Lebens-und Futtermitteln – Herausforderung an die Analytik · Nahrungsergänzungsmittel...
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BUNDESINSTITUT FÜR RISIKOBEWERTUNG Pyrrolizidinalkaloide in Lebens- und Futtermitteln – Herausforderung an die Analytik Dorina Bodi
Transcript of Lebens-und Futtermitteln – Herausforderung an die Analytik · Nahrungsergänzungsmittel...
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NG Pyrrolizidinalkaloide in
Lebens- und Futtermitteln –
Herausforderung an die Analytik
Dorina Bodi
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 2
Vor welchen Herausforderungen stehen wir ?
Menge an potentiellen Analyten• 660 bekannte PA ↔ 30 Standardsubstanzen• Analysenverfahren (indirekt/direkt) • Relevanz (Vorkommen)
Beschaffenheit der Proben• Einfluss des Probenmaterials auf die Analyse• Homogenität (Charge – Stichprobe – Laborprobe)• Probenahmeverfahren
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 3
660 bekannte 1,2-ungesättigte Pyrrolizidinalkaloide
N
OH
OH
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O
CH3O CH3CH3
CH3
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CH3
OH
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O
CH3
CH3
N
H
OO
O
O
CH2
O
CH3 CH3OH
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 4
Pyrrolizidinalkaloid-Strukturen
N
HO O
R1
R2
1
2
7R
N
HO O
R1
R2
1
2
7S
Heliotridin-Typ Retronecin-Typ Otonecin-Typ
N
OH
OH
OOH
CH3
O
CH3
CH3CH3
Heliotrin
N
HO
O
OH
OO
CH3
CH3 OH
CH3CH3
CH3
O
CH3
Lasiocarpin
N
OO O
OR
1
R2
O
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N
HOOH
O OHCH3
OH
CH3
CH3
Lycopsamin
N
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O
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CH3
O
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CH3
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CH3
Echimidin
N
OO
O
O
CH3
CH3
CH3OH
H
Senecionin
N
CH3
O
OO
OCH3
OCH3
CH3
OH
Senkirkin
Monoester Offenkettige Diester Zyklische Diester
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 5
• indirekte Bestimmung über gemeinsames Grundgerüst mit GC-MS (Kempf et al., 2008)
oder LC-MS/MS (Cramer et al., 2013)
Retronecin 26 µg/kg
• direkte Bestimmung der Einzelsubstanzen mitHPLC-ESI-MS/MS(Betteridge et al., 2005)
Re-Äquivalente
Lycopsamin 10 µg/kg → 5,2 µg/kg
Echimidin 15 µg/kg → 5,9 µg/kgSenecionin 25 µg/kg → 11,6 µg/kg
PA Gesamt Σ=50 µg/kg → 22,7 µg/kg
direkte und indirekte Methoden – 2 Wege zum PA-Summengehalt
N
HOOH
O OHCH3
OH
CH3
CH3
N
OH
OO
CH3
CH3
O
OH
CH3
OH
OH
CH3
CH3
N
OO
O
O
CH3
CH3
CH3OH
H
N
OHHOH
Derivatisierung
Summen-bildung
Summen-bildung
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 6
• indirekte Bestimmung über gemeinsames Grundgerüst mit GC-MS (Kempf et al., 2008)
oder LC-MS/MS (Cramer et al., 2013)
• direkte Bestimmung der Einzelsubstanzen mitHPLC-ESI-MS/MS(Betteridge et al., 2005)
direkte und indirekte Methoden – 2 Wege zum PA-Summengehalt
+ sehr spezifisch+ sensitiv+ Strukturinformationen zu PA
- Standardsubstanzen erforderlich- unbekannte PA vernachlässigt- zeitintensive Auswertung
Vor- und Nachteile ?
+ Großteil der relevanten PA erfasst+ wenige Standardsubstanzen+ Verwendung interner Standards
(auch stabilisotopenmarkiert)
- keine Strukturinformationen zu PA- aufwändige (doppelte)
Probenaufarbeitung
N
OHO
O
CH3
CH3
O
OH
CH3
OH
OH
CH3
CH3
N
HOOH
O OHCH3
OH
CH3
CH3
N
OO
O
O
CH3
CH3
CH3OH
H
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• Detektionsmethode HPLC-ESI-MS/MS (Multi-Reaction-Monitoring)
• BfR-PA-Honig-1.0/2013 und
BfR-PA-Tee-1.0/2013 für 17 PAim internationalen Ringversucherfolgreich validiert(2014 auf 28 PA erweitert)
• BfR-PA-Mehl-1.0/2014 (28 PA)
BfR-Methoden: direkte Bestimmung der Einzelsubstanzen
Heliotrin
Q1 Q2 Q3
Kollisionszelle
N
OHOH
OOH
i-Pr
CH3
O
CH3
Prod_Hn_314_CE27eV RT: 6.8 NL: 5.62E5
+ c ESI Full ms2 314.200 [50.000-350.000]
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z
138
156
96
120
82108
3140
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive A
bundance
CH2
+
N
m/z 120
OH CH2
+
N
m/z 138
138
120
156
HPLC ESI
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 8
variierendes Analytspektrum durch• verbesserte Verfügbarkeit von Standardsubstanzen
(BfR-PA-Tee-1.0/2013 mit 17 PA � BfR-PA-Tee-2.0/2014 mit 28 PA)• Modifikation der Methode in den Laboratorien
� Summengehalte nicht vergleichbar! einheitliches Analytspektrum erforderlich!
Und in der Praxis? - Vergleichbarkeit der Summengehalte
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• Welche der vorhandenen Standards sind relevant ? (Beispiel Tee)
Auswertung der vorliegenden Gehaltsdaten nach
a) Häufigkeit
Einheitliches Analytspektrum zur Bildung des PA-Summengehalts
0
10
20
30
40
50
60
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Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 10
• Welche der vorhandenen Standards sind relevant ? (Beispiel Tee)
Auswertung der vorliegenden Gehaltsdaten nach
b) Höhe der Gehalte
Einheitliches Analytspektrum zur Bildung des PA-Summengehalts
Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
0
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(µ
g/k
g)
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• Welche der vorhandenen Standards sind relevant ? (Beispiel Tee)
Auswertung der vorliegenden Gehaltsdaten nach
a) Häufigkeit und b) Höhe der Gehalte
Einheitliches Analytspektrum zur Bildung des PA-Summengehalts
Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
Datengrundlage466 Teeprobenuntersucht auf 17 bzw. 28 PA
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µg
/kg)
% P
rob
en
> B
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gsgr
en
ze % Proben >LOQ
Mittelwert (µg/kg)
� BfR-Empfehlung : 21 PA zur Bildung des PA-Summengehaltes in Tee (vorläufig)
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 12
Beschaffenheit des Probenmaterials (Matrix)
MatrixFuttermittel
Honig, Tee, MehlMilch, Fleisch, Eier
Nahrungsergänzungsmittel
Probenahme
Repräsentativität der Probe
Inhomogenität
Matrixeffekte(LC-MS/MS)
Null-Matrix ?
Nachweis-grenzen
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 13
Matrixeffekte bei der Teeanalyse – Folgen für die Quantifizierung
0,E+00
1,E+06
2,E+06
3,E+06
4,E+06
0 10 20 30 40 50
Inte
nsi
tät
(cp
s)ng/mL
Standard in
Lösungsmittel
Standard inKräutertee-extrakt(matrix-matchedStandard)
Kalibrierung für Echimidin
10 ng/mL Echimidin
in Methanol
in Kräutertee-extrakt
Quantifizierung in verschiedenen Teesorten?
• für (fast) jede Teesorte entsprechende Matrix-matched Kalibrierung erforderlich
� Aufwand � Null-Material verfügbar ?
• Alternative: Quantifizierung über Standardaddition
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 14
• Beispiel: „Rooibostee Vanille“
• jeweils 2 Packungen verschiedener Chargen
• Größenordnung vergleichbar!
Homogenität der Stichprobe – Spotkontamination und Probenahme
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Charge 1 Charge 2 Charge 3 Charge 4
PA-S
um
me
nge
ha
lt in
µg
/kg
Packung 1
Packung 2
0
50
100
150
200
250
300
Charge 1 Charge 2
PA-S
um
me
nge
hal
t in
µg
/kg
Packung 1
Packung 2
Packung 3
• Beispiel: „Brennnesseltee“
• 3 bzw. 1 Packung von 2 Chargen
• Größenordnung vergleichbar!
� Probenahmeverfahren angelehnt an VO (EG) 401/2006 Anhang I E (Gewürze)
Variation des PA-Gehaltes innerhalb und zwischen Chargen
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 15
Beispiel Rooibostee: gemahlen in Ultrazentrifugalmühle (UZM)
mit und ohne Trockeneis (TE)
• 5fach-Bestimmung der PA-Konzentrationen in beiden Homogenisaten
• Vergleich der relativen Standardabweichung (RSD)
Homogenität der Laborprobe – Mahlverfahren für Teeproben
Ultrazentrifugalmühle + Trockeneis (500 µm Sieb)Ultrazentrifugalmühle (500 µm Sieb)
optimierte Homogenisierung (BfR-PA-Tee-2.0/2014)
ursprüngliches Verfahren optimiertes Verfahren
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 16
Beispiel Rooibostee: gemahlen in Ultrazentrifugalmühle (UZM)
mit und ohne Trockeneis (TE)
• 5fach-Bestimmung der PA-Konzentrationen in beiden Homogenisaten
• Vergleich der relativen Standardabweichung (RSD)
Homogenität der Laborprobe – Mahlverfahren für Teeproben
� optimiertes Homogenisierungsverfahren (BfR-PA-Tee-2.0/2014)
0
5
10
15
20
25
Im La ImN LaN Re ReN Sp SpN Sv Sc ScN Em Sk
RSD
(%
)
UZM ohne TE UZM mit TE
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 17
• leistungsfähige Analysenverfahren vorhanden
• verschiedene methodische Ansätze zur PA-Analytikdirekte/indirekte Verfahren
• im Ringversuch validierte Methoden für Honig und Tee
• umfangreiche Daten zum Vorkommen von PA in Lebens- und Futtermitteln
• Empfehlungen zur Gewährleistung der Vergleichbarkeitvon Analysenergebnissen für von PA in Tee:
� Analytspektrum für Summenbildung (21 PA)� Probenahmeverfahren (VO (EG) 401/2006 Anhang I, E.4)
Zusammenfassung
BfR-Verbraucherforum Pyrrolizidinalkaloide – 03.12.2015 – Dorina Bodi Seite 18
• Bericht zur Laborvergleichsuntersuchung zu PA in Tee � Erkenntnisse zur weiteren Methodenoptimierung
• Standardisierung einer Methode zur Bestimmung von PA in Futtermitteln (Mandat SA/CEN/ENTR/523/2013.14)
• Methoden zur Erfassung des PA-Gesamtprofils (hochauflösende LC-MS/MS)� Identifizierung weiterer relevanter PA
• Biotransformationsprodukte von PA in Lebensmitteln tierischen Ursprungs ?� Identifizierung von Metaboliten in-vitro und in-vivo� Methoden zur quantitativen Bestimmung
von PA-Metaboliten
Ausblick
PA
Metabolismus
M4M5
M2M1 M3
BU
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DANKE FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT
Bundesinstitut für Risikobewertung
Max-Dohrn-Str. 8-10 � 10589 Berlin
Tel. 0 30 - 184 12 - 0 � Fax 0 30 - 184 12 - 47 41
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