L’analyse quantitative de lipides par HPTLC, est-elle ... · L’analysequantitative de lipides...
Transcript of L’analyse quantitative de lipides par HPTLC, est-elle ... · L’analysequantitative de lipides...
L’analyse quantitative de lipides par
HPTLC, est-elle possible?
L’example des monoacylglycerides en EMAG-biodiesel
J. Vela1,2, L. Membrado1, M.P. Lapieza1, V.L. Cebolla1
1 Instituto de Carboquímica, CSIC; 2 Universidad de Zaragoza, Spain
20 Anniversaire Club CCM, Montpellier 2018
Tolerance maximale aux MG: 0.7 wt% (UNE EN14214:2013)
Les impuretés lipidiques (MG, DG, TG, acides gras..) affectent la performance du biodiesel EMAG dans les moteurs
Introduction
quelles informations quantitatives pouvons-nous obtenir en séparant les
mélanges de lipides en classes, et à partir des spectres de masse?
carburant renouvelable composé d’esters methyliques des acides gras, substituttotal ou partiel du diésel.
MG peuvent produire obstruction dans les filtres à carburant
Example des MG en biodiesel EMAG
EMAG < 98% conditions de réaction inappropriées
Qualité EMAG
Transesterification catalytique avec un alcool
Nature des lipides source (huiles végétales, graisses animales, etc.)
ATS4
Application
EMAG
AMDChromatogram
UV
Densitometrie
Fluorophore post-
impregnation
Fluorescence
(FDIC)
densitometrie
HPTLC-MS
Identification
espéces
HRMS
ESI-MS, MS2, MS3
Normalization
Semi-quantification
d’espèces
Quantification MG
comme classe:
-avec un étalon externe
-avec addition d’etalon
Primuline
Choix d’étalon
Séparation des MG
Détection des
MG insaturésDétection des
MG insaturés + saturés
Caractérisation des Monoacylglycerides (MG) des biodiesel type EMAG
Étalon: 1-oleoyl-rac-glycerol
Profil ESI-MS des ions
PL en bacteriasSéparation et détection des MG d’un biodiesel EMAG
+ polar - polar FDIC, 365/>400 nm
PRIMULINE
200 mg·L-1 en MeOH
MG
FA
DG
TG
ME
STANDARD
EMAG diéseldiesel
EMAG-diesel 50%Diesel pur
➢ Pas de traitement d’échantillon, pur EMAG
Impurités
lipidiques
EMAG
md (mm)
Steryl
glucoside
Esterified
Steryl
glucoside
1-Oleoyl-rac-glycerol
Stearic acid
Palmitic acid
Oleic acid
Linoleic acid Gly
ce
ryl
1,3
-dis
tea
rate
Cholesteryl Oleate
Methyl Oleate
Gly
ce
ryl T
riste
ara
te
Ch
ole
ste
rol
Steryl
glucoside
Esterified
Steryl
glucoside
1-Oleoyl-
rac-glycerol
Linoleic
acid
Oleic
acid
Cholesterol Methyl
Oleate
Cholesteryl
Oleate
ZONE 1
Steryl Glucoside
ZONE 2
Esterified
Steryl GlucosideZONE 3
Monoglycerides
ZONE 4
Fatty acids
UV (190nm)FDIC-365nm
100% Tert-Butyl Methyl Ether
80% Tert-Butyl Methyl Ether + 20%MeOH
90% Tert-Butyl Methyl Ether + 10%MeOH
60% Tert-Butyl Methyl Ether + 40%C7
50% Tert-Butyl Methyl Ether + 50%C7
1-stearoyl-rac-glycerol
??
?? ?
Détection UV versus FDIC
J. Chromatogr. A 2011, 1218, 2668-2675
20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
20
40
60
80
100
0
0
50
100
150
57
911
13
15
17
19
21
23
25
0
50
100
150
200
250
300
57
911
1315
17
19
21
23
25
Étalonnage Externe de MG: UV and FDIC-primuline
UV 190 nm FDIC-Primuline
Bandes: 4 mm
19 tracks
Standard: 1-Oleoyl-rac-Glycerol,
0,978 mg · mL-1 (en MeOH)Y, m
m
De
ve
lop
pe
me
ntso
lva
nt
Échantillon: pure EMAG
36
912
1518
Bla
nk
run
(Me
OH
) (1
µL
)
0.2
μL
sta
nd
ard
0.5
µL
sta
nd
ard
1,0
µL
sta
nd
ard
1.5
μL
sta
nd
ard
2.0
µL
sta
nd
ard
1 µ
L E
MA
G
AMD 3-étapes
36
912
1518
3 6 9 12 15 18
X, mm
MG
MG
20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
20
40
60
80
100
0
Étalonnage par addition standard of MG: UV et FDIC-primuline
Bandes: 4 mm
19 tracks
Standard: 1-Oleoyl-rac-Glycerol,
0,978 mg · mL-1 (en MeOH)
Y, m
m
So
lve
ntD
eve
lop
me
nt
Échantillon: pur EMAG
36
912
1518
Bla
nk
run
(Me
OH
) (1
µL
)
0.3
µL
std
0.6
µL
std
0.9
μL
std
1.2
µL
std
36
912
1518
3 6 9 12 15 18
X, mm
0
50
100
150
57
911
13
15
17
19
21
23
25
0
50
100
150
200
250
300
57
911
1315
17
19
21
23
25
27
29
UV 190 nm AMD 3 étapes FDIC-Primuline
1 µ
L E
MA
G
1 µ
L E
MA
G
1 µ
L E
MA
G
+ +
1 µ
L E
MA
G+
1 µ
L E
MA
G+
1 µ
L E
MA
G
1.5
µL
std
Overspotting
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Are
a co
un
ts
Mass of O-RAC (µg)
FDIC-Primuline, 365 nmUltraviolet, 190 nm
Incertitude ±tS (95%)
Pente 856,5 29,6 94,3
O. Origine 38,8 35,6 113,2
Coef. Regr. 0,9982
Conc (µg · µL-1) Incertitude
Valeur 778,0 0,86 0,04
Incertitude ±tS (95%)
Pente 2730 70,4 224,1
O. Origine -40,1 84,6 269,2
Coef. Regr. 0,9990038
Conc (µg · µL-1) Incertitude
Valeur 3360,7 1,25 0,03
(n=3)
Étalonnage externe
FDIC-Primuline, 365 nm
UV, 190 nm
RSD% écart-type relatif; et incertitude comme (σn-1 / n)1/2
UV190
(n=5)
RSD% 6.9 (EMAG)
RSD% 8.2 (étalon)
FDIC 365/>400 nm
(n=5)
RSD% 5.2 (EMAG)
RSD% 7.3 (étalon)
Étalonnage par addition standard
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
Are
a co
un
ts
Added mass of standard (µg)
FDIC-Primuline, 365 nmUltraviolet, 190 nm
Incertitude ±tS (95%)
Pente 928,8 61,1 169,5
O. Origine 742,8 54,2 150,6
Coef. corrl 0,9914
Conc (µg · µL-1) Incertitude
Valeur 0,80 0,11
Incertitude ±tS (95%)
Pente 1733 37,2 103,3
O. Origine 2032 33,0 91,7
Coef. corrl 0,9990
Conc (µg · µL-1) Incertitude
Valeur 1,17 0,04
(n=3)
FDIC-Primuline, 365 nm UV, 190 nm
√ Nous pouvons choisir un étalon répresentatif à partir de l’identification MS
√ Des résultats cohérents entre les deux méthodes d’étalonnage pourchaque technique de détection
Quantification en moyenne de la classe MG d’un EMAG par densitometrie
√ UV: dosage des MG insaturés. FDIC: dosage des MG saturés + insaturés(hypothèse vraisemblable)
External standard
UV 0.86 ± 0.04
FDIC 1.25 ± 0.03
Standard addition
UV 0.80 ± 0.11
FDIC 1.17 ± 0.04
(µg · µL-1)
Maximum MG tolerance en EMAG: 0.7 wt% (UNE EN14214:2013).Cette EMAG a 0.1 wt% in MG. Méthode de control.
√ On obtient des pourcentages quantitatives en moyenne, car ils dépendentde l’etalon
ESI(+)-MS
MS/MS
MS3
Profil des MG en EMAG par ESI(+)-MS, e identification par MS/MS et MS3 (ion-trap)
375.3
377.3
378.3
379.3
381.3
383.3 391.3
393.3
394.3
395.3
396.3399.3 401.3 407.3
409.3
411.3 413.3 421.3423.3
425.3
+MS, 0.6-1.2min #(32-63)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
6x10
Intens.
375 380 385 390 395 400 405 410 415 420 425 m/z
[C21H38O4+Na]+
C18:2
[C21H40O4+Na]+
C18:1
[C21H42O4+Na]+
C18:0 [C21H38O5+Na]+
C18:2 oxidé
[C21H40O5+Na]+
C18:1 oxidé[C23H46O4+Na]+
C20:0[C23H44O4+Na]+
C20:1 oxidé
i) les efficacités d'ionisation sont similaires pour les espècesmoléculaires appartenant à une classe donnée de lipides*, par example,les MG;
ii) En HPTLC, le solvant-gradient de développement est évaporé avant la détection;
iii) le solvant d'élution de l’interface (MeOH) a une composition constante et, de cette manière, des efficacités d'ionisation similaires sont obtenues pour les lipides individuels d'une classe.
Les spectres ESI (+)-MS présentent des profils représentatifs
d'espèces moléculaires individuelles MG dans un EMAG
* Han X. Lipidomics: Comprehensive mass spectrometry of lipids. Wiley & Sons, Inc.
New Jersey, 2016
Normalization des ions de la clase MG et analyse semiquantitative
des espèces moléculaires par densitometrie
m/z
377.3
379.3
381.3
393.3
395.3
409.3
425.3
[C21H38O4+Na]+
[C21H40O4+Na]+
[C21H42O4+Na]+
[C21H38O5+Na]+
[C21H40O5+Na]+
[C23H46O4+Na]+
[C23H44O4+Na]+
C18:2
C18:1
C18:0
C18:2 oxidé
C18:1 oxidé
C20:0
C20:1 oxidé
%
16
35
8
10
15
7
9
C (µg µL-1)
0.19
0.43
0.10
0.12
0.18
0.01
0.11
Utile pour distinguer le biodiesel de différentes origines (animale, végétale) ou issu de différents traitements
√
Une caractérisation analytique profonde des monoacyglicerides (MG) dans EMAG biodiesel par HPTLC-densitométrie-Tandem MS estpossible
1) une determination quantitative moyenne de monoacylglycerides comme
classe de lipides, par densitometrie UV (MG insaturés) ou fluorescence-
induite (MG saturés+ insaturés).
Conclusions
2) une identification structurelle directe, rapide and relevante des espèces
moléculaires individuelles par ESI(+)-MS/MS (trap d’ions)
3) obtention d’un profil réprésentatif des MG par ESI(+)-MS.
4) normalization des ions ESI-MS pour obténir la composition
semiquantitative des espèces moléculaires individuelles à partir des
pourcentages MG préalablement obtenus par densitometrie.
Merci de votre attention