Pharmazeutische Technologie und Medizinprodukte; Nanopharmazie_3

Nanopartikel zur Therapie und Diagnose

nawroth @uni-mainz.delangguth @uni-mainz.de

1. Prinzip, Typen von Nanopartikeln, Liposomen Teil 1

2. Herstellung, Charakterisierung, Liposomen & Lipoid-Partikel Teil 2

3. Magnetische Nanopartikel, Ferrofluide; Anwendungen

Polymere, Aerosole Bio-Ferrofluide, Poly-Ferrofluide : magnetisch

Nanopartikel Charakterisierung 8 Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS

• Partikel im Laser-Lichtstrahl erzeugen Interferenzmuster (Specles, 2D)

• Lichtstreu-Messung bei der nicht die Winkelabhängigkeit, sondern die zeitliche Schwankung ermittelt wird

• Das Streulicht schwankt im Maße der Brown‘schen Molekularbewegung, d.h. der Diffusion (Temperatur-abhängig).

• Bei Nanopartikeln erfolgt die Variation im µs-Bereich –> schneller Detektor.

• Analyse durch Autokorrelationsfunktion(Häufigkeits-Analyse).

• Die Interpretation mit allgemeinen Streugesetzen (I ~r6, M ~r3 etc.) liefert die Massenzusammensetzung der Probe aus Partikelpopulationen verschiedener Größe

• Bei konzentrierten Proben (Pharma-NP‘s) muß in Rückstreuung gemessen werden (170°)

Specles

Laser-Lichtstrahl

NP‘sBewegung

µs

Nanopartikel Charakterisierung 9 Partikelgrößenverteilung : Dynamische Lichtstreuung DLS

Schritte einer DLS-Untersuchung :Messung:

• Bestimmung der zeitlichen Schwankung des Streulichts für ca. 30s -5 Minuten : I(t)

• Automatische Ermittlung der Auto-Korrelationsfunktion C(τ)

Auswertung (PC):• Komponentenanalyse der Auto-

Korrelationsfunktion: regularized Fit- ergibt die Streubeiträge (τ)- Software: z.B. von ALV (Langen)

• Umrechnung in die unskalierte Partikelgrößenverteilung P(r)= Beiträge zum Streulicht

• Umrechnung in die massen-skalierte Partikelgrößenverteilung M(r)= Massenanteile an der Probe

(Gewichts-%, relativ)

DLS-Untersuchung von Liposomen (Dissertation T. Peters)

Struktur von therapeutischen Nanopartikeln :die medizinische Sicherheit hängt von den Eigenschaften ab

• Chemical and spectroscopy analysis of targetentrapping and release, and of components

• Average particle size estimation bydynamic light scattering DLS (PCS)

• Structure of individual particles byelectron microscopy (TEM)

• Structure and dynamics investigation byneutron small angle scatteringSANS and TR-SANS (time-resolved)at ILL-D22

• Structure and target localization byanomalous X-ray scattering ASAXS and EXAFS at L-edges: at ESRF-ID1

• Target absorption at therapeutically usedK-edges : at ESRF-ID17

TEM of a liposome (SUV) bearing Gd-DTP-DMPE

DLS of a disk-shapedPoly-Ferrofluid (160x10nm)for medical applications

SANS of a liposomes yields size & volume@ ILL-D22.

Lanthanide Nano-targetbiocompatible Gd-citrateformulation @ ESRF-ID1

Nanoparticles for therapy can carry drugs of radiation therapy targets (lanthanides).A size of 100 nm is optimal in load and avoidsembolic, which appears, if >500 nm

The nanoparticles are characterized by:

embolicrisk limit

(Charakterisierung - 8)

Nanopartikel Charakterisierung Zusammenfassung

Analytik im Apothekenbereich und Klinik-Qualitätssicherung (QS) :

Kostenlimit (20 – 50 000 € / Gerät)

- Sterilitätstest / Mikrobiol. Untersuchung,

- Photometrie,

- Mikroskopie zur Partikeluntersuchung / Überprüfung

- DLS (spezifische Identitätsprüfung)

Zusammenfassung Analytik:

Erweiterte Analytik im F&E - Bereich- Streumethoden (Röntgen-, Neutronen-Streuung- Elektronenmikroskopie, DLS, magnetische Untersuchung- Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenz-Spektroskopie, Lumineszenz- Dissolutionstest / Freisetzungsstudie- Biokompatibilität / Toxiditätsanalyse- Wirksamkeit : Zellkultur-Tests- Wirksamkeit : Tierversuche - Wirksamkeit : Klinische Tests (I, II, III)

• Der in Liposomen verkapselte Wirkstoff (Target) kann jeder Wasser-lösliche Stoff sein, z.B. Metallverbindungen für die Strahlentherapie, Wirkstoffe für Chemotherapie: MDT.

• Der in Lipoid-Partikel oder Aerosol-Partikel gelöste Wirkstoff kann jede lipophile Verbindung sein, z.B. Wirkstoffe für die Chemotherapie, Diagnose: MDT , Bildgebung.

• Polymere, Membranproteine und Oberflächengebundene Peptide • Magnetische Liposomen können Metall in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid

Liposomen b) Liposomen mit verkapselten Maghemite Nanopartikeln, c) Metaloxide-LipidDoppelschalen-Liposomen. Der gebundene Wirkstoff (Target (T)) ,z.B. GdDTPA, drugs kann selektiv und zeitlich definiert freigesetzt werden (Lokalisation und Zeitsteuerung).

• Binäre Schalen- und Poly-Ferrofluide (d) enhalten z.B. ~ 10 - 100 magnetische Core-Partikelvon 10-20 nm Größe. Durch gezielte Struktur-Synthese können 5% Wirkstoff gebunden werden.

4 Typen von Pharma- Nanopartikeln :

Liposomen, Lipoid-partikel, Polymere, Ferrofluide

Liposome (30 – 500 nm) Lipoid-Particle Polymer Ferrofluid / magn-NP magnetic liposomeMicrosphere -------Aerosol particle--------- Poly-Ferrofluid multicomponent NP

kombinierte Partikel:

Wirkstoff-Zielsteuerung zu Zellen : TargetingChemotherapie, Nano-RT, -PDT, Imaging

Nanopartikel können die Therapie und Diagnose durch Lokalisierung verbessern :

• Verstärkte (Enhanced) Radiotherapie mit Bio-Nanopartikeln ist möglich mit: (a) hohlen Target-Liposomen, Lipoid-Partikeln, Polymeren oder (b) binären Poly-Ferrofluiden, die ~ 1,000,000 Wirkstoffmoleküle in kolloidalen Partikeln von 100 nm Größe konzentrieren. (50-500 nm is ok.)

• Regioselektivität kann erzielt werden durch: Diffusions-Restriktion, (c) magnetische Target-nanopartikelin eine, magnetischen Feld-Gradienten, (d) Rezeptor-Ligand Interaction und/ oder Immuno-Nanopartikel, die specifische Antikörper, Antigene tragen.

• Kompatible Methoden sind mit Nanopartikeln parallel möglich: MDT, RT, PAT, PDT, NCT, imaging: PET, MRI

magnetic drug targeting MDT: C. Alexiou, R. Schmid, R. Jurgons, M. Kremer, M. Wanner, C. Bergemann, E. Huenges, T. Nawroth, W. Arnold, F. Parak (2006) Eur. Biophys. J. 35, 446-450

Zielsteuerung : Magnetic Drug Targeting MDTmagnetische Partikel – externe Manipulation

• Magnetische Partikel:- Kraftwirkung im magnetischen

Feld-Gradienten- sekundäre Strukturbildung im

magnetischen Feld

• Ferrofluide:– Superparamgnetische Partikel

(keine magnetische Remanenz)– Zwei Strukturebenen möglich:

• Magnetische Kernpartikel (Cores)– typische Partikelgröße 10 nm– Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle– Technische Ferrofluide in Öl !!

• Poly-Ferrofluide– Typische Partikelgröße 100 nm– großes magnetisches Moment– im Blutstrom lokalisierbar

Technisches Ferrofluid (in Öl) im magnetischen Feld

Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -2magnetische Partikel – externe Manipulation

Ferrofluide:– Superparamgnetische Partikel

(keine magnetische Remanenz)– Zwei Strukturebenen möglich:

• Magnetische Kernpartikel (Cores)– typische Partikelgröße 10 nm– Bio-Ferrofluide mit hydrophiler Hülle– Technische Ferrofluide in Öl !!

• Poly-Ferrofluide– Typische Partikelgröße 100 nm– großes magnetisches Moment– im Blutstrom lokalisierbar

• Gebundene Pharmaka: – Polymerhülle ums Ferrofluid– als Gegenion an einem Hüllpolymer– In Poren eines Hüllpolymers

Bio-Ferrofluide : Magnetic Drug Targeting MDT -3magnetische Partikel – Wirkstoffbindung und Freisetzung

Beladenes Ferrofluid

Applikation Patient / Tier ... lokale Infusion ( 30 min )Im Magnetfeld (Feldgradient)

Immobilisiertes Ferrofluidim Zielorgan / Tumor

+ NaCl (Blut .... 130 mM Na+)Elution des Pharmakums ( 1h )

Pharmakum-Bindung und Wirkung im TumorTage -Wochen

Strukturprinzip von pharmazeutischen Hüll-Ferrofluiden:

Die geladene Polymerhülle bindet den Wirkstoff als Gegenion(magnetische Ionenaustauscher)

Beispiel: Phosphodextram + Mitoxantron

Magnetic Drug Targeting MDT -4Chemotherapie – Anwendung (Krebstherapie)

• Chemotherapie mit magnetischem Drug-Targeting MDT im Tierversuch

• Poly-Ferrofluid mit gebundenem Mitoxantron

• Intra-Arterielle Gabe (Arterie führt zum Tumor am Bein)

• Konzentration der NP‘s im magnetischen Gradienten (1,7 T)

• Freisetzung durch das Na+ im Blut (in 1 h)Lit.: Alexiou, Schmid, Jurgons, Kremer, Wanner, Bergemann ,Huenges, Nawroth, Arnold, Parak (2006) Eur. Biophys. J 35, 446-450

EM-Analytik:Histologie (links),EDX-Raster-EM (rechts)

VX-2 squamous cell Carcinom: Kaninchen

TEM des Therapiematerials (non-stained)

• Magnetische Liposomen können Metalle in drei Strukturen enthalten: a) Metallo-Lipid liposomen b) Liposomes mit eingeschlossenen Maghemite NanoPartikeln (cores), c) Metall-oxide-Lipid Doppel-Schalen Liposomen. das wasserlösliche Strahlen-Target (T, enhancer) ist im Lumen eingeschlossen: GdDTPA, Borat, Chemotherapeutica

• Das liposomal verkapselte Target kann jede wasserlösliche Verbindung sein, z.B. Lanthanid-DTPA‘s (Gd - Lu), Hf, Boron-Diol-Ester oder Wirkstoffe für die Chemotherapie: MDT.

• Hyperthermie : Magnetische Nanopartikel können durch Mikrowellen-Absorption zur Wärmetherapie genutzt werden. Dazu genügt eine Temperatur von 42-43°C.

Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln : Magnetische Target-Liposomen

• Non-stained electron micrographs of the three types of metallo-target-liposomes: a) membrane metal liposomes (Gd outside), b) core entrapped vesicles (10nm cores), and c) shell layer metal liposomes. The images depict the burried metal directly.

• The membrane metal liposomes (a) contained 5% Gd- loaded chelate-head lipid DTPA-DMPE in DMPC, as in ESRF-experiments with ASAXS at ID01.

• The entrapped core vesicles (b) contained sub-nanoparticles (10-15 nm cores, chromatographically purified γ-Fe2O3) and loaded with Gd-DTPA, Eu-DTPA, as at ESRF

• The shell layer liposomes (c) had a double layer of lipid and γ-Fe2O3, and were investigated by time resolved neutron scattering TR-SANS at ILL-D22

Elektronenmikroskopie von Metallo-Liposomen :Magnetische Target-Liposomen, Poly-Ferrofluid

Tris2Gd-DTPA, Polyferrofluid PF100C (FerroMed), MRI-analog: Magnevist(S h i )

Nawroth, Rusp, May (2004) Physica B350, e635-638

Struktur Prinzipien von Target-Nanopartikeln : Protein-haltige Liposomen zur Zielsteuerung

• Nanopartikel können durch Oberflächen-Modfikation zielgesteuert werden• Geeignete Wechselwirkungen / Strukturen:

- Ligand – Rezeptor-Protein: Ligand am NP , z.B. zur Endocytose- Ligand – Enzym-Protein: Ligand am NP- Ligand – Enzym-Protein: Protein am NP

- Antigen – Antikörper : Antigen am NP …. Tumor-spezifische …- Antigen – Antikörper : Antikörper am NP

Membran-Proteine und Lipid-gebundene Liganden können mit Verfahren aus der Membranbiochemie gerichtet in Liposomen und NP‘s rekonstituiert werden

Gerichtete Protein-Rekonstitution in Liposomen (Tutus et al., Makromolecular Bioscience 8, 1034 (2008)

Indirekte Strahlentherapie IRT : sekundäre Strahlungsprodukte inaktivieren Krebs-Zellen

1) Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a local target by specific absorption of

a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron : PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy),

b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapyc) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons):

NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium),d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons :

Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV)

…. four sources with a common principle

2) Chemotherapy drugs convert temporal radiation demages (single strain breaks) to letal radiation demages, which cannot be repaired by the cells. Example: cis-Platinum.

Indirekte Strahlentherapie IRT - 2 : Erzeugung der sekundäre Strahlungsprodukte

Secondary radiation or products of short range (30 µm) evolve from a local target by specific absorption of

a) X-ray photons (medium energy, 60 keV) of a synchrotron : PAT, photon activation therapy (= PXT, photodynamic X-ray therapy),

b) IR-light photons (water filtered) absorbed at organic target: PDT, photodynamic therapyc) Neutrons from a reactor (thermal or cold neutrons):

NCT, neutron capture therapy (with Boron or Gadolinium),d) High energy photons produce DNA-lesions and free electrons :

Photon therapy PT, (clinics standard: 6-15 MeV)

…. four sources with a common principle

PAT Entwicklung bei ESRF : Tier-Imaging, Tests (Ratte)Therapie und Imaging von Ratten unter Anaestesie

• Animals are prepared for imaging and therapy in the biomedical facility BMF: aseptic animal house, ethically correct

• Transfer and treatment under anestesia

• Beam from a wiggler (30-300 keV) is a line (max. 1 x 200 mm)

• Monochromatic beam (double crystal):below / above K-edge (on-off)

• Client is rotated and elevated (hight) in the beam – stereotactic irradiation:high dose at tumor only

• Image reconstruction from sinograms:tumor localization before treatment

PAT Entwicklung bei ESRF : Tiervesuche (Ratte, F98-Zellline)

Therapie Versuche mit Tumorratten, Imaging und PAT-IRT• Tumor rats were induced with

F98 cancer cells (104, 5 µl).• The animals showed tumors of

~ 2-4 mm size after 14 days

• Imaging (350 µm) at iodine K-edge forlocalization of tumors (33 keV, Iopamidole 2 ml i.V.)

• Subsequent intracranial application of target-liposomes (15 µl, 40 mg/ml)

• Irradiation at Lutetium K-edge (15 Gy at tumor, 64 keV, tomographic method)

• 3D-alignment of sCT, target injection, and radiation treatment (tomographic)

Synchrotron-tomography sCT of a rat bearing a brain tumor from F98 cells by K-edge contrastimaging with Iopamidole @ 33 keV (iodine-K).

The images were obtained with a Ge-detector.

tumor

Iopamidol contrast:

PAT Entwicklung bei ESRF : erfolgreiche Tierversuche (Ratte)

Therapieversuche mit Tumor-Ratten und Lanthanid-Nanopartikeln

• Tumor rats wereinduced with F98 cancer cells (104).

• The animals showedtumors of ~ 4 mm size after 14 days.

• After intracranicalinjection of 10µl target-drug an indirect radiationtherapy test (10 Gy, at K-edge) was donewith 1 h delay by thetomographictechnique (rotating)

• Prolonged survivalof animals, which gotGd-DTPA and Lu-DTPA in liposomes, indicated a successfulIRT treatment.

Survival curves of tumor rats in animal tests of indirectradiation therapy with Lanthanide targets and Nanoparticles.

The tumor were induced at day 0, the IRT treatment was doneat day 14. Additionally the tumors were detected by imaging.

tumor

PAT

Tris2Lu-DTPA, Tris2Gd-DTPA (FerroMed), MRI-analog: Magnevist (Schering)

Anwendungen von pharmazeutischen Nanopartikeln : Liposomen – Produkte, parenteral

•AmBisome, Albelcet ;Membran-intercaliertes Amphotericin BSUV, gefriergetrocknet, Lipid: H-SPC (hydriertes Soya-PC), Cholesterin, DSPG

•DaunoXomeEncapsuliertes Daunorubicin : KrebstherapieSUV, wässrige Suspension : im Blut stabilLipid: DSPC, Cholesterol

•Doxil (und Myocet)Encapsuliertes Doxorubicin : KrebstherapieLUV, wässrige Suspension : im Blut 4 Tage stabilLipid: MPEG-DSPE, H-SPC, CholesterinAmmonium-Gradient hält den Wirkstoff in den LUV

•VisudyneMembran-intercaliertes BenzoporphyrinSUV, gefriergetrocknet : in Blut instabil, schnelle Freis.Lipid: Ei-PG + DMPC + Antioxidatien

•JunovanMembran-intercaliertes MTP-PE : Krebstherapie

MLV , in-situ präpariert : im Blut instabil, Phase-IIILipid: POPC / OOPS : negativ geladen -> Makrophagen

F. Martin / www.fda.gov