Kraftspektroskopie an einzelnen Titin-Molekülen

AFM(Atomic Force Microscop)

• Erfinder Gerd Binning

• Nobelpreis für das Rastertunnel Mikroskop

• Funktion wie RTM nur Kraft statt Tunnelstrom als Messgröße

Aufbau des AFM

• 3D Piezo Motor

• Feder mit niedriger Federkonstanten ca.0.1-1 N/m

• Scharfe Messpitze

• Feedback System zur Bestimmung und Regulierung der Feder

Messspitze

• Die Spitze im ersten AFM war ein Diamantsplitter

• Auch möglich sind Si3N4 Kristalle

• Die Feder kann mit integrierter Spitze gebaut werden

• Für elektrische oder magnetische Kräfte kann man feine geätzte Drähte als Spitze verwenden

Feder

• Lithographisch hergestellt

• Aus Silizium, SiliziumOxid oder SiliziumNitrid

• ca. 100μm lang und 1μm dick

• Ferdekonstanten 0.1-1 N/m

• Resonanzfrequenzen 10-100 kHz

Verschiedenen Typen des AFM

• Raster Kraft Mikroskop

• Es können verschiedene Kräfte gemessen werden und damit– Atomare Kräfte

– Magnetische Felder

– Elektrische Felder

– Van der Vaals

Betriebsmoden

• Contact-mode– Auflagekraft von typischerweise 10-7 bis 10-11

• Langreichweitige Kräfte– Abstand zur Probe 10-100 nm

– Feder wird nahe der Resonanz in Schwingung versetzt

– Der Kraft Gradient Fz/ z verändert die Resonanz Frequenz

Der Versuch

• Einzelmolekül Kraftspektroskopie an Titin

• Matthias Rief, Mathias Gautel, Filipp Österhelt, Julio M. Fernandez, Hermann E. Gaub

• Ziele– Untersuchung der mechanischen Eigenschaften des Muskelprotein

Titin

– und damit besseres Verständnis über die Stabilität von Muskeln

Die Probe

• Frisch aufgedampfte Gold Oberfläche

• titin Lösung 10 -100 μg/ml in Phosphat gepuffertem Salin (PBS) bei pH 7,4

• Nach 10 min abgespült mit PBS

Aufbau und Durchführung

• Die Spitze Si3N4 wird auf die Probe gepresst, und nach kurzem Warten wieder weggezogen

Konstante Geschwindigkeit

Immunoglobulin (Ig) Domänen

• Sägezahn Profil

• Zähne haben abstand 22-28 nm

• 150-300 pN je nach Geschwindigkeit

• Vermutung:– Die einzelnen Immunoglobulin Domänen entfalten sich

nacheinander

• Eine vollständig Entfaltete Domäne ist 31 nm lang

Natürliches titin und Ig4 Ig8

• Um zu beweisen, das die Ig Domänen für die schrittweise Verlängerung verantwortlich sind wurde künstliches Titin hergestellt, das nur 4 bzw. 8 Ig Domänen enthält (Ig4 Ig8)

• Bei den Versuchen mit diesem Titin wurden immer nur maximal soviele Sägezähne aufgezeichnet wie Ig Domänen vorhanden waren.

Wormlike chain model

• Beschreibt die Kraft Dehnungs Kurve

• F(x)=(kT/b)[0.25(1-x/L)-2-0.25+x/L]

• Fitten des Mesergebnis eines Ig8 mit 7 Peaks, mit Hilfe dieser Formel ergab:– Anfangslänge von 58 nm (fiten des 1. Peaks)

– Verlängerung von 28 bis 29 nm beim fiten des nächsten Peaks

Reversibel

• Nach vollständiger Entspannung falten sich die Ig Domänen wieder zusammen

• Dieser Vorgang war sehr oft wiederholbar => reversibel

Andere Methoden zur Kraftspektroskopie

• Mit Hilfe eines Force clamp AFM sind folgende Methoden möglich– Konstante Kraft

• konstante Kraft zwischen 50 und 200 pN

• Dauer zwischen 10 und 30 sec

– Kraft wächst linear mit der Zeit

• ca. 100 pN/s

Konstante Kraft

Konstante Kraft

• Man sieht einen Stufenweisen Anstieg der Länge

• Die meisten Stufen sind 22 nm

• Es gibt auch Vielfache davon, mehrere Ereignisse die nicht mehr zeitlich aufgelöst werden konnten

Zeitlich linear ansteigende Kraft

• Das entfalten spielt sich in wesentlich kürzerer Zeit ab

• aber sonst keine neuen Ergebnisse

Abhängigkeit der Kraft von zuggeschw.

• Komplexe Moleküle haben viele Konformationen

• Potentialverlauf ist Abhängig von Zuggeschwindigkeit

Montecarlo Simulation

• Simulation eines thermischen Gleichgewichts

• Annahme Ig-Domäne wird duch 6 H-Brücken gehalten

• H-Brücken können brechen und rekombinieren

• Zugkraft verteilt sich auf die bestehenden H-Brücken

• Nur möglich wenn sehr hohe Zuggeschwindigkeiten simuliert werden

Andere ähnliche Experimente

• Kraftspektroskopie an Biomolekülen

• Auch andere Domänen können sich entfalten– Immunoglobulin

– Fibronectin type III

– Cadherin

– α-Helix (DNS)

• Entfaltung lösen Nervenimpulse aus