutationen mit einbezogen, die

mindestens fünf Mal in der Datenbank enthalten waren. Die Mutationen wurden nach ihrem

mittleren Gewicht sortiert, so dass man eine Rangliste von Mutationen graduiert nach ihrem

Einfuß auf die RC erhielt. Mutationen mit großem Einfluss auf die RC stehen in der Rangliste

oben. Die multivariate Analyse wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden durchgeführt, den

Entscheidungswäldern und den Support Vector Machines.

Die Methode der Rekursiven Partitionierung (Entscheidungsbäume) wurde erstmals von

Leo Breiman 1984 entwickelt (Breiman L., 2001). Mit Hilfe der Entscheidungsbäume konnte

bereits gezeigt werden, dass man für den Genotyp einer Probe die voraussichtliche Resistenz

gegen ein Medikament vorhersagen kann (Beerenwinkel et al., 2002; Quigg et al., 2002; Segal

et al., 2004). Dabei wurden die Sequenzen rekursiv in Teilmengen unterteilt, sodass Sequenzen

der gleichen Partition sich phänotypisch zunehmend ähnlicher waren als solche aus anderen

Partitionen. Jede zu prüfende Sequenzposition erhielt dabei eine Zuordnung, resistent oder

sensitiv gegenüber einem Medikament, und führte zur nächsten Sequenzposition weiter. So

konnte ein Pfad erstellt werden, der die Interpretation einer Probe erleichtert.

In dieser Arbeit wurde das Modell zur Vorhersage von RF auf die Vorhersage der RC adaptiert,

wobei hauptsächlich auf den Veröffentlichungen von Beerenwinkel und Kollegen aufgebaut

wurde (Beerenwinkel et al., 2003a; Beerenwinkel et al., 2005). Um eine noch genauere

Vorhersage erstellen zu können, wurden mehr als 1000 Entscheidungsbäume zu

Entscheidungswäldern (EW: engl.: random forests) zusammengefasst (Segal, 1995). Die

Vorhersagequalität wurde beurteilt, indem die Vorhersage aller Proben bis auf eine

berücksichtigt und anschließend die fehlende Probe klassifiziert wurde. Man erhält so einen


41

prozentualen Wert an falsch klassifizierten Proben, den so genannten Vorhersagefehler

(engl.: mean squared error: MSE).

Auch bei der Methode der Vorhersage der RC mittels Support Vector Machines (SVM)

handelt es sich um ein maschinelles Lernverfahren, welches mit Algorithmen arbeitet und sich

zu Klassifikation und nicht linearen Regressionsanalysen eignet (Chalimourda et al., 2004).

Dadurch ist das Lernen in hochdimensionalen Sequenzräumen möglich. Auch dieses Verfahren

wurde bereits erfolgreich zur Vorhersage von Resistenzfaktoren verwendet (Beerenwinkel et

al., 2003a). Im Unterschied zur rekursiven Partitionierung werden in die quantitative

Vorhersage mittels SVM alle Sequenzpositionen im Kontext berücksichtigt und mit

unterschiedlichen Gewichten versehen. Dadurch konnte der Einfluss des gesamten

Sequenzhintergrundes bei der Vorhersage mit einbezogen werden. Mutationen, die nur im

Kontext anderer Mutationen zu veränderter Replikationskapazität führten, konnten über

Transformation der Sequenzen in den Euclideanischen Vektorraum X identifiziert werden. Für

die Implementierung wurde das R-package „e1071“ verwendet (Dimitriadou E. et al., 2006).

Um eine Aussage über die Vorhersagegüte dieses Modells machen zu können, wurde die

zehnfache Kreuzvalidierung angewandt, wodurch ein Korrelationskoeffizient errechnet werden

konnte. Man erhält diesen, indem man den vorhandenen Datensatz in zehn Teile gliedert und

mit Hilfe von neun Teilen den zehnten Teil voraussagt. Dieses Prozedere wurde für alle

anderen Teile jeweils wiederholt. Der resultierende Korrelationskoeffizient ist ein Maß dafür,

wie nahe eine unbekannte Sequenz nach der Vorhersage am tatsächlichen Wert liegt.

ERGEBNISSE 42

5 ERGEBNISSE

5.1 Vergleich der Produktion von p24-Antigen und Infektiosität in

Zellkultur

Ein Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Testsystems zur Bestimmung der RC, wobei

insbesondere die Variabilität der Virusquantifizierung reduziert werden sollte. Bei der

parallelen Bestimmung von p24-Antigen (p24-ag) und TCID50 in infizierten Kulturen konnte

bei allen Viren ein Anstieg von p24-ag und Infektiosität innerhalb der ersten drei bis vier Tage

nach Infektion festgestellt werden (Abb. 6), gefolgt von einem Abfall der Infektiosität.

Dagegen wurde ein weiterer Anstieg von p24-ag bis Tag sieben in allen Kulturen beobachtet.

Anschließend ging die nachweisbare Menge an p24-ag in ein Plateau über. Das Verhältnis

zwischen Infektiosität und p24-ag verringerte sich daher in allen Kulturen nach vier Tagen

Kultivierung stetig (Tab. 7). Für das nicht resistente Virus NL4-3 betrug das Verhältnis nach

drei Tagen 17:1 und verringerte sich bis zum letzten Versuchstag auf 0,1:1. Die resistenten

Virusüberstände von 1G25 und 4lig7 erzielten niedrigere Verhältnisse zwischen Infektiosität

und p24-ag und der Abfall der Infektiosität erfolgte verzögert im Vergleich zu NL4-3

(Tschochner et al., 2007).

Tab. 7: Verhältnis von Infektiosität (TCID50) und p24-Antigen. Die virale Aktivität von NL4-3 erreicht an Tag 2 ihr Maximum und fällt dann stetig ab.

TCID50 / p24-ag

Tag nach Infektion NL4-3-2 4lig7-2 1G25-2

Tag 0 0,4 0,0 0,1

Tag 1 1,4 0,1 0,2

Tag 2 17,5 n.d. n.d.

Tag 3 15,9 n.d. n.d.

Tag 4 10,4 6,3 3,5

Tag 5 2,1 3,3 1,1

Tag 6 2,0 1,0 0,3

Tag 7 1,4 1,9 0,1

Tag 8 n.d. n.d. n.d.

Tag 9 0,1 0,3 0,0

n.d.: nicht durchgeführt; p24-ag: p24-Antigen; TCID50: engl.: tissue culture infectious dose 50 %; IU: engl.: infectious units; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; n.d.: nicht durchgeführt.

ERGEBNISSE

43

Abb. 6: Vergleich der viralen Produktion von p24-Antigen und Infektiosität in Zellkultur im zeitlichen Verlauf (Tschochner et al., 2007). A) Nach initialem Anstieg ist ein Abfall der Infektiosität ab Tag fünf zu beobachten. B) Anreicherung des viralen p24-ag bis Tag sieben und Übergang in ein Plateau. Die Abbildung ist repräsentativ für vier unabhängig voneinander durchgeführte Experimente mit geringfügiger Modifikation der Infektionsdosis. p24-ag: p24-Antigen; TCID50: engl.: tissue culture infectious dose 50 %; IU: engl.: infectious units; NL4-3: nicht resistentes Referenzvirus; 4lig7 und 1G25: resistente virale Klone.

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

TC

ID50

(IU

)

B

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tage

p24-

ag (n

g/m

l)

NL4-3

4lig7

1G25A

Tage

NL4-3

4lig7

1G25

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

TC

ID50

(IU

)

B

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tage

p24-

ag (n

g/m

l)

NL4-3

4lig7

1G25A

Tage

NL4-3

4lig7

1G25

ERGEBNISSE

44

5.2 Replikationskapazität rekombinanter Viren

Identifikation von optimalen Zellkulturbedingungen bei der viralen Replikation

Virale Replikation in Zellkultur ist abhängig von den Bedingungen für den Zellstoffwechsel

und darum in der Folge der lytischen Replikation auch von der HIV-Infektionsdosis. Um

gesättigte Kulturen identifizieren zu können, wurden CEMx-174-SEAP-Zellen mit

verschiedenen Verdünnungen eines hochtitrigen Virusüberstands des Kontrollklons 4lig7

infiziert. Der Verdünnungsfaktor von Kultur zu Kultur betrug dabei 1,427. Die am höchsten

infizierte Kultur wurde mit 24-fach verdünntem Virusüberstand infiziert, die am niedrigsten

infizierte Kultur 582-fach verdünntem Virusüberstand. Im angegebenen Beispiel Abb. 7 wird

deutlich, dass gesättigte Zellkulturen keine optimale Virusreplikation aufweisen. Die LTR-

induzierte SEAP-Indikator-Aktivität, angegeben in RLU, an den Tagen eins bis drei nach

Infektion in den Kulturen der Verdünnungen 24, 34, 48 und 69 zeigte keine erhöhte SEAP-

Aktivität im Vergleich zur jeweils nächst höher verdünnten Kultur. Auch in der Zellkultur,

welche 99-fach verdünnt infiziert wurde traten Sättigungseffekte auf, da in dieser Kultur die

SEAP-Produktion nicht weiter exponentiell über die Zeit anstieg.

Wie in Abb. 7 bereits ersichtlich, können solche gesättigten Kulturen aber auch über die

Bestimmung der viralen Aktivität ausschließlich zu einem Zeitpunkt, etwa an Versuchstag drei

oder vier, identifiziert werden, wenn dies im Vergleich mit anderen Infektionsdosen geschieht.

Dies wird anhand eines Beispiels noch deutlicher Abb. 8. Im angegebenen Versuch wurden

Zellkulturen mit 30 verschiedenen Infektionsdosen eines Virusüberstandes von NL4-3 infiziert

und die SEAP-Produktion drei Tage nach Infektion bestimmt. Der Verdünnungsfaktor betrug

dabei jeweils 1,39-fach. Die Kultur, die mit ca. zehnfacher Verdünnung des Virusüberstandes

infiziert war, konnte innerhalb von drei Tagen 14482 RLU produzieren, die nächst höher

infizierte Kultur (Verdünnungsfaktor 7,19) konnte dagegen nur 14078 RLU produzieren und ist

damit die erste Kultur, die gesättigt war. Demnach waren auch alle höher infizierten Kulturen

gesättigt (verdünnt über einen Bereich von 1,39 bis 7,19).

ERGEBNISSE

45

Abb. 7: Infektion von zehn Zellkulturen mit geringfügig unterschiedlicher Infektionsdosis des Referenzvirus 4lig7. Die Verdünnung des viralen Überstandes zur Infektion umfasste einen Verdünnungsbereich von 24- bis 582-fach. Je geringer der Verdünnungsfaktor gewählt wurde, desto höher war die Infektionsdosis und in der Folge auch die SEAP-Produktion. Sättigungseffekte einer Kultur wurden erkennbar, wenn die SEAP-Produktion nicht weiter exponentiell über die Zeit anstieg, aber auch wenn die SEAP-Aktivität trotz höherer Infektionsdosis nicht höher war als die der nächst geringer infizierten Zellkultur. In diesem Versuch sind die Kulturen, welche mit Verdünnungen von 24, 34, 48, 69 und 99 infiziert worden sind gesättigt. Die Grafik steht exemplarisch für 28 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente für das resistente Referenzvirus 4lig7. RLU: engl.: relative light units; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.

Abb. 8: Infektion von 30 Zellkulturen mit sukzessive ansteigender Infektionsdosis anhand eines Beispiels des Referenzvirus NL4-3. Angegeben sind die Mittelwerte der SEAP-Produktion drei Tage nach Infektion aus jeweils sechs unabhängig infizierten Zellkulturen und die zugehörigen Standardabweichungen (vertikale Linien an den Balken). Gesättigt sind in diesem Beispiel die Kulturen der Verdünnungen von 1 (1,39) bis 7 (7,19). Die Grafik steht exemplarisch für NL4-3 für 73 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente. RLU: engl.: relative light units; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

1 2 3 4 5 7 10 14 19 27 37 52 72 99 138

192

266

370

514

713

991

1376

1911

2655

3687

5121

7113

9878

1372

0

1905

6

Verdünnung

SE

AP

(R

LU)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

1 2 3 4 5 7 10 14 19 27 37 52 72 99 138

192

266

370

514

713

991

1376

1911

2655

3687

5121

7113

9878

1372

0

1905

6

Verdünnung

SE

AP

(R

LU)

Verdünnung

Tag 2 Tag 3

2434486999141200286408582

SE

AP

(R

LU

)

Tag 10

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

Verdünnung

Tag 2 Tag 3

2434486999141200286408582

SE

AP

(R

LU

)

Tag 10

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

ERGEBNISSE

46

Um die optimalen Bedingungen zur Virusreplikation für jedes Isolat bestimmen zu können,

wurde eine extrapolierte Solver-Kurve über die Rohwerte gelegt. Die Funktion näherte sich

dem Plateauwert asymptotisch an. Anhand dieser Kurvenfunktion konnte die Verdünnung

errechnet werden, die der Kultur mit idealer Replikation zugrunde lag. Voraussetzung dafür

war die Annahme, dass ideale Replikation vorlag, wenn die Hälfte des maximalen,

extrapolierten SEAP-Werts in der Plateauphase erreicht wurde (VA50%: virale Aktivität 50%).

Dadurch wurde gewährleistet, dass die Kultur einerseits nicht gesättigt war und andererseits die

SEAP-Aktivität nicht im Hintergrundbereich der SEAP-Messung lag. Im Beispiel (Abb. 9)

zeigte die Kultur mit optimaler Virusreplikation eine SEAP-Aktivität von 6518 RLU und eine

errechnete zugehörige Verdünnung von 26-fach. An Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion)

zeigte die Kultur mit optimaler Virusreplikation eine SEAP-Aktivität von 11938 RLU und eine

zugehörige Verdünnung von 92-fach. Offenbar wurde durch die Virusproduktion innerhalb der

ersten drei Tage bei der Passage mit einer höheren Infektionsdosis als an Tag 0 infiziert.

Demgemäß war für eine ideale Virusreplikation in den Kulturen an Tag sechs meist eine initial

geringere Infektionsdosis als an Tag drei zugrunde liegend. Anders gesagt, wenn die gleiche

Infektionsdosis in den Zellkulturen am Tag 0 und am Tag 3 optimale Replikationsbedingungen

hervorrief, dann war in den Kulturen infiziert mit etwa 92-fach verdünntem Überstand nach

drei Tagen soviel Infektiosität entstanden, die der Infektionsdosis der mit etwa 26-fach

verdünntem Überstand infizierten Kultur am Tag 0 entsprach. In diesem System war eine

Passagierung viraler Überstände in Zellkultur notwendig, da bei der Infektion desselben Virus

mit identischer Infektionsdosis Unterschiede in der absolut erreichbaren Virusreplikation

erzeugt wurden (vgl. Standardabweichungen Abb. 8), welche maßgeblich auf Variabilität der

Zellzahl und den Zustand der infizierten Zellen zurückgeführt werden konnten.

Um zu prüfen, ob bei der Passagierung Verschiebungen in der Quasispezies auftraten, wurden

20 Proben zufällig ausgewählt und die Sequenz der Plasmapopulation mit der Sequenz der

rekombinanten Überstände am letzten Versuchstag der RC-Bestimmung verglichen. In dieser

Untersuchung wurden nur geringe Abweichungen festgestellt, die zumeist an ohnehin

gemischten Sequenzpositionen auftraten (Daten nicht gezeigt).

ERGEBNISSE

47

Abb. 9: Identifikation der Kultur mit optimaler Virusreplikation anhand einer extrapolierten Solver-Kurve. A) Originalwerte und extrapolierte Kurve des nicht resistenten Virus NL4-3 an Tag drei ohne gesättigte Werte. B) Originalwerte für das nicht resistente Virus NL4-3 an Tag sechs (Tag drei nach Überinfektion) ohne gesättigte Werte. Die Grafik steht exemplarisch für 73 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente für NL4-3. RLU: engl.: relative light units; Originalwerte: Mittelwerte der Sechsfachmessung einer jeden Verdünnung; VA50%: virale Aktivität 50%; SEAP: sekretierte alkalische Phosphatase.

16000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

2 4 7 14 27 52 99 192

370

713

1376

2655

5121

9878

1905

6

20000

25000

30000

192

370

713

1376

2655

5121

9878

1905

6

OriginalwerteSolver-Kurve

15000

7 14 27 52 99

0

5000

10000SE

AP

(R

LU)

Verdünnung

SE

AP

(RLU

)

Verdünnung

Tag 6

VA50%

B

A

Tag 3

VA50%


16000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

2 4 7 14 27 52 99 192

370

713

1376

2655

5121

9878

1905

6

20000

25000

30000

192

370

713

1376

2655

5121

9878

1905

6


15000

7 14 27 52 99

0

5000

10000SE

AP

(R

LU)

Verdünnung

SE

AP

(RLU

)

Verdünnung

Tag 6

VA50%

B

A

Tag 3

VA50%


ERGEBNISSE

48

Variationsbreite des Tests zur Bestimmung der Replikationskapazität

Zunächst wurde der Test zur Bestimmung der RC für rekombinante Viren etabliert. Insgesamt

wurden 48 verschiedene Experimente zu Bestimmung der RC von rekombinanten Viren

erfolgreich durchgeführt. In diesen Versuchen wurde das Kontrollvirus 4lig7 insgesamt 68-mal

gemessen und ein Median für dieses Virus von 52 % ermittelt. Ein Versuch wurde als valide

gewertet, wenn mindestens ein Wert des Kontrollvirus 4lig7 in einem Interquartilenbereich

(IQR: engl.: interquarile range) von 0,131 – 0,869, entsprechend der asymmetrischen

Datenverteilung lag, was RC-Werten zwischen 35 % - 77 % entsprach. Diese Kriterien konnten

von 17 Virusüberständen von 4lig7 in elf Versuchen nicht eingehalten werden. Da nicht

auszuschließen war, dass die Messabweichugen des Kontrollvirus auf eine Abweichung des

Referenz-Wildtyp-Virus im entsprechenden Lauf zurückzuführen war, wurde von den 48

Versuchen der Median über den Faktor für das Wildtyp-Virus NL4-3 gebildet, der den Anstieg

der Wildtyp-Aktivität von Tag drei auf Tag sechs wiedergab. Demgemäß war für die optimale

Wildtyp-Virus-Replikation in den Kulturen an Tag sechs im Median eine 10,476-fach

niedrigere Infektionsdosis als an Tag drei notwendig. Mit diesem Wert wurden die tatsächlich

gemessenen Wildtyp-Faktoren über den Anstieg der Aktivität von Tag drei auf sechs aus den

elf Läufen, in denen 4lig7 nicht im IQR zwischen 0,131 – 0,869 lag, ersetzt. Lag der RC-Wert

von 4lig7 nach dieser Korrektur innerhalb des gültigen IQR, wurde für das Wildtyp-Virus der

korrigierte Wert angenommen und der Versuch für alle Isolate als valide gewertet. Insgesamt

wurden sieben Werte in fünf Versuchen (Doppelbestimmung) ersetzt, sechs Versuche wurden

aus der Wertung ausgeschlossen. Eine Probe wurde aufgrund eines singulären, ungewöhnlich

hohen RC-Wert trotz valider Wertung (RC: 3410 %) aus der Auswertung ausgeschlossen.

Insgesamt wurden Messungen von 411 Virusüberständen als valide gewertet, die sich

zusammensetzten aus 279 klinischen Proben, 59 Messungen des resistenten Referenzvirus

4lig7 und 73 Messungen des nicht resistenten Referenzvirus NL4-3.

Um zu prüfen, ob alle validierten RC-Werte für 4lig7 normalverteilt waren, wurden sie

logarithmiert und anschließend der Kolmogorov-Smirnov-Test angewandt. D.h. Werte p < 0.05

stammen sehr unwahrscheinlich aus einer Normalverteilung. Da der Test statistisch nicht

signifikant war (p = 0,2), wies er darauf hin, dass die Daten mit sehr großer Wahrscheinlich

normal verteilt waren.

Der Mittelwert für das Kontrollvirus 4lig7 betrug nach abgeschlossener Validierung in 59

Wertungen 52 % (Min.: 35; Max.: 76). Die Standardabweichung schwankte um den

Faktor 1,27 (Abb. 10).

ERGEBNISSE

49

Abb. 10: Box-Plot über die Verteilung von 59 Replikationskapazitäts-Werten des resistenten Referenzvirus 4lig7. Die Angabe der Y-Achse entspricht Prozentangaben in Abhängigkeit zum Wildtyp-Virus NL4-3. n: Anzahl; die Balkenlänge entspricht dem Interquartilenbereich (25 % Quartile, Median, 75 % Quartile), die vertikale Linie am Balken entspricht dem Interquartilenbereich (5 % Quartile, 95 % Quartile). Um die Variabilität des Testverfahrens anhand von unabhängigen Proben zu beurteilen, wurde

die RC von 15 rekombinanten Virusüberständen in je zwei unterschiedlichen Messungen

bestimmt und eine niedrige Abweichung gefunden (Tab. 8).

Die Virusüberstände von N2D und N3L wurden jeweils in drei unabhängigen Experimenten

bestimmt und mit RC-Ergebnissen, die mit Hilfe eines Koinfektionsverfahrens bestimmt

worden waren, verglichen (Nijhuis et al., 1999) (Tab. 9). Von einem weiteren Klon der im

Koinfektionsversuch stark reduzierte RC aufwies, konnten keine rekombinanten Viren

Tab. 8: Doppelbestimmung von 15 rekombinanten Viren.

Probe KL20 KL37 KL64 KL86 FL3 KV13 KV30 KV31

RC 1 33 % 18 % 12 % 13 % 38 % 18 % 8 % 5 %

RC 2 40 % 41 % 32 % 19 % 74 % 27 % 9 % 3 %

Probe KV47 KV62 KK1 KK2 KK3 KK4 KK7

RC 1 17 % 6 % 5 % 8 % 29 % 33 % 48 %

RC 2 24 % 12 % 9 % 14 % 53 % 49 % 81 %

RC: Replikationskapazität.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1004lig7n = 59

Rep

likat

ions

kapa

zitä

t (%

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1004lig7n = 59

Rep

likat

ions

kapa

zitä

t (%

)

ERGEBNISSE

50

generiert werden, weshalb keine parallelen RC-Werte zu diesem Klon vorliegen. Die beiden

Virusüberstände N2D und N3L wurden jeweils in drei unabhängigen Experimenten bestimmt.

Folgende RC-Einzelwerte konnten ermittelt werden: N3L: 106 %, 142 %, 143 %; N2D: 106 %,

145 %, 101 %.

Tab. 9: Vergleich der Replikationskapazität der Klone N2D und N3L, gemessen im hier vorgestellten Versuch und mit Hilfe eines Koinfektionsversuch.

Probe PR

Mutationen Koinfektions-

Versuch eigene

Methode Stabwn eigene

Methode

N3L 62I, 77I RC: 100% RC: 130 % 19,7 %

N2D 20R, 36I, 54V, 71V, 82T RC: 110% RC: 117 % 1,71 %

RC: Replikationskapazität; Stabwn: Standardabweichung; PR: Protease; Die Ergebnisse des Koinfektionsversuches wurden durchgeführt und beschrieben von Nijhuis et al., 1999.

5.3 Replikationskapazität von Volllänge-Viren

Das Testsystem zur Bestimmung der RC konnte zudem auf die Verwendung von Volllänge-

Viren und non-B-Subtypen hin adaptiert werden. Es wurden drei unabhängige Experimente zur

Bestimmung der RC von Volllänge-Viren durchgeführt. Da die Identifizierung der idealen

Replikationsbedingungen auf der Identifikation der maximal erreichbaren viralen Aktivität

beruht, die PM1-Zellen aber eine geringere Zellteilung als CEMx-174-SEAP-Zellen aufwiesen,

musste der Messzeitpunkt der viralen Replikation auf einen späteren Zeitpunkt verschoben

werden. Zur Validierung wurde in diesen Experimenten neben 4lig7 zusätzlich das

rekombinante Virus N2D bestimmt. Beide Kontrollviren lagen in den Versuchen im validen

Messbereich (Tab. 10). Für die Isolate G und HIV-2 war es möglich, dass innerhalb von vier

Tagen die maximale Aktivität des Indikatorgens erreicht wurde. Dagegen erreichten einige der

Volllänge-Isolate (B, CRF01_AE, O und C) nicht die gewünschte maximale Replikation

innerhalb von vier Kultivierungstagen. Dies lag maßgeblich an sehr niedrigen Virustitern in

den verwendeten Virusüberständen. Auch wenn damit die strengen Validierungsauflagen nicht

erfüllt wurden, konnte für die Kulturen von Subtyp B, CRF01_AE und C anhand der

Kurvenfunktion ein Maximum der Virusreplikation extrapoliert werden. Die errechneten RC-

Werte von Subtyp B (112 %) und Subtyp C (60 %) entsprachen dabei unlängst vergleichbar

publizierten Werten für Isolate dieser Subtypen (Ball et al., 2003; Marozsan et al., 2005; Rubio

et al., 2006).

ERGEBNISSE

51

Tab. 10: Replikationskapazitäts-Werte der getesteten Volllänge-Isolate und rekombinanten resistenten Referenzviren.

Subtyp / Isolat RC 1 ( % ) RC 2 ( % ) RC 3 ( % ) MW RC ( % )

G 104 95 n.d. 99

HIV-2 141 103 n.d. 122

CRF01_AE 203 n.d. n.d. n.d.

C 57 63 n.d. 60

B 112 n.d. n.d. n.d.

4lig7* 52 48 49 50

N2D* 125 124 n.d. 124

* rekombinante resistente Referenzviren; RC: Replikationskapazität; MW: Mittelwert; n.d.: nicht durchgeführt.

5.4 Charakterisierung der Datenbanken

Ergebnisse aus der Geno2RC-Datenbank

Insgesamt umfasst diese Datenbank 279 RC-getestete Proben. Die Verteilung der gemessenen

RC-Werte streute über einen großen Bereich (Min.: 2 %; Max.: 300 %; Median: 41 %;

IQR (25 - 75): 17 % - 76 %). Es konnte aber eine deutliche Häufung von Proben mit niedriger

RC festgestellt werden. Die Verteilung aller RC-Werte wurde in einem Box Plot dargestellt

(Abb. 11). Zur Verteilung der Einzelwerte siehe auch Abb. 16.

Von allen 279 Proben der Geno2RC Datenbank wurden 261 Proben erfolgreich genotypisiert.

Bei den Genotypen wurden neben zahlreichen Mutationen auch folgende Insertionen

festgestellt: In der PR trat in vier Proben die Insertion 31IF auf und in der RT traten insgesamt

in neun Proben die Insertionen 1 x 63(K/N)(K/N), 1 x 64R, 1 x 65KGSNR, 2 x 66ST,

3 x 68SC, 1 x 69KREKTSE auf. Für 92 Proben konnten zusätzlich Sequenzanalysen aus dem

gag-Anteil der rekombinanten Viren durchgeführt werden. Der Anteil an Insertionen in gag

war sehr hoch. Es konnten insgesamt 28 Insertionen von zwei bis zu 13 Aminosäuren gefunden

werden. Unter den genotypisierten Proben fanden sich insgesamt 59 Proben ohne primäre

Resistenz-assoziierte Mutationen (Min.: 5 %; Max.: 300 %; Median: 56 %; IQR (25 - 75):

31 % - 101 %).

ERGEBNISSE

52

Abb. 11: Box Plot über die Verteilung von 279 Replikationskapazitäts-Werten für Proben der Geno2RC-Datenbank. Die Angabe der Y-Achse entspricht RC-Prozentangaben in Abhängigkeit zum Wildtyp-Virus NL4-3. n: Anzahl. * Extremfälle die mehr als Faktor drei vom Interquartilenbereich abweichen; U Ausreißer zwischen Faktor 1,5 und drei vom Interquartilenbereich abweichen; die Balkenlänge entspricht dem Interquartilenbereich (25 % Quartile, Median, 75 % Quartile), die vertikale Linie am Balken entspricht dem Interquartilenbereich (5 % Quartile, 95 % Quartile).

Abb. 12: Eine lineare Regressionsanalyse ergab eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl an primären Resistenz-assoziierten Mutationen und der RC. RC: Replikationskapazität;

Alle anderen 220 Proben wiesen mindestens eine primäre Resistenz-assoziierte Mutation auf

(Min.: 2 %; Max.: 292 %; Median: 34 %; IQR (25 - 75): 15 % - 68 %). Mit Hilfe einer linearen

Regressionsanalyse konnte eine hoch signifikante Korrelation zwischen der Anzahl an

primären Resistenz-assoziierten Mutationen und der RC festgestellt werden (p < 0,001;

p < 0,001R2: 0,071

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Anzahl primärer Resistenz-assoziierter Mutationen

RC

(%)

p < 0,001R2: 0,071

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10 12 14 16


RC

(%)

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10 12 14 16


RC

(%)

0

100

150

200

300

I

II

I

I

I

I

I

S

SS

250

allen = 279allen = 279

Rep

likat

ions

kapa

zitä

t(%

)

50

0

100

150

200

300

I

II

I

I

I

I

I

S

SS

250

allen = 279allen = 279

Rep

likat

ions

kapa

zitä

t(%

)

50

ERGEBNISSE

53

R2: 0,071. Dabei war die RC umso niedriger, je höher die Anzahl an primären Resistenz-

assoziierten Mutationen war (Abb. 12).

Außerdem wurde anhand der genotypischen Sequenzinformation der Subtyp der Proben

vorhergesagt (Geno2Pheno.org). Im gesamten Datensatz waren 53 non-B-Subtypen vorhanden.

Diese ließen sich folgenden Subtypen zuordnen: 2 x A1, 1 x A2, 14 x C, 9 x D, 1 x F1, 1 x F2,

2 x G, 1 x H, 1 x 05_DF, 1 x 14_BG, 3 x 01_AE, 4 x 02_AG, 2 x 06_CPX, 3 x 09_CPX,

2 x 11_CPX, 2 x 13_CPX, 4 x CRF10_CD. Zusätzlich wurden für insgesamt 18 Medikamente

erfolgreich phänotypische Resistenztestungen durchgeführt (Tab. 11).

Tab. 11: Anzahl der Phänotypisierungen, je Medikament aus der Geno2RC-Datenbank.

PI IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV

Anzahl 247 249 250 249 238 234 234 RTI ZDV DDI D4T FTC ABC TDV NVP EFV DLV 3TC DDC

Anzahl 251 252 251 19 251 239 251 250 252 195 17

PI: Protease-Inhibitor, RTI: reverser Transkriptase-Inhibitor, Abkürzungen der Medikamente, s. Anhang.

Ergebnisse aus den Daten der CAT-Datenbank

Insgesamt umfasst diese Datenbank 544 Datensätze von 21 Patienten. Die Angaben zum

Interquartilenbereich (25 % Quartile, Median, 75 % Quartile) über die VL, RC, CD4- und

CD8-Werte je Patient befinden sich im Anhang in Tab. 34. 170 Proben wurden genotypisiert.

144 Proben wurden mit ViroSeq sequenziert, 68 Proben mit TrueGene. Davon wurden

26 Proben parallel mit beiden Sequenzier-Methoden bestimmt und vergleichbare Ergebnisse

erzeugt (Daten nicht gezeigt). In der CAT-Datenbank waren die HIV-Sequenzen von

19 Patienten dem Subtyp B zuzuordnen und jeweils bei einem Patienten den Subtypen

CRF10_CD und C. Bei den Genotypen wurden in der PR in sechs Proben eines Patienten die

Insertionen 33IF festgestellt. In der RT wurde in sieben Proben eines Patienten die Insertionen

68AV nachgewiesen. Von 67 Proben wurde die RC getestet (Min.: 2 %; Max.: 102 %; Median:

21 %; IQR (2 - 75): 12 % - 34 %). Zusätzlich wurden je nach Medikament zwischen 14 und

109 Phänotypisierungen durchgeführt (Tab. 12).

ERGEBNISSE

54

Tab. 12: Anzahl der Phänotypisierungen, je Medikament aus der CAT-Datenbank.

PI IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV

Anzahl 103 109 108 108 105 108 109 RTI ZDV DDI D4T FTC ABC TDV NVP EFV DLV 3TC DDC

Anzahl 109 109 109 49 108 109 103 109 108 14 77

PI: Protease-Inhibitor, RTI: reverser Transkriptase-Inhibitor, Abkürzungen der Medikamente, s. Anhang.

Außerdem wurden die RC- und die RF-Werte für 112 Proben vom Genotyp vorhergesagt

(geno2pheno.org). Die Auflistung der vorhergesagten Konfidenzintervalle für RF- und RC-

Werte je Patient, befinden sich im Anhang in Tab. 35.

Durch die stichprobenartige Bestimmung der Medikamentenspiegel von insgesamt 39 Proben

aus der CAT-Studie konnte festgestellt werden (Tab. 13), dass die Patienten 5 und 8 zu jeweils

einem Zeitpunkt andere Medikamente eingenommen hatten als vom Arzt verordnet worden

waren. Zusätzlich konnten in allen untersuchten Proben erhöhte Triglyceridspiegel festgestellt

werden. Diese liefern einen zusätzlichen indirekten Hinweis, dass Medikamente eingenommen

worden waren.

Tab. 13: Anzahl der Medikamentenspiegel-Bestimmungen je Medikament.

PI IDV SQV RTV APV LPV

Anzahl 5 33 37 8 32

RTI 3TC ABC TDV FTC NVP

Anzahl 41 27 23 3 1

PI: Protease-Inhibitor, RTI: reverser Transkriptase-Inhibitor, Abkürzungen der Medikamente s. Anhang.

Ein Patient musste aus den Analysen ausgeschlossen werden, weil er nicht den

Einschlusskriterien der Studie entsprach (weniger als zwei Klassen-Resistenz). Zudem wurden

von 516 Proben die CD4-Zellzahl (Min.: 3, Max.: 690) und von 494 Proben die CD8-Zellzahl

(Min.: 69, Max.: 4340) sowie von 511 Proben die VL bestimmt (Min.: 50, Max.: 772100). Die

Ausgangs-Charakteristiken der Studien-Patienten hinsichtlich der Parameter VL, CD4- und

CD8-Zellzahlen sind in Abb. 13 dargestellt. Bei vier Patienten (Patient 1, 2, 3 und 18) lagen zu

Studienbeginn keine CD8-Zellzahlen vor.

ERGEBNISSE

55

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Patient

CD

4- u

nd

CD

8-Z

ellz

ahl

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

VL

(lo

g)

CD4CD8VL

Abb. 13: Ausgangs-Verteilung von VL, CD4- und CD8-Zellzahl je Patient zu Studienbeginn. Von den Patienten 1, 2, 3 und 18 wurde zu Studienbeginn keine CD8-Zellzahl bestimmt. VL: Viruslast; CAT: engl.: continuously alternating therapy. Häufigkeitsverteilungen der ermittelten Resistenzfaktoren (RF) aus dem CAT- und Geno2RC-Datensatz

Eine Häufigkeitsverteilung der gemessenen Resistenzfaktoren aus den phänotypischen

Analysen ergab je Medikament ein spezifisches Muster, wobei RF-Werte die um 1 verteilt

liegen, als suszeptibel eingestuft werden und RF-Werte, die weit über 1 verteilt liegen, auf

Resistenz hinweisen. Dazwischen treten selten Werte auf. FTC und DDC wurden aus dieser

Analyse für die Geno2RC-Datenbank ausgeschlossen, da eine Verteilung bei 17 bzw. 19

Werten nicht aussagekräftig war. Für die Medikamente IDV, SQV, RTV NLV, APV, LPV,

ATV, AZT, ABC, DLV, NVP, EFV, 3TC wurde eine zweigipflige Verteilung ermittelt

(Abb. 14, im Anhang Abb. 29), wohingegen sich für die Medikamente DDI, D4T und TDV

nur eine eingipflige Verteilung ergab (Abb. 15, im Anhang Abb. 28). Dennoch kann man

selbst innerhalb der eingipfligen Verteilungen erkennen, dass die RF für die Proben aus der

CAT-Studie im Vergleich zu Proben aus der Geno2RC-Datenbank deutlich höher waren.

Proben aus der CAT-Studie wiesen erwartungsgemäß nahezu ausschließlich hohe RF auf, was

auf die Einschlusskriterien der Studie zurückzuführen ist.

ERGEBNISSE

56

IDV

02468

101214161820

0,16

0,25 0,

4

0,6

1,0

1,6

2,5

4,0

6,3 10 16 25 40 63 100

158

251

398

631

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

Abb. 14 Zweigipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben aus der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von Indinavir (IDV). Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy; Häufigkeitsverteilung der Resistenzfaktoren für die Medikamente SQV, RTV NLV, APV, LPV, ATV, AZT, ABC, DLV, NVP, EFV, 3TC und deren Abkürzungen s. Anhang.

ddI

05

1015202530354045

0,25

0,32 0,

40,

50,

60,

81,

01,

31,

62,

02,

53,

24,

05,

06,

37,

9 10 13 16 20 25

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

Abb. 15: Eingipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von Didanosine (DDI). Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy; Häufigkeitsverteilung der Resistenzfaktoren für die Medikamente D4T und TDV s. Anhang.

ERGEBNISSE

57

5.5 Identifikation Replikationskapazitäts-assoziierter Mutationen

5.5.1 Univariate Analyse

Einfluss von Mischungen an Sequenzpositionen auf die Ergebnisse aus der univariaten Analyse

Die univariate Analyse wurde für 261 Daten aus der Geno2RC-Datenbank durchgeführt. Die

wichtigsten Mutationen dieser Liste dienten als Marker für veränderte RC einer Probe im

Vergleich zum Wildtyp NL4-3.

Um den Einfluss der Mischpopulationen herauszufinden, wurden die Ergebnisse der drei

univariaten Analysen A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen B)

unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil

besitzen C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen für die ersten 25

gelisteten Mutationen verglichen. Mutationen, die sehr geringen Einfluss auf die RC besitzen

sollten, wurden weiter unten in der Rangfolge gelistet und sollten nur einen geringen Einfluss

auf die Veränderung der RC haben. Mutationen, deren Vorhandensein in der bioinformatischen

Analyse auf einen höheren RC-Wert der Probe im Vergleich zu der nicht mutierten Sequenz

von HXB2 schließen lässt, sind fett markiert. In den Spalten des Positionsvergleiches ist

angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der

zweiten Analyse positioniert ist. So wurde beispielsweise die Mutation RT:T39E in Analyse A

auf Platz zwei gefunden und in Analyse C auf Platz neun. In der Spalte des

Positionsvergleiches A - C ist deshalb die Zahl neun eingetragen. Wurde eine Mutation im

Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden, ist dies mit

„fehlt“ gekennzeichnet.

Die drei Einzelanalysen waren sehr gut miteinander vergleichbar. Innerhalb der ersten

25 Ränge aus allen drei Analysen fanden sich jeweils mindestens 21 übereinstimmende

Mutationen. Die Unterschiede im jeweiligen Rang sind in Tab. 14 dargestellt. Dabei

unterschieden sich die Ränge in Analyse A zu B im Median um 1,5 die Ränge in Analyse A zu

C im Median um 2,0 und die Ränge in Analyse B zu C im Median um 1,0 Rangplätze. Die

maximale Verschiebung betrug 11 Rangplätze und trat bei der Mutation PR:E65D zwischen

Analyse A und B auf.

ERGEBNISSE

58

Tab. 14: Analyse des Einflusses von Mischungen an Sequenzpositionen anhand der Verschiebung der Ränge. Untersucht wurden die Top-25-Mutationen aus der univariaten Analyse anhand von 261 Proben des Geno2RC-Datensatzes.

Geno2RC (261) A B C Positionsvergleich

Rang Gen Mutation Gen Mutation Gen Mutation A – B A – C B – C

1 PR L90M PR L90M PR L90M 1 1 1 2 RT T39E RT T39E RT D67N 2 9 9 3 RT D67N RT D67N PR I72L 3 2 2 4 RT E79D RT T215Y RT T215Y fehlt fehlt 4 5 RT T215Y RT Y188L RT Y188L 4 4 5 6 RT Y188L RT A98G RT A98G 5 5 6 7 RT A98G PR V82A PR V82A 6 6 7 8 PR V82A PR I72L PR G73T 7 7 3 9 PR I72L PR E65D RT T39E 8 3 10 10 RT K219R PR I54V PR E65D 19 19 11 11 RT L210W PR G73T PR I54V 14 14 8 12 PR I54V PR I93L PR I93L 10 11 12 13 PR G73T PR G48M PR L24F 11 8 15 14 PR I93L RT L210W RT L210W 12 12 14 15 PR G48M PR L24F PR G48M 13 15 13 16 PR L24F RT V118I RT Q207E 15 13 17 17 RT R172K RT Q207E RT V118I 23 24 16 18 RT Q207E RT T139K PR K20I 17 16 21 19 RT T139K RT K219R RT K219R 18 21 19 20 PR E65D RT M41L RT E122K 9 10 22 21 PR I72V RT E122K RT T139K fehlt fehlt 20 22 RT V118I RT E40F RT M41L 16 17 23 23 RT M41L RT R172K RT E40F 20 22 24 24 RT V75I PR K20I RT R172K fehlt fehlt 18 25 RT E40F PR S37D PR I54T 22 23 fehlt

Mutationen, die in der bioinformatischen Analyse auf Viren mit höherer RC als Wildtyp hinweisen sind fett gedruckt. In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der zweiten Analyse positioniert ist. Mutationen, die in der Listung der ersten 25 Positionen in der Vergleichs-Listung nicht vorkommen wurden mit „fehlt“ markiert. A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, B) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil besitzen, und C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

In allen drei Einzelanalysen wurde die Mutation PR:L90M an erster Position identifiziert.

Diese Mutation konnte dabei als wichtigste Indikatormutation für verringerte RC, die PR-

Mutation 65D als wichtigste Indikatormutation für erhöhte RC einer Probe bestimmt werden.

ERGEBNISSE

59

Unter den ersten 25 Positionen in allen drei Analysen wurden insgesamt vier Mutationen

identifiziert, deren singuläres Vorhandensein auf einen höheren RC-Wert der Probe im

Vergleich zum Wildtyp schließen ließ. Es handelte sich dabei um die Mutationen PR:K20I,

PR:E65D und RT:Q207E, RT:E122K, wobei die Mutation PR:E65D allen drei Analysen

gemeinsam war.

Einfluss von gag-Mutationen auf die Ergebnisse aus der univariaten Analyse

Alle drei univariaten Einzelanalysen (A, B und C) wurden anhand von 92 Proben des

Geno2RC-Datensatzes, der zudem einen gag-Sequenzanteil besaß, wiederholt. Es sollte

untersucht werden, inwiefern sich gag-Mutationen unter den ersten Rängen einordnen.

Innerhalb der ersten 25 Positionen aus allen drei Analysen fanden sich jeweils mindestens 21

übereinstimmende Mutationen. Die Unterschiede in der Positionierung sind in Tab. 15

dargestellt. Dabei unterschieden sich die Rangplätze in Analyse A und B im Median um 4,0

Positionen, die Rangplätze in Analyse A und C im Median um 4,0 Positionen und die

Rangplätze in Analyse B und C im Median um 1,0 Positionen. Die maximale Verschiebung

betrug elf Positionen und trat bei der Mutation RT:R172K zwischen Analyse A und B auf. Die

zuvor auf dem ersten Rang gelistete Mutation PR:L90M wurde unter Einbezug der gag-

Sequenzen von Rang 1 auf die Ränge 14 (A) und 10 (B, C) verdrängt. Stattdessen wurden die

Mutationen RT:T39E (A) und PR:I72L (B, C) auf Rang eins gelistet. Es wurden insgesamt

innerhalb der ersten 25 Ränge folgende fünf gag-Mutationen unter den wichtigsten

identifiziert: Gag:A431V, Gag:F463V, Gag:E468K, Gag:E477G und Gag:I479V. Allen drei

Analysen gemeinsam waren dabei die Mutationen Gag:E477G, Gag:I479V. Keine der

wichtigsten gag-Mutationen aus den Top-25 Mutationen dieser Analyse wies auf erhöhte RC

im Vergleich zum Wildtyp HXB2 hin.

ERGEBNISSE

60

Tab. 15: Analyse des Einflusses von Gag-Mutationen anhand der Verschiebung der Ränge. Untersucht wurden die Top-25-Mutationen aus der univariaten Analyse von 92 Proben anhand des Geno2RC- Datensatzes.

Geno2RC (92) A B C Positionsvergleich

Position Gen Mutation Gen Mutation Gen Mutation A – B A – C B – C

1 RT T39E PR I72L PR I72L 2 5 1

2 PR G73T RT T39E PR G73T 3 2 5

3 PR I72L PR G73T GAG E477G 1 1 2

4 GAG E477G GAG E477G RT A98G 4 3 3

5 RT A98G RT A98G RT T39E 5 4 4

6 RT Y181C GAG I479V GAG I479V 13 11 6

7 GAG I479V RT D67N RT D67N 6 6 7

8 RT E79D PR I62V PR I62V fehlt fehlt 8

9 RT I178M PR I93L PR I93L 15 16 9

10 RT D67N PR L90M PR L90M 7 7 10

11 RT K219R RT T39A RT Y181C 16 20 fehlt

12 PR I93L RT T215Y RT M41L 9 9 18

13 RT R172K RT Y181C PR L10I 23 24 11

14 PR L90M RT M41L GAG F463V 10 10 12

15 PR I62V RT I178M RT L210W 8 8 16

16 RT T39A RT K219R RT I178M 11 fehlt 20

17 RT T215Y GAG F463V GAG A431V a 12 18 14

18 RT V75I RT L210W RT T215Y fehlt fehlt 15

19 PR L24F GAG A431V a PR I64V fehlt fehlt 17

20 RT M41L PR I64V RT K219R 14 12 19

21 GAG F463V RT V179I RT V179I 17 14 21

22 PR I64V RT Y188L RT Y188L 20 19 22

23 RT L210W RT R172K RT E122K 18 15 24

24 GAG A431V a PR G48M RT R172K 19 17 fehlt

25 RT Y188L GAG E468K GAG E468K 22 22 25

Mutationen, die in der bioinformatischen Analyse auf Viren mit höherer RC als diejenige des Wildtyp-Referenzvirus hinweisen, sind fett gedruckt. In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der zweiten Analyse positioniert ist. Mutationen, die in der Listung der ersten 25 Positionen in der Vergleichs-Listung nicht vorkommen, wurden mit „fehlt“ markiert. A) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, B) unter Berücksichtigung aller Mischungen an Sequenzpositionen, die keinen Wildtyp-Anteil besitzen, und C) unter Ausschluss von allen Mischungen an Sequenzpositionen; a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einer anderen Analyse nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

61

5.5.2 Multivariate Analyse

Support Vector Machines

In Tab. 16 wurden exemplarisch die Mutationen der ersten 25 Positionen aus den drei

Analysen, 261 Proben ohne gag-Mutationen, 92 Proben ohne gag (92_oG) Mutationen, sowie

das 92er Datenset unter Einbezug der gag-Informationen (92_mG) unter Berücksichtigung aller

Mischungen und mit allen Mutationen im Kontext verglichen und deren Einfluss auf Resistenz

hin begutachtet. Innerhalb der ersten 25 Positionen aus den drei verschiedenen Analysen

wurden in der PR drei und in der RT neun mit primärer Resistenz-assoziierte Mutationen

festgestellt (Johnson et al., 2006). Allen drei Analysen gemeinsam war die mit primärer

Resistenz-assoziierte Mutationen RT:Y181C, die in der Analyse mit SVM mit einem positiven

Einfluss auf RC gekoppelt war. Außerdem wurde festgestellt, dass die Mutationen Gag:I437V

und Gag:S451N in den Gag-Spaltstellen p7 / p1 bzw. p1 / p6 liegen. Berücksichtigte man

zusätzlich zu den primären Resistenz-assoziierten Mutationen die sekundären Mutationen, so

konnte man zusätzlich 12 Mutationen in der PR identifizieren. In allen drei Analysen wurden

die sekundären Mutationen die Mutationen PR:L10I und PR:G73T als relevant erkannt.

Entscheidungswälder

Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung der Wertigkeit von AS-Positionen aus

Sequenzinformation für Funktionen stellen die Entscheidungswälder dar. In Analogie zu den

SVM, wurden dieselben drei Datensätze aus der Geno2RC-Datenbank verwendet. Auch hier

wurden exemplarisch die Mutationen der ersten 25 Positionen aus allen drei Analysen

verglichen (Tab. 17). Mit maßgeblichem Einfluss auf die RC konnten sowohl in der PR, als

auch in der RT sieben gemeinsame Aminosäure-Positionen unter den ersten 25 Rängen

identifiziert werden. PR:54, PR :71, PR :72, PR :73, PR :82, PR:90, RT:39, RT:67, RT :98,

RT:122, RT:162, RT:210 und RT:215.

ERGEBNISSE

62

Tab. 16: Multivariate Analyse des Einflusses von Mutationen auf die Replikationskapazität mittels Support Vector Machines mit und ohne Berücksichtigung der gag-Sequenzinformationen.

Positionsvergleich

SVM 261 92_oG 92_mG 261 261 92_oG

Rang Gen Mut. Gen Mut. Gen Mut. 92_oG 92_mG 92_mG

1 RT Y181C* RT D67N* RT Y181C* 11 1 fehlt

2 RT Q207E PR I62V* RT I178M fehlt 14 fehlt

3 RT T215Y* PR L90M* RT E122K 8 fehlt fehlt

4 PR V82A* RT M41L* PR L10I* fehlt 11 fehlt

5 RT K70R* RT D177E Gag R490K fehlt fehlt 18

6 PR K20I* PR I93L* RT L74V* fehlt fehlt 15

7 PR L10I* PR L63P* Gag I479V 20 4 fehlt

8 RT T39E RT T215Y* PR I64V* 23 fehlt fehlt

9 PR L63P* PR G73T* RT K20R 7 fehlt 21

10 PR L90M* PR A71V* RT G190A* 3 fehlt fehlt

11 RT Y188L* RT Y181C* PR V82A* 21 fehlt 1

12 PR E65D RT V179I RT T139K fehlt fehlt fehlt

13 RT A98G RT L210W* Gag P473S 16 fehlt fehlt

14 PR I15V* PR I72L RT Q207E fehlt fehlt fehlt

15 RT L74V* RT V118I PR I93L* fehlt 6 fehlt

16 PR I54V* RT A98G Gag E477G fehlt fehlt fehlt

17 PR L10F* RT D123E RT D123E fehlt 25 17

18 RT E122K RT K219R RT D177E 24 3 24

19 RT V35M PR I64V* Gag I437V a fehlt fehlt 8

20 PR I13V* PR L10I* Gag K475R fehlt fehlt 4

21 PR L19I RT Y188L* PR G73T* fehlt fehlt fehlt

22 PR L10V PR M46I* Gag S451N°a fehlt fehlt fehlt

23 PR G73T* RT T39E RT D123N 9 21 fehlt

24 RT T139K RT E122K RT K219R fehlt 12 3

25 PR L24F RT V60I PR L10F* fehlt fehlt fehlt * Mutationen, die als Resistenz-assoziiert beschrieben sind nach Johnson et al., 2006 (Johnson et al., 2006: 16946457); Mutationen (Mut.), die auf Viren mit höherer RC als Wildtyp hinweisen, sind fett gedruckt In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der Zweitgenannten Analyse positioniert ist. 92_oG : 92 Proben ohne gag, 92_mG : 92 Proben mit gag. SVM: Support Vector Machines, a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1, ° Position liegt in der Spaltstelle p1 / p6; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einem anderen Datensatz nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

63

Tab. 17: Analyse des Einflusses von Mutationen auf die Replikationskapazität über Entscheidungswälder Machines mit und ohne Berücksichtigung der gag-Sequenzinformationen.

EW 261 92_oG 92_mG Positionsvergleich

Rang Gen AS-

Position Gen AS-

Position Gen AS-

Position 261-

92_oG 261-

92_mG 92_oG-92_mG

1 PR 82 PR 82 PR 72 1 13 13

2 RT 215 RT 215 Gag 479 2 11 11

3 RT 39 RT 39 PR 73 3 4 4

4 PR 63 RT 245 RT 39 6 fehlt fehlt

5 RT 245 PR 72 RT 67 4 fehlt 1

6 RT 67 PR 63 RT 98 7 5 fehlt

7 PR 90 RT 67 Gag 477 8 12 5

8 PR 72 PR 90 RT 219 5 1 12

9 RT 210 PR 54 RT 41 13 18 19

10 RT 98 RT 207 PR 93 11 6 fehlt

11 RT 139 RT 98 RT 215 15 fehlt 6

12 RT 207 PR 65 PR 90 10 fehlt fehlt

13 PR 54 RT 210 PR 82 9 19 18

14 PR 20 PR 20 RT 188 14 fehlt fehlt

15 PR 65 RT 139 RT 181 12 fehlt fehlt

16 RT 219 RT 35 PR 10 fehlt 8 fehlt

17 RT 188 PR 93 PR 62 fehlt 14 10

18 PR 24 PR 24 RT 210 18 fehlt fehlt

19 PR 93 RT 122 PR 54 17 10 23

20 PR 71 PR 10 RT 179 21 24 16

21 RT 35 PR 71 RT 162 16 fehlt 24

22 RT 162 RT 184 RT 123 25 21 fehlt

23 PR 73 PR 73 RT 122 23 3 3

24 PR 37 RT 181 PR 71 fehlt fehlt 15

25 RT 122 RT 162 PR 77 19 23 21 In den Spalten des Positionsvergleiches ist angegeben, an welchem Rangplatz die jeweilige Mutation der erstgenannten Analyse in der Zweitgenannten Analyse positioniert ist. 92_oG : 92 Proben ohne Einbezug der gag-Informationen, 92_mG : 92 Proben mit gag-Informationen. EW: Entscheidungswälder; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Mutation wurde im Vergleich mit einem anderen Datensatz nicht unter den Top-25-Mutationen gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

64

Gegenüberstellung von Replikations-beeinflussenden gag-Mutationen, identifiziert mittels Support Vector Machines und Entscheidungswäldern

In Tab. 18 sind die Top-20 gag-Mutationen in der Übersicht dargestellt, die in den SVM und

den EW den größten Einfluss auf die RC besitzen (92 Daten).

Tab. 18: Vergleich der Top-20-Gag-Positionen. Analysiert wurden dazu 92 Proben, die mit Hilfe von Entscheidungswäldern und Support Vector Machines analysiert wurden.

92 EW_mG SVM 92_mG

Rang gag-AS Position Rang Mutation Positionsvergleich

2 479 5 R490K 2

7 477 7 I479V 4

27 463 13 P473S fehlt

30 468 16 E477G fehlt

35 460 19 I437V a fehlt

36 441 20 K475R 9

39 431? 22 S451N b 10

40 469 34 I479T fehlt

44 487 36 Y441N fehlt

46 451? 40 A431V a 7

49 473 51 L449F b 3

57 436? 54 P478L 19

62 ins 56 S451T b fehlt

63 428? 61 V467E 18

64 471 73 R464K fehlt

65 478 86 K481E 12

74 490 87 P473L 1

82 470 88 E428A a fehlt

85 464 91 K436R a 15

88 449? 94 N495S 11 Fett gedruckt sind Mutationen in den SVM, die auf Viren mit erhöhter RC im Vergleich zu Wildtyp hinweisen. In den Entscheidungswäldern ist keine Angabe von AS möglich. Daher werden einige Mutationen in den SVM öfter unter den ersten 20 Mutationen gelistet. Mutationen, die auf erhöhte RC im Vergleich zum Referenzvirus HXB2 hinweisen sind fett gedruckt. EW; Entscheidungswälder; VM: Support Vector Machines; a Position liegt in der Spaltstelle p7 / p1; b Position liegt in der Spaltstelle p1 / p6; gag: engl.: group specific antigen; fehlt: diese Gag-Position wurde nur unter den Top-20Gag-Positionen einer der Analysen mittels SVM oder EW gefunden; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

65

Über den Rang ist angegeben, an welcher Position in der Liste die Mutation vorkam. Für die

Entscheidungswälder ist dabei die jeweilige Position der veränderten Aminosäure gelistet, für

die SVM der entsprechende Aminosäure-Austausch. Es konnten 12 übereinstimmende

Aminosäure-Positionen in den Top-20 gag-Mutationen beider Listen gefunden werden. Es

handelt sich dabei um die Positionen: Gag:428, Gag:431, Gag:436, Gag:441, Gag:449,

Gag:451, Gag:464, Gag:473, Gag:477, Gag:478, Gag:479 und Gag:490. In dieser Analyse

wurden verschiedene Aminosäure-Positionen identifiziert, die in den gag-Spaltstellen liegen.

Zu den Positionen in der p1 / p6 Spaltstelle (443 - 453) gehören: Gag:449 und Gag: 451. Zu

den Positionen in der p7 / p1 Spaltstelle (428 - 437) gehören: Gag:428, Gag:431, Gag:436

sowie Gag:437. Mutationen in den Spaltstellen sind als kompensatorische RC-Mutationen

beschrieben worden (Zhang et al., 1997). Außerhalb dieser beiden Schnittstellen wurde die

Mutation Gag:I479V als Therapie-assoziiert beschrieben (Peters et al., 2001).

Identische Replikationskapazitäts-assoziierte Mutationen aus univariater- und multivariater-Analyse

Um abschätzen zu können, welche der RC-assoziierten Mutationen aus der univariaten

Analyse, den SVM und EW mit dem niedrigsten Fehler RC-assoziierte Mutationen darstellen,

wurden die ersten 25 Mutationen aus der univariaten Analyse unter Einbezug aller Mischungen

mit den ersten 25 Mutationen der SVM und EW verglichen. Dabei wurde einerseits der große

Datensatz mit 261 Datenpaaren ohne gag-Mutationen und andererseits der kleine Datensatz mit

92 Datenpaaren inklusive gag-Mutationen verglichen. Die Mutationen, die in der univariaten

Analyse als wichtigste eingestuft wurden, stimmten zu einem erheblichen Anteil mit der Liste

der Mutationspositionen aus den EW überein. Weniger Übereinstimmungen konnten dagegen

beim Vergleich der wichtigsten Mutationen aus der univariaten Analyse mit den SVM

gefunden werden. Da hier nur die wichtigsten 25 Positionen untersucht wurden, ist

anzumerken, dass RC-assoziierte Mutationen in den verschiedenen Analysen auch in den

Positionen unterhalb der ersten 25 Listenplätze durchaus hoch identisch waren, wobei der

Abstand der Rangplätze in verschiedenen Analysen aber etwas größer war, was unter anderem

an der verschiedenen Anzahl an Rangplätzen in den unterschiedlichen Analysen lag. So

enthielt der Datensatz 261 ohne Gag in der Analyse mittels SVM 1435 Rangplätze und in der

Analyse mittels EW 404 Rangplätze, der Datensatz 92 mit Gag in der Analyse mittels SVM

717 Rangplätze und in der Analyse mittels EW 349 Rangplätze.

ERGEBNISSE

66

Im kleinen Datensatz mit gag (92) stimmten folgende sechs Mutationen im Vergleich der Top-

25 Mutationen aus univariater Analyse, SVM und EW überein: GAG:E477G, GAG:I479V,

PR:G73T, PR:I93L, RT:Y181C, RT:K219R. Im großen Datensatz (261) stimmten im

Vergleich die 12 Mutationen PR:L24F, PR:I54V, PR:E65D, PR:G73T, PR:V82A, PR:L90M,

RT:T39E, RT:A98G, RT:T139K, RT:Y188L, RT:Q207E, RT:T215Y überein. Einzig die

Mutation PR:G73T konnte im Vergleich der univariaten Analyse mit SVM und EW sowohl im

großen, als auch im keinen Datensatz unter den Top-25-Mutationen identifiziert werden.

Mutationen, die sowohl in der univariaten Analyse als auch in über SVM und EW unter den

Top-25-Mutationen im kleinen, oder im großen Datensatz identifiziert wurden, sind in Tab. 19

dargestellt. Zusätzlich ist in dieser Tabelle angegeben, wie viele Proben im großen Datensatz

die jeweilige Mutation aufwiesen und in wie vielen Proben an dieser AS-Position die Wildtyp-

AS vorlag. In den übereinstimmenden RC-assoziierten Mutationen aus der univariaten

Analyse, SVM und EW wurden interessanterweise bereits zuvor viele der identifizierten

Mutationen als Resistenz-assoziiert, RC-assoziiert oder als Polymorphismen beschrieben

(Tab. 19). Bei einer Mutation handelt es sich um einen Polymorphismus, wenn eine Mutation

auch in therapienaiven Patienten auftritt.

Da die Stanford HIV Drug Resistance Database einen sehr großen Datensatz verfügt

(8426 Proben von 5867 Patienten), konnten mit Hilfe der über das Internet frei zugänglichen

Datenbank die von uns identifizierten Mutationen PR:L24F, PR:E65D, RT:T39E, RT:T139K

und RT:Q207E als Polymorphismen identifiziert werden (http://www.hivdb.stanford.edu/). Des

Weiteren wurde für die Mutation Gag:I479V beschrieben, dass sie innerhalb eines Gag-Epitops

liegt, welches Hinweise auf die Rolle dieser Mutation im Kontext der Immunabwehr liefert

(Geldmacher et al., 2007).

Zu den mit primärer Resistenz-assoziierten Mutationen gehören die PR-Mutationen: PR:V82A,

PR:L90M, und die RT-Mutationen: RT:Y181C, RT:Y188L, RT:T215Y, zu den mit sekundärer

Resistenz-assoziierten Mutationen die PR-Mutationen: PR:I54V, PR:G73T und PR:I93L

(Stanford Drug Resistance Database); (Berkhout et al., 2006; Cabana et al., 1999; Gallego et

al., 2001; Johnson et al., 2006; Peters et al., 2001). In Zusammenhang mit verminderter RC

wurden die Mutationen PR:I54V, PR:V82A, PR:L90M, PR:I93L, Y188L und RT:T215Y

beschrieben, in Zusammenhang mit erhöhter RC die Mutation RT:Y181C (Andreoni, 2004;

Barbour et al., 2002; Charpentier et al., 2004; Goudsmit et al., 1997; Harrigan et al., 1998; Iga

et al., 2002; Iglesias-Ussel et al., 2002; Isaguliants et al., 2004; Kosalaraksa et al., 1999;

ERGEBNISSE

67

Martinez-Picado et al., 1999; Menzo et al., 2003; Nicastri et al., 2003; Picchio et al., 2000;

Prado et al., 2004; Weber et al., 2003).

Tab. 19: Übersicht der wichtigsten Replikationskapazitäts-assoziierten Mutationen, identifiziert über univariate Analyse, SVM und EW mit zusätzlicher Charakterisierung dieser Mutationen aus der Literatur.

Gen Mutation Proben mit

WT AS Proben mit

mut AS RC Resistenz Poly-

morphismus

Gag E477G 76 14 - ja -

Gag I479V 49 16 - ja -

PR L24F 237 9 - - ja

PR I54V° 155 87 ja ja -

PR E65D 254 9 - - ja

PR G73T° 219 20 - ja -

PR V82A* 153 63 ja ja -

PR L90M* 159 107 ja ja -

PR I93L° 149 114 ja ja -

RT T39E 181 20 - - ja

RT A98G 208 33 - ja -

RT T139K 250 7 - - ja

RT Y181C* 224 36 ja ja -

RT Y188L* 231 25 ja ja -

RT Q207E 172 68 - ja ja

RT T215Y* 100 136 ja ja -

RT K219R 172 28 - ja - * primäre Resistenz-assoziierte Mutationen und ° sekundäre Resistenz-assoziierte Mutationen nach Johnson et al., 2006; Polymorphismen wurden mit Hilfe der Stanford HIV Drug Resistance Database identifiziert; Mutationen mit höherer Replikationskapazität als NL4-3 sind fett gedruckt; Proben mit WT AS: Anzahl der Proben, die im großen Datensatz an dieser Position die Wildtyp (NL4-3) Aminosäure aufwiesen; Proben mit mut AS: Anzahl der Proben, die im großen Datensatz an dieser Position eine abweichende Aminosäure von NL4-3 aufwiesen; AS: Aminosäure, WT: Wildtyp, mut: mutiert; SVM: Support Vector Machines; EW: Entscheidungswälder; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

5.6 Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps

Der gesamte Datensatz der für die bioinformatischen Analysen basiert auf 261 Genotyp-RC-

Proben. Um für eine unbekannte Probe die RC mittels SVM oder EW vorherzusagen, wurden

ERGEBNISSE

68

für diese Probe alle Gewichte der Einzelmutationen verrechnet, so dass man abschließend

einen Wert über die voraussichtliche RC dieser Probe erhält. Eine gute Vorhersage von RC-

Werten zeichnet sich durch niedrige MSE-Werte (engl.: mean squared error) und hohe R2-

Werte aus. In der Korrelationsgrafik zwischen gemessener und vorhergesagter RC würde die

ideale Vorhersage eine Winkelhalbierende ergeben (Abb. 16). Der Vergleich zwischen

gemessener und vorhergesagter RC ergab aber nur für Proben mit geringer RC eine gute

Korrelation. Werte mit hoher RC wurden dagegen generell zu niedrig vorhergesagt. Dies traf

sowohl für die Vorhersage über SVM, als auch über EW zu. Der niedrigste gemessene RC-

Wert betrug 2 %, der höchste 300 %. Der niedrigste vorhergesagte RC Wert betrug 7 %, der

höchste 89 %.

Abb. 16: Korrelation zwischen gemessener und vorhergesagter RC anhand von 242 Proben aus der Geno2RC-Datenbank. Die Vorhersage der Replikationskapazität anhand des Genotyps erfolgte mittels Support Vector Machines (SVM) und Entscheidungswäldern (EW). Der Pfeil in der Diagonale stellt die idealisierte, optimale Korrelation dar. Die Linie, mit den benachbarten zwei gestrichelten Linien stellt die Hyperebene mit den Abständen zu den dichtest benachbarten Vektoren dar. Die Vorhersagequalität für niedrige RC-Werte (kleines Quadrat) war besser, als für RC-Werte oberhalb von 65%. RC: Replikationskapazität. Der Vorhersagefehler für die PR- und RT-Sequenzen betrug für 261 Daten für SVM 15,2 %

und für die EW 14,4 % und ist damit für beide Verfahren vergleichbar (Tab. 20). Der Fehler

wurde in dem kleineren Datensatz von 92 Proben etwas geringer, unabhängig davon, ob die

gag-Sequenzen in die Analyse mit einbezogen wurden (SVM 13.9 %, EW 14.2 %) oder nicht

(SVM 14.0 %, EW 13.9 %). Diese Unterschiede waren aber sehr wahrscheinlich nicht relevant.

SVM

vorh

erg

esag

te R

C (%

)

gemessene RC (%)

RFvo

rher

ges

agte

RC

(%)

gemessene RC (%)

50 100 1500

5010

015

00

50 100 1500

5010

015

00 HyperebeneHyperebene

SVM

vorh

erg

esag

te R

C (%

)

gemessene RC (%)

RFvo

rher

ges

agte

RC

(%)

gemessene RC (%)

50 100 1500

5010

015

00

50 100 1500

5010

015

00 HyperebeneHyperebene

ERGEBNISSE

69

Tab. 20: Vorhersagefehler der Kreuzvalidierung für Entscheidungswälder und Support Vector Machines mit und ohne Einbezug der gag-Sequenzen.

(261) PR, RT (92) PR, RT (92) PR, RT, Gag

SVM MSE R2 MSE R2 MSE R2

MW 0,152 0,241 0,140 0,298 0,139 0,325

Stabwn 0,001 0,015 0,004 0,040 0,003 0,029

EW MSE R2 MSE R2 MSE R2

MW 0,144 0,297 0,139 0,320 0,1419 0,319

Stabwn 0,003 0,019 0,004 0,029 0,005 0,024

MSE: engl.: mean squared error; Stabwn: Standardabweichung; EW: Entscheidungswälder; SVM: Support Vector Machines.

Eine Subtypen-spezifische Analyse der RC-Vorhersage auf Basis der Geno2RC-Datenbank

ergab, dass sowohl in B- als auch in non-B-Subtypen Proben mit geringer RC und mit primären

Resistenz-assoziierten Mutationen besser vorhergesagt werden konnten als Proben mit hoher

RC ohne Resistenz-assoziierte Mutationen.

Für B-Subtypen mit primären Rsistenz-assoziierten Mutationen wurden folgende RC-

Verteilungen ermittelt: Die gemessene RC lag im Median bei 30 % (IQR (25 - 75): 13 % -

56 %) und die vorhergesagte RC im Median bei 34 % (IQR (25 - 75): 23 % - 45 %). Für non-

B-Subtypen mit primären Resistenz-assoziierten Mutationen wurden folgende RC-

Verteilungen ermittelt: gemessene RC im Median 47 % (IQR (25 - 75): 28 % - 85 %) und

vorhergesagte RC im Median 49 % (IQR (25 - 75): 33 % - 55 %). Für B-Subtypen ohne

primäre Resistenz-assoziierte Mutationen wurden folgende RC-Verteilungen ermittelt:

gemessene RC im Median 61% (IQR (25 - 75): 41 % - 100 %) und vorhergesagte RC im

Median 53 % (IQR (25 - 75): 50 % - 59 %). Für non-B-Subtypen ohne primäre Resistenz-

assoziierte Mutationen lagen diese Werte dagegen höher mit einem Median von 77% der

gemessenen RC (IQR (25 - 75): 34 % - 116 %) und einer vorhergesagten RC von 63%

(IQR (25 - 75): 50 % - 75 %).

Die beiden nicht resistenten Wildtyp-Viren erreichten bei dieser Vorhersage RC-Werte von

NL4-3: 53,34 % und HXB2: 47,42 %. Um abschätzen zu können, ob dieser geringfügige

ERGEBNISSE

70

Unterschied der nicht resistenten Wildtyp-Viren auf verschiedene AS im rekombinanten Anteil

zurückzuführen war, wurden deren rekombinante Sequenzabschnitte verglichen und dabei 14

abweichende AS identifiziert (Tab. 21).

Tab. 21: Aminosäure-Unterschiede zwischen den beiden nicht resistenten Wildtyp-Viren HXB2 und NL4-3 im rekombinanten Genanteil.

Gen AS Position AS HXB2 AS NL4-3 Gen AS Position AS HXB2 AS NL4-3

Gag 441 Y H PR 57 R G

Gag 467 V E RT 102 K Q

Gag 473 P S RT 122 E K

Gag 487 T A RT 163 S C

Gag 495 N S RT 214 L F

PR 3 V I RT 272 P A

PR 37 S N RT 293 I V

AS: Aminosäure; PR: Protease; RT: reverse Transkriptase; HXB2, NL4-3: Vektoren die keine Resistenz-assoziierten Aminosäuren tragen; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

5.7 Analyse der Auswirkungen des wechselnden Selektionsdrucks

in der CAT-Studie

Der wechselnde Selektionsdruck in der CAT-Studie wirkt sich auf die verschiedenen Varianten

in der Plasmapopulation unterschiedlich aus. In drei Patienten konnte ein stetiger Wechsel von

zwei Hauptpopulationen festgestellt werden (Patienten: 4, 5, 8). Eine Population trug dabei

vornehmlich Mutationen, die PI-Resistenz hervorrufen, die andere hingegen Mutationen, die

vornehmlich RTI-Resistenz hervorrufen. In der Folge des kontinuierlichen Therapie-Wechsels,

erschien abwechselnd eine der beiden Populationen als vorherrschend. Exemplarisch sollen

hier die beiden alternierenden Populationen von Patient 4 charakterisiert werden. Die unter RTI

selektionierte Population besaß im Mittel eine RC von 16 % (Einzelwerte: Woche 12: 19 %,

Woche 26: 13 %, Woche 30: 17 %, Woche 40: 23 %, Woche 46: 8 %). Sie war charakterisiert

durch das Erscheinen der Resistenz-assoziierten Mutationen: RT:70R, RT:184V. Die unter PI

selektionierte Population besaß im Mittel eine RC von 4 % (Einzelwerte: Woche 14: 3 %,

Woche 52: 5 %) und war charakterisiert durch das Auftauchen der Resistenz-assoziierten

ERGEBNISSE

71

Mutationen: PR:33F, PR:54V, PR:71V, PR:82A. In Tab. 22 ist ein Beispiel von zwei

wechselnden Populationen unter RTI- und PI-Therapie für die Protease dargestellt.

Tab. 22: Darstellung des Wechsels von zwei Hauptpopulationen anhand der Protease-Mutationen in Patient 4 der CAT-Studie. Unter RTI-Therapie verschwinden die Protease-Inhibitor-Mutationen und erscheinen wieder beim Wechsel zum Protease-Inhibitor-haltigem-Therapieregime.

RTI: AZT 3TC ABC TDV PI: LPV/r SQV

Wo 0 Wo 4 Wo 6 Wo 8 Wo 10 Wo 12 Wo 14

n.d. V3I V3I V3I V3I V3I V3I

L10I L10I L10I L10I L10I L10I L10I

I13V I13V I13V I13V I13V I13V I13V

L24F L24F/L L24F/L - - L24F L24F

L33F L33F/L L33F/L - - L33F L33F

S37N S37N S37N S37N S37N S37N S37N

R41K R41K R41K R41K R41K R41K R41K

M46I M46I M46I M46I M46I M46I M46I

I54V I54I/V I54I/V - - I54V I54V

- K55K/R - K55K/R K55K/R - -

D60E D60E D60E D60E D60E D60E D60E

I62V I62V I62V I62V I62V I62V I62V

L63P L63P L63P L63P L63P L63P L63P

A71A/V A71A/V - - - A71V A71A/V

I72L I72L I72L I72L I72L I72L I72L

G73T G73T G73T G73T G73T G73T G73T

V77I V77I V77I V77I V77I V77I V77I

V82A V82A/V V82A/V - - V82A V82A

N83N/Y - - - - - -

L90M L90M L90M L90M L90M L90M L90M

I93L I93L I93L I93L I93L I93L I93L

Fett gedruckt sind die Resistenz-assoziierten Mutationen, die unter PI-Therapie selektioniert wurden (Johnson et al., 2006). Die unter PI selektionierten Resistenz-assoziierten Mutationen verschwinden unter RTI-Therapie und tauchen beim Wechsel zur PI-Therapie in Woche 12 wieder auf. PR: Protease; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; Wo: Woche; - : keine Mutation detektiert Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

Prinzipiell war eine partielle Resensitivierung multipel resistenter Virusstämme durch

alternierende Therapie-Regimes möglich. Reversionen erfolgten jedoch nur in einem geringen

Prozentsatz der Patienten, da in den anderen 18 Patienten kein Wechsel von zwei

Hauptpopulationen nachgewiesen werden konnte.

ERGEBNISSE

72

5.8 Untersuchung von Viruslastveränderungen in der CAT-Studie

Gemäß den Kriterien der CAT-Studie erfolgten Therapie-Umstellungen, wenn die VL um mehr

als den Faktor drei anstieg. In einigen Fällen aber wurde der VL-Wiederanstieg erst bekannt,

wenn der Patient bereits wieder vorstellig geworden war, so dass zum nächsten Termin Werte

aus einer erneuten VL-Bestimmung vorlagen. In wenigen Fällen zeigte sich dabei, dass die VL

unter unveränderter Therapie wieder abgesunken war. Dies ging zumeist einher mit einer

phänotypischen Veränderung, aber kaum Änderungen in den Sequenzen. Insbesondere an den

zu erwartenden Änderungen an Resistenz-assoziierten Positionen, welche mittels

konventioneller Sequenzierung untersucht wurden, konnten keine maßgeblichen

Verschiebungen gefunden werden.

Abb. 17: Verlauf von VL und CD4-Zellzahl in Patient 8 der CAT-Studie. Nach Therapie-Umstellung von reverse Transkriptase-Inhibitoren (RTI) zu Protease-Inhibitoren (PI) in Woche 10 folgte ein initialer Viruslast-Abfall bis zur 18. Woche ohne Veränderung der CD4-Zellzahl. Diesem folgte ein transienter Viruslast-Anstieg größer Faktor drei von Woche 18 auf 20, einhergehend mit einem parallelen Anstieg der CD4-Zellzahl und einem Abfall der Phänotypischen Resistenz; VL: Viruslast; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; PI: Protease-Inhibitoren. Auffällig war außerdem, dass in einigen Patienten nach Therapie-Umstellung trotz initialem

VL-Abfall die CD4-Zellzahlen weitestgehend stabil blieben und auch in diesen Proben keine

maßgeblichen genotypischen Veränderungen festgestellt werden konnten. Das angegebene

Beispiel Abb. 17 und Tab. 23 (Patient 8) soll diese beiden Phänomene exemplarisch

illustrieren.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 26 28

CD

4-Ze

llzah

l

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

Viru

slas

tCD4Viruslast

RTI PI

Woche

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 4 6 8 12 16 18 20 22 24 26 28

CD

4-Ze

llzah

l

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

Viru

slas

tCD4Viruslast

RTI PI

Woche

ERGEBNISSE

73

Tab. 23: Exemplarisch werden hier die Proben aus Woche 18 und 20 charakterisiert. Parallel zum Viruslast- und CD4-Zellzahlanstieg in Woche 20 stieg die Replikationskapazität ohne relevante genotypische Veränderungen an und die phänotypische Resistenz fiel ab. A) Genotypische Veränderungen, B) CD4-Zellzahl, Viruslast RC und Resistenzfaktoren der Protease und C) Resistenzfaktoren der reversen Transkriptase;

A

Woche PR PR PR RT RT

18 A71A/V T74K/P/Q/T L89M D218D/E/K K219K/Q

20 A71A/V/L/P T74P/T L89M/V D218D/E K219Q

B RF der PI Woche CD4 VL RC IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV

18 80 21200 17 % 29 143 >129* 32 >357* >75* >128*

20 140 262900 33 % 5,2 93 >168* 4,7 >213* >106* >310*

C RF der RTI Woche ZDV DDI D4T 3TC FTC ABC TDV NVP EFV DLV

18 137 2,2 2,3 >15* n.d. 6,7 3,5 37 9,1 24

20 >59* 0,9 2,8 n.d. >146* 13 1,2 13 0,6 7

* diese RF lagen an der Obergrenze des Messbereiches und könnten real höher liegen; grau hinterlegt sind die Medikamente aus der verabreichten Therapie; VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; RF: Resistenzfaktor; RC: Replikationskapazität; PI: Protease-Inhibitoren; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitoren; n.d.: nicht durchgeführt; Abkürzungen der Medikamente s. Anhang; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

Klonale Analysen

Da bekannter Maßen über konventionelle Sequenzierung Virus-Minoritäten nur zu einem

geringen Anteil erfasst werden können (Nachweisgrenze bei etwa 25 % - 30 %) sollte überprüft

werden, ob durch klonale Analysen zusätzliche Resistenz-assoziierte Mutationen detektiert

werden können (Beerenwinkel et al., 2003b; Korn et al., 2003; Schuurman et al., 1999;

Schuurman et al., 2002).

Von fünf Patienten und 22 Proben aus der CAT-Studie konnten erfolgreich 110 molekulare

Klone generiert und sequenziert werden. Als Kontrollgruppe dienten sieben Patienten mit acht

Proben, von denen 48 Klone erfolgreich generiert und sequenziert wurden. Alle untersuchten

ERGEBNISSE

74

Klone wurden über einen identischen Genanteil mit einheitlicher Größe von 1035 bp untersucht

(PR: AS 1 - 99, RT: AS 1 - 246), für die eine parallele VL vorlag.

Tab. 24: Korrelationen der Viruslast-Veränderung mit Aminosäueaustauschen und Basenaustauschen der Klone aus der CAT-Gruppe.

CAT

Patient Plasma-

probe dVL Klone neue Mut bp-Tausche neue Mut /

1000bp neue bp / 1000bp

1 KV66 6,5 7 10 24 1,38 3,31

1 KV67 11,6 3 13 23 4,19 7,41

1 KV84 3,5 7 4 17 0,55 2,35

1 KV85 0,5 10 13 25 1,26 2,42

4 KV13 1,6 4 8 14 1,93 3,38

4 KV14 0,8 3 0 15 0,00 4,83

5 KL19 1,8 1 0 6 0,00 5,80

5 KL20 0,5 3 1 9 0,32 2,90

5 KL21 1,0 6 1 11 0,16 1,77

5 KL22 0,7 6 12 21 1,93 3,38

5 KL23 0,6 4 3 11 0,72 2,66

5 KL24* 4,2 4 7 22 1,69 5,31

8 KL64 0,7 4 11 33 2,66 7,97

8 KL65 0,2 3 5 14 1,61 4,51

8 KL66 0,4 4 5 10 1,21 2,42

8 KL67 12,4 8 22 52 2,66 6,28

8 KL68 0,4 1 2 13 1,93 12,56

8 KL69 1,4 2 5 12 2,42 5,80

11 KL89 0,1 7 6 12 0,83 1,66

11 KL90 3,3 6 9 28 1,45 4,51

11 KL91 2,9 10 31 44 3,00 4,25

11 KL92 0,3 7 6 20 0,83 2,76 *Die Probe KL24 wurde aus der Analyse ausgeschlossen, weil die zugehörige VL an der Obergrenze des Messbereiches lag, und die reale VL möglicherweise höher war. VL: Viruslast; d: delta; bp: Basenpaar; bp-Tausche: Basenaustausche.

ERGEBNISSE

75

Tab. 25 Korrelationen der Veränderung der Viruslast mit Aminosäure-Austauschen und Basenaustauschen der Klone aus der Kontrollgruppe

Kontrollgruppe

Patient Plasma-

probe dVL Klone neue Mut bp-Tausche neue Mut /

1000bp neue bp / 1000bp

23 NZ8 0,6 3 7 10 2,25 3,2

23 NZ9 3,7 8 17 29 2,05 3,5

24 NZ12 n.d. 3 n.d. n.d. n.d. n.d.

24 NZ13 2716 6 10 36 1,61 5,8

25 NZ14 n.d. 2 n.d. n.d. n.d. n.d.

25 NZ15 0,0 10 19 21 1,84 2,0

26 NZ16 1,2 3 3 10 0,97 3,2

26 NZ17 0,9 6 10 20 1,61 3,2

27 NZ19 0,6 6 8 25 1,29 4,0

28 PK9 0,3 6 14 40 2,25 6,4 *Die Probe KL24 wurde aus der Analyse ausgeschlossen, weil die zugehörige VL an der Obergrenze des Messbereiches lag und die reelle VL möglicherweise höher ist. VL: Viruslast; d: delta; bp: Basenpaar; bp-Tausche: Basenaustausche; n.d.: nicht durchgeführt.

Korrelation von der Viruslastveränderung mit Aminosäure-Austauschen, die nur in den Klonen, jedoch nicht in der Plasmasequenz gefunden wurden

Bei den klonalen Analysen wurden zunächst die Sequenzen der Klone auf Aminosäure-

Abweichungen zum Wildtyp HXB2 hin untersucht. Diejenigen Mutationen, die zusätzlich zu

Mutationen auftraten, die bereits mit konventioneller Sequenzierung nachgewiesen worden

waren, wurden als neu gefundene Minoritäten-Mutationen erfasst. Betrachtete man den

mittleren Anteil an AS-Austauschen pro 1000 bp, so konnte man feststellen, dass die absolute

Anzahl an AS-Austauschen im Mittel in der Kontrollgruppe (1,7) vergleichbar war zu denen

der CAT-Klone (1,5).

In der Kontrollgruppe konnte aber keine signifikante Korrelation zwischen der Veränderung

der VL (dVL) und der Anzahl an Minoritäten-Mutationen festgestellt werden (p: 0,796,

R2: 0,012). Dagegen konnte bei den CAT-Klonen eine signifikante Korrelation zwischen dVL

und der Anzahl an Minoritäten-Mutationen festgestellt werden (p: 0,006, R2: 0,316) (Abb. 18).

ERGEBNISSE

76

Abb. 18: Lineare Regressionsanalysen der dVL und Minoritäten-Mutationen (Aminosäure-Austausche) in CAT- und Kontroll-Klonen. A) Signifikante Korrelation zwischen der Anzahl an Minoritäten-Mutationen und der Veränderung der Viruslast über die Zeit in den CAT-Klonen; B) Keine Korrelation zwischen der Anzahl an Minoritäten-Mutationen und der Veränderung der Viruslast über die Zeit in den Kontroll-Klonen; CAT: engl.: continuously alternating therapy; VL: Viruslast; d: delta.

Korrelation der Basenaustausche in den Minoritäten-Mutationen

In dieser Analyse wurden im Unterschied zu der vorangegangenen auch Basenaustausche

berücksichtigt, die keine Veränderung in der AS-Sequenz verursachten. Nun konnten weder für

die CAT-Klone (p: 0,260, R2: 0,061) noch für die Kontroll-Klone (p: 0,187, R2: 0,269)

Korrelationen zwischen der dVL und den Basenaustauschen je 1000 bp festgestellt werden

(Abb. 19). Interessanterweise war der mittlere Anteil an Basenaustauschen pro 1000 bp in der

p: 0,796R2: 0,012

B)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 1 2 3 4 5

dVL

Min

oritä

ten-

M

utat

ione

n/10

00 b

p

p: 0,006R2: 0,316

A)

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10 12 14

dVL

Min

oritä

ten-

M

utat

ione

n/10

00 b

p

ERGEBNISSE

77

Gruppe der Kontroll-Klone (3,9) niedriger als in der CAT-Gruppe (4,5). Je höher die Änderung

in der VL war, desto höher war auch die Anzahl an Basenaustauschen in der CAT-Gruppe.

Dieser Trend war in der Kontrollgruppe nicht zu beobachten.

Abb. 19: Lineare Regressionsanalysen der delta Viruslast (dVL) und Basenaustauschen in CAT- und Kontroll-Klonen. A) Trend einer Verknüpfung von erhöhter Anzahl an Basenaustauschen mit einer vermehrten Veränderung der Viruslast in CAT. B) Keine Korrelation zwischen Basenaustauschen und einer Veränderung der Viruslast in der Kontrollgruppe; CAT: engl.: continuously alternating therapy; VL: Viruslast; d: delta.

Analyse der Minoritäten-Mutationen Insgesamt wurden in den CAT-Klonen 174 Minoritäten-Mutationen (Mutationen die nicht

durch konventionelle Sequenzierung gefunden wurden) gefunden, davon 41 in der PR an 22

p: 0,269R2: 0,187

B)

01234567

0 1 2 3 4 5

dVL

Bas

enau

stau

sche

/1

000

bp

p: 0,260R2: 0,061

A)

02468

101214

0 2 4 6 8 10 12 14

dVL

Bas

enau

stau

sche

/1

000

bp

ERGEBNISSE

78

verschiedenen AS-Positionen und 133 in der RT an 82 AS-Positionen. Dagegen wurden in den

Kontrollklonen 88 Minoritäten-Mutationen gefunden, davon 33 in der PR an 23 verschiedenen

AS-Positionen und 55 in der RT an 48 AS-Positionen.

Es konnten 17 Positionen in der RT und sechs Positionen in der PR identifiziert werden, an

denen sowohl in den CAT- als auch in den Kontroll-Klonen Aminosäure-Austausche vorlagen.

Dabei handelte es sich um die PR-Positionen 23, 35, 41, 43, 48, 65 und die RT-Positionen 7,

16, 64, 75, 102, 104, 218, 128, 177, 198, 199, 201, 202, 218, 230, 232 und 242. Bei genauerer

Betrachtung stimmten in beiden Gruppen die Mutationen PR:23P, PR:35G, PR:41K, PR:42R,

PR:48E, RT:64E, RT:102R, RT:198R, RT:199G, RT:201R, RT:232C und RT:242R überein.

In einer weiteren Analyse beider Gruppen wurden die Minoritäten-Mutationen auf Resistenz-

assoziierte Mutationen hin untersucht (Johnson et al., 2006). In der Liste der

übereinstimmenden Mutationen aus beiden Gruppen konnte nur die Mutation PR:E35G als

Resistenz-assoziierte Mutation identifiziert werden. Betrachtet man die beiden Gruppen jedoch

einzeln, ließen sich zudem weitere Resistenz-assoziierte Mutationen identifizieren. In der CAT-

Gruppe konnten die zehn Mutationen PR:I13V, PR:E35G, PR:I62V, PR:I64M, RT:A62V,

RT:F77L, RT:F116Y, RT:Y181C, RT:G190A und RT:K219E identifiziert werden. In der

Kontrollgruppe konnten die fünf Mutationen PR:E35G, PR:V82A, RT:D67N und RT:L100I

identifiziert werden. Die einzigen Mutationen aus dieser Liste, die häufiger als einmal

detektiert wurden (jeweils fünf Mal detektiert) und die mit hoher Resistenz assoziiert sind,

waren die Mutationen Y181C und G190A. Diese Mutationen traten jedoch immer in

Kombination mit einer der Mutationen RT:K103N oder RT:Y188L auf, welche an sich jeweils

hohe NNRTI-Kreuzresistenz verursachen.

Vergleich der Minoritäten-Detektion mittels allelspezifischer selektiver real-time-PCR, konventioneller Sequenzierung und klonalen Analysen

Als zweite Methode zur Untersuchung der Plasmapopulationen aus den Proben mit transienten

VL-Anstiegen wurden sehr sensitive quantitative allelspezifische real-time-PCRs nach Metzner

und Kollegen durchgeführt (Metzner et al., 2003; Metzner et al., 2005). Es sollte untersucht

werden, ob möglicherweise Mutationen an Positionen, die mit starker Resistenz assoziiert sind,

durch sequenzielle Analyse der Plasmapopulation und klonale Analysen nicht erfasst wurden.

ERGEBNISSE

79

Tab. 26: Gegenüberstellung der Minoritäten-Detektion mit Hilfe von konventioneller Sequenzierung, klonalen Analysen und allelspezifischer real-time-PCR an den Aminosäure-Positionen A) 90 in der Protease (PR), sowie in der reversen Transkriptase (RT) B) 103 und C)184 A Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 90M in real-time-PCR

KL66 8 21200 9 90M, M/V > 99,48

KL67 8 262900 8 90M, M > 99,96

KL68 8 94700 3 90M, M/V > 99,88

KL90 11 4210 6 90L L < 2,64

KL91 11 12100 10 90L L 1,23 ± 0,38 %

KL92 11 3040 7 90L L < 3,65

KL20 5 361000 3 90L L < 0,03

KV13 4 7460 5 90M, M > 98,51

KV14 4 6060 6 90M, M > 98,17

KV84 1 137600 8 90M, M > 99,92

KV85 1 72500 10 90M, M > 99,85 B Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 103N in real-time-PCR

KL66 8 21200 9 103N, N 57,69 ± 8,67 %

KL67 8 262900 8 103N, N/T 92,04 ± 10,54 %

KL68 8 94700 3 103N, K/N 89,68 ± 15,82 %

KL90 11 4210 6 103K K 15,69 ± 5,18 %

KL91 11 12100 10 103K K 1,47 ± 0,80 %

KL92 11 3040 7 103K K 4,77 ± 0,52 %

KL20 5 361000 3 103K/N K 4,32 ± 1,21 %

KV13 4 7460 5 103N, N 90,62 ± 12,10 %

KV14 4 6060 6 103K/N K/N 3,69 ± 2,82 %

KV84 1 137600 8 103K/N K 5,66 ± 2,11 %

KV85 1 72500 10 103K K 4,48 ± 1,98 % C Probe Patient VL Anzahl Plasma Klone 184V in real-time-PCR

KL66 8 21200 9 184V, V 99,17 ± 0,03 %

KL67 8 262900 8 184V, V 95,83 ± 0,18 %

KL68 8 94700 3 184V, V 90,43 ± 0,62 %

KL90 11 4210 6 184V, V > 97,36

KL91 11 12100 10 184V, V/E > 99,08

KL92 11 3040 7 184V, V 89,46 ± 5,38 %

KL20 5 361000 3 184V, V 93,41 ± 0,65 %

KV13 4 7460 5 184M/V M/V 66,78 ± 0,82 %

KV14 4 6060 6 184M/V V 77,95 ± 0,17 %

KV84 1 137600 8 184V, V 99,61 ± 0,09 %

KV85 1 72500 10 184V, V 99,67 ± 0,03 %

VL: Viruslast; detektierte Minoritäten sind fett geruckt; Anzahl: Anzahl der Klone; PCR: Polymerase Kettenreaktion; Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

80

Dazu wurden exemplarisch elf Proben von fünf Patienten aus der CAT-Studie untersucht, die

veränderte phänotypische Resistenz trotz kaum veränderter Genotypen besaßen. An den

untersuchten drei Kodons, die als mit hoher Resistenz assoziiert beschrieben wurden, konnten

über konventionelle Sequenzierung insgesamt fünf Minoritäten detektiert werden, über klonale

Analysen sieben Minoritäten und über selektive real-time-PCR 23 Minoritäten (Tab. 26).

Damit stellt die selektive real-time-PCR in dieser Analyse die sensitivste Methode dar, um

Minoritäten zu erkennen, gefolgt von der klonalen Analyse und der konventionellen

Sequenzierung. Die Sequenzierung von Klonen aus der Plasmasequenz detektierte Minoritäten

geringfügig besser als die Sequenzierung der Plasmapopulation und könnte wahrscheinlich

über Erhöhung der Klonanzahl noch gesteigert werden.

Betrachtete man aufeinander folgende Proben eines Patienten jeweils im Verlauf, konnten

keine Verschiebungen der Resistenz-assoziierten Mutationen festgestellt werden, die transiente

VL-Anstiege erklären könnten.

Art der Basenaustausche in klonalen Sequenzen

Die Analyse über Vier-Felder-Tafeln ergab, dass keine Base in der CAT-Gruppe häufiger als in

der Kontrollgruppe zu einer anderen Base mutiert war (Tab. 27). Adenin-

Austausche: Chi2: 0,198, p: 0,656, Cytosin-Austausche: Chi2: 0,330 p: 0,565, Guanin-

Austausche: Chi2: 0,283, p: 0,595, Thymin-Austausche: Chi2: 0,095, p: 0,758.

Auch in einer detaillierteren Untersuchung der Art der Basenaustausche konnte keine

signifikant unterschiedliche Verteilung zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden. Die

Analyse über Vier-Felder-Analysen ergab zwar zunächst eine signifikante Korrelation von

vermehrten Guanin- zu Cytosin-Austauschen in der Kontrollgruppe (Chi2: 3,871, p: 0,049),

nach Anwendung der Bonferroni-Korrektur konnte diese Signifikanz jedoch nicht bestätigt

werden.

Tab. 27: Anteil an Basenaustauschen in der Plasmasequenz und in den Klonen für Proben der CAT- und der Kontroll-Gruppe.

Basen in der Plasmasequenz Mutierte Basen in den

Klonen

Gruppe Proben Klone A C G T A C G T

CAT-Gruppe 22 110 43605 18627 23700 26698 207 50 69 110

Kontrollgruppe 8 48 19397 8093 10131 11784 87 25 33 46

A: Adenin; C: Cytosin; G: Guanin; T: Thymin.

ERGEBNISSE

81

Bei näherer Betrachtung war jedoch zu beobachten, dass innerhalb der CAT-Gruppe signifikant

mehr Adenin als Cytosin (Chi2: 13,5, p: < 0,001) oder Guanin (Chi2: 12,7, p: < 0,001) mutiert

waren (Tab. 28). Dagegen mutierte innerhalb der Kontrollgruppe keine Base signifikant

häufiger als eine andere, was für ungerichtete Basenaustausche innerhalb der Kontrollgruppe

spricht.

Tab. 28: Analyse der Basenaustausche in den Klonen der CAT- und Kontroll-Gruppe mittels Vier-Felder-Tafeln.

Gruppe A-C A-G A-T

CAT- Chi2 13,5 Chi2 12,7 Chi2 0,23 Gruppe p < 0.001 p < 0.001 p 1,450

Kontroll- Chi2 2,74 Chi2 2,48 Chi2 0,58

Gruppe p 0,098 p 0,115 p 0,445

Gruppe C-G C-T G-T

CAT- Chi2 0,2 Chi2 6,4 Chi2 5,2

Gruppe p 0,661 p 0,011* p 0,023*

Kontroll- Chi2 0,04 Chi2 0,89 Chi2 0,63

Gruppe p 0,841 p 0,344 p 0,426

*nach Bonferroni Korrektur nicht statistisch signifikant; A: Adenin; C: Cytosin; G: Guanin; T: Thymin; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

Betrachtete man die Art der gefundenen Basenaustausche, konnte in der Einzelanalyse

festgestellt werden, dass es sich in beiden Gruppen bei den Adenin-Austauschen vorwiegend

um Adenin- zu Guanin-Austausche handelte, bei den Cytosin-Austauschen vorwiegend um

Cytosin- zu Thymin-Austausche, bei den Guanin-Austauschen vorwiegend um Guanin- zu

Adenin-Austausche, sowie bei den bei den Thymin-Austauschen vorwiegend um Thymin- zu

Cytosin-Austausche handelte (Tab. 29). Interessanterweise traten in der CAT-Gruppe keine

Cytosin- zu Guanin-Austausche und in der Kontrollgruppe keine Guanin- zu Cytosin-

Austausche auf.

In einer abschließenden Untersuchung sollte festgestellt werden, ob eine residuelle

ABOBEC3G-Aktivität vorlag, welche vermehrte Guanin zu Adenin Austausche verursacht.

Eine Analyse über Vier-Felder-Tafeln ergab, dass in der Kontrollgruppe kein signifikanter

Unterschied in der Anzahl der Guanin- zu Adenin-Austausche im Vergleich zu den Adenin- zu

ERGEBNISSE

82

Guanin-Austauschen vorlag (Chi2: 1,09, p: 0,297). Dagegen konnte in der CAT-Gruppe eine

signifikante Häufung von Guanin- zu Adenin-Austauschen im Vergleich zu Adenin- zu

Guanin-Austauschen festgestellt werden (Chi2: 8,543, p: 0,003). Damit war zumindest in der

CAT-Gruppe der Anteil an Guanin- zu Adenin-Austauschen höher, aber die vorhandenen

Adenin- zu Guanin-Austausche könnten dennoch von ABOBEC3G verursacht worden sein.

Tab. 29: Anteile an Basenaustauschen in CAT- und Kontroll-Klonen anteilig an der absoluten Basenzahl / 1000 bp im Vergleich zur Plasmasequenz.

A C G T

Gruppe zu C zu G zu T zu A zu G zu T zu A zu C zu T zu A zu C zu G CAT-Gruppe 20 175 12 14 0 36 62 6 1 13 88 9

Kontroll-gruppe 8 72 7 3 1 21 30 0 3 4 38 4

fett markiert sind jeweils diejenigen Austausche, zu denen eine Base signifikant am häufigsten mutierte; A: Adenin; C: Cytosin; G: Guanin; T: Thymin; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

Phylogenetische Untersuchungen

Phylogenetische Untersuchungen machen es möglich, das Maß der Verwandtschaft zwischen

Proben anhand deren Sequenz-Übereinstimmungen zu ermitteln. Interessanterweise

gruppierten sich in der CAT-Gruppe die Plasmapopulationen eines Patienten nicht mit den

zugehörigen Klonsequenzen, die aus der jeweiligen Plasmasequenz isoliert wurden, sondern

die Sequenzen der Plasmapopulationen untereinander, sowie die Sequenzen der Klone

untereinander (Abb. 20). Eine Ausnahme stellt dabei die Plasmaprobe KL89 dar, die sich nicht

mit den anderen Plasmaproben gruppierte. Dabei ist anzumerken, dass die Probe KL89 unter

AZT + 3TC + ABC + TDV-Therapie selektioniert wurde, wohingegen die Proben KL90 -KL92

jeweils unter LPV/r + SQV-Therapie selektioniert wurden.

Im Vergleich dazu gruppierten sich in der Kontrollgruppe nur in zwei Patienten die Sequenzen

der Plasmapopulation untereinander (NZ12-13, NZ18-19), sowie die Sequenzen der Klone

zueinander. Dagegen gruppierten sich die Plasmasequenzen drei anderer Patienten nicht so nah

nebeneinander wie in der CAT-Gruppe. Für die Plasmaprobe PK9 war keine zweite

Plasmaprobe verfügbar.

ERGEBNISSE

83

NZ8

Kontrollgruppe:

NZ8-61NZ8

NZ9 1NZ9

10NZ911NZ9

12NZ97NZ9

13NZ92NZ9

8NZ9

5NZ81NZ14

3NZ14NZ14 NZ15

2NZ1511NZ15

7NZ1510NZ15

15NZ1512NZ1514NZ15

4NZ158NZ15

Kontrollgruppe: Kontrollgruppe:

1NZ162NZ16

3NZ16NZ16

8NZ1710NZ17

5NZ173NZ1713NZ17

6NZ17NZ17

NZ18 NZ19

13NZ1915NZ19

8NZ191NZ19

2NZ197NZ19

Kontrollgruppe:

NZ12 NZ13

1NZ129NZ12

3NZ1211NZ13

12NZ137NZ136NZ13

9NZ138NZ13

Kontrollgruppe:

10PK911PK99PK9

13PK91PK9

7PK9PK9

Kontrollgruppe:

22KV135KV147KV1423KV1324KV13

2KV13KV13

KV14 17KV14

CAT :

10bp

Maßstab:

5bp 10bp

Maßstab:

5bp

10KV6618KV663KV66

4KV665KV66

6KV6612KV67

3KV67KV66

KV67 4KV67

8KV66

CAT :

10KV849KV85

15KV857KV858KV85

3KV8410KV8511KV8512KV85

5KV8514KV85

KV84 KV85

1KV844KV84

2KV845KV849KV84

2KV85

CAT :

ERGEBNISSE

84

Abb. 20: Darstellung des Verwandtschaftsgrads zwischen Plasmaproben und zugehörigen Klonen in phylogenetischen Untersuchungen. Im Vergleich der Proben aus den beiden Gruppen zeigt sich innerhalb der CAT-Gruppe im Gegensatz zur Kontrollgruppe eine höhere Verwandtschaft der Plasmaproben zueinander als zu den abgeleiteten Klonen. CAT: engl.: continuously alternating therapy.

5.9 Die klinische Relevanz der RC

Korrelation von Replikationskapazität, Viruslast, CD4- und CD8-Zellzahl, sowie Therapie-Ansprechen innerhalb der CAT-Studie

Bei den Untersuchungen der Mittelwerte über die Daten von RC, VL, CD4- und CD8-Zellzahl

aller Patienten der CAT-Studie, konnte eine signifikante inverse Korrelation zwischen der

CD4-Zellzahl und der VL festgestellt werden (n: 21, p: 0,035, R2: 0,214) (Abb. 21). Außerdem

konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und CD8-Zellzahl festgestellt werden

(n: 21, p: 0,01, R2: 0,304) (Abb. 22). Dabei war die CD4-Zellzahl umso höher, je höher die

35KL1940KL21

44KL2035KL21

41KL2144KL2143KL21

42KL2143KL20

47KL2013KL2245KL22

KL19 KL20

KL21 KL22

KL23 KL24

45KL2437KL24

12KL2214KL22

51KL2343KL24

46KL2250KL23

47KL2241KL23

44KL2447KL23

CAT :

17KL644KL68

10KL6510KL66

19KL65KL64

KL65 KL66

KL67 KL68 KL69

16KL6542KL67

45KL6748KL67

35KL6644KL66

36KL6739KL6749KL67

44KL6949KL69

37KL6743KL67

28KL6429KL64

4KL6418KL66

CAT :

1KL892KL89

KL89 48KL90

51KL9010KL92

65KL9149KL9050KL90

10KL911KL91

KL90 KL91 KL92 54KL90

8KL919KL9111KL92

6KL893KL894KL89

5KL897KL8952KL90

3KL9158KL9166KL91

62KL9163KL91

12KL923KL92

2KL924KL928KL92

CAT :

10bp

Maßstab:

5bp 10bp

Maßstab:

5bp

ERGEBNISSE

85

CD8-Zellzahl war. Das Verhältnis der CD4- zur CD8-Zellzahl lag für jeden Patienten unter

dem Normalwert von 0,7 - 2,8 (n: 21; Min.: 0,02; Max.: 0,56) (http://www.laborlexikon.de)

Abb. 21 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4-Zellzahlen und der VL von allen 21 Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante negative Korrelation zwischen der CD4-Zellzahl und der VL festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

Abb. 22 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4- und CD8-Zellzahlen von allen 21 Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und der CD8-Zellzahl festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

p: 0,035R2 :0,214

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 100 200 300 400 500 600

CD4

VL

p: 0,01R2 : 0,304

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 100 200 300 400 500 600

CD4

CD

8

ERGEBNISSE

86

Betrachtet man den Unterschied zwischen RTI- und PI-Behandlung bezüglich der

Behandlungsdauer unabhängig vom Patienten und Zyklus, ist ein hochsignifikanter

Unterschied zwischen den beiden Behandlungen feststellbar. Im Median dauerten RTI-

Behandlungen 67 Wochen, PI-Behandlungen 43 Wochen. RTI-Behandlungen (n: 57) dauern

somit eindeutig länger als PI-Behandlungen (n: 53, p: < 0,001). Diese Beobachtung trifft auch

zu, wenn man die Behandlungsdauer für beide Therapie-Strategien je Zyklus betrachtet

(Abb. 23).

Abb. 23: Unterschied in der Behandlungsdauer zwischen RTI- und PI-Therapie-Regime für Zyklus 1 der CAT-Studie. RTI-Behandlungen dauern signifikant länger als PI-Behandlungen (p < 0,001). CAT: engl.: continuously alternating therapy; RTI: reverse Transkriptase-Inhibitor; PI: Protease-Inhibitor; n: Anzahl.

In die Analyse der Korrelationen bezüglich der RC wurden sechs Patienten der CAT-Studie mit

eingeschlossen, da von diesen Patienten mehr als sechs RC-Bestimmungen im Verlauf

vorlagen (Patienten: 2, 4, 5, 6, 8, 11) (Tab. 30). Für Patient 5 konnte beim Vergleich der RC-

Werte unter PI und RTI Therapie ein signifikanter Unterschied in der RC in Bezug auf die

Behandlung festgestellt werden (p: 0,031, Chi2: 0,025). Unter PI-Behandlung betrug die RC im

Mittel 40 % (n: 6), unter RTI-Behandlung 71 % (n: 6). In diesem Patienten verursachten also

die PI-Mutationen erhebliche Replikations-Einbußen. Bei den anderen fünf Patienten konnte

kein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Des Weiteren konnte eine signifikante Korrelation zwischen der mittleren CD4-Zellzahl und

der RC festgestellt werden (n: 6, p: 0,008, R2: 0,858) (Abb. 24), sowie eine signifikante

Korrelation zwischen der mittleren RC-Veränderung und der mittleren Veränderung der CD8-

0

5

10

15

20

25

30

35

Woc

hen

Median 5,9

RTI PI

n = 10n = 11Median 16,2

0

5

10

15

20

25

30

35

Woc

hen

Median 5,9

RTI PI

n = 10n = 11Median 16,2

ERGEBNISSE

87

Zellzahl (n: 6, p: 0,031, R2: 0,728) (Abb. 25). Dagegen wurde keine signifikante Korrelation

zwischen der mittleren CD4-Zellzahl und der absoluten VL oder der Veränderung in der VL im

Vergleich zur Vor- oder der Folgeprobe festgestellt.

Tab. 30: Mittelwerte klinischer Parameter von sechs Patienten aus der CAT-Studie, von denen mindestens sechs Verlaufsproben bestimmt wurden.

Pat. VL CD4 CD8 RC ( % ) dVL dCD4 dCD8 dRC dVL/dCD4 dCD4/dVL

2 304777 284 1040 16 1,5 0,9 1,2 1,2 1,7 1,1

4 106087 246 2547 12 3,3 1,0 1,1 1,4 4,1 2,4

5 293571 20 314 55 1,6 1,0 1,1 1,2 2,3 1,2

6 80093 14 597 39 1,4 0,9 0,8 3,1 2,0 1,6

8 114364 93 1185 35 1,1 1,2 1,3 1,5 1,0 1,7

11 7213 196 570 19 4,1 1,1 1,2 1,2 2,7 5,9

VL: Viruslast, CD4: CD4-Zellzahl, CD8: CD8-Zellzahl, RC: Replikationskapazität, d: delta = Veränderung eines Parameters, errechnet durch Division des Wertes der Folgeprobe durch den Wert der Vorprobe; Pat.: Patient; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

Betrachtete man die Proben der einzelnen Patienten im longitudinalen Verlauf, so ließ sich

auch hier in 9 von 12 Patienten eine signifikante Korrelation zwischen der CD4- und der

CD8-Zellzahl feststellen (Daten nicht gezeigt). Dagegen wurde keine Korrelation zwischen der

RC und der VL festgestellt.

Abb. 24 Regressionsanalyse über die Mittelwerte der CD4-Zellzahlen und der RC von sechs Patienten aus der CAT-Studie. Es konnte eine signifikante Korrelation zwischen der CD4-Zellzahl und der RC festgestellt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

p: 0,008R2 : 0,858

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300

CD4

RC

ERGEBNISSE

88

Abb. 25 In einer Regressionsanalyse über die Veränderung der CD4- und CD8-Zellzahl von sechs Patienten aus der CAT-Studie, konnte eine signifikante Korrelation ermittelt werden. RC: Replikationskapazität; CAT: engl.: continuously alternating therapy.

Korrelation von Replikationskapazität, Viruslast und CD4-Zellzahl in klinischen Verlaufsproben

Um den prognostischen Wert der Replikationskapazität für die Klinik zu überprüfen, sollten

diagnostische Verlaufsproben hinzugezogen werden. Dabei wird ein echtes therapeutisches

Ansprechen erst bei einer VL-Veränderung von 2,5-fach und größer angenommen, da eine

singuläre Bestimmung der einzelnen Parameter Messschwankungen unterliegt (Hughes et al.,

1997). Es wurden für diese Analysen sechs Proben von drei Patienten aus der Geno2RC-

Datenbank näher untersucht, für die VL- und CD4-Zellzahl-Bestimmungen, genotypische und

phänotypische Analysen, sowie Replikationsanalysen erfolgreich durchgeführt wurden

(Tab. 31, Tab. 32, Abb. 26). Die genotypische Analyse ergab eine Vielzahl an Resistenz-

assoziierten Mutationen (Tab. 32). In einem Fall (Patient Wki) war unter Anstieg der Resistenz

ein Abfall der ohnehin sehr niedrigen RC zu beobachten. Der Patient war immunologisch und

klinisch im gesamten Beobachtungszeitraum unauffällig. Die VL fiel um den Faktor 2 ab. Ein

anderer Patient (Patient Dki) dagegen verschlechterte sich immunologisch im

Beobachtungszeitraum, was sich im Abfall der CD4-Zellzahl widerspiegelte. Die RC stieg

parallel dazu knapp auf das Doppelte an. Die Viren vom dritten Patienten (Patient Fki) zeigten

keine signifikante Veränderung über den Beobachtungszeitraum und waren mit ca. 82% der

Wildtyp-Aktivität auch nicht stark in der Replikation herabgesetzt. Der Patient war im

R2 = 0,728p = 0,031

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

dCD4

dCD

8

ERGEBNISSE

89

Beobachtungszeitraum klinisch und immunologisch stabil. In den Patienten Fki und Dki nahm

die phänotypische Resistenz zur Folgeprobe hin stark zu, wohingegen im Patienten Wki die

Resistenz für das Medikament 3TC stark zunahm, aber für die Medikamente Efavirenz, DDC

und D4T stark abnahm.

Tab. 31: Viruslast (VL), CD4-Zellzahl und Replikationskapazität von sechs Proben von drei Patienten im Verlauf. Alle Proben enthalten hoch resistente Viren und liegen jeweils 1,5 Jahre auseinander.

Patient Probe Datum VL CD4 RC

1 Wki1 01.12.98 81000 879 15 %

1 Wki2 01.05.00 40000 838 7 %

2 Dki1 22.11.98 630000 127 41 %

2 Dki2 01.05.00 440000 45 70 %

3 Fki1 26.10.98 196000 513 77 %

3 Fki2 08.05.00 130000 638 87 %

VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; RC: Replikationskapazität;

Tab. 32: Aminosäureaustausche im Vergleich zum Referenzvirus HXB2.

Patient Probe Mutationen im PR Gen Mutationen im RT Gen

1 Wki1 V3I,L10I,K14R,I15V,L19Q, K20I,M36I,S37N, I54V,R57K,L63P,A71I,G73S,I84V, L90M,I93L

K22R,M41L,D67S,S68V,T69S,K70R,L74I/L/V,W88S,K103N,V118I,D123E,I135T,K166R,G196E,T215Y, R277K,E297E/K/Q/* Insertion RT: 66a = S, 66b = T

1 Wki2 V3I,L10I,V11L,K14R,I15V, L19Q,K20I,L33I,E35G,M36I,S37N, I54V,R57K,L63P, A71I,I84V,I85V,L90M,I93L

K22R,A62V,D67S,S68V,T69S,W88S,K103N,V118I, D123E,I135T,E138K,Y146S,S156P,K166R,M184I, G196E,T215Y,R277K Insertion RT: 66a = S, 66b = T

2 Dki1 V3I,L10Y,K20I,M36I/M, S37N,M46I,L63P,I64V, I66I/V, I72V,G73T, I84V, L90M

M41L,K43N/S,A62A/V,K64K/R,D67N,K70R,L74I, V75T,K104N,V118I,I142I/V,M184V,G196E,T200I, I202V,L210W,L214F,T215Y,K219Q,L228H,E248D, D250E, R277K,K281R,E297E/K

2 Dki2 V3I,L10F/L,Q18H/Q, K20I/K/M,S37N,M46I/M, L63L/P,I64V,I66I/V,I72I/V, G73A/G/S/T, I84I/V,L90L/M

K20K/R, M41L/M,K43K/N,K49K/R,V60I/V,A62A/V, K64K/R,D67D/N,K70K/R,L74I/L,V75A/I/T/V,R83K/R, K103K/N,V118I/V,E122E/K,I135I/T,I142I/V,F171F/Y,M184M/V,G196E/G,T200I,I202V,H208H/Y,L210W, L214F, T215F/Y,D218D/E,K219K/Q,L228H/L,E248D, D250E,R277K,K281R,E297E/K

3 Fki1 V3I,L10I,T12A/E/K/T,K20I, S37N,R41K,K43K/R, M46I, F53L,D60E,L63P,A71V, G73S,V77I,L90M

V35T,M41L,K64H,D67N,T69N,K70R,L74I,V75I/T, K101Q,E122E/K,D123E,S162Y,V179I,M184V,H208Y,L214F,T215F,D218E,K219Q,L228H,K281R,I293V, E297E/K

3 Fki2 V3I,L10I,T12E,K20I,S37N, R41K,M46I,F53L,I54M, K55K/R,D60E,L63P,A71V,G73C,V77I,L90M

V35T,M41L,K64H,D67N,T69N,K70R,L74I,V75S,I94L,K101Q,K103N,E122K,D123E,I135I/T,S162Y,V179I, M184V,G196Q,H208Y,L214F,T215F,D218E,K219Q,H221Y,L228H,K281K/R,I293V,E297E/K

RT: reverse Transkriptase; PR: Protease; primäre Resistenz-assoziierte Mutationen sind fett markiert (Johnson: 16946457); Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren s. Anhang.

ERGEBNISSE

90

Abb. 26: Ermittelte Resistenzfaktoren in phänotypischen Resistenzanalysen von Verlaufsproben dreier Patienten aus der Geno2RC-Datenbank. In den Patienten Fki und Dki nahm die Resistenz zur Folgeprobe für alle Medikamente stak zu. Im Patienten Wki nahm die Resistenz v.a. für das Medikament 3TC stark zu, dagegen für die Medikamente Efavirenz DDC und D4T stark ab. Min.: Liegt der Resistenzfaktor einer Probe innerhalb des grauen Kreises in der Mitte, so wird dieses Medikament als suszeptibel eingestuft; Max.: Die Äußerste Umrandung gibt die maximal messbare Resistenz des Medikamentes an; Abkürzungen der Medikamente, s. Anhang.

5

86

29

95

55

11 1

9

2

14

678

>148

1

10

100

1000

10000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Fki1Min.

20

75

53

85

59

2344 87

10

4

11

7

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Fki2Min.

21

139

68

>100

61

11 1

6

>100

1

3

3151

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Dki1Min.

4577

28

101

301

1728 103

9

4

4

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Dki2Min.

61

405

304

>100

>200

1014

32

9

31

10

3

>10>265

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Wki1Min.

19

76

220

111

139

3 10 21

6

1

9

6

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Wki2Min.

5

86

29

95

55

11 1

9

2

14

678

>148

1

10

100

1000

10000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Fki1Min.

Max.Fki1Min.

20

75

53

85

59

2344 87

10

4

11

7

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Fki2Min.

Max.Fki2Min.

21

139

68

>100

61

11 1

6

>100

1

3

3151

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Dki1Min.

Max.Dki1Min.

4577

28

101

301

1728 103

9

4

4

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Dki2Min.

Max.Dki2Min.

61

405

304

>100

>200

1014

32

9

31

10

3

>10>265

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Wki1Min.

Max.Wki1Min.

19

76

220

111

139

3 10 21

6

1

9

6

>463

>314

1

10

100

1000

AZTDDC

DDI

D4T

3TC

ABC

NVPDLV

EFV

IDV

SQV

RTV

NLV

APVMax.Wki2Min.

Max.Wki2Min.

ERGEBNISSE

91

RC und Resistenz als prognostische Parameter für Therapie-Ansprechen

Um die klinische Relevanz von RC und Resistenz als prognostischen Marker für Therapie-

Ansprechen zu prüfen, wurde der EUResist-Datensatz näher untersucht. Es wurde analysiert,

inwiefern die Parameter von RC und RF eine Vorhersage des Therapie-Ansprechens

verbessern. Im unten dargestellten Diagramm zeigt die Winkelhalbierende an, wie die Werte

bei einer zufälligen Verteilung angeordnet wären (Abb. 27). Es wird deutlich, dass unter

Einbezug der RC-Werte wertvolle Hinweise auf das künftige Therapie-Ansprechen angegeben

werden können. Dennoch scheint der Parameter der RF in Bezug auf VL-Veränderungen den

entscheidenderen Einfluss auszuüben. In einer Analyse, in die sowohl die RC als auch die RF

als Faktoren für die Prädiktion eines Therapie-Erfolges mit einbezogen wurden, ist nur noch

eine sehr geringfügige Verbesserung der Vorhersage des Therapie-Ansprechens im Vergleich

zum prädiktiven Parameter der RF alleine sichtbar.

Abb. 27: Analyse über den Einfluss von Replikationskapazität (RC) und Resistenzfaktoren (RF) als prognostische Parameter für Therapie-Ansprechen. Analysiert wurden 2044 Proben aus dem EUResist-Datensatz. Die Vorhersage der RC und RF erfolgte über Support Vector Machines anhand der Sequenz. Der Einfluss der RF auf das Therapie-Ansprechen war hier deutlich größer als der Einfluss der RC; gepunktete Linie: Winkelhalbierende.

durchschnittliche falsch negative Werte

du

rch

sch

nit

tlic

he

fals

ch p

osi

tive

Wer

te

RC

RF x RCRF

durchschnittliche falsch negative Werte

du

rch

sch

nit

tlic

he

fals

ch p

osi

tive

Wer

te

RC

RF x RCRF

DISKUSSION 92

6 DISKUSSION

Zu den Zielen dieser Arbeit zählte es, einen Test zur Bestimmung der RC aufzubauen, der die

Problematik der initialen Virusquantifizierung handhaben und zudem die meisten bekannten

Resistenz- und RC-assoziierten Mutationen erfassen konnte. Gängige Verfahren generieren für

funktionelle Untersuchungen rekombinante HI-Viren, weil es bei der Anzucht primärer Isolate

zu kompetitiver Virusreplikation kommen kann, bei der die oft weniger replikativen resistenten

Viren von replikationskompetenteren Varianten aus der Quasispezies verdrängt werden können

(Charpentier et al., 2004). Rekombinante Systeme basieren zumeist auf der Amplifikation des

pol-Gens aus der im Plasma vorherrschenden viralen Quasispezies. Ein kritischer Punkt der

rekombinanten Systeme in dieser Arbeit war die Auswahl des zu amplifizierenden Bereichs, da

die Sensitivität der PCR mit der Größe des Amplifikats abnimmt. Für die Amplifikation der

rekombinanten Anteile der Viren wurde eine sehr sensitive PCR verwendet, deren Amplifikat

den C-terminalen Teil des gag-Gens (AS 428 - 500) einschließlich der PR-Schnittstellen des

Gag-Pol-Vorläuferproteins p7 / p1 und p1 / p6, die gesamte PR (AS 1 - 99) und den

überwiegende Anteil der RT (AS 1 - 300) enthielt (Walter et al., 1999). In diesem Teil des

HIV-1-Genoms liegen die meisten bekannten Resistenz- und Replikations-assoziierten

Mutationen (Doyon et al., 1996; Johnson et al., 2006). Dennoch sind im Zusammenhang

veränderter RC viele Mutationen auch außerhalb des hier benutzten rekombinanten

Virussystems beschrieben, und ein Einfluss auf die RC solcher Mutationen in-vivo ist

prinzipiell nicht auszuschließen.

Ein weiteres großes Problem bei der Durchführung Infektions-gebundener Testverfahren zur

Bestimmung der RC ist die Ermittlung der initialen Infektionsdosis. Zum einen weisen die

Verfahren zur Virusquantifizierung nicht selten selbst eine höhere Variabilität auf als die zu

messenden RC-Unterschiede, zum anderen führt insbesondere PI-Resistenz auch zu

Veränderungen der Infektiosität (de la Carriere et al., 1999; Mammano et al., 1998). Letztere

werden im Wesentlichen auf Reifungsstörungen des Virus zurückgeführt, die der verminderten

Prozessierung der viralen Strukturproteine durch die resistente Protease direkt folgen (Bleiber

et al., 2001; Brenner et al., 2002; Zennou et al., 1998). Die Quantifizierung über das virale

Protein p24-ag erfasst auch unreifes p24-Protein, was zur Überquantifizierung der Infektiosität

für PI-resistente HI-Viren führen kann. Ergänzend zu diesen Daten ließ sich in dieser Arbeit

zeigen, dass durch die lange Haltbarkeit des p24-Proteins im Gegensatz zur funktionellen

Infektiosität unterschiedliche Verhältnisse für die Mengen an p24-ag und Infektiosität in

DISKUSSION

93

Zellkulturüberständen erzeugt werden (Tschochner et al., 2007). Demgemäß erreichte die

Infektiosität in Zellkultur nach wenigen Tagen ihren höchsten Wert und sank dann durch

virusbedingte Lyse und Saturationseffekte in der Zellkultur schnell wieder ab. Dagegen

reicherte sich das virale Kapsidprotein weiter an, so dass sich in HIV-Zellkulturüberständen

eines jeden Virus verschiedene Verhältnisse für p24-ag und Infektiosität ergaben, deren

absoluter Wert im Wesentlichen vom Entnahmezeitpunkt des virushaltigen Überstands abhing.

Da die Virusquantifizierung über RNS weitgehend ähnliche Ergebnisse wie die Bestimmung

von p24-ag ergab, erscheinen diese beiden Methoden nicht geeignet, die Infektionsdosis für

funktionelle Tests zu bestimmen (Tschochner et al., 2007).

Neben der Problematik um die Bestimmung der Infektionsdosis zeigte sich, dass ein Teil der

Variabilität auf den Zustand der infizierten Zellen zurückzuführen war, da auch nach Infektion

desselben Virus bei identischer Infektionsdosis Unterschiede in der absolut erreichbaren

Virusreplikation erzeugt wurden. Deshalb war ein Vergleich anhand der absoluten Werte der

erzeugten Virusaktivität nicht möglich. Im Gegensatz dazu konnten bei zeitgleich infizierten

Zellkulturen mit steigender Infektionsdosis je Virus solange höhere absolute Werte für die

virale Replikation erzeugt werden, bis das Virus in sehr hohen Infektionsdosen durch seine

lytische Replikation zu keinem weiteren Anstieg der Werte führte. Die Verwendung mehrer

Infektionsdosen je Virus zur RC-Bestimmung hatte also den Vorteil, dass Zellkultur-

Saturationseffekte unabhängig davon, ob sie durch das Virus oder durch die Zellen einer

Zellkultur erzeugt wurden erkennbar wurden. Zudem konnte dadurch in dem hier vorgestellten

Verfahren auf die initiale Virusquantifizierung verzichtet werden. In der Folge konnte

einerseits eine sehr geringe Testvariabilität erzielt werden und andererseits die Durchführung

maßgeblich beschleunigt werden, da eine Bestimmung der infektiösen Einheiten nach Reed

und Münch im günstigsten Fall zusätzliche 14 Tage dauern würde (Reed und Münch, 2007).

In dem hier vorgestellten Test zu Bestimmung der Replikationskapazität erreichte der Klon

4lig7, welcher als resistentes Kontrollvirus in jedem Experiment mitgeführt wurde, einen

vergleichbaren Wert wie für dessen Plasmaprobe in einer Publikation 2002 ermittelt wurde

(Walter et al., 2002). Dessen Variabilität über die Gesamtheit der Versuche war für Zellkultur-

basierte Verfahren erstaunlich gering (1,27-fach) und zu anderen hoch standardisierten

Methoden vergleichbar. Mit Hilfe des neuartigen Messverfahrens konnten für N2D und N3L

geringfügig höhere RC-Werte ermittelt werden, wie sie für die Testung der beiden

Referenzviren in Koinfektionsversuchen zuvor publiziert worden waren (Nijhuis et al., 1999).

DISKUSSION

94

Es wäre denkbar, dass dies in der unterschiedlichen Herstellungsstrategie der Viren begründet

liegt. In den Koinfektionsversuchen wurde zur Herstellung der rekombinanten Viren das

Verfahren der homologen Rekombination angewandt. Dabei ist eine Mischung geringfügig

unterschiedlicher Varianten im DNS-Überlappungsbereich nicht auszuschließen, welche aber

durchaus zu geringgradig verändertem Replikationsverhalten führen könnten. Zudem wurde im

hier beschriebenen Testsystem NL4-3 als Klonierungsvektor und nicht wie im

Koinfektionsversuch HXB2 verwendet, was zu einer unterschiedlichen Replikationskapazität

der resultierenden rekombinanten Viren führen kann (Quinones-Mateu und Arts, 2002). Nicht

zuletzt wurde in unserem Versuch eine Zelllinie verwendet, im Koinfektionsversuch dagegen

primäre Zellen. Retrovirale Replikation variiert aber stark in unterschiedlichen Zellen, was

unter anderem auf verschiedene Konzentrationen an Deoxynukleosid-Triphosphaten

zurückzuführen sein kann (Jamburuthugoda et al., 2006; Quinones-Mateu und Arts, 2002;

Tebit et al., 2004). Von einer Arbeitsgruppe konnte zudem gezeigt werden, dass die Zugabe des

Lektins PHA zu Zellkulturen, welches auch zur Stimulation von primären Zellen Verwendung

findet, durch Aktivierung verschiedener Signalkaskaden die Mengen an Transkriptionsfaktoren

im Zellkern verändert und dadurch die Replikation herabsetzt (Van Opijnen et al., 2004).

Da sowohl im neu etablierten, als auch im Koinfektionsversuch der Klon N2D eine höhere RC

als das nicht resistente Referenzvirus erzielte, stellt sich die Frage, wie Viren generell eine

höhere RC besitzen können als nicht resistente, hoch adaptierte Wildtyp-Viren (z.B. NL4-3

oder HXB2). Erneut ist anzumerken, dass bei der Verwendung von rekombinanten Viren große

Patienten-abgeleitete Genanteile nicht vorhanden sind. Dadurch könnten in-vitro RC-Werte

größer als 100 % gemessen werden, die in-vivo unter Einbezug aller viraler Gene dagegen

möglicher Weise durch Mutationen in anderen viralen Genanteilen kompensiert werden

könnten. Auch konnte bereits von Simon und Kollegen in 2003 gezeigt werden, dass in

rekombinanten Viren, die nur die PR- und RT-Gene enthielten RC-Werte größer 100%

gemessen wurden, welche nach zusätzlichen Einbezug von gag in den rekombinanten Anteil

RC-Werte unter 100% erzielten. Noch sind nicht sämtliche Aminosäuren identifiziert, die einen

Einfluss auf die RC haben (Simon et al., 2003). In 2001 konnten Wrin und Kollegen zeigen,

dass Viren therapienaiver Patienten im Median eine Replikationskapazität von 73 % im

Vergleich zu NL4-3 besaßen (IQR (25-75): 47 % - 89 %) (Wrin et al., 2001). Dabei zeigte sich,

dass die nicht resistenten Viren eine sehr große Bandbreite an RC-Werten aufwiesen. Auch bei

der Analyse unserer Proben ohne primäre Resistenz-assoziierte Mutationen im Geno2RC-

Datensatz, konnte ein breites Spektrum an RC gefunden werden (n: 56, Min.: 5 %,

DISKUSSION

95

Max.: 300 %, Median: 56 %, IQR (25 - 75): 31 % - 101 %). Streng genommen ist aber ein

Vergleich der beiden Datensätze nicht ohne weiteres möglich, da sowohl rekombinante

Virusanteile als auch die Einschluss-Kriterien verschieden waren. So können einerseits Viren

von therapienaiven Patienten durch Transmission sehr wohl starke Resistenz aufweisen, und

andererseits die Abwesenheit der als primär beschriebenen Resistenz-Mutationen nicht alle

Mutationen mit einschließen, die der RC des Virus abträglich sind. Wie erst kürzlich

beschrieben, sind aber auch in-vivo vereinzelt Viren aufzufinden, die zu beschleunigter

Krankheitsprogression führen, einige wenige sogar obwohl sie hoch resistent sind (Markowitz

et al., 2005).

Neben Viren ohne Resistenz-assoziierte Mutationen, wurden in dieser Arbeit auch

verschiedene Proben mit primären und oder sekundären Resistenz-assoziierten Mutationen auf

ihre Replikationskapazität untersucht. Dies wurde neben den genotypischen Veränderungen aus

der Verteilung der Resistenzfaktoren ersichtlich. Beim Vergleich der Häufigkeitsverteilung der

CAT-Datenbank und der Geno2Pheno-Datenbank konnten eingipflige und zweigipflige

Verteilungen der Resistenzfaktoren festgestellt werden. Bei der eingipfligen Verteilung liegen

im Gegensatz zur zweigipfligen Verteilung, die Gipfel der sensitiven und der resistenten

Population so nahe beieinander, dass das Tal dazwischen überdeckt wird (Beerenwinkel et al.,

2003a). Betroffen davon sind diejenigen Medikamente, bei denen der maximal messbare

Resistenzfaktor kaum höher liegt als der klinisch relevante. Eine eingipflige Verteilung kann

prinzipiell auch dadurch verursacht werden, dass die analysierten Daten ausschließlich

resistente oder sensitive Viren gegenüber dem zu untersuchenden Medikament enthalten.

Tatsächlich aber erscheint diese Erklärung angesichts der breiten Kreuzresistenzen innerhalb

der Stoffklassen für die meisten Medikamente als nicht sehr wahrscheinlich. So besteht eine

strenge Korrelation zwischen den Resistenzprofilen der beiden Thymidin-Analoga D4T und

AZT. Zutreffen könnte das Argument dagegen für die Medikamente DDI, D4T und TDV der

CAT-Datenbank, da hier die RF-Werte fast ausschließlich größer als 1 waren. Auch der

Vergleich der RC-Verteilung mit der Verteilung der Resistenzen ergab - in Übereinstimmung

mit der Literatur - , dass eine reduzierte RC in der Regel mit einer erhöhten Resistenz

einherging. Alle Proben aus der CAT-Datenbank waren multipel vorbehandelt und wiesen

mehrere primäre Resistenz-assoziierte Mutationen auf. Die 67 Proben der CAT-Datenbank

besaßen im Vergleich zu resistenten Proben der Geno2RC-Datenbank erheblich niedrigere RC-

Werte (n: 67, Min.: 2 %, Max.: 102 %, MW: 27 %, Median: 21 %).

DISKUSSION

96

Auch wenn bislang kein Verfahren etabliert wurde, welches die kompetitive Anzucht von

Volllänge-Isolaten zur Gewinnung hochtitriger Virusüberstände verhindern kann, sollte das in

dieser Arbeit entwickelte System zur Bestimmung der RC prinzipiell dazu geeignet sein,

Volllänge-Isolaten bestimmen zu können. Die Notwendigkeit zur Entwicklung eines solchen

Verfahrens ergibt sich aus der zunehmenden Zahl an antiretroviralen Stoffklassen mit Zielen in

den gag-, pol- und env-Genen einerseits und auch aus der in dieser Arbeit aufgezeigten starken

Interaktion der viralen Gene untereinander. So werden zunehmend Mutationen außerhalb des

pol-Gens als Resistenz- und oder RC-assoziiert beschrieben wie z.B. die Mutationen im env-

Gen: Env:Q39R, Env:L44M, Env:R46M, Env:V69I (Kemp et al., 1998; Sa-Ferreira et al.,

2007). Durch die Übertragung des für rekombinante Viren etablierten Systems auf PM1-Zellen,

konnte die Replikationskapazität auch erfolgreich für Volllänge-Isolate bestimmt werden. Die

Ergebnisse belegten zudem für die Isolate vom Subtyp G und HIV-2, dass unter optimalen

Replikationsbedingungen in-vitro vergleichbare RC-Werte wie für HIV-1 (NL4-3) erreicht

werden können. Dies legt nahe, dass die verminderte Progression zu AIDS in HIV-2-infizierten

Personen im Vergleich zu HIV-1 am ehesten auf eine verminderte Pathogenität zurückzuführen

ist und nicht auf eine geringere RC. Einige der Volllänge-Isolate (B, CRF01_AE und C)

erreichten auf PM1-Zellen nicht die gewünschte maximale Replikation innerhalb von vier

Kultivierungstagen. Dies lag vermutlich an sehr niedrigen Virustitern in den verwendeten

Virusüberständen und langsameren Wachstumskinetiken der PM1 Zellen im Vergleich zu den

CEMx-174Seap-Zellen, so dass diese Viren die gesättigte Replikationsphase nicht erreichten.

Auch wenn damit die strengen Validierungsauflagen, die für die rekombinanten Viren

entwickelt worden waren, in diesen Fällen nicht erfüllt wurden, konnte für die Isolate der

Subtypen B und C anhand der Solver-Kurvenfunktion über die Rohwerte ein Maximum der

Virusreplikation extrapoliert werden. Der so errechnete RC-Wert von Subtyp C (60 %)

entsprach unlängst publizierten Werten (Ball et al., 2003; Marozsan et al., 2005). Besonderes

Interesse verdienen dabei die Hinweise auf die langsamere Progredienz der mit HIV-1 Subtyp

C infizierten Patienten, deren CD4-Zellzahlen in einer Studie signifikant langsamer abfielen als

in einer Vergleichspopulation, die mit einem anderen Subtyp infiziert war (Ball et al., 2003).

Diese Daten konnten jedoch von anderen Arbeitsgruppen bisher nicht bestätigt werden.

Kontrovers diskutiert wird bislang auch, wieso trotzdem die Prävalenz von HIV-1 Subtyp C

weltweit auf dem Vormarsch ist (Pollakis et al., 2004).

Insgesamt hat sich das hier entwickelte Verfahren als geeignet zur Testung von rekombinantem

HIV-1, primären HIV-1-Isolaten verschiedener Subtypen der Gruppe M sowie für HIV-2

DISKUSSION

97

erwiesen und erfüllt somit die Erwartungen. So konnte erfolgreich ein Datensatz generiert

werden, der funktionelle RC-Daten und korrespondierende Sequenzdaten enthielt. In dieser

Größenordung existiert weltweit bisher nur ein Datensatz zur RC, der aber nur in Auszügen frei

verfügbar ist (Segal et al., 2004). Dies liegt daran, dass sowohl rekombinante Virusverfahren

als auch funktionelle Verfahren zur Bestimmung der RC bislang nur zu Zwecken der

Forschung angewendet werden, und in diesem Kontext selten viele klinische Proben getestet

werden. Darum war ein nahe liegender Schritt, in Anlehnung an die Vorarbeiten in der

Arbeitsgruppe mit bioinformatischen Methoden ein Vorhersagesystem zu generieren, das direkt

von der Sequenzinformation die RC vorhersagen kann. Dazu wurden zwei selbst lernende

Verfahren angewendet: SVM und Entscheidungswälder. Beide Verfahren sind zur gefragten

Problemlösung grundsätzlich geeignet, aber die auf Entscheidungsbäumen beruhenden Wälder

sind theoretisch besser geeignet, um nominelle Daten wie z.B. Mutationen aufzutrennen,

wogegen SVM sich besser eignen, Datensätze mit kontinuierlichen Daten wie z.B. RC-Werte

zu interpretieren. In unserer Analyse der Mutationen ergab die Vorhersage der RC über

Entscheidungswälder einen vergleichbaren Vorhersagefehler wie die Analyse mittels SVM.

Dieser war mit etwa 13 - 15 % im oberen Mittelfeld, wenn man ihn mit den Vorhersagefehlern

der Resistenzfaktoren innerhalb des geno2pheno Systems vergleicht. Der Vorhersagefehler für

die RC war mit 15 % etwas größer als derjenige für die Resistenzfaktoren der PI und die

meisten NNRTI (9.6 % - 12,6 %), gleich gut wie für ABC (15,5 %) aber geringer wie

diejenigen für DDC, DDI und D4T (25 % - 32 %) (Beerenwinkel et al., 2002). Nach einer

Publikation von Beerenwinkel und Kollegen in 2003, kann die unterschiedliche

Vorhersagegüte der Resistenzfaktoren, besonders die hohe Abweichung für die Medikamente

DDI, DDC und D4T, am ehesten auf der Schwierigkeit bei deren technischer Bestimmung

beruhen. Demgemäß scheint die Auftrennbarkeit der RC-Daten hinsichtlich einzelner

Mutationen nicht so hoch gewesen zu sein, wie es für die leicht zu interpretierenden Daten der

NNRTI-Resistenz und der PI-Resistenz bei gleich großer Datenmenge war. Dies weist darauf

hin, dass es bei der Vorhersage der RC weniger Schlüsselmutationen zu geben scheint als

zumindest bei der NNRTI- und PI-Resistenz. Wie es auch in der relativen Gewichtung der

einzelnen Mutationen sichtbar wurde, sind für die RC eher viele Einzelmutationen mit jeweils

wenig Gewicht relevant. Demnach wäre die Vorhersage der RC insgesamt komplexer als die

Vorhersage einzelner Resistenzfaktoren. So gesehen wäre es denkbar, dass ein entsprechend

größerer Datensatz den Vorhersagefehler der RC senken könnte.

DISKUSSION

98

Bei genauerer Betrachtung der RC-Ergebnisse ließ sich aber auch feststellen, dass hoch

resistente Viren mit niedriger RC besser vergleichbare Werte zwischen gemessener und

vorhergesagter Replikationskapazität erzielten, wohingegen für wenig oder nicht resistente

Viren mit hoher RC generell zu geringe Werte vorhergesagt wurden. Beispielsweise betrug der

vorhergesagte Wert für das Referenzvirus NL4-3: 53 %, obwohl er definitionsgemäß 100 %

betragen sollte. Auch die Vorhersage der RC für den nicht resistenten Klon HXB2 ergab einen

zu niedrigen Wert (47,42%). HXB2 unterscheidet sich im rekombinanten Genanteil in 14

Aminosäuren von NL4-3, was geringfügig andere Voraussagen für NL4-3 und HXB2 erklärbar

macht. Da auch die RC von HXB2 als zu gering geschätzt wurde, liegt es nahe, dass das

Gewicht dieser Polymorphismen für die RC-Vorhersage nicht entscheidend war. Auch war die

gering vorhergesagte RC nicht auf den Effekt einzelner entscheidender Mutationen

zurückzuführen und muss daher am ehesten auf dem Summationseffekt vieler AS an vielen

Positionen beruhen. Aber selbst umfangreiche Fehleranalysen und Neuberechnungen mit

teilweise virtuellen Datensätzen führten jedoch nicht zu einer deutlichen Verbesserung der

Vorhersage für Wildtyp-artige Viren. So war eine mögliche Erklärung, dass wesentlich mehr

resistente als nicht resistente Viren in der analysierten Datenbank enthalten waren. Bei einer

Zusatzanalyse des gleichen Datensatzes, aber unter zusätzlichem Einbezug von 50 NL4-3-

Sequenzen, konnten für nicht resistente Viren aber nur geringfügig höhere RC-Werte erzielt

werden (Daten nicht gezeigt). Auch sind in den Datensatz zur Vorhersage der

Replikationskapazität verschiedene Subtypen eingegangen. Für die Resistenz ist bereits

bekannt, dass Subtypen-spezifisch Polymorphismen auftreten, welche die Entstehung von

Resistenz in einem Subtyp zu beeinflussen scheinen. Es scheint mehr als wahrscheinlich, dass

Subtyp-spezifisch relevante Mutationen auftreten, die Einfluss auf die RC besitzen. Durch den

Einbezug von 53 verschiedenen Proben von non-B-Subtypen zur Vorhersage der RC, könnten

Mutationen als relevant erachtet worden sein, die im Subtyp B, dem auch NL4-3 zuzuordnen

ist, keine Relevanz haben. In der Folge könnte die RC für Subtyp B fälschlicherweise zu

niedrig vorhergesagt werden. Zukünftige Analysen können möglicherweise eine Abklärung

erbringen.

Insgesamt wurden jeweils eine univariate und zwei multivariate Analysen der funktionellen

RC-Daten im Vergleich zu pol-Sequenzen und – aus einem kleineren Datensatz – zu gag- und

pol-Sequenzen durchgeführt. Die mit Hilfe der univariaten Analyse ermittelten AS-Austausche

mögen auf Grund der Eigenschaft univariater Analysen, Korrelationen zu ermitteln, ohne den

Kontext anderer Mutationen zu berücksichtigen, im Wesentlichen Indikatoren für eine

verringerte oder erhöhte RC einer Probe im Vergleich zu NL4-3 darstellen. Der Einfluss von

DISKUSSION

99

Mischungen an Sequenzpositionen zeigte sich bei dieser Analyse als geringgradig. Diese

Untersuchung war insofern von besonderem Interesse, da Mischungen in klinischen Proben

recht häufig auftreten und der Einfluss von nicht eindeutigen Sequenzinformationen auf

bioinformatische Methoden zum Teil gravierend sein kann. Hinsichtlich der RC-Vorhersagen

traf dies aber offenbar nicht zu. Interessanterweise wurden viele der univariat identifizierten

Markermutationen auch über die multivariate Analyse, insbesondere mit den

Entscheidungswäldern identifiziert. Einerseits könnte die univariate Analyse besonders adäquat

war gewesen sein, anderseits könnte der geringe Unterschied auf eine zu geringe

Diskriminierungsfähigkeit kausaler Zusammenhänge durch die Entscheidungswälder

zurückzuführen gewesen sein. Es stellte sich also die Frage, inwieweit die identifizierten

Mutationen objektivierbar relevant für die RC-Veränderungen waren.

Ein Vergleich der identifizierten RC-beeinflussenden Mutationen mit der aktuellen Literatur

ergab, dass ein großer Anteil der RC-beeinflussenden Mutationen auch als Resistenz-

assoziierte Mutationen identifiziert worden war. Der große Anteil an Resistenz-assoziierten

Mutationen, ist am ehesten darauf zurückzuführen, dass der Selektionsdruck sich größtenteils

auf Genabschnitte auswirkt, welche sich ohne einen Gesamt-Funktionsverlust verändern

können (Croteau et al., 1997). In der Folge werden auch Mutationen, welche die RC verändern

an diesen Genorten gehäuft auftreten. Wie bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen publiziert

war zu erwarten gewesen, dass primäre Mutationen als wesentliche, die RC negativ

beeinflussende Faktoren in Erscheinung treten. Aber auch die sekundären Mutationen sollten

als kompensatorische Mutationen mit positivem Einfluss Geltung finden. Und so finden sich

auch einige, aber durchaus nicht alle primären PI-Resistenz-assoziierten Mutationen als RC-

relevant wieder. Daher bleibt anzumerken, dass der Einfluss von seltenen Mutationen auf die

RC möglicherweise noch unterquantifiziert war. Eine Erweiterung des Datensatzes könnte

darüber Aufschluss geben. Darüber hinaus war auffällig, dass viele Polymorphismen eher als

negative Faktoren erkannt wurden, anstelle tatsächlich kompensatorisch zu wirken.

Möglicherweise sind diese Phänomene aber auch im Kontext der als zu gering eingeschätzten

Wildtyp-RC-Werte des Subtyps B zu sehen. Neben publizierten RC-beeinflussenden

Mutationen wurden aber auch neue, bislang nicht beschriebene Mutationen identifiziert, deren

Bedeutung in der Zukunft funktionell untersucht werden sollte.

Zudem sollte geprüft werden, ob der Einbezug von 92 gag-Sequenzen in die bioinformatischen

Analysen eine andere Verteilung der wichtigsten RC-assoziierten Mutationen ergibt. Sowohl in

DISKUSSION

100

der univariaten Analyse, als auch in der multivariaten Analyse, konnten gag-Mutationen unter

den 25 wichtigsten RC-beeinflussenden Mutationen ermittelt werden. Erneut wurden einige

dieser Mutationen bereits als Resistenz-assoziierte und / oder RC-beeinflussende Mutationen

publiziert. Die Mutation Gag:I479V wurde bereits als Therapie-assoziiert beschrieben (Peters

et al., 2001). Die Mutation Gag:E477G liegt im KQE-Motiv und wurde von einigen Autoren

als Therapie-assoziiert beschrieben, was aber von anderen Autoren nicht bestätigt werden

konnte (Gallego et al., 2001). Die beiden Mutationen liegen außerhalb der

Schnittstellen p7 / p1-gag (428 - 437) und p1 / p6-gag (443 - 453), was zu belegen scheint, dass

nicht nur Mutationen direkt innerhalb der Schnittstellen für die Prozessierung des Gag-Pol-

Vorläuferproteins durch PI-resistente Proteasen relevant sein können. Zudem konnten auch

innerhalb der Schnittstellen für die PR wichtige RC-beeinflussende Mutationen erkannt

werden, die zuvor bereits als relevant beschrieben wurden (Barbour et al., 2002; Menzo et al.,

2003; Picchio et al., 2000). Innerhalb der wichtigsten RC-beeinflussenden Mutationen konnte

interessanterweise auch eine Insertion gefunden werden. Da gag eines der variabelsten Gene in

HIV ist und die Bedeutung der häufigen Insertionen in diesem Gen noch nicht geklärt ist,

könnte es durchaus sein, dass die Insertionen einen wesentlichen Beitrag zur Kompensation

verringerter RC liefern (Barbour et al., 2002; Holguin et al., 2005; Menzo et al., 2003; Picchio

et al., 2000). Der Einschluss von Teilen der Gag-Sequenzen in die Analysen hat in

Übereinstimmung zur Literatur ergeben, dass im C-terminalen Gag-Protein relevante

Adaptionen im Zusammenhang mit PI-Resistenz und RC stattfinden. Darum liegt es nahe, dass

die Vorhersage der RC verbessert werden könnte, wenn zusätzlich zu pol-Sequenzen gag-

Sequenzen zumindest in Anteilen zur RC-Vorhersage mit einbezogen würden. Dies wird auch

dadurch angedeutet, dass der Vorhersagefehler der Prädiktion trotz der deutlich verringerten

Datensatzgröße vergleichsweise unverändert war. Insgesamt bleibt festzustellen, dass die

Vorhersage der RC komplexer zu sein scheint als diejenige der Resistenz, was am ehesten an

der Vielzahl von RC-assoziierten Mutationen mit jeweils relativ geringem Einfluss begründet

sein könnte. Auch daher erscheinen zukünftige Analysen über größere Datensätze

wünschenswert, mit der auch subtypenspezifische Vorhersagen der RC sowie eine bessere

Vorhersage von nicht resistenten Viren möglich sein sollten. Nicht zuletzt sollten weitere virale

Gene in das Vorhersagesystem integriert werden, um neue RC-assoziierte Mutationen

außerhalb der bisher erfassten Genabschnitte zu identifizieren.

Durch den steten Wechsel zwischen PI- und RTI-haltiger Therapie wurde in der CAT-Studie

auf die virale Quasispezies enormer Selektionsdruck ausgeübt. Ziel der Studie war eine

DISKUSSION

101

partielle Reversion zu Wildtyp im jeweils nicht therapierten Genomabschnitt. Dieses Ziel

konnte jedoch nur in drei Patienten erreicht werden. In diesen Patienten herrschte abwechselnd

eine von zwei Hauptpopulationen vor, die jeweils gemäß ihrer Resistenz gegen die aktuelle

antiretrovirale Therapie (ART) selektioniert wurden. Auch hier zeigte sich, dass die unter PI

selektionierte Population eine stärker reduzierte RC aufwies als die unter RTI selektionierte

(Deeks et al., 2005). Warum dieses Phänomen bei den übrigen Patienten nicht nachweisbar

wurde, lässt sich möglicherweise dadurch erklären, dass bei diesen Patienten in den

Quasispezies keine Viren vorhanden waren, die entweder hauptsächlich PI-resistent oder

hauptsächlich RTI-resistent waren, sondern nur multipel resistente Virusstämme. Liegen nur

Viren vor, die sowohl hohe PI- als auch hohe RTI-Resistenz verursachen, wäre eine

Verschiebung der viralen Populationen möglicherweise nicht im selben Ausmaß zu

beobachten. Unklar ist dabei, wieso diese Varianten nicht durch Rekombination mit Wildtyp-

artigen Viren entstehen. Möglicherweise sind bei manchen Patienten durch lang anhaltende

Therapie nicht resistente Wildtyp-Viren gänzlich aus der Quasispezies verdrängt worden. Auch

wäre es denkbar, dass ein Wechsel der vorrangigen Population einer anderen Population mit

einer zu gewichtigen Replikations-Einbuße einherginge. Da aber in den anderen Patienten

kaum genotypische Veränderungen aufzufinden waren, selbst wenn Veränderungen der VL

etwa nach einer Therapie-Umstellung auftraten, lag der Schluss nahe, dass diese Varianten

wegen der Detektionsgrenze der genotypischen Analyse von bis zu 30 % zwar vorhanden sind,

aber bei dieser Art von Analyse nicht in Erscheinung treten (Beerenwinkel et al., 2003b; Korn

et al., 2003; Schuurman et al., 1999; Schuurman et al., 2002). Zum Nachweis solcher

Minoritäten wurden klonale Analysen und selektive real-time-PCR-Methoden mit deutlich

geringerer Nachweisgrenze verwendet. Tatsächlich konnten aber in keiner der Methoden

Minoritäten entdeckt werden, welche die beobachteten Veränderungen der VL hätten erklären

können. Da mit der hoch empfindlichen real-time-PCR aber nur drei Resistenz-assoziierte

Mutationen untersucht wurden, besteht grundsätzlich die Möglichkeit, dass an anderen

Resistenz-assoziierten Positionen vermehrt nicht detektierte Minoritäten vorgelegen haben,

welche die transienten VL-Anstiege erklären könnten.

In den CAT-Klonen konnten einzig die mit primärer Resistenz assoziierten Mutationen

RT:Y181C und RT:G190A häufiger als einmal in den Minoritäten nachgewiesen werden.

Diese Mutationen traten jedoch immer in Kombination entweder mit der NNRTI-Mutation

RT:K103N oder RT:Y188L auf, welche allein hohe NNRTI-Resistenz verursachen.

Anzumerken ist, dass diese Patienten während der Studie keine NNRTI-haltige Therapie

DISKUSSION

102

verabreicht bekamen. Da NNRTI-Resistenz-Mutationen überwiegend mit keinen oder sehr

geringen Veränderungen der RC einhergehen sollen war zu erwarten, dass durch den fehlenden

Selektionsdruck für die NNRTI-Resistenzmutationen kaum Verschiebungen auftraten (Dykes

et al., 2001; Iglesias-Ussel et al., 2002). Auch in der Kontrollgruppe konnten einige wenige

Resistenzmutationen nachgewiesen werden, die am ehesten auf Transmission oder gerade

entstehende Resistenz zurückzuführen waren. Der überwiegende Anteil der nur als Minoritäten

nachgewiesen Mutationen waren bislang unbeschriebene Mutationen. Es stellte sich heraus,

dass nur in der CAT-Gruppe die Anzahl dieser Mutationen direkt mit der Veränderung in der

VL einherging. Diese Korrelation konnte auf Basenebene jedoch nicht gefunden werden, was

dafür spricht, dass die Aminosäure-Austausche in den CAT-Klonen durch das wechselnde

Therapie-Regime selektioniert wurden. Bei den Basenaustauschen ging bemerkenswerter

Weise die Korrelation durch die ungerichtete Anzahl an stummen Mutationen verloren. Da seit

einiger Zeit ist bekannt, das sich virale Varianten in verschiedenen Kompartimenten wie

Gehirn, Lymphkonten oder Hoden unabhängig voneinander entwickeln können, wäre auch eine

Rekrutierung verschiedener viraler Varianten aus unterschiedlichen Kompartimenten denkbar

(Bagasra, 2006). Auf eine unterschiedliche Herkunft der nachgewiesenen Varianten deuten

auch die Ergebnisse der phylogenetischen Analysen. Hier stellte sich heraus, dass die

Sequenzen der Klone in der CAT-Gruppe eher untereinander verwandt waren als mit ihrer

jeweiligen Plasmapopulation. Auch waren die Sequenzen der Plasmapopulationen zueinander

enger verwandt als zu ihren Klonen. Eine Ausnahme stellte der auffällig große genetische

Abstand zwischen der Sequenz der CAT-Plasmaprobe KL89 und den Plasmasequenzen KL90 -

KL92 des Patienten 11 dar. Er lässt sich aber deutlich auf einen Wechsel des Therapie-

Regimes zurückführen. Abgesehen von dieser Ausnahme lässt sich die nahe phylogenetische

Verwandtschaft zwischen den Sequenzen der Plasmapopulationen untereinander und der große

phylogenetische Unterschied zu den jeweiligen klonalen Sequenzen am ehesten durch folgende

Überlegungen erklären. Einerseits wurden - wie bereits mehrfach erwähnt - bei der

Sequenzanalyse von Plasmapopulationen Minoritäten nur zu einem geringen Anteil erfasst. Bei

den Klonen hingegen wurden auch Minoritäten erfasst. Werden mehrere Klone mit ähnlichen

Minoritäten-Mutationen bestimmt, kann die Verwandtschaft der Klone zueinander größer sein

als zur Plasmapopulation, in der alle Minoritäten fehlen. So gesehen stellt die Sequenz der

Plasmapopulation eine idealisierte Population dar, die einen Querschnitt über die

verschiedenen Quasispezies repräsentiert (Coffin, 1995). Der Unterschied zwischen

Plasmasequenz und zugehörigen Klonen steigt dabei, je größer der Anteil an Subpopulationen

ist. Gemäß dieser Vorstellung spricht die höhere Auftrennung zwischen Plasmapopulationen

DISKUSSION

103

und zugehörigen Klonen in der CAT-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe für das

Vorhandensein einer größeren Diversität in der CAT-Gruppe, und somit dafür, dass der unter

stetig wechselndem Selektionsdruck vermehrt virale Varianten selektioniert werden.

Da es Hinweise darauf gibt, dass die Hemmung der zellulären Deaminase APOBEC3G durch

das virale Protein Vif nicht vollständig ausgeprägt ist, war es nahe liegend zu prüfen, ob ein

Zusammenhang zwischen den uncharakterisierten Mutationen in den CAT-Klonen und einer

residuellen APOBEC3G-Aktivität bestand (Berkhout et al., 2006). Betrachtet man die

prozentuale Verteilung der vier Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin in der HIV-1-

Sequenz von Patientenviren aus der CAT- und der Kontrollgruppe, kann in beiden Gruppen ein

erhöhter Anteil an Adenin- und Thymidinbasen festgestellt werden. Diese ungleiche Basen-

Verteilung ist als typisch für Lentiviren beschrieben worden (Zhang et al., 2003) und

wahrscheinlich die direkte Folge der residuellen APOBEC3G-Aktivität. Überraschenderweise

waren bei den als Minoritäten nachgewiesenen Mutationen innerhalb der CAT-Gruppe jedoch

signifikant mehr Adenin als Cytosin oder Guanin ausgetauscht. Dagegen mutierte innerhalb der

Kontrollgruppe keine Base signifikant häufiger als eine andere, was für ungerichtete

Basenaustausche innerhalb der Kontrollgruppe spricht. Insbesondere fand sich in der CAT-

Gruppe eine signifikante Häufung von Adenin zu Guanin-Austauschen im Vergleich zu Guanin

zu Adenin-Austauschen. Daher kann den Minoritäten-Mutationen nur zu einem geringen Anteil

eine residuelle APOBEC-3G-Aktivität zu Grunde liegen. Vielmehr scheint es eine Art

gegenläufigen Mechanismus zu geben. Es wäre auch denkbar, dass die Minoritäten-Mutationen

Folge der Rekrutierung von erheblich älteren Varianten sind, und aus diesem Grund noch

geringere Anteile von Guanin zu Adenin-Austauschen aufweisen. Zusammengenommen lassen

sich in der CAT-Population Minoritäten mit größerer Diversität und in Korrelation zur Plasma-

Viruslast-Veränderung nachweisen, die am ehesten den höheren Selektionsdruck durch das

besondere Therapie-Regime wiederspiegeln. Die pathogenetische Herkunft und die Bedeutung

der Varianten konnte aber letztlich nicht abgeklärt werden, da sich keine relevanten

Unterschiede in Resistenz oder RC nachweisen ließen.

Das abschließend maßgebliche Kriterium zur Beurteilung der RC sollte das therapeutische

Ansprechen und die damit verbundene klinische Relevanz sein. In dieser Arbeit wurden

insgesamt drei verschiedene Datensätze auf die klinische Relevanz der RC hin untersucht.

Zunächst ließ sich anhand dreier Patienten im Verlauf eine gute Korrelation der RC, zum VL-

Verlauf und zur Resistenz herstellen. Anhand dieser Fallbeispiele kann man gut demonstrieren,

DISKUSSION

104

dass RC, VL und CD4-Zellzahlen im Verlauf voneinander abhängig erscheinen. So können

RC-Anstiege offenbar mit einer klinischen Verschlechterung einhergehen, und RC-Abfälle sich

als prognostisch günstig erweisen. Fallbeschreibungen sind aber neben ihrer Anschaulichkeit

nicht generalisierbar. Daher wurden in der Folge und unter Zuhilfenahme der entwickelten

Methoden größere klinische Probenzahlen von Patienten im Verlauf untersucht.

In einer weiteren Analyse anhand von Daten aus der EUResist-Kohorte wurden anhand der

vorliegenden Sequenzanalysen aus dem pol-Gen die RC und Resistenz vorhergesagt und in

Bezug auf das Therapie-Ansprechen in Folgeproben retrospektiv beurteilt. Es wurde deutlich,

dass der Einbezug von RC-Werten einen wertvollen Hinweis auf das künftige Therapie-

Ansprechen leisten kann. Den weitaus größeren Einfluss schien jedoch die Resistenz zu haben.

Anzumerken ist, dass anhand dieses Modells nur das Therapie-Ansprechen anhand der VL-

Reduktion beurteilt werden konnte, Veränderungen der CD4-Zellzahl jedoch nicht

berücksichtigt werden konnten, da dazu keine Angaben vorlagen. Eine Korrelation von RC und

CD4-Zellzahl scheint aber viel versprechender zu sein als die Korrelation zur VL, da die

klinische Relevanz der RC durchaus schon im Kontext stabiler immunologischer Verläufe bei

gleichzeitigem virologischem Therapie-Versagen diskutiert wurde. So scheint eine

ausführlichere Prüfung des Modells unter Einbezug der CD4-Zellzahl zur Vorhersage des

Therapie-Ansprechens sinnvoll. Dennoch bleibt festzustellen, dass der prognostische Wert der

RC auf den VL-Verlauf eher gering zu sein scheint. Im Gegensatz zu den Verlaufsproben der

beschriebenen Fallbeispiele wurden in dieser Analyse nicht die RC der Folgeproben

berücksichtigt. So muss auch überlegt werden, dass der RC als Verlaufsparameter

möglicherweise eine höhere Bedeutung zukommen kann im Vergleich zu ihrem prognostischen

Wert.

Um die RC in einer Studienpopulation zu untersuchen, in welcher der Einfluss der Resistenz

vergleichsweise gering war, wurde der Datensatz der CAT-Studie herangezogen. Durch die

durchwegs hohe Resistenz von Folgeproben innerhalb dieser Studienpopulation sollte der

Einfluss der Resistenz auf das Therapie-Ansprechen relativ gering sein. In Übereinstimmung

mit aktueller Literatur ergab sich eine signifikante Korrelation zwischen der CD4-Zellzahl und

der VL. Des Weiteren konnte eine signifikante Korrelation zwischen der RC und der CD4-

Zellzahl festgestellt werden, aber erneut nicht zwischen der RC und der VL. Dieses Ergebnis

unterstützt somit die bereits erwähnten Überlegungen. Offenbar wirkten sich Veränderungen

der RC vor allem auf die CD4-Zellzahlen günstig aus und hatten weniger Einfluss auf die VL.

Zudem konnte eine signifikante Korrelation zwischen der RC-Veränderung und der

DISKUSSION

105

Veränderung der CD8-Zellzahl ermittelt werden. Ein kausaler Zusammenhang zwischen der

Aktivierung des Immunsystems und der Replikation wurde bereits für einzelne virale

Mutationen gezeigt (Moore et al., 2002). Dies erscheint plausibel, da auch in dieser Arbeit eine

signifikante Korrelation zwischen den Veränderungen der CD4- und CD8-Zellzahl im

zeitlichen Verlauf nachgewiesen wurde. Leider scheint die Annahme, dass in der speziellen

Studienpopulation der CAT-Studie der Einfluss der Resistenz leichter herauszurechnen sei

nicht ohne weiteres zuzutreffen. Wie in der Analyse der Effizienz des PI-Regimes gegenüber

dem NRTI-Regime deutlich wurde, lag eine maßgebliche residuelle Medikamentenaktivität für

RTI-basierte Behandlungen vor. So dauerten diese eindeutig länger als PI-basierte

Behandlungsphasen. Diese Daten werden unterstützt durch Daten von Deeks, der ähnliches

beobachtete (Deeks et al., 2005). Hier wurden Patienten unter HAART nur mit den RTI-

Anteilen oder den PI-Anteilen ihrer Therapie weiterbehandelt, und auch hier zeigte sich, dass

die Patienten unter RTI-haltiger Therapie weniger gravierende CD4-Zellzahl-Abfälle

aufwiesen als unter der PI-Therapie.

So zeigt sich der klinische Einfluss der RC im Wesentlichen als kleiner als der der Resistenz.

Dagegen scheint die RC vor allem die Pathogenität des Virus wiederzuspiegeln. Dafür

sprechen vor allem die zahlreichen Korrelationen, die für immunologische Parameter und die

RC, wie z.B. die CD8-Zellzahl nachgewiesen werden konnten. Demgemäß werden in-vivo HI-

Viren ohne Replikationsvorteil nur selektioniert, wenn dadurch auch ein immunologischer

Benefit bewirkt wird. Dies bedeutet, dass die Pathogenität des Virus deshalb nicht gleichzeitig

erhöht sein muss. Da die RC in den verwendeten klinischen Datensets nicht mit der VL, aber

zu den immunologischen Parametern korreliert, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass

die RC – möglicherweise als Surrogatmarker – sehr wohl geeignet ist, die pathogenetischen

Veränderungen des Virus darzustellen. Dennoch ist der Einfluss der RC durch die

Wechselwirkung einer Vielzahl von klinischen Parametern sehr schwer differenzierbar. Um die

hoch komplexen Zusammenhänge hinreichend darzustellen, scheinen Analysen von weiteren

umfangreichen Datensets unter Zuhilfenahme bioinformatischer Methoden essentiell.

DISKUSSION

106

Ausblick

Prinzipiell scheint die RC – insbesondere als Verlaufsparamter - in der klinischen Praxis in

Kombination mit einer Resistenz-Bestimmung denkbar. Über die Vorhersage der RC anhand

des Genotyps wäre die Bestimmung der RC einer Probe wesentlich erleichtert und in kurzer

Zeit durchführbar. Die Problematik der Vorhersagegenauigkeit für Wildtypen sollte dazu aber

gelöst werden, was über eine Adaption des Vorhersagemodells auf verschiedene Subtypen

denkbar wäre. Auch sollte das Modell auf weitere Genabschnitte, wenn nicht das gesamte HIV-

Genom erweitert werden. Dazu muss jedoch eine Möglichkeit gefunden werden, die Anzucht

primärer Isolate mit kompetitiver Virusreplikation zu verhindern. Die so ermittelten

Mutationen und deren Einfluss auf die RC könnten anschließend mit den verabreichten

Therapie-Regimes abgeglichen werden. Dann ließen sich künftig Therapie-Regimes

entwickeln, die im Fall der Entstehung von Medikamentenresistenz eine Verschiebung in

Richtung geringer RC verursachen könnten.

Neuere Daten zeigen, dass die Anzahl an multipel medikamentenresistenten Virusvarianten in

Patienten steigt. Obwohl eine Beibehaltung des Therapie-Regimes meist trotz der hohen

Resistenz einen geringfügigen klinischen Benefit bewirkt, sind die Limitationen der

antiretroviralen Therapie hier besonders deutlich. Eine Anwendungsmöglichkeit könnte im

Falle einer Schwangerschaft bestehen. In dieser Phase ist der Einsatz von antiretroviraler

Therapie nicht immer von Vorteil. Bei langsam replizierenden Viren könnte eine Therapie-

Unterbrechung in Betracht gezogen werden, oder durch geeignete antiretrovirale Therapie die

Selektion langsam replizierender Viren gefördert werden.

Kontrovers diskutiert wird auch heute noch, wann die antiretrovirale Therapie begonnen

werden sollte. In Anbetracht der immer höheren Übertragungsrate von Resistenz bei der

Transmission kann möglicherweise die Bestimmung der RC einen maßgeblichen Beitrag in der

klinischen Praxis leisten.

Abschließend haben sich in dieser Arbeit einige Hinweise ergeben, dass die Resistenz-

assoziierte Verringerung der RC mit einer Verminderung der viralen Pathogenität einhergeht.

Weitergehende Untersuchungen in diese Richtung können möglicherweise helfen, attenuierte

HI-Viren zu finden, deren Nutzen neben dem sekundären Benefit unter einer ART

weitergehend in Richtung Vakzine-Entwicklung zu sehen sein könnten.

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

107

7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abkürzung Ausformulierung

% Prozent °C Grad Celsius

µ Mikro (10-6)

(a) engl.: antisense Abb. Abbildung

AIDS engl.: aquired immunodeficiency syndrome

APOBEC3G engl.: apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G = CEM15 ART Antiretrovirale Therapie

AS Aminosäure

bp Basenpaar BSA Kälberserumalbumin

bzw. beziehungsweise

CAT engl.: continuously alternating therapy CRF engl.: circulating recombinant form

CTL engl.: cytotoxic T-lymphocyte

DMEM engl.: Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid

DNS Desoxyribnucleinsäure

dNTP Deoxynukleotidtriphosphate E.coli lat.: Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraazetat

ELISA engl.: enzyme linked immunosorbent assay env engl.: envelope glycoproteins

et al. und andere

FKS Fötales Kälberserum FI Fusions-Inhibitoren

g Gramm

gag engl.: group specific antigen Gag Gag-Protein

gp engl.: glycoprotein

h engl.: hour HAART engl.: highly active antiretroviral therapy

H2O Wasser

H3C2O2 Azetat


108


HCl Salzsäure HIV Humanes Immundefizienzvirus IC50 engl.: inhibitoriy conzentration 50 % ID Infektionsdosis IL Interleukin INT Integrase IQR engl.: interquartile range IU engl.: infectious units k Kilo kb Kilobasen KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kalium-Dihydrogenphosphat Konz. Konzentration l Liter LB Luria-Bertani LTR engl.: long terminal repeat M Molar (mol/l) m milli (10-3) MA Matrix Max. Maximum MDR engl.: multidrug resistance MgCl Magnesiumchlorid min Minute Min. Minimum MOI engl.: multiplicity of infection MW Mittelwert N Normale n Anzahl Na2 HPO4 Di-Natriumhydrogenphosphat NaAc Natriumacetat NaCl Natriumchlorid NC Engl.: nucleocapsid NEB engl.: New Englangd Biolabs n d. nicht durchgeführt NNRTI nicht- nukleosidaler reverse Transkriptase-Inhibitor NRTI nukleosidaler reverse Transkriptase-Inhibitor NtRTI nukleotidaler reverse Transkriptase-Inhibitor o. ohne OD Optische Dichte


109


p Piko (10-12) Pat. Patient p24-ag p24-Antigen PBMC engl.: peripheral blood mononuclear cells PCR engl.: polymerase chain reaction pH Negativer lokatischer Logarithmus der Protonenkonzentration PHA-P Phytohämagglutinin PI Protease-Inhibitor Pol Polymerase PR Protease RC engl.: replication capacity RLU engl.: relative light units RF Resistenfaktor RNS Ribonucleinsäure RT reverse Transkriptase RTI reverser Transkriptase-Inhibitor s Sekunde (s) engl.: sense s. siehe s.o. siehe oben s.u. siehe unten SEAP Sezernierte alkalische Phosphatase Stabwn Standardabweichung SIV engl.: simian immunodefiziency virus SV40-Virus simian virus 40 Tab. Tabelle TAE-Puffer Tris-Acetat-EDTA-Puffer tat engl: transactivator of transcription TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TCID50 engl.: tissue culture infectious dose TM Transmembranprotein Tris Trishydroxymethylaminomethan U Units Upm Umdrehungen pro Minute VL Viruslast UNAIDS Koordinierungsprogramm der Vereinten Nationen zur HIV-Bekämpfung Wo Woche WHO engl.: world health organisation WT Wildtyp

LITERATURVERZEICHNIS

110

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http://www.laborlexikon.de

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http://www.virologie-uni-erlangen.de

DANKSAGUNG

124

9 DANKSAGUNG

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein für die Betreuuung und die

Möglichkeit, diese Arbeit unter hervorragenden Bedingungen und einem angenehmen

Arbeitsklima am Virologischen Institut, Klinische und Molekulare Virolgie, Nationales

Referenzzentrum für Retreoviren durchführen zu können.

Bei Herrn PD Dr. Robert Slany bedanke ich mich herzlich für seine Bereitschaft, die

vorliegende Arbeit als Gutachter vor dem Fachbereich II der Naturwissenschaftlichen Fakultät

zu vertreten. Vielmals bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler für

die Durchführung der Promotionsprüfung.

Besonderer Dank gilt meinem Betreuer Dr. Hauke Walter für die zahlreichen Ideen und

Diskussionen, die dieser Arbeit zugrunde liegen.

Ganz spezieller Dank gilt PD Dr. Barbara Schmidt, die immer ein offenes Ohr für mich hatte

und mir stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Außerdem möchte ich mich bei allen aktuellen

und ehemaligen Mitarbeitern für die große Einsatzbereitschaft und gute Zusammenarbeit,

sowie bei Karin Metzner und der Abteilung der Diagnostik und dem Leiter Dr. Klaus Korn

bedanken.

Für die Zusammenarbeit bei mathematischen Fragestellungen gilt mein besonderer Dank

Dr. Thomas Straubinger.

An dieser Stelle sei auch unseren Kooperationspartnern vielmals gedankt in Saarbrücken:

Prof. Dr. Thomas Lengauer, Dr. Joachim Büch, Tobias Sing und Hendrik Weisser, in Berlin:

Dr. Keikawus Arasteh, Dr. Hartmuth Stocker und Christoph Weber, in Ispra:

Dr. Niko Stilianakis, und nicht zu vergessen allen Patienten und Klinikern, die diese Arbeit

durch Teilnahme und Durchführung der klinischen Studien mit ermöglicht haben.

Zudem sei auch allen anderen herzlich gedankt, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen

haben.

ANHANG

125

10 ANHANG

Tab. 33: Liste der in Deutschland zur Zeit zugelassenen antiretroviralen Medikamente, modifiziert nach Schmidt et al., 2006, Springer Verlag)

nukleosidische reverse

Transkriptase-Inhibitoren


nicht-nukleosidische

reverse Transkriptase-

Inhibitoren

Fusions-Inhibitoren

NRTI PI NNRTI FI

Zidovudine (AZT) Ritonavir (RTV) Nevirapine (NVP) Enfuvirtide (T-20)

Lamivudine (3TC) Saquinavir (SQV) Delavirdine (DLV)

Zalcitabine (DDC) Indinavir (IDV) Efavirenz (EFV)

Didanosine (DDI) Nelfinavir (NLV)

Stavudine (D4T) Amprenavir (APV)

Abacavir (ABC) Lopinavir / r (LPV)

Tenofovir (TDV) a Atazanavir (ATV)

Emticitabine (FTC) Tipranavir (TPV) a NtRTI: nukleotidischer reverser Transkriptase-Inhibitor; /r: Kombination mit niedrig dosiertem Ritonavir.

Ein-Buchstaben-Benennungen der Aminosäuren

Aminosäure Abkürzung Aminosäure Abkürzung

Alanin A Leucin L Arginin R Lysin K

Asparagin N Methionin M Asparaginsäure D Phenylalanin F

Cystein C Proline P Glycin G Serin S

Glutamin Q Threonin T Glutaminsäure E Tryptophan W

Histidin H Tyrosin Y Isoleucin I Valin V

ANHANG

126

Tab. 34: Charakteristiken der Patienten aus der CAT-Studie. Angegeben sind jeweils Minimum, Median und Maximum, sowie die 25 %- und 75 %-Quantil von VL, CD4- und CD8-Zellzahl.

Pat. 1 VL CD4 CD8 RC Pat. 7 VL CD4 CD8 RC

Min 700 60 870 n.d. Min 9630 50 150 n.d. 25% Quantil 23075 105 1420 n.d. 25% Quantil 127500 70 313 n.d.

Median 61265 160 1600 n.d. Median 230450 100 445 n.d. 75% Quantil 127875 180 1860 n.d. 75% Quantil 293550 120 613 n.d.

Max. 486300 210 2040 n.d. Max. 605300 170 1110 n.d. Anzahl 38 39 35 0 Anzahl 22 22 22 0 Pat. 2 Pat. 8

Min 35900 200 230 8% Min 21200 50 730 17% 25% Quantil 159670 235 820 n.d. 25% Quantil 93200 70 990 n.d.

Median 294200 290 950 13% Median 222000 80 1130 27% 75% Quantil 412200 345 1170 n.d. 75% Quantil 261950 90 1305 n.d.

Max. 772100 480 2130 31% Max. 416000 140 1970 39% Anzahl 31 31 29 7 Anzahl 23 23 23 11 Pat. 3 Pat. 9

Min 1600 90 570 n.d. Min 44713 10 150 30% 25% Quantil 9465 150 975 n.d. 25% Quantil 64175 10 258 n.d.

Median 24650 190 1210 n.d. Median 81700 20 310 38% 75% Quantil 95375 238 1890 n.d. 75% Quantil 132000 25 358 n.d.

Max. 750000 300 3160 n.d. Max. 254650 30 540 41% Anzahl 30 30 28 0 Anzahl 11 11 8 4 Pat. 4 Pat. 10


Median 123100 220 2355 11% Median 185710 320 1030 48% 75% Quantil 307250 280 2780 n.d. 75% Quantil 263900 360 1205 n.d.



Median 254815 17,5 275 46% Median 8400 210 690 24% 75% Quantil 385200 30 310 n.d. 75% Quantil 21540 240 780 n.d.


Min 26800 5 480 31% Min 50 310 560 n.d. 25% Quantil 73345 10 550 n.d. 25% Quantil 90 450 760 n.d.

Median 144650 10 625 35% Median 250 480 845 n.d. 75% Quantil 177388 10 710 n.d. 75% Quantil 880 520 950 n.d.

Max. 512000 30 930 37% Max. 41000 600 1300 n.d. Anzahl 30 31 28 10 Anzahl 21 21 21 0

ANHANG

127

Pat. 13 VL CD4 CD8 RC Pat. 18 VL CD4 CD8 RC












Max. 493000 110 670 n.d. Max. 750000 180 1790 n.d. Anzahl 26 27 27 0 Anzahl 25 25 25 0 Pat. 17

Min 31800 10 210 n.d. 25% Quantil 636500 20 408 n.d.

Median 750000 35 480 n.d. 75% Quantil 750000 40 568 n.d.

Max. 750000 80 910 n.d. Anzahl 26 27 26 0

Pat.: Patient; Anzahl: Probenanzahl, welche in die jeweilige Analyse einbezogen wurde. VL: Viruslast; CD4: CD4-Zellzahl; CD8: CD8-Zellzahl; RC: Repliaktionskapazität; Min.: Minimum; Max.: Maximum; n.d.: nicht durchgeführt.

ANHANG

128

Tab. 35: Charakteristiken der Patienten aus der CAT-Studie. Angegeben sind jeweils Minimum, Median und Maximum, sowie die 25 %- und 75 %-Quartile der vom Genotyp vorhergesagten Replikationskapazitäts-Werte und Resistenzfaktoren.

Vorher-sage RC IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV ZDV DDC DDI D4T 3TC ABC TDV NVP DLV EFV

Pat. 1

Min 23% 56 5 64 50 22 26 12 117 2 3 3 5 5 4 3 1 1

Median 25% 96 9 100 72 27 38 17 260 4 5 4 155 10 4 104 19 13

Max. 29% 120 17 161 95 35 53 21 434 5 6 5 165 11 6 579 29 65

Anzahl 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19

Pat. 2

Min 12% 20 11 17 23 15 8 7 62 2 6 3 13 8 8 60 3 18

Median 16% 208 75 190 219 132 82 44 99 2 8 3 14 9 14 162 4 34

Max. 18% 460 287 293 347 175 136 52 169 3 10 3 73 10 15 264 5 46

Anzahl 20 20 20 20 20 20 20 20 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19

Pat. 4

Min 7% 35 15 15 41 9 7 9 62 2 3 2 8 6 3 1 0 0

Median 11% 180 51 198 226 47 66 41 176 3 4 3 100 9 4 130 39 37

Max. 19% 292 84 326 386 57 108 75 411 5 7 6 206 13 7 1832 555 90

Anzahl 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23 23

Pat. 5

Min 40% 47 35 122 34 17 42 24 102 5 3 3 157 8 2 110 17 22

Median 46% 108 122 167 64 23 62 34 161 5 4 3 195 9 2 145 94 74

Max. 55% 111 128 256 67 28 63 35 314 5 5 4 222 11 2 791 681 132

Anzahl 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14

Pat. 6

Min 31% 135 33 310 201 111 91 45 123 5 6 5 145 10 4 54 7 23

Median 35% 165 45 441 281 141 120 73 172 6 8 5 158 13 5 93 11 32

Max. 37% 207 59 564 342 180 130 85 295 7 10 7 211 15 7 132 21 53

Anzahl 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

Pat. 8

Min 17% 19 27 23 27 39 6 13 60 2 2 2 13 7 3 15 5 5

Median 27% 65 64 142 44 131 27 36 131 5 2 2 161 7 3 19 15 6

Max. 39% 185 141 198 220 304 72 56 174 6 8 3 200 10 14 213 92 46

Anzahl 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11

Pat. 9

Min 30% 62 81 155 29 243 28 39 109 5 2 2 163 7 3 20 15 7

Median 38% 91 100 160 123 245 134 72 701 8 11 5 229 13 6 23 18 8

Max. 41% 145 131 267 176 276 166 79 754 8 12 5 247 13 7 26 18 8

Anzahl 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Pat. 10

Min 36% 2 1 1 2 1 1 2 140 3 4 2 126 9 3 66 2 36

Median 48% 2 2 1 2 1 1 2 151 3 4 2 130 9 3 71 2 40

Max. 49% 142 114 498 135 43 47 113 154 3 4 2 131 9 4 80 2 42

Anzahl 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Pat. 11

Min 23% 41 62 87 40 5 32 15 138 2 4 3 6 6 2 28 24 6

Median 24% 61 140 128 61 5 40 17 186 4 6 3 187 12 3 87 45 30

Max. 26% 67 175 147 91 13 42 18 267 4 6 3 200 13 4 639 175 144

Anzahl 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11

ANHANG

129

Vorher-sage RC IDV SQV RTV NFV APV LPV ATV ZDV DDC DDI D4T 3TC ABC TDV NVP DLV EFV

Pat. 13

Min 27% 77 96 149 77 509 65 54 208 4 8 3 10 8 5 103 6 15

Median 27% 118 116 266 116 533 78 56 240 7 12 4 293 17 6 134 8 17

Max. 29% 121 133 313 123 570 78 56 331 7 13 4 293 17 8 156 9 20

Anzahl 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

Pat. 15

Min 23% 97 36 126 85 124 71 56 120 2 2 2 6 4 3 30 19 11

Median 28% 151 136 512 114 214 128 108 131 4 3 2 148 8 4 102 22 38

Max. 31% 175 171 583 167 240 172 139 203 5 4 4 175 8 5 137 32 43

Anzahl 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Pat. 16

Min 23% 169 37 169 135 129 87 98 101 4 4 4 175 8 3 24 36 11

Median 23% 174 54 177 136 134 89 99 172 4 4 4 178 8 3 25 39 11

Max. 27% 224 78 298 234 167 126 105 179 5 5 5 194 11 9 415 207 138

Anzahl 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Pat. 17

Min 28% 2 1 1 2 1 1 2 39 3 4 4 115 8 5 21 5 7

Median 30% 219 49 223 234 84 96 89 76 5 5 5 164 10 11 90 15 33

Max. 52% 254 109 273 334 149 115 105 103 5 6 6 194 12 11 322 259 64

Anzahl 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

Pat. 18

Min 28% 134 173 377 188 137 141 89 108 3 4 3 114 8 3 202 3 13

Median 28% 134 173 377 188 137 141 89 132 3 4 4 120 9 3 216 3 14

Max. 29% 134 173 377 188 137 141 89 138 3 4 4 124 9 3 269 3 14

Anzahl 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Pat. 19

Min 29% 67 36 109 55 65 60 31 52 4 5 4 142 10 6 63 24 8

Median 29% 72 46 114 62 65 61 31 54 4 5 5 146 10 6 74 26 9

Max. 30% 85 46 129 67 83 64 32 54 4 5 5 146 10 6 75 26 9

Anzahl 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Pat. 20

Min 24% 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 4 1 2

Median 39% 1 1 1 1 1 1 1 7 1 2 2 3 2 2 14 19 7

Max. 44% 88 19 153 37 20 74 43 18 2 4 2 86 5 4 106 84 41

Anzahl 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

Pat. 21

Min 25% 390 158 464 218 263 97 76 182 4 7 5 62 11 4 116 10 62

Median 26% 433 209 643 265 309 103 79 227 4 8 5 65 11 5 211 13 68

Max. 27% 433 209 643 265 309 103 79 259 4 10 5 73 13 6 343 19 76

Anzahl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

Die Patienten 3, 7, 12 und 14 wurden in dieser Tabelle ausgeschlossen, weil von den Proben dieser Patienten weniger als drei RC- und RF-Werte vorhergesagt wurden; Pat.: Patient; Anzahl: Probenanzahl, welche in die jeweilige Analyse mit einbezogen wurden; RC: Replikationskapazität; Abkürzungen der Medikamente: s. Anhang.

ANHANG

130

Abb. 28 Eingipflige Verteilung der Resistenzfaktoren von Proben der CAT- und Geno2RC-Datenbank am Beispiel von D4T und TDV. Resistenzfaktor: RF; CAT: engl.: continuously alternating therapy, D4T: Stavudine; TDV: Tenofovir.

d4T

0

5

10

15

20

25

30

0,20

0,25

0,32 0,

40,

50,

60,

81,

01,

31,

62,

02,

53,

24,

05,

06,

37,

910 13 16 20 25 32 40 50 63

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

TDV

0

5

10

15

20

25

30

0,20

0,25

0,32 0,

40,

50,

60,

81,

01,

31,

62,

02,

53,

24,

05,

06,

37,

910 13 16 20 25 32 40 50 63 79 10

0

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ANHANG

131

SQV

0

5

10

15

20

25

30

0,13

0,20

0,32 0,

5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9

13 20 32 50 79 126

200

316

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

RTV

0

5

10

15

20

25

30

0,16

0,25 0,

4

0,6

1,0

1,6

2,5

4,0

6,3

10 16 25 40 63 100

158

251

398

631

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

NLV

02468

1012141618

0,16

0,25 0,

4

0,6

1,0

1,6

2,5

4,0

6,3

10 16 25 40 63 100

158

251

398

631

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ANHANG

132

LPV

0

5

10

15

20

25

30

0,16

0,25 0,

4

0,6

1,0

1,6

2,5

4,0

6,3 10 16 25 40 63 100

158

251

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ATV

0

5

10

15

20

25

30

35

0,20

0,32 0,

5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9 13 20 32 50 79 126

200

316

501

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

AZT

0

5

10

15

20

25

30

0,0

0,13

0,20

0,32 0,5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9 13 20 32 50 79 126

200

316

501

794

1259

1995

3162

4034

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ANHANG

133

3TC

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0,25 0,

4

0,6

1,0

1,6

2,5

4,0

6,3 10 16 25 40 63 100

158

251

398

631

1000

1585

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

DLV

02468

1012141618

00,

130,

200,

32 0,5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9

13 20 32 50 79 126

200

316

501

794

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

NVP

0

5

10

15

20

25

30

00,

130,

200,

32 0,5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9 13 20 32 50 79 126

200

316

501

794

1259

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ANHANG

134

Abb. 29: Zweigipflige Verteilug der CAT- und Geno2RC-Datenbank für die 16 Medikamente SQV, RTV, NLV, APV, LPV, ATV, AZT, ABC, DLV, NVP und EFV. Resistenzfaktor: RF; SQV: Saquinavir; RTV: Ritonavir; NLV: Nelfinavir; APV: Amprenavir; LPV: Lopinavir; ATV: Atazanavir; 3TC: Lamivudine; AZT: Zidovudine; ABC: Abacavir; DLV: Delavirdin; NVP: Nevirapin; EFV: Efavirenz.

EFV

0

5

10

15

20

25

0

0,13

0,20

0,32 0,

5

0,8

1,3

2,0

3,2

5,0

7,9

13 20 32 50 79 126

200

316

501

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

APV

0

5

10

15

20

25

0,0

0,13

0,20

0,32 0,

50,

81,

32,

03,

25,

0

7,9 13 20 32 50 79 126

200

316

501

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

ABC

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0,25

0,32 0,

40,

50,

60,

81,

01,

31,

62,

02,

53,

24,

05,

06,

37,

910 13 16 20 25 32 40 50 63

RF

Anz

ahl

CAT

Geno2RC

PUBLIKATIONEN

135

Publikationen

Walter H., Low P., Harrer T., Schmitt M., Schwingel E., Tschochner M., Helm M., Korn K.,

Überla K., Schmidt B. No Evidence for Persistence of Multidrug-Resistant Viral Strains after a

7-Month Treatment Interruption in an HIV-1-Infected Individual. J Acquir Immune Defic

Syndr. 2002 Oct 1;31(2):137-46.

Tschochner M., Schwingel E., Thein C., Wittmann S., Paatz C., Walter H. Superiority of

Infectivity-Based over Particle-Based Methods for Quantitation of Drug Resistant HIV-1 as

Inocula for Cell Cultures. J. Virol. Methods. 2007 Apr, 141(1):87-96. Epub 2006 Dec 28

Tschochner M., Schwingel E., Wittmann S., Thein C., Paatz C., Vöglein A., Walter H. A new

method to determine the replication capacity of recombinant and full-length HIV-1 viruses. J.

Virol. Methods. (Manuskript in Vorbereitung)

Tschochner M., Weber C., Wittmann S., Paatz C., Thein C., Metzner K.M., Stocker H.,

Sopper S., Kurowski M., Arasteh K.,Walter H. Differences in selective drug preassure

correlates with changes in HIV-1 viral load and is accompanied by changes in the numbers of

mutations in viral minority populations. J. Clin. Virol. (Manuskript in Vorbereitung)

Buchkapitel

Resistenz in der HIV-Therapie-Diagnostik und Management, Oette M., Kaiser R. und

Häusinger D., 1. Auflage – Bremen: UNI-MED, 2003, ISBN 3-89599-736-6.

Dipl.-Biol. Tschochner M., chapter 3.3, p58-62.

Managing antiretroviral resistance. In: Bogner E. and Holzenburg A. (eds.). New Concepts of

Antiviral Therapies. Springer, New York and Dodrecht, 2006, ISBN 0-387-31046-0.

Schmidt B., Tschochner M., Walter H., Korn K., chapter 1.9, p255-279.

PUBLIKATIONEN

136

Poster und Kongreßvorträge

Tschochner M.*, Schmidt B., Korn K., Walter H. Comparison of Common Methods to

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2004, Tübingen, abstract 535.

Tschochner M.*, Weber C., Stocker H., Sopper S., Kurowski M., Walter H., Arasteh K., for

the KompNet HIV/AIDS. Small Differences of HIV-1 Phenotypic Drug Resistance and Viral

Replication Capacity in Follow-up Samples Indicate Changes in Viral Minorities Undetected

by Conventional Sequencing. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie, 2005, Hannover,

abstract CLV 28.

Tschochner M.*, Weber C., Stocker H., Sopper S., Kurowski M., Walter H., Metzner K.,

Arasteh K., for the KompNet HIV/AIDS. Small Increases of HIV Viral Load under Non-

Suppressive ART - Association with Increasing Numbers of Mutations in Viral Minority

Populations. 3. European HIV Drug Resistance Workshop, 2004, Athen, abstract 7.2 (oral

presentation).

Tschochner M., Weber C., Stocker H., Sopper S., Kurowski M., Walter H.*, Metzner K.,

Arasteh K., for the KompNet HIV/AIDS. Größere Anzahl an Mutationen in den

Subpopulationen während transienter Anstiege der HIV-1 Viruslast unter nicht suppressiver

Therapie. 10. Deutscher und 16. Österreichischer AIDS Kongress, 2005, Wien.

Tschochner M., Weber C., Stocker H., Sopper S., Kurowski M., Walter H.*, Metzner K.,

Arasteh K., for the KompNet HIV/AIDS. Increasing Numbers of Mutations Found in Viral

Minority Populations are Associated with Small Increases of HIV Viral Load under Non-

Suppressive Antiretroviral Treatment. The 3rd IAS Conference on HIV pathogenesis and

Treatment, 2005, Rio de Janeiro.

Tschochner M.*, Wittmann S., Thein C., Paatz C., Sing T., Weisser H., Lengauer T.,

Walter H. Use of Support Vector Machines for Identification and Ranking of HIV-1 Mutations

in the Protease and Reverse Transcriptase Genes Associated with Changes in Replicative

Capacity. Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie 2006 in München, abstract 254.

PUBLIKATIONEN

137

Sing T.*, Tschochner M., Weisser H., Verheyen J., Daumer M., Kaiser R., Korn K., Walter H.,

Lengauer T. Predictive and Interpretable Models Relating HIV-1 gag/pol Genotype to

Replication Capacity. 4th European HIV Drug Resistance Workshop, Monte Carlo, March 29-

31, 2006 in Monaco, abstract 55.

Tschochner M.*, Kaiser R., Verheyen J., Daeumer M., Sing T., Weisser H., Lengauer T.,

Walter H. Influence of HIV-1 Resistance Associated Mutations in gag, Protease and Reverse

Transcriptase Genes on Replicative Capacity. 18. Annual ASHM Conference, Australia, 2006

in Melbourne, abstract 492. (oral presentation)

Tschochner M.*, Weber C., Stocker H., Sopper S., Kurowski M., Arasteh K., KompNet

HIV/AIDS Germany, Walter H. Changes of HIV-1 Viral Load are Accompanied by Changes in

the Numbers of Mutations in Viral Minority Populations. 18. Annual ASHM Conference,

Australia, 2006 in Melbourne, abstract 493. (oral presentation)

Weber C.*, Stocker H., Tschochner M., Walter H., Sopper S., Haus S., Arasteh K. CAT - eine

mögliche Behandlungsstrategie für sehr stark vorbehandelte, multiresistente Patienten mit HIV-

1. 12. Deutscher und 18. Österreichischer AIDS Kongress, Juni, 2007, Frankfurt.

* Präsentierender Author

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