Mikrobiologische Diagnostik wann entnehme ich wie welches...

Mikrobiologische Diagnostik wann entnehme ich wie welches

Untersuchungsmaterial?

9. Hygieneforum Neumünster 9. März 2017

Dr. Ines Fenner

MVZ Labor Dr. Fenner und Kollegen

Mikrobiologische Diagnostik - Übersicht

• Allgemein

• Materialien:

• Blutkultur

• Liquor

• Atemwegsmaterialien, Mykobakterien

• Urin

• Stuhl

• Abstriche • Screeningabstriche

• Umgebungsuntersuchungen

Vorgaben

• Verfahrensrichtlinien der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)

• in den Qualitätsstandards (MiQ) niedergelegt

• Empfehlungen der American Society for Microbiology (ASM)-> (im "Cumitech", im "Clinical Microbiology Procedures Handbook" und im "Manual of Clinical Microbiology" nachzulesen)

• Empfehlungen der beiden Gesellschaften (DGHM und ASM) nicht immer deckungsgleich

• KRINKO-Empfehlungen

Wer, wann, wo und wie entnehmen?

• Durch erfahrenen Untersucher / geschultes Personal

• möglichst gezielt vom Infektionsort

• möglichst ohne Kontamination

• Entnahme vor Beginn einer antibiotischen Therapie

• Ausreichend Material gewinnen

• Mehrmalige Entnahmen erhöhen die diagnostische Sicherheit

• Nach Entnahme mit sterilem Besteck Material nativ in einem sterilen Gefäß oder ggf. in einem speziellen Transportmedium einsenden

• Und dann: Schnell ins Labor!

Welche Untersuchungsmöglichkeiten gibt es ?

• Kultur: pathogene Keime und Resistenzbestimmung • Zum Teil spezielle Verfahren!

• PCR (Nachweis Erreger-spezifischer DNA/RNA), z.B. von Viren, Toxingene

• ELISA-Verfahren (Nachweis von Antigenen), z.B. Rotaviren, Adenoviren, Clostridium difficile GDH-Test, C.diff Toxintest)

Besondere Anforderungen

• Aktinomyzeten

• A-Streptokokken

• Chlamydien

• Cholera

• Diphtherie

• Gonokokken

• Helicobacter

• Legionellen

• Mykoplasmen / Ureaplasmen

• Pertussis

• Pilze

• Pneumocystis

• Protozoen

• Tuberkulose bzw. Mykobakterien

• alle viralen Erreger

• Würmer und Wurmeier

Probenbegleitschein

• Art des Untersuchungsmaterials, gewünschte Untersuchung

• Entnahmestelle

• Entnahmezeitpunkt

• Diagnose oder Verdachtsdiagnose

• Krankheitsbild und -dauer

• Vorausgegangene / laufende Medikation - Antibiotika

• Umgebungs- / Reiseanamnese

• Patientendaten

• Indikationen: • Unklares Fieber

• Sepsis, Meningitis, Pneumonie, Endokarditis, Osteomyelitis, pyogene Arthritis, Pyelonephritis

• Abnahmezeitpunkt: • Zeitpunkt der Blutentnahme im Hinblick auf Symptomatik / Fieber

ist unerheblich (Riedel S et al., J Clin Microbiol, 2008)

• Möglichst vor Beginn einer Antibiotikatherapie

• Entnahmeort: • Möglichst peripher und nicht aus Venenkatheter bzw. ZVK

(Kontaminationsraten peripher: 1,2-7,3% vs. Katheter 3,4-13%)

• arteriell kein Vorteil

• Wenn Abnahme aus venösen Zugängen (PVK, ZVK, Port) bitte angeben

Blutkultur

Bakteriämierate (und/oder –dichte) ist abhängig vom Infektionsfokus

Brunkhorst FM et al., DIVI, 2010

• Wann sollen wieviele Flaschen abgenommen werden?

• Unterschiedliche Empfehlungen!

Blutkultur

• MiQ Blutkulturdiagnostik (2007):

• für Erwachsene mindestens 2 – 4 BK- Sets, bei V.a. Endokarditis 6 BK-Sets

• In klinisch dringenden Fällen, in denen eine unmittelbare antibiotische Therapie erforderlich ist (z.B. akute Endokarditis, Fieber bei Granulozytopenie, schwere Sepsis, septischer Schock) Abnahme von 2 – 3 BK-Sets durch separate Venenpunktion gewonnen „in rascher Folge“

• Literatur: Keine Hinweise für den optimalen Zeitabstand zwischen den Abnahmen

Blutkultur

Lee A et al., J Clin Microbiol, 2007

Wie viele Blutkulturen müssen abgenommen werden?

• Patienten mit > 3 Blutkulturpaaren innerhalb von 24h • 1 BK = 1 Aerobe + 1 Anaerobe Flasche • Gesamt-Detektionsrate nach: 1. BK 73,1%, 2. BK 89,7%, 3. BK 98,2%, 4. BK 99,8%

• Erst mit 3 abgenommenen BK-Sets sind Detektionsraten von >95% zu erwarten.

• Ab 4 BK-Sets kann mit Detektionsraten >99% gerechnet werden.

Wie viele Blutkulturen müssen abgenommen werden?

Blutkultur

Blutkultur: Prävention von Kontaminationen durch korrekte Entnahme

Prävention, Diagnose, Therapie und Nachsorge der Sepsis

Empfehlungen der Deutschen Sepsis-Gesellschaft e.V.; 2010

• Frage: Ist der ZVK die Quelle der Blutstrominfektion ?

• DTP Differential Time to Positivity

• Abnahme gepaarter Blutkulturen aus dem ZVK und peripher

• Wenn Blutkultur aus dem ZVK mindestens zwei Stunden vor der peripher abgenommenen Blutkultur ein positives Signal liefert

• -> wichtiger Hinweis

• Mikrobiologische Untersuchung der ZVK-Spitze

• Wenn Verdacht auf eine vom ZVK ausgehende Infektion besteht

• Vor dem Entfernen Kathetereintrittsstelle mit Hautantiseptikum behandeln

Blutkultur

• Blutentnahme aus dem ZVK:

• Rate an kontaminierten Blutkulturen hoch

• Höher als bei Abnahme peripher (Boyce et al 2013)

Blutkultur

• Abnahmetechnik

• Gründliche Hautdesinfektion vor Abnahme, Einwirkzeit beachten, ohne Zusatz von remanenten Wirkstoffen

• Hygienische HD, sterile Handschuhe, Vene nicht erneut palpieren

• Bei Neugeborenen und Kleinkindern in der Regel nur eine aerobe Flasche mit 0,5 bis 4 ml (1 – 5 ml) Blut befüllen, da bei Sepsis eine 10-fach höhere Bakterienkonzentration vorliegt im Vergleich zu Erwachsenen

• Beimpfung der Flaschen:

• Plastikkappe entfernen

• Gummistopfen desinfizieren (70% Ethanol oder Isopropanol)

• Blut in die Flasche injizieren, Flasche nicht belüften

Blutkultur

• Bitte Flasche und Begleitschein kennzeichnen, wenn andere Materialien in die Blutkulturflasche inokuliert werden (z.B. Liquor, Punktate)

• Lagerung der beimpften Flaschen

• bei Raumtemperatur (bis zu 48 Stunden), nicht vorbebrüten

• Mit diesem System können nicht nachgewiesen werden:

• Bartonella spp.

• Borrelia spp.

• Chlamydia spp.

• Mycobacteria spp.

• Dimorphe Pilze

• Parasiten

• Viren

Blutkultur - Besonderheiten

• Nativ: • Mikroskopie, • Zellzählung - innerhalb von 30-60 Min. nach Punktion • Antigennachweis / „Schnelltest“ • Kulturansatz • Ggf. PCR oder Multiplex-PCR auf bakterielle und virale Erreger • Achtung, Reihenfolge der Entnahme für die jeweiligen Bestimmungen beachten! • Umgehender Transport ins Labor

• Beimpfung einer Blutkuturflasche • Bei vermutlich geringer Keimzahl • Bei bisher schwierigem Erregernachweis

• Wichtig:

• Entnahmestelle angeben (Ventrikel-, Lumbal-Liquor, Shunt?)

• Trübungen, Blutbeimengungen vermerken

Liquor

• Sputum

• Vor Abnahme Mund mit abgekochtem Wasser / TEE spülen

• Am besten Morgensputum aus tiefer Expektoration

• Sekret in Sputumgefäß

• Nicht sammeln

• Zwangsläufige Kontamination mit Mund- und Rachenflora

• Tracheal- und Bronchialsekret

• Durch Aspiration bei Tracheostoma, Intubation, Nasotrachealkatheter

• Bei der Bronchoskopie: • Materialgewinnung ohne vorherige Spülung mit NaCl • Aspiration des Sekrets nativ über den Absaugkanal, in sterile Röhrchen geben

• BAL: getrennt nach Absaugort

• Bitte gezielter Auftrag bei V.a. Pneumocystis jiroveci

• Gekühlter Transport

Atemwegsmaterialien

Atemwegsmaterialien

• Bitte Angaben zu Erkrankungen und Verdachtsdiagnosen wie

• Mukoviszidose, Immundefekte, Pilzinfektionen, Aspirationspneumonie

• Bei akuten Pneumonien auch Blutkulturen abnehmen

• Folgende Erreger bitte gesondert anfordern:

• Chlamydophila pneumoniae (PCR)

• Mykoplasma pneumoniae (PCR)

• Pneumocystis jiroveci (PCR, IFT)

• CMV (PCR), HSV (PCR)

• Legionella spp. (PCR; Kultur, Urin: Antigentest auf Legionella pneumophila SG 1)

• RSV (Schnelltest, PCR)

• Influenza A / B (Schnelltest, PCR)

• Mykobakterien (Kultur, PCR)

• Respiratorische Multiplex-PCR: zusätzlich Haemophilus influenzae, S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Viren: Metapneumov., Parainfluenzav., Adenov., Enterov., Bocav., Metapneumov., Coronaviren, Rhinovirus

• Untersuchung auf Pertussis (PCR)

• Trockener Abstrichtupfer, Entnahme aus dem Rachen

• Untersuchung auf Chlamydophila trachomatis (PCR)

• Trockener Abstrichtupfer

• (Urin)

• Influenza Schnelltest (Antigentest, PCR)

• Aus Nasenspülflüssigkeit,

• Aus Aspirat aus Nase oder Rachen

• Trockener Abstrichtupfer aus Rachen oder Nase

Atemwegsmaterialien - Besonderheiten

Mykobakteriendiagnostik

• Auch hier gilt: je größer das Probenvolumen, desto höher die Ausbeute

• Anforderung: Mycobacterium tuberculosis, atypische Mykobakterien

• Diagnostik: Präparat auf säurefeste Stäbchen, Kultur, PCR, Resistenzbestimmung, (IGRA-Test – Interferon-Gamma-Release Assay)

• Sputum

• 5-10 ml, möglichst 3 Proben (ggf. mehr Proben bei klinischem Verdacht und negativer Mikroskopie)

• Möglichst vor dem Frühstück, nach Mundspülung

• Magensaft

• 3 Proben

• Magen mit 20 - 30 ml steriler physiologischer NaCl-Lösung spülen

• Entnahme morgens, Patient nüchtern

• Sättigung mit 1-2 ml Natriumphosphat-Lösung erfolgt im Labor

• Bronchialsekret (Sekret, Spülung, Bürste)

• Bei der Gewinnung möglichst kein Lokalanästhetikum verwenden

• Erstes Sputum nach der Bronchoskopie ist oft ergiebiger

• Erguss, Abszesspunktate

• Aspiriertes Material, keine Watteträger

• Biopsie, OP-Material (z.B. Lymphknoten)

• Zusammen mit wenig NaCl 0,9% einsenden, nicht fixieren (kein Formalin)

• Liquor

• Mindestens 3 ml in sterilem Röhrchen einsenden

• Bei klinischem Verdacht auch PCR

Mykobakteriendiagnostik

Urindiagnostik

• Mittelstrahlurin

• Katheterurin

• Blasenpunktionsurin

• Tütenurin (Kinder)

Bitte NICHT: Beutelurin

• Transportgefäße:

• Eintauchnährböden (z.B. Uricult®, Urotube®):

• Nährböden vollständig mit Urin benetzen

• bis zum Transport im Brutschrank lagern

• Sterile Urinauffanggefäße

• Wenn zwischen Urinentnahme und Abholung der Probe >2 Stunden: Probe bei 2-8°C aufbewahren

Urindiagnostik

• Mittelstrahlurin

• Morgenurin für möglichst hohe Keimzahlen (Abgrenzung gegen Kontaminanten)

• bzw. Urinentnahme frühestens 3-5 Stunden nach der letzten Miktion

• Vorgehen:

• Beim Mann: Hände und Vorhaut mit Seife waschen. Vorhaut zurückziehen, Eichel mit milder Seifenlösung waschen, mit frischem Wasser spülen, mit sauberem Tupfer trocknen. Das 1. Urindrittel ablaufen lassen, dann, ohne den Harnstrahl zu unterbrechen, 10 - 20 ml in sterilem Gefäß auffangen.

• Bei der Frau: Eventuell Hilfsperson erforderlich. Äußeres Genitale und den Damm gründlich mit Seife waschen, mit Wasser abspülen. Nach Spreizen der Labien Urethralmündung und Umgebung mit 3 feuchten sterilen Tupfern reinigen, mit einem vierten sterilen Tupfer trocknen. Weiteres Vorgehen wie beim Mann.

• Katheterurin

• Entnahme: Morgens, bzw. frühestens 3-5 Stunden nach der letzten Miktion

• gründliche Reinigung der Urethralmündung und Umgebung

• 10-20 ml K-Urin in sterilem Gefäß auffangen

• Nur in Ausnahmefällen bei liegendem Dauerkatheter z.B. bei alten Patienten oder Querschnittsgelähmten:

• Urin direkt aus dem (zuvor desinfizierten!) Katheter, nicht aus dem Auffangbeutel entnehmen.

Urindiagnostik

• Punktionsurin

• Voraussetzung: gefüllte Blase

• Desinfektion der suprapubischen Punktionsstelle

• Entnahme von 10-20 ml Urin

• in ein steriles Gefäß füllen

• größter Ausssagewert!

• jede Keimzahl ist als diagnostisch signifikant anzusehen

Urindiagnostik

Stuhl - Diagnostik

• Portion: ca. 2 Stuhllöffel oder bei flüssigem Stuhl 3-5ml in ein Stuhlröhrchen geben

• Für Wurmeier ca. 20g (erbsengroß) möglichst frischen Stuhl • Für Oxyureneier: besser Tesafilmstreifen

• Stuhlbeschaffenheit dokumentieren (blutig, schleimig ?)

• Bitte kühl aufbewahren

• In der Regel 2-3 Stuhlproben einsenden dadurch wird die Nachweisrate darmpathogener Erreger deutlich erhöht

• Pathogene Keime beinhaltet:

Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, Yersinien

• Weitere Anforderungen:

• Rotaviren, Noroviren, Adenoviren, Clostridium difficile, Lamblien Entamoeben, Wurmeier und Parasiten, EHEC, EPEC

• Ggf. bei Verdacht auf weitere darmpathogene Erreger (Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio, Listerien ->Mekonium)

• Für mikrobiologische Untersuchungen:

• Universalabstrichtupfer (Watte) mit Amies-Medium als Transportmedium

• Beflockte (mit Nylon-Flockfaser) Tupfer mit Amiesmedium (flüssig)

• Verschiedene Ausführungen

• Lagerung und Transport: bei Raumtemperatur

• Für molekulargenetische Untersuchunge (PCR):

• Kein Transportmedium verwenden (Ca-Alginat im Medium hemmt die PCR)

• Lagerung und Transport: trocken und kühl (2-8°C)

Abstriche - allgemein

• Gefahr durch Kontamination mit Sekundärkeimen

• • Bitte beachten: topische Anästhetika sind antimikrobiell

• Schwierig: allgemeine bakteriologische Untersuchung und gleichzeitig Untersuchung auf Mykobakterien

aus dem gleichen Material - unterschiedliche Aufbereitung

Abstriche - allgemein

Eiter und Wundabstriche

• Zunächst Krusten und oberflächliches Sekret mit sterilem Tupfer entfernen

• Material aus der Tiefe und aus den Randbezirken entnehmen und in Transportmedium (Amies) überführen

• Bei trockenen Wunden: Tupfer mit sterilem NaCl anfeuchten

• Bitte folgende Angaben

• Art der Materialentnahme, z.B. intraoperativ

• Art der Wundinfektion (chirurgische WI, akute WI wie Abszesse, traumatische Wunden, Bisswunde, Verbrennungswunde)

• Bei Verdacht auf Osteomyelitis auch Blutkulturen abnehmen

Eiter, Sekrete, Punktate, Aszites, Gewebe, Drainageflüssigkeiten

• Flüssige Materialien/direkte Materialien sind immer besser geeignet als Tupferabstriche

• In sterilen Röhrchen einsenden

• Oder: Inokulation in Blutkulturflaschen

• Nachteil: kein Grampräparat, kein Hemmsotffnachweis, keine Zelldifferenzierung

• Punktion primär steriler Körperhöhlen (Pleura, Pericard, Gelenke) unter streng aseptischen Bedingungen

• Abszesse: perkutane Punktion möglichst vor der Spaltung

• Infektionserreger vor allem in den Randbereichen

• Hautdesinfektion, Entnahme mit Spritze, in steriles Behältnis füllen oder in Blutkulturflasche impfen

• Bitte gezielter Auftrag bei Verdacht auf Nocardien und Actinomyzeten

• nativ in sterilem Röhrchen

• ggf. unter Zugabe von einigen Tropfen sterilem NaCl (wenn nur wenig Material)

• kein Formaldehyd verwenden

Intraoperativ gewonnene Materialien - Gewebe

• Abklärung:

• Warum soll ein Screening durchgeführt werden ?

• Erkennung von Besiedelungen • spezifische Hygienemaßnahmen können angesetzt werden

• Wer soll gescreent werden? – Risikopatient?

• Worauf soll gescreent werden? - MRSA, MRGN, VRE?

• Wie soll gescreent werden? – Methode: Kultur, PCR ?

• Wo soll gescreent werden? – Untersuchungsort?

Abstriche - Screeningabstriche

• Abklärung: • Wer soll gescreent werden? – Risikopatient? • Worauf soll gescreent werden? - MRSA, MRGN, VRE? Vorgaben in den jeweiligen KRINKO-Empfehlungen Immer hilfreich ????

• Z.B. Risikofaktor • Auslandsanamnese • Regionen / Einrichtungen mit bekannt hoher MRSA-Prävalenz (z.B. Einrichtungen in Ländern

mit hoher MRSA-Prävalenz oder Einrichtungen mit bekannt hoher MRSA-Prävalenz in Deutschland) ?

• Kontakt zum Gesundheitssystem in Ländern mit endemischem Auftreten?


Wo finde ich die Informationen zu „Ländern / Gebieten mit erhöhtem endemischen Vorkommen“?

https://www.ars.rki.de


• EARSS

https://www.ecdc.europa.eu/en/publications/Publications/antimicrobial-resistance-europe-2015.pdf


https://resistancemap.cddep.org/

• Wie soll gescreent werden? – Methode: Kultur, PCR ?

Kostenfaktor: Kultur günstiger als PCR Untersuchungsdauer: Ergebnis der PCR schneller verfügbar als Kultur PCR bei MRSA: sehr gute negative Prädiktivität (97 – 99%) (Daeschlein G et al

2006, Holfelder M et al 2006) Erfassung: bei MRGN erfasst die PCR nur Isolate mit bestimmten

Carbapenemasen Faktor Einfluss: Antibiotika, Dekolonisierungsmaßnahmen (PCR)


• Wo soll gescreent werden? – Untersuchungsort?

• MRSA:

• Nase / Rachen kombiniert: Rachenabstrich und beide Nasenvorhöfe

• Ggf. Wunden

• Erhöhung der Gesamtsensitivität um 20% durch Screening zusätzlicher Lokalisationen (McKinnell JA et al 2013)


• Wo soll gescreent werden? – Untersuchungsort? • Unterschiedliche Empfehlungen für die Durchführung!

• MRGN: • KRINKO: Rektalabstriche, ggf. zusätzlich Urin, chronische Wunden • Acinetobacter: Mund-Rachen-Raum, Haut • zusätzlich beidseitige Abstriche der Leisten-/Hüftregion können sinnvoll sein (mit Schwämmchen,

Abnahmeort: Bein, Sensitivität 82,6%; großzügiger Abstrich Wangenschleimhaut Sensitivität 52,2%, insgesamt 46 Patienten; Doi Y et al 2011)

• 90% der kolonisierten Patienten (gesamt 73) mit rektalen und / oder Rachenabstrichen bzw. Trachealsekret im Screening identifiziert (Rodriguez-Bano J et al, 2009)

• Pseudomonas aeruginosa: Rektal, Rachen

• Sensitivität Rektalabstrich 94% - Sensitivität Perianalabstrich 53% (Wiener-Well Y et al 2010, Calfee D et al 2008)


• Asklepios: großflächiger Hautabstrich einschl. Axilla, Brust, Leiste, Analbereich (7er Abstrich Asklepios-Kliniken ) auf MRGN inkl. Acinetobacter baumannii

• Keine Daten zur Sensitivität bekannt


• Raumtemperatur 24 Stunden

• Abstriche Abstrichtupfer mit Transportmedium

• Blutkulturen in Blutkulturflaschen

• Biopsien, Gewebe Röhrchen, steril (NaCl 0,9%)

• Liquor Röhrchen, steril u. beimpfte Blutkulturflaschen

• Punktate Röhrchen, steril u. beimpfte Blutkulturflaschen

• Kühlschrank

• BAL Sputumröhrchen, steril

• Katheter Röhrchen, steril

• Sputum, Trachealsekret Sputumröhrchen, steril

• Urin Röhrchen, steril

• Stuhl Stuhlröhrchen

Aufbewahrung von mikrobiologischem Untersuchungsmaterial

Umgebungsuntersuchungen in der Hygiene – Abklatsche, Abstriche

• WICHTIG: immer eine Momentaufnahme! – Reproduzierbarkeit?

• Bewertung der Ergebnisse schwierig, keine „Grenzwerte“ vorhanden

• Womit?

• Abklatschplatte (RODAC – replicate organism detection and counting) mit / ohne Enthemmer

• Abstrichtupfer, ggf. angefeuchtet mit 0,9% NaCl

• Angefeuchtete „Läppchen“, z.B. mit Peptonlösung

• Was soll wann verwendet werden? • Abhängig von der Fragestellung

• Beschaffenheit der zu untersuchenden Oberfläche

• Entsprechend der Vorgaben / Prüfnorm – wenn vorhanden


• WICHTIG: immer eine Momentaufnahme! – Reproduzierbarkeit?

• Bewertung der Ergebnisse schwierig, keine „Grenzwerte“ vorhanden

• Wann sind Abklatschuntersuchungen sinnvoll / angebracht?

1. Wenn es dafür Vorgaben / Prüfnormen gibt:

• Z.B. Abklatsch von Geschirr bei der Überprüfung von ETGM nach DIN 10512 und MTGM nach DIN 10510

2. Empfehlung in den Regelwerken z.B. zum HACCP – Konzept im Küchenbereich / Lebensmittelhygiene

• DIN 10524 Lebensmittelhygiene / Arbeitsbekleidung in Lebensmittelbetrieben

• Überprüfung von Reinigung und Desinfektion im Küchenbereich (gezielt, kritische, schlecht zugängliche Bereiche z.B. Schneidebretter, Messerschneide, -griffe, Aufschnittmaschinen)

3. In außergewöhnlichen Situationen • Ausbrüche mit V. a. exogene Quelle


• Wann sind Abklatschuntersuchungen sinnvoll / angebracht?????

4. Kontrolle der Flächenreinigung und –desinfektion im Routinebereich

A Anforderung an die Hygiene bei der Reinigung und Desinfektion von Flächen, KRINKO-Empfehlung 1/2004

5. im Rahmen von Fortbildungsmaßnahmen, z. B. Überprüfung von Händedesinfektionsmaßnahmen – wird in der KRINKO-Empfehlung „Händehygiene in Einrichtungen des Gesundheitswesens“ 9/2016 und bei der „Aktion Saubere Hände“ nicht erwähnt

BITTE keine unnötigen und überflüssigen Umgebungsuntersuchungen mit sehr fraglicher Aussagekraft !

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

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