Optimale Trennungen stationären Phasen - APPLICA 2017 · ACE AQ ACE C18 ACE C18‐AR ACE C18‐PFP...

© Dr. Juergen Maier-Rosenkranz 2014

Der HPLC Säulenmarkt hat eine noch nie dagewesene Komplexität erreicht und für heutige Anwender ist es zunehmend schwieriger zu entscheiden welche Säulen bzw. Stationäre Phasen am besten zur jeweiligen Anwendung passen würde.Neben modernen totalporösen (C18) Standardphasen werden heute insbesondere Hybrid‐ und/oder Fused Core Materialien eingesetzt.Erster Schritt um dieser Komplexität zu begegnen ist, dass man sich mit den Parametern zur Charakterisierung einer Stationären Phase auseinandersetzt. Basierend auf einer „Art Steckbrief“ können Phasen leichter verglichen und auch entsprechend den Anwendungen zugeordnet werden. Im zweiten Schritt zeigen Beispiele welcher Phasentyp eignet sich für welche Anwendung unter welchen Bedingungen. Ein wichtiger Bereich sind auch die Einflüsse der HPLC Geräte die in diesem Zusammenhang angesprochen werden. Ein kurzer Ausblick in die Zukunft soll zeigen was eventuell demnächst ins Labor kommt.

Optimale Trennungen mit neuen stationären Phasen


Stationäre Phasen

ACE C18‐300ACE AQACE C18ACE C18‐ARACE C18‐PFPAccQTag UltraACQUITY CSH C18ACQUITY UPLC BEH130ACQUITY UPLC BEH 300ACQUITY UPLC BEH C18ACQUITY UPLC BEH Shield RP18ACQUITY UPLC HSS C18ACQUITY UPLC HSS C18 SBACQUITY UPLC HSS T3ACQUITY UPLC OST C18Adsorbosil C18Adsorbosphere C18Adsorbosphere HS C18Adsorbosphere UHS C18Adsorbosphere XL 300 C18Adsorbosphere XL C18Adsorbosphere XL C18‐BAllsphere ODS‐1Allsphere ODS‐2Allure C18Allure Aqueous C18Alltima C18Alltima C18 LLAlltima HP C18Alltima HP C18 EPSAlltima HP C18 Hi‐LoadAlltima HP C18 AQAlltima HP C18 AmideAlltima WP C18AlphaBond C18Amethyst C18AminoQuantAPEX ODSApollo C18AQUA C18

Chemcosorb 5‐ODS‐H

Chromegabond C18

Chromegabond WR‐C18

Chromolith RP‐18e

Clarity Oligo‐MS

Clarity Oligo‐RP

Clipeus C18

Cogent HPS C18

Cogent hQ C18

Cogent Simulare C18

Cogent MicroBee C18

Cogent Bidentate C18

Cogent e‐Column C18

Cosmosil C18 MS‐II

Cosmosil C18 AR‐II

Cosmosil C18 AR‐300

Cosmosil C18 PAQ

Delta‐Pak C18

Denali

Develosil ODS

Diazem 2060 C18 60A

Diazem 300A C18 4‐222

Diazem 4‐206 C18

Diazem 4‐230 C18

Diazem 4‐246 C18

Diazem 4‐247 C18EC

Diazem C18

Diazem C18 1000

Diazem C18 1120

Diazem C18 120A

Diazem C18 120A series 43,44,45 and 46

Diazem C18 series 200A, 300A

Diazem C18 series 2000



Diazem C18 60A

Diazem C18 60A series 1,2,3

Diazem C18 series EC

Diazem C18 Dual‐Zone

Discovery C18

Discovery HS C18

Discovery BIO Wide Pore C18Econosil C18Econosphere C18Everest C18Fortis C18Fortis H2oGammabond C18Gemini C18Gemini‐NXGenesis C18GP‐C18GraceSmart C18Haisil 100, 300 C18Haisil HL C18HALO C18HALO Peptide ES‐C18Hi Chrom Reversible ODSHibar II C18Hibar ODSHP‐C18HxSil C18HydroBond PS‐C18High Strength Silica (HSS) C18High Strength Silica (HSS) C18 SBHigh Strength Silica (HSS) T3Hyperclone BDS C18Hyperclone ODS (C18)Hyperprep HS C18Hypersil 100 C18Hypersil BDS C18Hypersil GOLDHypersil GOLD aQHypersil‐ODSHypersil ODS‐2Hypersil Green PAH HyPURITY AQUASTARHyPURITY C18IBM OctadecylIB‐SIL C18IB‐SIL C18 BD

Inertsil ODSInertsil ODS series 1,2,3ISCO C‐18J’Sphere ODS‐H80J’Sphere ODS‐L80J’Sphere ODS‐M80Jupiter C18Kinetex C18Kinetex XB C18Kromasil C18Kromasil Eternity C18LiChrospher PAHLiChrosorb RP‐18LiChrospher 100 RP‐18LiChrospher RP18eLuna C18Luna C18(2)Macrosphere 300 C18MetaSil AQ C18MetaSil ODSMetroSep C18HMetroSep C18AQMetroSep C18 AQ+MetroSep C18SHMetroSep C18EPSMPLC RP‐18µBondapak C18µBondapak C18 Radial‐PakMicrosorb C18MicroSpher C18 MonoChrom C18nanoAcquity BEH130nanoAcquity BEH300Nova‐Pak C18NUCLEODUR C18 GravityNUCLEODUR C18 HTecNUCLEODUR C18 IsisNUCLEODUR C18 PAHNUCLEODUR C18 PyramidNUCLEODUR 100 C18 ec

Sunfire C18 Sunsil C18SUPELCOSIL LC‐18SUPELCOSIL LC‐18‐DBSUPELCOSIL LC‐318SUPELCOSIL LC‐PAHSUPELCOSIL LC‐18‐TSUPELCOSIL LC‐18‐SSuperiorexSuperspher 100 RP‐18Superspher RP18eSymmetry C18SymmetryPrep C18Symmetry300 C18SymmetryShield RP18SynChropak RPPSynChropak RPP‐1000SynChropak RPP‐4000SynChropak RPP‐100SynChropak RPS‐100Synergi Fusion‐RPSynergi Hydro‐RPTarga C18TSKgel ODS‐100VTSKgel ODS‐100ZTSKgel ODS‐100STSKgel Super‐ODSTSKgel ODS‐80TmTSKgel ODS‐80TsTSKgel ODS‐120ATSKgel ODS‐120TTSKgel ODS‐140HTPTSKgel OligoDNA‐RPUltra C18Ultra Aqueous C18Ultra II C18Ultra II Aqueous C18Ultracarb ODS Ultrasphere ODSUltrasphere C18‐IPUltremex C18

Wakopak MS‐5C18 GTWakopak Navi C18‐5Wakopak Combi ODSWakopak Combi ODS FastXBridge BEH130XBridge BEH300XBridge C18XBridge OST C18XBridge Shield RP18XSelect CSH C18XTerra MS C18XTerra RP18YMC‐Pack Hydrosphere C18YMC‐Pack ODS‐AYMC‐Pack ODS‐ALYMC‐Pack ODS‐AMYMC‐Pack ODS‐AQYMC‐Pack Pro C18YMC‐Pack Pro C18 RSZodiac C18Zodiac C18(1)Zodiac C18(2)Zodiac 100 C18Zodiac C18AQZodiac C18 ShieldZodiac 120 C18HZodiac 120 C18AQZodiac 120 C18 EurobondZodiac 120 AC EPSZodiac 120 C18SHZodiac ODSZodiac ODS HZORBAX ODS C18ZORBAX ODS ClassicZORBAX Eclipse Plus C18ZORBAX Eclipse PAHZORBAX Eclipse XDB‐C18ZORBAX Extend‐C18ZORBAX Rx C18ZORBAX StableBond C18ZORBAX 300 StableBond C18

USP L1 Säulen Liste = Standard C18ca. 500 verschiedene Phasen


Stationäre Phasen - Kieselgele

1970 A-Type Kieselgele - wenige Stationäre Phasen(hoher Anteil an Fremdmetallen wie Fe, Al, Ca, …;hohe Silanolaktivität)

Entwicklungsschritte:• kleinere Korngrößen: von 10 µm zu 7, 5 und 3 µm• Endcapping

1990 B-Type Kieselgele (hoch reine Kieselgele mit hohem %C)

Entwicklungsschritte:• Unterschiedliche Belegungstechnologien• Polare RP Phasen


Weitere Stationäre Phasen

• Polystyrol (PS/DVB): PRP-1, PLRP-S, Amberchrom

• Acrylate: YMC Polymer C18, HEMA

• Non Porous Silicagel (NPS): Micra, Kovasil

• Non Porous Resin (NPR): TSK NPR

• Zirkoniumphase: ZirChrom

• Mischphase: ZirChrom PBD, Xterra, XBridge

• Graphitphase: Hypercarb, ZirChrom Carb

• Monolithische Säulen – SiO2 oder PS/DVB

• Fused core Particles


Sationäre Phasen - Eigenschaften

Charakterisierung von Stationären Phasen:

• Basismaterial: Silica, PS/DVB, Zirkoniumdioxid, Hybridmaterialien

• Porengröße: 60, 80, 100, 120, 150, 200, 300 Å – Porengrößenverteilung!!

• Oberfläche: 500 bis 50 m2/g

• Porenvolumen: 0,6 bis 1,8 ml/g

• Partikelgröße: 1,5 …..10 µm – Partikelgrößenverteilung!!

• Belegung: C30, C18, C8, Phenyl, C4, CN, Diol, Amino, TMS

AQ/HE Type, EPS, embedded, shielded

monomer, dimer / polymer

• Reinheit: Fremdmetalle wie Eisen, Aluminium, …

• Belegungsdichte: µmol/m2


Porengröße

Kleinere Poren ergeben höhere Oberflächen:

60 Å: ~ 500 m2/g

120 Å: ~ 300 m2/g

200 Å: ~ 200 m2/g

300 Å: ~ 120 m2/g

1000 Å: ~ 30 m2/g

Höhere Oberflächen

• Erlauben höhere Belegung - %C höher

• Höhere Kapazität

• Höhere sterische Selektivität


Einfluß Porengröße

65 Å, 125 mm Länge 120 Å, 250 mm

Länge

Quelle: Katalog, Grom Analytik und HPLC GmbH, 2004


Gute Trennung auf einem 60Å Material



Partikelgröße: dp – average particle diameter: d50

Bestimmt: Bodenzahl: N ½ * L / dp

Druck: P ~ 1 / dp2

Wichtig: Partikelgrößenverteilung

kleine Partikel: Druckerhöhung

kleine Partikel: Peak Verbreiterung – N

Wichtiger Parameter:

d50 – d90 – d10 und d90/d10

Einfluß Partikelgröße


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

Particle size µm

Particle size distribution

Cumuliert Volume Cumuliert Number

d50

d10

d90



Quelle: Grace, Alltech Grom GmbH



Mercury Pressure Porosimetry

MPP by FISONS Pascal 440

Quelle: Grace, Alltech Grom GmbH



Quelle: http://www.ymc.de/ymceurope/products/analyticalLC/analyticalColumns/images/triart-pore-distribution.jpg



Breite Porengrößenverteilung für PS/DVB



Beispiel Paracelsine

Separation on C8 Silica


Separation on PS/ DVB



Separation on PS/ DVB with wide pore size distribution



Sationäre Phasen - Eigenschaften

Porengröße und Porengrößenverteilung sowie

Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung bestimmen

• Welche Bodenzahl erreicht wird

• bei welchem Druck

• mit welcher Flussrate

• In Abhängigkeit vom Analyten


Stationäre Phasen - Selektivität



Quelle: http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10048475&alias=Alias_selectivitychart__CHEMISTRY&locale=en_US



Quelle: Grace VisonHT media Platform Prospekt


Stationäre Phasen -Parameter

PackingCarbon Load

Pore Size

Surface Area Endcapped

pH Range

* Feature Recommended Useage

C18 High Load 11% 120Å 220m2/g Yes 1–10

Ultra high-purity silica, Fully Bonded

General Purpose. High-capacity for hydrophobic compounds.

C18 Classic 6% 100Å 200m2/g Yes 1–10

Lower carbon load, Slight silica exposure

Reversed phase separations optimized for speed. Some additional polar retention

C18 Basic 5% 120Å 220m2/g No 1–10

Ultra-High purity silica, High silica exposure

Alternate RP selectivity. High polar retention Excellent for basic compounds

C18 Polar 5% 100Å 200m2/g No 1–10High silica exposure Most polar selectivity.

HILIC NA 120Å 220m2/g No 2–8 Polar phase

Ideal for very polar compounds with high organic mobile phases for improved sensitivity by MS.

Silica NA 120Å 220m2/g No 2–8Traditional normal phase

For isomeric separation of non-aqueous compatible compounds by absorption chromatography.



Stationäre Phasen

• Total poröse Kieselgele

druckstabil, schnelle Diffusion, hohe N, z.T. gute pH-Stabilität

• Hybridphasen

Sehr gute pH-Stabilität, sehr geringe Silanolaktivität

• Monolithische Säulen

Geringer Druck, hohe Flussraten möglich, hohe N

• Fused core, Core shell, SPP: Superficially Porous Particles

Geringer Druck, hohe Flussraten möglich, hohe N


Vergleich unterschiedlicher Technologien

Columns for Celestoderm‐V Ointment® analysisJinjian Zhenga, Dolly Patelb, Qinglin Tanga, Robert J. Markovicha, Abu M. Rustuma

a Global Quality Services‐Analytical Sciences, Schering‐Plough Corporation, Union, NJ 07083, USAb Philadelphia College of Pharmacy, University of the Sciences in Philadelphia, 600 South 43rd St., Philadelphia, PA 19104, USA

Fig. 2. Overlay of the chromatograms of a standard mixture of BMV, BMEE, and BMEZ using ACE C18 (bottom), Halo C18 (middle), and Chromolith C18 (up) columns. HPLC conditions: acetonitrile:water 42:58 (v/v) at 1.0 mL/min.


Innovation für die Zukunft?

Eigenschaften Fused Core Particles:• Kürzere Diffusionswege

• Enge Partikelgrößenverteilung – geringere Eddy-Diffussion

• Bei gleicher Trennleistung niedriger Druck

• Bei gleichem Druck höhere Trennleistung

• Einsatz auf konventionellen HPLC-Systemen


Übersicht Fused Core

DurchmesserPartikel

DurchmesserSoild Core

Dickeporöse Schicht

VolumenSolid Core

Volumenporöse Schicht

VolumenPartikel

% Volumenporöse Schicht

µm µm µm µm3 µm3 µm3 %5,0 3,3 0,60 18,8 46,6 65,4 702,7 1,7 0,50 2,6 7,7 10,3 752,6 1,9 0,35 3,6 5,6 9,2 601,7 1,3 0,22 1,0 1,5 2,6 601,3 1,0 0,17 0,5 0,7 1,2 60


Übersicht Fused Core

Oberfläche Porengröße Dichte Oberfläche V0 tR für k=10

pro Säule für 100 x 4.6 mm bei 1mL/min

m2/g A g/mL m2 mL min

NPS 2 ‐ 2,0 7 0,65 7,15

Fused Core 100 90 0,7 116 0,90 9,90

TPS 320 100 0,5 266 1,20 13,20


Quelle: www.mn-net.com

Vergleich Fused Core / Total Porös


Partikelgröße Bodenzahl Peakbreite t0 tR für k=5 Peakkapazitätfür 100 x 4.6

mm für k = 5für 100 x 4.6

mm bei 1mL/min für t0 bis tR

µm min min min

Fused Core 2,7 21.786 0,146 0,90 5,40 31

TPS 3 16.667 0,223 1,20 7,20 27

TPS 2,7 18.519 0,212 1,20 7,20 28

Verwendete Reduzierte Bodenhöhen: FCS = 1,7TPS = 2,0



Einfluß der Porengröße

Lorazepam:

Naphtalin

Quelle: MZ-Analysentechnik: Halo Prospekt Quelle: Wikipedia


Einfluß der Porengröße / Oberfläche

Columns for Celestoderm‐V Ointment® analysisJinjian Zhenga, Dolly Patelb, Qinglin Tanga, Robert J. Markovicha, Abu M. Rustuma

a Global Quality Services‐Analytical Sciences, Schering‐Plough Corporation, Union, NJ 07083, USAb Philadelphia College of Pharmacy, University of the Sciences in Philadelphia, 600 South 43rd St., Philadelphia, PA 19104, USA

20 µg on column entspricht:

10 µL Injektionsvolumen miteiner Konzentration von 2mg/mL



Quelle: http://fortis-technologies.com/UHPLC.html, 20.10.2013


3 u. 5 µm bei hohen Flussraten

Dr. Stefan Lamotte, HPLC-Tage 2012


Quelle: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/analytical-chromatography/hplc/Titan/TITAN_c18-performance.gif

TPS Silica mit sehr enger Partikelgrößenverteilung


High Speed Chromatographie 1993

Column: GROM-SIL 100 ODS-2 FE,

1.5 µm, 33 x 4.6 mm

Eluent: 35% v/v Acetonitrile,

65% v/v 0.1% TFA

Flow rate: 1.5 ml/min

Pressure: 26.2 MPa

Temperature: RT

Detection: 254 nm

Sample: 1 µl


Monolithische Säulen

Spezifikationen Chromolith® RP-18 endcapped HighResolution RP-18 endcapped

Silica type High-purity High-purityParticle size Monolithic Monolithic

Macropore size 1.5 μm (2 mm i.d. columns)2 μm (25, 10, 4.6 and 3 mm i.d. columns) 1.15 micrometer

Mesopore size 13 nm (130 Å) 15 nm (150 Angström)

Pore volume 1 mL/g 1 mL/g

Total porosity > 80%

Total pore volume 2.9 mL/g

Surface area 300 m2/g 250 m2/g

Surface modification RP-18 endcapped RP-18 endcapped

Carbon content 18% 18%

Quelle: www.merckmillipore.de/chemicals/chromolith-rp-18-endcapped/ am 20.10.2013


Monolithische Säulen

Quelle: www.merckmillipore.de/chemicals/chromolith-rp-18-endcapped/ am 20.10.2013


Phenylphasen

PhenylpropylPhenylhexylDiphenylBiphenl

Selektivitätskonzepte


Alternativen zu Acetonitril

Umrechnung der Eluentenzusammensetzung mit dem Löslichkeitsparameter δ

Acetonitril δA 23,9 δ = Löslichkeitsparameter

Wasser δW 47,8 φ = Volumenanteil

Methanol δM 29,4

Mischung δm 35,85

δm = Σi φi δi


Alternativen zu Acetonitril: Methanol

Säulentestmix:

UracilPhenolN,N‐Diethyl‐M‐ToluamidToluol

Standardeluent:ACN : Wasser = 58 : 42

Berechnet:MeOH : Wasser = 75 : 25

Angepasst:MeOH : Wasser = 65 : 35



Alltima C18, 3 µm; 100 x 2 mm

Standard C18

ACN : Wasser = 58 : 42

MeOH : Wasser = 75 : 25


Zur Verfügung gestellt von:Grace Davison Discovery SciencesAlltech Grom GmbH



Platinum C18, 3 µm; 100 x 2 mm

Polare C18 Phase







Genesis Phenyl, 4 µm; 100 x 2 mm






Einfluss Peakbreite / Bodenzahl

Partikelgröße Bodenzahl tR für k=5 Peakbreite empf. Messzellenvolumnen [µL]für 100 x 4.6

mmbei

1mL/min für k = 5 10x 25x 50x

µm min minFused Core 2,7 21.786 5,40 0,146 15 6 3

TPS 3 16.667 7,20 0,223 22 9 4

TPS 2,7 18.519 7,20 0,212 21 8 4



Partikelgröße Bodenzahl tR für k=5 Peakbreite empf. Messzellenvolumnen [µL]für 100 x 4.6

mm bei 1mL/min für k = 5 10x 25x 50xµm min min

TPS 5 10.000 7,20 0,288 29 11,5 5,8TPS 4 12.500 7,20 0,258 26 10,3 5,2TPS 3 16.667 7,20 0,223 22 8,9 4,5TPS 2,7 18.519 7,20 0,212 21 8,5 4,2TPS 2 25.000 7,20 0,182 18 7,3 3,6TPS 1,7 29.412 7,20 0,168 17 6,7 3,4TPS 1,5 33.333 7,20 0,158 16 6,3 3,2

Fused Core 5 11.765 5,40 0,199 20 8,0 4,0Fused Core 4 14.706 5,40 0,178 18 7,1 3,6Fused Core 2,7 21.786 5,40 0,146 15 5,9 2,9Fused Core 1,7 34.602 5,40 0,116 12 4,6 2,3Fused Core 1,3 45.249 5,40 0,102 10 4,1 2,0



Partikelgröße Bodenzahl tR für k=5 Peakbreite empf. Messzellenvolumnen [µL]für 100 x 2 mm bei 189 µL/min für k = 5 10x 25x 50x

µm min minTPS 5 10.000 7,20 0,288 5 2,2 1,09TPS 4 12.500 7,20 0,258 5 1,9 0,97TPS 3 16.667 7,20 0,223 4 1,7 0,84TPS 2,7 18.519 7,20 0,212 4 1,6 0,80TPS 2 25.000 7,20 0,182 3 1,4 0,69TPS 1,7 29.412 7,20 0,168 3 1,3 0,63TPS 1,5 33.333 7,20 0,158 3 1,2 0,60

Fused Core 5 11.765 5,40 0,199 20 1,5 0,75Fused Core 4 14.706 5,40 0,178 18 1,3 0,67Fused Core 2,7 21.786 5,40 0,146 15 1,1 0,55Fused Core 1,7 34.602 5,40 0,116 12 0,9 0,44Fused Core 1,3 45.249 5,40 0,102 10 0,8 0,38


Systemvergleich

0 min 5% B2 min 5% B8 min 60% B10 min 60% B11 min 5% B14 min 5% B

Säule: 50 x 4.6 mm, 5 µm TPS

A: Wasser mit TFA auf pH 2,5B: ACN

Fluß: 1 mL / min

Im Gradientenmodus werden die Peaks noch schmäler: ca. 0,125 min


Systemvergleich mit Säule: 50 x 4.6 mm

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0-20

0

20

40

60

80

100 04020402 #7 [modified by LabEAHPLC_01] Testmischung (1 : 1 verdünnt mit H/0072/04) UV_VIS_1mAU

min

1,68

min

5,04

min

5,22

min

5,37

min

5,66

min

5,98

min

6,29

min

6,54

min

6,68

min 6,86

min

7,08

min

WVL:230 nm

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0-10

20

40

60

80

100

120 04020401 #8 [modified by LabEAHPLC_01] Testmischung UV_VIS_1mAU

min

1,00

min

1,28

min 5,

72 m

in

5,91

min

6,17

min

6,43

min

6,76

min

6,91

min

7,31

min

7,47

min 7,

63 m

in

7,83

min

WVL:230 nm


Ausblick

Methoden• SFC

Detektion• MS – Technologien• Aerosol basierende Detektoren (ELSD, Corona CAD, NQAD)• FID

Säulenschaltungen• Matrixeffekte elemenieren• 2D HPLC (LC-LC)

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