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Mikrobiologie

Inhaltsverzeichnis

Herstellung von Nähr-Agar................................................................................................................................. 5

Formen von Nähragar................................................................................................................................................... 5Gießen der Nähragar-Platten........................................................................................................................................5Beschriftung der Platten...............................................................................................................................................5

Steriler Arbeitsplatz............................................................................................................................................. 7

Sicherheitswerkbank, Klasse 1....................................................................................................................................7Sicherheitswerkbank, Klasse 2....................................................................................................................................7Sicherheitswerkbank, Klasse 3....................................................................................................................................7Suboptimaler Arbeitsplatz............................................................................................................................................8

Mikroorganismen................................................................................................................................................. 9

Definition von Mikroorganismen..................................................................................................................................9Einteilung der Mikroorganismen in Gruppen.............................................................................................................9Typische Eigenschaften von Mikroorganismen.........................................................................................................9Voraussetzungen für Mikroorganismen......................................................................................................................9Beispiele für Keimzahlen..............................................................................................................................................9

Monitoring.......................................................................................................................................................... 11

Wie ist die Vorgehensweise.......................................................................................................................................11Möglichkeiten des Monitorings..................................................................................................................................11

Luftmonitoring.....................................................................................................................................................................................11Oberflächenmonitoring.......................................................................................................................................................................12Personalmonitoring.............................................................................................................................................................................12

Charakterisierung von Mikroorganismen........................................................................................................13

Makroskopische Begutachtung.................................................................................................................................13Kriterien zur Begutachtung:................................................................................................................................................................13Verdünnungsausstrich........................................................................................................................................................................13

Mikroskopische Begutachtung..................................................................................................................................13Typische Formen von Mikroorganismen.............................................................................................................................................14Mikroskopische Begutachtung............................................................................................................................................................15Dokumentation der mikroskopischen Begutachtung...........................................................................................................................15

Anhang............................................................................................................................................................... 17

Abbildungsverzeichnis...............................................................................................................................................17Tabellenverzeichnis.......................................................................................................................................................17

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Mikrobiologie

Herstellung von Nähr-Agar

1. Als Gefäß verwendet man Schraubflaschen, die zu maximal ⅔ gefüllt werden.

2. Die Beschriftung erfolgt am besten auf Autoklavenband (WAS (Inhalt), WANN (Datum), WER (Name des Präparators).

3. Die Einwaage errechnet sich laut Hersteller (siehe Behälter der Agarmischung). Lösen erfolgt in VE-Wasser (möglichst ohne Schaumbildung). ACHTUNG: Agar löst sich nicht vollständig!

4. Im Anschluss Kontrolle des pH-Werts laut Verpackung (eventuell einstellen).

5. Empfehlenswert ist es, die Lösung für 10 min in ein kochendes Wasserbad zu stellen.

6. Autoklavieren! Dabei den Deckel nur leicht andrehen, damit der Überdruck entweichen kann!

Formen von Nähragar1. Nähragar: Für die meisten Bakterien geeignet (neutral, proteïnreich)

2. Malzagar: Für Hefen und Pilze (leicht saurer pH-Wert, Kohlenhydrate)

3. Neutralagar: Für Abklatschtests (neutralisiert Desinfektionsmittel und wachstumshemmende Stoffe)

Gießen der Nähragar-PlattenFür Nähr- und Malzagar werden normale Petrischalen mit einem Volumen von ≈ 25 ml verwendet. Sie werden zu ⅓-½ hoch gegossen.

Für Neutralagar werden sogenannte Kontaktschalen mit einem Volumen von ≈ 20 ml verwendet. Sie werden vorsichtig so weit gefüllt, dass sich eine Wölbung ergibt. Dies ist notwendig, um später einen Abklatschtest durchführen zu können.

Nach dem Erstarren der Gele werden die Platten mit dem Deckel nach unten gelagert, um das Eintragen von Kondenswasser in die Gele zu verhindern.

Abbildung 1 : Petrischale Abbildung 2 : Kontaktschale

Beschriftung der PlattenDie Beschriftung erfolgt von unten am Rand der Schale (Name, Inhalt, Datum der Präparation).

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Mikrobiologie

Steriler Arbeitsplatz

Ein optimaler, steriler Arbeitsplatz ist eine Sicherheitswerkbank. Diese wird in verschieden Klassen unterteilt.

Sicherheitswerkbank, Klasse 1

Abbildung 3 : Sicherheitswerkbank, Klasse 1

Sterile Luft strömt dem Laboranten entgegen.

1. Das Produkt bleibt steril!

2. Das Personal wird nicht geschützt!

Die Filterung erfolgt durch einen Tiefenfilter (HEPA), d.h.: Filterung durch Adsorption an das Filtermaterial (z.B.: Cellulosefasern).

Sicherheitswerkbank, Klasse 2

Abbildung 4 : Sicherheitswerkbank, Klasse 2

Der Luftstrom erfolgt von oben nach unten.

1. Das Produkt bleibt steril!

2. Das Personal wird nicht geschützt!

Keine Partikel (Mikroorganismen, Viren, Stäube) gelangen nach außen!

Sicherheitswerkbank, Klasse 3

Abbildung 5 : Sicherheitswerkbank, Klasse 3 (Glove box)

Eine Sicherheitszelle („Kasten“) mit eingearbeiteten Gummihandschuhen („Glove box“). Einsatz bei hochinfektiösen Keimen.

1. Ist ein geschlossenes System!

2. Es besteht kein direkter Kontakt zur Außenwelt!

Bei allen Sicherheitsbänken herrscht eine laminare Strömung!

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Mikrobiologie

Suboptimaler ArbeitsplatzHiermit ist das mikrobielle Arbeiten am normalen Arbeitstisch gemeint.

1. Der Arbeitsplatz soll möglichst freigeräumt sein.

2. Die Fläche muss desinfiziert sein.

3. Ein Bunsenbrenner mit rauschender Flamme muss in Betrieb.

4. Jede Vermeidung von Luftbewegungen (keine hektischen Bewegungen).

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Mikrobiologie

Mikroorganismen

Definition von MikroorganismenMikroorganismen sind vorwiegend einzellige Lebewesen, die mit bloßem Auge nicht sichtbar sind.

Einteilung der Mikroorganismen in Gruppen- Bakterien

- Pilze / Schimmelpilze

- Viren, sind aber kein „echtes“ Leben

- Eukoriontysche Einzeller (Wimperntierchen, Pantoffeltierchen,...)

- Hefen (gehören eigentlich zu den Pilzen, bilden aber eine eigene Klasse)

- Algen

Typische Eigenschaften von MikroorganismenSie haben eine starre Zellwand, die Größe beträgt ≈ 0,2 – 10 µm, die Größe von Viren bewegt sich im nm-Bereich, Pilz-Hyphen erreichen Größen von mehreren 100 µm. Ein Sonderfall sind Mycoplasten, deren Größe liegt bei ≈ 0,2 µm und sie sind leicht verformbar (können ein 0,2 µm-Filter passieren).

- Sie haben eine sehr hohe Stoffwechselleistung. Beispiel:

Kuh (≈ 500 kg) produziert am Tag ≈ 0,5 kg Proteïn!

Hefezellen (≈ 500 kg) produzieren am Tag ≈ 50.000 kg Proteïn!!!

- Sie haben eine sehr schnelle Vermehrung. Beispiel:

Escherichia coli teilt sich ≈ alle 20 min unter optimalen Bedingungen.

- Sie besitzen eine hohe Anpassungsfähigkeit an den Lebensraum in Bezug auf Temperatur, pH-Wert und Nährstoffangebot. Beispiele:

Mikroorganismen in heißen Quellen (Thermoplilis aquaticus lebt bei ≈ 100 °C!

„Erdölfressende“ Mikroorganismen leben in der Nähe von Tankstellen und Öltanks (allgemein im Erdreich).

Heliobacter pylori, der Verursacher von Gastritis, ist stark azidophil.

Verschiedene Mikroorganismen bevorzugen Salzseen als Lebensraum (halophile Mikroorganismen).

Eigentlich gibt es keinen Lebensraum auf der Erde, der frei von Mikroorganismen ist: Mikroorganismen sind ubiquitär!

Voraussetzungen für Mikroorganismen- Ausreichende Feuchtigkeit (je nach Anspruch)

- Entsprechende Nährstoffe (sehr vielfältige Möglichkeiten)

Beispiele für KeimzahlenErdboden: Bis zu 1012 Keime/g

Luft: Außenluft: ≈ 500 Keime/mlRaumluft: ≈ 1.000 – 2.000 Keime/ml

Wasser: Flusswasser: bis zu 107 Keime/mlTrinkwasser: max. 100 Keime/ml, dabei keine E.coli und Enterokokken

Lebensmittel: Rohmilch: bis zu 107 Keime/mlHackfleisch: bis zu 106 Keime/g

Mensch:Darminhalt: 1011 Keime/gHarn: keimfreiHandoberfläche: 1.000 – 10.000 Keime/cm2

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Mikrobiologie

Monitoring

Monitoring bedeutet die Überwachung des Keimstatus, d.h.: die mikrobielle Belastung von Räumen, Geräten, Personen,... Sie ist besonders wichtig in Bereichen, wo auf Hygiëne geachtet werden muss, z.B.: Pharma- und Lebensmittelindustrie, Krankenhäuser, Schwimmbäder (Wasserwerke und Tierzucht, welche zur Lebensmittelindustrie gezählt werden).

Grenzwerte für die Belastung durch Mikroorganismen sind in Verordnungen festgelegt.

Je nach Bereich, z.B.: sind die Grenzwerte in der Pharmaindustrie strenger als in einem Schwimmbad. Die Regelungen in der Pharma- und Lebensmittelindustrie gehören zum GMP1-Bereich. In der GMP-Richtlinie sind mindestens folgende Grenzwerte definiert:

1. Warnlimit: Limit, ab dem Handlungsbedarf angezeigt ist.

2. Aktionslimit (Eingriffsgrenze): Limit, ab dem dringender Handlungsbedarf besteht.

Beispiel:

Cremeproduktion unter Reinraumbedingungen

- Warnlimit für die Raumluft: 200 Keime/m3

- Aktionslimit für die Raumluft: 400 Keime/m3

Wie ist die VorgehensweiseWöchentliche Kontrolle der Raumluft!

Keimgehalt <200 Keime/m3 Kein Handlungsbedarf

Keimgehalt >200<400 Keime/m3 Das Warnlimit überschritten, erhöhte Aufmerksamkeit, da die Keimbelastung erhöht ist, aber gerade noch im „grünen Bereich“. Die Produktion kann weiterlaufen, aber die Kontrolle der Hygiënemaßnahmen ist erforderlich (Mitarbeiterschulung, allgemeine Kontrolle der Filter und der Desinfektionsanlagen. Nach der Kontrolle ist ein Wiederholungsmonitoring angezeigt (Ergebnisse → siehe oben).

Keimgehalt >400 Keime/m3 Das Aktionslimit ist überschritten! Es besteht sofortiger Handlungsbedarf! Einleitung eines Produktionsstops und gründliche Untersuchung der Ursachen (Ursachenforschung). Einleiten eines Wiederholungsmonitorings.

W I C H T I G ! Alle Schritte müssen dokumentiert werden! Im Falle eines Verstoßes droht der Entzug der Herstellungslizenz!

Möglichkeiten des Monitorings

Luftmonitoring

Sedimentationsplatten

Eine Agarplatte wird für eine definierte Zeit (z.B.: 1 Stunde) offen stehengelassen. Die an den Staub gebundenen Keime sedimentieren auf der Platte und werden nach Ablauf des vorgegebenen Zeitraums bebrütet (30 °C für 2 Tage) und ausgezählt.

Der „Transport“ von Keimen ist an Staubteilchen gebunden, d.h.:

Wenig Staub geringe Keimbelastung

Viel Staub hohe Keimbelastung

Zum Einsatz kommen:

Nähragar: optimal für die meisten Mikroorganismen

Malzagar: optimal für die meisten Hefe und Pilze

Luftsammler

Eine definierte Luftmenge wird auf einen speziellen, gerätetypischen Nährboden geblasen (Ventilator). Die Keime bleiben am Nährboden hängen und werden bei 30 °C für 2 Tage bebrütet.

Die Auswertung erfolgt durch Auszählen und Hochrechnen auf Keime/m3.

1 Good Manufactory Practice

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Mikrobiologie

Oberflächenmonitoring

Das Monitoring erfolgt durch Abklatsch- oder Kontaktschalen, welche mit Neutralagar bestückt sind. Sie werden ebenfalls bei 30 °C für 2 Tage bebrütet und ausgezählt.

W I C H T I G ! Der Abklatsch muss standardisiert sein!

- Andruck: 500 g ± 50 g

- Andruckzeit: 10 s ± 1 s

Personalmonitoring

Es wird ein Abklatsch von den Fingerspitzen und von der Ärmelunterseite des Kittels entnommen. Dieser wird bei 30 °C für 2 Tage bebrütet und ausgezählt.

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Mikrobiologie

Charakterisierung von Mikroorganismen

Makroskopische BegutachtungDie makroskopische Begutachtung von Einzelkolonien2 erfolgt mit bloßem Auge bzw. einer Lupe.

- Form, Farbe etc. sind artspezifisch bei gleichbleibenden Kulturbedingungen (Nährstoffe, Temperatur, Zeit, pH-Wert,...)

Kriterien zur Begutachtung:

- Farbe der Kolonie

- Größe der Kolonie (Durchmesser in mm)

- Oberfläche: glatt, rau, pelzig, glänzend, trocken, feucht, fädig,...

- Kolonieform: rund, oval, unregelmäßig, wurzelförmig

- Kolonieprofil: konvexflacheingedelltknopfförmig,halbkugelig

- Kolonierand: glattgezacktgewelltfransig / fädiglockig

- Konsistenz: fest, cremig, gelartig, bröckelig, flauschig / wattig, schleimig

- Geruch: neutral, erdig, fischig, faulig, ranzig, ammoniakalisch

Verdünnungsausstrich

Abbildung 6 : Verdünnungsausstrich

A) 1. Ausstrich – 2 – 3 mal hin und her

B) 2. Ausstrich – Verteilung mäandrierend

C) 3. Ausstrich – Verteilung mäandrierend (im Idealfall erhält man Einzelkolonien)

Mikroskopische BegutachtungDie Mikroorganismen werden mikroskopisch nach folgenden Kriterien begutachtet:

- Form

- Größe

- Fortbewegung

2 Im Idealfall aus einem einzelnen Mikroorganismus entstanden!

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Mikrobiologie

Typische Formen von Mikroorganismen

Kokken (kugelrund)

Streptokokken (kettenförmig)

Staphylokokken (traubenförmig)

Neiseria

Diplokokken (2er-Kokken)

Tetrakokken (4er-Kokken)

Sarcina (Paketkokken)

Tabelle 1 : Formen von Kokken

Stäbchen (länglich)

Langstäbchen

Kurzstäbchen

Ovale Stäbchen (kokkoide)

Fädige Stäbchen

Tabelle 2 : Formen von Stäbchen

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Mikrobiologie

Vibrionen

Abbildung 7 : Vibrionen

Spirillen

Abbildung 8 : Spirillen

Mikroskopische Begutachtung

Im einfachsten Fall wird ein sogenanntes Deckglaspräparat hergestellt.

1. Objektträger mit einem Tropfen Leitungswasser bestücken

2. Mit einer sterilen Impföse wenig Mikroorganismenmaterial einer Kultur entnehmen und im Tropfen verteilen

3. Deckgläschen auflegen und mikroskopieren (bei 1.000-facher Vergrößerung Immersionsöl zur Kontraststeigerung zwischen Deckglas und Objektiv bringen)

Dokumentation der mikroskopischen Begutachtung

Es wird eine Bleistiftskizze erstellt, die möglichst originalgetreu die Größe und Form der Mikroorganismen wiedergibt.

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Mikrobiologie

Anhang

AbbildungsverzeichnisAbbildung 1 : Petrischale......................................................................................................................................................................5

Abbildung 2 : Kontaktschale.................................................................................................................................................................5

Abbildung 3 : Sicherheitswerkbank, Klasse 1.......................................................................................................................................7

Abbildung 4 : Sicherheitswerkbank, Klasse 2.......................................................................................................................................7

Abbildung 5 : Sicherheitswerkbank, Klasse 3 (Glove box)....................................................................................................................7

Abbildung 6 : Verdünnungsausstrich..................................................................................................................................................13

Abbildung 7 : Vibrionen.......................................................................................................................................................................15

Abbildung 8 : Spirillen.........................................................................................................................................................................15

TabellenverzeichnisTabelle 1 : Formen von Kokken..........................................................................................................................................................14

Tabelle 2 : Formen von Stäbchen.......................................................................................................................................................14

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