Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen ...

Aus der Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie

und aus dem Institut für Versuchstierkunde

der Medizinischen Hochschule Hannover

Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in den

sekundär lymphatischen Organen der Ratte

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Andrea Sahle

aus Münster/ Westf.

Hannover 2001

II

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. J. Westermann

Univ.-Prof. Dr. R. Pabst

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H.- J. Hedrich

2. Gutachter: PD Dr. H.- J. Schuberth

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2001

Diese Arbeit wurde mit der finanziellen Unterstützung des Graduierten Kollegs

„Charakterisierung von regulatorischen Peptiden und ihrer Zielproteine“ angefertigt.

III

Meiner Mutter

und

meinem Sonnenschein

Yana-Marie

Man sieht nur

mit dem Herzen gut,

das Wesentliche ist

für die Augen unsichtbar.

Antoine de Saint-Exupery

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen................................................... 7

I. Einleitung........................................................................................................ 9

II. Literaturübersicht...................................................................................... 11

1. Das Immunsystem....................................................................................................... 11

2. Die lymphatischen Organe.......................................................................................... 14

3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort ................. 18

4. Die Migration von Lymphozyten................................................................................ 21

5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort...................................... 24

III. Material und Methoden ........................................................................... 31

1. Geräte und Laborbedarf.............................................................................................. 31

2. Puffer, Medien und Materialien ................................................................................. 32

3. Antikörper .................................................................................................................. 35

4. Versuchstiere.............................................................................................................. 37

5. Gewinnung, Aufbereitung und Injektion von Subpopulationen der Lymphozyten ... 38

6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten

................................................................................................................................... 40

7. Immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte in der konfokalen Mikroskopie.......... 45

8. Darstellung von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC im

Mausmodell ............................................................................................................... 46

9. Auswertung ................................................................................................................ 48

10. Verwendete Computerprogramme und Statistik ...................................................... 50

IV. Ergebnisse .................................................................................................. 52

A. Untersuchung der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit

interdigitierenden dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen

Organen der Ratte........................................................................................... 52

1. Injizierte T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen können auf

immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten identifiziert werden. ...................... 52

6

2. In den sekundär lymphatischen Organen befinden sich 80% der injizierten T-

Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen. ...... 55

3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion der T-Lymphozyten lassen sich

gleiche Anteile von Membrankontakten beobachten. ............................................... 57

4. Endogene T-Lymphozyten zeigen über 60% Membrankontakte zu DC.................... 60

5. Membrankontakte zu IgD-positiven B-Lymphozyten befinden sich vorwiegend im

äußeren Bereich der periarteriolären lymphatischen Begleitscheide der Milz .......... 60

6. Membrankontakte von injizierten T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen lassen

sich auch mit konfokaler Mikroskopie aufzeigen. .................................................... 63

7. In der Maus werden interdigitierende dendritische Zellen über den spezifischen

Marker DEC-205 nachgewiesen................................................................................ 67

B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation ..................... 70

1. Ki-67+ T-Lymphozyten im Blut ................................................................................. 70

2. BrdU+ T-Lymphozyten in der Milz ............................................................................ 72

3. Die Anteile der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten sind erhöht zu finden, wenn

Membrankontakte mit IDC in der Milz vorliegen..................................................... 72

V. Diskussion.................................................................................................... 80

1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein konstantes

Phänomen dar. ........................................................................................................... 80

2. Funktion von LFA-1 bei Membrankontakten im Mausmodell .................................. 88

3. Membrankontakte beeinflussen den Anteil der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten. 88

VI. Zusammenfassung..................................................................................... 92

VII. Summary .................................................................................................. 95

VIII. Literaturverzeichnis .............................................................................. 97

IX. Anhang ..................................................................................................... 117

7

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung AP Alkalische Phosphatase APAAP Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase APC antigen presentating cell, Antigen-präsentierende Zelle BrdU 5’-Brom 2’-Desoxyuridin BSA bovines Serumalbumin ca. circa CD Cluster of Differentiation, Differenzierungskluster CO2 Kohlendioxid CSFE 5-,6-carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester CTLA-4 cytotoxic T lymphocyte antigen-4, zytotoxisches T-Zellantigen-4 DC dendritic cell, dendritische Zelle Dig Digoxigenin

d.h. das heißt DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure etc. et cetera FACS fluorescence activated cell sorter,

fluoreszenzaktivierter Zellsortierer FCS fetal calf serum, fetales Kälberserum GM-CSF Granulocyte/ Macrophage-colony-stimulating factor,

Granulozyten/ Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor h hora, Stunde HEV high endothelial venule, hochendotheliale Venule ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1, interzelluläres Zelladhäsionsmolekül-1 IDC interdigitating dendritic cell, interdigitierende dendritische Zelle Ig Immunglobulin IL- 2 Interleukin-2 i.v. intravenös Ko Kontrolle LFA-1 Lymphocyte function-associated antigen-1,

lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen-1 mAb monoclonal antibody, monoklonaler Antikörper MAdCAM-1 mucosal addressin-cell adhesion molecule-1,

mukosales Addressin-Zelladhäsionsmolekül-1

8

MCP macrophage chemotactic protein, Makrophagen chemotaktisches Protein

M-CSF macrophage colony-stimulating factor, Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor

Mib5 Molecular Institute of Borstel, Antikörper gegen nukleäres Antigen des Zellzyklus (in der Ratte während der G1-M2-Phase exprimiert) Min Minute MIP1-α macrophage inflammatory protein 1-alpha MHC Major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex mLN mesenterial lymph node, mesenterialer Lymphknoten MLR mixed lymphocyte reaction, gemischte Lymphozytenreaktion MS Mäuseserum NaCl Natriumchlorid NK-Zelle Natürliche Killerzelle PALS periarteriolar lymphatic sheath,

periarterioläre lymphatische Begleitscheide PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PE Phycoerythrin PFA Paraformaldehyd pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PP Peyersche Platten RANTES regulated on activation, normally T cell expressed and secreted,

durch Aktivierung reguliertes, normalerweise von T-Zellen exprimiertes und sezerniertes Chemokin

RT Raumtemperatur s. siehe S. Seite sec Sekunde SPF spezifisch pathogenfrei TH1/2 T-Helfer1/ 2 TDL thoracic duct lymphocytes, Lymphozyten aus dem Ductus thoracicus TNF-α tumor necrosis factor-alpha TTBS Trisgepufferte Salzlösung mit Tween TCR T cell receptor, T-Zellrezeptor VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1,

vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1 VLA-4 very late antigen-4, sehr spätes Antigen-4 z.B. zum Beispiel

9

I. Einleitung

Das Immunsystem beschäftigt sich tagtäglich mit der Abwehr möglicher Pathogene. Im Laufe

der Evolution haben sich dabei eine angeborene und eine erworbene Immunabwehr

entwickelt, die ineinandergreifend effektiv den Organismus zu schützen imstande sind. T-

Lymphozyten und B-Lymphozyten als Träger der erworbenen Immunabwehr erkennen über

spezialisierte Rezeptoren Antigene. Um eine T-Zellabhängige Immunantwort auszulösen,

benötigen T-Lymphozyten ihr spezifisches, in Peptide „zerlegtes“ (prozessiertes) Antigen, das

mit dem Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (MHC) zusammen präsentiert werden muss.

Da sich Immunantworten auch gegen das eigene Gewebe richten können (Autoimmunität),

müssen sie reguliert werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). In verschiedenen Modellen

konnte gezeigt werden, wie wichtig die Interaktion zwischen T-Lymphozyten, aber auch B-

Lymphozyten mit dendritischen Zellen (DC) für die Auslösung von Immunantworten, die

Induktion und das Aufrechterhalten von peripherer Toleranz (BANCHEREAU u.

STEINMAN, 1998) und das Überleben der Lymphozyten in den peripheren Geweben ist

(BROCKER, 1997; INGULLI et al., 1997). In den sekundär lymphatischen Organen wird

durch die spezialisierte Einteilung in Kompartimente das Zusammentreffen von Antigenen

aus dem Blut oder den Geweben und der T-Lymphozyten und DC ermöglicht.

Interdigitierende dendritische Zellen (IDC) stellen DC eines reifen Phänotyps (Fähigkeit zur

Auslösung primärer T-Zellabhängiger Immunantworten) dar, die sich in den T-Zellarealen der

sekundär lymphatischen Organe befinden und mit ihrer charakteristischen Morphologie mit

zahlreichen dendritischen Ausläufern ein dichtes Netzwerk ausbilden. Durch eine hohe

Expression von MHC Klasse II und kostimulatorischen Molekülen lassen sich diese Zellen in

den Geweben nachweisen (STEINMAN et al., 1997).

Obwohl der Interaktion zwischen T-Lymphozyten und DC verschiedene wichtige Funktionen

bei der Einleitung und Regulierung von Immunantworten zugeschrieben wird, ist nicht

bekannt, in welchem Ausmaß sich die Zellen in einem in vivo Modell in Kontakt zueinander

befinden. Um diese Interaktion besser verstehen zu lernen, wurden in der vorliegenden Arbeit

durch die Auswertung von Immunhistologien nach Injektion von T-Lymphozyten in einem

kongenen Rattenmodell folgende Aspekte untersucht:

10

- Welcher Anteil von injizierten kongenen T-Lymphozyten befindet sich in

Membrankontakt zu IDC in den T-Zellarealen der Milz, der mesenterialen

Lymphknoten und der Peyerschen Platten?

- Haben die verschiedenen Aktivierungsstadien (naive, Effektor und „Gedächtnis“-

T-Lymphozyten) der T-Lymphozyten einen Einfluss auf die Anzahl der Kontakte?

- Lassen sich die Membrankontakte mittels weitergehender Techniken (konfokaler

Mikroskopie) nachweisen?

- Welchen Anteil von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und dendritische

Zellen lassen sich in der Maus mit einem spezifischen Marker für dendritische Zellen

feststellen?

- Welchen Einfluss hat eine LFA-1-Defizienz der T-Lymphozyten auf die

Membrankontakte?

- Welchen Einfluss haben immunhistologisch nachgewiesene Membrankontakte auf den

Zellzyklus oder den Einbau von BrdU während der S-Phase des Zellzyklus für die

T-Lymphozyten?

11

II. Literaturübersicht

1. Das Immunsystem

Jeder Organismus muss tagtäglich gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen und

anderen Substanzen geschützt werden. Im Laufe der Evolution haben sich verschiedene

Mechanismen entwickelt, die der effektiven Abwehr dienen. Die Aufgabe des Immunsystems

ist es, die Integrität des Körpers gegen das Eindringen dieser Fremdstoffe von außen zu

gewährleisten. Diese Abwehrreaktionen des Organismus gegen Pathogene werden einerseits

durch die unspezifische (angeborene) und durch die spezifische (erworbene) Abwehr

vermittelt (JANEWAY et al., 1999). Diese komplexen Vorgänge werden hier allerdings nur

vereinfacht dargestellt.

Die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen ist die unspezifische Immunität, die direkt

Effektorfunktionen zur Bekämpfung der Pathogene einleitet. Physikalisch-chemische

Barrieren wie der natürliche Säuremantel der Haut und den Epithelien der Schleimhäute

reduzieren ein Eindringen von fremden Substanzen bereits auf ein Minimum. Daneben haben

Granulozyten und Makrophagen die Aufgabe, schnell alle eingedrungenen Erreger zu

beseitigen. Makrophagen gehören zu einer Familie von langlebigen Zellen, die in fast allen

Geweben verteilt sind und ein frühes Warnsystem gegenüber dem Eindringen exogener

Agentien darstellen. Lösliche, zirkulierende Moleküle wie die Komplementfaktoren sind in

der Lage, sich an Mikroorganismen anzuheften und zu einer verbesserten Erkennung und

Phagozytose (Aufnahme von Fremdstoffen und Bakterien) zu führen (Opsonisierung)

(GORDON, 1999). Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) nehmen eine Zwischenstufe zwischen

der unspezifischen und spezifischen Immunität ein, da sie einerseits Virus-infizierte Zellen

aufspüren und eliminieren können, obwohl ihnen andrerseits Antigen-spezifische Rezeptoren

fehlen. Die Verteidigungsstrategien der unspezifischen Immunität laufen stets gleichartig ab

und sind unabhängig von einem vorherigen Kontakt mit den Erregern. Wenn diese Abwehr

durchbrochen wird, ist die spezifische Immunität gefordert, die sich mit der

Höherentwicklung der Wirbeltiere etabliert hat und vorwiegend von T- und B-Lymphozyten

vermittelt wird. Die Spezifität der Antigen-spezifischen Antwort ergibt sich aus dem

12

Repertoire von Antigenrezeptoren, die von den T- und B-Lymphozyten exprimiert werden.

Jeder individuelle T- oder B-Lymphozyt trägt Antigenrezeptoren auf seiner Zelloberfläche, die

in einzigartiger Weise fähig sind, spezifische Strukturdeterminanten (Epitope) oder Antigen

zu erkennen. Die Verschiedenheit (Diversität) der Antigenrezeptoren wird durch eine

kombinatorische Neuordnung einer Varietät von Immunglobulin- oder T-Zellrezeptor-

Gensegmenten und somatischer Mutation gewährleistet. Dieses breit angelegte

Immunrepertoire erlaubt der Lymphozytenpopulation, auf jedes virtuelle, potentiell pathogene

Agens reagieren zu können.

Die selektive Vermehrung eines Lymphozytenklons, die durch ein Antigen hervorgerufen

wird, ermöglicht es dem Immunsystem, die Immunantwort an häufig vorkommende

Pathogene anzupassen und ein immunologisches Gedächtnis zu entwickeln. Durch eine

erhöhte Frequenz von Antigen-spezifischen Lymphozyten und eine erhöhte Sensibilität

gegenüber dem Antigen können die sogenannten „memory“ Lymphozyten bei erneutem

Eindringen des Antigens schneller reagieren. Zusätzlich werden durch die spezifische

Immunabwehr auch die Schutzmechanismen der unspezifischen Abwehr verstärkt, indem z.B.

durch Botenstoffe (Zytokine, Chemokine) Phagozyten an den Ort der Entzündung gelockt

werden können, die bei der Eliminierung der Fremdstoffe unterstützend wirken (HALE u.

HAYNES, 1999).

B-Lymphozyten sind die Vorläufer von Antikörper-sezernierenden Plasmazellen, die eine

humorale Immunität vermitteln. Antikörper haften an eingedrungenen Antigenen, aktivieren

das Komplementsystem und führen zur verbesserten Aufnahme durch Makrophagen.

Besonders Bakterien und deren Toxine, die sich im extrazellulären Raum befinden, werden

durch diesen Mechanismus eliminiert. T-Lymphozyten vermitteln hingegen die

Antigen-spezifische zelluläre Immunität und regulieren gleichzeitig auch die Funktion der

B-Lymphozyten und Makrophagen durch zelluläre Interaktionen und die Produktion von

Zytokinen. Die Wichtigkeit der T- und B-Lymphozyten zur allgemeinen Funktion des

Immunsystems wird durch die Vielzahl der infektiösen Erkrankungen reflektiert, die bei einer

verminderten Anzahl oder dem Fehlen dieser Zellen eintreten (z.B. kongenitale

Immundefizienz, Infektion mit dem humanen Immundefizienz Virus, HIV) (HALE u.

HAYNES, 1999; JANEWAY et al., 1999).

13

Der T-Zellrezeptor erkennt keine strukturellen Determinanten oder Epitope in ihrer nativen

Form. Stattdessen erkennen T-Lymphozyten proteolytisch zerteilte Peptidfragmente des

Antigens, die an den polymorphen Anteil der Moleküle des

Hauptgewebeverträglichkeitskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) auf der

Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle gebunden sind. Der Prozess, durch den

Antigene in Peptide abgebaut und an die MHC-Moleküle gebunden werden, wird als

Antigenprozessierung bezeichnet. Dabei existieren spezialisierte Abbauwege für Antigene, die

aus dem extra- oder intrazellulären Raum stammen. Extrazelluläre Antigene wie Bakterien

und Viren werden durch Antigen-präsentierende Zellen aufgenommen, nach ihrem Abbau an

Moleküle des MHC Klasse II gebunden, auf der Oberfläche exprimiert und von CD4+

T-Lymphozyten erkannt. CD4+ T-Lymphozyten werden auch als T-Helferzellen bezeichnet,

da sie durch direkte Zellinteraktionen und die Ausschüttung von Zytokinen Makrophagen und

B-Lymphozyten aktivieren können. Antigene innerhalb der Zellen, wie sie nach Infektion

durch Viren, obligaten intrazellulären Pathogenen oder Tumorantigenen entstehen, werden

nach proteolytischem Abbau in Zusammenhang mit Molekülen des MHC Klasse I präsentiert

und von CD8+ T-Lymphozyten erkannt. CD8+ T-Lymphozyten werden auch zytotoxische

T-Lymphozyten genannt, da sie eine immunvermittelte Zerstörung von Virus-infizierten

Zellen oder Tumorzellen einleiten.

Der prädominante Ort der Sensibilisierung von Lymphozyten gegenüber neuem Antigen sind

die sekundär lymphatischen Organe, in denen die T-Lymphozyten und Antigen-

präsentierenden Zellen, wie z.B. dendritische Zellen, in einem besonderen Mikromilieu

kolokalisiert sind (GUNN et al., 1999). In den lymphatischen Organen werden den

Lymphozyten Antigene aus dem Blut und den peripheren Geweben präsentiert und damit die

Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens eines spezifischen Lymphozyten mit seinem

Antigen erhöht. Dendritische Zellen (DC) nehmen dabei in den peripheren Geweben Antigen

auf, zerteilen es in kleine Peptide, wandern in die lymphatischen Organe und präsentieren es

dort zusammen mit dem MHC-Komplex auf ihrer Oberfläche. Durch zahlreiche

Oberflächenmoleküle (kostimulatorische oder akzessorische Moleküle) können sie T-

Lymphozyten optimal stimulieren und Immunantworten einleiten. Die Schlüsselrolle für die

Kontrolle der Immunantwort durch die DC liegt hierbei im Wechsel des Phänotyps: von der

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effektiven Antigenaufnahme (unreifer Phänotyp) zur effektiven Antigen-Präsentation (reifer

Phänotyp) (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998).

Um die Regulation und die Einleitung von Immunantworten besser nachvollziehen zu können,

werden im folgenden Abschnitt der Aufbau und die Funktion der lymphatischen Organe

erläutert.

2. Die lymphatischen Organe

Lymphozyten stammen von lymphoiden Vorläuferzellen ab, die sich frühzeitig aus

hämatopoetischen Stammzellen aus dem Knochenmark entwickeln. Das Knochenmark dient

der Vermehrung der Lymphozyten, im Thymus wird die Entscheidung über die weitere

Entwicklung der T-Lymphozyten getroffen. Im Gegensatz zum Knochenmark und dem

Thymus, die als primäre oder zentrale lymphatische Organe gelten, werden die Milz, die

Lymphknoten und Darm-, Mukosa- oder Bronchus-assoziierte lymphatische Gewebe (GALT,

respektive MALT und BALT), zu denen auch die Peyerschen Platten zählen, als sekundär

oder peripher lymphatische Organe bezeichnet. Bei lymphatischen Organen handelt es sich

um organisierte Gewebe, in denen die Lymphozyten Interaktionen mit nicht-lymphatischen

Zellen eingehen, die zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen können.

2.1 Die Milz

Die Milz ist ein beim Menschen etwa faustgroßes, bei der Ratte ein circa 3 cm langes,

kompaktes Organ, das als Blutfilter fungiert. Das Parenchym der Milz besteht aus zwei

Kompartimenten: die rote und die weiße Pulpa. In der roten Pulpa werden alternde

Erythrozyten phagozytiert, die durch die enge Passage der Milzgefäße nicht wieder in die

Blutbahn gelangen können, und zur Wiederverwertung in ihre Bestandteile zerlegt. Die weiße

Pulpa repräsentiert den Teil des Organs mit der höchsten Dichte an Lymphozyten und umfasst

drei Unterkompartimente: die periarterioläre lymphatische Begleitscheide, kurz PALS genannt

(T-Zellareal), die Follikel (B-Zellareal) und die Marginalzone. Die PALS ist konzentrisch um

15

die Zentralarteriolen, die durch die gesamte Milz ziehen, gelagert. Sie beinhaltet vorwiegend

T-Lymphozyten und dendritische Zellen, die hier aufgrund ihrer Morphologie mit zahlreichen

Ausläufern interdigitierende dendritische Zellen genannt werden (STEINMAN et al., 1997).

B-Lymphozyten befinden sich nur zu einem geringen Anteil in der PALS und sind dann

bevorzugt im äußeren Anteil (äußere PALS) anzutreffen. An diesem Übergang zwischen

T- und B-Zellareal finden Antigen-spezifische Interaktionen zwischen T-Lymphozyten und

wandernden B-Lymphozyten während primärer und sekundärer Immunantworten statt.

Antigen-spezifische B-Lymphozyten wandern aus der Marginalzone in die angrenzende

äußere PALS. Durch eine gegenläufige Wanderung wird das Zusammentreffen von

Antigen-spezifischen T- und B-Lymphozyten optimiert. B-Lymphozyten können so die

notwendige T-Zellhilfe erhalten und sich in der Marginalzone zu Antikörper-produzierenden

Plasmazellen entwickeln (VAN ROOIJEN, 1990). Die angrenzenden Follikeln beinhalten

vorwiegend B-Lymphozyten und nur wenige CD4+ T-Lymphozyten. Follikuläre dendritische

Zellen, die vermutlich nicht von Vorläufern aus dem Knochenmark stammen, halten auf ihrer

Oberfläche Antigen in nativer Form als Immunkomplex zurück und präsentieren es

B-Lymphozyten in den Keimzentren (STEINMAN et al., 1997). Die Marginalzone umgibt

PALS und Follikel und bildet ein breites, gut demarkiertes Band zwischen weißer und roter

Pulpa. In dieser Zone befinden sich vorwiegend eine Population von memory B-

Lymphozyten, die durch eine sofortige Antikörperantwort auf Polysaccharidkomponenten aus

Bakterienkapseln einen Schutz vor Sepsis bieten (STEINIGER u. BARTH, 2000).

2.2 Lymphknoten

Lymphknoten sind in die Lymphbahnen eingeschaltete Filterstationen, die in ihrer Größe und

ihrer Anzahl im Körper variieren können. In den meisten Geweben befinden sich

lymphatische Gefäße, die als afferente Lymphbahnen die Lymphknoten speisen. Lymphknoten

bestehen aus einer Bindegewebskapsel, von der aus Trabekel in das Innere einstrahlen und

den Lymphknoten segmentieren. Von außen wird die Kapsel von den Vasae afferentiae, den

zuleitenden Lymphgefäßen, unterbrochen, von denen aus die Lymphe unter der Kapsel weiter

über die Intermediärsinus in den Marksinus und abschließend in die Vasae efferentiae

weitergeleitet wird. Der Lymphknoten wirkt hierbei als Filter sowohl für inerte Partikel (z.B.

16

Farbpartikel nach Tätowierungen) als auch für Bakterien oder Zellreste, die von den Fress-

und Immunzellen aufgenommen werden. Im Lymphknoten werden 3 Kompartimente

unterschieden: der Kortex, der Parakortex und die Medulla. Im Kortex sind die Lymphozyten

in primäre und sekundäre Follikel mit Keimzentren angeordnet, die in der Hauptsache von B-

Lymphozyten und wenigen CD4+ T-Helferzellen besiedelt sind. Der Parakortex besteht

vorwiegend aus T-Lymphozyten und dendritischen Zellen. Eine Besonderheit des Parakortex

ist das Vorkommen von hochspezialisierten, postkapillären Venulen mit einem kubischen

Epithel (hochendotheliale Venulen, HEV), die es den Lymphozyten in hoher Anzahl

ermöglichen, aus dem Blut in die Lymphknoten einzuwandern. (PABST, 1994).

2.3 Peyersche Platten

Die Schleimhäute des Verdauungstraktes besitzen eine besonders große Oberfläche und ein

dünnes Epithel zur effektiven Resorption von Nährstoffen. Beides ermöglicht es aber auch

Pathogenen wie Bakterien oder Viren die Schleimhautbarriere zu überwinden, in das Gewebe

einzudringen und es zu schädigen. Das Darm-assoziierte, lymphatische Gewebe vermindert

das Eindringen und die Vermehrung der Mikroorganismen. Es setzt sich aus vielen vereinzelt

(solitär) gelegenen Follikeln und aus Follikeln mit spezialisiertem Epithel, den Peyerschen

Platten, auch „Plaques“ genannt, zusammen. Letztere sind im Bereich des gesamten

Dünndarmes anzutreffen und zeichnen sich dadurch aus, dass sie keine afferenten

Lymphgefäße besitzen. Zum Darmlumen hin sind sie mit einem spezialisierten Epithel

bedeckt, das den Antigenkontakt und die -aufnahme ermöglicht. In der Histologie sind auch

hierbei deutlich abgrenzbare Kompartimente zu erkennen: bei den Follikeln handelt es sich

ausschließlich um Sekundärfollikel mit aktiven Keimzentren und einem Randwall aus

kleineren Lymphozyten. In der zwischen den Follikeln gelegenen Interfollikulärregion

befinden sich in der Hauptsache dicht gepackt liegende T-Lymphozyten, DC und HEVs. Zum

Darmlumen hin kommt es zu einer kappenartigen Ansammlung von T- und B-Lymphozyten,

die Dom-Epithel genannt wird. Aufgrund seiner Funktion zeichnet sich das Epithel dort mit

einigen Besonderheiten aus: es hat weder Krypten noch Zotten, kaum oder keine Becherzellen

und ist somit nicht von einer Schleimschicht geschützt, trägt keine IgA-Rezeptoren und

zwischen den Epithelzellen finden sich Zellen, die zum Lumen hin eine membranförmige

17

Faltung haben und aufgrund ihrer Form M-Zellen („membranous cells“) genannt werden.

Durch Transzytose sind diese Zellen in der Lage, große Moleküle, Bakterien und Viren

aufzunehmen und mit den räumlich nahe gelegenen Immunzellen in Kontakt zu bringen

(PABST, 1994; GEBERT, 1997; BEIER u. GEBERT, 1998).

2.4. Morpholgie der sekundär lymphatischen Organe in LFA-1-defizienten Mäusen

LFA-1 (CD11a-/-/CD18) aus der β2- Integrinrezeptorfamilie wird vor allem auf Leukozyten

exprimiert und nimmt eine Schlüsselrolle in der Funktion, wie z. B. bei der Adhäsion dieser

Zellen an andere Zellen oder das Epithel, ein. LFA-1 setzt sich aus zwei Ketten zusammen,

die auf unterschiedlichen Genen kodiert werden: Integrin alpha L (CD11a, Ly 15, Ly 29) wird

auf dem Chromosom 7 kodiert, Integrin beta 2 auf Chromosom 10 (CD18). Die Produkte

beider Gene formen das funktionelle LFA-1. Wird die Expression eines der beiden Produkte

unterdrückt wie im vorliegenden Fall die Expression von CD11a, so liegt eine Defizienz des

LFA-1-Moleküls vor. Im Vergleich zu Wildtypmäusen, die eine normale Expression des LFA-

1-Moleküls auf der Oberfläche der Zellen aufweisen, konnte bei LFA-1-defizienten Mäusen

eine Vergrößerung der Milz bei männlichen Tieren um das 1,7 fache, bei weiblichen Tieren

um das 1,2 fache festgestellt werden. Die peripheren Lymphknoten hingegen sind um etwa

30% kleiner als bei Wildtypmäusen, wohingegen weder die mesenterialen Lymphknoten, noch

weitere Lymphknoten diese Veränderung aufwiesen. Bei der Analyse der T- und B-

Lymphozyten konnte ein deutlicher Verlust von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten in den

peripheren Lymphknoten nachgewiesen werden, in der Milz hingegen fanden sich signifikant

mehr T-Lymphozyten. Diese LFA-1-Defizienz resultierte in einer Reduktion der

Einwanderung von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten und in die Peyerschen

Platten auf etwa 30% (BERLIN-RUFENACH et al., 1999).

In den sekundär lymphatischen Organen werden die Funktionen der spezifischen

Immunabwehr eingeleitet. Nach Antigenkontakt durchlaufen die Lymphozyten verschiedene

Phasen der Reifung und werden in naive, Effektor und memory T-Lymphozyten eingeteilt, die

im folgenden näher erläutert werden.

18

3. Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten im Laufe einer Immunantwort

3.1. Naive T-Lymphozyten

Nach ihrer Entstehung im Knochenmark wandern Prä-T-Lymphozyten in den Thymus ein.

Das T-Zellrepertoire muss weitgehend tolerant gegenüber körpereigenen Strukturen und

Proteinen sein. Um diese „zentrale Toleranz“ zu gewährleisten, werden während der

Entwicklung im Thymus körpereigene Proteine auf MHC-Molekülen von dendritischen

Zellen präsentiert. Zum einen werden Thymozyten darauf getestet, ob sie den

Hauptgewebeverträglichkeitskomplex (major histocompatibility complex, MHC) auf den

körpereigenen Zellen erkennen (positive Selektion), zum anderen, ob sie eine verstärkte

Affinität auf körpereigenes Protein zeigen (negative Selektion). Etwa 95% der T-

Lymphozyten überstehen diesen Prozess nicht und sterben im Thymus (SPRENT et al., 1996).

Nach ihrer Differenzierung im Thymus tragen naive T-Lymphozyten auf ihrer Oberfläche

bestimmte Moleküle, die dem Anheften an bestimmten Oberflächen (Adhäsion) oder der

Bindung von Proteinen aus der Zirkulation oder auf anderen Zellen (Rezeptoren) dienen. Zu

diesen Molekülen werden der T-Zellrezeptor, CD28 und CD4 oder CD8 gezählt, die sich auch

bei einer Aktivierung des Lymphozyten nur wenig in ihrer Expression verändern. Andere

Moleküle wie CD45RC und L-Selektin werden nach einem spezifischen Antigenkontakt

weniger oder nicht mehr exprimiert (BODE, 1998). Diese Moleküle werden auch zur

Unterscheidung des Aktivierungszustandes herangezogen. Diese T-Lymphozyten, die den

Thymus verlassen haben, aber noch nicht mit ihrem spezifischen Antigen in Kontakt

gekommen sind, werden auch als naive T-Lymphozyten bezeichnet, deren Lebensspanne in

der Maus etwa 6 Monate beträgt (DI ROSA et al., 1999).

19

3.2. Aktivierung und Effektorphase

Durch den T-Zellrezeptor (TCR) erkennen und binden T-Lymphozyten Peptide in

Zusammenhang mit MHC-Molekülen. Die Antigen-abhängige Stimulation des TCR resultiert

in einer komplexen Kaskade von biochemischen Signalereignissen, die drei mögliche Folgen

hat: Proliferation und klonale Expansion, Apoptose oder Anergie. Einige Ergebnisse lassen

vermuten, dass in Abhängigkeit des gebundenen Liganden, der Zeit oder anderen

Eigenschaften der physikalischen Bindung eine qualitativ und quantitativ unterschiedliche

Antwort hervorgerufen wird (LORD et al., 1999). Die Avidität der TCR-Bindung wird durch

die Moleküle CD4 oder CD8 verstärkt und es kommt zu einer Stabilisierung des Kontaktes

und einer Veränderung des Schwellenwertes durch ein direktes Signal oder Induktion der IL-

2-Transkription. Die Bindung weiterer kostimulatorischer Moleküle wie beispielsweise B7.1

(CD80), B7.2 (CD86) oder des interzellulären Zelladhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1, CD54) auf

der Zelloberfläche wird benötigt, damit T-Lymphozyten proliferieren können (HALE u.

HAYNES, 1999). B7 wird dabei eine zentrale Rolle in der Regulation der Proliferation

zugeschrieben. Einerseits führt es zum Überleben der Zellen (DEETHS u. MESCHER, 1999),

andrerseits kommt es durch die Bindung an das zytotoxische T-Zellantigen-4 (cytotoxic T

lymphocyte antigen-4, CTLA-4) zu einer Hemmung der Proliferation (CHAMBERS, 2001).

Aber auch durch die Neuanordnung von weit über die Oberfläche herausragenden Molekülen

wie CD45 und CD43 (Sialophorin, 45nm), durch die eine Interaktion des kleinen TCR (15nm)

mit dem MHC ermöglicht wird, kann die Aktivierung beeinflussen (SHAW u. DUSTIN,

1997). Integrine, u.a. LFA-1, werden dabei für den initialen Zell-Zell-Kontakt und

kostimulatorische Moleküle (CD28) zur Ausbildung eines stabilen Kontaktes benötigt. Eine

Bindung des TCR an den MHC-Peptid-Komplex ohne die gleichzeitige Bindung der

kostimulatorischen Moleküle führt zu Anergie oder „unresponsiveness“ des T-Lymphozyten,

d.h. die Zelle ist zwar weiterhin überlebensfähig, aber reagiert nicht weiter auf sein

spezifisches Antigen.

Eine vollständige Aktivierung führt zur Differenzierung der Zelle. Die Funktion der Zelle

wechselt vom Erkennen des Antigens zum Eliminieren der Mikroorganismen (ABBAS et al.,

1994). Bereits innerhalb von Sekunden nach der Bindung des TCR kommt es zur Auslösung

der Signalkaskade. Biochemische Veränderungen, die mit der Aktivierung des TCR

20

einhergehen, dauern über mehrere Stunden und bieten die Möglichkeiten der Beeinflussung

durch zusätzliche regulative Wege. Nach der TCR-Aktivierung werden innerhalb von etwa 2h

Zytokine sezerniert, zur DNS-Replikation kommt es nach 24h, eine Zellteilung erfolgt nach

48h, die Differenzierung in Effektorzellen benötigt einige Tage (HALE u. HAYNES, 1999).

Bei den Effektor T-Lymphozyten handelt es sich um große, blastoide Zellen, die eine hohe

Synthese von DNS zeigen. Es kommt zu einem Wechsel des auf der Oberfläche getragenen

Molekülmusters, die zum einen die Zytokinrezeptoren betreffen und zum anderen die

Adhäsionsmoleküle, die für das Anheften der Zellen am Endothel entscheidend sind

(SPRINGER, 1994). Durch die Interaktion mit dendritischen Zellen differenzieren sich

CD4+ T-Lymphozyten in zwei Klassen T-Helferzellen: TH1-Lymphozyten, die bevorzugt

Interferon-γ (IFN-γ) exprimieren, welches bei Entzündungsprozessen eine wichtige Rolle

spielt, und die sich durch Hyperaktivierung von Makrophagen bei der Abwehr von

intrazellulären Pathogenen beteiligen. TH2-Lymphozyten sezernieren IL-4, Il-5, IL-6 und IL-10

(MOSMANN et al., 1991) und aktivieren B-Lymphozyten zur Produktion und Sekretion von

spezifischen Antikörpern (DEFRANCO, 1988). In Abhängigkeit des Zytokins kommt es bei

den B-Lymphozyten zur Synthese von verschiedenen Antikörperklassen (SWAIN et al.,

1996). Der Mechanismus der Differenzierung der T-Helferzellen ist nicht vollständig geklärt.

Es wird jedoch vermutet, dass DC nicht nur die Signale zur klonalen Expansion der

Helferzellen geben, sondern selektive Signale von unterschiedlichen funktionellen

Subpopulationen von DC zur Differenzierung der T-Helferzellen führen (BOTTOMLY, 1999;

RISSOAN et al., 1999). CD8+ T-Lymphozyten differenzieren sich in zytotoxische Zellen, die

durch infizierte Zellen angreifen und in die Apoptose treiben können (JANEWAY et al.,

1999).

3.3 Memory T-Lymphozyten

Die von den differenzierten Zellen sezernierten Zytokine können sich auf den gesamten

Körper schädlich auswirken. Aus diesem Grunde muss nach einer erfolgreichen Eliminierung

des Antigens die Immunantwort streng reguliert werden und die potentiell gefährlichen Zellen

beseitigt werden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998). Ein Hauptteil der Effektor T-

21

Lymphozyten, etwa 70%, wird dabei durch einen induzierten Zelltod, die Apoptose,

unschädlich gemacht (SMITH et al., 1980; BINNS et al., 1992; BOISE et al., 1995). Dabei

wird das auf der Oberfläche von Effektor T-Lymphozyten getragene Molekül Fas (CD95) von

seinem Liganden (Fas-L, CD95L) auf den dendritischen Zellen oder den Makrophagen

aktiviert und führt über eine Signalkaskade zum Abbau der DNS in den T-Lymphozyten

(NAGATA, 1997). Nach Abklingen einer Immunantwort überleben einige Antigen-

spezifische T-Lymphozyten und bilden das immunologische Gedächtnis („memory“).

Memory T-Lymphozyten werden in der Ratte durch den phänotypischen Verlust des Markers

CD45RC und in der Maus über die Kombination der Marker CD45low, L-Selektinlow und

CD44high identifiziert (TIETZ u. HAMANN, 1997). Sie kommen in höherer Frequenz als

naive T-Lymphozyten vor und haben eine längere Lebensdauer als diese. Bei einem

sekundären Kontakt zum spezifischen Antigen läuft die Immunabwehr schneller ab. Um

sowohl eine möglichst breite Reihe an Antigenen erkennen zu können, aber auch gleichzeitig

eine effektive Immunantwort auslösen zu können, bedarf es eines Gleichgewichtes zwischen

dem naiven und dem memory T-Zellpool. Die Aufrechterhaltung des T-Zellpools ist ein

aktiver Prozess, der eine kontinuierliche Bindung des TCR durch MHC auf z.B. dendritischen

Zellen erfordert. Diese Interaktion scheint über die Expression von Bcl-2 das Überleben der

T-Lymphozyten vermitteln zu können (TANCHOT u. ROCHA, 1998).

4. Die Migration von Lymphozyten

Eine charakteristische und zum Auffinden des spezifischen Antigens wichtige Eigenschaft

von Lymphozyten ist ihre Fähigkeit, in nahezu alle Organe und Gewebe ein- und auswandern

zu können („Migration“). Die Rezirkulation von Lymphozyten ist ausschlaggebend für die

Interaktion zwischen T-Lymphozyten und den dendritischen Zellen zur kontinuierlichen

Präsentation des gesamten Antigenrepertoires im Körper und damit zur Einleitung von

Immunantworten (WESTERMANN u. PABST, 1990). Dabei herrscht ein reger Verkehr

zwischen dem Blut, den Geweben und der Lymphe. Etwa 5 x 1011 Lymphozyten wandern

beim Menschen jeden Tag aus dem Blut aus und wieder zurück. Das Blut enthält nur 2% der

22

gesamten Lymphozyten, die sich im Durchschnitt nur etwa 30 Min dort aufhalten. Die meisten

Lymphozyten wandern in Organe wie die Lunge, Milz, Leber, Knochenmark und nur ein

geringerer Anteil, unter physiologischen Bedingungen, auch in die Haut, die Synovia, die

Muskulatur oder das Gehirn. Durch Entzündungsgeschehen oder chronische Erkrankungen

kann sich diese Situation aber deutlich verändern (WESTERMANN et al., 1988;

WESTERMANN u. PABST, 1996).

Ein Antigen, das die angeborene Immunabwehr durchbrochen hat, wird von dendritischen

Zellen aufgenommen und zu den lymphatischen Organen transportiert, wo optimale

Bedingungen für die Antigenerkennung herrschen (MONDINO et al., 1996). Ein Großteil der

naiven T-Lymphozyten gelangt über Adhäsionsmoleküle wie L-Selektin über die

hochendothelialen Venulen (HEV) in die sekundär lymphatischen Organe und durchwandert

das Gewebe. Findet in dieser Zeit keine Antigenerkennung statt, so wandern die naiven T-

Lymphozyten über die efferente Lymphe (SMITH u. FORD, 1983) aus und gelangen wieder

in die Zirkulation (GIRARD u. SPRINGER, 1995). Die Anheftung an das Epithel und die

anschließende Einwanderung in das Gewebe umfasst dabei mehrere Schritte und wird durch

die Interaktion der Adhäsionsmoleküle auf den T-Lymphozyten und den spezifischen

Rezeptoren auf den Endothelzellen vermittelt. Dabei werden in der Literatur immer wieder

sogenannte „Homingrezeptoren“ diskutiert, die für den Eintritt der Lymphozyten in bestimmte

Gewebe verantwortlich sein sollen, wie z.B. L-Selektin für den Eintritt in periphere

Lymphknoten (GALLATIN et al., 1983), α4β7-Integrin für den Eintritt in die Peyerschen

Platten (HAMANN et al., 1994). In LFA-1-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass

die Migration von T-Lymphozyten in die peripheren Lymphknoten zwar bis auf 30% des

Wertes bei Wildtypmäusen abfällt, jedoch andere α4-Integrine wie α4β7 oder α4β1 das Fehlen

eines funktionellen LFA-1-Moleküls teilweise kompensieren können (BERLIN-RUFENACH

et al., 1999). Für die Milz konnte kein spezifisches Molekül identifiziert werden. Zusätzlich

zu den lymphatischen Geweben wandern naive T-Lymphozyten auch in die Leber (LUETTIG

et al., 1999) und die Lunge ein.

Findet bei der Durchwanderung z.B. des Lymphknotens eine Antigenerkennung statt, so stellt

die Bindung des TCR ein Stopsignal für den T-Lymphozyten da und führt zur Beendigung der

Migration (DUSTIN et al., 1997). Dieses Phänomen wird als ein Mechanismus angesehen, um

23

Antigen-spezifische Lymphozyten im drainierenden Lymphknoten anzureichern. Dabei ist die

Bindung des membrangebundenen LFA-1 mit seinen Liganden ICAM-1, -2 oder –3 auf den

T-Lymphozyten ein früher und essentieller Schritt in der Zellaktivierung. LFA-1 gehört zur

Familie der β2-Integrine und vermittelt eine Antigen-unabhängige Bindung der T-

Lymphozyten mit dendritischen Zellen, aber auch mit dem Endothel von Gefäßen

(SPRINGER, 1990). Durch die Rezeptor-Ligandenpaare LFA-1/ ICAM, ICAM/ LFA-1,

CD2/ LFA-3 und CD28/ CD80 wird eine transiente Adhäsion zwischen CD4+ T-Lymphozyten

und DC vermittelt, wie durch monoklonale Antikörper nachgewiesen werden konnte (HAUSS

et al., 1995).

Die Interaktion mit der DC erfordert mehrere Stunden zur Initiierung der Zytokinproduktion,

zum Eintritt in den Zellzyklus und zur Differenzierung. Einige dieser Effektor T-

Lymphozyten wandern vom Parakortex in die Follikel ein und initiieren dort eine B-

Zellantwort, die zur Ausbildung von Keimzentren führt (FULLER et al., 1993). Andere T-

Lymphozyten verlassen auch über die efferente Lymphe den Lymphknoten auf dem Weg in

das Blut (AGER, 1994).

Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten sind phänotypische Veränderungen der Zellen

verbunden, die u.a. zu einer Funktionsänderung, aber auch zu einem veränderten

Wanderungsverhalten führen. Auf aktivierten T-Lymphozyten werden Adhäsionsmoleküle

wie LFA-1, VLA-1 und CD2 verstärkt exprimiert, von denen angenommen wird, dass sie eine

erhöhte Interaktion mit dem Endothel bewirken. Dadurch könnte eine verbesserte

Einwanderung in nicht-lymphatische Gewebe und eine erhöhte Kapazität in entzündete

Gewebe einwandern zu können, erklärt werden (SPRENT, 1994). Entgegen der Annahme,

dass über diesen Mechanismus Antigen-spezifische T-Lymphozyten so an den Ursprung der

Entzündung wandern (DUNON et al., 1996), konnte gezeigt werden, dass Effektor T-

Lymphozyten in alle Gewebe einwandern, aber nur in ihrem Herkunftsmilieu bevorzugt

proliferieren und vermindert der Apoptose anheim fallen (BODE et al., 1999). Effektor T-

Lymphozyten finden sich vorwiegend in nicht-lymphatischen Geweben wie Lunge, Leber und

Darm wieder (HAMANN u. REBSTOCK, 1993; LUETTIG et al., 1999). Es konnten aber

auch Effektor T-Lymphozyten im Lymphknoten und in den Peyerschen Platten nachgewiesen

24

werden (BODE et al., 1999), obwohl auf vielen Effektor T-Lymphozyten kein oder nur

geringe Mengen L-Selektin exprimiert wird (DAILEY et al., 1985), das für den Eintritt über

HEV in Lymphknoten verantwortlich gemacht wird.

T-Lymphozyten, die nach der Aktivierung und Differenzierung entstehen und eine

Immunantwort überleben, werden als „memory“ Lymphozyten bezeichnet. Es konnte jedoch

gezeigt werden, dass sowohl naive wie auch memory T-Lymphozyten in der Lage sind, über

HEV in lymphatische Gewebe einzuwandern. Beide Subpopulationen wandern ebenfalls in B-

Zellareale und Keimzentren ein. Dabei wandern T-Lymphozyten vom memory-Phänotyp

schneller durch die T-Zellareale und lassen sich deshalb in geringer Anzahl im Gewebe

auffinden (WESTERMANN et al., 1997). Für andere Spezies wie der Maus wird beschrieben,

dass sich memory T-Lymphozyten, wie auch Effektor T-Lymphozyten, vorwiegend in Leber

und Lunge ansammeln, aber nicht von der Migration in lymphatische Gewebe ausgeschlossen

sind (TIETZ u. HAMANN, 1997).

5. Antigenpräsentation oder: die Kontrolle der Immunantwort

T- und B-Lymphozyten sind zwar die Botschafter der Immunabwehr, aber ihre Funktion steht

unter der Kontrolle der DC, die zu den effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen zählen

(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). B-Lymphozyten als Vorläufer der Antikörper

sezernierenden Plasmazellen können über ihren B-Zellrezeptor natives Antigen direkt

erkennen. Zur Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort benötigt der T-Lymphozyt

sein spezifisches Antigen in einer prozessierten und präsentierten Form in einem MHC-

Peptid-Komplex und kostimulatorischen Molekülen wie CD28 und LFA-1. Dabei müssen die

CD8+ T-Lymphozyten Fremdpeptide auf der Oberfläche von infizierten Körperzellen finden,

die sich überall im Körper befinden können. Die Menge spezifischen MHC-Peptid-Komplexe

auf infizierten und Tumorzellen ist gering (100 oder weniger pro Zelle), es fehlen meistens

kostimulatorische Moleküle und die Zellen müssen von seltenen T-Zellklonen (1: 100.000

oder weniger) erkannt werden, die T-Zellrezeptoren mit niedriger Affinität besitzen

(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). DC haben alle phänotypischen und funktionellen

25

Eigenschaften, die zur effizienten Einleitung einer zellulären Immunantwort nötig sind: in den

meisten Geweben vertreten, binden sie in der Peripherie Antigen, prozessieren es und

präsentieren es in einem MHC-Peptid-Komplex in Zusammenhang mit kostimulatorischen

Molekülen wie ICAM-1 und der B-7-Familie. Im Gegensatz zu Makrophagen liegt ihre

Aufgabe jedoch nicht in der Beseitigung der eingedrungenen Pathogene, sondern in der

Alarmierung des Immunsystems (STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).

Dendritische Zellen sind unverwechselbare Antigen-präsentierende Zellen (APC), die drei

Hauptfunktionen haben: 1. DC sind überaus potente APC. In vitro und in vivo sind nur einige

DC notwendig, um eine starke T-Zellantwort einzuleiten. DC induzieren eine sogenannte

gemischte Leukozytenreaktion (mixed leucocyte reaction, MLR), wobei nur eine DC

notwendig ist, um 100-3000 T-Lymphozyten zu stimulieren. DC aktivieren T-Lymphozyten

nicht nur gegenüber körperfremden MHC-Molekülen, sondern auch gegenüber einer Reihe

von Fremdproteinen und mikrobiellen Proteine wie Superantigenen, die ohne Prozessierung

direkt an die MHC-Moleküle binden (BHARDWAJ et al., 1993), oder den

„Standardproteinen“, die eine Prozessierung erfordern einschließlich Entzündungsprodukten

(INABA et al., 1993) und Tumorantigenen (MAYORDOMO et al., 1995; ZITVOGEL et al.,

1996). 2. DC induzieren als einzige Zellen primäre T-Zellabhängige Immunantworten, die

sich anschließend in T-Helfer oder zytotoxische Zellen differenzieren. 3. Nach der

Aktivierung durch DC können T-Lymphozyten effizient mit Makrophagen und B-

Lymphozyten interagieren.

Der Wechsel von der Prozessierung des aufgenommenen Antigens und der Präsentation mit

anschließender Aktivierung von naiven T-Lymphozyten wird allgemein als „Reifung“

bezeichnet. DC, die sich in fast alle Geweben befinden, weisen einen „unreifen“ Phänotyp

auf, d.h. sie haben nur eine schwache stimulatorische Aktivität für T-Lymphozyten, die des

weiteren mit einer niedrigeren oder abwesenden Expression von Oberflächenmolekülen wie

MHC Klasse II, CD40, ICAM-1 oder B7-1 assoziiert ist. So ist MHC Klasse II bis zu 10 mal

niedriger exprimiert. Nach Isolierung aus Geweben und Organen reifen sie jedoch in der

Kultur schnell aus, was durch eine koordinierte Reihe von Veränderungen wie der

Hochregulierung der MHC-Moleküle und kostimulatorischer Moleküle deutlich wird

(STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999). Der Prototyp der unreifen DC ist die Langerhanszelle

in der Haut, die auch unter Zugabe von M-CSF nicht zu Makrophagen ausdifferenziert. In

26

vielen verschiedenen Kultursystemen sind die Stimuli untersucht worden, die zu einer

Ausreifung der DC führen. So werden DC durch Entzündungsstimuli und infektiöse Agentien,

wie z.B. LPS aus Bakterienwänden, aktiviert und produzieren Chemokine (MIP-1α, MIP-2,

MCP-1, TNFα), die Makrophagen, NK-Zellen, Neutrophile Granulozyten und weitere unreife

DC an den Ort der Entzündung locken. Danach erst durchlaufen sie ein induziertes

Reifungsprogramm, in dem sie irreversible Veränderungen von der Antigenaufnahme

(unreifer Phänotyp) über eine intermediäre Phase von 24-48h bis zur Auslösung von

Immunantworten (reifer Phänotyp) durchlaufen (RESCIGNO et al., 1999). Verglichen mit

anderen Leukozyten sind DC ungewöhnlich reich an Genprodukten des MHC Klasse II, das

sich in intrazellulären endozytotischen Vakuolen, MHC II reiche Kompartimente (MIIC)

genannt, befindet. Nach einem Stimulus erfolgt eine erhöhte Synthese der MHC Klasse II und

die Fusion der Vesikel. Das Antigen wird an das MHC-Molekül gebunden und auf die

Oberfläche der Zelle ausgeschleust, wobei die Halbwertszeit der Komplexe über 100h beträgt

und sie so über mehrere Tage T-Lymphozyten stimulieren können. Der Wechsel der

Kompartimentalisierung aus den MIIC an die Oberfläche erfolgt in 24h bis 48h nach den

Antigenaufnahme (PIERRE et al., 1997). Die Gegenwart der MIIC erklärt, warum der unreife

Phänotyp das Stadium in der Entwicklung der DC ist, in dem DC aktiv Proteine aufnehmen

und zur Präsentation für T-Lymphozyten prozessieren. Diese endgültige Ausreifung der DC

nach Stimulierung durch Entzündungsprodukte, virale und bakterielle Komponenten oder

durch CD40Ligand wird als der Kontrollpunkt zur Einleitung von Immunantworten oder

Toleranz angesehen (STEINMAN et al., 2000). Dabei werden kostimulatorische und

Adhäsionsmoleküle wie B7-2, MHC II und CD40 bereits nach 1-2h hochreguliert, B7-1 und

MHC I hingegen erst nach 4-6h initiiert und das Maximum nach 18h erreicht. Die Expression

der Chemokinrezeptoren (u.a. CCR1, CCR5) wechselt von der Erkennung von

Entzündungschemokinen (SLC, ELC) zu konstitutiv im Gewebe exprimierten Chemokinen.

Diesem Wechsel wird auch die erhöhte Wanderungsaktivität in lymphatische Gewebe

zugeschrieben, wo sie in den T-Zellarealen zurückgehalten werden und sich auf die Suche

nach Antigen-spezifischen T-Lymphozyten machen (RESCIGNO et al., 1999).

Wie es auch der Fall bei anderen Zellen von myeloider Abstammung ist, ist die Morphologie

zur Identifizierung der DC nützlich. So weisen DC lange, blattähnliche Ausläufer, die auch

27

Lamellipodia oder „veiled“ genannt werden, auf, die in verschiedene Richtungen vom

Zellkörper ausstrahlen. Im lebenden Zustand werden diese Ausläufer ständig neu geformt und

aktiv bewegt. Diese ungerichteten Bewegungen sind bei anderen Leukozyten nicht zu

beobachten. Obwohl diese Zelleigenschaften nicht so diagnostisch sind wie die gefärbten

Granula von eosinophilen oder basophilen Granulozyten, so ist doch die Morphologie der DC

ausreichend charakteristisch, um die Identifikation und Aufreinigung zu erlauben. In

humanem Blut, afferenter Lymphe und Haut von Mäusen, Affen und Menschen, aber auch in

den lymphatischen Organen von Mäusen, Ratten und Menschen sind DC untersucht worden.

Die einzigartige Morphologie der DC wurde dazu herangezogen, Methoden zur Gewinnung

von großen Mengen von DC zu etablieren. Durch FACS-Untersuchungen konnte gezeigt

werden, dass neben zahlreichen anderen Molekülen vor allem MHC-Produkte auf der

Oberfläche von DC exprimiert werden. Besonders MHC Klasse II ist überreichlich exprimiert.

Quantitative Bindungsstudien mit monoklonalen Antikörpern ergaben mehr als 106

Bindungsstellen pro Zelle (CELLA et al., 1997). Durch die Expression von MHC Klasse I,

sowie MHC Klasse II präsentieren DC sowohl Antigene aus dem Zytosol der Zelle, wie auch

aus endozytotischen Vesikeln (JANEWAY et al.,1999). DC exprimieren die meisten der

bekannten akzessorischen oder kostimulatorischen Moleküle für T-Lymphozyten wie CD40,

ICAM-1 (CD54), CD58, B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86). Diese Moleküle erklären die

Effizienz, mit der DC T-Lymphozyten binden und stimulieren. Die Interaktion ist

bidirektional in dem Sinne, dass die Bindung der T-Lymphozyten zu Veränderungen des T-

Lymphozyten wie auch der DC führen. Dies ist besonders kennzeichnend für die Bindung von

CD40. Nach Interaktion mit CD40L auf aktivierten T-Lymphozyten bleibt die Lebensfähigkeit

der DC erhalten und sie produzieren große Mengen an IL-12 (HOWLAND et al., 2000;

KOCH et al., 1996; TAKASHIMA u. KITAJIMA, 1998). Spezifische Marker für andere

Leukozyten fehlen auf DC wie CD14 für Makrophagen, CD16 für NK-Zellen, CD19 und

CD20 für B-Lymphozyten. Zellspezifische Marker waren bislang aufgrund geringer

verfügbarer Anzahl an DC nur sehr schwierig zu identifizieren. Für den Menschen werden 3

Antigene zur Identifizierung verwendet: S100b, p55 und CD83, die jedoch nicht

zellspezifisch sind, da sie ebenfalls auf Zellen im Neuralgewebe exprimiert werden

(STEINMAN u. BHARDWAJ, 1999).

28

Die Charakterisierung der DC macht die Separation von anderen Leukozyten, im besonderen

aber von den Makrophagen notwendig. Diese Separation ist aufwendig, da DC in nur sehr

geringer Anzahl vorkommen, wie z.B. im humanen Blut, in dem sich das Verhältnis von

Monozyten zu DC auf 20-50:1 belaufen. Durch die Entwicklung von Kulturprotokollen ist es

neuerlich möglich (CRAWFORD et al., 1999; TALMOR et al., 1998), größere Mengen von

DC zu gewinnen und in der aktiven Immuntherapie gegen Tumorzellen oder virale Antigene

einzusetzen (HIRAO et al., 2000; LUDEWIG et al., 1999a; MANICKASINGHAM u. REIS,

2000; SCHULER u. STEINMAN, 1997). So konnten aus CD34+ humanen Blutzellen und aus

Monozyten durch die Zugabe von GM-CSF und Zytokinen Zellen mit DC-Charakter

gewonnen werden (TALMOR et al., 1998).

DC sind in vivo in den meisten Geweben (z.B. Langerhanszellen in der Epidermis, in der

afferenten Lymphe, in Herz, Nieren, IDC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe)

vorhanden und können aus den verschiedenen Kompartimenten über die afferente Lymphe

oder das Blut in die T-Zellareale der lymphatischen Organe einwandern. DC stellen jedoch

keine einheitliche Gruppe von Zellen dar. So konnte gezeigt werden, dass DC aus mehreren

verschiedenen Vorläuferzellen, aber auch verschiedene funktionelle Phänotypen von DC aus

der gleichen Vorläuferzellen in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen gewonnen werden

können (GRABBE et al., 2000). Auch im Blut, in der Milz (STEINMAN et al., 1997), den

Lymphknoten (DE ST GROTH, 1998; SALOMON et al., 1998) und den Peyerschen Platten

(ANJUERE et al., 1999; VREMEC u. SHORTMAN, 1997) sind verschiedene Subtypen von

DC anwesend.

Die speziellen Fähigkeiten der DC scheinen nur in Relation zur Expression der

Oberflächenmoleküle und zu ihrer Regulierung vor und während der Immunantworten zu

stehen (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Im Vergleich zu anderen Antigen-

präsentierenden Zellen wie B-Lymphozyten oder Makrophagen werden MHC- Produkte und

MHC- Peptid-Komplexe auf den DC 10-100mal höher exprimiert. Des weiteren synthetisieren

DC hohe IL-12-Spiegel, die die angeborene wie erworbene Immunabwehr stimulieren

(CELLA et al., 1996; KOCH et al., 1996; SOUSA et al., 1997). Durch Freisetzung von

Chemokinen können sie T- und B-Lymphozyten anlocken und das Überleben der

rezirkulierenden T-Lymphozyten sichern. DC befinden sich in der afferenten Lymphe, sind

aber nicht in der efferenten Lymphe nachzuweisen (INGULLI et al., 1997). So sind DC 48h

29

nach enger Interaktion mit T-Lymphozyten nicht mehr nachzuweisen. DC erhalten während

einer Antigen-spezifischen Interaktion mit T-Lymphozyten auch Signale durch die T-

Lymphozyten, u.a. durch Bindung des Fas-L, das die Apoptose der DC vermittelt (MATSUE

et al.,). Der aktive Zelltod der DC stellt einen Mechanismus zur Herunterregulierung einer

Immunantwort dar, um eine ständige Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten

zu vermeiden (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).

Auch die Einleitung und das Aufrechterhalten der peripheren Toleranz benötigt ein Absuchen

der DC durch die T-Lymphozyten. Die Kontakte sind notwendig, um potentiell reaktive Klone

zu deletieren oder die Anergie zu versetzen. So sind DC in der Lage, apoptotische Zellen aus

dem Intestinaltrakt, die beim physiologischen Zelluntergang anfallen, von Tumoren, nach

Transplantationen oder nach Virusinfektion aufzunehmen, über die afferente Lymphe in die

Lymphknoten zu transportieren und dort den rezirkulierenden T-Lymphozyten zu präsentieren

(ALBERT et al., 1998a; ALBERT et al., 1998b; HUANG et al., 2000). Diese Wanderung tritt

auch in Abwesenheit von Antigen oder Entzündungen auf, wie in SPF-Tieren gezeigt werden

konnte. Im Gegensatz zur Nekrose führt die Aufnahme der apoptotischen Zellen jedoch nicht

zur Ausreifung der DC. Diese sind deshalb nur in geringem Ausmaß fähig, eine

Immunantwort gegenüber dem Selbstantigen auszulösen (SAUTER et al., 2000; STEINMAN

et al., 2000b).

Obwohl DC von großem Interesse für die Wissenschaft sind, ist der physikalische Kontakt in

vivo in den lymphatischen Organen nicht weiter untersucht worden. Gerade bei klinischem

Einsatz von DC bei neu entwickelten Impfschemata (DNS-Vakzinierung) oder in der

Tumorbehandlung ist es von Interesse, Immunantworten über die Charakterisierung der

Kontakte, das Wissen über die Funktion und die beteiligten Moleküle besser verstehen zu

lernen und beeinflussen zu können. So ist nicht weiter bekannt, ob die Mikroumgebung wie

die verschiedenen Kompartimente in den lymphatischen Organen die Interaktion beeinflusst,

wie es für die Einwanderung über HEV in die lymphatischen Organe berichtet wurde. Auch

der Einfluss der Oberflächenmoleküle auf die Interaktion von T-Lymphozyten und DC ist

bislang nicht weiter untersucht worden. Es wurde in der vorliegenden Arbeit versucht zu

klären, welcher Anteil der durch die lymphatischen Organe wandernden T-Lymphozyten

Kontakte zu dendritischen Zellen ausbildet. Durch ein kongenes Rattenmodell konnten

30

injizierte Zellen auf Immunhistologien nachgewiesen werden und damit das Verhalten in vivo

in den Kompartimenten aufgeklärt werden.

31

III. Material und Methoden

1. Geräte und Laborbedarf

Geräte

Autoklav Memmert, Schwabach

Coulter Counter Coulter Counter Electronics, England

Durchlichtmikroskop Fa. Carl Zeiss Jena GmbH, Jena

Okular: Kpl W 12,5

Objektive: Zeiss 10x/ 0,22

Neofluar 25x/ 0,60

Zeiss 40x/ 0,65

IKA Schüttler, KS 501 D Fa. Janke u. Kunkel, IKA-Labortechnik,

Staufen

konfokales Mikroskop Leica TCS, Benzheim

Objektive: Plan Apo, Immersionsöl 40x/ 1,0

Plan Apo, Immersionsöl 100x/ 1,4

Filtersätze: N2.1 für TRITC, Cy3, Alexa 568

I3 für FITC, Cy2, Alexa 488

Kryostat, Typ 1720 Leitz, Wetzlar

pH-Meter, CG 840 Schott, Wiesbaden

Photomikroskop Zeiss, Oberkochem

+Mikroskopkamera MC 80DX Zeiss, Oberkochem

Pipetten, einstellbar Eppendorf, Fa. Hinz, Hamburg

(100-1.000µl, 20-200µl, 10-100µl, 1-20µl)

Tischventilator FT-30 Salco, Bensheim

Zentrifuge Universal 30 RF Hettich, Tuttlingen

Zytozentrifuge Typ Cytospin Shandon INC., Pittsbourgh, USA

32

Geräte für Zellkulturarbeiten

CO2-Brutschrank Heraeus, Hanau

Pinzette, gebogen, anatomisch Aesculap, Tuttlingen

Sterile Werkbank Mahl, Neuss

Drahtnetz (Porengröße 0,4mm) Forschungswerkstatt der Medizinischen

Hochschule Hannover

Laborbedarf

Kulturflaschen , 260ml Greiner, Frickenhausen

Objektträger, 76 x 25mm, geputzt Menzel, Braunschweig

Pipettenspitzen, gelb und blau Sarstedt, Nümbrecht

PAP-Pen (Wachsstift) science service

Blue caps, 50ml Falcon, Dänemark

Becton Dickinson, Heidelberg

2. Puffer, Medien und Materialien

PBS (Phosphat gepufferte Salzlösung) Serva, Heidelberg

TBS (Tris gepufferte Salzlösung) Serva, Heidelberg

TTBS (TBS mit 0,05% Tween) Merck, Darmstadt

EDTA-Puffer (1mmol/l EDTA auf 1l Aqua dest.,

0,372mg EDTA-Puffer, mit 1mol/l NaOH

auf pH7,2 einstellen)

Antiklotting-Medium ( 0,9% NaCl + 2,5mmol/l EDTA

+ 5%BSA, auf pH7,2 einstellen)

33

Schwinzerlyse (8,3g NH4Cl + 0,1g EDTA + 1,0g KHCO3

auf 1l Aqua dest.)

in vitro Stimulation

Kulturmedium (KM):

RPMI 1640 Biochrom KG, Berlin

mit

4mmol/l Glutamin Biochrom KG, Berlin

15 µmol/l Hepes ICN flow, Eschwege

100 U/ml Penicillin + 100µmol/lStreptomycin Biochrom KG, Berlin

0,1 nmol/l beta-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

Medium 199/ Hanks’ Biochrom KG, Berlin

fetales Kälberserum (FCS) Biochrom KG, Berlin

5’-Brom-2’-Desoxyuridin (BrdU) Sigma, Deisenhofen

Trypanblau, 0.16% in NaCl Serva, Heidelberg

2% hitzeinaktiviertes Rattenserum in PBS

laboreigene Herstellung: gepooltes Blut von LEW (RT7a) und LEW.7B(BH)

Ratten wurde für 30 Min bei RT stehen gelassen, anschließend für 30 Min bei

800xg (RT) zentrifugiert, der Überstand in Blue caps aufgenommen und erneut

für 30 Min bei 800xg (RT) zentrifugiert. Das so erhaltene Serum wurde in 5ml

Portionen für 30 Min bei 56°C in Wasser inaktiviert und anschließend bei

-20°C bis zur Verwendung gelagert

Markierung der Mauszellen

2µmol/l 5-,6-carboxyfluorescein diacetat

succinimidyl ester (CSFE 557) in PBS Molecular probes, USA

DIG-NHS Boehringer Mannheim, Mannheim

34

(DIG-antibody labeling Kit Nr.1367200)

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Immunhistologie

PAP-Substrat

280mmol/l 3,3’-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid

in 0,2% H2O2 in TTBS Sigma, Deisenhofen

APAAP-Substrat

540µmol/l Naphthol-AS-MX-phospat Sigma N4875, Deisenhofen

2,5mmol/l Fast Blue oder 1mMol Fast Red Sigma, Deisenhofen

2% N,N-Dimethylformamid Fluka 40240, Buchs

1mmol/l Levamisol Sigma L 9756, Deisenhofen

0,1 mol/l Tris, pH 8,2

Fixierung:

Paraformaldehyd (PFA)

4%ig: 8g Paraformaldehyd auf 200ml PBS pH 7,2

Methanol, z.A. (6009) Merck, Darmstadt

Aceton, z.A. (14.2500) Merck, Darmstadt

Hämatoxylin Fluka, Buchs

Glycergel (Einschlußmittel C 563) Dako, Hamburg

Moviol (4-88) Hoechst AG, Frankfurt

35

3. Antikörper

Primäre Antikörper Tabelle 1 zeigt Antikörper (Spalte 2), die in der vorliegenden Arbeit für die Charakterisierung in der Immunhistologie eingesetzt worden sind. Soweit nicht anders beschrieben, wurden monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Die Antikörper wurden mit verschiedenen Konjugationen eingesetzt (Spalte 3). Des weiteren wird die Verdünnung, der Isotyp des Antikörpers und die Veröffentlichung angegeben, in der der Einsatz des Antikörpers beschrieben wurde. Spezifität Antikörper/

Klon

Konjugat Isotyp Spezies Verdünnunga Referenz

Anti-TCR R73b IgG1 Ratte 1:2, 1:5 (HUNIG et al., 1989) Anti-CD28 JJ319 b IgG1 Ratte 1:2, 1:5 (TACKE et al., 1997)

HIS 14 IgG1 Ratte 1:50 (KROESE et al., 1987) B-Lymphozyten α-IgD Ratte 1:100

CD45RC c His 41 biotinyliert IgG1 Ratte 1:100

(KAMPINGA et al., 1990)

MHC Klasse II Ox 6 IgG1 Ratte 1:500 (FUKUMOTO et al., 1982)

ICAM-1 1A29 IgG1 Ratte 1:300 1:500 (konfokal)

(TAMATANI u. MIYASAKA, 1990)

Ki-67 Antigen MIB5 biotinyliert IgG1 Ratte 1:5000

(SCHLUTER et al., 1993)

Interdigitierende dendritische Zellen

NLDC-145d

IgG 2a Maus 1:50 (KRAAL et al., 1986) (BREEL et al., 1987)

Anti-Digoxigenin-AP

Alkalische Phosphatase

IgG Maus 1:150

Anti-Fluoreszin B13-DE-1 biotinyliert IgG1 Maus 1:5000 (RIGBY et al., 1977)

a Die Verdünnung erfolgte, soweit nicht anders aufgeführt, für die primären Antikörper in der Ratte in 0,9% NaCl + 5% Rattenserum, 1:2. In der Maus erfolgte die Verdünnung in PBS + 5% Mäuseserum, zu gleichen Teilen. Die Verdünnung der biotinylierten Antikörper erfolgte in PBS und 20% Mäuseserum.

b Zur Stimulierung der T-Lymphozyten wurden die Zellkulturüberstände dieser Hybridome eingesetzt. c Nachweis des RT7b Molekül nach Injektion von Zellen in kongene LEW (RT7a) d Wird in der Literatur auch als Multilektin-Rezeptor DEC-205 bezeichnet.

Antikörper und sekundäre Nachweisreagenzien

36

Tabelle 2 zeigt die Antikörper und die sekundären Reagenzien, die in der vorliegenden Arbeit

für den Nachweis gebundener Antikörper eingesetzt wurden. Soweit nicht anders beschrieben,

wurden monoklonale Antikörper aus der Maus eingesetzt. Zusätzlich wird die Verdünnung,

der Isotyp des Antikörpers und die Firma angegeben, die diesen Antikörper vertreibt.

Spezifität Antikörper Konjugat Isotyp Verdünnunga Firma/ Vertrieb

Kaninchen-Ig Alexa 568

polyklonal

(Ziege)

CyTM 5 IgG 1:100 Dianova, Hamburg

Hamster-Ig Alexa 488

polyklonal

(Ziege)

CyTM 3 IgG 1:100 Dianova, Hamburg

Maus-Ig Z259, polyklonal

(Kaninchen)

Ig-Fraktion 1:50 Dako, Hamburg

Maus-Ig D651 APAAP 1:50 (in TTBS) Dako, Hamburg

Ratten-Ig Z494, polyklonal

(Kaninchen)

1:100 b Dako, Hamburg

Ratten-Ig D488 APAAP 1:100 b Dako, Hamburg

BrdU Peroxidase IgG1 1:100 Boehringer

Mannheim,

Mannheim

Alkalische Phosphatase-

Anti-Alkalische

Phosphatase (APAAP)

1:50 Dako, Hamburg

Peroxidase-Anti-

Peroxidase (PAP)

1:50 Dako, Hamburg

Streptavidin-Peroxidase

(SAAP)

1:500 Dianova, Hamburg

a die Verdünnung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, in PBS und 5% Rattenserum b in TTBS + 5% Mäuseserum

37

4. Versuchstiere

Als Versuchstiere wurden kongene Lewis-Rattenstämme eingesetzt. Durch den

Polymorphismus im Gen RT7 (Allele RT7a und RT7b) exprimieren LEWIS (RT7a) und

LEW.7B(BH) Rattenstämme zwei unterschiedliche Varianten der Protein-Tyrosin-

Phosphatase, Rezeptor Typ C (Ptprc, CD45) (WONIGEIT, 1979). Das Gen RT7 wurde auch

als ART-1, RT-Ly-1, T200 oder Leucocyte common antigen (L-ca) bezeichnet. Dabei kann

das RT7B-Molekül durch den monoklonalen Antikörper His41 nachgewiesen werden

(KAMPINGA et al., 1990). Bei einer Transplantation oder einer Injektion von Zellen eines

Stammes in den anderen findet keine Abstoßungsreaktion statt und Zellen lassen sich in

einem in vivo Modell verfolgen. Die Ratten wurden unter spezifiziert pathogenfreien

Bedingungen (SPF) im Tierlabor der medizinischen Fakultät der Universität Manchester

(naive, memory T-Lymphozyten-Versuche) und im Tierhaus der Medizinischen Hochschule

Hannover (Effektor T-Lymphozyten-Versuche) gezüchtet und gehalten. Die Ratten wurden in

Gruppen bis zu drei Tieren in Makrolonkäfigen Typ III auf staubfreiem Weichholzgranulat

gehalten. Die in den Kontrollversuchen zum Nachweis der DC eingesetzten C57BL/6 Mäuse

wurden in Makrolonkäfigen Typ II gehalten. Die Raumtemperatur lag bei 22±2°C, die relative

Luftfeuchtigkeit bei 55±5%, die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt. Die

Tiere wurden mit einem pelletierten, autoklavierten Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der

Firma Altromin GmbH (Lage) [Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,00%, Rohfett 4%, Rohfaser

6,00%, Rohasche 7,00%, Rohwasser 10% und N-freie Extraktstoffe 54%; Zusatzstoffe (je kg):

Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg] gefüttert. Zur

Wasserversorgung wurde steriles Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libitum bereitgestellt.

Die Tiere wurden regelmäßig jedes Quartal auf das Vorkommen von Erregern entsprechend

der Liste GV-SOLAS (1986) untersucht.

Lymphozyten-Funktionsantigen-1-defiziente (LFA-1, αL/ β2, CD11a-/-/ CD18) Mäuse wie sie

von BERLIN-RUFENACH et al. (1999) beschrieben wurden, wurden freundlicherweise von

Frau Dr. N. Hogg, England, zur Verfügung gestellt. LFA-1-defiziente Mäuse wurden im

Tierlabor des „Lymphocyte Molecular Biology Labratory“, London, gezüchtet und unter

spezifisch pathogenfreien Konditionen in Übereinstimmung mit Regulationen des „United

38

Kingdom Home Office“ gehalten. Sie wurden routinemäßig auf Parasiten, Bakterien und Pilze

untersucht und wurden für pathogenfrei befunden.

Das Gewicht richtete sich nach dem Verwendungszweck und lag bei den Ratten zwischen

250-350g, bei den Mäusen zwischen 20-30g.

Genehmigung:

Das Tierversuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Hannover unter der Nummer 604-

42502-94/716, ein Fortsetzungsantrag unter der gleichen Nummer und ein Neuantrag unter

der Nummer 604-42502-99/166 genehmigt.

5. Gewinnung, Aufbereitung und Injektion von Subpopulationen der

Lymphozyten

5.1. Naive und memory CD4+ T-Lymphozyten

Durch die Kanülierung des Ductus thoracicus von Spendertieren konnte die Lymphe über

mehrere Stunden gesammelt werden. Nach der von WESTERMANN et al. (1996)

beschriebenen Aufbereitung der Zellen wurden jedem kongenen Empfängertier 20 x 106 naive

(CD45RC+) oder memory (CD45RC-) CD4+ T-Lymphozyten in die Schwanzvene injiziert Die

Empfängertiere wurden nach 30 Min (jeweils n=5 für Ratten mit naiven oder memory CD4+

T-Lymphozyten), nach 2 Stunden (n= 6, jeweils naive und memory), nach 24 Stunden (n=6

für naive, n=5 für memory) und nach 48 Stunden (n= 2 für naive, n= 1 für memory) unter

Etheranästhesie durch Entbluten aus der Bauchaorta getötet. Es wurden die Milz, die

mesenterialen Lymphknoten, sowie die Peyerschen Platten entnommen, in flüssigem

Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Von diesen Organen wurden anschließend

Gefrierschnitte in einer Dicke von 5µm angefertigt, luftgetrocknet und bis zur weiteren

Verwendung (s. 6.1.) in Aluminiumfolie gewickelt bei -20°C gelagert.

39

5.2. Effektor T-Lymphozyten

Zwei LEW.7B(BH) Ratten wurden nach CO2-Begasung durch Herzpunktion entblutet. Die

axillären, zervikalen, brachialen und mesenterialen Lymphknoten wurden unter sterilen

Bedingungen entnommen und in einem Metallsieb (0,4mm Porendurchmesser) in maximal

50ml Medium-199/Hanks zerzupft und in ein 50ml Blue Cap aufgenommen. Anschließend

wurde die Zellsuspension für 10 Min bei 400xg (bei 4°C) zentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Pellet in 20ml (4°C) neues Medium wieder aufgenommen. Nekrotische

Zellen wurden beseitigt, indem die Zellsuspensionen mit 5ml FCS unterschichtet und danach

bei 400xg für 10 Min (bei 4°C) zentrifugiert wurden. Nach zweimaligem Waschen in M199

wurde das Pellet in 10ml aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen mit 0,16%

Trypanblau in NaCl angefärbt und mikroskopisch eine Zellzählung der vitalen Zellen

durchgeführt.

Danach erfolgte eine Antikörperinkubation für 30 Min auf Eis. Dazu wurden die Zellen erneut

zentrifugiert (200xg, 10 Min, 4°C) und mit den Kulturüberständen der Hybridome R73

(Antikörper gegen den αβ-T-Zellrezeptor gerichtet) und JJ319 (Antikörper gegen CD28

gerichtet) inkubiert, wobei für eine vollständige Antikörperanlagerung 1ml der optimalen

Konzentration (1:2 bis 1:5 in M199, abhängig von der verwendeten Charge, durch Titration

im Facs kontrolliert, beschrieben von BODE, 1998) des Kulturüberstandes auf 10 x 106

Zellen eingesetzt wurden. Nach erneutem Waschen und Zentrifugation bei 200xg für 10 Min

bei 4°C wurde zur Markierung der aktivierten Zellen, wie bereits beschrieben (FRITZ et al.,

1990) dem Kulturmedium 5µmol/l BrdU zugesetzt, das als Thymidinanalogon während der S-

Phase des Zellzyklus in die DNS eingebaut wurde.

Zur Kreuzvernetzung der Antikörper wurden 260ml Kulturflaschen vor dem Gebrauch mit

Ziegenantikörpern gegen Mausimmunglobuline (Maus-Ig, 3µg/ml) in PBS über Nacht bei 4°C

beschichtet. Der überschüssige Antikörperanteil wurde vor der Eingabe der Zellen zweimal

mit PBS ausgewaschen (TACKE et al., 1995). Die jeweiligen Zellsuspensionen mit einer

Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml wurden bei 37°C und einer 5% CO2-Konzentration für 72

Stunden im Brutschrank inkubiert. BODE (1998) konnte mit dieser Methode 78,8 ± 6,1% der

Zellen nachweisen, die BrdU eingebaut hatten. Von diesen Zellen war der überwiegende Teil

40

T-Lymphozyten, die jeweils etwa zur Hälfte CD4+ und CD8+ gewesen sind.

Kontrollexperimente zur Messung des BrdU-Einbaus wurden im ELISA durchgeführt und

ebenfalls von BODE (1998) beschrieben.

Um die mit BrdU markierten 20-100 x 106 Lymphknotenzellen zu injizieren, wurden

männliche LEW-Ratten (RT7a) mit Ethylether narkotisiert und die Zellen intravenös (i.v.) in

1ml M199 in die Schwanzvene gegeben. Die Ratten wurden nach 1h (n=3), 9h (n=4), 24h

(n=8), 72h (n=4) und 96h (n=3) erneut narkotisiert und durch Öffnen der Aorta abdominalis

entblutet. Die Lymphknoten, die Peyerschen Platten und die Milz wurden entnommen, in

flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C gelagert. Von diesen Organen wurden 5-7µm

dicke Gewebeschnitte angefertigt, an der Luft getrocknet und anschließend bis zur weiteren

Verwendung (s. 6.2.) in Aluminiumfolie bei -20°C gelagert.

6. Darstellung der Membrankontakte auf immunhistologisch gefärbten

Gewebeschnitten

6.1. Darstellung der Membrankontakte zwischen naiven oder memory CD4+ T-

Lymphozyten mit interdigitierenden dendritischen Zellen in den T-Zellarealen der

lymphatischen Organe

Die Färbung und Fixierung der Präparate erfolgte nach bereits etablierter Methode

(WESTERMANN et al., 1997). Die Fixierung wurde durch eine 10 minütige Inkubation (bei

-20°C) in Methanol und Azeton zu gleichen Teilen vorgenommen. Anschließend erfolgte eine

Spülung mit 0,05% Tween 20 in TBS. In einem ersten Schritt wurde der monoklonale

Antikörper gegen das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, 1A29) in einer

Verdünnung von 1:300 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) für 30 Min auf die Objektträger

aufgebracht, das sowohl von dendritischen Zellen wie auch von B-Lymphozyten exprimiert

wird. Alternativ dazu wurde der monoklonale Maus-Antikörper anti-IgD in einer Verdünnung

von 1:100 (in 0,9% NaCl und 5% Rattenserum) verwendet. Nach zweimaligem Waschen in

PBS erfolgte eine zweite Inkubation für 30 Min mit einem Brückenantikörper Kaninchen-anti-

41

Maus in der Verdünnung von 1:50 (in PBS und 5% Rattenserum). Nach zweimaligem

Waschen in PBS wurde der Brückenantikörper erneut für 15 Min aufgetragen und wieder

abgespült. Anschließend wurde zur Wiedererkennung der injizierten Spender-T-Lymphozyten

des PVG.7B Stammes der biotinylierte Antikörper His 41 (1:100, 30 Min, in PBS und 20%

Mäuseserum), gefolgt von Avidin-Peroxidase (30 Min) verwendet. Für die Anfärbung der

Spenderzellen in braun wurde Diaminobenzidin eingesetzt. Die dendritischen Zellen (s.Abb.1,

S. 53), beziehungsweise die B-Lymphozyten (s.Abb.4, S. 60) wurden mit dem Substrat Fast

Blue in blau sichtbar gemacht. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in 70%igem Ethanol

(30 Min) fixiert und luftgetrocknet. Hämatoxylin diente in den meisten Fällen als

Gegenfärbung. Die Präparate wurden mit Dako-Glycergel eingedeckelt und wie in 9.1.

beschrieben ausgewertet.

6.2. Darstellung der Membrankontakte von Effektor T-Lymphozyten mit IDC in den T-

Zellarealen der lymphatischen Organe

Die Gewebeschnitte der Milz, der Lymphknoten und der Peyerschen Platten der

Empfängertiere nach Injektion von aktivierten Lymphknotenzellen wurden untersucht. Diese

wurden bei -20°C für 10 Min in gleichen Teilen Methanol/Aceton fixiert und danach in TTBS

gewaschen.

Alle nachfolgenden Inkubationsschritte erfolgten 30 Min bei Raumtemperatur (RT) in einer

feuchten Kammer. Die Objektträger wurden mit dem primären Antikörper inkubiert, um die

injizierten LEW.7B(BH)-Lymphozyten (mAb His41) und die Expression von ICAM-1 (mAb

1A29) auf den dendritischen Zellen darzustellen. Nach zweimaligem Waschen in TTBS

wurden die Zellen mit dem sekundären Antikörper Z259 (Kaninchen-anti-Maus, 1:50 in PBS

+ 5% RS) inkubiert. Nach erneutem Waschen in TTBS wurde der tertiäre Antikörper (D651,

Maus-APAAP, 1:50 in TBS-Tween) auf die Präparate gegeben. Zur Verstärkung des Signals

wurde die Inkubation mit dem sekundären und tertiären Antikörper für jeweils 15 Min

wiederholt. Das Oberflächenantigen, an das der primäre Antikörper (His41) gebunden hatte,

wurde durch die Inkubation des APAAP-Substrates mit Fast Blue in blau visualisiert

(WESTERMANN u. PABST, 1996; WILLFUHR et al., 1989). Nach gründlichem Spülen

42

wurden die Präparate in 70%igem Ethanol für 30 Min fixiert und für weitere 30 Min vor dem

Ventilator getrocknet.

Um das eingebaute BrdU zu detektieren, wurden die Präparate mit Formamid und NaOH

denaturiert. Dazu wurden 190ml Formamid auf 70°C erwärmt und dann 8 Min mit 100mmol/l

NaOH gemischt. In diesem Gemisch wurden die Objektträger 30 sec inkubiert. Nach Waschen

in 70°C warmen TTBS wurden die Präparate für 15 Min in 70°C warmen Formamid mit

7,5mmol/l Trinatriumcitrat inkubiert. Darauf erfolgte ein Spülen in eiskaltem TBS für 15 Min

und eine Fixierung mit 1% Formaldehyd bei RT. Des weiteren wurden sie mit TTBS

gewaschen und 10 Min mit 0,2% Glutaraldehyd bei RT fixiert. Nach erneutem Spülen in

TTBS wurden die Objektträger über Nacht mit 50µl Anti-BrdU-Antikörper (1:500, in TBS +

5% Rattenserum, 1:2) im Kühlschrank inkubiert. Nach Abspülen des überschüssigen

Antikörpers mit TTBS wurden die Objektträger mit dem APAAP-Komplex inkubiert und die

Inkubationsschritte ein zweites Mal für jeweils 15 Min wiederholt. Zur Darstellung des BrdU

wurden 2mg Fast Red mit 3ml APAAP vorsichtig vermischt und für 10 Min bei RT stehen

gelassen. Anschließend wurden die Präparate für genau 25 Min damit inkubiert. Wie in

Abb.10 (s. S. 73) zu erkennen ist, waren die injizierten T-Lymphozyten nach dieser Färbung

in blau, BrdU+ Zellen anhand eines roten Kernes zu erkennen. Dendritische Zellen stellten

sich durch den Nachweis des ICAM-1 auf ihrer Oberfläche in braun dar. Nach gründlichem

Waschen mit TTBS wurden die Präparate mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die fertigen

Präparate wurden mit Dako Glycergel eingedeckelt.

6.3. Herstellung und Färbung von Blutzytospots

Um die injizierten Zellen im Blut der Empfängertiere zu detektieren und auszuzählen, wurden

500µl Blut mit 10ml Schwinzerlyse versetzt und für 10 Min inkubiert. Anschließend wurden

die Leukozyten zentrifugiert (400xg, 10 Min, RT). Diese Zellen (1 x 106 Zellen/ml) wurden in

Antiklotting-Medium (0,9%NaCl, 2,5mmol/l EDTA, 5% BSA bei pH 7,2) aufgenommen und

bei 200xg für 8 Min bei RT in einer Zytozentrifuge auf Objektträger aufgebracht.

Anschließend wurden diese getrocknet und bis zur immunzytologischen Färbung (s. 6.4.) bei -

20°C gelagert.

43

6.4. Darstellung der Zellen im Zellzyklus

Der monoklonale Antikörper MIB5 reagiert mit dem nukleären Protein „Ki-67“, das während

aller aktiven Phasen des Zellzyklus (G1-M2) in der Ratte exprimiert wird und mit der

Zellproliferation assoziiert wird (GERLACH et al., 1997). Die Spezifität des Antikörpers in

der Immunhistochemie und bei anderen Analysen ist von CATTORETTI et al. (1992) und

SCHLUTER et al. (1993) beschrieben worden.

Zur Darstellung der Ki-67+-Zellen wurden Zytospots vom Blut (s. 6.3.) und 5-7µm dicke

Gefrierschnitte der Milz und der Lymphknoten nach Injektion von naiven, memory (s. 5.1.)

und aktivierten (s. 5.2.) T-Lymphozyten immunhistochemisch angefärbt. Dabei wurde, wie

bereits für die Darstellung von BrdU (siehe 6.2.) beschrieben, zuerst eine Oberflächenfärbung

und nach Denaturierung die Färbung des Zellkernantigens durchgeführt. Nach dem Trocknen

der Gewebeschnitte und Einkreisen mit dem PAP-Pen wurden die Präparate für 10 Min bei

-20°C in einem Gemisch von Methanol/Aceton zu gleichen Teilen fixiert und danach

zweimalig in PBS gewaschen. Im weiteren wurden die Objektträger für 30 Min bei RT mit

50µl des primären Antikörpers inkubiert, um auf der Oberfläche der Zellen ICAM-1 (1A29,

1:300, in 0,9%NaCl und Rattenserum, zu gleichen Teilen) zu identifizieren. Nach

zweimaligem Spülen in PBS wurden die Präparate bei 4°C für 45 Min in Paraformaldehyd

(PFA) fixiert und anschließend zweimal in TBS gewaschen. Daraufhin wurden die

Gefrierschnitte mit dem sekundären Antikörper, einem Kaninchenantikörper gegen Maus-Ig

(1:50, in PBS und 5%Rattenserum, 1:2) für 30 Min auf dem Schüttler inkubiert und einmal in

TBS/Tween abgewaschen. Eine weitere Inkubation erfolgte mit einem Maus-APAAP-

Antikörper für 30 Min bei RT. Die letzten beiden Inkubationsschritte wurden jeweils für 15

Min wiederholt. Die Identifizierung der injizierten LEW.7B(BH) Lymphozyten erfolgte durch

die Inkubation mit dem biotinylierten, monoklonalen Antikörper His41 (His41-Biotin in PBS

und 20% Mäuseserum, 1:100), wie bereits unter 6.2. beschrieben. Die Inkubation erfolgte für

1h bei 4°C in einer feuchten Kammer. Zur Visualisierung des biotinylierten His41 wurden die

Präparate für 45 Min bei RT mit Streptavidin alkalische Phosphatase (in PBS und 5%

Rattenserum) inkubiert, in TBS gewaschen und für 10 Min in Benzidin (4ml TBS/Tween mit

80µl H2O2 und 160µl Benzidin) inkubiert. Anschließend wurden die Oberflächenantigene

44

durch 25minütige Inkubation des APAAP-Substrates und Fast Blue in blau visualisiert,

gewaschen, für 30 Min mit 70%igem Ethanol fixiert und anschließend getrocknet.

Zur Darstellung des Zellkernantigens Ki-67 wurden die Zellen in EDTA (0,372g/l, pH 7,2) in

90°C warmen Wasserbad für 45 Min denaturiert. Daraufhin erfolgte ein zweimaliges Spülen

in eiskaltem TBS für jeweils 10 Min. Über Nacht wurde der Antikörper zur Darstellung von

Ki-67 (Mib5, 1:5000, in PBS, 1% BSA und 0,1NaN3) auf die Objektträger aufgebracht.

Nachdem der überschüssige Antikörper durch Spülen mit PBS entfernt worden ist, erfolgte

die Visualisierung des APAAP-Komplexes mit Fast Red, so dass proliferierende Zellen durch

einen roten Kern zu identifizieren waren. Wie in der Darstellung des BrdU in 6.2. stellen sich

dendritische Zellen durch die Expression von ICAM-1 in braun, injizierte T-Lymphozyten in

blau dar. Mib+ Zellen lassen sich durch einen roten Zellkern differenzieren (ähnlich der

Abb.10, S.73, keine eigene Darstellung).

Nach einer Gegenfärbung für 30 sec mit Hämatoxylin wurden die fertigen Präparate mit

Glycergel eingedeckelt.

6.5. Darstellung der BrdU+ Effektor T-Lymphozyten

Wie unter 5.2. beschrieben, wurden Lymphknotenzellen gewonnen und mit Antikörpern

gegen den TCR und CD28 (1:2 bis 1:5 abhängig von der Charge) für 30 Min auf Eis

inkubiert. Um herausfinden zu können, welcher Anteil der injizierten T-Lymphozyten sich

innerhalb der untersuchten Organe in der S-Phase befindet, wurde abweichend von dieser

Beschreibung dem Kulturmedium kein BrdU zugesetzt. Zur Kreuzvernetzung der Antikörper

wurden die Zellen für 72h bei 37°C und einer 5% CO2-Konzentration in Kulturflaschen

inkubiert, die zuvor mit Ziegenantikörpern gegen Maus-Ig (3µl/ml) beschichtet worden waren.

Die Injektion erfolgte wie in 5.2. beschrieben in die Schwanzvene. Nach 24h (n=2) und 72h

(n=10) wurden die Tiere durch Entbluten getötet und die Organe entnommen. Eine Stunde vor

der Entblutung erfolgte unter Ethernarkose eine intravenöse Injektion von 5mg BrdU/ 100g

Körpergewicht. Alle Zellen, die sich innerhalb dieser Stunde in der S-Phase befunden haben,

haben BrdU eingebaut. Es wurden Gewebeschnitte angefertigt und die Darstellung der Zellen

erfolgte wie bereits in 6.2. beschrieben.

45

7. Immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte in der konfokalen

Mikroskopie

Naive und memory T-Lymphozyten wurden, wie bereits unter 5.1. beschrieben, gewonnen

und die Milz 24h nach Injektion der Spenderlymphozyten aufbereitet (jeweils n=3). Es

wurden 14µm dicke Gewebeschnitte der Milz angefertigt und auf Gelatine-beschichtete

Objektträger aufgebracht. Die Gefrierschnitte wurden dabei mit einem Wachsstift (PAP-Pen)

umrandet und 1-2 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Präparate wurden für 10 Min

in einem Gemisch von Methanol/Aceton zu gleichen Teilen fixiert und anschließend für 3 x 5

Min in TBS mit Tween 20 gewaschen. Anschließend wurde die Vorinkubationslösung

(PBS+BSA+1% NaN3+10% Ziegenserum) auf die Schnitte aufgetragen und diese für 1 h in

einer feuchten Kammer bei RT inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Objektträger 3 x 5

Minuten in TBS + Tween gewaschen und danach der in PBS+1%BSA+0,1%NaN3 verdünnte

primäre Antikörper (ICAM-1, 1:500) aufgegeben. Der nichtgebundene Anteil des primären

Antikörpers wurde nach einer Stunde durch erneutes Waschen in TTBS entfernt und

anschließend der fluorochrom-markierte sekundäre Antikörper (Alexa 568, 1:100, in PBS+5%

Rattenserum) aufgegeben und in einer feuchten Kammer 1 h im Dunkeln inkubiert. Zur

Darstellung der injizierten T-Lymphozyten wurde der zweite primäre Antikörper (His41bio,

1:100, in PBS+10% Mäuseserum) auf die Objektträger aufgegeben und für 1h inkubiert. Nach

wiederholtem Waschen wurde der zweite, Fluorochrom-markierte sekundäre Antikörper,

Alexa 488 (1:100, in PBS+5% Rattenserum) für 1h aufgetragen. Nach 3 x 5 Min Spülen in

TTBS wurden die Objektträger mit Moviol eingedeckelt. Wie in Abb.6 (S.63/ 64) zu

erkennen ist, stellten sich die injizierten T-Lymphozyten anschließend in der roten

Fluoreszenz, die ICAM-1+ DC in der grünen Fluoreszenz dar.

Die Schnitte wurden mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie untersucht. Nach

Anregung der Fluorochrome bei 488nm und 568nm mit einem Laser wurden für die

Übersichtsaufnahmen 11-17 Schnitte im Abstand von 0,5µm mit dem 40er Objektiv bei

unterschiedlichen Nachvergrößerungen aufgenommen und im ‘extended focus’-Modus

übereinander projiziert. Zur Dokumentation von Detailaufnahmen der Membrankontakte

zwischen den injizierten, kongenen T-Lymphozyten und dendritischen Zellen wurde ein 100 x

46

Ölimmersions-Objektiv (numerische Apertur 1,4) verwendet und einzelne Schnitte im 0,5µm

Abstand gespeichert. Diese wurden als Einzelschnitte untersucht oder in einer Projektion

betrachtet. Die Bilder wurden digital nachbearbeitet (Adobe Photoshop 4.0). Zur

photographischen Dokumentation wurden Ekta Chrom 64 Filme von Kodak verwendet.

8. Darstellung von Membrankontakten zwischen T-Lymphozyten und IDC

im Mausmodell

8.1 Darstellung der Expression des Multilektin-Rezeptors DEC-205 auf

interdigitierender dendritischer Zelle im T-Zellareal der Milz

Die Milz von 12 Wochen alten C57BL/6 Mäusen wurde entnommen, tiefgefroren und daraus

Gewebeschnitte hergestellt. Diese wurden für 10 Min bei -20°C in einem Gemisch von

Methanol/Aceton fixiert und danach gewaschen. Die Objektträger wurden für 30 Min mit dem

primären Antikörper NLDC-145 (non-lymphoid dendritic cell antigen of 145 kDa, 1:50)

inkubiert, um die dendritischen Zellen im T-Zellareal der Milz über die Expression des

Multilektinrezeptors DEC-205 darzustellen. Nach erneutem Waschen wurden die Präparate

mit dem sekundären Antikörper Z494 (1:100 mit PBS und 5% Mäuseserum) für 30 Min

inkubiert, gewaschen und mit dem tertiären Antikörper D488 (1:100) für weitere 30 Min

inkubiert. Zur Verstärkung der Bindung wurde die Inkubation mit dem sekundären und

tertiären Antikörper für jeweils 15 Min wiederholt. Die Darstellung des Oberflächenantigens

des primären Antikörpers erfolgte durch die Inkubation des APAAP-Substrates mit Fast Blue.

Nach gründlichem Spülen wurden die Präparate mit Hämatoxylin für 30 Min gegengefärbt

und anschließend mit Dako-Glycergel eingedeckelt. Wie in Abb.8 (S.68) zu erkennen, stellen

sich die dendritischen Zellen in blau dar.

47

8.2 Nachweis von Membrankontakten zwischen markierten Wildtyp- oder

LFA-1-defizienten Zellen und DC in der PALS der Maus

Zur Markierung der Zellen wurden C57BL/6 und LFA-1-defiziente (CD11a-/-/ CD18) Mäuse

im Alter von 12 Wochen durch Genickbruch getötet und die Milz und der mesenteriale

Lymphknoten entnommen. In einem engmaschigen Drahtnetz (Porengröße 0,4mm), bedeckt

mit Medium 199, wurde vorsichtig das Fett entfernt und die Organe zerzupft. Die so

gewonnenen Zellsuspensionen wurden bei 400xg für 10 Min bei RT zentrifugiert, der

Überstand abgesaugt und die Zellen in M199 wieder aufgenommen. Durch die Zugabe von

25ml Schwinzerlyse für 10 Min wurden die Erythrozyten lysiert und durch Zentrifugation bei

400xg für 10 Min entfernt. Die Zellen wurden wiederholt in PBS gewaschen und in 12ml

resuspendiert. Nach Zugabe von 10ml PBS pH7,2 wurden die Zellen erneut für 10 Min bei

400xg zentrifugiert, anschließend in 1ml PBS aufgenommen und bis 2ml aufgefüllt.

Anschließend wurden die Zellen mit 0,16% Trypanblau in NaCl angefärbt und mikroskopisch

eine Zellzählung der vitalen Zellen (80-210 x 106 Zellen) durchgeführt.

Zum Nachweis der Zellen in den Empfängermäusen wurde ein Teil der Zellsuspension mit

Fluoreszenzmarker CSFE markiert. Da gleichzeitig Spenderzellen aus LFA-1-defizienten

Mäusen, aber auch von Wildtypmäusen intravenös in Wildtypmäuse injiziert wurden, wurden

die Zellsuspensionen mit zwei unterschiedlichen Markierungen (CSFE und DIG-NHS)

versehen. Dazu wurden 50 x 106 Zellen (in 2ml) mit einer 2µmol/l CSFE-Lösung (in PBS) für

30 Min bei 37°C inkubiert. Zur Markierung des anderen Anteils der Zellsuspension mit DIG-

NHS wurden 50 x 106 Zellen in 60µg DIG-NHS für 15 Min bei RT inkubiert. Nach der

Markierung wurden die Zellen in PBS gewaschen, bei 400xg für 10 Min bei RT zentrifugiert

und in 1200µl PBS+0,1%BSA resuspendiert. Um einen Einfluss der Markierung auf das

Wanderungsverhalten der Zellen ausschließen zu können, wurde die Markierung für die

LFA-1-defizienten Zellen und die Wildtypzellen gewechselt.

Als Empfängertiere dienten 12 Wochen alte männliche Wildtypmäuse (C57BL/6), die 300µl

eines Gemisches aus CSFE- und DIG-NHS-markierten (Wildtypzellen und LFA-1defiziente

Zellen in wechselnder Markierung) Zellen i. v. in die Schwanzvene erhalten haben.

Nach 2h wurden die Empfängermäuse durch Genickbruch getötet, die Milz entnommen und

tiefgefroren. Wie unter 8.1. beschrieben, wurden Gewebeschnitte hergestellt und nach einer

48

Fixierung in Methanol/Aceton der primäre Antikörper NLDC-145 (1:50) und im Falle der

Darstellung der CSFE-Markierung der Antikörper B13-DE-1bio (1:5000) aufgegeben. Nach

gründlichem Waschen wurden die Objektträger mit dem sekundären (Z494, 1:100 in TTBS +

5% Mäuseserum) und dem tertiären (D488, 1:100 in TTBS + 5% Mäuseserum) Antikörper für

jeweils 30 Min inkubiert und beide Schritte nach erneutem Waschen für jeweils 15 Min

wiederholt. Zuzüglich zu den DC in der PALS wurden die vor der Injektion markierten Zellen

dargestellt. Um Zellen darzustellen, die mit DIG-NHS markiert worden sind, wurden die

Präparate mit anti-Dig P (1:150 in PBS + 5% Mäuseserum) für 30 Min inkubiert, gewaschen

und für 10 Min mit Benzidin inkubiert. Durch die anschließende Inkubation des APAAP-

Substrates mit Fast Blue für 25 Min wurde das Oberflächenantigen des primären Antikörpers

visualisiert. Zellen, die mit CSFE markiert worden waren, wurden für 30 Min mit

Streptavidin-Phosphatase inkubiert, im weiteren, wie zuvor beschrieben, mit Benzidin und

anschließend Fast Blue dargestellt. Injizierte Zellen wiesen damit eine braune Färbung auf.

Dendritische Zellen waren in blau zu erkennen (siehe Abb.8, S.68). Alle Präparate wurden mit

Dako-Glycergel eingedeckelt.

9. Auswertung

9.1. Ermittlung der Anzahl von Membrankontakten zwischen den injizierten T-

Lymphozyten und den dendritischen Zellen in den sekundär lymphaischen Organen

In den T-Zellarealen der Milz, des Lymphknotens und der Peyerschen Platten wurden

mindestens 200 injizierte T-Lymphozyten gezählt und von diesen der Anteil ermittelt, die sich

in direktem Membrankontakt zu ICAM-1+ dendritischen Zellen befinden. Dabei wurden 3-6

Gewebeschnitte eines jeden Organs des jeweiligen Empfängertieres begutachtet und in die

Auswertung einbezogen. Für den Zeitpunkt 24h nach Injektion wurden für naive (n=6), für

memory (n=5) und für Effektor (n=7) Empfängertiere ausgewertet und aus diesen Mittelwert

und Standardabweichung errechnet. Für die weiteren Zeitpunkte wurden 3 bis 5 unabhängige

Versuche ausgewertet.

49

9.2. Ermittlung der Anzahl von Membrankontakten mit der konfokalen Mikrospkopie

In einer 100er Vergrößerung der PALS wurden in der Teilprojektion (computergestützte

Übereinanderlagerung von 9 Einzelschnitten) einzelne injizierte Lymphozyten ausgewählt und

eingeteilt, ob sie einen Membrankontakt mit einer DC aufweisen (mit/ohne Kontakt). Diese

Zellen wurden über die Einzelschnitte verfolgt, um festzustellen, in wie vielen Schichten die

Zellen Kontakt haben und wie der Kontakt ausgebildet ist. Durch Einzelschnitte, die ober- und

unterhalb der Teilprojektion gelegt worden waren, konnte zudem analysiert werden, ob die

ausgewählten T-Lymphozyten weitere Membrankontakte aufwiesen. Es wurden 24h nach

Injektion Präparate von naiven und memory T-Lymphozyten (je n=3) ausgewählt. Es wurden

pro Tier 3 bis 5 Ausschnitte der PALS ausgewertet.

9.3. Ermittlung der Membrankontakte im Mausmodell

Milz- und Lymphknotenzellen aus Wildtypmäusen und aus LFA-1-defizienten Mäusen

wurden wechselweise mit CSFE oder Digoxigenin markiert und gleichzeitig zu gleichen

Anteilen in Wildtypmäuse injiziert. Zwei Stunden nach der Injektion wurde die Milz der

Empfängertiere entnommen und die unter 8.2. beschriebenen Immunhistologien ausgewertet.

Dabei wurde zum einen der Anteil der empfängereigenen (endogenen) Zellen bestimmt, die

Membrankontakt zu DC in der PALS aufgewiesen haben. Zum anderen wurde die Anzahl der

markierten Zellen ausgewertet und unter diesen der Anteil der Zellen mit einem Kontakt zu

DC bestimmt. Es wurden jeweils n=6 Tiere für die Markierung mit CSFE und Digoxigenin

ausgewertet, wobei für jeden Versuch mindestens 3 Schnitte ausgewertet wurden. Es wurden

Mittelwert und Standardabweichung errechnet.

9.4. Ermittlung des Prozentsatzes von T-Lymphozyten im Zellzyklus oder in der S-Phase

im Blut

Nach 24h und 72h wurde der Prozentsatz der Lymphozyten im Zellzyklus (Ki-67+) oder in der

S-Phase (BrdU+) ermittelt. Dazu wurden mindestens 100 His41+ injizierte Lymphozyten

50

identifiziert und der prozentuale Anteil daran bestimmt, der sowohl His41+, als auch BrdU+

oder Mib+ war. Aufgrund des geringen Prozentsatzes BrdU+ Lymphozyten wurden nur etwa

20-40 dieser Zellen ermittelt. Es wurden Mittelwert und Standardabweichung von 2-10

Versuchen errechnet.

9.5. Ermittlung von Membrankontakten von T-Lymphozyten im Zellzyklus oder in der

S-Phase mit DC in der Milz

In immunhistologischen 3-fach Färbungen der Milz sind 1h, 9h, 24h, 72h und 96h nach

Injektion der kongenen Spenderzellen die His41+ T-Lymphozyten analysiert worden, die einen

Kontakt zu einer DC hatten und daran der Anteil ausgewertet, der sich im Zellzyklus (Mib+)

befand. Zum Vergleich dazu wurde der Anteil der His41+-Mib+ ermittelt, die keinen Kontakt

mit DC hatten. In der Milz wurde zuzüglich zwischen einem inneren und äußeren Anteil der

PALS unterschieden.

Mit dem gleichen Prinzip sind Präparate von Tieren ausgewertet worden, die eine Stunde vor

der Organentnahme BrdU intravenös erhalten hatten. Es sind die Zeitpunkte 24h und 72h nach

Injektion ausgewertet worden. Es wurden mehrere Organschnitte von jeweils 2-10

unabhängigen Versuchen ausgewertet.

10. Verwendete Computerprogramme und Statistik

Zur Auswertung der computergespeicherten konfokalen Bilder wurde das Programm confocal

assistant und Adobe Photoshop, Version 4.0 verwendet.

10.1. Statistik

Die Daten wurden mit SPSS für Windows Version 6.0 oder Version10.0 (SPSS Inc., Chicago,

IL, USA) erfasst. Mittelwerte und Standardabweichung wurden errechnet. Als nicht-

parametrische Tests dienten entweder der Mann-Whitney-U-Test oder der Wilcoxon Test.

51

Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn in einem der Tests p<0,05

erreicht wurde.

10.2. Graphik

Die graphische Verarbeitung der Daten erfolgte mit Sigma Plot Version 5.0 (Scientific

Graphing Software, Jandel Cooperation, Erkrath).

52

IV. Ergebnisse

A. Untersuchung der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit

interdigitierenden dendritischen Zellen in den sekundär

lymphatischen Organen der Ratte

Als prädominanter Ort der Sensibilisierung von T-Lymphozyten gegenüber ihrem

spezifischen Antigen und der Regulation vieler T-Zellabhängigen Immunantworten sind die

sekundär lymphatischen Organe bekannt. Die Ausübung dieser Funktionen setzt die

Kolokalisation von 2 verschiedenen Populationen von Leukozyten voraus: die T-

Lymphozyten und die dendritischen Zellen. Aus diesem Grunde war es wichtig, im

vorliegenden in vivo Modell sowohl die T-Lymphozyten, als auch die interdigitierenden

dendritischen Zellen immunhistologisch in der Milz, den Lymphknoten und den Peyerschen

Platten identifizieren zu können.

1. Injizierte T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen

können auf immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten

identifiziert werden.

Im kongenen Rattenmodell konnte festgestellt werden, welche Anzahl von T-Lymphozyten in

Membrankontakt zu den interdigitierenden dendritischen Zellen lag. Durch die Separation von

naiven und memory T-Lymphozyten über die Expression der hohen (CD45RChigh) oder

niedrigen (CD45RClow) Isoform des allgemeinen Leukozytenantigens und die polyklonale

Aktivierung über den T-Zellrezeptor und CD28 konnten verschiedene Aktivierungszustände

beobachtet werden.

In Abb. 1A ist die Milz zu erkennen. Um die Zentralarterie herum befindet sich die

periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), in der sich vorwiegend T-Lymphozyten

und nur wenige B-Lymphozyten befinden. Angrenzend sind Follikel zu erkennen, die sich

durch die gut demarkierte Marginalzone von der roten Pulpa unterscheiden lässt. Auch im

53

Lymphknoten und in den Peyerschen Platten sind T-Zellareale zu sehen, in denen sich

zahlreiche injizierte T-Lymphozyten differenzieren lassen. Im Lymphknoten (Abb. 1C) lassen

sich die T-Lymphozyten überwiegend im Parakortex ausmachen. Angrenzend ist der Kortex

mit einem Follikel zu sehen. Die Medulla ist in diesem Anschnitt nicht zu erkennen.

Betrachtet man einen vergrößerten Ausschnitt der PALS in Abb. 1B, so lassen sich zahlreiche

injizierte, in braun angefärbte T-Lymphozyten erkennen. Daneben sind über die Expression

des interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) in blau angefärbte Zellen zu erkennen, die

interdigitierende dendritische Zellen darstellen. Bei der Auswertung von Immunhistologien

der lymphatischen Organe wurden verschiedene Kriterien zur Identifizierung der DC zu

Grunde gelegt, da bislang kein monoklonaler Antikörper in der Ratte zur Verfügung steht.

Reife DC exprimieren auf ihrer Oberfläche das Molekül ICAM-1 sowie MHC II. Diese lassen

sich über monoklonale Antikörper (1A29, respektive Ox6) nachweisen. Ein zweites Kriterium

ist die charakteristische Morphologie der DC, die zur Unterscheidung herangezogen wurde.

Neben einem großen Zellkern besitzen DC zahlreiche blattähnliche Zellausläufer, die sich in

alle Richtungen von der Zelle aus erstrecken und die diesen Zellen ihren Namen verliehen

haben. Die Lokalisation der ICAM-1+-DC im T-Zellareal der lymphatischen Organe stellt das

dritte Kriterium dar.

B-Lymphozyten und auch Makrophagen exprimieren ebenfalls ICAM-1 und MHC II auf ihrer

Oberfläche. Wie in Abb.1A zu erkennen ist, ist die Expression von ICAM-1 auf den B-

Lymphozyten jedoch schwächer und ermöglicht eine deutliche Abgrenzung der

Kompartimente. Aus diesem Grunde wurden in den nachfolgenden Versuchen DC über die

Expression von ICAM-1 nachgewiesen. Des weiteren weisen B-Lymphozyten eine zumeist

runde Morphologie auf und sind deutlich kleiner als die DC und befinden sich in der

Hauptsache in den an die PALS grenzenden Follikeln. B-Lymphozyten erleichtern so die

Abgrenzung zwischen roter und weißer Pulpa. Makrophagen lassen sich aufgrund ihrer

unregelmäßigen Konturen von DC und B-Lymphozyten unterscheiden und sind in der PALS

nur selten anzutreffen.

54

Abb. 1 Im kongenen Rattenmodell können die den Empfängertieren injizierten T-Lymphozyten durch den mAb His41 und interdigitierende dendritische Zellen durch die hohe Expression von ICAM-1 nachgewiesen werden. Dargestellt sind immunhistologisch gefärbte Gewebeschnitte der Milz, des mesenterialen Lymphknotens und der Peyerschen Platten. Naive (CD45RChigh) und memory (CD45RClow) CD4+ T-Lymphozyten wurden in kongene Empfängertiere injiziert. Die lymphatischen Organe wurden 24h später entnommen. T-Lymphozyten wurden durch den mAb His41 immunhistologisch in braun dargestellt. Zusätzlich sind interdigitierende dendritische Zellen über ihre hohe Expression des interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1) in blau dargestellt und durch ihre charakteristische Morphologie und ihre Lokalisierung im T-Zellareal identifiziert worden. (A) In der Übersichtsvergrößerung der Milz sind die rote (RP) und weiße Pulpa zu erkennen, wobei sich die letztere weiter in die um die Zentralarterie (Za) gelegene periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), die Follikel (F) und die Marginalzone (Mz) einteilen läßt. (APAAP-Technik, 250fache Vergrößerung) (B) Deutlich sind zahlreiche Membrankontakte (schwarze Pfeile) zwischen den injizierten T-Lymphozyten und interdigitierenden dendritischen Zellen zu erkennen. (APAAP-Technik, 1000fache Vergrößerung). (C) Im Lymphknoten lassen sich ein Follikel (Fo) im Kortex und der Parakortex (Pk), das T-Zellareal, unterscheiden (400fache Vergrößerung). (D) In den Peyerschen Platten lassen sich das Domepithel (Do), die Krypten (Kr), Follikel (Fo) und Interfollikulärregion (Ifr) abgrenzen (400fache Vergrößerung).

55

2. In den sekundär lymphatischen Organen befinden sich 80% der

injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden

dendritischen Zellen.

In der PALS, deutlicher zu erkennen in der höheren Vergrößerung (Abb.1B), befindet sich ein

großer Anteil der injizierten T-Lymphozyten in enger Nachbarschaft zu stark ICAM-1+

interdigitierenden dendritischen Zellen. Durch ihre zahlreichen langen Ausläufer bilden IDC

ein Netzwerk, durch das die T-Lymphozyten wandern. Die Pfeile weisen auf

Membrankontakte zwischen den einzelnen Zellen hin. Ausgewertet wurde im folgenden der

Anteil der T-Lymphozyten, die in Membrankontakt zu IDC liegen, als Prozentsatz an den

injizierten kongenen T-Lymphozyten, die im Organ zu identifizieren sind. Es sind keine

Zellanhäufungen (Kluster) der injizierten T-Lymphozyten um die IDC zu beobachten, wenn

sich auch häufig mehr als ein T-Lymphozyt an einer IDC befindet.

Wie in Abb.2 zu erkennen ist, befinden sich in der Milz über 80% His41+ T-Lymphozyten in

Membrankontakt mit IDC. Die untersuchten Subpopulationen der T-Lymphozyten, d.h. die

naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten, unterscheiden sich hinsichtlich des

prozentualen Anteils der Kontakte nicht. Für alle Subpopulationen liegt der Mittelwert des

Prozentsatzes bei 80%±10%. Betrachtet man daraufhin den mesenterialen Lymphknoten oder

die Peyerschen Platten, so findet sich das gleiche Bild auch dort wieder. Die

Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten mit IDC stellen ein konstantes Phänomen dar,

das vermutlich von den Subpopulationen der T-Lymphozyten nicht beeinflusst wird, obwohl

BODE (1998) zeigen konnte, dass sich die Expression von z.B. L-Selektin und des IL-2-

Rezeptors deutlich auf naiven und aktivierten T-Lymphozyten unterscheidet. Auch die

unterschiedliche Mikroumgebung in den sekundär lymphatischen Organen scheint keinen

Einfluss auf das Ausmaß der Membrankontakte zwischen den T-Lymphozyten mit den IDC

zu haben. Eine mögliche Erklärung dieses Phänomens ist das dichte Netzwerk, dass durch die

DC mit ihren zahlreichen Ausläufern gebildet wird, wie es sich auch in der Immunhistologie

in Abb.1 zu sehen ist. Gelangen T-Lymphozyten in die sekundär lymphatischen Organe,

müssen sie auf ihrer Wanderung durch dieses Netzwerk hindurch und bekommen so

zahlreichen Kontakt zu den DC.

56

Lymphknoten

20

40

60

80

100

Milz

Subpopulationen der T- Lymphozyten

Ant

eil d

er T

-Lym

phoz

yten

in M

embr

anko

ntak

t m

it ID

C a

n in

jizie

rten

T-L

ymph

ozyt

en [%

]

20

40

60

80

100

Peyersche Platten

naiv memory effektor

20

40

60

80

100

E

Abb. 2

In der Milz, dem mesenterialen Lymphknoten und den Peyerschen Platten befinden sich über 80% der injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen. Zum Zeitpunkt 24h nach Injektion von kongenen naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten wurden die Milz, der mesenteriale Lymphknoten und die Peyerschen Platten entnommen und Gewebeschnitte angefertigt (siehe 5.1 und 5.2). Immunhistologisch wurden die injizierten T-Lymphozyten mit dem mAb His41 und IDC über ICAM-1 dargestellt. Die Membrankontakte der T-Lymphozyten mit IDC wurden ermittelt und der Anteil der Kontakte als Prozentsatz an den injizierten T-Lymphozyten aufgeführt. Es sind Mittelwert und Standardabweichung von n=5-7 unabhängigen Versuchen aufgeführt.

57

Neben den Kriterien der Lokalisation und ihrer charakteristischen Morphologie wurde die

hohe Expression von ICAM-1 zur Identifikation der IDC verwendet. Auf ausgereiften

interdigitierenden dendritischen Zellen ist jedoch MHC Klasse II sehr hoch exprimiert, ein

Molekül, das bei der Antigenerkennung durch CD4+ T-Lymphozyten eine entscheidende

Rolle spielt. Bei der Auswertung der Membrankontakte über einen anti-MHC Klasse II-

Antikörper (s.III.3.) befinden sich in allen untersuchten lymphatischen Organen über 80% der

injizierten T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC (s. Tabelle 1). Bei der Verwendung

von MHC Klasse II als Nachweis für die IDC findet sich kein signifikanter Unterschied dieser

Anteile zwischen naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten oder zwischen den

verschiedenen sekundär lymphatischen Organen, was die bisherigen Ergebnisse bestätigt. Da

beide Nachweise für die DC zu gleich guten Ergebnissen führten, die Abgrenzung der

Kompartimente mit der Färbung des ICAM-1 jedoch deutlicher zu sehen war, wurde dieser im

folgenden zur Färbung der DC herangezogen.

3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion der T-Lymphozyten

lassen sich gleiche Anteile von Membrankontakten beobachten.

Um die Frage zu beantworten, ob sich zu früheren oder späteren Zeitpunkten der Anteil der

Kontakte verändert, wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der kongenen

T-Lymphozyten die Membrankontakte analysiert. Abb. 3 zeigt verschiedene Zeitpunkte von

0,5h bis 96h nach Injektion der T-Lymphozyten. Obwohl vermutet wird, dass die Wanderung

der Subpopulationen der T-Lymphozyten durch die Gewebe verschieden lange dauert und sich

das Migrationsverhalten deutlich unterscheidet, befinden sich bereits nach einer halben Stunde

naive und memory T-Lymphozyten in Membrankontakten zu IDC. Zu diesem frühen

Zeitpunkt finden sich absolut gesehen weniger kongene T-Lymphozyten in den T-Zellarealen

der Milz (Daten nicht gezeigt). Festzustellen ist jedoch, dass sich der Anteil der injizierten

T-Lymphozyten, die sich in Membrankontakt mit IDC befinden, auf 80±10% beläuft. Auch

Effektor T-Lymphozyten, deren Verhalten nach 1h analysiert wurde, weisen ebenfalls in der

großen Mehrheit Membrankontakte auf. Zu allen weiteren untersuchten Zeitpunkten (2h, 9h,

58

24h, 48h, 72h und 96h) nach der Injektion lassen sich die gleichen Anteile der Kontakte

feststellen. Damit erscheinen die Membrankontakte ein von der Zeit unbeeinflusstes

Phänomen darzustellen, die unabhängig von der absoluten Anzahl der im Organ

nachzuweisenden T-Lymphozyten in großer Mehrheit nachzuweisen sind.

In der Zeitkinetik konnte kein unterschiedliches Verhalten von naiven, memory oder Effektor

T-Lymphozyten festgestellt werden. Sie sind aus diesem Grunde in der Graphik gemeinsam

dargestellt.

Tabelle 1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozytena und interdigitierenden

dendritischen Zellenb, die über die Oberflächenexpression von MHC Klasse II in den

sekundär lymphatischen Organen nachgewiesen worden sind.

Subpopulationen injizierter T-Lymphozyten

Organec naive memory Effektor

Milz 80,6 ± 10,5d 82,7 ± 7,1 71,6 ± 9,5

Lymphknoten 82,7 ± 4,6 80,7 ± 6,9 83,0 ± 5,5

Peyersche Platten 84,5 ± 3,7 84,5 ± 8,8 84,4 ± 6,9

a Aus dem Ductus thoracicus wurden naive (CD45RC+) und memory (CD45RC-) T-Lymphozyten separiert. T-Lymphozyten aus Lymphknoten wurden über den T-Zellrezeptor und CD28 in Gegenwart von BrdU für 72h polyklonal aktiviert. LEW.7B(BH) T-Lymphozytensubpopulationen sind LEW (RT7a)-Empfängertieren in die Schwanzvene injiziert worden b Interdigitierende dendritische Zellen wurden über ihre hohe Oberflächenexpression MHC Klasse II, ihre charakteristische Form und ihrer Lokalisation in den T- Zellarealen der peripheren lymphatischen Organe identifiziert. c Die Organe wurden 24 Stunden nach der Injektion der T-Lymphozyten entnommen und durch immunhistochemische Färbungen von Gefrierschnitten ausgewertet. In den T-Zellarealen der Milz, der Lymphknoten und den Peyerschen Platten wurde der Anteil der injizierten T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit interdigitierenden dendritischen Zellen an den injizierten Zellen ermittelt. d Die Werte sind Mittelwert und Standardabweichung von n=4-7 unabhängigen Experimenten.

59

Zeit nach Injektion [h]0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 48 72 96

Ant

eil d

er T

-Lym

phoz

yten

in M

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anko

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den

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Zel

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an in

jizie

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T- L

ymph

ozyt

en [%

]

40

50

60

70

80

90

100

Abb. 3

Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion der T-Lymphozyten befinden sich gleiche Anteile

der Zellen in Membrankontakt zu DC.

Nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten wurden nach 30min, 2h und 48h (• ) und nach Injektion von aktivierten T-Lymphozyten nach 1h, 9h, 24h, 72h und 96h (■) die Milz entnommen und Gewebeschnitte hergestellt. Die kongenen T-Lymphozyten wurden über den mAb His41, die DC über ihre Expression des ICAM-1 immunhistologisch identifiziert. Es wurde die Anzahl der injizierten T-Lymphozyten ermittelt und davon der Anteil bestimmt, der sich in Membrankontakt zu den DC in der PALS befindet. Da sich für die Anteile der Membrankontakte von naiven und memory T-Lymphozyten keine signifikanten Abweichungen ergeben haben, sind diese in der Zeitkinetik zusammengefasst dargestellt. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von n=3-7 unabhängigen Versuchen.

60

4. Endogene T-Lymphozyten zeigen über 60% Membrankontakte zu DC

Endogene T-Lymphozyten liegen dicht gedrängt in den T-Zellarealen der lymphatischen

Organe, durch die IDC mit ihren zahlreichen Ausläufern ein Netzwerk bilden. Wenn kongene

naive, memory und Effektor T-Lymphozyten zu gleichen Anteilen Membrankontakte

ausbilden, so müssten auch endogene, empfängereigene T-Lymphozyten einen hohen Anteil

an Kontakten aufweisen. In einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin und über den Nachweis der

IDC konnten auch Membrankontakte zwischen endogenen T-Lymphozyten und IDC

ausgewertet werden. Nach der Injektion von naiven, memory und Effektor T-Lymphozyten

wurden auch die Anzahl der Membrankontakte der endogenen T-Lymphozyten ausgewertet.

In der Milz befand sich der größte Anteil, 65,9±3,8%, der endogenen Zellen in

Membrankontakt zu IDC.

5. Membrankontakte zu IgD-positiven B-Lymphozyten befinden sich

vorwiegend im äußeren Bereich der periarteriolären lymphatischen

Begleitscheide der Milz

Neben den IDC gelten auch B-Lymphozyten als Antigen-präsentierende Zellen, die sowohl

MHC, als auch ICAM-1 schwach auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Dabei steht jedoch

nicht die Auslösung einer T-Zellabhängigen Immunantwort im Mittelpunkt, sondern die

B-Lymphozyten benötigen die Interaktion mit Antigen-spezifischen T-Helfer-Zellen zur

Enddifferenzierung in Antikörper-sezernierende Plasmazellen.

In Abbildung 4A und B sind im inneren Anteil der PALS nur vereinzelt B-Lymphozyten zu

erkennen, im äußeren Anteil und zu den Follikeln hingegen sind jedoch zahlreiche, dicht

beieinander liegende B-Lymphozyten zu sehen. Der Hauptteil der injizierten T-Lymphozyten

befindet sich gleichmäßig verteilt sowohl im inneren, als auch im äußeren Anteil der PALS.

Einige T-Lymphozyten sind auch in den Follikeln zu erkennen. Abb.5 zeigt den Anteil der

injizierten T-Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu den IgD+ B-Lymphozyten im

inneren Anteil der PALS aufweisen und 20±5% ausmacht. Im äußeren Teil der PALS

61

hingegen beläuft sich der Kontakt auf über 70%, eine vergleichbare Größenordnung zu den

Membrankontakten mit IDC. Lässt sich zwischen den Membrankontakten zwischen den T-

und B-Lymphozyten ein deutliches Gefälle zwischen innerem und äußerem Anteil der PALS

feststellen, so sind die Kontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC gleichmäßig über die

gesamte PALS verteilt (hellgraue Balken). Auch in den Anteilen der Membrankontakte zu B-

Lymphozyten lässt sich kein Unterschied zwischen naiven, memory und Effektor T-

Lymphozyten finden (Daten nicht gezeigt). Membrankontakte zwischen T- und B-

Lymphozyten sind vorwiegend im äußeren Bereich der PALS anzutreffen.

Abb.4 Membrankontakte zwischen injizierten T-Lymphozyten und IgD+B-Lymphozyten finden vorwiegend im äußeren Anteil der PALS statt. (A) Gezeigt ist ein immunhistologisch gefärbter Gewebeschnitt der Milz 24h nach Injektion von kongenen naiven (CD45RChigh) T-Lymphozyten. Die periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS), Follikel (F), Marginalzone (MZ) und die rote Pulpa (Rp) lassen sich durch die Darstellung der B-Lymphozyten mit einem anti-IgD-Antikörper in blau deutlich abgrenzen. Die Pfeile weisen auf den äußeren Anteil der PALS, in dem der Hauptteil der T-Lymphozyten Membrankontakt zu B-Lymphozyten zeigt. (B) Injizierte T-Lymphozyten zeigen im vergrößerten Ausschnitt durch die Anfärbung mit dem mAb His41 eine intensive braune Membranfärbung (Pfeilspitzen). Vorwiegend im äußeren Anteil der PALS sind zahlreiche Membrankontakte zu deutlich blau gefärbten B-Lymphozyten zu sehen (schwarze Pfeile).

62

Anteil der PALSinnerer äußererAn

teil

der T

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phoz

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tm

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der B

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injiz

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n T-

Lym

phoz

yten

[%]

20

40

60

80

100B-LymphozytenIDC

Abb. 5 Die Anteile der Membrankontakte von T-Lymphozyten mit IDC oder mit B-Lymphozyten

unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Verteilung in der PALS.

Bei der Auswertung der in Abb. 4 gezeigten Gewebeschnitte wurde ein innerer (Mitte) und ein äußerer (Peripherie) Anteil der PALS unterschieden. Gezeigt ist die Auswertung der Membrankontakte zwischen den naiven T- und den B-Lymphozyten (schwarze Balken), die sich vorwiegend im äußeren Teil der PALS nachweisen lassen. Die grauen Balken geben zum Vergleich die Membrankontakten zwischen naiven T-Lymphozyten und IDC in einer ICAM-1-Färbung wieder. Im inneren Bereich der PALS befinden sich signifikant mehr T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC als zu B-Lymphozyten (p<0,05; Wilcoxon-Test). Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung von n=5 unabhängigen Versuchen.

63

6. Membrankontakte von injizierten T-Lymphozyten mit dendritischen

Zellen lassen sich auch mit konfokaler Mikroskopie aufzeigen.

In der bei den Immunhistologien verwendeten APAAP-Technik kommt es zur Verwendung

von Brückenantikörpern, die optisch einen erhöhten Farbniederschlag vorspiegeln können.

Dadurch könnten Überlagerung der Farbniederschläge in der Auswertung zu einem höheren

Anteil an Membrankontakten führen. In der konfokalen Mikroskopie werden Fluorochrom-

gekoppelte Antikörper verwendet, die den primären Antikörper erkennen und durch einen

Laser zur Emission angeregt werden und somit einen deutlich geringeren Farbniederschlag

aufweisen. Ein weiterer Vorteil der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass durch einen

immunhistologischen Schnitt mehrere Ebenen gelegt werden können, die bei einer

computergestützten Projektion ein dreidimensionales Bild der Kontakte wiedergibt. Es ist

also, wie in Abb.6 gezeigt, möglich, den Verlauf und die Lokalisation der Membrankontakte

zu verfolgen und des weiteren Überlagerungen ober- oder unterhalb der Schnittebene

auszuschließen. Im grünen Kanal lassen sich deutlich die mit His41 angefärbten injizierten T-

Lymphozyten (siehe Abb.6A) erkennen. Im roten Kanal ist der Zellkörper einer IDC mit einer

hohen Expression von ICAM-1 und zu mehreren Seiten abgehenden dendritischen

Zellausläufern zu sehen (Abb.6B). In der Projektion sind einige der T-Lymphozyten in

direkter Nähe zu der IDC zu erkennen, der gelbe Saum entsteht durch eine Überlagerung des

roten und grünen Kanals. Auf den folgenden, 0,5µm auseinander liegenden Schnitten lässt

sich ein Membrankontakt zwischen der IDC und einem T-Lymphozyten verfolgen

(Sternchen). Auch andere T-Lymphozyten weisen einen Membrankontakt auf, sind aber nicht

als ganze Zelle im Schnitt enthalten. Mit einem Dreieck gekennzeichnet ist ein T-Lymphozyt,

der über die gesamte Schnittebene keinen Kontakt aufweist.

In den Immunhistologien, die mittels konfokaler Mikroskopie ausgewertet worden sind, haben

sich 60±5% der injizierten T-Lymphozyten in engem Membrankontakt zu den IDC befunden.

Die Kontakte, die sich schichtweise pro Zelle verfolgen lassen, sind dabei gleichmäßig

verteilt. Durch einen T-Lymphozyt konnten 9,5±1,9 Schichten gelegt werden, was einem

berechneten Durchmesser von etwa 5µm entspricht. In einem Hauptteil der verfolgten

Kontakte haben die T-Lymphozyten über alle Schichten Kontakt, was in Abb.7 dargestellt ist.

64

Zellen, die sich komplett im Schnitt befunden haben, wurden dabei von oben bis unten

durchgemustert. Dabei hatten 33 von 84 ausgewerteten T-Lymphozyten in allen Schichten

(100%) Membrankontakt zu einer IDC. In nur weniger als 5% der untersuchten Zellen

konnten Überlagerungsartefakte festgestellt werden, d.h. in den Einzelschnitten konnte kein

Kontakt festgestellt werden, obwohl in der Projektion die Zelle als positiv (mit Kontakt)

gewertet worden war (falsch positiv). Hingegen konnte mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

festgestellt werden, dass fast 50% der Zellen ohne Kontakt ober- oder unterhalb der

Schnittebene Kontakte aufgewiesen haben (falsch negativ).

Abb. 6

In der konfokalen Mikroskopie lassen sich die Membrankontakte über den ganzen Kontakt

verfolgen.

Gezeigt ist eine Immunhistologie der Milz 24h nach Injektion von CD4+ Gedächtnis T-Lymphozyten im kongenen Modell. Bei den Einzelbildern handelt es sich um Ausschnitte aus der PALS (1000fache Vergrößerung). a) Im grünen Kanal sind T-Lymphozyten (T) über Fluorochromfarbstoff-gekoppelte Antikörper (mAb His41) in grüner Fluoreszenz dargestellt, der gegen den LEWIS RT7b-Phänotyp gerichtet ist. Es sind mehrere T-Lymphozyten zu erkennen. b) Im roten Kanal ist durch eine Markierung mit anti-ICAM-1 (Antikörper 1A29) eine interdigitierende dendritische Zelle dargestellt, deren Zellkörper und einige dendritische Ausläufer zu sehen sind. c) Die Abbildung zeigt eine konfokale Gesamtprojektion des grünen und roten Kanals durch computergestützte Übereinanderlagerung der optischen Einzelschnitte. Durch die Übereinanderlagerung der Kanäle erscheinen die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC in gelb. d-l) Optische konfokale Folgeschnitte im Abstand von 0,5µm durch den Ausschnitt der PALS der Milz. Mit einem Stern (*) gekennzeichnet ist ein T-Lymphozyt, der durch alle optische Einzelschnitte hindurch verfolgt werden kann und einen deutlichen Membrankontakt zur dendritischen Zelle aufweist. Mit einem Dreieck (∆) gekennzeichnet ist hingegen ein T-Lymphozyt, bei dem über alle Einzelschnitte kein Kontakt zu beobachten ist. Die Pfeile (→) weisen exemplarisch auf Membrankontakte zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den dendritischen Zellen (mit einer gelb erscheinenden Überlappungszone) hin.

66

Ausmaß der Membrankontakte in Prozent

10 20 30 40 50 60 70 80 % 100

Anz

ahl d

er in

jizie

rten

T-L

ymph

ozyt

en

0

5

10

15

20

25

30

35

Abb. 7

Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC lassen sich in der Mehrzahl über

mehrere Schichten verfolgen.

Auf Gewebeschnitten wurden die injizierten naiven (CD45RChigh) und memory (CD45RClow) T-Lymphozyten mit dem fluorochrom-markierten Antikörper His41 in grün dargestellt. Über die Expression von ICAM-1 wurden IDC in der PALS in roter Fluoreszenz nachgewiesen. Mit Unterstützung eines bildgebenden Verfahrens am Computer wurden insgesamt 9 (Z-Dicke = 0,5µm) durch einen Ausschnitt der PALS gelegte Einzelschnitte übereinander gelagert und als Teilprojektion definiert. In dieser Darstellung wurden in der PALS injizierte T-Lymphozyten ausgewählt, die einen Membrankontakt zu einer IDC aufgewiesen haben und über die Einzelprojektionen der Kontakt verfolgt. Es wurden bei der Auswertung nur Zellen genommen, die sich mit ihrer gesamten Zelloberfläche innerhalb des Gewebeschnittes befunden haben. Die y-Achse zeigt dabei die Anzahl der T-Lymphozyten an, die x-Achse den prozentualen Anteil der Schichten, in denen die T-Lymphozyten einen Membrankontakt aufweisen, an allen Schichten der Zelle. Dabei sind T-Lymphozyten, die in allen Schichten Membrankontakt aufweisen, unter 100% aufgeführt. Zellen, die nur in der Hälfte ihrer Schichten Kontakte hatten, sind in der Kategorie 50% aufgeführt. Angegeben sind nur die T-Lymphozyten (n=84), die in der Teilprojektion wie auch den Einzelschnitten Membrankontakte gezeigt haben.

67

7. In der Maus werden interdigitierende dendritische Zellen über den

spezifischen Marker DEC-205 nachgewiesen.

Um herauszufinden, ob es sich bei der beobachteten Größenordnung von Membrankontakten

um speziesspezifische Effekte handelt, die sich nur in der Ratte darstellen lassen, wurden im

weiteren auch Mäuse untersucht. In der Maus sind spezifische Marker für IDC bekannt. Ein

Beispiel ist der Nachweis des Multilektinrezeptors DEC-205, der sich in den T-Zellarealen der

lymphatischen Organe identifizieren lässt. Auch weitere spezifische Marker, Mac-1 und

CD11c, für IDC wurden auf den Immunhistologien getestet, erbrachten jedoch keine zufrieden

stellenden Ergebnisse. So war Mac-1auf Gewebeschnitten nur auf Makrophagen in der roten

Pulpa exprimiert und konnte zum Nachweis der IDC nicht weiter eingesetzt werden. CD11c

konnte nicht in gleicher Intensität wie NLDC-145 in der Maus oder ICAM-1 in der Ratte

nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

In Abb.8 ist im inneren Bereich der PALS eine deutliche Markierung von Zellen mit IDC-

Charakter zu beobachten, die sich zum äußeren Bereich der PALS hin verliert. Die

Abgrenzung zu den Follikeln im äußeren Anteil der PALS ist nicht so deutlich ausgeprägt,

wie es bei der Verwendung von ICAM-1 (s.Abb.1) oder MHC Klasse II (nicht gezeigt) in der

Ratte der Fall ist. Endogene T-Lymphozyten liegen zu 55,7 ± 2,7% in Membrankontakt mit

IDC. Die Membrankontakte von endogenen T-Lymphozyten mit IDC in der Ratte und in der

Maus liegen in einer vergleichbaren Größenordnung. Das Mausmodell eröffnet hingegen eine

Reihe weiterer Untersuchungsmöglichkeiten.

7.1. LFA-1-defiziente Zellen weisen eine unverändert hohe Anzahl von

Membrankontakten zu DC auf.

Durch die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen ist es möglich, die Beteiligung von

Oberflächenmolekülen bei der Ausbildung der Membrankontakte zu untersuchen. LFA-1 ist

als ein wichtiges Molekül bei der Migration der Lymphozyten aus den Blutgefäßen bekannt,

spielt aber auch eine entscheidende Rolle in der Vermittlung von transienten Zell-Zell-

68

Interaktionen. Um herauszufinden, welche Rolle LFA-1 in der Ausbildung von

Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC hat, wurden Wildtypmäusen

gleichzeitig markierte Wildtypzellen und LFA-1-defiziente (αL-/-/ β2, CD11a-/-/ CD18)

Lymphozyten injiziert. Immunhistologisch konnten Membrankontakte zu IDC, die über den

spezifischen Antikörper NLDC-145 nachgewiesen wurden, in der Milz ausgewertet werden.

Dabei befanden sich Zellen aus Wildtyptieren zu gleichen Anteilen (59,9±5,2%) in

Membrankontakt zu IDC wie die Zellen aus LFA-1-defizienten Tieren (59,0±5,3%). Eine

mögliche Erklärung dieses Ergebnis ist die Expression von LFA-1 auf den Dendritischen

Zellen und des ICAM-1 auf den T-Lymphozyten, die den Kontakt gewährleisten könnten.

Auch andere Ligand-Rezeptorbindungen wie CD2/ LFA-3 oder CD28/ CD80 können

Antigen-unabhängige Membrankontakte vermitteln. Durch eine zusätzliche Blockierung mit

einem Antikörper, der gegen ICAM-1 gerichtet ist, könnte in einer weiteren Untersuchung der

Einfluss des LFA-1 auf die Membrankontakte deutlicher gezeigt werden. Ob das fehlende

LFA-1-Molekül Auswirkungen auf die Signaltransduktion für die T-Lymphozyten mit sich

bringt, bleibt in weiteren Studien mit diesen genetisch veränderten Mäusen zu zeigen.

69

Abb. 8

In der Maus lassen sich IDC über den spezifischen Marker DEC-205 nachweisen.

Gewebeschnitt der Milz einer Wildtypmaus. IDC lassen sich über die Expression des Multilektinrezeptors DEC-205 (Antikörper NLDC-145) in blau darstellen. (A) Im inneren Anteil der PALS heben sich die DC durch die Färbung besonders hervor, zum äußeren Bereich der PALS hin ist die Färbung schwächer ausgeprägt. Endogene T-Lymphozyten zeigen durch eine Gegenfärbung mit Hämalaun eine schwach blaue Färbung. Es ist zu erkennen, dass sie dicht gedrängt in der PALS liegen. Angrenzend an die PALS sind Follikel (F) schwach zu erkennen. (250 x Vergrößerung, APAAP-Technik) (B) In der Ausschnittsvergrößerung sind einzelne T-Lymphozyten aus einer Wildtypmaus zu erkennen, die vor der Injektion in Wildtypmäuse mit Digoxigenin markiert worden ist. Die schwarzen Pfeile weisen auf T-Lymphozyten hin, die einen Membrankontakt zu einer DC aufweisen. (1000 x)

70

B. Effektor T-Lymphozyten in Zellzyklus und Proliferation

Eine wesentliche, in der Literatur beschriebene Funktion der DC liegt in der Auslösung von

primären oder sekundären T-Zellabhängigen Immunantworten. Dabei wird einem

T-Lymphozyt sein spezifisches Antigen in einem MHC-Peptid-Komplex verbunden mit

kostimulatorischen Molekülen präsentiert, d.h. es erfolgt eine vollständige Aktivierung der

Zelle. Diese führt zur Proliferation und zur klonalen Expansion des spezifischen

T-Lymphozyten. Als ein Nachweis für Proliferation gilt der Einbau von BrdU, eines

Thymidinanalogons, in die DNS. Als eine weitere wichtige Funktion der DC wird das

Überleben von aktivierten, aber auch von naiven und memory T-Lymphozyten beschrieben. In

verschiedenen Modellen konnte gezeigt werden, dass T-Lymphozyten ohne den regelmäßigen

Kontakt zu DC nicht lange überleben können, sondern vermutlich durch eine

Grundaktivierung im Zellzyklus gehalten werden müssen.

Aus diesem Grunde ist im zweiten Teil der Arbeit der Fokus auf den Zellzyklus und die

Proliferation in Abhängigkeit von Membrankontakten gerichtet worden.

1. Ki-67+ T-Lymphozyten im Blut

Um Hinweise auf die Funktion der morphologisch beobachteten Membrankontakte zu

erhalten, wurde die Expression des nukleären Zellantigens Ki-67 von aktivierten T-

Lymphozyten ausgewertet. Ki-67, das durch den spezifischen Marker Mib5 nachzuweisen ist,

wird in der Ratte in der G1-Phase, der M1-Phase, der S-Phase und der M2-Phase exprimiert.

Diese Phasen werde im weiteren als „Zellzyklus“ referiert. Nach Aktivierung der T-

Lymphozyten wie unter 5.2 beschrieben, sind etwa die Hälfte der T-Lymphozyten im

Inokulum Ki-67+, d.h. sie befinden sich im Zellzyklus. Wie in Abb.9 zu erkennen ist, befinden

sich nach intravenöser Injektion in die Schwanzvene von Empfängertieren bereits nach einer

Stunde davon nur noch ein Fünftel, d.h. 10% der im Blut identifizierten Zellen, im Zellzyklus.

Dieser Wert bleibt über 9h, 24h und 96h konstant. Es ist nicht geklärt, ob sich nach einer

Stunde oder zu späteren Zeitpunkten vermehrt T-Lymphozyten in den Organen im Zellzyklus

71

befinden und ob die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und dendritischen Zellen

einen Einfluss darauf haben.

Blut

Zeit nach InjektionInokulum 1h 9h 24h 96hA

ntei

l der

Zel

len

im Z

ellz

yklu

s vo

n de

nin

jizie

rten

T-Ly

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Blu

t

0

10

20

30

40

%

60

50

Abb. 9

Zeitkinetik von injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus im Blut

Kongene T-Lymphozyten aus den Lymphknoten wurden über den TCR und CD28 polyklonal aktiviert und Empfängertieren i.v. in die Schwanzvene injiziert (siehe 5.2). Nach 1h, 9h, 24h und 96h wurden jeweils Tiere durch Entbluten getötet. Auf Blutzytospots (siehe 6.3 und 6.4) wurden durch den monoklonalen Antikörper His41 die injizierten T-Lymphozyten identifiziert. Unter diesen wurde der Anteil der Zellen ermittelt, die Mib+ waren. Dieser Antikörper erkennt das nukleäre Zellantigen Ki-67, das während des Zellzyklus (G1-M2) exprimiert wird. Es sind Mittelwert und Standardabweichung aus n= 3-7 unabhängigen Versuchen gezeigt.

72

2. BrdU+ T-Lymphozyten in der Milz

Während das nukleäre Zellantigen Ki-67 während des gesamten Zellzyklus über alle Phasen

außer G0 exprimiert wird, wird das Thymidinanalogon BrdU nur während der S-Phase des

Zellzyklus in die DNS eingebaut. Befindet sich eine Zelle in der S-Phase, so durchläuft sie in

den meisten Fällen eine aktive Zellteilung, wohingegen der Zellzyklus vorher an bestimmten

Checkpunkten gestoppt werden kann, um unkontrollierte Proliferation verhindern zu können.

Um festzustellen, inwiefern sich die eingewanderten, aktivierten Lymphozyten in der Milz

teilen, wurde den Ratten eine Stunde vor dem Entbluten BrdU appliziert (siehe 6.5). Dadurch

haben nur solche Zellen BrdU in ihre DNS einbauen können, die sich in den Organen in der

S-Phase befunden haben. Bereits 24h nach i.v. Injektion der aktivierten T-Lymphozyten waren

2,2% BrdU+ T-Lymphozyten zu finden, 72h nach der Injektion war der Anteil auf 3,3%

angestiegen. Aufgrund sehr niedriger Zellzahlen wurden die Rohdaten für 24h (n=2), für 72h

(n=10 unabhängige Versuche) zu einer Summe zusammengezogen und daran der Anteil der

BrdU+ Zellen ermittelt. Wie zu erwarten gewesen war, lag der Anteil der BrdU+ Zellen

deutlich unter den Anteilen der Ki-67+ T-Lymphozyten.

Von Interesse ist für diese Arbeit gewesen, ob die Membrankontakte zwischen den injizierten

T-Lymphozyten und den IDC in der PALS den Anteil der Zellen im Zellzyklus (Expression

von Ki-67) und den Anteil der proliferierenden Zellen (Einbau von BrdU) beeinflussen

können.

3. Die Anteile der Ki-67+ und BrdU+ T-Lymphozyten sind erhöht zu finden,

wenn Membrankontakte mit IDC in der Milz vorliegen

Wie im ersten Teil beschrieben, befinden sich 80±10% der injizierten T-Lymphozyten, aber

auch 60±5% der endogenen T-Lymphozyten in Membrankontakt mit den IDC. Abb.10 zeigt

eine 3fach Färbung der Milz, in der deutlich die T-Lymphozyten in blau und die IDC mit ihrer

charakteristischen Morphologie in braun zu erkennen sind. Die schwarzen Pfeilköpfe weisen

73

auf injizierte His41+ T-Lymphozyten hin, die in Membrankontakt zu einer IDC liegen.

Deutlich zu erkennen ist ein T-Lymphozyt mit Membrankontakt zu einer IDC, der sich durch

einen roten (BrdU+) Zellkern hervorhebt (schwarzer Pfeil). Auch endogene Zellen sind zu

beobachten, die eine rote Zellkernfärbung aufweisen (weiße Pfeilköpfe). Sie sind ein Indiz

dafür, dass sich sowohl injizierte, als auch empfängereigene Zellen zum Zeitpunkt der

Organentnahme in der S-Phase des Zellzyklus befunden haben. Im folgenden wurde

ausgewertet, ob sich vermehrt T-Lymphozyten in der S-Phase des Zellzyklus oder in allen

Phasen des Zellzyklus außer G0 nachweisen lassen, wenn sie einen Membrankontakt zu IDC

aufweisen. Dabei wurden die Zeitpunkte 24h und 72h nach der Injektion der T-Lymphozyten

ausgewählt, da sich frühestens nach 24h die DNS-Replikation und nach 48h die Zellteilung

nachweisen lassen.

3.1. T-Lymphozyten, die in der Milz einen Membrankontakt zu IDC aufweisen,

befinden sich signifikant erhöht im Zellzyklus und in der S-Phase

Vergleicht man in der Milz die injizierten T-Lymphozyten, die einen Membrankontakt mit

IDC haben, mit solchen, die keinen haben, so lässt sich sowohl bei Ki-67+ Zellen, wie auch

bei den BrdU+ Zellen ein signifikanter Unterschied feststellen. Wie es in Abb.11 zu erkennen

ist, sind bereits 24h nach der Injektion 28,9±7,3% der T-Lymphozyten mit einem Kontakt Ki-

67+ gegenüber 20,2±8,9% T-Lymphozyten ohne Kontakt zu einer IDC. In der Darstellung der

Einzeltiere wird deutlich, dass zwar die Anteile der Zellen im Zellzyklus zwischen 20 bis 50%

schwanken können, aber doch deutlich mehr Zellen mit Kontakt das Ki-67-Antigen

exprimieren. 72h nach der Injektion sinkt der Anteil der Zellen im Zellzyklus auf 13±5,1% ab,

aber auch hier befinden sich signifikant mehr Zellen im Zellzyklus, wenn sie gleichzeitig

einen Membrankontakt zu einer IDC aufweisen. Der Anteil der T-Lymphozyten, die während

der S-Phase BrdU eingebaut haben, liegt deutlich niedriger: nach 24h bei etwa 8%, nach 72h

bei noch etwa 4%. Doch auch hier lässt sich ein signifikanter Unterschied feststellen, wenn

man Zellen mit und ohne Kontakt vergleicht. Diese Ergebnisse scheinen darauf hinzuweisen,

74

dass T-Lymphozyten auf Kontakte zu IDC angewiesen sind, um im Zellzyklus zu verbleiben

und in geringerem Maße zu proliferieren.

Abb. 10

Injizierte, proliferierende T-Lymphozyten befinden sich in Membrankontakten zu IDC. Auf einem Gewebeschnitt der Rattenmilz ist ein Ausschnitt der PALS gezeigt. Die Milz wurde 72 Stunden nach Injektion von polyklonal über den TCR und CD28 aktivierten T-Lymphozyten entnommen (s.5.2. und 5.3.). Eine Stunde zuvor wurde den Tieren BrdU i.v. in die Schwanzvene injiziert, um die Proliferation von Zellen nachweisen zu können. Die injizierten T-Lymphozyten zeigen durch die Anfärbung mit dem mAb His41 eine intensive blaue Membranfärbung. IDC sind über ihre hohe Expression des ICAM-1 in braun dargestellt. Proliferierende Zellen zeigen durch den Nachweis des während der S-Phase in die DNS eingebauten BrdU eine intensive rote Kernfärbung. Deutlich zu erkennen ist ein injizierter T-Lymphozyt in Membrankontakt zu einer IDC, der einen intensiv roten, BrdU+ Zellkern aufweist (schwarzer Pfeil). Die schwarzen Pfeilköpfe verweisen auf Membrankontakte zwischen den injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Auch endogene Zellen haben BrdU eingebaut und weisen eine rote Kernfärbung auf (weiße Pfeilköpfe). (APAAP-Technik, 1000fache Vergrößerung)

75

24h nach Injektion

Membrankontakt zu dendritischen Zellen

ohne mit

Ki-6

7+ T-L

ymph

ozyt

en a

n de

n in

jizie

rten

T-L

ymph

ozyt

en [%

]

10

20

30

40

50

72h nach Injektion

20.2 + 8.9

28.9 + 7.3

* |__________|

0.8 1.2

ohne mit

5

10

15

20

8.6 + 4.4

13.0 + 5.1

* |___________|

Abb. 11

T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC weisen einen erhöhten Anteil von

Ki-67+Zellen auf.

Jeweils 24h und 72h nach Injektion von aktivierten T-Lymphozyten wurde die Milz entnommen, tiefgefroren und T-Lymphozyten und IDC immunhistochemisch anfärbt. Zusätzlich wurden Zellen, die sich im Zellzyklus befinden, über das nukleäre Zellkernantigen Ki-67 (mAb Mib5) nachgewiesen. Der Prozentsatz (y-Achse) gibt an, welcher Anteil der His41+ Lymphozyten sich im Zellzyklus befindet. Die x-Achse gibt Auskunft, ob die T-Lymphozyten Membrankontakt gezeigt haben. Signifikant mehr T-Lymphozyten befinden sich im Zellzyklus, wenn sie einen Kontakt zu einer IDC aufweisen. Zusätzlich sind Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben worden, die allerdings aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe zusammengefasst worden sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=5-6 unabhängigen Versuchen. Das Sternchen (*) verweist auf eine Signfikanz von p<0,05, die mit dem Wilcoxon-Test berechnet wurde.

76

72h nach Injektion

Membrankontakt zu dendritischen Zellen

ohne mit

Brd

U+ T-

Lym

phoz

yten

unt

er d

en in

jizie

rten

T-L

ymph

ozyt

en [%

]

2

4

6

8

10

|__________|

*2.0 + 0.5

3.9 + 1.0

24h nach Injektion

ohne mit

2

4

6

8

10

0.5 0.8

7.8 + 1.1

4.9 + 1.1

Abb. 12

T-Lymphozyten mit einem Membrankontakt mit IDC sind zu einem erhöhten Anteil BrdU+.

Wie für Abb. 11 beschrieben wurden T-Lymphozyten polyklonal aktiviert, injiziert und nach 24h und 72h die Milz entnommen und tiefgefroren. Injizierte T-Lymphozyten wurden über den mAb His41 und die IDC über ICAM-1 identifiziert. Zusätzlich wurden Zellen, die sich in der S-Phase befanden, über das Thymidinanalogon BrdU nachgewiesen. Der Prozentsatz gibt an, welcher Anteil der His41+ Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC haben, sich in der S-Phase befindet. Signifikant mehr T-Lymphozyten proliferieren, wenn sie einen Kontakte zu einer IDC aufweisen. Zusätzlich sind Daten nach Injektion von naiven und memory T-Lymphozyten erhoben worden, die allerdings aufgrund von sehr geringen Zellzahlen aus n=5 Versuchen zu einer Summe zusammengefasst worden sind (schwarze Raute). Gezeigt sind Einzeltiere aus n=2-10 unabhängigen Versuchen. (*, p<0,05; Wilcoxon-Test)

77

3.2. Ki-67+ T-Lymphozyten sind gleichmäßig über die PALS verteilt, T-Lymphozyten

mit BrdU-Einbau befinden sich hingegen vorwiegend im äußeren Anteil der PALS.

Wie in Abb.5 gezeigt wurde, finden Membrankontakte von T-Lymphozyten zu B-

Lymphozyten vorwiegend im äußeren Anteil der PALS statt. Auf ihrer Wanderung gelangen

sowohl T-, als auch B-Lymphozyten in diesen Randbereich zwischen Follikeln und PALS.

Die Kontakte zwischen CD4+ T-Lymphozyten und B-Lymphozyten sind entscheidend für die

Einleitung einer humoralen Immunantwort, also der Enddifferenzierung der B-Lymphozyten

in Plasmazellen und der Produktion von spezifischen Antikörpern. Nach ihrer Aktivierung im

inneren Anteil der PALS wandern T-Helferzellen in den äußeren Anteil der PALS und in die

Follikel, wo sich Antigen-spezifische B-Lymphozyten befinden. Betrachtet man nun in

Abb.13 den Anteil der injizierten Lymphozyten, die einen Membrankontakt zu IDC

aufweisen, in Abhängigkeit von der Lokalisation, also dem inneren oder äußeren Anteil der

PALS, so lässt sich feststellen, dass sich im äußeren Anteil mehr Lymphozyten in der S-Phase

(BrdU+) befinden als im inneren Anteil. Im Gegensatz dazu lässt sich bei Lymphozyten im

Zellzyklus (Mib5+) kein signifikanter Unterschied feststellen. Etwa 30% der T-Lymphozyten

befinden sich in der gesamten PALS gleichmäßig verteilt im Zellzyklus. Eine mögliche

Erklärung für dieses Ergebnis könnte die gegenseitige Aktivierung der CD4+ T-, wie auch der

B-Lymphozyten in diesem Randbereich der PALS sein, der zu einem erhöhten Anteil an

BrdU+ Zellen unter den injizierten T-Lymphozyten führen könnte.

78

72h nach Injektion

2

4

6

8

10

12 |____________|

**

BrdU + T-Lymphozyten

innere äußere

Antei

l der

Mib

+ T-

Lymp

hozy

tenan

injiz

ierten

T-Ly

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10

20

30

40

50

innere äußere

10

20

30

40

50

Ki-67 + T-Lymphozyten

24h nach Injektion

Lokalisation der injizierten T-Lymphozytenin der PALS der Milz

Antei

l der

Brd

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-Lym

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an in

jizier

ten T

-Lym

phoz

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2

4

6

8

10

12

79

Abb. 13

In der äußeren PALS befinden sich signifikant mehr BrdU+ T-Lymphozyten als in der inneren

PALS, wohingegen sich kein Unterschied der Verteilung der Ki-67+ T-Lymphozyten feststellen

lässt.

Jeweils 24h und 72h nach Injektion von kongenen, polyklonal aktivierten T-Lymphozyten wurde die Milz entnommen und Immunhistologien angefertigt. Der Nachweis der T-Lymphozyten wurde über den mAb His41, der DC über die Expression von ICAM-1 geführt. Zellen in der S-Phase wurden durch den Einbau von BrdU, das eine Stunde vor der Organentnahme i.v. injiziert wurde, nachgewiesen. Zellen im Zellzyklus wurden hingegen durch das Zellzyklus-assoziierte Zellkernantigen Ki-67 (Antikörper Mib5) identifiziert. Es wurde ausgewertet, welcher prozentuale Anteil der injizierten T-Lymphozyten, die einen Kontakt zu DC aufweisen, sich in der S-Phase oder im Zellzyklus befindet. Bei der Auswertung wurde zusätzlich unterschieden, ob sich die injizierten Zellen im inneren (Mitte) oder äußeren Bereich (Peripherie) der PALS befanden. Angegeben sind die Werte von Einzeltieren aus jeweils n=2-10 unabhängigen Versuchen. Die Signifikanz (**, p<0,02) wurde mit dem Wilcoxon-Test für nicht parametrische Tests ermittelt. Für 24h (BrdU) ließ sich aufgrund der geringen Anzahl der Versuche keine Signifikanz ermitteln.

80

V. Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Anzahl der Membrankontakte zwischen T-

Lymphozyten und dendritischen Zellen (DC) in vivo in den T-Zellarealen der sekundär

lymphatischen Organen zu untersuchen. DC werden eine essentielle Rolle in der T-

Zellaktivierung (BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998)), dem Überleben der T-

Lymphozyten in Abhängigkeit der peripheren MHC-Präsentation (BEUTNER u.

MACDONALD, 1998; BROCKER, 1997; DANIEL et al., 1998), der peripheren Toleranz

(STEINMAN et al., 2000a), der Tumorimmunität (SCHULER u. STEINMAN, 1997) und der

Entwicklung von Autoimmunität (DELEMARRE et al., 1999; LUDEWIG et al., 1999b)

zugeschrieben. Um diese vielfältigen Aufgaben wahrnehmen zu können, benötigen die Zellen

jedoch den Kontakt zueinander. Bisherige Daten zur physikalischen Interaktion sind

vorwiegend aus Kultursystemen in vitro (GEIJTENBEEK et al., 2000; POPE et al., 1995)

oder aus adoptiven Transfermodellen (TANCHOT u. ROCHA, 1998) bekannt geworden. In

diesen, wie auch in anderen Untersuchungen zur Interaktion von T-Lymphozyten mit

dendritischen Zellen (BOTTOMLY, 1999; RISSOAN et al., 1999; SCHUHBAUER et al.,

2000), aber auch zur Interaktion mit B-Lymphozyten (DEFRANCO, 1988; GARSIDE et al.,

1998; KUSHNIR et al., 1998), mit Makrophagen (UNDERHILL et al., 1999), mit Mastzellen

(MEKORI u. METCALFE, 1999) oder mit Endothelzellen (JANCIC et al., 1998) bleibt

unbekannt, welche Anzahl von Membrankontakten stattfindet. Diese Größenordnung der

Membrankontakte kann zu einem grundlegenden Verständnis über die Kommunikation der T-

Lymphozyten mit ihrer Umgebung führen.

1. Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und IDC stellen ein

konstantes Phänomen dar.

Identifizierung der T-Lymphozyten und der interdigitierenden dendritischen Zellen

Bei den Untersuchungen für diese Arbeit wurde auf Gewebeschnitten der Rattenmilz die

Membrankontakte von T-Lymphozyten mit DC in vivo analysiert. Als Grundlage dieser Arbeit

wurde das etablierte, kongene Modell (WONIGEIT, 1979) eingesetzt, da es eine

81

Identifizierung injizierter T-Lymphozyten erlaubte, ohne eine vorherige Markierung der

Zellen vornehmen zu müssen. So blieben die Oberflächenmoleküle auf den Zellen

unbeeinträchtigt und ermöglichten immunhistochemische Mehrfachfärbungen.

Durch die Verwendung von immunhistologischen Färbungen konnten T-Lymphozyten, sowie

DC in den Kompartimenten und die Anzahl der Membrankontakte zwischen den beiden

Zelltypen in vivo nachgewiesen werden. DC in den T-Zellarealen der lymphatischen Organe,

auf die in dieser Arbeit Bezug genommen wurde, werden aufgrund ihrer charakteristischen

Morphologie mit zahlreichen Zellausläufern auch als interdigitierende dendritische Zellen

(IDC) bezeichnet (STEINMAN et al., 1997). Neben der Morphologie und der Lokalisation

exprimieren IDC, die durch ihre Kapazität zur Auslösung einer T-Zellabhängigen

Immunantwort einen reifen Phänotyp der DC darstellen, MHC Klasse II und

Adhäsionsmoleküle wie das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) auf ihrer

Zelloberfläche. Mit Antikörpern gegen ICAM-1 oder gegen den MHC Klasse II konnten so

die IDC gut identifiziert werden, obwohl bisher kein spezifischer Antikörper in der Ratte

bekannt ist. Es konnten mit beiden Antikörpern gleiche Anteile an Membrankontakten

festgestellt werden (etwa 80%), wobei im weiteren der Antikörper gegen ICAM-1 verwendet

worden ist. Bei der Auswertung von Immunhistologien bleibt die Morphologie der Organe

erhalten und ermöglicht so eine Zuordnung der Zellen in bestimmte Kompartimente. Im

Gegensatz hierzu werden beim Einsatz von durchflußzytometrischen (FACS ) Messungen die

Zellen aus ihren Gewebeverbänden herausgelöst betrachtet (WESTERMANN u. PABST,

1992). Membrankontakte, wie sie im Falle dieser Arbeit beschrieben werden, können so nicht

ausgewertet werden.

Probleme beim Nachweis der Membrankontakte

Wenn man 24h nach der Injektion die periarterioläre lymphatische Begleitscheide (PALS) der

Milz immunhistologisch betrachtet, befinden sich 80% der T-Lymphozyten in

Membrankontakt zu IDC. Die bei der Darstellung der Zellen verwendete APAAP-Technik

kann durch die Signalverstärkung über Brückenantikörper zu einem Farbniederschlag führen.

Es ist nicht auszuschließen, dass sich dadurch ein Farbring um die Zellen bildet, der in die

Wertung der Zellkontakte eingeht und zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Der Einsatz der

82

konfokalen Mikroskopie ermöglicht die Darstellung ganzer T-Lymphozyten und eine

Minimierung der Farbniederschläge. In der konfokalen Mikroskopie konnten über 60%

Membrankontakte zwischen den T-Lymphozyten und IDC beobachtet werden. Um eine

bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse der Immunhistologie mit der konfokalen

Mikroskopie zu erreichen, wurden computergestützt durchschnittlich 15 Schichten von 0,5µm

Dicke durch eine Histologie gelegt (gescannt). Davon wurden die 9 mittleren Schichten

ausgewählt und übereinander projiziert, so dass diese „Teilprojektion“ einem Gewebeschnitt

im Durchlichtmikroskop entsprach. Dieses Vorgehen ermöglichte es, einzelne Zellen

auszuwählen, erst in der Teilprojektion Membrankontakte festzustellen und diese nachfolgend

in den unter- und oberhalb liegenden Schichten zu verfolgen. Interessanterweise ließ sich bei

diesem Vorgehen feststellen, dass von den 40% der T-Lymphozyten, die in der Teilprojektion

keinen Membrankontakt hatten, noch etwa die Hälfte unter- und oberhalb der Teilprojektion

Membrankontakt zu einer IDC hatte. Finden wir also in der Immunhistologie 80%

Membrankontakte, die zum Teil durch Farbniederschläge um die Zellen zustande kommen

können, so können wir doch aus den Ergebnissen der konfokalen Mikroskopie schließen, dass

weit über 60% der T-Lymphozyten Membrankontakte aufweisen müssen. Überlappungen

(falsch-positive Ergebnisse), d.h. dass durch die Lichtführung im Mikroskop Zellen einen

Kontakt aufweisen, die sich auf unterschiedlichen Ebenen befinden, ließen sich in nur weniger

als 5% der Fälle nachweisen. Die Vorhersage, dass sich eine T-Zelle in der Teilprojektion in

Kontakt zu einer DC befindet, trifft mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit zu. Durch diese

Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass sich der Hauptteil der in der Milz

einwandernden naiven T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC befindet.

Naive, Effektor und CD4+ Gedächtnis T-Lymphozyten weisen in allen lymphatischen

Organen zu 80% Membrankontakte mit IDC auf.

Übereinstimmend mit der Beobachtung, dass in allen sekundär lymphatischen Organen ein

dichtes Netzwerk von IDC durch die T-Zellareale ausgebildet wird, durch das die T-

Lymphozyten kontinuierlich rezirkulieren (STEINMAN et al., 1997), befinden sich jeweils

etwa 80% Membrankontakte zwischen injizierten T-Lymphozyten und den IDC. Keinen

Einfluss scheint auch die Herkunft der Antigene zu haben, da die Milz Antigene aus dem Blut,

83

die Lymphknoten aus den von ihnen drainierten Geweben und die Peyerschen Platten über M-

Zellen aus dem Darm erhalten (JANEWAY et al., 1999). Den sekundär lymphatischen Organe

ist die Aufgabe gemein, durch ihre spezialisierte Aufteilung in T- und B-Zellkompartimente

die Auslösung und Regulation von Immunantworten zu unterstützen und zu erleichtern. In den

lymphatischen Organen wird ein konzentriertes Zusammentreffen von T-Lymphozyten auf der

Suche nach ihrem spezifischen Antigen und Antigen-spezifischen IDC ermöglicht.

Mit der Aktivierung der T-Lymphozyten gehen phänotypische Veränderungen einher, die mit

einer Veränderung der Expression von Adhäsionsmolekülen und Aktivierungsmarkern

verbunden ist (BODE, 1998). Damit unterscheiden sich Effektor T-Lymphozyten deutlich von

naiven T-Lymphozyten. Memory T-Lymphozyten in der Ratte werden durch die niedrige

Expression des CD45RC von naiven T-Lymphozyten unterschieden, wobei nach neueren

Erkenntnissen ein Teil der memory T-Lymphozyten wieder die hohe Isoform des CD45RC

exprimieren kann (BELL u. SPARSHOTT, 1990). Da Adhäsionsmoleküle für die spezifische

Einwanderung in lymphatische oder nicht-lymphatische Organe und für die Interaktion mit

anderen Zellen wie auch den DC verantwortlich gemacht werden, wurden naive, Effektor und

memory T-Lymphozyten auf die Anzahl ihrer Membrankontakte zu IDC untersucht. Bislang

gibt es in der Literatur keine Daten zu der Anzahl der Membrankontakte zwischen T-

Lymphozyten und DC. Aufgrund der Reexpression der hohen Isoform des CD45RC kann eine

„Verunreinigung“ der hier betrachteten naiven Zellpopulation nicht vollständig

ausgeschlossen werden. Da sich aber die Membrankontakte zwischen naiven und memory T-

Lymphozyten mit den IDC nicht signifikant unterscheiden, ist diese Verunreinigung

höchstwahrscheinlich nicht relevant.

Membrankontakte endogener T-Lymphozyten

Da sich kongene, injizierte T-Lymphozyten wie empfängereigene T-Lymphozyten verhalten,

müssten auch endogene T-Lymphozyten in hohem Maße Membrankontakte zu DC aufweisen.

In den T-Zellarealen liegen endogene T-Lymphozyten dicht gedrängt beieinander, was sich

durch eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin darstellen lässt. Ein Hauptteil der endogenen T-

Lymphozyten (über 60%) liegt ebenfalls in Membrankontakt mit den ICAM-1-positiven IDC.

Dieses unterstützt die aus der Elektronenmikroskopie gewonnenen Beobachtungen, dass IDC

ein Netzwerk formen, durch das die T-Lymphozyten kontinuierlich rezirkulieren und so

84

spezifische Klone für das präsentierte Antigen herausfiltern können (STEINMAN et al.,

1997). Die niedrigere Frequenz (60% versus 80%) der Membrankontakte im Vergleich zu den

injizierten T-Lymphozyten kann teilweise durch die fehlende Färbung der T-Lymphozyten

erklärt werden, da nur die IDC durch den ICAM-1 Antikörper nachgewiesen werden.

Auswirkung der Membrankontakte auf die T-Lymphozyten

Interessant sind diese Ergebnisse im Hinblick darauf, dass die Aktivierungsstadien der T-

Lymphozyten, wie sie hier beobachtet worden sind, unterschiedliche Ansprüche an die

Membrankontakte stellen. So sind naive T-Lymphozyten abhängig von der Präsentation ihres

spezifischen Antigens in Zusammenhang mit einem MHC-Peptid-Komplex und

kostimulatorischen Molekülen, um zu proliferieren, sich in Effektorzellen zu differenzieren

(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998) und benötigen damit den ständigen Kontakt zu

zahlreichen IDC in den lymphatischen Organen. Effektor T-Lymphozyten sind bereits

aktiviert und potentiell schädlich für den Organismus. Nach erfolgreicher Eliminierung des

Antigenstimulus ist es wichtig, die Ansammlung einer großen Anzahl von Effektorzellen zu

verhindern. Zur Aufrechterhaltung der Homöostase wird nach Aktivierung des TCR das Fas-

Molekül (CD95) hochreguliert. Die Bindung von Fas/CD95 durch FasL/CD95L auf den IDC

führt zur Aktivierung des programmierten Zelltods (Apoptose) und damit zur Beendigung der

Immunantwort (VAN PARIJS u. ABBAS, 1998).

Memory T-Lymphozyten, die bei einer Sekundärantwort schneller Effektorfunktionen

(Sekretion von IFN-γ, IL-4, IL-5 nach 12-24h, Proliferation bei geringen Antigen-

Konzentrationen) exprimieren können, könnten durch die Membrankontakte mit IDC in

Abwesenheit des Antigens überleben (LONDON et al., 1999). Aber auch für die Auslösung

einer sekundären Immunantwort benötigen memory T-Lymphozyten die Präsentation des

spezifischen Antigens durch eine IDC. Auch die unterschiedliche Herkunft und Behandlung

der naiven, memory (Ductus thoracicus durch Separation) und Effektor (Lymphknoten durch

polyklonale Aktivierung über den T-Zellrezeptor und CD28) T-Lymphozyten scheint für das

Phänomen der Membrankontakte eine untergeordnete Rolle zu spielen.

85

Dynamik der Membrankontakte

Die T-Zellareale können nach Betrachtung der Membrankontakte von naiven, memory und

Effektor T-Lymphozyten mit IDC als Kompartimente eingeordnet werden, in denen die

Membrankontakte ein sehr robustes Phänomen darstellen. IDC bilden dabei ein dichtes

Netzwerk aus, durch das sich die T-Lymphozyten während ihrer Wanderung bewegen und

zahlreiche Kontakte aufnehmen können. GUNZER et al. (2000) konnten in einem 3-D-

Kollagengel ebenfalls zeigen, dass sich T-Lymphozyten in ständigem Kontakt zu IDC

befinden. Interessanterweise konnten sie zeigen, dass die Kontakte dynamischer Natur (im

Minutenbereich) sind und T-Lymphozyten von einer IDC zur nächsten wandern, bevor sie

aktiviert werden. Dieses Modell könnte eine Erklärung für die hohe Anzahl Membrankontakte

bieten, die sich in vivo finden lassen. LORD et al., (1999) berechnen über die

Dissoziationskonstanten der beteiligten Moleküle ein kinetisches Modell, in dem durch die

niedrige Affinität viele verschiedene Antigen-präsentierende Zellen abgesucht werden

können. Die von uns gemachte Beobachtung, dass zu verschiedenen Zeitpunkten 80% der T-

Lymphozyten Membrankontakte mit IDC in einem Antigen-unspezifischen Modell aufweisen,

unterstützt diese dynamische Sicht. Die Anzahl der Membrankontakte ist unabhängig von den

verschiedenen beobachteten Zeitpunkten (24h, 48h, 72h und 96h) der Untersuchung. Diese

Feststellung lässt vermuten, dass diese Kontakte zu jeder Zeit stattfinden.

Übereinstimmend mit der hohen Anzahl der Membrankontakte ist die Beobachtung von

vorübergehenden, kurz andauernden (transienten) Kontakten zwischen T-Lymphozyten und

DC, wenn kein spezifisches Antigen präsentiert wird (HAUSS et al., 1995; INGULLI et al.,

1997). Die transiente Bindung der Zellen könnte erklären, wie T-Lymphozyten während ihrer

Wanderung durch die lymphatischen Gewebe eine möglichst hohe Anzahl von DC nach ihrem

Antigen absuchen können.

Keine Ausbildung von Zellaggregaten (Kluster) von T-Lymphozyten mit IDC im in vivo

Modell

Die Möglichkeit zur physikalischen Überwachung und Beobachtung der anatomischen

Lokalisation von T-Lymphozyten und IDC in den Kompartimenten der lymphatischen

Organen erlaubt einige Schlussfolgerungen in Hinblick auf die Antigen-Präsentation in vivo in

den Geweben. So wird aus verschiedenen Studien berichtet, dass IDC Zellaggregate (Kluster)

86

mit T-Lymphozyten (INGULLI et al., 1997; KUDO et al., 1997) oder B-Lymphozyten

(DUBOIS et al., 1997; KUSHNIR et al., 1998) ausbilden. In dieser Miniaturumgebung

können IDC die Proliferation von ruhenden T-Lymphozyten einleiten, wobei die Ausbildung

der Zellaggregate ein Adhäsionsmolekül abhängiges Phänomen zu sein scheint. In der

untersuchten Antigen-unspezifischen Situation lassen sich hingegen keine oder nur sehr kleine

Kluster (weniger als 5 T-Lymphozyten/IDC) zwischen den injizierten T-Lymphozyten und

den IDC finden. Das Fehlen von großen Klustern mit mehr als 5 T-Lymphozyten an einer IDC

im Gewebe kann durch verschiedene Beobachtungen erklärt werden. Die

Wanderungsdynamik der T-Lymphozyten im Gewebe vermindert das stabile Binden an die

IDC und favorisiert das Ablösen der Zellen. Die Beweglichkeit der T-Lymphozyten ist stark

erhöht und ist in der Gegenwart von IDC verlängert, vermutlich hervorgerufen durch

Zytokine, die von den IDC sezerniert werden (TANG und CYSTER, 1999). Diese locken

nicht nur naive oder Effektor T-Lymphozyten in IDC-enthaltende Kompartimente, sondern

fördern auch eine ungerichtete Migration in den Kompartimenten. Auch wurde vorwiegend

aus Antigen-spezifischen in vitro Kulturen über die Ausbildung von Klustern berichtet. In

diesen Kulturen fehlt jedoch die dreidimensionale Miniaturumgebung mit extrazellulärer

Matrix und retikulären Zellen, die das Grundgerüst der Organe stellen und die

Wanderungsdynamik und die Position von wandernden Zellen deutlich beeinflusst. GUNZER

et al. (2000) konnten in einem, dem Gewebe nachgeahmten 3D-Kulturgel ebenfalls keine

Ausbildung von Klustern feststellen.

Vergleich der Membrankontakte im Rattenmodells mit einem Mausmodell

Es stellt sich die Frage, ob es sich bei den bisher nachgewiesenen Membrankontakten

zwischen T-Lymphozyten und IDC um speziesspezifische Effekte in der Ratte handeln kann.

Um einen Vergleich zu den Immunhistologien der Ratte erstellen zu können, wurden die

Membrankontakte der endogenen T-Lymphozyten (Gegenfärbung mit Hämatoxylin) mit IDC

in der Maus ausgewertet, die über einen Antikörper gegen DEC-205 (NLDC-145)

nachgewiesen worden sind. Endogene T-Lymphozyten in der Maus weisen zu etwa 60%

Membrankontakte zu diesen IDC in der Milz auf. Dabei ist allerdings zu beachten, dass DC

keine phänotypisch oder funktional einheitliche Gruppe bilden (GRABBE et al., 2000).

Diskutiert wird dabei zum einen die Abstammung von einer myeloiden Stammzelle, die sich

87

unter verschiedenen Kulturbedingungen sowohl in Makrophagen (M-CSF), als auch bei

Zugabe des GM-CSF und verschiedenen Zytokinen wie IL-4 oder TGF-β in dendritische

Zellen differenzieren kann. Aber auch die Abstammung von einer lymphoiden Stammzelle,

die sich in Lymphozyten und DC differenzieren kann, konnte nachgewiesen werden. In der

Milz werden lymphoide und myeloide DC-Populationen aufgrund der Expression von CD8α,

33D1 und DEC-205 unterschieden (SALOMON et al., 1998). So sind DC der myeloiden

Abstammung, Cd8α-, DEC-205-/low CD11b+, vorwiegend in der Marginalzone anzutreffen.

Diese führen zur Produktion eines unterschiedlichen Zytokinprofils in T-Lymphozyten und

sind verantwortlich für die Einleitung von T-Zellabhängigen Immunantworten. Lymphoide

DC, Cd8α+, DEC-205+ CD11b-, die zu hohen Anteilen in Milz, Thymus, Lymphknoten und

Peyersche Platten anzutreffen sind, sind für die Induktion von Toleranz zuständig (CELLA et

al., 1997). Finden wir also in der Maus eine Größenordnung von 60% Membrankontakten, so

könnte eine Begründung sein, dass der verwendete Antikörper DEC-205 nur DC der

myeloiden Abstammung erfasst. Im Gegensatz zu den spezifischen Markern in der Maus,

exprimieren alle IDC eines reifen Phänotyps ungeachtet ihrer Herkunft oder Funktion hohe

Level an MHC Klasse I und II und kostimulatorische Moleküle wie ICAM-1

(BANCHEREAU u. STEINMAN, 1998). Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Definition

der IDC und einem einheitlichen spezifischen Marker für IDC in der Ratte ist deshalb die

Arbeit auf den ausgereiften Phänotyp beschränkt und ermöglicht dadurch eine eindeutige

Identifikation. In diesem Sinne ist es von Vorteil gewesen, sich die Expression von ICAM-1

und MHC Klasse II zunutze zu machen, die, unabhängig von der myeloiden oder lymphoiden

Abstammung oder den Kulturbedingungen, auf allen IDC des reifen Phänotyps einheitlich ist.

In der Ratte scheint der Unterschied zwischen verschiedenen Phänotypen der DC keinen

Einfluss auf die Anzahl der Membrankontakte zu haben.

88

2. Funktion von LFA-1 bei Membrankontakten im Mausmodell

Um besser verstehen zu können, wie die Membrankontakte zwischen T-Lymphozyten und

DC, die bisher in der Immunhistologie und der konfokalen Mikroskopie betrachtet worden

sind, in vivo zustande kommen und zu bewerten sind, wurde die Rolle des

Leukozytenfunktionsantigens-1 (LFA-1) untersucht.

Mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Wildtypzellen und LFA-1-defiziente Zellen wurden

gleichzeitig in Wildtypmäuse injiziert. Nach 2h wurden die Membrankontakte zu DC in der

Milz betrachtet. Obwohl LFA-1 eine Schlüsselrolle bei der Zelladhäsion zugeschrieben wird

(DEETHS u. MESCHER, 1999), befanden sich sowohl die Wildtypzellen, als auch die

LFA-1-defizienten Zellen zu etwa 60% in Membrankontakt zu DC. Das fehlende LFA-1 auf

den T-Lymphozyten scheint den Anteil der Membrankontakte nicht zu beeinflussen. Eine

Erklärung für diese Befunde könnte sein, dass auch DC das LFA-1-Molekül und

T-Lymphozyten den Bindungspartner ICAM-1 exprimieren. Erst durch den zusätzlichen

Einsatz von Antikörpern gegen LFA-1 oder ICAM-1 könnte in einem weiteren

Versuchsansatz der Einfluss des LFA-1 auf die Kontakte deutlicher gezeigt werden. Aber wie

SWARTE et al. (1998) zeigen konnten, wird auch über L-Selektin ein Kontakt zwischen

Zellen ausgebildet, was auf eine gewisse Redundanz der Zelladhäsion schließen läßt. Auch

weitere Liganden-Rezeptorenpaare wie CD2/ LFA-3, CD28/ CD80 und CD40/ CD40L

können die Antigen-unabhängige, transiente Bindung zwischen T-Lymphozyten und DC in

Abwesenheit des LFA-1-Moleküls vermitteln (HAUSS et al., 1995).

3. Membrankontakte beeinflussen den Anteil der Ki-67+ und BrdU+

T-Lymphozyten

Die Proliferation der injizierten Effektor T-Lymphozyten wurde über die Expression des

Zellzyklus-assoziierten Zellkernantigen Ki67 dargestellt, das über den gesamten Zellzyklus

(G1-M2) hindurch exprimiert wird (GERLACH et al., 1997). Ein weiterer Nachweis der

Proliferation ist der Einbau von BrdU, das während der S-Phase des Zellzyklus in die DNS

89

eingebaut wird. Bei der Untersuchung der Proliferation der injizierten Effektor T-

Lymphozyten zeigte sich, dass zu allen Beobachtungszeitpunkten Proliferation in der PALS

nachweisbar war (Daten nicht gezeigt). Im Inokulum befindet sich ein Anteil von 50% der T-

Lymphozyten im Zellzyklus, jedoch sind im Blut nach bereits 1h und zu späteren Zeitpunkten

nur noch 10% der injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus nachzuweisen. Das entspricht der

Beobachtung, dass nach Aktivierung von T-Lymphozyten etwa 70% dieser Zellen innerhalb

von 24h nach Injektion absterben (BINNS et al., 1992; SMITH et al., 1980). Betrachtet man

diesen Anteil der proliferierenden T-Lymphozyten näher und in Abhängigkeit zu den

Membrankontakten, so war festzustellen, dass sich signifikant mehr injizierte T-Lymphozyten

im Zellzyklus und auch in der S-Phase befanden, wenn sie gleichzeitig einen Membrankontakt

mit einer DC aufwiesen. Nach 24h befanden sich etwa 30% der injizierten T-Lymphozyten

mit Kontakt zu einer DC im Zellzyklus, jedoch nur 20% der T-Lymphozyten, die keinen

Kontakt zu einer DC aufwiesen. Individuelle Schwankungen zwischen den Tieren sind von

20-40% zu finden, die Tendenz zeigt sich jedoch in allen untersuchten Tieren. Die Hälfte der

T-Lymphozyten ohne Membrankontakt konnte mit der Hilfe des konfokalen Mikroskops als

falsch-positiv erkannt werden. Korrigiert man die 20% der T-Lymphozyten im Zellzyklus um

diese Erkenntnis, so liegt man bei etwa 10% der injizierten Zellen im Zellzyklus, die sich auch

im Blut wiederfinden lassen.

Auch für die T-Lymphozyten in der S-Phase konnten gleiche Tendenzen gefunden werden. Es

war ein Anstieg der Zellen im Zellzyklus oder der S-Phase um 50% zu verzeichnen, wenn die

T-Lymphozyten in Membrankontakt zu IDC lagen. Auch nach 72h ist der Einfluss der

Membrankontakte auf den Zellzyklus und die S-Phase der T-Lymphozyten noch

nachzuweisen. Im Vergleich zu den Werten nach 24h sind die Werte auf etwa die Hälfte

abgefallen, bleiben in der Tendenz jedoch gleich. Auch hier finden sich signifikante

Unterschiede von T-Lymphozyten mit Membrankontakt zu IDC.

In diese Ergebnisse kann auch die Überlegung einbezogen werden, die mit dem konfokalen

Mikroskop gezeigt werden konnte. So ist zu vermuten, dass auch die Hälfte der T-

Lymphozyten im Zellzyklus oder in der S-Phase, die keinen Membrankontakt aufgewiesen

haben, ober- oder unterhalb der Schnittebene durchaus in Membrankontakt liegt. Eine weitere

Erklärung für den Prozentsatz der T-Lymphozyten im Zellzyklus ohne Kontakt kann die

Dynamik der Zell-Zellkontakte bieten, die von GUNZER et al. (2000) gefunden wurden. So

90

können die T-Lymphozyten durch zahlreiche Kontakte zu verschiedenen DC

aufeinanderfolgende Signale akkumulieren und so weiter im Zellzyklus verbleiben oder weiter

durch die S-Phase geleitet werden. Die Gewebeumgebung unterstützt die Ansammlung von

Einzelsignalen, die schlussendlich zu einer Aktivierung und Auslösung einer Immunantwort

führen kann.

Da sich im äußeren Anteil der PALS vermehrt auch B-Zellen aufhalten (STEINIGER et al.,

2000), die zu ihrer Enddifferenzierung in Plasmazellen die Hilfe von aktivierten,

Antigen-spezifischen T-Lymphozyten benötigen (DEFRANCO, 1988), stellte sich die Frage,

ob sich die Membrankontakte zwischen dem äußeren und inneren Anteil der PALS

unterscheiden und nachfolgend zu einer erhöhten Proliferation führen. Die Membrankontakte

zwischen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten belaufen sich im äußeren Bereich auf über

70%. Im inneren Bereich der PALS haben nur 20% der injizierten T-Lymphozyten

Membrankontakt zu B-Lymphozyten. Es lässt sich also vermuten, dass am Übergang der

PALS zu den Follikeln T-Lymphozyten sowohl zu DC, als auch gleichzeitig zu B-

Lymphozyten Membrankontakte haben. Diese Mikroumgebung nimmt eine Schlüsselrolle für

die Funktion der T- und B-Lymphozyten, sowie den DC während einer Immunantwort ein

(VAN ROOIJEN, 1990). T-Lymphozyten, die sich im Zellzyklus befinden, sind gleichmäßig

über beide Bereiche der PALS verteilt. Im inneren, wie im äußeren Bereich befinden sich 30%

der injizierten T-Lymphozyten im Zellzyklus, wenn sie einen Membrankontakt zu DC

aufweisen. Betrachtet man hingegen die T-Lymphozyten, die sich in der S-Phase befinden,

also eine Zellteilung durchlaufen, so finden sich nach 24h im inneren Anteil 6% der T-

Lymphozyten in der S-Phase, im äußeren sind es jedoch über 8%. Deutlicher wird dieser

Unterschied nach 72h, wenn sich nur noch 2% im inneren Bereich, aber mehr als die doppelte

Anzahl im äußeren Bereich in der S-Phase befindet. Auch zahlreiche endogene Lymphozyten,

bei denen allerdings nicht zwischen T- oder B-Lymphozyten unterschieden werden konnte,

proliferieren im äußeren Bereich der PALS. Nach Kontakt zu DC können stimulierte T-

Helferzellen im äußeren Anteil der PALS auf B-Zellen treffen und diese zur

Antikörperproduktion stimulieren. Im Zusammenspiel mit CD8+ T-Lymphozyten können sie

diese zu einer zytotoxischen Immunantwort „lizenzieren“ (LANZAVECCHIA, 1998) oder

aber Makrophagen unterstützen bei der Eliminierung von Fremdkörpern (GORDON, 1999;

JANEWAY et al.,1999).

91

Membrankontakte finden unabhängig von der Lokalisation, dem Aktivierungsstatus der T-

Lymphozyten und unabhängig vom Zeitpunkt auf einem sehr hohen Niveau statt. Mit diesen

Ergebnissen können die in verschiedenen Zelltransfermodellen ermittelten Daten in anderem

Licht betrachtet werden. So produzieren DC Chemokine, die verschiedene

Aktivierungsstadien von T-Lymphozyten, andere DC oder weitere Zelltypen anlocken können

wie z.B. das secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) (GUNN et al., 1999). Durch ständig

im Gewebe (konstitutiv) exprimierte Chemokine können DC Lymphozyten in T- und B-

Zellkompartimente unterteilen. In Anbetracht der erhobenen Daten ist es jedoch fraglich, ob

die Anlockung von T-Lymphozyten ausschließlich durch die von DC sezernierten Chemokine

zustande kommt oder ob nicht die Mikroumgebung der Kompartimente und das Netzwerk der

DC zu ersten Membrankontakten zwischen den Zellen führen. Chemokine könnten die Art

und Funktion des Kontaktes zwischen T-Lymphozyten und DC bestimmen und

Immunantworten regulieren. Dieser Frage wäre in der Fortsetzung dieser Arbeit weiter

nachzugehen.

92

VI. Zusammenfassung

Andrea Sahle

Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in den sekundär

lymphatischen Organen der Ratte

Bisher sind nur wenige in vivo Daten zu den Kontakten zwischen T-Lymphozyten und DC

erhoben worden, obwohl dem Zusammenspiel von T-Lymphozyten und dendritischen Zellen

eine ausschlaggebende Rolle bei der Kontrolle von Immunantworten und zahlreichen weiteren

Funktionen zugeschrieben wird. Dendritische Zellen werden als besonders potente Antigen-

präsentierende Zellen beschrieben, da sie in der Peripherie Antigen aufnehmen, es

prozessieren und durch ihre sehr hohe Expression von MHC und kostimulatorischen

Molekülen primäre und sekundäre T-Zellabhängige Immunantworten auslösen können.

T-Lymphozyten, die vom Blut in die Gewebe und zurück wandern können, nehmen in den

sekundär lymphatischen Organen vielfachen Kontakt zu den Antigen-tragenden DC auf.

Durch dieses System wird aus weiten Gebieten des Körpers Antigen konzentriert in den

lymphatischen Organen angeboten. Um ein sensibles Zusammenspiel zu gewährleisten,

benötigen die Zellen direkten physikalischen Kontakt und Interaktion miteinander. Es ist

jedoch bislang in keinem System analysiert worden, in welcher Anzahl die Kontakte in einer

physiologischen Situation in vivo in den Kompartimenten der lymphatischen Organe

vorkommen und durch welche Parameter sie beeinflusst werden. Diese Erkenntnis könnte zu

einem besseren Verständnis der Regulation von Immunantworten beitragen.

Um immunhistologisch nachweisen zu können, welcher Anteil von T-Lymphozyten sich in

Membrankontakt zu IDC befindet, wurden CD4+ T-Lymphozyten des kongenen

Rattenstammes LEW.7B(BH) in naive (CD45RC+) und memory (CD45RC-) Zellen separiert.

Des weiteren wurden aus dem Lymphknoten stammende T-Lymphozyten mit monoklonalen

Antikörpern über den T-Zellrezeptor und CD28 aktiviert und während der Inkubation mit

5’-Brom-2’Desoxyuridin (BrdU) markiert. Diese Zellpopulationen wurden intravenös in

LEW-Ratten (RT7a) injiziert. Nach 24h wurden die Milz, die Lymphknoten und die

93

Peyerschen Platten entnommen. Außerdem wurde die Milz zu weiteren Zeitpunkten (1h, 9h,

72h 96h) gewonnen. Es erfolgte die immunhistologische Darstellung der Membrankontakte

zwischen den T-Lymphozyten und DC in den jeweiligen T-Zellarealen (PALS, Parakortex,

interfollikuläre Region). Es zeigte sich, dass sich in vivo 80±10% der injizierten

T-Lymphozyten in Membrankontakt zu DC befindet. Dieses Phänomen lässt sich unabhängig

vom lymphatischen Organ, unabhängig vom Zeitpunkt nach Injektion und unabhängig vom

Aktivierungsstadium der injizierten T-Lymphozyten beobachten. Auch die dem Empfänger

eigenen, endogenen T-Lymphozyten befinden sich zu über 60% in Membrankontakt zu IDC.

Durch ihre langen Ausläufer bilden IDC ein dichtes Netzwerk in den T-Zellarealen und

ermöglichen eine effektive Überwachung des aus der Peripherie stammenden Antigens durch

die wandernden T-Lymphozyten.

Um ausschließen zu können, dass der hohe Anteil der Membrankontakte durch eine

Übereinanderlagerung des Farbniederschlags auf den Zelloberflächen zustande kommt,

erfolgte im weiteren eine Aufarbeitung der Immunhistologien in der konfokalen Mikroskopie.

Durch die Verwendung von Fluorochrom-markierten Farbstoffen kommt ein geringerer

Farbniederschlag zustande. Es konnte auch mit dieser Methode ein Anteil von über 65%

Membrankontakte aufgezeigt werden. Die Kontakte waren in mehr als der Hälfte der durch

die Zelle gelegten Schichten ausgebildet. In etwa 50% der Fälle ließen sich auch ober- oder

unterhalb der Schnittebene noch Kontakte feststellen. Damit konnten die hohen Anteile an

Membrankontakten in der lichtmikroskopischen Methode bestätigt werden.

Um Hinweise auf die Funktion der bislang morphologisch nachgewiesenen Membrankontakte

zu erhalten, wurden T-Lymphozyten im Zellzyklus und in der S-Phase immunhistologisch

identifiziert. Es zeigte sich, dass sich signifikant mehr T-Lymphozyten im Zellzyklus (Ki-67+)

oder in der S-Phase (BrdU+) befanden, wenn sie einen Kontakt zu einer IDC aufwiesen.

Unter Verwendung eines spezifischen Markers für DC im Mausmodell konnte gezeigt

werden, dass auch spezies-unspezifisch der Hauptteil der endogenen T-Lymphozyten in der

Milz Membrankontakt zu DC aufweist.

Im Mausmodell wurde die Rolle des Leukozytenfunktionsantigen-1 (LFA-1) getestet. Vor der

Injektion in Wildtypmäuse wurden Zellen von LFA-1-defizienten (CD11a-/-/CD18) Mäusen,

aber auch Wildtypzellen markiert und immunhistologisch in den Kompartimenten der Milz

94

nachgewiesen. Die Membrankontakte erwiesen sich als unabhängig von der LFA-1-

Expression auf den T-Lymphozyten. Da jedoch auch dendritische Zellen LFA-1 und

T-Lymphozyten das ICAM-1-Molekül auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, müsste in

weiteren Versuchen durch den Einsatz eines anti-ICAM-1-Antikörpers der Einfluss von LFA-

1 auf die Membrankontakte zwischen den Zellen untersucht werden. Aber auch weitere

Liganden-Rezeptorpaare wie CD2/ LFA-3 und CD28/ CD80 können transiente, Antigen-

unabhängige Kontakte vermitteln. Diese Redundanz der Moleküle weist darauf hin, wie

wichtig die Interaktion der Zellen im Organismus ist.

Die Wanderung der T-Lymphozyten durch das enge Netzwerk von DC in den T-Zellarealen

der sekundär lymphatischen Organe ermöglicht das Absuchen von möglichst vielen

Oberflächen (DC) nach spezifischem Antigen und damit der Regulierung und Kontrolle von

Immunantworten. Fraglich bleibt die Rolle der Chemokine bei der Anlockung der

Antigen-spezifischen T-Lymphozyten. Möglich wäre auch dynamische Aufnahme von

zahlreichen Kontakten, deren Signale kumuliert würden, um T-Lymphozyten zu aktivieren.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen eine einfache Möglichkeit auf, wie die

Regulierung und Kontrolle einer Immunantwort gewährleistet werden kann.

95

VII. Summary

Andrea Sahle

Interaction of T-lymphocytes with dendritic cells in the secondary lymphoid organs of the rat

The interaction between T lymphocytes and dendritic cells (DC) plays a major role in the

control of the immune response and in many other functions. However, few in vivo data have

been collected so far on this interaction. Dendritic cells are very potent antigen presenting

cells since they take up antigen in the periphery, process it, and thus initiate primary and

secondary T cell dependent immune responses. They do this through their high expression of

MHC and costimulatory molecules. T lymphocytes, which migrate from the blood to the

tissue and back, interact in lymphatic organs with the antigen bearing DC. Antigen from all

areas of the organism is presented in a concentrated way via this system. In order to ensure

interaction the cells need direct physical contact. It has not been studied in animals or humans

how many such contacts occur in the physiological situation in vivo in the compartments of

lymphatic organs and what parameters influence these contacts. These investigations could

lead to a better understanding of the regulation of the immune response.

In order to investigate what proportion of T lymphocytes have direct physical contact with DC

in the T cell areas of lymphatic organs, lymphocytes of congenic LEW.7B(BH) rats were

separated into naïve (CD45RC+) and memory (CD45RC-) cells. Furthermore, lymph node T

cells were stimulated with monoclonal antibodies against the T cell receptor and CD28 in the

presence of BrdU to show proliferation. These cell populations were injected iv into

LEW (RT7a) rats. Spleen, lymph node, and Peyer’s patches were removed after 24h.

Additionally, spleen was removed at various time points (1h, 9h, 72h, 96h). An

immunohistological demonstration of the membrane contacts between T lymphocytes and DC

in the respective T cell area (PALS, paracortex, interfollicular region) followed. It was shown

in the congenic rat model that in vivo 80±10% of the injected T cells had membrane contact

with DC. This phenomenon was observed independent of the lymphatic organ and T

lymphocyte subset studied. It was also independent of the time following cell injection. More

96

than 60% of the endogenous T cells also had membrane contact with DC building a network

via their long dendritic branches.

Then an analysis of the immunohistologies using a confocal microscope was performed. It

was shown that more than half of the sections through a cell revealed contact between the

cells. Furthermore, in 50% of the cases contact could still be observed above and below the

projection.

Using a mouse model the role of leukocyte function antigen-1 (LFA-1) was investigated.

Before injection into wild type mice, wild type cells or cells from LFA-1 deficient (CD11a-/-

/CD18) mice were labelled. These cells were then analysed immunohistologically in the

spleen compartments. In the mouse model, using a specific DC marker, the majority of

injected T lymphocytes also had membrane contact with DC. This contact was not dependent

on LFA-1 expression on T lymphocytes. To exclude a redundant expression of surface

molecules it would be interesting to use a monoclonal antibody against ICAM-1 or LFA-1

showing the influence of LFA-1. Meanwhile other receptor/ligand pathways, CD2/ LFA-3,

CD28/ CD80 or Cd40/ CD40L could be involved in the transient, antigen independent

contacts between T lymphocytes and DC.

Furthermore, T lymphocytes were immunohistogically identified in cell cycle (Ki-67+) and in

the S-phase (BrdU+). Significantly more T lymphocytes were in cell cycle or S-phase, ie

proliferating, when contact with a DC was observed.

Contact is important for the survival of T lymphocytes and DC and for tolerance. It is a

constant phenomenon that is not dependent on cell surface molecules such as L-selectin, IL-2,

which change upon activation of T lymphocytes and molecules such as LFA-1. During

migration T lymphocytes take up dynamic contact with DC allowing them to control the

immune response against foreign and most likely self proteins.

The migration of T lymphocytes through the tight network of DC in the secondary lymphoid

organs could show a simple mechanism to regulate and control immune responses.

97

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IX. Anhang

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Membrankontakte von T-Lymphozyten mit

dendritischen Zellen in den sekundär lymphatischen Organen der Ratte“ selbständig verfasst

habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

- die Versuche zur Kanülierung des Ductus thoracicus mit anschließender Aufreinigung

der CD4+T-Lymphozyten wurden von Frau Ulrike Geismar, Frau Dr. rer. nat. Ulrike

Bode und Herrn Prof. Dr. med. J. Westermann durchgeführt.

- Die Gewinnung von T-Lymphozyten aus peripheren und mesenterialen Lymphknoten

und anschließender Aktivierung in vitro wurde von Frau Dr. rer. nat. Ulrike Bode, geb.

Peters, als Methode etabliert und mit ihr als Verantwortlicher zusammen durchgeführt.

- Die Gefrierschnitte der Organe und die immunhistologische Färbung derselbigen

wurden mit der tatkräftigen Unterstützung von Frau I. Dressendörfer und Frau

S. Lopez-Kostka angefertigt.

- Die Konfokale Mikroskopie wurde methodisch von Frau Dr. med. Astrid Markus

etabliert. In Zusammenarbeit mit ihr wurden die immunhistochemischen Färbungen

zur Auswertung mit der konfokalen Mikroskopie erstellt.

- LFA-1-defiziente Mäuse wurden im Institut von Frau N. Hogg etabliert und gezüchtet.

LFA-1-defiziente T-Lymphozyten wurden der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr.

J. Westermann zur Verfügung gestellt.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir

unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

118

Ich habe die Dissertation an der folgenden Institution angefertigt:

- Abteilung für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule

Hannover

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Eigenhändige Unterschrift:

119

Aus Prioritätsgründen wurden Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit vorgestellt:

Vorträge

SAHLE, A., U. BODE, E. B. BELL, R. PABST, J. WESTERMANN

Interaktion von naiven, aktivierten und memory T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen in

T-Zellarealen von lymphatischen Organen.

94. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft, Hamburg, 26.-29.03.1999

WESTERMANN, J., A. SAHLE

Interaktion von dendritischen Zellen und T-Lymphozyten Subpopulationen in vivo.

22. Arbeitstagung Norddeutscher Immunologen, Borstel, 10.12.1999

Poster

SAHLE, A., U. BODE, E. B. BELL, R. PABST, J. WESTERMANN

Interaction of naive, activated and memory T cells with interdigitating dendritic cells in

lymphoid organs.

30. Tagung der Deutsche Gesellschaft für Immunologie, Hannover , 29.09.-02.10.1999

(Immunobiol. 200, S.445-6, 1999)

120

Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. R. Pabst danke ich für die freundliche Überlassung des Themas, die

guten technischen Voraussetzungen bei der Durchführung dieser Arbeit und die Bereitstellung

der notwendigen Räumlichkeiten.

Bei Herrn Prof. Dr. med. vet. H.-J. Hedrich möchte ich mich für die freundliche Übernahme

der wissenschaftlichen Betreuung bedanken.

Bei Herrn Prof. Dr. med. J. Westermann möchte ich mich ganz besonders für die gute

Betreuung und die stete, auch kurzfristige Bereitschaft zur Diskussion und Kritik bedanken.

Ich habe in dieser Zeit nicht nur wissenschaftlich, sondern auch menschlich viel gelernt.

Meinen Kobetreuern im Graduierten Kolleg, Herrn Prof. Dr. med. H.-G. Forssmann und

Herrn Priv.-Doz. Dr. med. H. Holtmann möchte ich danken, dass sie mir die Möglichkeit

gegeben haben, in diesem Rahmen zu promovieren.

Ganz herzlich möchte ich mich bei meinen Kolleginnen Frau Dr. U. Bode und Frau Dr. B.

Lüttig bedanken, mit deren Geduld, Wissen und moralischer Unterstützung ich jederzeit

rechnen konnte.

Frau Dr. A. Markus danke ich für die viele Zeit und Mühe, die sie sich mit der Anfertigung

und Verarbeitung der konfokalen Bilder gemacht hat. Herrn Priv.-Doz. Dr. med. A. Gebert

danke ich für die Unterstützung bei der Auswertung der konfokalen Bilder und für seine

Unterstützung in allen graphischen und computerrelevanten Fragen.

Frau I. Dressendörfer und Frau S. Lopez danke ich für die tatkräftige Hilfe und die Geduld bei

der Anfertigung zahlreicher Präparate und Immunhistologien.

Allen Mitarbeitern der Abteilung, deren freundliche Unterstützung, Ratschläge und Geduld

eine angenehme und motivierende Arbeitsatmosphäre schaffte, möchte ich herzlich danken.

Meiner Mutter, meinem Bruder und meiner Schwägerin möchte ich für das offene Ohr und die

telefonische Aufbauarbeit in den kritischen Momenten dieser Arbeit danken.

Frau med. vet. U. Raschke und Frau med. vet. A. Heipke danke ich für den konstanten

moralischen Beistand, ohne den ich so manches Mal verzweifelt wäre. Abschließend danke

ich meiner Tochter, dass sie mir in den schwierigsten Momenten geholfen hat, das Lachen

nicht zu verlernen.

Membrankontakte von T-Lymphozyten mit dendritischen Zellen ...

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