Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver...

Nachweis von Calciumdipicolinat in Bacillus subtilis Endosporen mittels energiedispersiver Röntgenbeugung

von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

Übersicht

Motivation

Messapparatur

- Aufbau

- Optimierung der Einstellungen

- Durchführung der Messungen

Auswertung

- Normierung der Messdaten

- Faltung der Messdaten

- Korngrößenabhängigkeit

Zusammenfassung & Ausblick

Quellen

Seite 2PP Vortrag von Andreas Behrendt & Simon Schlesinger

Motivation – Bacillus subtilis


Bakterium „Bacillus subtilis“ ist Endosporenbildner

Endosporen Ähnlichkeit zu- Bacillus anthracis

- Clostridium botulinum

- Clostridium tetani

Große Mengen vonkristallinem Ca-DPAim „Core“

Rest besteht aus nicht-kristallinen Proteinen,DNA, etc…

Motivation – Calcium Dipicolinat (Ca-DPA)


Ca-DPA ist Salz der Dipicolinsäure,welche ebenfalls in einigen Sporenzu finden ist.

Ca-DPA = C7H3CaNO4

bildet monoklines Gitter mit 4Molekülen / Zelle

Spektroskopisch viel untersuchteSubstanz, jedoch kaum mittels EDX.

Detektion interessant für Brief- &Paketscanner etc.

Messapparatur – Schematischer Aufbau


fokussierter Röntgenstrahl

3D - Objekt

Primär-kollimator

Streu-kollimator L

Objektpunkt

eff. Streuwinkel

x

z

q s

q p

Fokus

Messapparatur – Änderung des Messwinkels


0

9000

0 20 40 60 80 100 120 140

Energy [keV]

rel.

Inte

nsi

ty

0

30000

0 20 40 60 80 100 120 140

Energy [keV]

rel.

Inte

nsi

ty

xy

L

zx

z

y

L

Messapparatur – Änderung der Streublendenöffnung


x

z

y

A

A

0

18000

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Energy [keV]

rel.

Inte

nsi

ty

xz

y

A

A

0

8500

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Energy [keV]

rel.

Inte

nsi

ty

Röhren-Parameter & Datenaufnahme


wesentliche Bestandteile der Röntgenanlage X-Ray-Tube (Philips) mit Wolfram-Röntgenanode:

energieauflösender Ge-Halbleiter-Detektor (Eurisys Mesures)

Röhren-Parameter Beschleunigungspannung bis 150keV

Anodenstrom bis 10mA

Datenaufnahme

Vorbereitungen für die Datenauswertung Energie-Kanal-Eichung mittels charakteristischer Linien: in Kanal ; in Kanal

keVK 59 keVK 67

Detektorspannung ( E) Vorverstärker

MCA (2048 Kanäle) mit ADC „winTMCA“ (PC-Software)

Ky

Kx

Ky

Kx

KKK

KK

KiKK

KK

i xxx

yyyx

xx

yyy

Kanalnummer

iyix

Energie [keV]

Normierung des Beugungsspektrums


Problem:

Lösung:

Vorgehensweise:

1. Aufnahme des Transmissionsspektrums: Detektion ungebeugter Photonen bei geringem Anodenstrom (I=1mA um Detektor nicht zu schädigen)

2. Division des Beugungs- durch das Transmissionsspektrum (Für manche Energien ist die Intensität im Transmissionsspektrum nahe null Hohe Intensitäten im Divisionsspektrum, allerdings lediglich in uninteressanten Randbereichen.)

Strahlungsintensität über Energien nicht konstant(aufgrund Bremsstrahlung & charakteristischer Linien)

Normierung des Beugungsspektrums mittels Transmissionsspektrum:Abgesehen von Rauscheffekten lässt sich so obige Intensitätsabhängigkeit herausfiltern

Messapparatur – Optimierung (I)


Vormessung mit Dipicolinsäure

Bestimmung der Netzebenen-

abstände d mittels Gauß-Fit

d [A] rel. Intensität

3.189 100

6.278 9

5.259 22

4.547 12

3.652 25

2.730 18

2.422 27

Messapparatur Optimierung (II) – mit xSim2001 v1.0


xSim2001 v1.0 Im Rahmen einer Diplom-Arbeit für diese Röntgenanlage erstelltes

Simulationsprogramm

basierend auf „Monte Carlo Verfahren“

Anlagenparameter einstellbar (Blendenöffnungen, Winkel, ROI,zu untersuchendes Objekt sowie dessen Position)

Simulation von Messungen (mit d-Werten) Durchführung von Simulationsläufen

für verschiedene Blendensysteme und Beugungswinkel

Ermittlung optimaler Parametereinstellungen

entsprechende Konfiguration der Röntenbeugungsanlage

Ergebnisse der besten Simulationen (Spektren)

Primäre Beugungsblenden: 1te Konfiguration: oben:0.4 mm, unten 0.25 mm

2te Konfiguration oben:1.5 mm, unten:1.25 mm

Sekundäre Beugungsblenden: gleiche Konfig. oben: 4.7/5.6 mm, unten 12.9/14 mm

Beugungswinkel: 38mrad

Messapparatur Optimierung (II) – xSim2001 v1.0 Screenshot


Darstellung simulierter Beugungsmessungen

Messapparatur – Messung (I)


Im Folgenden führten wir folgende Messungen durch:

1. Messung: Ca-DPA mit kleinen Blenden + Transmission

2. Messung: Ca-DPA mit großen Blenden + Transmission

3. Messung: Sporen + Untergrund + Transmission

Messapparatur – Messung (II)


Ca-DPA Messung bei einem Winkel von 38mrad

Primärblenden: 0.4mm / 0.25mm 1.5mm / 1.25mm

Messapparatur – Messung (III)


Sporen Messung bei einem Winkel von 38mrad Primärblenden: 1.5mm / 1.25mm

Gemessene Spektren Divisionsspektrum

Auswertung – Normierung (I)


Division der Spektren, dann:- Fit der Peaks und Bestimmung/Vergleich der d-Werte

- Untersuchung der Peakverbreiterung

- Rekonstruktion

Auswertung – Netzebenen (II)


Vergleich der d-Werte zu Referenz [1]

Gute Übereinstimmung bei gleichen Anlagenparametern(kleine Blendenkonfiguration)

Verschiebung zu größeren d-Werten bei größeren Blenden(wg. Asymmetrie)

Peak Energie [keV] d [Å] Abweichung [%]

1 38.04 ± 0.02 8.584 ± 0.005 -2.8

2 50.36 ± 0.02 6.484 ± 0.003 -1.5

3 69.34 ± 0.08 4.710 ± 0.006 +2.8

4 82.52 ± 0.05 3.957 ± 0.002 +0.1

5 98.23 ± 0.09 3.324 ± 0.003 +2.3

Auswertung – Blendenverbreiterung (III)


Aus der Winkelunsicherheit ΔΘ folgt eine Peakverbreiterung- Bragg-Gleichung liefert Energie … und daher Unsicherheit

- Winkelunsicherheit nicht exakt bekannt

Experimentelle Verbreiterungenaus Gauß-Fits werden gewichtetgefittet („Verbreiterungsfaktoren“)

Abschätzung zeigt Überein-stimmung mit Größenordnung

sin2d

nhcE E

d

nhcE

E

cotsin2

Auswertung – Faltung (I)


Dk

kngkfgf

Dgf

)()()(

:, Diskrete Faltung:

Problem: Nicht-konstanter Faltungskern verursacht im diskreten Fall „stark nicht-stetige“ Resultate

- Blendenverbreiterung ΔE ~ E

- Korngrößenänderung ΔE ~ 1/E

Abhilfe: Spline-Interpolation “zwischen zwei Kernen“

Realisierung eines Algorithmus mit Matlab

Auswertung – Faltung (II)


Verwendung von Gaußkernen

Beispiel: Faltung von zwei Peaks mit lin. Verbreiterung ~ E

2

0

2exp)(

w

xxAxg

Auswertung – Faltung (III)


Rekonstruktion der gemessenen Ca-DPA-Spektren aus- d-Werten

- Intensitäten

- Verbreiterungsfaktoren

Auswertung – Faltung (IV)


Vergleich mit Simulation

Fehlende d-Werte werden bestätigt

Ähnlich Resultate, jedoch geringere Übereinstimmung

Auswertung – Faltung (V)


Ziel: Rekonstruktion des relevanten Bereich des Sporenspektrums aus Ca-DPA Spektrum

Algorithmische Minimierungder Differenzspektren inMaximumnorm

Annahmen- Generelle Verschmierung durch

biologische Probe(Grundverbreiterung)

- Korngrößenverkleinerung deskristallinen Ca-DPA(Scherrerverbreiterung)

Auswertung – Faltung (VI)


Faltung von Ca-DPA Spektrum mit Verbreiterungskern

Aufgabe:Suche Verbreiterung, s.d. Abstände der beidenMaxima im Sporenspektrum mit denen im gefalteten Spektrum etwa übereinstimmen:

Auswertung – Korngröße (I)


Problem: Linker Peak weist zuwenig Intensität auf

Möglicher Grund: Korngrößenverkleinerung

Scherrer – Formel

- Hier ist Δ die Peakverbreiterung, K der Scherrer-Formfaktor und L die Korngröße

- Kleine Kristallite Größere Verbreiterung

Idee: Faltung des verbreiterten Spektrums mit einem gemäß 1/E verbreiternden Kerns.

EEL

Khc

L

K 11

coscos

Auswertung – Korngröße (II)


1/E Kernverhalten kann ersten Peak vergrößern

Recht gute Übereinstimmung, Abweichung 8-10 %

Aber: Zu ungenau – Verbreiterung korrespondiert zu Korngrößen im Bereich ~1nm nach Scherrer

Fazit - Ist Ca-DPA in den Sporen nachweisbar...?


Zusammenfassung Vormessung & Simulation

wichtige Voraussetzung zur Parameter-Optimierung

Messung und Auswertung der aufgenommenen Spektren Bestimmung der d-Werte,

Intensitäten

Halbwertsbreiten

Matlab-Analyse zur RekonstruktionSporen-Spektrums aus Ca-DPA-Spektrum mittels Faltung

Fazit / Ausblick Spektrum konnte mittels Faltung rekonstruiert werden

Ursachen der Verbreiterung nicht gänzlich geklärt

Bilden eines Entfaltungskern: Sporen Ca-DPA

Kurze Messzeiten & schnelle Algorithmen zur Auswertung für spätere kommerzielle Anwendung notwendig

Quellen

1. „Möglichkeiten zur Identifikation von Bakterien-Endosporen durch kohärente Röntgenstreuung“Diplomarbeit 2004DANIELA FELLINGER

2. „The Crystal Structure of Calcium Dipieolinate Trihydrate (A Bacterial Spore Metabolite)“Acta Cryst. (1968). B 24, 571GERALD STRAHS AND RICHARD E. DICKERSON

3. „Quantitative simulation of coherent X-ray scatter measurements on bulk objects“Journal of X-Ray Science and Technology 12 (2004) 83-96H. Bomsdorf, T. Müller, H. Strecker

4. Wikipedia Commons


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