Nukleinsäuren: Replikation und Transkription · DNA Replikation Bei der Zellteilung muss die DNA...
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Nukleinsäuren: Replikation und Transkription
Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):
Biochemie 06/1
DNA Replikation
Bei der Zellteilung muss die DNA schnell, effizient und korrekt vermehrt werden.
Aus einem Doppelstrang werden zwei identische Tochter-Stränge, wobei das Experiment von Meselson & Stahl gezeigthat, dass die DNA-Replikation semikonservativ verläuft.
Biochemie 06/2
DNA-Replikation
Biochemie 06/3
DNA Polymerisation
DNA-Polymerase(DNA-abhängig)
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Biochemie 06/4
DNA-Polymerasen
E. coli: DNA-Polymerase I, II, III (Pol I, Pol II, Pol III)
Pol I Pol II Pol IIIMasse (kD) 103 90 130Moleküle/Zelle 400 ? 10-20Wechselzahl* 600 30-60 60.000Strukturgen polA polB polCLetale Mutante + - +Polymerase:
5‘3‘ + + +Exonuclease
3‘ 5‘ + + +5‘ 3‘ + - -
*neue Nucleotide/min und Molekül bei 37°CBiochemie 06/5
Polymerisationsrichtung: 5‘3‘
Die DNA-Polymerisation verläuft immer in 5‘3‘-Richtung!!!!DNA-Polymerase kann nur Oligonucleotide verlängern!
ElternstrangFolgestrang (Okazakifragment)Leitstrang
Bewegung derReplikationsgabel
Biochemie 06/6
DNA-Replikation
• Entwindung der DNA: Einzelstrang• Stabilisierung der Einzelstränge• RNA-Primer durch Primase• Verlängerung durch DNA-Polymerase III• Leit- und Folgestrang• Nick-Translation durch DNA-Polymerase I• DNA-Ligase
Biochemie 06/7
DNA-Replikation bei E. coli
Untersuchung mit Hilfe von AutoradiogrammenReplikationsauge: Θ-Struktur
Biochemie 06/8
Replikations-Typen
Biochemie 06/9
Initiation der Replikation
• oriC-Locus: 245 bp, stark konserviert,„Origin of Replication“
• 30 UE von DnaA-Protein (52 kD) binden an oriC, schmelzen DNA auf
• Helikase: DnaB (Hexamer) entwindet DNA,ATP-abhängig
• Einzelstrang-Bindungsproteine (SSBs) stabilisieren die einzelsträngige DNA
Biochemie 06/10
Initiation der Replikation
Biochemie 06/11
Komplex aus SSB und DNA
ssDNA
SSB
Biochemie 06/12
Primase (DnaG)
• DNA-abhängige RNA-Polymerase• Synthese eines RNA-Primers durch Primase (DnaG)• Teil des Primosom (mit DnaA, DnaB, PriA,B,C, DnaT)
Biochemie 06/13
RNA-Primer
• 10-12 Basen lang• etwa alle 1000 Basen auf der DNA (Folgestrang)
Biochemie 06/14
RNA-Primer
Okazaki-Fragmente:• Prokaryonten: 1.000-2.000 Basen• Eukaryonten: 100-200 Basen
Biochemie 06/15
Replikation
• Entwindung der DNA: Einzelstrang• Stabilisierung der Einzelstränge• RNA-Primer durch Primase• Verlängerung durch DNA-Polymerase III• Leit- und Folgestrang• Nicktranslation durch DNA-Polymerase I• DNA-Ligase
Biochemie 06/16
DNA-Polymerase III
Holoenzym: Multiproteinkomplex
Biochemie 06/17
Komponenten der DNA-Polymerase III (E. coli)
Biochemie 06/18
DNA-Polymerase III
Core-Enzyme:α-Untereinheit: Polymerase 5‘3‘ε-Einheit: Exonuclease 3‘5‘θ-Einheit: Hilfsprotein
Biochemie 06/19
DNA-Polymerase III
β-Untereinheit: sliding clamp
Biochemie 06/20
DNA-Polymerase III
β-Untereinheit: sliding clamp
Biochemie 06/21
DNA-Polymerase III
Core-Enzym: 10-15 BasenHoloenzym: >5.000 Basen!
Prozessivität:
Katalyse-Zyklen, ohne vom Substrat abzufallen
Biochemie 06/22
DNA Rotation
Biochemie 06/23
DNA Rotation
Replikationsgeschwindigkeit (E. coli):
500-800 Nukleotide/sec
50-80 Rotationen/sec wären nötig!(~3.000-5.000 rpm)
großer Energie-Verbrauch!
Biochemie 06/24
DNA Rotation
Topoisomerase
Biochemie 06/25
DNA Rotation
Replikationsgeschwindigkeit (E. coli):
500-800 Nukleotide/sec
50-80 Rotationen/sec wären nötig!(~3.000-5.000 rpm)
großer Energie-Verbrauch!
Biochemie 06/26
RNA Primer
RNA Primer(müssen noch gegen DNA ausgetauscht werden!)
Biochemie 06/27
DNA-Polymerase I
928 Aminosäuren
Polymerase5‘3‘
Exonuklease3‘5‘ erlaubt eigene Fehlerkorrektur5‘3‘ repariert Einzelstrangbrüche, entfernt RNA Primer
Biochemie 06/28
DNA-Polymerase I
Exonuklease 5‘3‘Polymerase 5‘3‘
Nick
Nick Translation
Biochemie 06/29
DNA-Polymerase I
Exonuklease 5‘3‘Polymerase 5‘3‘
*
* * * * *
radioaktive Markierung der DNA
Biochemie 06/30
DNA-Polymerase I
Exonuklease 3‘5‘ Korrekturfunktion (Proofreading)
Biochemie 06/31
DNA-Ligase
Biochemie 06/32
DNA-Ligase
NAD+
ATP
Biochemie 06/33
Replikations-Gabel (3D)
Biochemie 06/34
Replikations-Gabel (3D)
Biochemie 06/35
Termination der Replikation
Ter-Sequenz: ~23 bp350 kb Region DNA Polymerase
DNA Polymerase
Biochemie 06/36
Termination der Replikation
Tus-Proteinebinden anTer-DNA
Ter-Sequenz: ~23 bp350 kb Region DNA Polymerase
DNA Polymerase
Biochemie 06/37
Termination der Replikation
Tus-Protein (Terminator utilization substance) mit ter-DNA
Biochemie 06/38
Replikation
E. coli:Replikation des Genoms: 35-40 min.Zellteilung: 20 min!
Biochemie 06/39
Replikation
E. coli:Replikation des Genoms: 35-40 min.Zellteilung: 20 min!
Biochemie 06/40
Replikation bei Eukaryonten
Biochemie 06/41
Zellzyklus
Mitose
Interphase
Biochemie 01/42
Replikation bei Eukaryonten
• DNA-Polymerase fest assoziierte Primase-Aktivität, keine Exonuclease-Aktivitätsynthetisiert ca. 100 nt
• DNA-Polymerase im Komplex mit PCNAExonuclease-Aktivitäthohe Prozessivität
• DNA-Polymerase Exonuclease-Aktivitäthöchste Prozessivität
• DNA-Polymerase β (Reparatur)• DNA-Polymerase γ (Mitochondrien)
Folgestrang-Polymerase
(proliferating cellnuclear antigen)
Leitstrang-Polymerase
Biochemie 06/43
Initiation bei Eukaryonten
Menschliches Genom:3x109 bp
E. coli Genom:4.7x106 bp
Biochemie 06/44
Initiation bei Eukaryonten
Biochemie 06/45
Eukaryontische Sliding Clamp
Prokaryonten:
Eukaryonten:
Biochemie 06/46
DNA-Polymerase β
DNA-Polymerase βKlenow Fragment
Biochemie 06/47
Replikationsauge
E. coliD. melanogaster
Biochemie 06/48
Verteilung der Nukleosomen
Biochemie 06/49
Ligase (Eukaryonten)
Biochemie 06/50
DNA-Ligase (Eukaryonten)
NAD+
ATP
Biochemie 06/51
ATPPPi
ATP
Termination bei Eukaryonten
Prokaryonten: Eukaryonten:
meist zirkulär linear
Biochemie 06/52
Termination bei Eukaryonten
Biochemie 06/53
Telomerase
Telomerase ist ein Ribonucleo-Protein!
Protein- und RNA-UntereinheitBiochemie 06/54
Telomerase
Biochemie 06/55
Telomer-Struktur
Hoogsteen-Wasserstoffbrücken
G-Quartett
Biochemie 06/56
Nukleinsäuren: Replikation und Transkription
Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):
Biochemie 06/57
Transkription
DNA:
RNA:
Biochemie 06/58
Transkription
DNA:
RNA:
Biochemie 06/59
Transkription
RNA:
Biochemie 06/60
Transkription
RNA:
Biochemie 06/61
(3) (-)
Transkription
Biochemie 06/62
Transkription
DNA: Sense/codierender StrangDNA: Antisense/nicht codierendRNA: Transkript
(codogen)
Biochemie 06/63
Transkription
Biochemie 06/64
RNA-Polymerase in E. coli
Biochemie 06/65
RNA-Polymerase: E. coli
RNA Polymerase Klenow Fragment
Biochemie 06/66
RNA-Polymerase: E. coli
RNA Polymerase
Cα–Kette von analogem Segment der KLENOW-DNA-Pol
Biochemie 06/67
Transkriptionsstart
Replikation:
Transkription:
Primer-abhängig!
Primer-unabhängig!
Biochemie 06/68
Promotor
Biochemie 06/69
Promotor
Konsensussequenzen: codierender Strang
-35-Region -10-Region
Biochemie 06/70
Transkriptionsstart
geschlossener Komplex
Bindung der RNA-Polymerase mittels Sigma-Faktor
+
Biochemie 06/71
Transkriptionsstart
Sigma-Faktor: Helix-Turn-Helix-Motiv
große Furche
Erkennung
Fixierung
Biochemie 06/72
Transkriptionsstart
geschlossener Komplex
offener Komplex
Aufschmelzen des Doppelstranges
Biochemie 06/73
Transkriptionsstart
offener Komplex
Transkription ohne Sigma-Faktor
Biochemie 06/74
Transkriptionsstart
Biochemie 06/75
Transkription
Synthese verläuft in 5‘ 3‘-Richtung(analog der DNA-Synthese)
EM-Aufnahme bakterielle Transkription von zwei rRNA Genen
Biochemie 06/76
Termination der Transkription
Terminator
Biochemie 06/77
Termination der Transkription
Rho-unabhängigerTerminator
Biochemie 06/78
Termination der Transkription
Biochemie 06/79
Organisation bakterieller Gene
Operon-Struktur
mRNAZ Y A
Biochemie 06/80
Transkription bei Eukaryonten
RNA-Polymerase II (Hefe)
DNARNA
Roger KornbergStanford
Nobelpreis Chemie 2006:
Biochemie 06/81
Transkription bei Eukaryonten
• RNA-Polymerase I: synthetisiert rRNA• RNA-Polymerase II: synthetisiert mRNA• RNA-Polymerase III: 5S-rRNA, tRNAs,
nukleäre und cytosolische RNAs
• Multimere Proteinkomplexe:2 große, nicht identische UE (>100 kD)< 12 kleine UE (<50 kD)
Biochemie 06/82
Transkription bei Eukaryonten
T. aquaticus S. cerevisiaePol II
Biochemie 06/83
Transkriptionsstart
Konsensus-Sequenz des Transkriptionsstarts der RNA-Polymerase II
-70 bis -90CCAAT-Box
Biochemie 06/84
Transkriptionsstart
Weitere Regulationselemente: Enhancer, …
Biochemie 06/85
Transkriptionsstart
Biochemie 06/86
Präinitiationskomplex
PIC: Präinitiationskomplex Biochemie 06/87
Transkription bei Eukaryonten
Biochemie 06/88
RNA Prozessierung
Biochemie 01/89
RNA Prozessierung
GMP-Addition, Methylierung der ersten Nukleotide
Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten
Entfernen von Introns
Biochemie 01/90
Struktur einer eukaryontischen mRNA:
5‘-Kappe
Biochemie 01/91
5‘-Kappe
• 7-Methylguanosin über 5‘, 5‘-Triphosphat an 5‘-Ende
• Guanylyltransferase:an Transkripte über 20 nt
• Export aus dem Zellkern
• verhindert Abbau durch Exonukleasen, erhöht die Stabilität der mRNA
• Ribosomen-Assembly
Biochemie 01/92
5‘-Capping-Mechanismus
S-Adenosyl-Methionin(SAM)
S-Adenosyl-Homocystein
Biochemie 01/93
RNA Prozessierung
Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten
Entfernen von Introns
Biochemie 01/94
Struktur einer eukaryontischen mRNA:
3‘-Polyadenylierung
• Poly(A)-Schwanz am 3´-Ende nach der Transkription durch Poly(A)-Polymerase
• erhöht die Stabilität am 3´-Ende gegenüber Exonuklease
Biochemie 01/95
RNA Prozessierung
Entfernen von Introns
Biochemie 01/96
Struktur einer eukaryontischen mRNA:
Exon/Intron-Struktur
Biochemie 01/97
Exon/Intron-Struktur
Biochemie 01/98
Exon/Intron-Struktur
Exons: Expressed Regions; Bereiche in DNA/RNA, die für Teile des Proteins codieren
Introns: Intervening Regions; DNA-/RNA-Bereiche zwischen Exons, die nicht codieren und auf RNA-Ebene entfernt werden müssen
Biochemie 01/99
Konsensus-Sequenz der Exon/Intron-Grenzen
G100=100% G, A60 = 60% A etc.
Biochemie 01/100
Herausschneiden von Introns: Splicing
Biochemie 01/101
Splicing
Splicing.mov
Biochemie 01/102
Posttranskriptionale Modifizierung
GMP-Addition, Methylierung der ersten Nukleotide
Schnitt der prä-mRNA und Addition von A-Resten
Entfernen von Introns
Biochemie 01/103
Struktur einer eukaryontischen mRNA:
Alternatives Splicing
Biochemie 01/104
Alternatives Splicing
- neue, zusätzliche Funktionen- andere Regulation, andere Substratspezifität
Biochemie 01/105
Alternatives Splicing
Humanes Genom:
Caenorhabditis elegans: 19.000Drosophila melanogaster: 14.000Saccharomyces cerevisiae: 6.500Arabidopsis thaliana: 26.000
bis zu 75% aller humanen Gene mit alternativem Splicing!
Biochemie 01/106
Reifung der mRNA
Biochemie 01/107
Zentrales Dogma der Biologie
Das Zentrale Dogma (F. Crick, 1956):
Biochemie 07/108