Medizinische Fakultät der Universität Duisburg-Essen · gegen Epilepsie (International League...

Medizinische Fakultät

der

Universität Duisburg-Essen

Aus der Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung

der Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

Glia und Epilepsie: Experimentelle Untersuchung klinisch relevanter

Antiepileptika an einem in vitro Astrozyten/Mikroglia Entzündungs-

Zellkulturmodell

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften in der Medizin

durch die Medizinische Fakultät

der Universität Duisburg-Essen

Vorgelegt von

Hannes Dambach

aus Bietigheim-Bissingen

2014

2

Dekan: Herr Univ.-Prof. Dr. med. J. Buer

1. Gutachter: Herr Prof. Dr. med. A. Hufnagel

2. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. rer. nat. N. Dünker

3. Gutachter: Frau Univ.-Prof. Dr. med. K. Keyvani

Tag der mündlichen Prüfung:

14. Januar 2015

3

Publikation

Dambach H, Hinkerohe D, Prochnow N, Stienen MN, Moinfar Z, Haase CG, Hufnagel A,

Faustmann PM. (2014): Glia and epilepsy: Experimental investigation of antiepileptic drugs

in an astroglia/microglia co-culture model of inflammation. Epilepsia. 55,184-92.

4

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung (S.6)

1.1 Epilepsie ............................................................................................................................................ 6

1.2 Zerebrale Inflammation ..................................................................................................................... 6

1.3 Zusammenhang zwischen Epilepsie und Inflammation .................................................................... 7

1.4 Antiepileptika .................................................................................................................................... 8

1.5 Astrozyten ......................................................................................................................................... 9

1.6 Astrogliale Gap Junctions und Connexin 43 (Cx43) ...................................................................... 10

1.7 Mikroglia ......................................................................................................................................... 10

1.8 Das Astrozyten-Mikroglia Ko-Kultur Model .................................................................................. 11

1.9 Fragestellung der Dissertation ........................................................................................................ 12

2. Material und Methoden (S.15)

2.1 Zellkultur ......................................................................................................................................... 15

2.1.1 Astrozyten-Mikroglia Ko-Kultur.............................................................................................. 15

2.1.2 Inkubation mit den antiepileptisch wirksamen Substanzen ..................................................... 16

2.2 Viabilitätsassay ................................................................................................................................ 17

2.4. Immunocytochemie ........................................................................................................................ 17

2.5 Auswertung der immunocytochemischen Färbungen ..................................................................... 18

2.6 ELISA .............................................................................................................................................. 19

2.7 Western Blot .................................................................................................................................... 21

2.7.1 Zellaufschluss ........................................................................................................................... 21

2.7.2 Konzentrationsbestimmung nach Bradford .............................................................................. 21

2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................................... 22

2.7.4 Western Blot und immunologischer Nachweis der Proteine .................................................... 22

2.8 Statistik ............................................................................................................................................ 23

3. Ergebnisse (S.25)

3.1 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Viabilität primärer M5 und M30

Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen ....................................................................................................... 25

3.2 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die mikrogliale Aktivierung/ Inaktivierung in

primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen .................................................................. 26

5

3.3 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die astrogliale Cx43 Expression in primären M5 und

M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen .............................................................................................. 29

3.4 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Expression der beiden Zytokine TGF-ß1 und

TNF-α in primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen .................................................. 30

4. Diskussion (S.32)

4.1 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Viabilität primärer M5 und M30

Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen ........................................................................................................ 32

4.2. Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die mikrogliale Aktivierung/ Inaktivierung in

primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen ................................................................... 33

4.3 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die astrogliale Cx43 Expression in primären M5 und

M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen ................................................................................................ 34

4.4 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Expression der beiden Zytokine TGF-ß1 und TNF-

α in primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen............................................................ 35

4.5 Klinische Interpretation antiepileptischer Substanzen mit zusätzlichem antiinflammatorischen

Potential bei Patienten mit inflammatorisch bedingten Anfällen ........................................................ 36

5. Zusammenfassung (S.39)

6. Literaturverzeichnis (S.40)

7. Abkürzungsverzeichnis (S.47)

8. Anhang (S.49)

9. Danksagung (S.52)

10. Lebenslauf (S.54)

6

1. Einleitung

1.1 Epilepsie

Epilepsie ist eine der geläufigsten neurologischen Erkrankungen, welche etwa 1 % der

weltweiten Bevölkerung betrifft. Epileptische Anfälle sind gekennzeichnet durch repetitive,

hypersynchrone elektrischen Entladungen von Nervenzellen im Gehirn. Bei etwa einem

Drittel der betroffenen Patienten ist die Behandlung mit derzeitig verfügbaren antiepileptisch

wirksamen Medikamenten nicht kontrollierbar (Seifert et al. 2006). Die Internationale Liga

gegen Epilepsie (International League Against Epilepsy; ILAE) unterscheidet bei

epileptischen Anfällen zwischen generalisierten und fokalen epileptischen Anfällen.

Generalisierte epileptische Anfälle gehen von einem neuronalen Netzwerk aus, bei welchem

beide Großhirnhemisphären beteiligt sind. Diese sogenannten „bilateralen“ Netzwerke

können sowohl kortikale als auch subkortikale Strukturen beinhalten. Hingegen gehen fokale

epileptische Anfälle von einem neuronalen Netzwerk aus, bei welchem lediglich eine

Großhirnhemisphäre beteiligt ist (Berg et al. 2010). Es werden drei zugrunde liegende

Ursachen für epileptische Anfälle behandelt. Epilepsie als Ursache: 1. eines genetischen

Defekts, 2. einer struktureller und metabolischer Veränderungen oder 3. einer bislang nicht

aufgeklärten, unbekannten Ursache.

1.2 Zerebrale Inflammation

Inflammatorische Reaktionen innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) entstehen durch

eine Reihe unterschiedlicher Erkrankungen. Dazu gehören inflammatorische Erkrankungen,

wie bakterielle und virale Infektionen sowie Multiple Sklerose. Ebenfalls können

Erkrankungen, welche nicht in erster Linie inflammatorischer Natur sind wie Ischämie,

Tumore und Trauma, inflammatorische Reaktionen im ZNS hervorrufen (Walz 2010).

Einerseits schützen inflammatorische Reaktionen das Gehirn vor bakteriellen und viralen

Infektionen. Andererseits können Infektionen des ZNS langanhaltende, neurologische

Spätschäden zur Folge haben. In der Literatur wird unter anderem diskutiert, dass

Gewebeschädigungen aufgrund der inflammatorischen Antwort des Gehirns ernsthaftere

Konsequenzen als die Infektion an sich haben können (Wraith und Nicholson 2012). Lang

andauernde inflammatorische Bedingungen sind gekennzeichnet durch eine Ansammlung,

7

Aktivierung und Proliferation von immunmologisch aktiven Gliazellen wie der Mikroglia. Sie

werden durch ihr biochemisches Umfeld stark beeinflusst und reagieren auf Signale

umliegender Zellen. Unter inflammatorisch veränderten Bedingungen proliferieren Mikroglia

und nehmen einen aktivierten Phenotyp ein (Kettenmann et al. 2011).

1.3 Zusammenhang zwischen Epilepsie und Inflammation

Eine zunehmende Anzahl klinischer als auch experimenteller Studien berichten von einem

Zusammenhang zwischen Epilepsie und einer Inflammation des zentralen Nervensystems

(ZNS) (Vezzani and Granata 2005, Vezzani et al. 2011, Vezzani and Rüegg 2011).

Klinische Erkenntnisse basieren auf der Beobachtung, dass bei Medikament resistenten

Epilepsien eine anti-inflammatorische Therapie bei den Patienten eine Verbesserung bewirkte

(Wirrell et al. 2005, Wheless et al. 2007, Yu et al. 2013). Ein weiterer Hinweis basiert auf

dem erhöhten proinflammatorischen Zytokinlevel in der Zerebrospinalflüssigkeit und im

Serum von chronischen Epilepsie-Patienten nach einem Anfall (Hulkkonen et al. 2004,

Vezzani 2005, Aronica and Crino 2011). Ein Beispiel hierfür ist die erhöht gemessene

Interleukin-6 (IL-6) Konzentration im Liquor und Plasma von Patienten innerhalb von 24

Stunden nach einem tonisch-klonischen Anfall (Peltola et al. 1998). Ein weiterer Hinweis ist

die erhöhte gliale und neuronale Expression inflammatorischer Mediatoren in chirurgisch

entfernten Gehirngewebe von Patienten mit refraktärer Epilepsie (Vezzani and Granata 2005,

Choi et al. 2009, Aronica and Crino 2011, Vezzani 2011, Vezzani and Rüegg 2011, Silveira et

al. 2012). In chirurgisch entfernten Hippocampi von Patienten mit Temporallappenepilepsie

(TLE) konnten ebenfalls Indikatoren für eine Inflammation, wie aktivierte Mikroglia, reaktive

Astrozytose und proinflammatorische Zytokine, nachgewiesen werden (Vezzani et al. 2011).

Experimentelle Untersuchungen in Tiermodellen ergeben ebenfalls Hinweise auf einen

Zusammenhang zwischen Epilepsie und Inflammation: Induzierte epileptische Anfälle führten

zu einer Aktivierung glialer Zellen und folglich erhöhten Anzahl proinflammatorischer

Mediatoren (Vezzani et al. 1999, De Simoni 2000, Voutsine-Porche et al. 2004, Ravizza et al.

2005, Choi and Koh. 2008, Vezzani et al. 2011, Li et al. 2011). Die direkte intrazerebrale

Injektion proinflammatorischer Zytokine oder Lipopolysaccharide (LPS) führte in

Tiermodellen zudem zu einer erhöhten Aktivität von epileptischen Anfällen (Galic et al. 2008,

Auvin et al. 2010). Im Gegensatz führten Zytokinrezeptor Antikörper, wie Interleukin-1

Rezeptorantagonisten, zu einer effektiven antikonvulsiven Aktivität (Vezzani et al. 2000).

8

1.4 Antiepileptika

Der Wirkungsmechanismus der in dieser Dissertationsarbeit verwendeten Antiepileptika

Valproat (VPA), Carbamazepin (CBZ), Phenytoin (PHE) und Gabapentin (GBT) soll in

diesem Abschnitt erläutert werden:

Die therapeutische Wirksamkeit von Antiepileptika zur Senkung der neuronalen Aktivität

kann durch die folgenden Mechanismen erfolgen (Lüllmann et al. 2010):

- Blockade von spannungsabhängigen Na+ -Kanälen (CBZ, VPA, PHE)

- Förderung einer GABAergen Hemmung (GBT, VPA)

- Hemmung eines T-Typ-Ca2+

-Einwärtsstroms

Das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ) wird sowohl für die Behandlung von Epilepsie als

auch neuropathischer Schmerzen und affektiven Funktionsstörungen eingesetzt (Ambrosio et

al. 2002). Es wird bei der Behandlung von Epilepsie-Patienten mit fokalen Anfällen und

sekundär generalisierten tonisch-klonischen Anfällen verwendet (Pohlmann-Eden und

Steinhoff, 2006). Die Wirkung von CBZ erfolgt über die Blockade von spannungsabhängigen

Na+ -Kanälen. Eine Wirksamkeit auf verschiedene Typen anderer Kanäle und Rezeptoren

wird ebenfalls angegeben (Ambrosio et al. 2002).

Valproinsäure (VPS), im englischen durch VPA (valproic acid) abgekürzt, wird für die

Behandlung von Epilepsie und bipolaren Störungen eingesetzt (Monti et al. 2009). Die Salze

der Valproinsäure, die sogenannten Valproate, werden als Antiepileptika für die Behandlung

von Myoklonien, Grand-mal-, generalisierten und fokalen Anfällen verwendet (Pohlmann-

Eden und Steinhoff, 2006). Die antiepileptische Wirkung von VPA erfolgt über Blockade

von spannungsabhängigen Na+ -Kanälen. Außerdem soll VPA zudem die Aktivität des

Neurotransmitters GABA (γ-Aminobuttersäure) verstärken (Monti et al. 2009).

Phenytoin (PHE) wird für die Behandlung von Epilepsie und Herzrhytmusstörungen

eingesetzt (Tunnicliff 1996). Es wird bei der Behandlung von Epilepsie-Patienten mit fokalen

Anfällen, Grand-mal- und komplex-fokalen Anfällen mit Bewusstseinstörungen verwendet

(Pohlmann-Eden und Steinhoff, 2006). Die Wirkung von Phenytoin erfolgt über eine

Blockade von spannungsabhängigen Na+ -Kanälen in der Plasmamembran von Nervenzellen.

Gabapentin (GBT), ein chemisches GABA (γ-Aminobuttersäure) Analog, wird für die

Behandlung von Epilepsie und bei Schmerzen im Rahmen von Neuropathien verabreicht

(Pohlmann-Eden und Steinhoff, 2006). Obwohl GBT ein chemisches GABA Analog ist,

9

bindet es weder an GABAA- noch GABAB-Rezeptoren und wird metabolisch nicht zu GABA

transformiert (Honarmand et al. 2012). Es wird bei Epilepsie-Patienten mit fokalen Anfällen

und großen epileptischen Anfällen eingesetzt (Pohlmann-Eden und Steinhoff, 2006).

Gabapentin bindet an die α2δ Untereinheit spannungsabhängiger Ca2+

-Kanäle und moduliert

den Einstrom von Ca2+

, wodurch es zu einer reduzierten Freisetzung exzitatorischer

Neurotransmitter kommt (Beal et al. 2012).

In der Pathophysiologie der Epilepsie wird der Beteiligung von Gliazellen immer mehr

Bedeutung zugeschrieben (Binder und Steinhäuser 2006, Seifert et al. 2006, Jabs et al. 2008,

Wetherington et al. 2008, Seifert et al. 2010, Devinsky et al. 2013). Astrozyten und Mikroglia

spielen eine wichtige Rolle bei der Initiation und Aufrechterhaltung der zerebralen

Immunantwort sowie der Versorgung der Nervenzellen (Pavone und Cardile 2003,

Kettenmann et al. 2011, Seifert und Steinhäuser 2013). Der Einfluss antiepileptischer

Medikamente auf Gliazellen ist teilweise bekannt, allerdings bleibt der detaillierte

Mechanismus oftmals ungeklärt (Cardile et al. 2001, Pavone und Cardile 2003, Dragunow et

al. 2006, Haghikia et al. 2008, Black et al. 2009, Smith et al. 2010, Andrzejczak 2011,

Gibbons et al. 2011, Stienen et al. 2011, Devinsky et al. 2013).

1.5 Astrozyten

Astrozyten nehmen in etwa 40 % des gesamten Gehirnvolumens ein und liegen in ca. 10 fach

höherer Anzahl als Nervenzellen im humanen Gehirn vor. Ihre Aufgaben im

Zentralnervensystem (ZNS) sind vielseitig. Sie bilden Ausläufer zu den Endothelzellen von

Kapillaren und sind am Aufbau und der Regulation der Blut-Hirn Schranke beteiligt (Nico

und Ribatti 2012). Außerdem umhüllen Astrozyten zentrale neuronale Synapsen und

exprimieren G-Protein gekoppelte Neurotransmitter Rezeptoren sowie Transporter, wodurch

sie direkt auf die Aktivität von Nervenzellen reagieren (Stobart und Anderson 2013). Diese

strukturelle Spezifikation und das breit vernetzte Synzytium ermöglicht es den Astrozyten mit

allen wichtigen Elementen des Zentralnervensystems zu interagieren. In Bezug auf die

neuronale Aktivität wird Astrozyten einerseits eine Versorgungsfunktion als auch effektive

Beseitigungsfunktion von Produkten, welche die Nervenzellen nicht mehr benötigen,

zugeschrieben (Walz 2010).

10

1.6 Astrogliale Gap Junctions und Connexin 43 (Cx43)

Astrozyten bilden ein über Gap-Junction Kanäle gekoppeltes funktionelles Synzytium,

welches für den Erhalt der zerebralen Homöostase essentiell ist (Dermietzel und Spray 1993).

Die interzellulären Kanäle werden durch spezifische Proteine, die Connexine gebildet. Bei

Astrozyten ist Connexin 43 (Cx43) die mit am häufigsten vorkommende Proteinuntereinheit

(Dermietzel et al. 1991; Giaume et al. 1991; Retamal et al. 2007). Insgesamt bilden sechs

Connexine einen Hemikanal (Connexon), welcher aus dem Endoplasmatischen Retikulum zur

Plasmamembran transportiert wird. Die Verknüpfung zweier Connexone benachbarter Zellen,

ermöglicht die Ausbildung eines funktionellen Gap-Junction Kanals zwischen den beiden

Zellen. Die astroglialen Gap-Junction Kanäle ermöglichen einen Austausch von Ionen und

Molekülen zwischen benachbarten Zellen ohne Kontakt zum extrazellulären Milieu.

Neurogliale Interaktionen über Gap Junctions zwischen Gliazellen und Nervenzellen sind

sowohl unter physiologischen als auch pathologischen Konditionen für die neuronale

Aktivität essentiell (Giaume et al. 2013). Veränderungen in der Expression und der Funktion

von Gap-Junction Kanälen sind mit verschiedenen Formen von Nervenkrankheiten assoziiert.

Die zell-spezifische Deletion von Cx43 und Cx30 führte in Mäusen zu einer Generierung

spontaner epileptischer Aktivität (Wallraff et al. 2006). In der Studie von Seifert et al. 2010

wird beschrieben, dass eine verringerte gap junctionale Permeabilität offenbar gegensätzliche

Auswirkungen auf die Exzitabilität zur Folge haben kann: einerseits einen prokonvulsiven

Effekt aufgrund der beeinträchtigten K+

Umverteilung und andererseits einen

antiepileptischen Effekt aufgrund der eingeschränkten neuronalen Energieversorgung. In

weiteren Studien konnte unter inflammatorisch modifizierten Bedingungen bei kultivierten

Astrozyten eine verringerte Cx43 Expression ermittelt werden (Faustmann et. al. 2003,

Hinkerohe et al. 2005). Mikroglia, welche das neuronale Umfeld kontrollieren, sind in der

Lage die astrogliale Zell-Zellkommunikation durch die Produktion einer Vielzahl

proinflammatorischer Zytokine, zu beeinflussen (Aloisi 2001, Faustmann et al. 2003,

Hinkerohe et al. 2005, 2010).

1.7 Mikroglia

Mikroglia, welche oftmals als Makrophagen des Gehirns bezeichnet werden, sind neben

Astrozyten die immunologisch aktiven Zellen des ZNS. Sie migrieren in alle Regionen des

ZNS und nehmen morphologisch einen inaktiven ramifizierten Zustand (resting ramified type

11

RRT) an (Kettenmann et al. 2011). Der Anteil an Mikroglia Zellen im adulten ZNS liegt bei

5-15 % der gesamten glialen Zellpopulation (Walz 2010). Mikroglia tasten ihre territorialen

Domänen ab und kommunizieren über eine große Anzahl an Signalwegen mit Astrozyten,

Oligodendrozyten, Nervenzellen und Zellen des Immunsystems (Kettenmann et al. 2011).

Neuere Studien berichten außerdem, dass Mikroglia, ähnlich wie Astrozyten, an der

Regulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind. Diese Erkenntnis beruht unter anderem auf

Studien, welche von einer pathologischen neuronalen Aktivität aufgrund einer Veränderung

der mikroglialen Funktion ausgehen (Béchade et al. 2013). Mikroglia gelten außerdem als

empfindlichste Sensoren für pathologisch veränderte zerebrale Bedingungen. Entdecken

Mikroglia Zellen Hinweise für zerebrale Verletzungen oder Dysfunktionen des

Nervensystems, kommt es zu einem komplexen, mehrstufigen Aktivierungsprozess. In diesem

Prozess wechselt der morphologische Zustand der Mikroglia vom inaktiven ramifizierten

Zustand (resting ramified type RRT) in den aktivierten phagozytierenden Zustand (rounded

phagocytic type RPT). Der morphologische Zustand der Mikroglia ist abhängig vom

immunologischen Status der Zellen (Faustmann et al. 2003; Hinkerohe et al. 2005). Aktivierte

Mikroglia kann zu Verletzungen des Hirngewebes migrieren, dort proliferieren und sowohl

zelluläre Kompartimente als auch komplette Zellen phagozytieren. Im aktivierten Zustand

besitzen Mikroglia außerdem die Fähigkeit eine große Anzahl an verschiedenen Substanzen

zu exprimieren, welche nützlich oder schädlich für umliegende Zellen sein können

(Kettenmann et al. 2011). Die exprimierten Substanzen sind abhängig von dem

unterschiedlichen Status, welchen die Mikroglia im aktivierten Zustand einnehmen können.

Die primären Zustände der aktivierten Mikroglia werden als M1 (klassische Aktivierung) und

M2 (alternative Aktivierung) bezeichnet (Benarroch 2013). Der M1 Zustand ist

gekennzeichnet durch einen phagozytierenden Phenotyp, verbunden mit der Produktion

inflammatorischer Zytokine (IL-1ß, IL-6, IL-23 und TNF-alpha), zytotoxischer Substanzen

(Stickstoffmonoxid), Peroxinitrite und exzitatorischen Aminosäuren. Der M2 Zustand ist

gekennzeichnet durch einen phagozytierenden Phenotyp, bewirkt jedoch eine Produktion

antiinflammatorischer Zytokine (TGF-beta, IL-10) oder unterstützt alternativ die Reperatur

von Gewebe durch die Ausschüttung von Matrixproteinen.

1.8 Das Astrozyten-Mikroglia Ko-Kultur Model

Wie bereits zuvor ausführlich erläutert, kommt es unter inflammatorischen Bedingungen,

verursacht durch zerebrale Infektionen, Verletzungen oder Dysfunktionen, zu einer

12

Aktivierung, Proliferation und Akkumulation immunologisch aktiver Mikroglia. Im

aktivierten Zustand sind sowohl Astrozyten als auch Mikroglia in der Lage eine Vielzahl anti-

/inflammatorischer Substanzen zu exprimieren. Folglich haben sie einen direkten Einfluss auf

benachbarte Nerven- und Gliazellen. Um den direkten Einfluss aktivierter Mikroglia auf die

interzelluläre Kopplungseigenschaften des astrozytären Synzytiums zu untersuchen, etablierte

Faustmann et al. (2003) ein Ko-Kultur Modell. Für diese Studie wurde einerseits eine

Astrozyten Ko-Kultur mit einem Mikroglia Anteil von ungefähr 5 % und von 30 % kultiviert.

Die Astrozyten Kultur mit einem Mikroglia Anteil von 5 % (M5) ist repräsentativ für den

physiologischen und mit einem Anteil von 30 % Mikroglia (M30) für den inflammatorisch

modifizierten Bereich des Gehirns. Basierend auf dem Astrozyten/Mikroglia Ko-Kultur

Modell wurde der Einfluss verschiedener neurologischer Medikamente, pro-/anti-

inflammatorischer Zytokine und anderer Substanzen auf den Mikroglia In-

/Aktivierungszustand sowie den Einfluss auf die astrozytäre Zell-Zell-Kommunikation

untersucht (Faustmann et al. 2003, Hinkerohe et al. 2005, Haghikia et al. 2008, Hinkerohe

2010, Stienen et al. 2011). Im Vergleich zur physiologischen M5 Ko-Kultur ist der Anteil

aktivierter Mikroglia bei der proinflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kultur signifikant

erhöht (Faustmann et al. 2003). Des Weiteren konnte bei der M30 Ko-Kultur eine reduzierte,

quantitative Expression des Gap-Junction-Proteins Connexin 43 (Cx43) gemessen werden.

Die reduzierte Cx43 Expression ging zudem mit einem reduzierten Membranruhepotential

(MRP) sowie astrozytären funktionellen Kopplungsfähigkeit einher.

In dieser Dissertationsarbeit wird der direkte Einfluss der vier Antiepileptika VPA, PHE, CBZ

und GBT auf die Gliazellen in dem erläuterten M5/ M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kultur

Model untersucht. Es wird die gliale Viabilität, Expression des Gap Junction Proteins

Connexin 43, In-/ und Aktivierung von Mikroglia Zellen sowie die Zytokin Expression

untersucht.

1.9 Fragestellung der Dissertation

In etwa 1 % der weltweiten Bevölkerung leiden unter epileptischen Anfällen. Die Ursachen

sind vielfältig: Genetische Prädisposition, traumatische Hirnschädigungen, Hirninfarkt und

Erkrankungen des Zentralnervensystems in Folge einer Meningitis. Die therapeutische

Wirksamkeit von Antiepileptika erfolgt über die Senkung der neuronalen Aktivität. Bei etwa

einem Drittel der betroffenen Patienten ist die Behandlung mit derzeit verfügbaren

Antiepileptika nicht kontrollierbar. Aus diesem Grund beschäftigen sich zunehmend mehr

13

Studien mit neuen Ansätzen. Einer dieser Ansätze, welcher in dieser Dissertation thematisiert

wird, ist der erläuterte Zusammenhang zwischen Epilepsie und einer Inflammation des

zentralen Nervensystems (ZNS). Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Initiation und

Aufrechterhaltung der zerebralen Immunantwort sowie der Versorgung der Nervenzellen.

Anhand des beschriebenen Astrozyten/Mikroglia Zellkultur-Modells soll der Einfluss

der alltäglich verwendeten Antiepileptika VPA, PHE, CBZ und GBT auf die Viabilität

von Gliazellen mittels eines Assays zur Bestimmung der Zellviabilität untersucht

werden.

Neurogliale Interaktionen zwischen Gliazellen und Nervenzellen sind für die neuronale

Aktivität essentiell. Gliazellen sind an der Modulation der synaptischen Transmission durch

die Modifikation von Kanälen, Transportern, Rezeptoren und Gap Junction Kanäle beteiligt.

Veränderungen in der Expression und der Funktion von Gap-Junction Kanälen sind mit

verschiedenen Formen von Nervenkrankheiten assoziiert.

Astrozyten bilden ein via Gap-Junction gekoppeltes, funktionelles Synzytium, welches

für den Erhalt der zerebralen Homöostase essentiell ist. Anhand des

Astrozyten/Mikroglia Zellkultur-Modells soll untersucht werden, inwiefern

Antiepileptika die Expression des Gap-Junction Proteins Cx43 beeinflussen können.

Der Zusammenhang zwischen Epilepsie und Inflammation ist durch klinische und

experimentelle Studien erwiesen. Inwiefern etablierte Medikamente gegen Epilepsie

entzündungshemmend oder -fördernd wirken ist jedoch nicht bekannt. Gliazellen sorgen als

Mikroglia für die Entzündungs- und Immunregulation. Unter inflammatorischen Bedingungen

verändert sich der Funktionszustand der Mikroglia von einem inaktiven zu einem aktivierten

Phenotyp. Die mikrogliale Aktivierung gilt somit als eines der wichtigsten Kennzeichen für

eine Entzündungsreaktionen im ZNS und kann mittels immunocytochemischer Färbung

visualisiert werden.

Das in dieser Arbeit verwendete Zellkulturmodell imitiert durch die Ko-Kultur

unterschiedlicher Astroglia- und Mikrogliaanteile normale und entzündliche

Bedingungen im ZNS. Anhand der M5 Ko-Kultur soll mittels immuncytochemischer

Färbung untersucht werden, inwiefern die Antiepileptika VPA, PHE, CBZ und GBT

14

den Aktivierungsgrad der Mikroglia beeinflussen. Hingegen soll anhand der M30 Ko-

Kultur, welche durch eine hohe Anzahl aktivierter Mikroglia gekennzeichnet ist

untersucht werden, inwiefern die Antiepileptika VPA, PHE, CBZ und GBT den

Aktivierungsgrad der Mikroglia herabsetzen und dadurch entzündungshemmende

Eigenschaften aufweisen.

Die beiden Zytokine TGF-beta1 und TNF-alpha sind bei der Regulation von

Entzündungsprozessen im Gehirn beteiligt. Beide Zytokine werden sowohl von Astrozyten als

auch von Mikroglia exprimiert. TGF-beta1 gilt als anti-inflammatorisches Zytokin und TNF-

alpha als proinflammatorisches Zytokin. Die pro- oder antiinflammatorische Wirksamkeit

hängt allerdings von verschiedenen Faktoren wie der Konzentration, der lokalen Verteilung

und dem Einfluss von verschiedenen inhibitorischen Faktoren ab.

Die Bestimmung der Zytokinkonzentrationen von TGF-beta1 und TNF-alpha mittels

Sandwich-ELISA in den Überständen der M5 und M30 Ko-Kulturen nach Inkubation

mit den Antiepileptika VPA, PHE, CBZ und GBT soll zusätzliche Informationen über

die entzündungshemmende oder –fördernde Wirkung der Medikamente auf Gliazellen

ergeben.

15

2. Material und Methoden

2.1 Zellkultur

2.1.1 Astrozyten-Mikroglia Ko-Kultur

Die primären Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen werden postnatal aus dem Gehirn von

neugeborenen Wistar-Ratten (P0-P2) präpariert. Hierfür wurden die Tiere dekapitiert und der

Schädel mit sterilem Besteck geöffnet. Anschließend wurde das Gehirn vorsichtig entnommen

und in eine durch Eis gekühlte Petrischale mit sterilem PBS (Phosphat-buffered saline)

gelegt. Die Meningen wurden mit zwei sterilen Pinzetten unter Binokular-Kontrolle

abgezogen und der Plexus sowie das Kleinhirn entfernt. Nach erfolgter Präparation wurden

die in PBS gesammelten Hemisphären mechanisch, mit einer 10 ml Pipette durch auf- und

abziehen, zerkleinert und für 30 Minuten bei 37 °C in einer 0,1%igen Trypsin-Lösung (PAA

Laboratories, Pasching, Österreich) im Wasserbad inkubiert. Die verdaute Gehirnmischung

wurde mit PBS auf 20 ml aufgefüllt und bei 500g für 7 Minuten zentrifugiert. Der Überstand

wurde vorsichtig verworfen und das Pellet mit 5 ml DNase I (Serva Electrophoresis,

Heidelberg, Deutschland) 100 µg/ml in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) für 5

Minuten bei Raumtemperatur (RT) verdaut. Die Suspension wurde mit DMEM auf 20 ml

aufgefüllt und für 5 Minuten bei 200g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das

Pellet mit 1 ml DMEM pro Hemisphäre resuspendiert. Im Anschluss wurde die

Zellsuspension durch ein steriles Nylon-Netz mit einem Durchmesser von 60 µm filtriert. Das

Filtrat mit den glialen Zellen wurde in Zellkulturflaschen (4 Hemisphären pro 25 cm2

-

Flasche) mit Astrozyten-Medium* ausgesäht und im Wärmeschrank bei 7 % CO2 und 37 °C

kultiviert. Am Folgetag wurden die adhärenten Zellen nochmals gewaschen und frisches

Kulturmedium hinzugegeben. Nach etwa einer Woche waren die Zellen konfluent gewachsen

und konnten für die jeweiligen Experimente ausgesäht werden.

*Inhalt: 87 % DMEM, Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland)

10 % Fetales Kälberserum, Biochrom AG (Berlin, Deutschland)

1 % Penicillin/Streptomycin, Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland)

1 % Nichtessentielle Aminosäuren, PAA Laboratories (Pasching, Österreich)

1 % Glutamin, PAA Laboratories (Linz, Österreich)

16

Um eine Astrozyten Ko-Kultur mit einem Mikroglia-Anteil von 30 % zu generieren, wird das

Medium der adhärenten Zellen verworfen und mit PBS gewaschen. Da sich die Mikroglia auf

den konfluent gewachsenen Astrozyten absetzen ist es bei der M30 Ko-Kultur wichtig

vorsichtig mit PBS zu waschen, um möglichst wenige Mikroglia abzulösen. Im Vergleich

werden bei der Herstellung einer Astrozyten Ko-Kultur mit einem Mikroglia-Anteil von 5 %

die adhärenten Zellen für 1 Stunde bei 300 rpm unter sterilen Bedingungen bei RT

geschüttelt. Dabei löst sich ein bestimmter Anteil an adhärenten Mikroglia ab und geht in das

Zellkulturmedium über. Das Zellkulturmedium wird anschließend verworfen.

Im weiteren Verlauf wurden die Astrozyten-Mikroglia Ko-Kulturen passagiert und für die

jeweiligen Versuche auf PLL (Poly-L-Lysin) beschichtete Deckgläschen (12 mm) (Assistent,

Sondheim, Deutschland) ausgesäht (60.000 Zellen/Deckgläschen). Alternativ wurden die Ko-

Kulturen auf PLL beschichteten 96 Well-Platten (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland)

mit einer Dichte von 10.000 Zellen/Well ausgesäht.

2.1.2 Inkubation mit den antiepileptisch wirksamen Substanzen

Basierend auf vorherigen Studien mit dem Antiepileptikum Levetiracetam (Haghikia et al.

2008, Stienen et al. 2011) und in Übereinstimmung mit gemessenen Serumkonzentrationen

von Epilepsie Patienten (Fröscher et al. 1999, Grim et al. 2003) werden in dieser Dissertation

klinisch effiziente Konzentrationen der antiepileptischen Substanzen Valproat (VPA),

Carbamazepin (CBZ), Phenytoin (PHE) und Gabapentin (GBT) verwendet. Aufgrund der

Variation gemessener Konzentrationen im Serum, Liquor und Hirngewebe von Epilepsie

Patienten (Schnabel et al. 1996, Mataringa et al. 2002, Rambeck et al. 2006) und um einen

konzentrationsabhängigen Einfluss auf die Ko-Kulturen zu untersuchen, werden folgende

Konzentrationen der Antiepileptika eingesetzt: VPA [50, 100 und 200 µg/ml], CBZ [10, 25,

50 und 100 µg/ml], PHE [10, 25, 50 und 100 µg/ml] und GBT [10, 25, 50 und 100 µg/ml].

Die antiepileptisch wirksamen Substanzen VPA, GBT und PHE (Sigma-Aldrich, Steinheim,

Deutschland) wurden in destilliertem H2O gelöst. CBZ (Sigma-Aldrich, Steinheim,

Deutschland) wurde in DMSO (Dimethyl Sulfoxide) gelöst und mit destilliertem H2O

verdünnt. Die finale Konzentration von DMSO war geringer als 1%. Die Ko-Kulturen wurden

mit VPA, CBZ, PHE und GBT für 24 Stunden im Wärmeschrank bei 7 % CO2 und 37 °C

inkubiert.

17

2.2 Viabilitätsassay

Der konzentrationsabhängige Einfluss der Antiepileptika VPA, CBZ, PHE und GBT auf die

Viabilität und Proliferation der Ko-Kulturen wurde mit dem Cell Proliferation Kit I (Roche

Diagnostics, Mannheim, Deutschland) entsprechend der Beschreibung des Herstellers,

bestimmt. Der Assay basiert auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT (-3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) zu violett gefärbten Formazan

Kristallen, durch Enzyme des Endoplasmatischen Reticulums. Die Verstoffwechselung findet

lediglich in metabolisch aktiven Zellen statt. Die quantitative Ausbeute des violett gefärbten

Formazan korrelierte direkt mit der Anzahl metabolisch aktiver glialer Zellen in den Ko-

Kulturen. Die Absobtion des Farbstoffes wurde mit dem Mikroplatten Lesegerät (Bio-Rad

550, München, Deutschland) bei 570 nm ermittelt.

2.4. Immunocytochemie

Für die Untersuchung der mikroglialen Aktivierung wurden die auf den PLL-beschichteten

Deckgläschen, adhärenten Ko-Kulturen dreimal mit PBS (phosphate buffered saline) für

jeweils 10 Minuten gewaschen und anschließend mit eiskaltem Ethanol (100 %) fixiert.

Nachdem die Zellen fixiert waren, wurde nochmals dreimal mit PBS unter Schütteln

gewaschen und anschließend für 20 Minuten mit PBS + 1 % BSA (bovine serum albumin) +

10 % HS (horse serum) geblockt, um später unspezifische Bindungen der Antikörper zu

vermeiden. Im Anschluss an den Blockschritt wurde der primäre Antikörper in PBS + 1 %

BSA verdünnt und auf die Deckgläschen pipettiert (25 µl/Deckgläschen) und über Nacht bei 4

°C inkubiert. Die Ko-Kulturen wurden mit dem primären mouse anti ED-1 (Serotec,

Düsseldorf, Deutschland) im Verhältnis 1:250 inkubiert. Am Folgetag wurden die Zellen

dreimal mit PBS + 1 % BSA für jeweils 10 Minuten gewaschen und mit dem sekundären

Antikörper Alexa rot 568 anti-mouse (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) mit einer

Verdünnung von 1:1000 in PBS + 1 % BSA für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT)

inkubiert (25 µl/Deckgläschen). Im letzten Schritt wurden die Deckgläschen mit dem

Kernfarbstoff Hoechst 33342 versetzten ProLong-antifade-Kleber (Invitrogen, Karlsruhe,

Deutschland) auf Objekträgern fixiert. Nach 1-2 Tagen konnten die Zellen am

Immunfluoreszenz-Mikroskop (Axiophot Carl Zeiss GmbH, Jena, Deutschland) ausgewertet

werden.

18

In dieser Dissertationsarbeit werden zusätzliche immunocytochemische Färbungen der Ko-

Kulturen sowie histologische Gehirnschnittfärbungen von der Ratte (Kontrolle) mit den

Markern GFAP (Glial fibrillary acidic protein) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland),

NeuN (Neuronal Nuclei) (Millipore, Darmstadt, Deutschland), CNPase (2',3'-cyclic-

nucleotide phosphodiesterase) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) angefertigt. Diese

Färbungen gelten als Nachweis, dass die Ko-Kulturen, welche aus dem Gehirn von

neugeborenen Wistar-Ratten (P0-P2) gewonnen werden, hautpsächlich aus Astrozyten und

Mikroglia bestehen und keine weiteren Zelltypen vorhanden sind (Details siehe Anhang 7.2).

2.5 Auswertung der immunocytochemischen Färbungen

Die Auswertung der immunocytochemisch gefärbten Astrozyten-Mikroglia Ko-Kulturen

erfolgt visuell am Fluoreszenzmikroskop (Axiophot Carl Zeiss GmbH, Jena). Für die

Bestimmung des prozentualen Mikroglia-Anteils wird das Verhältnis der Gesamtzahl der ED-

1 gefärbten Mikroglia mit der Gesamtzahl durch den Kernfarbstoff Hoechst 33342

angefärbten Kerne insgesamt (Astrozyten und Mikroglia) bestimmt (siehe Anhang 7.1). Es

wurden pro Deckgläschen drei unterschiedliche Sichtfelder ausgezählt (63x Vergrößerung).

Die Einteilung der Mikroglia Phenotypen erfolgt entsprechend Faustmann et al. 2003 in

inaktive ramifizierte Mikroglia (resting ramified type RRT), intermediäre Mikroglia (INT)

und aktive phagozytierende Mikroglia (rounded phagocytic type RPT) (Abb. 2.5). Pro

Deckgläschen wurden jeweils die Gesamtzahl aller Mikroglia von drei unterschiedlichen

Sichtfeldern ausgezählt und in den jeweiligen Funktionszustand eingeteilt (63x

Vergrößerung). Die aktivierten Mikroglia (RPT) sind durch ihre runden Zellkörper ohne

Zellfortsätze deutlich zu erkennen. Im Vergleich zum RPT ist der RRT durch seine langen

Zellfortsätze gekennzeichnet. Die intermediären Mikroglia sind durch kurze Zellfortsätze,

welche den Durchmesser des Soma nicht überschreitet, gekennzeichnet.

Für die M5/M30 Kontrolle als auch für die mit den verschiedenen Antiepileptika inkubierten

Ko-Kulturen wurde der Mittelwert ± SEM für die Anzahl der jeweiligen Phenotypen (RRT,

INT und RPT) aus allen ausgewerteten Sichtfeldern bestimmt. Anschließend wurde der

Mittelwert der einzelnen Mikroglia Phenotypen (RRT und RPT) für die Kontrolle gleich 1

gesetzt und mit dem Mittelwert der Phenotypen der mit Antiepileptika inkubierten Ko-

Kulturen normalisiert.

19

Abb. 2.5. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Immunocytochemische Färbung

der Mikroglia (rot) mit dem monoklonalen ED-1 Antikörper. Die Zellkerne wurden mit dem Kernfarbstoff DAPI

(blau) visualisiert, um die gesamte Anzahl an Gliazellen zu ermitteln. A. Astrozyten Ko-Kultur mit einem

Mikroglia-Anteil von etwa 30 %, welche in vitro das inflammatorisch betroffene Gewebe des Gehirns

repräsentiert. B. Astrozyten Ko-Kultur mit einem Mikroglia-Anteil von etwa 5 %, welche in vitro das

physiologische Gewebe des Gehirns repräsentiert. C. D. E. Klassifikation der verschiedenen Mikroglia

Phenotypen: Inaktive ramifizierte Mikroglia (resting ramified type, RRT) (C), intermediäre Mikroglia

(intermediate type, INT) (D) und aktive phagozytierende Mikroglia (activated, round phagocytic type, RPT) (E).

2.6 ELISA

Die TGF-beta1 Konzentration in den Zellkultur-Überstanden der Ko-Kulturen wurde mittels

Sandwich-ELISA (Promega, Madison, USA) quantifiziert. Entsprechend der technischen

Beschreibung des Herstellers wurde eine 96-Well Mikrotiterplatte mit dem primären TGF-

beta1 monoklonalen Antikörper (TGF-beta mAB) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am

Folgetag wurde die Mikrotiterplatte mit einem Block-Puffer für 35 Minuten bei 37 °C

blockiert und mit TBST-Puffer (Tris-buffered saline mit Tween 20) ausgewaschen.

Anschließend wurden die zu untersuchenden Proben und eine Standardreihe in die 96-Well

Mikrotiterplatte pipettiert und für 2 Stunden bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurde die

20

Mikrotiterplatte fünfmal mit TBST-Puffer gewaschen und für weitere zwei Stunden bei RT

mit dem sekundären polyklonalen Antikörper (anti-TGF-beta1 pAB) inkubiert. Im Anschluss

wurden je 100 µl TGF-beta1 HRP (horseradish peroxidase) Konjugat in die präparierten

Wells pipettiert, nachdem die Mikrotiterplatte fünfmal mit TBST-Puffer ausgewaschen

wurde. Die Mikrotiterplatte wurde für zwei weitere Stunden bei RT inkubiert. Im Anschluss

an den letzten Waschritt mit TBST-Puffer, wurde die Mikrotiterplatte mit jeweils 100 µl der

vom Hersteller mitgelieferten TMB One Solution pro Well inkubiert. Durch die von dem

Enzym HRP katalysierte Reaktion wird das farblose Substrat TMB (3,3’, 5,5’ –

tetramethylbenziden) in ein blau angefärbtes Produkt umgesetzt. Diese Reaktion wurde nach

15 Minuten durch die Zugabe von 100 µl 1 molarer Salzsäure pro Well gestoppt. Durch den

niedrigen ph-Wert kommt es dabei zu einem Farbumschlag von blau nach gelb. Die optische

Dichte wurde direkt nach Zugabe der Salzsäure mittels eines Mikroplatten-Reader (Bio-Rad

550, München, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

Die TNF-alpha Konzentration in den Zellkultur-Überstanden der Ko-Kulturen wurde mittels

Sandwich-ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland), entsprechend der Beschreibung

für den Quantikine® Rat TNF-alpha Assay, bestimmt. Die Proben und Standardreihe wurden

auf die mit dem primären TNF-alpha monoklonalen Antikörper (TNF-alpha mAB)

beschichtete 96-Well Mikrotiterplatte pipettiert und für 2 Stunden bei RT inkubiert.

Anschließend wurde die Mikrotiterplatte fünfmal mit dem mitgelieferten Waschpuffer

ausgewaschen und für 2 Stunden bei RT, mit dem TNF-alpha HRP-konjugierten sekundären,

polyklonalen Antikörper, inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Mikrotiterplatte fünfmal

gewaschen und mit 100 µl der mitgelieferten Substratlösung pro Well für 30 Minuten bei RT

inkubiert. Die darauf folgende enzymatische Reaktion wurde bereits im vorherigen Abschnitt

beschrieben. Durch die Zugabe von 100 µl Stop Solution wurde die Reaktion gestoppt und die

optische Dichte bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge bis 570 nm mit dem Mikroplatten-

Reader, gemessen.

Die TGF-beta1 und TNF-alpha Konzentrationen der jeweiligen Zellkultur-Überstände

wurden anhand einer Standardkurve aus zwei gleichen Verdünnungsreihen ermittelt. Jedes

Ergebnis entspricht dem Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) als Resultat von

mehreren unabhängig durchgeführten Experimenten.

21

2.7 Western Blot

2.7.1 Zellaufschluss

Für die quantitative Cx43 Proteinbestimmung wurden die Ko-Kulturen, welche in kleinen

Petrischalen (60 x 15 mm) (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) ausgesäht (300.000

Zellen pro Petrischale) wurden, zuerst mechanisch lysiert. Hierfür wurden 200 µl 1 x

Laemmli Puffer und 4 µl Proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) zu den

Zellen hinzugegeben und mit einem Silikonspatel von den Petrischalen abgekratzt.

Anschließend wurden die Zellen mit einer Spritze mechanisch durch auf- und abziehen lysiert

und die Zellsuspension in 1,5 ml Eppendorf-Tubes überführt.

2.7.2 Konzentrationsbestimmung nach Bradford

Die Proteinbestimmung nach Bradford basiert auf der Verwendung des blauen

Säurefarbstoffes Coomasie-Brilliantblau. In Gegenwart von Proteinen im sauren Milieu

verschiebt sich das Absorptionsmaximum des Coomasie-Brilliantblaus G250 von 465 auf 595

nm. Der Grund für die Verschiebung des Absorptionsmaximums ist vermutlich die

Stabilisierung des Farbstoffes in seiner unprotonierten, anionischen Sulfonat-Form durch

Komplexbildung zwischen Farbstoff und Protein. Für die Erstellung der Eichkurve wird

Rinderserumalbumin (BSA bovine serum albumin) verwendet. Hierfür wurden Proben

unterschiedlicher Proteinkonzentrationen von BSA (1, 2, 4, 6, 8 und 10 µg/µl) mit

destilliertem H2O (799, 798, 796, 794, 793 und 790 µl) und 200 µl Bradford-Standardlösung

(BioRad, München, Deutschland) versetzt. Die Standards wurden innerhalb von 15 Minuten

bei 595 nm in Plastikküvetten (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gemessen. Die

Nullkontrolle für die Eichung bestand lediglich aus destilliertem H2O (800 µl) und Bradford-

Standardlösung (200 µl) ohne zugesetzte Proteinlösung. Die BSA-Eichkurve ergibt sich aus

der gemessenen Extinktion, die gegen die bekannte Proteinkonzentration aufgetragen wird.

Von der jeweiligen Zellsuspension wurden 5 µl der Probe mit 795 µl dest. Wasser und 200 µl

Bradford-Reagenz in den Plastikküvetten vermischt und nach 15 Minuten die Extinktion mit

dem Photometer Ultrospec 3000 (GE-Healthcare, München, Deutschland) gemessen.

Anschließend wurde die Konzentration durch Vergleich der ermittelten Extinktion der

unbekannten Proteinprobe mit der Eichkurve ermittelt.

22

2.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Auftrennung nach der Molekularmasse der Proteine aus den Zellsuspensionen wurde

durch die Gelelektrophorese gewährleistet. Hierbei liegt die Molekularmasse des zu

untersuchenden Gap-Junction Proteins bei 43 Dalton. Die Proben wurden für 5 Minuten auf

95 °C erhitzt, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden. Dadurch kommt es zur Aufspaltung

von Wasserstoff-Brücken und somit zur Auflösung der Sekundär- und Tertiärstruktur der

Proteine. Das Sammel- und Trenngel wird wie folgt zusammengesetzt, wobei der

Radikalstarter APS (Ammoniumperoxodisulfat) (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) und

der Katalysator TEMED (Tetramethylethylenediamine) (AppliChem, Darmstadt,

Deutschland), welche zur Polymerisierung des Gels führen, als letztes hinzugegeben werden.

Jeweils 10 µl der Proben sowie 5 µl eines Kaleidoskop-Markers (BioRad, München,

Deutschland) wurden in die Gel-Taschen aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 100 V

gestartet bis die Proben aus dem Sammelgel in das Trenngel übergegangen sind, anschließend

wurde auf 150 V erhöht.

Trenngel Sammelgel

dest. H2O 5,1 ml 2,9 ml

Tris, pH 8,8 3,2 ml -

Tris, pH 6,8 - 1,25 ml

30 % Acrylamid 4,2 ml 833 μl

10 % SDS 125 μl 50 μl

10 % APS 100 μl 37,5 μl

TEMED 10 μl 7,5 μl

Zusammensetzung für 2 Gele für die SDS-PAGE

2.7.4 Western Blot und immunologischer Nachweis der Proteine

Im Anschluss an die Gelelektrophorese wurden die auf dem Gel separierten Proteine auf ein

Nitrozellulosepapier transferiert. Hierfür wurden die Blotting-Papiere und die

Nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia, Little Chalfont, England) auf das Gel

zurechtgeschnitten und für 10 Minuten in Blotting-Puffer bei 4 °C eingelegt. Bei dem

23

Western-Blot musste die Nitrozellulosemembran zum Plus- und das Gel zum Minuspol

gerichtet werden. Anschließend wurde für eine Stunde bei 90 mA geblottet.

Die Nitrozellulosemembran wurde im Anschluss an den Blot für eine Stunde in 0,5 %

Blocklösung bei RT inkubiert. Im Anschluss wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit

dem primären Antikörper Rabbit anti-Connexin 43 (Invitrogen, Carlsbad, Deutschland) im

Verhältnis von 1:1000 in 0,2 % Blocklösung inkubiert. Am Folgetag wurde dreimal für 20

Minuten mit PBS-Tween gewaschen und für eine Stunde bei RT mit dem sekundären

Antikörper Peroxidase goat anti-rabbit (Jackson ImmunoResearch, Suffold, England) im

Verhältnis von 1:5000 in 0,2 % Blocklösung inkubiert. Anschließend wurde die Membran

dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Im Fotolabor wurden 1 ml Peroxidase- und 1 ml

Enhancer-Solution (Thermo Scientific, Bonn, Deutschland) für 2 Minuten direkt auf die

Nitroczellulosemembran pipettiert. Durch Auflegen eines Hyperfilms (Amersham Pharmacia,

Little Chalfont, England) wurden die einzelnen Banden auf der Nitrozellulosemembran

sichtbar gemacht. Die Entwicklung des Hyperfilms erfolgte automatisch mit einer

Röntgenfilm-Entwicklungsmaschine Optimax (PROTEC GmbH, Oberstenfeld, Deutschland).

Der entwickelte Film wurde eingescannt und mit der Quantity-One-Software (Version 4.5.2)

hinsichtlich Dichte, Volumen und Fläche der detektierten Banden ausgewertet.

Im Anschluss an die Detektion der Cx43-Banden wurden die Antikörper von der

Nitrozellulosemembran wieder abgewaschen um eine erneute Markierung mit dem

Referenzprotein ß-Aktin durchzuführen. Hierfür wurde die Nitrozellulosemembran für 35

Minuten in Stripping-Puffer bei 50 °C gelegt und somit die Antikörpermarkierungen gelöst.

Die Membran wurde im Anschluss, wie bereits beschrieben, mit dem Erstantikörper anti-β-

Aktin (Sigma, St. Louis, USA) 1:7500 und mit dem Peroxidase-gekoppelten Zweitantikörper

rabbit anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research, West Grove, USA) im Verhältnis von

1:5000 in 0,2 % Blocklösung inkubiert und detektiert.

2.8 Statistik

Die signifikanten Unterschiede in der Viabilität, den Zytokinlevel und den Mikroglia

Phenotypen (RRT und RPT) zwischen der Kontrolle und den mit Antiepileptika inkubierten

Ko-Kulturen (M5 und M30) wurde mittels one-way ANOVA und anschließenden Bonferroni

post-hoc comparison test (GraphPad Software, San Diego, USA) ermittelt. Die signifikanten

Unterschiede des Median der prozentualen Cx43 Expression zwischen der Kontrolle und den

mit Antiepileptika inkubierten Ko-Kulturen wurde mittels one-way ANOVA und

24

anschließenden Kruskal-Wallis test, ermittelt. Die Unterschiede wurden bei p*<0.05,

p**<0.01 und p***<0.001 als signifikant anerkannt.

25

3. Ergebnisse

3.1 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Viabilität primärer

M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen

Die konzentrationsabhängige Inkubation mit den beiden Antiepileptika VPA und GBT führt

zu keiner Veränderung der Viabilität der M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen.

Hingegen führt die Inkubation der M5 Ko-Kulturen mit 50 und 100 µg/mL PHE (n=10;

p*<0.05 und p***<0.001) zu einer signifikant verringerten Viabilität der Zellen (Abb.3.1).

Abb. 3.1. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Viabilitätsassay (MTT) der M5

und M30 Ko-Kulturen, nach Inkubation [10-100 µg/ml] mit den entsprechenden antiepileptischen Substanzen

für 24 Stunden. Der Graph zeigt die Mittelwerte von n=10 unabhängig durchgeführten Experimenten der M5

und M30 Ko-Kulturen, auf. Die Unterschiede wurden als signifikant eingestuft bei p*<0.05, p**<0.01 und

p***<0.001 sowie als nicht signifkant (ns) bei p>0.05. Die Viabilität der Gliazellen der M5 als auch M30 Ko-

Kulturen ist dosisabhängig verringert, nach 24 stündiger Inkubation mit PHE und CBZ.

26

Eine signifikant verringerte Viabilität kann ebenfalls in den M30 Ko-Kulturen nachgewiesen

werden, nach 24 stündiger Inkubation mit 50 und 100 µg/mL PHE (n=12; p***<0.001 und

p***<0.001). Eine signifikante Verringerung der Metabolisierung des gelben

Tetrazoliumsalzes MTT kann nach Inkubation mit 100 µg/mL (n=10; p**<0.01) CBZ in den

M5 Ko-Kulturen gemessen werden. In den M30 Ko-Kulturen kann eine signifikant

verringerte Viabilität der Zellen nach Inkubation von 10, 25, 50 and 100 µg/mL CBZ (n=12;

p*<0.05, p**<0.001, p***<0.0001 und p***<0.0001) detektiert werden.

3.2 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die mikrogliale

Aktivierung/ Inaktivierung in primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia

Ko-Kulturen

Die Inkubation mit VPA für 24 Stunden führt zu einer signifikanten Aktivierung der

Mikroglia in den physiologischen M5 (Abb. 3.2.a) als auch inflammatorisch modifizierten

M30 (Abb. 3.2.b) Ko-Kulturen. Die Inkubation mit 50 µg/mL VPA führt zu einer

signifikanten Erhöhung der Anzahl des aktivierten Mikroglia Phenotyps (RPT) von 25.00%

(n=66)# auf 62.50% (n=33; p***<0.0001). Entsprechend verringert sich der prozentuale

Anteil des inaktivierten Mikroglia Phenotyps (RRT) signifikant von 42.86% (n=66)#

auf

10.00% (n=33; p***<0.0001). Die signifikante mikrogliale Aktivierung kann ebenfalls nach

Inkubation mit höheren Konzentrationen von VPA (100 und 200 µg/mL) gemessen werden.

Die Inkubation der M30 Ko-Kulturen mit 200 µg/mL VPA führt zu einem signifikant höheren

Anteil an aktivierten Mikroglia (RPT) von 66.67% (n=45)# auf 83.33% (n=24, p**<0.01).

Hingegen ist der prozentuale Anteil an inaktivierten Mikroglia (RRT) bereits ab einer

Konzentration von 50 µg/mL VPA signifikant verringert, im Vergleich zur Kontrolle von

8.62% (n=45)# auf 3.79% (n=24, p*<0.05).

Die konzentrationsabhängige Inkubation der M5 und M30 Ko-Kulturen mit GBT für 24

Stunden bewirkt keine signifikanten Veränderungen der Mikroglia Phenotypen, bei direktem

Vergleich mit der Kontrolle.

Die Inkubation mit PHE bewirkt eine signifikante Mikroglia Aktivierung in den M5, ohne

signifikante Veränderungen in den M30 Ko-Kulturen. Ab einer Konzentration von 50 µg/mL

PHE erhöht sich der prozentuale Anteil des aktivierten Mikroglia Phenotyps (RPT)

signifikant von 24.26% (n=62)# auf 50.00% (n=28, p**<0.01). Dementsprechend verringert

sich der prozentuale Anteil des inaktivierten Mikroglia Phenotyps (RRT) in den M5 Ko-

Kulturen von 41.42% (n=62)# auf 25.00% (n=28, p*<0.05).

27

Abb. 3.2.a. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Auf der linken Seite des

Graphs (blaue Balken) ist das Verhältnis des Mittelwerts des prozentualen Anteils an inaktivierten Mikroglia

(RRT) zwischen der Kontrolle (auf die Zahl 1 normiert) und mit den Antiepileptika* behandelten M5 Ko-

Kulturen. Auf der rechten Seite des Graphs (rote Balken) ist das Verhältnis des Mittelwerts des prozentualen

Anteils an aktivierten Mikroglia (RPT) zwischen der Kontrolle (auf die Zahl 1 normiert) und mit Antiepileptika

behandelten M5 Ko-Kulturen. *(VPA (n=33) GBT (n=24) PHE (n=28) und CBZ (n=22)). Die Unterschiede

wurden als signifikant eingestuft bei p*<0.05, p**<0.01 und p***<0.001 sowie als nicht signifkant (ns) bei

p>0.05. Die Inkubation der M5 Ko-Kulturen mit VPA (50, 100, 200 µg/ml) und PHE (50, 100 µg/ml) über 24

Stunden, führt zu einer signifikanten Aktivierung der Mikroglia.

Die 24 stündige Inkubation mit CBZ führt zu einer signifikanten Inaktivierung der Mikroglia

in den M30, ohne Veränderungen der Mikroglia Phenotypen in den M5 Ko-Kulturen. Der

prozentuale Anteil des aktivierten Mikroglia Phenotyps (RPT) ist signifikant reduziert, von

68.41% (n=28)# auf 29.41% (n=20, p*<0.05) nach Inkubation mit 25 µg/mL CBZ. Dieselbe

Konzentration von CBZ führt zu einem signifikant erhöhten Anteil des inaktivierten

Mikroglia Phenotyps (RRT) von 13.84% (n=28)# auf 45.55% (n=20, p**<0.01). Ein

vergleichbarer signifikanter Effekt kann bei höheren Konzentrationen von CBZ (50 und 100

µg/mL) ermittelt werden.

28

Abb. 3.2.b. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Auf der linken Seite des

Graphs (blaue Balken) ist das Verhältnis des Mittelwerts des prozentualen Anteils an inaktivierten Mikroglia

(RRT) zwischen der Kontrolle (auf die Zahl 1 normiert) und mit den Antiepileptika* behandelten M30 Ko-

Kulturen. Auf der rechten Seite des Graphs (rote Balken) ist das Verhältnis des Mittelwerts des prozentualen

Anteils an aktivierten Mikroglia (RPT) zwischen der Kontrolle (auf die Zahl 1 normiert) und mit Antiepileptika

behandelten M30 Ko-Kulturen. *(VPA (n=24) GBT (n=30) PHE (n=40) und CBZ (n=20)). Die Unterschiede

wurden als signifikant eingestuft bei p*<0.05, p**<0.01 und p***<0.001 sowie als nicht signifkant (ns) bei

p>0.05. Die Inkubation der M30 Ko-Kulturen mit VPA (200 µg/ml) über 24 Stunden, führt zu einer

signifikanten Aktivierung der Mikroglia. Hingegen führt die Inkubation der M30 Ko-Kulturen mit CBZ

(25,50,100 µg/ml) zu einer signifikant verringerten Anzahl aktivierter und erhöhten Anzahl inaktivierter

Mikroglia.

29

3.3 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die astrogliale Cx43

Expression in primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen

Die astrogliale Cx43 Expression in den M5 und M30 Ko-Kulturen wurde mittels quantitativer

Western Blot Analyse untersucht. Die konzentrationsabhängige Inkubation mit allen

untersuchten Antiepileptika VPA, GBT, PHE und CBZ bewirkt keine signifikant veränderte

astrogliale Cx43 Expression sowohl bei den M5 als auch M30 Ko-Kulturen (Abb. 3.3).

Abb. 3.3. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Die Western Blots zeigen keine

veränderte Cx43 Expression in den Ko-Kulturen, nach Inkubation mit VPA, GBT, PHE und CBZ (n=3) auf.

30

3.4 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Expression der beiden

Zytokine TGF-ß1 und TNF-α in primären M5 und M30

Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen

Nach 24 stündiger Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der beiden Antiepileptika

VPA und CBZ wurde in den Überständen der M5 als auch M30 Ko-Kulturen keine

veränderten TGF-ß1 und TNF-α Level detektiert (Abb. 3.4).

Die Inkubation mit 100 µg/mL GBT hingegen führt zu einem signifikant erhöhten TGF-ß1

Zytokinlevel in den Überständen der M5 (n=5; p**<0.01) als auch M30 (n=4; p**<0.01) Ko-

Kulturen.

Abb. 3.4. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Die mittels Sandwich-ELISA

quantitativ gemessene TGF-ß1 (n=4)* und TNF-α (n=3)* Zytokinkonzentration der M5 und M30 Ko-Kultur

Überstande, nach 24 stündiger Inkubation mit den antiepileptischen Substanzen. (n = Anzahl unabhängig

voneinander durchgeführter ELISA). Die Unterschiede wurden als signifikant eingestuft bei p*<0.05, p**<0.01

und p***<0.001 sowie als nicht signifkant (ns) bei p>0.05. Bei undetektierbaren (undetectable, ud) TNF-α Level

in den M30 Ko-Kulturen, einschließlich der Kontrollwerte, sind keine Balken aufgezeigt. Die Inkubation mit

hohen Konzentrationen von GBT als auch PHE führt zu einem signifikant erhöhten TGF-ß1 Level in den M5 als

auch M30 Ko-Kultur Überständen. Schlussendlich führt die 24 stündige Inkubation mit 25 und 100 µg/ml PHE

zu einer signifikant erhöhten TNF-α Zytokinkonzentration in den Überständen der M30 Ko-Kulturen.

31

Des Weiteren führt die Inkubation mit 100 µg/mL PHE zu einem signifikant erhöhten TGF-

ß1 Zytokinlevel in der Überständen der M5 Ko-Kulturen (n=4; p*<0.05). In den M30 Ko-

Kultur Überständen ist die TGF-ß1 Konzentration signifikant erhöht nach Inkubation mit 10,

25, 50 und 100 µg/mL PHE (n=4; p*<0.05, p*<0.05, p**<0.01 und p***<0.0001). Darüber

hinaus führt die Inkubation mit 25 und 100 µg/mL PHE zu einer signifikant erhöhten TNF-α

Zytokinkonzentration (n=3; p**<0.01 und p***<0.0001) in den Überständen der M30 Ko-

Kulturen.

32

3. Diskussion

4.1 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Viabilität

primärer M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen

Die Viabilität von primären Astrozyten nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen

der beiden Antiepileptika GBT und CBZ wurde bereits 2003 von Pavone und Cardile in einer

in vitro Studie untersucht. Sie zeigten eine verringerte Viabilität der Astrozyten nach

Inkubation mit 50 und 100 µg/mL GBT sowie 1, 10, 50 und 100 µg/mL CBZ auf.

Entsprechend der Studie von Pavone und Cardile 2003 führte die Inkubation der M5 Ko-

Kulturen mit 100 µg/mL CBZ ebenfalls zu einer signifikant verringerten Viabilität der

Gliazellen. Im Gegensatz zu der Studie führte die Inkubation mit allen untersuchten

Konzentrationen von GBT in dieser Arbeit bei den M5 Ko-Kulturen zu keiner signifikant

reduzierten Viabilität der Gliazellen. Demnach bewirkt die Ko-Existenz der Mikroglia in den

M5 Ko-Kulturen einen protektiven Effekt auf die Astrozyten, wodurch der zuvor berichtete

Viabilitätverlust nach Inkubation mit GBT verhindert wird. Der genaue Mechanismus dieses

protektiven Effekts der Mikroglia ist allerdings noch zu untersuchen. Letztendlich konnte in

dieser Studie eine konzentrationsabhängige verringerte Viabilität der M5 Ko-Kulturen durch

die Inkubation mit den Antiepileptika CBZ und PHE gemessen werden. Astrozyten sind

verantwortlich für die metabolische und trophische Versorgung der Nervenzellen. Eine

beeinträchtigte Funktion oder Viabilität, ausgelöst durch Antiepileptika, könnte im

ungünstigsten Falle ebenfalls die Versorgung der Nervenzellen bei der Behandlung

beeinträchtigen. Diese Hypothese sollte allerdings durch weitere in vivo Experimente

untersucht werden.

In früheren Untersuchungen mit den inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen im

Vergleich zu den M5 Ko-Kulturen wurde bereits eine Veränderung des

Membranruhepotentials (MRP) als auch der funktionellen Kopplung der Astrozyten ermittelt

(Hinkerohe et al. 2005, Haghikia et al. 2008, Stienen et al. 2011). In dieser Studie bewirkte

die 24 stündige Inkubation mit den beiden Antiepileptika CBZ und PHE eine

konzentrationsabhängig verringerte Viabilität der M30 Ko-Kulturen. Astrozyten reagieren auf

inflammatorische Stimuli (Mediatoren und Zytokine) und verändern verschiedene

Oberflächenrezeptoren, Enzyme, Kanäle sowie intrazelluläre und interzelluläre

Signalmoleküle. Diese astroglialen Veränderungen können verschiedene zelluläre Funktionen

beeinflussen einschließlich die Regulation der zerebralen Homöostase, der Synapsen und

33

neuronalen Funktion sowie der immunologischen und inflammatorischen Aktivität

(Sofroniew 2013). Dieser Prozess ist sehr komplex und hängt von den Stimuli sowie der

zugrunde liegenden pathologischen Veränderung ab. Inwiefern die Verringerung der

Viabilität durch CBZ und PHE unter inflammatorisch modifizierten Bedingungen

Auswirkungen auf die Astrozyten und deren zelluläre Funktion haben, kann in dieser Studie

nicht im Detail geklärt werden. Die signifikant erhöhten TNF-α und TGF-ß1 Zytokinlevel

nach 24 stündiger Inkubation mit PHE deuten jedoch auf einen Einfluss auf die anti-/

inflammatorische Aktivität der Gliazellen hin.

4.2. Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die mikrogliale

Aktivierung/ Inaktivierung in primären M5 und M30


In dieser Studie führte eine 24 stündige Inkubation mit dem Antiepileptikum VPA zu einer

signifikanten dosisabhängigen Aktivierung der Mikroglia Zellen in den physiologischen M5

als auch inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen. Die Inkubation führte jedoch zu

keiner veränderten Viabilität der Zellen. Hingegen zeigen verschiedene Studien eine

verringerte Viabilität sowie eine Caspase-3 vermittelte Apoptose mikroglialer Zellen auf

(Dragunow et al. 2006, Smith et al 2010, Xie et al. 2010 und Gibbons et al. 2011). Die

Koexistenz der Astrozyten, welche ein funktionelles Synzitium ausbilden, verhindert

vermutlich die apoptotisch beschriebene Wirksamkeit von VPA auf die Mikroglia und führt

lediglich zu einer signifikanten Aktivierung der Zellen. Dennoch ist die Aktivierung von

Mikroglia-Zellen ein typisches Merkmal inflammatorisch anhaltender Bedingungen. Im

aktivierten Zustand besitzen Mikroglia die Fähigkeit verschiedene Mediatoren zu

exprimieren, welche nützlich oder schädlich für umliegende Zellen sein können (Kettenmann

et al. 2011). Demnach kann die Aktivierung der Mikroglia-Zellen durch VPA zu einer

Expression diverser Mediatoren führen. Inwiefern die Expression die inflammatorische

Bedingung bei inflammatorisch bedingten epileptischen Anfällen konditioniert, müsste

spezifischer durch eine Bandbreite verschiedener Indikatoren untersucht werden. In dieser

Studie konnte zumindest keine signifikant erhöhte Konzentration des proinflammatorischen

Zytokins TNF-α nach Inkubation mit VPA gemessen werden.

Die konzentrationsabhängige Inkubation mit GBT führte zu keiner Veränderungen der

Mikroglia Phenotypen in den Ko-Kulturen. Bisher gibt es keine repräsentative Studien über

den genauen Wirkungsmechanismus von GBT und der direkte Einfluss auf Mikroglia Zellen

34

ist unerforscht. In dieser Studie konnten wir aufzeigen, dass GBT keinen Einfluss auf die

gliale Viabilität und mikrogliale Aktivierung, ausübt.

Bisher ist über den direkten Einfluss von PHE auf mikrogliale Zellen eher wenig bekannt.

Mikroglia-Zellen exprimieren neben zahlreichen Membranrezeptoren Ionenkanäle wie die

spannungsaktivierten Natriumkanäle. In der Studie von Black et al. (2009) wurde untersucht,

inwiefern aktivierte Mikroglia nach Inkubation mit Lipopolysaccharid (LPS), durch die

Aktivität von Natriumkanälen beeinflusst wird. Die Studie zeigte eine signifikant verringerte

phagozytierende Aktivität der Mikroglia nach der Natriumkanal Blockade durch PHE auf. Bei

den M5 Ko-Kulturen bewirkt die dosisabhängige Inkubation mit PHE eine signifikant erhöhte

Anzahl aktiverter phagozytierender Mikroglia (RPT). Allerdings wird in dieser Studie nicht

überprüft, inwiefern die erhöhte Anzahl aktivierter Mikroglia mit einer erhöhten

phagozytierenden Fähigkeit der Mikroglia einhergehen. Im Gegensatz zu den M5 Ko-

Kulturen bewirkte die Inkubation der M30 Ko-Kulturen keine signifikant erhöhte Anzahl

aktiverter Mikroglia.

Eine anti-inflammatorische Wirksamkeit von CBZ in Ratten wurde unter experimentellen

Bedingungen bereits beschrieben (Bianchi et al. 1995, Chogtu et al. 2011). Ausserdem wird

von einer Reduktion einer inflammatorisch bedingten Hyperalgesie durch dosisabhängige

Applikation von CBZ berichtet (Iwamoto et al. 2011). In dieser Studie bewirkte die

dosisabhängige Inkubation eine signifikante Inaktivierung der Mikroglia in den

inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen. Diese Inaktivierung konnte bei den M5 Ko-

Kulturen nicht ermittelt werden. Die erhöhte Anzahl an inaktivierten Mikroglia (RRT) unter

inflammatorischen Bedingungen (M30) nach Applikation von CBZ könnte eine weitere

antiinflammatorische therapeutische Wirksamkeit von CBZ darstellen. Um diese Vermutung

zu stärken sind jedoch weitere in vivo Untersuchungen notwendig.

4.3 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die astrogliale Cx43

Expression in primären M5 und M30 Astrozyten/Mikroglia Ko-

Kulturen

Astrozyten bilden ein via Gap-Junction (Cx 43) gekoppeltes funktionelles Synzytium,

welches für den Erhalt der Homöostase des extrazellulären Milieus von Nervenzellen

essentiell ist (Chew et al. 2010, Pannasch et al 2011). Diese strukturelle Spezifikation der

Astrozyten ermöglicht eine Interaktion und Versorgung der Nervenzellen sowie einen

Abtransport von Substanzen, welche die physiologische neuronale Aktivität einschränken.

35

Dementsprechend können Veränderungen der astrozytären Cx43 Expression mit

Einschränkungen der interzellulären metabolischen und trophischen Versorgung von

Nervenzellen einhergehen. In dieser Studie konnten wir keine signifikanten Veränderungen

der astrozytären Cx43 Expression in den physiologischen M5 Ko-Kulturen nach Inkubation

mit VPA, GBT, PHE sowie CBZ, feststellen.

In neuroinflammatorisch betroffenem Gewebe konnte bereits eine verringerte interzelluläre

gap junctionale Kommunikation von Astrozyten nachgewiesen werden (Karpuk et al. 2011).

In vorangegangenen Studien konnte ausserdem aufgezeigt werden, dass inflammatorisch

modifizierte Konditionen zu einer verringerten Cx43 Expression kultivierter Astrozyten

führen (Faustmann et. al. 2003; Hinkerohe et al. 2005). Aufbauend auf dem M30 Ko-Kultur

Modell wurde das antiinflammatorische Potenzial des Antiepileptikums Levetiracetam (LEV)

untersucht (Haghikia et al. 2008). Es konnte gezeigt werden, dass sich die inflammatorisch

bedingt veränderte astrozytäre Cx43-Expression, die interzelluläre Kopplungsfähigkeit sowie

das Membranruhepotential bei der M30 Ko-Kultur nach LEV Applikation normalisiert. Mit

einer therapeutischen Applikation von 50 µg/ml über 24 Stunden konnte bei den M30 Ko-

Kultur eine erhöhte Cx43-Expression gemessen werden. In dieser Studie bewirkte die

Inkubation mit allen getesteten Antiepileptika keinerlei veränderte Cx43 Expression in den

inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen.

4.4 Der Einfluss antiepileptischer Substanzen auf die Expression der

beiden Zytokine TGF-ß1 und TNF-α in primären M5 und M30


Dass Antiepileptika Zytokinlevel beeinflussen können, wurde bereits in in-vitro als auch in-

vivo Experimenten aufgezeigt (Andrzejczak 2011). Erhöhte Level proinflammatorischer

Zytokine, wie beispielsweise TNF-α, stehen unter anderem im Zusammenhang mit einer

Astrogliose und somit beeinträchtigten Bewältigung des extrazellulären Glutamatspiegel

(Choi and Koh. 2008). In dieser Studie konnte aufgezeigt werden, dass die Inkubation mit

allen getesten Antiepileptika zu keinem veränderten TNF-α Zytokinlevel in den M5 Ko-

Kulturen geführt hat.

Das von Gliazellen exprimierte Zytokin TGF-ß1 wird in der Regel im Gehirn als

antiinflammatorisches Zytokin betrachtet. In diesem Zusammenhang wird der glialen TGF-ß1

Expression eine neuroprotektive Rolle zugeschrieben (Doyle et al. 2010 and Caraci et al.

2011). In dieser Studie führte die konzentrationsabhängige Inkubation mit GBT und PHE zu

36

einer erhöhten TGF-ß1 Expression bei den M5 Ko-Kulturen. In Bezug auf die neuroprotektive

Charakteristik von TGF-ß1 ist die erhöhte Expression nach GBT und PHE Applikation, neben

der antikonvulsiven Wirkung, ein positiver Nebeneffekt. Allerdings muss berücksichtigt

werden, dass ständig eine Interaktion zwischen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen

besteht. Die pro- und antiinflammatorische Wirksamkeit hängt von verschiedenen Faktoren

wie der Zytokinkonzentration, der lokalen Verteilung der Zytokine sowie dem Einfluss von

verschiedenen inhibitorischen Faktoren ab.

Bei den M30 Ko-Kulturen konnte nach konzentrationsabhängiger Inkubation mit PHE ein

signifikant erhöhtes TNF-α Zytokinlevel gemessen werden. Im Gegensatz konnte bei den M5

Ko-Kulturen keine signifikant erhöhte TNF-α Konzentration gemessen werden. Dieser

Zusammenhang deutet darauf hin, dass die TNF-α Expression hauptsächlich von den

Mikroglia hervorgeht. Das erhöhte TNF-α Zytokinlevel, nach Inkubation der M30 Ko-

Kulturen mit PHE, könnte möglicherweise die inflammatorischen zerebralen Bedingungen

intensivieren. Allerdings scheint dies durch die gleichzeitig erhöhte TGF-ß1 Expression

abgemildert zu werden.

Die Inkubation der inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen mit der höchsten

Konzentration von GBT führte ebenfalls zu einem erhöhten TGF-ß1 Level. Bisher sind keine

vergleichbaren Studien über die gliale Zytokinexpression nach Applilkation von GBT

bekannt. Inwiefern die Expression des antiinflammatorischen und neuroprotektiven Zytokins

einem dauerhaft inflammatorischen Zustandes entgegenwirken könnte, müsste in weiteren

Untersuchungen geklärt werden.

4.5 Klinische Interpretation antiepileptischer Substanzen mit

zusätzlichem antiinflammatorischen Potential bei Patienten mit

inflammatorisch bedingten Anfällen

Epileptische Anfälle als Symptom von Erkrankungen wie einer bakteriellen oder viralen

Meningitis, einer Enzephalopathie oder eines Gehirntumors können ein Merkmal anhaltender

inflammatorischer Bedingungen darstellen. Die glialen Zellkulturen in dieser Arbeit wurden

aus postnatalen Rattenhirnen ohne Neigung zur Epilepsie gewonnen. Die Ergebnisse können

dadurch nicht direkt auf Epilepsie-kranke gliale Zellen übertragen werden, sondern auf den

inflammatorischen Zustand und deren beteiligten Zellen im Gehirn, welcher je nach

Krankheitsbild epileptische Anfälle induzieren kann.

37

Aktivierte Mikroglia-Zellen exprimieren eine Bandbreite molekularer Stoffe, welche den

inflammatorischen Zustand im Gehirn aufrechterhalten. Aus diesem Grund könnte die

signifikante Mikroglia Aktivierung durch VPA und PHE in den Ko-Kulturen, den

andauernden inflammatorischen Zustand bei Patienten unterstützen.

Im Gegensatz führt die Inkubation der inflammatorisch modifizierten M30 Ko-Kulturen mit

CBZ zu einer signifikanten mikroglialen Inaktivierung. Die mikrogliale Inaktivierung bei

anhaltender inflammatorischer Bedigungen könnte eine vorteilhafte Nebenwirkung für

Patienten darstellen, welche mit CBZ behandelt werden. Jedoch müsste im weiteren Verlauf

untersucht werden, inwieweit die mikrogliale Inaktivierung zu einer Verbesserung des

zerebralen inflammatorischen Zustandes bei Patienten beiträgt.

Astrozyten sorgen in einem funktionellen Synzitium für die metabolische und trophische

Versorgung sowie Beseitigung von Produkten der Nervenzellen. Kommt es zu einer Störung

der physiologischen Funktion von Astrozyten sind die in der Zirkumferenz liegenden

Nervenzellen ebenfalls betroffen. Eine verringerte Viabilität von Astrozyten, wie nach der

Applikation hoher Konzentrationen von CBZ und PHE in den Ko-Kulturen, könnte in vivo zu

einer Beeinträchtigung der neuronalen Homöostase führen.

Letztendlich beeinflusst das Antiepileptikum GBT keine der untersuchten Parameter in dieser

Studie. Im Anschluss an diese Arbeit können weitere Untersuchungen an Tiermodellen in-

vivo vorgenommen werden, um die pro-/anti-inflammatorische Wirkungsweise verschiedener

Antiepileptika zu manifestieren.

Bei der Behandlung von epileptischen Anfällen, welche im Zusammenhang mit

entzündlichen Erkrankungen stehen, sollte aufgrund aktueller Erkenntnisse beachtet werden,

dass die Auswahl des Antiepileptikum, Gliazellen und somit die inflammatorischen Prozesse

im Gehirn und ZNS beeinflussen können. Die Zellkulturexperimente in dieser Arbeit zeigen,

dass gebräuchliche Antiepileptika in sehr unterschiedlicher Weise, sowohl

entzündungsverstärkend als auch entzündungshemmend auf Gliazellen wirken.

Aus neurologischer und epileptologischer Sicht wird angeregt, in klinischen Studien die

Auswirkungen gebräuchlicher Antiepileptika nicht nur auf die Schwere und Häufigkeit

epileptischer Anfälle, sondern auch auf entzündliche Reaktionen des ZNS differenziert zu

untersuchen. Die Indikation der jeweiligen Medikation sollte der entzündlichen

Grunderkrankung, die zu einer Epilepsie führt, angepasst werden. Danach würde sich die

Auswahl des Antiepileptikums, z.B. bei der Behandlung einer Epilepsie bei viraler oder

bakterieller Hirnentzündung oder Multipler Sklerose, nicht nur an der Art und Schwere der

38

epileptischen Anfälle, sondern auch an der vorherrschenden entzündlichen Grunderkrankung

orientieren.

39

5. Zusammenfassung

Hintergrund: Die Beteiligung von Gliazellen, wie Astrozyten und Mikroglia, in der

Pathophysiologie der Epilepsie, wird zunehmend anerkannt. Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei

der Initiation und Aufrechterhaltung der zerebralen Immunantwort sowie der metabolischen und

trophischen Versorgung der Nervenzellen. Diverse klinische als auch experimentelle Studien berichten

von einem Zusammenhang zwischen epileptischer Aktivität und einer Inflammation des zentralen

Nervensystems (ZNS). Andauernde inflammatorische Bedingungen im Gehirn sind gekennzeichnet

durch eine Ansammlung, Aktivierung sowie Proliferation von Mikroglia und Astrozyten.

In dieser Arbeit soll der Einfluss alltäglich verwendeter antiepileptischer Substanzen auf die gliale

Viabilität, Expression des Gap Junction Proteins Connexin 43, In-/ Aktivierung von Mikroglia sowie

Zytokin Expression an einem in-vitro Astrozyten/Mikroglia Ko-Kultur Modell, untersucht werden.

Methoden: Eine Astrozyten Kultur (postnatal P0-P2 aus Rattenhirn) wurde mit einem

physiologischen (5%) und einem pathologischen (30%) Anteil Mikroglia, kultiviert. Die Ko-Kulturen

wurden für 24 Stunden mit den Antiepileptika Valproat (VPA), Carbamazepin (CBZ), Phenytoin

(PHE) und Gabapentin (GBT), inkubiert. Die Viabilität und Proliferation wurde mittels Tetrazolium

(MTT) Assay, untersucht. Die Mikroglia-Phänotypen wurden mittels immunocytochemischer

Färbungen, bestimmt. Die astrogliale Connexin 43 (Cx43) Expression wurde quantitativ mittels

Western-Blot und die TGF-beta1 und TNF- α Zytokin Expression mittels Sandwich-ELISA,

ausgewertet.

Ergebnisse: Die dosisabhängige Inkubation der M5 Ko-Kulturen mit PHE und CBZ führt zu einer

signifikant verringerten Viabilität der Zellen. Die Inkubation mit VPA führt zu einer signifikanten

Aktivierung der Mikroglia und die anti-inflammatorische TGF-β1 Zytokinkonzentration war

signifikant erhöht nach der Inkubation mit höheren Konzentrationen von GBT und PHE, in den M5

Ko-Kulturen. Bei den M30 Ko-Kulturen führt die dosisabhängige Inkubation mit PHE zu einer

signifikant verringerten Viabilität der Zellen sowie einer erhöhten TGF-β1 und TNF-α Expression. Die

Inkubation mit CBZ führt zu einer signifikant verringerten Anzahl aktivierter Mikroglia und

gleichzeitig erhöhten Anzahl inaktivierter Mikroglia, sowie einer verringerten Viabilität der Zellen, bei

den M30 Ko-Kulturen.

Schlussfolgerung: Inflammatorische Zustände des ZNS sind charakterisiert durch eine

Beeinträchtigung glialer Zellfunktionen. Die Aktivierung von Mikroglia ist ein typisches Merkmal

inflammatorischer Zustände und wurde ebenfalls durch die Inkubation mit VPA, in den M5 als auch

M30 Ko-Kulturen, induziert. Im aktiven Zustand können Mikroglia in unterschiedlichen Status (M1

oder M2) vorliegen und je nach Status eine unterschiedliche Wirkung (pro- oder antiinflammatorisch)

auf ihre Zirkumferenz ausüben. Eine proinflammatorische Wirkung könnte im Falle einer

inflammatorisch bedingten Epilepsie möglicherweise die inflammatorisch bedingte Grunderkrankung

bei Patienten verschlimmern. Hingegen führt die Inkubation mit CBZ zu einer signifikanten

mikroglialen Inaktivierung in den M30 Ko-Kulturen. Hinsichtlich der entzündlichen

Grunderkrankung, welche zu einer Epilepsie führt, sind Antiepileptika mit einem entzündungs-

hemmenden glialen Potential für Patienten vorteilhaft.

40

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7. Abku rzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

APS Ammoniumpersulfat

Aqua dest. Destilliertes Wasser

BSA Bovine serum albumin

Ca Calcium

CBZ Carbamazepin

CNPase 2',3'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase

CO2 Kohlenstoffdioxid

Cx43 Connexin 43

Cx30 Connexin 30

°C Grad Celsius

DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO Dimethyl Sulfoxide

DNase Desoxyribonuklease

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GABA γ-Aminobuttersäure

GBT Gabapentin

GFAP Glial fibrillary acidic protein

H2O Wasser

HRP Horseradish peroxidase

IgG Immunglobulin G

IL Interleukin

INT Intermediate type

LEV Levetiracetam

LPS Lipopolysaccharide

mA Milliampere

mAB Monoklonaler Antikörper

M5 Astrozyten Ko-Kultur mit 5 % Mikroglia

M30 Astrozyten Ko-Kultur mit 30 % Mikroglia

ml Mililiter

MRP Membranruhepotential

MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide

mV Milivolt

48

Na Natrium

NEA Nicht-essentielle Aminosäuren

NeuN Neuronal Nuclei

nm Nanometer

ns Nicht Signifikant

P0-P2 Postnatal

pAB Polyklonaler Antikörper

PBS Phosphat-buffered saline

PHE Phenytoin

PLL Poly-L-Lysin

RPT Rounded phagocytic type

rpm Rounds per minute

RRT Resting ramified type

RT Raumtemperatur

SDS Sodiumdodecylsulfat

SEM Standardfehler des Mittelwerts

TBST Tris-buffered saline mit Tween 20

TEMED Tetramethylethylendiamin

TGF-beta Transforming growth factor beta

TLE Temporallappenepilepsie

TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TNF-alpha Tumornekrosefaktor-α

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Tween Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat

V Volt

VPA Valproat

VPS Valproinsäure

ZNS Zentrale Nervensystem

μg Mikrogramm

μl Mikroliter

μm Mikrometer

49

8. Anhang

Tabelle 7.1

M5 Ko-Kulturen

M30 Ko-Kulturen

VPA Kontrolle 222.6 ± 13.96 18.1 ± 2.06 195.6 ± 8.82 44.8 ± 3.45 50 ug/ml 200.6 ± 12.64 21.7 ± 1.76 200.4 ± 8.67 43.5 ± 3.37

100 ug/ml 204.5 ± 11.49 23.5 ± 1.99 200.4 ± 9.15 41.6 ± 2.64

200 ug/ml 210.6 ± 12.28 22.9 ± 1.55 199.4 ± 7.52 39.7 ± 2.71

GBT

Kontrolle 132.3 ± 7.99 11.1 ± 1.33 207.8 ± 13.27 41.5 ± 3.14 10 ug/ml 124.1 ± 8.31 10.4 ± 1.79 216.7 ± 12.35 52.2 ± 3.21

25 ug/ml 119.2 ± 8.92 10.2 ± 1.92 215.7 ± 14.24 46.0 ± 2.46

50 ug/ml 127.5 ± 5.35 11.4 ± 1.48 223.5 ± 16.79 43.1 ± 3.55 100 ug/ml 128.3 ± 6.03 11.0 ± 1.37 221.6 ± 15.90 40.0 ± 3.73

PHE

Kontrolle 136.0 ± 6.44 11.9 ± 1.05 209.0 ± 10.53 43.4 ± 3.81 10 ug/ml 118.1 ± 6.87 9.5 ± 1.51 205.0 ± 12.89 47.7 ± 2.89 25 ug/ml 111.2 ± 7.74 8.6 ± 1.48 216.8 ± 12.18 43.9 ± 2.72 50 ug/ml 115.0 ± 7.50 10.8 ± 1.39 218.1 ± 10.37 39.2 ± 2.45

100 ug/ml 113.9 ± 6.76 11.4 ± 1.50 199.3 ± 11.24 35.7 ± 2.43

CBZ

Kontrolle 123.6 ± 8.88 10.3 ± 1.42 238.0 ± 18.09 49.7 ± 4.33 10 ug/ml 114.0 ± 8.31 10.6 ± 1.79 242.0 ± 19.06 46.1 ± 3.07 25 ug/ml 115.6 ± 7.79 10.7 ± 2.02 227.5 ± 13.20 45.9 ± 2.90

50 ug/ml 111.6 ± 10.03 10.5 ± 1.99 179.3 ± 9.25 35.9 ± 2.44 100 ug/ml 98.0 ± 10.70 9.1 ± 1.99 131.0 ± 7.60 20.3 ± 2.34

Gliazellen Mikroglia Gliazellen Mikroglia

Tab. 7.1. Tabelle entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014): Die Tabelle zeigt den Mittelwert

± Satndardfehler des Mittelwertes (SEM) der ausgewerteten Anzahl an Glia- und Mikroglia-Zellen der

immunocytochemischen Färbungen der M5* und M30** Ko-Kulturen. *(VPA (n=33) GBT (n=24) PHE

(n=28) und CBZ (n=22)). **(VPA (n=24) GBT (n=30) PHE (n=40) und CBZ (n=20)).

Abbildung 7.2.

51

Abb. 7.2. Abbildung entnommen und übersetzt aus (Dambach et al. 2014):

Neuronen Marker (NeuN)*

A. Positive Kontrolle: Immunohistochemische Färbung von Nervenzellen (rot) in Gehirnschnitten der Ratte mit

dem Marker Anti-NeuN (Millipore, Darmstadt) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 (Sigma-

Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne im Gehirnschnitt wurden zusätzlich mit dem Kernfarbstoff DAPI (4, 6-

diamidino-2-phenyl-indol) (blau) gefärbt, um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren. Die dargestellte

Region auf dem Bild zeigt den Hippocampus der Ratte.

B. Ko-Kulturen: Immunocytochemische Färbung der Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen mit dem neuronalen

(rot) Marker Anti-NeuN (Millipore, Darmstadt) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 (Sigma-

Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne wurden zusätzlich mit dem Kernfarbstoff DAPI (blau) gefärbt, um die

gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren. In den Ko-Kulturen waren keine NeuN positiven Zellen aufzufinden

(n=3).

Astrozyten Marker (GFAP)*

C. Positiv Kontrolle: Immunohistochemische Färbung von Astrozyten (grün) in Gehirnschnitten der Ratte mit

dem Marker Anti-GFAP (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488

(Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne im Gehirnschnitt wurden zusätzlich mit dem Kernfarbstoff

DAPI (blau) gefärbt, um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren.

D. Ko-Kulturen: Immunocytochemische Färbung der Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen mit dem Astrozyten

(grün) Marker Anti-GFAP (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488

(Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne wurden zusätzlich mit dem Kernfarbstoff DAPI (blau) gefärbt,

um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren (n=3).

Oligodendrozyten Marker (CNPase)*

E. Positiv Kontrolle: Immunohistochemische Färbung von Oligodendrozyten (grün) in Gehirnschnitten der

Ratte mit dem Marker Anti-CNPase (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa

Fluor 488 (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne im Gehirnschnitt wurden zusätzlich mit dem

Kernfarbstoff DAPI (blau) gefärbt, um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren.

F. Ko-Kulturen: Immunocytochemische Färbung der Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen mit dem

Oligodendrozyten (grün) Marker Anti-CNPase (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:100 und dem sekundären

Antikörper Alexa Fluor 488 (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:500. Die Zellkerne wurden zusätzlich mit dem

Kernfarbstoff DAPI (blau) gefärbt, um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren. In den Ko-Kulturen waren

1,27 % der gesamten Zellanzahl CNPase positive Zellen in insgesamt (n=24) Sichtfeldern aus (n=3) unabhängig

voneinander durchgeführten Färbungen.

Astrozyten (GFAP) und Mikroglia (ED-1) Marker*

G. + H. Ko-Kulturen: Immunocytochemische Färbung der Astrozyten/Mikroglia Ko-Kulturen mit dem

Astrozyten (grün) Marker Anti-GFAP (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:100 und dem sekundären Antikörper Alexa

Fluor 488 (Sigma-Aldrich, Steinheim) 1:500. Zusätzlich wurden die Ko-Kulturen mit dem Mikroglia (rot)

Marker ED-1 (1:250) (Serotec MCA 341R, Eching) und mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 568

(Invitrogen, Karlsruhe) 1:1000 angefärbt. Die Zellkerne wurden zusätzlich mit dem Kernfarbstoff DAPI (blau)

gefärbt, um die gesamte Anzahl an Zellen zu visualisieren (n=3).

* Alle Färbungen wurden am Immunflourezenz-Mikroskop (Axiophot Carl Zeiss GmbH, Jena) mit einem 63 x

Objektiv ausgewertet.

C D

52

9. Danksagung

Ich möchte mich herzlich bei allen Personen bedanken, welche wissenschaftlich beratend, moralisch

unterstützend und konstruktiv mitwirkend bei dieser Arbeit beteiligt waren:

Herrn Prof. Dr. med. Pedro Faustmann für die unvergleichlich sympathische Unterstützung und

motivierende Betreuung von Beginn meiner Masterarbeit bis zum Ende der Promotion. Ich habe

sowohl wissenschaftlich, medizinisch als auch persönlich viel von ihm gelernt und wäre den Schritt

Richtung Promotion nicht ohne ihn gegangen!

Herrn Prof. Dr. med. Andreas Hufnagel für die Betreuung, Unterstützung und Kooperationen

während dieser Doktorarbeit.

Frau Jun.-Prof. Dr. rer nat. Nora Prochnow für die Möglichkeit meine Doktorarbeit in der Abteilung

für Neuroanatomie erfolgreich zu vollenden, die tollen Kooperationen, die wissenschaftliche

Unterstützung sowie die ersten Einblicke in die medizinische Lehre.

Herrn Dr. med. Daniel Hinkerohe für die tolle, freundschaftliche Unterstützung während meiner

Master- und Doktorarbeit sowie die gemeinsamen Kongressbesuche.

Frau Dr. med. Zahra Moinfar für die aufmunternden wissenschaftlichen und privaten Dialoge sowie

medizinischen Erläuterungen während der Doktorarbeit und die tolle Arbeitsatmosphäre.

Allen Mitarbeitern der Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung, besonders Hans-

Werner Habbes, Sabine Schreiber-Minjoli, Sabine Peukert, Jeanette Wilms, Ulrike Becker und

Monika Birkelbach für die großartige technische und administrative Unterstützung.

Ein Dankeschön auch an meine Kommilitonen mit denen ich das Studium gemeistert habe. Besonders

Jens Christmann, Daniela Damen und Heiner Falkenberg.

Ich möchte mich aus ganzen Herzen bei denjenigen Personen bedanken, welche mein ganzes Leben

immer für mich da waren und mich bedingungslos auf dem Weg Richtung Promotion unterstützt

haben:

Mein allergrößter Dank gilt zweifellos meiner Mutter Hella Dambach, welche mich immer liebevoll

bei allem unterstützt hat was ich bis zu diesem Zeitpunkt erreicht habe und immer für mich da ist. Die

unzähligen aufmunternden Gespräche haben mich immer beruhigt, aufgebaut und vor allem motiviert!

Auch ein herzliches Dankeschön an ihren Lebenspartner Hartmann Rupp.

Meiner lieben Schwester Beate Schieber mit Marco, dem besten Schwager, den ich mir hätte

wünschen können, sowie meinem Neffen Mika und meiner Nichte Roxana. Vielen Dank für die

wunderschönen gemeinsamen Urlaube, Shopping-Touren, Spieleabende, Ablenkungen und

fürsorglichen Ratschläge während meiner Studien- und Promotionszeit!

Meinem großen Bruder Bernd Dambach mit Stefanie, meinen Neffen Robin und Luca sowie meiner

Nichte Jona für die vielen schönen Ablenkungen, Ratschläge und Unterkünfte während meiner

Studien- und Promotionszeit. Besonders herzlich möchte ich meinem Bruder dafür danken, dass er

mich immer bei wichtigen Entscheidungen ermutigt, stärkt und stets fürsorglich unterstützt!

Meinem besten Freund Daniel Rauschenberger für die Ablenkung in stressigen Zeiten. Was wir

schon alles zusammen erlebt haben lässt sich nicht auf einer Seite zusammenfassen.

53

Weitere Danksagung:

Die in dieser Dissertation verwendeten Graphen und Abbildungen aus der unten aufgelisteten

Veröffentlichung* und darin enthaltenen Ergebnisse sind mit der Genehmigung vom 28.4.2014 des

John Wiley & Sons, Inc. Verlages, dem Herausgeber der Fachzeitschrift Epilepsia der

Internationalen Liga gegen Epilepsie (ILAE), genehmigt worden.

*Dambach H, Hinkerohe D, Prochnow N, Stienen MN, Moinfar Z, Haase CG, Hufnagel A,

Faustmann PM. (2014): Glia and epilepsy: Experimental investigation of antiepileptic drugs in an

astroglia/microglia co-culture model of inflammation. Epilepsia. 55,184-92.

54

10. Lebenslauf

Der Lebenslauf ist in der Online-Version aus Gründen des Datenschutzes nicht enthalten.

Medizinische Fakultät der Universität Duisburg-Essen · gegen Epilepsie (International League...

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