Organische Wasserinhaltsstoffe · Arbeitsweise HPLC isokratisch die Eigenschaften der mobilen Phase...

Börnick - Vorlesung Wasseranalytik WS 2016/17

Analytik organischer Verbindungen

Organische

Wasserinhaltsstoffe

Organische

Komplexbildner

Kohlenwasserstoffe

LHKW

Phenole

PSMBP

Tenside

PAKHuminstoffe

N-Organika

Chlorbenzole/

-phenole

Aromatische

Sulfonsäuren

S-Organika

PCB



Erfassung aller einzelnen organischen Komponenten in einem Wasser nicht möglich


Organische Wasserinhaltsstoffe – gekennzeichnet durch hohe Vielfalt,

Wirksamkeit in stark verschiedenen Konzentrationsbereichen, rasche

Veränderlichkeit, weiter Bereich der Molmasseverteilung

Organische Inhaltsstoffe

natürlich vorkommend anthropogen vorkommend



Eintragsmöglichkeiten anthropogener organischer

Stoffe in Oberflächenwässer

Oberflächenwasser

Abwasser (häuslich,

gewerblich, Industrie,

Landwirtschaft)

Straßenschmutz

SchiffsverkehrBadebetrieb

Grundwasser (Versicke-

rung von Einträgen der

Landwirtschaft

Abschwemmungen

Boden (Pflanzen-

schutzmittel, Dünger)

Niederschlag

(gelöste Abgase, Staub)


Genormte Analysenverfahren: Deutsche Einheitsverfahren zur

Wasser-, Abwasser- und Schlamm-Untersuchung*

*ISBN-10: 3-527-19010-4 ISBN-13: 978-3-527-19010-2 - Wiley-VCH, Weinheim

organische Stoffe - F Gemeinsam erfassbare Stoffgruppen und

P Einzelkomponenten:

Organochlorinsektizide, Polychlorbiphenyle, Chlorbenzole; schwerflüchtige

Halogenkohlenwasserstoffe und Organochlorpestizide; polychlorierte Biphenyle; PAK;

leichtflüchtige halogenierte Kohlenwasserstoffe; organische Stickstoff- und

Phosphorverbindungen; Benzol und Derivate; organische Pflanzenbehandlungsmittel;

Organozinnverbindungen; Phenoxyalkancarbonsäuren; Chlorphenole; nitroaromatische

Verbindungen; monocyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, Naphthalin und chlorierte

Substanzen; Explosivstoffe und verwandte Verbindungen; Glyphosat und

Aminomethylphosphonsäure; Nitrophenole; Organophosphorverbindungen;

Halogenessigsäuren; Phthalate; Microcystine; Trihalogenmethane; Alkylphenole; polychlorierte

Dibenzodioxine und Dibenzofurane; Pflanzenbehandlungsmittel, Biozide und Abbauprodukte;

Kohlenstoffdisulfid; Vinylchlorid; EDTA und NTA; Acrylamid; Epichlorhydrin; Komplexbildner …

Analysenmethoden:

Flüssig-Flüssig-Extraktion; Festphasenextraktion; Headspace; Purge and Trap;

Festphasenmikroextraktion;

Gaschromatographie, Flüssigchromatographie; (Dünnschichtchromatographie;

Polarographie)


Eigenschaften Zielanalyten

Flüchtigkeit

Po

lari

tät

leichtflüchtig

mittelflüchtig

wenig flüchtig,

lipophil

wenig flüchtig,

amphiphil

wenig flüchtig,

hydrophil

nach C. ZWIENER, Karlsruhe


Stoffbeispiele

Flüchtigkeit

Po

lari

tät

MTBE

EDTA, NTA

Pestizide

PFT

Benzotriazole,

Benzothiazole

Arzneimittel,

AntibiotikaBTEX

Röntgenkon-

trastmittelTenside

THM

PAK

Organochlorpestizide



Auswahl der Analysenmethode (grobe Orientierung)

Flüchtigkeit

Po

lari

tät

Gaschromatographie

Flüssigchromatographie



Chromatographie

Chromatographische Analysenverfahren =

physikalisch-chemische Trennmethoden

notwendig:

1. Abtrennung störender Begleitstoffe

2. Erfassung möglichst vieler Stoffe in einem Trennungsgang

Einteilung Trennmethoden:

Trennung

mit Phasenumwandlung ohne Phasenumwandlung

mit chemischer

Reaktion

ohne chemische

Reaktion

- Fällung

- Elektrolyse

- Destillation

- Kondensation

- Sublimation

mit Hilfsphase ohne Hilfsphase

- Extraktion

- Ionenaustausch

- Chromatographie

- Sedimentation

- Zentrifugation

- Elektrophorese


Systematisierung:

Trennung durch unterschiedliche

Verteilung zwischen zwei

nichtmischbaren Phasen

Ziel Chromatographie:

- möglichst vollständige Trennung der einzelnen

Komponenten

- Ausnutzung unterschiedlicher Stoffeigenschaften (z. B.

Polarität, Ladung, Molekülgröße, funktionelle Gruppen …)

Trennung durch unterschiedliche

Wanderungsgeschwindigkeit in

einer Phase

Chromatographie


Chromatographie

Chromatographie

Definition:

- … ist ein Trennprozess, bei dem ein Probegemisch zwischen zwei

nichtmischbaren Phasen verteilt wird.

- Verteilung erfolgt zwischen einer ruhenden (stationären) und einer

sich bewegenden (mobilen) Hilfsphase

Allgemeine Kennzeichen:

- schonende Arbeitsweise

- stets Kopplung Trennung – Detektion

- qualitative/quantitative Aussagen

Systematisierung nach:

- Aggregatzustand mobile Phase

- Trennungsmechanismen

- Ausführungstechniken


Chromatographie

Arbeitsweise mit zwei Hilfsphasen (Teil 1)

Gefäß-Nr.: 1 2 3 4 n - 1 n

Ausgangszustand

1. Wiederholung

2. Wiederholung


Chromatographie

Arbeitsweise mit zwei Hilfsphasen (Teil 2)

Gefäß-Nr.: 1 2 3 4 n - 1 n

n – 2. Wiederholung

n - 1. Wiederholung

n - te Wiederholung

n + 1. Wiederholung


Chromatographie

Chromatographie

Aspekte:

- wichtig: Verteilungskoeffizienten der zu trennenden Stoffe

- im Laufe des Trennbettes: Einstellung immer neuer Gleichgewichte

- Strecke in der sich Gleichgewicht einstellt: theoretische Trennstufe

- Ziel: System mit hoher Trennstufenzahl

- somit lange Säule günstig, aber Bandenverbreiterung

- Abbildung des Trennergebnisses: Chromatogramm

Ursachen Bandenverbreiterung:

- Streudiffusion (EDDY-Diffusion)

- Strömungsverteilung (laminar)

- Längsdiffusion

- Stoffaustauschphänomene

- Abhängigkeit Trennstufenhöhe von Fließgeschwindigkeit, graphische

Darstellung: VAN DEEMTER-Kurve


Chromatographie

2

1

3

4

Voptim

Van-Deemter-Kurve

Lineare Fließgeschwindigkeit v

Tre

nn

stu

fen

hö

he H

1 EDDY-Diffusion + Strömungsverteilung

2 Längsdiffusion

3 Stoffaustauschphänomene

4 Resultierende Kurve


http://www.uni-mainz.de/FB/Chemie/AK-Heumann/

Van-Deemter-Kurve: Einfluss Partikeldurchmesser (gepackte Säulen)


Van-Deemter-Kurve / Bandenverbreiterung:

Schlussfolgerungen für LC

Regel 1: Packungsmaterial mit möglichst homogener Korngrößenverteilung

verwenden

Regel 2: Strömungsgeschwindigkeit mobile Phase so wählen, dass

Längsdiffusion keine Rolle spielt

Regel 3: stationäre Phase – möglichst kleine Teilchen bzw. Teilchen mit

dünner poröser Oberflächenschicht

Regel 4: Lösungsmittel mit kleiner Viskosität einsetzen

Regel 5: hohe Analysengeschwindigkeit gehen auf Kosten der Auflösung

und umgekehrt


Chromatographie

t‘R2

Signal

Zeit

t‘R1

t0

tR1

tR2

w1 w2

Komponente 1 Komponente 2

Probenaufgabe

Das Chromatogramm und seine Kenngrößen

w Basisbreite eines Peaks

t0 Totzeit der Trennsäule: die

Zeit, die die mobile Phase

benötigt, um durch die

Trennsäule zu wandern


Chromatographie

Das Chromatogramm und dessen Aussagen

- Erfassung der getrennten Substanzen mittels Detektor

- Einzelsignal: Peak, Gesamtheit: Chromatogramm

- Idealform eines Peaks: Gaußkurve

- jeder Peak ist charakterisiert durch Retentionszeit, Peakhöhe bzw. –fläche

Qualitative Messung

- Retentionszeit für jede Substanz bei konstanten chromatographischen Bedingungen

charakteristisch

- Faktoren, welche die Retentionszeit beeinflussen:

• Trennsäule

• Laufmittel

• Fließgeschwindigkeit

• Probengröße

• Temperatur

- Identifizierung: Vergleich Retentionszeit Probenpeak – Peak Reinsubstanz (Standard)


Chromatographie

Das Chromatogramm und dessen Aussagen

- bei Übereinstimmung kann Probenpeak gesuchte Substanz sein

- höhere Sicherheit durch:

• Aufstockungsverfahren

• Überprüfung mit anderen Trennsäule

• präparative Isolierung und Untersuchung mit zusätzlichen anderen Verfahren

(MS, IR, NMR)

• spezielle Detektoren (charakteristische Signalverhältnisse)

• parallele Anwendung einer anderen Methode


Chromatographie

Quantitative Messung

- Proportionalität Stoffkonzentration – Peakfläche (bzw. Peakhöhe)

- vorher mit verschiedenen Lösungen bekannter Konzentration (Standards) Kalibrierung

erstellen

- Fläche mittels Integratoren/Rechnern ermittelt

- früher:

• Wägemethode

• Millimeterpapier auszählen

• Bestimmung mittels Planimetrie

• Näherung: Halbwertsbreite mal Höhe

• Näherung: Höhe mal Gesamtretentionszeit


Chromatographie – Kalibrierung

Arten der Kalibrierung

I. Externe Kalibrierung (Methode des äußeren Standards)

- im Vorfeld der Probenanalytik wird mit Hilfe von verschiedenen Lösungen

exakt definierter Konzentration eine Kalibrierfunktion (i. a. linear) erstellt

(Stoffgemisch)

- bei neuen Methoden Kalibriervorschrift beachten (Arbeitsbereich an Problem

anpassen, 10-Punkte, äquidistant, statistische Kontrolle: Linearität und

Varianzhomogenität, Wiederholbarkeit, über Gesamtverfahren)

- Routineanalytik: weniger Punkte, zwischen den Proben Standards ermitteln,

Rekalibration

II. Interne Kalibrierung (Methode des inneren Standards)

- extern: Nachteil Schwankungen (z. B. Ursache Detektor), besonders GC

- Zugabe eines zusätzlichen Standards, der alle Prozesse (auch Störungen) mit

durchläuft, Standard wird jeder Probe zu Beginn der Analyse zugegeben

- im Vorfeld: Ermittlung einer Kalibrierkurve

- Messsignale werden immer auf diesen Standard bezogen


Chromatographie – Kalibrierung

Arten der Kalibrierung

Anforderungen interner Standard:

- nicht in Probe enthalten

- möglichst ähnliche Eigenschaften wie Analyten

- ähnliche Retentionszeit wie Analyten

- Konzentration im Bereich Analyten

III. Standardaddition (Aufstockungsverfahren)

- Problem: Matrixeinfluss auf Retentionszeit und Messsignal (Peakfläche)

- Ausweg: Zugabe der Kalibrierlösung zur Probe

- mehrere Kalibrierpunkte + Originalprobe – rechnerische oder graphische

Ermittlung der Probenkonzentration

- Vorteile:

• Berücksichtigung von Matrixeinfluss

• Zuordnung/Identifizierung von Peaks

• Erkennen von Störungen

- Nachteile: zeit- und arbeitsaufwendig, da für jede Probe mindestens 6

Bestimmungen erforderlich sind


Chromatographie

Wichtige Formeln in der Chromatographie

Verteilungskoeffizient

Kapazitätsfaktor

Trennfaktor (relative Retention)

mob

statX

c

cK

mob

statX

n

nk '

0

0

0

''

t

tt

t

tk RR

X

mob

stat

V

VKk '

1

2

01

02

1

2

'

'

K

K

tt

tt

k

k

R

R

(mit k‘2 > k‘1)(= Maß für Fähigkeit des chrom. Systems,

zwei Stoffe zu trennen; Beeinflussung

durch Wahl stat./mob. Phase)


Auflösung zweier Peaks

- Trennvermögen einer Säule bezüglich zweier Stoffe

- R = 2

Chromatographie

Differenz der Retentionszeiten

Summe der Basisbreiten

Auflösung zweier benachbarter Peaks21

122

RR tt

R


Chromatographie


Chromatographie

Wichtige Formeln in der Chromatographie

Trennstufenzahl

Trennstufenhöhe

Beeinflussung der Auflösung

22

21

2

24,516

A

thttN

RpRR

N

LH

'1

'1

4

1

k

kNR

2

''' 21 kk

k

mit

Abhängig von Trennstufenzahl eines chromatographischen Systems

Verbesserung durch:

- k‘: Änderung der Stärke der mobilen Phase

- N: Verwendung längerer / besserer Säulen; Fließgeschwindigkeit

optimieren

- α: Änderung - Art Trennmechanismus, chromatographische System


Peakkapazität

max'1ln4

1 kN

n -Leistungsfähigkeit Trennsystem

-Zahl getrennter Peaks (Auflösung 1)

innerhalb eines vorgegebenen k‘-Wertes

Beispiel:

Trennstufenzahl: 10.000

Totzeit: 1 min

… 41 Komponenten (Peaks) können innerhalb von 5 min mit einer Auflösung

von 1 getrennt werden

Lineare Geschwindigkeit des Lösungsmittels0t

Lu


Chromatographie

Zulässige Kapillarlänge lK, welche einen Peak um nicht mehr als 5 %

verbreitert:

NdV

DVl

k

mRK

4

2101064,7

VR: Retentionsvolumen in mL

Dm: Diffusionskoeffizient der Probe in m2/s

: Volumenstrom der mobilen Phase in mL/min

dK: Innendurchmesser in mm

N: Trennstufenzahl der Säule

V

TotvolumenBereich zwischen Probenaufgabe und Säule bzw. Säule und Detektor möglichst minimal

halten, sonst Bandenverbreiterung, schlechte Auflösung

Beispiel:

Volumenstrom: 1 mL/min

Rt: 3 min

Bodenzahl: 10.000

dK : 0,25 mm

Dm (Nitrobenzol

in Hexan): 3,8 10-9m²/s

Retentionsvolumen?

VR= · RtV

… lK = 67 cm


Chromatographie

a0,1 b0,1 0,1 h

h

Asymmetrischer Peak:

Peaksymmetrieideale Peakform: Gaußkurve

Praxis: fast immer geringe Abweichungen

starke Asymmetrie (Fronting, Tailing) verursacht durch Fehler

Tailing (Fronting)

1,0

1,0

a

bT < 2,5

Ursachen:- schlechte Säulenpackung

- Totvolumen System

- Überladung

- Unverträglichkeit


Van-Deemter-Gleichung

- Beziehung, welche die Trennleistung eines chromatographischen Systems

(ausgedrückt als Bodenhöhe H) in Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit u

der mobilen Phase beschreibt

- Gleichung berücksichtigt Diffusions- und Massentransfereffekte

uCu

BAH

uD

dKu

D

dK

u

DdH

M

f

S

PMP

2

22

122

λ: Konstante, die Partikelform und die Homogenität der Packung wiedergibt

dP: Partikeldurchmesser

DM: Diffusionkoeffizient in der mobilen Phase

DS: Diffusionskoeffizient in der stationären Phase

Ψ: Korrekturfaktor, der Freiräume zwischen den Partikeln wiedergibt

df: Dicke des Flüssigkeitsfilmes

K1 & K2: Korrekturfaktoren, die die Geometrie der Säule und die Säulenkapazität wiedergibt

Längstdiffusion

Streudiffusion

Strömungsverteilung

Stoffaustausch (Massentransfer)


Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Auswerte-

einheit

Trennsäule

Probeneingabe/ Reodyne

(+ Autosampler)Pumpe(n)

Säulen-

thermostat

Druckgasflasche

(Trägergas)

Detektor


Chromatographie – HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatographie)

Physikalisch-chemische Prozesse:

- Adsorption

- Verteilung

- Siebeffekte

- Ionenaustauschvorgänge

- selektive Bindungen

LC-Formen:

- Adsorptionschromatographie - Mixed-Mode-LC

- Verteilungschromatographie - HILIC-LC

- Umkehrphasenchromatographie

- Ionenaustauschchromatographie

- Ionenpaarchromatographie

- Größenausschlusschromatographie

- Affinitätschromatographie



Trennleistung/Selektivität

der Trennsäule

Empfindlichkeit/Selektivität

des Detektors

bestimmen

Leistungsfähigkeit der HPLC



Laufmittel in der HPLC:

- Anforderungen:

• niedrige Viskosität

• gute UV-Durchlässigkeit

• Brechungsindexunterschied zur Probe

• Mischbarkeit mit anderen Laufmitteln

• Siedepunkt beachten

• hohe Reinheit (problemangepasst)

• inert bezüglich Probesubstanzen, Leitungssytemen

• möglichst geringe Toxizität, niedriger Preis

• ohne Luftanteil

• schwebstofffrei



Elutionskraft ε0 verschiedener Lösungsmittel

Lösungsmittel Al2O3 -SiO3 MgO Florisil

Pentan

Hexan

Cyclohexan

Tetrachlormethan

Diisopropylether

Benzol

Diethylether

Chloroform

Dichlormethan

Aceton

1,4-Dioxan

Essigsäureethylester

Acetonitril

Pyridin

Ethanol

Methanol

Wasser

0,00

0,01

0,04

0,18

0,28

0,32

0,38

0,40

0,42

0,56

0,56

0,58

0,65

0,71

0,88

0,95

sehr groß

0,00

0,03

0,03

0,11

0,21

0,25

0,38

0,26

0,32

0,47

0,49

0,38

0,50

0,73

0,00

-

0,06

0,16

-

0,22

0,21

0,26

0,26

0,50

-

-

-

> 0,7

0,00

-

-

0,04

-

0,17

0,30

0,19

0,23

-

-

-

-

-



Arbeitsweise HPLC

isokratisch

die Eigenschaften der mobilen

Phase bleiben während der

Analyse konstant

Gradient

Laufmitteleigenschaften werden

während des

chromatographischen Vorgangs

kontinuierlich verändert

Vorteile:

- Reduzierung Analysenzeit und Laufmittelmenge

- nach Optimierung Gradient Multikomponentenanalyse möglich

- Reduzierung Bandenverbreiterung

- Verbesserung Peakform

Probleme:

- Basisliniendrift

- zusätzliches Zurückfahren und Equilibrieren

- hohe Reinheitsanforderungen an Laufmittel



Vergleich von isokratischer und

Gradientenelution


Niederdruck-Gradient Hochdruck-Gradient

Vorteile - konstante Flussrate

- Anschluss beliebig vieler

Vorratssysteme

- geringerer apparativer

Aufwand

- preiswerter

- einfache Bedienung

- flexibel

- automatisierbar

- kurze Ansprechzeiten

- exaktere Mischungsverhältnisse

Nachteile - Abweichungen im

Mischungsverhältnis durch

verzögerte

Ansaugphase/Totvolumen der

Pumpe (unterschiedliche

Kompressibilität der

Lösungsmittel;

Volumenkontraktion beim

Mischen)

- Flussrate ist von der Volumenkontraktion

abhängig

- teurer

- hoher apparativer Aufwand (pro

Lösungsmittel separate Hochdruckpumpe;

Ultraschallschwinger zum Mischen unter

hohem Druck)

- Mischgenauigkeit sinkt bei kleinen

Flussraten/niedrigen

Mischungsverhältnissen



Pumpe- Erzeugung hoher Drücke (geringe Teilchendurchmesser) und

konstanter Fördergeschwindigkeiten

- weiterhin gut durchspülbar, korrosionsbeständig,

wartungsarm, keine Erwärmung beim Betrieb, geräuscharm

Probenaufgabe:- Probe soll als unendlich kleines Volumen in Mitte des

Säulenanfangs platziert werden

- Dosierschlaufen vorteilhafter als Septumeinlass

- diese mit Überlauf füllen



Reodyne-Ventile


U(H)PLC - Ultra (High) Performance Chromatographie

Kennzeichen: stationäre Phase – kleine Teilchendurchmesser + vergleichsweise

hoher Fluss, resultierend daraus: hoher Druck (bis 1500 bar)

Vorteile: - höhere Flexibilität / mehr Möglichkeiten um Selektivität zu verbessern

(Nutzung Methanol, Flusserhöhung, Einsatz dünner/langer Säulen)

- deutliche Erhöhung von Bodenzahl / Peakkapazität kann erreicht werden

- Materialien mit ≤ 2 µm – sehre gutes

Bodenzahl/Retentionszeitverhältnis, gute Auflösung in kurzer Zeit,

geringerer Lösungsmittelverbrauch, schnellere Analysen

- kleinere Totvolumina, kleinere Peakvolumina, Verbesserung

Empfindlichkeit

Nachteile: - größerer Aufwand bei Probenvorbereitung

-teilweise schlechtere Reproduzierbarkeiten (bei wechselnder

Randbedingungen)

- Schwierigkeiten beim Methodentransfer

- deutlich höherer technischer Aufwand (Kosten, Verschleiß)

- mehr Sorgfalt beim Handling notwendig



Signal

Signal

Rauschpegel

Drift

t

h

Zeit t

h

Licht

Detektor

Detektion in der Chromatographie

Detektorrauschen und Drift

Durchflusszelle eines

UV/VIS-Detektors



HPLC-Detektoren

Aufgabe:

- Nachweis der getrennten Analyten durch kontinuierliche

Messung physikalischer Größen

- erfassen Änderungen der Zusammensetzung der mobilen

Phasen und Umwandlung in elektrische Signale

Anforderungen:

- hohe Empfindlichkeit

- geringe Drift/Rauschen

- unempfindlich bei Temperaturänderungen

- unempfindlich bei Änderung Lösungsmittelzusammensetzung

- kleines Zellvolumen

- schnelle Ansprechzeit

- hohe lineare Proportionalität Signal – Stoffmenge

- leicht bedienbar, robust, preiswert


Chromatographie - HPLC

HPLC-Detektoren I

UV-Detektor:

- Absorptionsmessung des in Probe eingebrachten Lichtes (LAMBERT-BEER)

- relativ hohe Empfindlichkeit

- für die meisten Wasserschadstoffe einsetzbar

- kleines Zellvolumen möglich

- Gradiententechnik i.Allg. anwendbar

- großer linearer Bereich

- Nachteil: Analyten müssen ähnliche Lage Absorptionsmaxima aufweisen

(Ausweg: programmierbarer UV-Detektor, DAD)

Diodenarraydetektor:

- Spezialform des UVD

- Messung Lichtabsorption durch größere Anzahl kleiner Photodioden

- Absorption bei verschiedenen Wellenlängen innerhalb kurzer Zeit

- Aufnahme von Spektren zu jeder Retentionszeit (3-D-Chromatogramm)

- Peakidentifikation/Erkennen von Störungen

- hohe Rechenanforderungen

- geringere Empfindlichkeit


Chromatographie – Detektoren

Deuterium-

Lampe

Linsen-

System

Blende Messzelle Holographisches

Gitter

Photodioden-Reihe


Chromatographie – HPLC/Detektoren

HPLC-Detektoren II

AnregungsfilterLampe

Zelle

Emissionsfilter

PhotodiodeFluoreszenzdetektor

Fluoreszenzdetektor:

- begrenzter Einsatz, Derivatisierung

- sehr empfindlich (bis in den ppb-Bereich)

- Optimierung Extinktions- und

Emissionswellenlänge (Empfindlichkeit)

- wichtige Anwendungsbeispiele: PAK,

Sulfonsäuren



fluoreszenzaktiv: Moleküle mit delokalisierten Elektronen in bindenden p-Orbitalen (Elektronen mit

antiparallelen Spin, Singulettzustände), z. B. PAK

Umkehr Lichtabsorption – Deaktivierung angeregter Elektronenzustände

Reemission der Anregungsenergie in Form von definierter Strahlung (UV/VIS- bzw. Röntgenbereich)

Vergleich zur einfallenden Strahlung: gleiche oder geringere Energie

Deaktivierung höher angeregter Elektronenzustände zum niedrigsten Anregungszustand: strahlungslos

Fluoreszenz (Lichtemission): Übergang vom niedrigsten angeregten Zustand (Singulett-Zustand) auf einen

Elektronengrundzustand

Erfassung der Fluoreszenzsignale im steilen (rechten) Winkel zum Anregungslicht – Vermeidung von

Überlagerungen

S 1

S 2

S 0

T 1

FluoreszenzAbsorption

Phosphoreszenz

210

hvA hvFhvA

hvP

Fluoreszenzdetektion



Brechungsindexdetektor

Weitere HPLC-Detektoren:

- IR-Detektor

- Leitfähigkeitsdetektor

- RI-Detektor

- Kopplung LC – Massenspektrometer

Grundplatte

Prisma Photodiode

Licht


Chromatographie

Kopplung LC – MS

Anfänge: Thermospray

Übertragung von Ladungen/geladenen Spezies auf Analyt durch chemische

Ionisation

Entstehung von Molekülionen (detektierbar); „Quasi“-Molekülionen

Positiv-/Negativmodus (Zufügen/Verlust von Protonen bzw. Bildung von

Clustern, Addukten, … ) +/- H3O+, NH4+, Kationen, Molekülbruchstücke

CI-Spektren – keine/wenige Fragmentierung

diverse Kopplungstechniken (Inerface)

Kopplungstechniken: u.a. : LC – GC

LC – DC

LC – NMR

LC – MS (MS² …)


Chromatographie

Lösungsmittel in der LC-MS

geeignet:

- Mischungen aus Wasser und Methanol bzw. Acetonitril

- Zusatz flüchtiger Puffer (Ammoniumacetat, -formiat), Konzentration wichtig!

ungeeignet:

- Zusatz von Salzen, nichtflüchtige Puffer

- anorganische Säuren

- Zusatz anderer üblicher Zusätze (Trifluoressigsäure, Triethylamine)

Positive / negative Ionisation?

N-haltige Moleküle positiv

Ether/Ester positiv *

Thiole positiv

Carbonsäuren negativ

Phenole negativ

Phosphate negativ

*mögliche Bildung neutraler Addukte


Möglichkeit der Bildung von Addukten/ Clustern bei der LC-MS


Analyt (M=1012), positive Ionisation

[M + NH4]+

[M + Na]+[M + K]+


Chromatographie

APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation):

- Eluent wird verdampft/zerstäubt (Heizrohr, „heated nebulizer gas“)

- Korona-Entladungsnadel: Entstehung von Primärionen aus LM

- Reaktion mit Analytmolekülen in der Gasphase

- hohe Flussrate möglich

ESI (ElectroSpray Ionisation):

- Notwendigkeit polarer Eluenten/Vorhandensein von Ionen

- Hochspannung Zuleitung + „nebulizer gas“ – Spraybildung

- Lösungsmittelverdunstung/Selbstabstoßung: Überwindung

Oberflächenspannung, „Tröpfchenexplosion“, Emission von

Molekülionen

Kopplung LC – MS


Chromatographie

XH+

MH+

X

X M

Zusatzgas

Zerstäubergas

LC-Ablauf

M

XH+

X

X

Probe

(M)

(~ 120 °C)

Korona-Entladungsnadel

MXH+

XX

1.

2.

MH+

XH+

X X

XX

X

3.

1. Primärionenentstehung vorwiegend aus

Lösungsmittel.

2. Die entstandenen Ionen reagieren mit

Analytmolekülen, Bildung von Clustern

3. Das Elektronenfängergas unterstützt

denTransfer der Ionen zum Massen-

detektor und bewirkt eine Ionenent-

clusterung

+: chemische Ionisation

unter atmosphärischem

Druck

X: Lösungsmittelmoleküle,

z. B. H2O, NH3, etc.

LC-APCI-MS (heated nebulizer, PESciex) Elektronen-

fängergas

Elektronen-

fängergas


Chromatographie

+

Elektronen-

fängergas

+

+

+

-

-

+

+

+

+

+

++

+

+

-+

++

++++

+-

+-+

+

+

+

+

LC-Ablauf

Zerstäubergas

Hochspannung

1.

2.

3.

1. Das Ionenspray-Inlet erzeugt kleine geladene

Tröpfchen; LM verdunstet - das elektrische

Feld wird verstärkt und die Ionen bewegen

sich Richtung Oberfläche.

2. T erhöht/LM-Moleküle verdampft; ab einem

bestimmten kritischen Feldwert emittieren

Ionen aus den Tröpfchen.

3. Das Elektronenfängergas unterstützt die

Abtrennung der Ionen.

Ion Spray-Ionenquelle

(PESciex)

Elektronen-

fängergas

+ ++

++

+

+

+-

-+

+++

+

+


E.M. Thurman et al., Anal. Chem. 73, 2001

Kopplung LC – MS: Auswahl Interface zur Ionisation der Analyten

- für polare Stoffe: sowohl APCI als auch ESI geeignet

- ESI: gut für ionische, stark polare Verbindungen

- Zusammensetzung Eluent beeinflusst Signale im ESI stärker als im APCI

- ESI -hohe Pufferkonzentration: Abnahme Signalintensität

- höhere Tendenz zur Bildung von Addukten beim ESI

- Wahl ESI oder APCI abhängig von Analyteigenschaften, Art der verwendeten

Chromatographie (u.a. Eluent), Probenmatrix (APCI stärker anfällig!)

- sinnvoll, beide Methoden jeweils zu prüfen!


ESI versus APCIBeispiel: Erythromycin

(Antibiotikum)


Massenspektrometer - Quadrupol

m/z ~ (DC*RF*r0)/W

DC = Gleichspannung

RF = Wechselspannung

r0 = Radius des Quadrupols

W = Frequenz der

Wechselspannung

• Trennung nach Masse-Ladungs-

verhältnis (mehrfach geladene Ionen als

solche nicht erkennbar)

• keine gleichzeitige Erfassung mehrere

Massen

• aber schnelles „Springen“ (durch

Änderung der Spannung innerhalb von

3ms oder darunter): quasi-simultan


LC-MS/MS

Iontrap-Systeme

- Fragmentierung von Molekülionen (Tochterionen) in

Interface (schlecht definiert) und Q2 (Kollisionszelle)

- bessere Möglichkeiten zur Identifizierung, aber Art

der Fragmentbildung stark von Randbedingungen

abhängig!! (keine universelle MS-Bibliothek!)

- diskontinuierliche Arbeitsweise

- höhere Empfindlichkeit im Scan-

Modus

- Problem: oft Wechselwirkungen


Beispiel QTRAP-System (Kopplung von Triple-Quadrupol und Linear Iontrap)

Wahl Ionisierung: ESI bzw. APCI; positive bzw. negative Ionisation: substanzabhängig!

Arbeitsweise Q1 Q2 Q3

Q1 Scan (Q3 Scan) Scan (-) - - (Scan)

Q1 Multiple Ion SIM - -

Product Ion Scan SIM Fragmentierung Scan

Multiple Reaction Monitoring SIM Fragmentierung SIM

Precursor Ion Scan Scan Fragmentierung SIM

Neutral Loss Scan Scan Fragmentierung Scans

Enhanced MS Scan - - Trap Scan

Enhanced Resolution Scan SIM - Trap Scan

Enhanced Product Ion scan SIM Fragmentierung Trap Scan

MS³ SIM Fragmentierung Trap, Isolation & Fragmentierung


Arbeitsweise Anwendung

Q1 Scan (Q3 Scan) Suche nach auftretenden Ionen (qualitativ)

Q1 Multiple Ion Messung bestimmter Massen (qualitativ, quantitativ)

Product Ion Scan Erfassung von Fragmenten (qualitativ)

Multiple Reaction Monitoring selektive, empfindliche Quantifizierung

Precursor Ion Scan Suche nach Verbindungen, welche die gleichen Produkte

(Fragmente) bilden

Neutral Loss Scan Suche nach Verbindungen, welche das gleiche Fragment

bilden, Strukturaufklärung

Enhanced MS Scan empfindlichere Prüfung, welche Ionen auftreten (qualitativ)

Enhanced Resolution Scan von gewählter Masse - Spektrum mit hoher Auflösung

(Isotopenverhältnis, Mehrfachladung …)

Enhanced Product Ion scan empfindlicher „Product Ion Scan“ aber diskontinuierlich

MS³ Strukturaufklärung, aber auch selektive Quantifizierung


Chromatographie

HPLC Methodenentwicklung - Möglichkeiten Variation:

- „Fahrweise“, Gradient

- Säule: Art, Länge, Teilchengröße, Endcapping u. a.

- Laufmittel: Art, Zusammensetzung, pH-Wert, Zusätze

- Fließgeschwindigkeit

- Säulentemperatur

- Detektorparameter

Optimierung von Intensität, Auflösung und Analysenzeit



Fehler in der HPLC

allgemein:

- Ursachenfindung: Ausschluss-

verfahren

- Führung exakter Aufzeichnungen

- frühzeitiges Erkennen wichtig

mobile Phase:

- Verunreinigungen

- Gasblasengehalt

- Algenbildung

Pumpe:

- Leckbildung,

Ablagerungen/Verschleiß an

Dichtungen und Pumpenköpfen

Injektor:

- Verstopfungen, Lecks

- Injektionslösungsmittel ungeeignet

Säule:

- Verunreinigungen (Vorsäule!,

Spülen)

- Pufferausfällung

- Hohlräume (plötzliche Verände-

rung Fluss, Eluent)

Detektor:

- mechanische und optische

Probleme selber lösen

- elektronische Probleme: Firma


Chromatographie

Allgemeine Vorgehensweise bei der chromatographischen Trennung

1. Literaturrecherche, problemorientiert, Vorauswahl Trennmechanismus und Detektion

2. Isokratische Trennung Analytgemisch (Standards), Überprüfen Peakanzahl, Peak-

breite (Fließgeschwindigkeit ändern)

3. einfacher Gradient, (lange Analysenzeit wählen)

4. Variation Gradient (Steilheit, Kombination mit isokratischen Abschnitten), Analysen-

zeit optimieren, bei Nichtlösen Trennproblem: Änderung Säule, Trennprinzip, Säulen-

länge, Laufmittel (auch pH-Wert, Zusätze)

5. Einzelstoffe injizieren (Peakzuordnung)

6. Kalibrierung mit definierten Standardmischungen

7. Überprüfung Gesamtverfahren mit Reinstwasser (alle Probenvorbereitungsschritte),

Ermittlung Wiederfindungsrate, Kalibrierung

8. Einbeziehung Realwasser (Matrixeinfluss), Störungen?, ev. Parameter verändern

(Clean-up, Gradient), Kalibrierung, Statistik, Wiederholbarkeit

9. Aufnahme von Messwerten, Rekalibrieren, Überprüfung (Parallelverfahren, Standard-

zusatz, Ringtest)

Verringerung des praktischen Aufwandes durch Rechnersimulation möglich („Dry Lab“), aber

einzelne Punkte nicht ersetzbar


N

O

F

N

NH

HO

ON

NH2N

NH2

O

O

OTrimethoprim

O

OH

O

N

N

Cl

Ciprofloxacin

Cetirizin



HPLC – anwendungsorientierte Aspekte I

Trennung dissoziierbarer organischer Verbindungen mittels RP:

Grundsätze: - dissoziierte Komponente stets polarer – kürzere Rt!

- Verbindung sollte nicht in zwei Ladungsformen vorliegen (Peakform!)

- geladene Komponenten: unerwünschte Sekundär-WW

bei Kenntnis pKs-Wert Ladungszustand ableitbar; Probleme: 1) z.T. unzureichende

Literaturangaben, 2) amphotere Stoffe/ multifunktionelle Moleküle

Beeinflussung Ladungszustand?

- durch Zusatz von geeigneten Puffern im Laufmittel

- Anforderungen: möglichst geringe Beeinflussung Detektion, nicht

korrosiv, beständig, keine Mischungsprobleme, MSD: flüchtig!

Beispiele: stark sauer pH 1,3…3,3 Phosphatpuffer (H2PO4-), HCOOH

schwach sauer pH 3,8…5,8 Acetatpuffer

neutral bis schwach basisch pH 6,2…8,2 Phosphatpuffer (HPO42-)

basisch pH 7,0…9,5 Boratpuffer, NH4HCO3

Achtung, Stabilität RP-Phasen beachten! (pH<2: Hydrolyse C18, pH>8: Auflösung)



Bei der Umkehrphasenchromatographie zur Trennung dissoziierbarer Verbindungen

müssen Puffer eingesetzt werden. Welchen Einfluss hat deren Konzentration?

generell gilt:

1) Eluent wird polarer: - kürzere Retention polarerer Stoffe

- lipophilere Verbindungen eluieren später

- Löslichkeit des polaren Kieselgels erhöht sich, Verschleiß!

2) Unterdrückung der Dissoziation der freien Silanolgruppen: geringere Auswirkungen

bei Chargenunterschieden; System wird robuster

- Puffer soll eine pH-Änderung sicher vermeiden

- bei schwach polaren Analyten: 5 bis 10 mM oft ausreichend

- sonst 20 bis 30 mM (insbesondere bei älteren Materialien)

- Ionenpaarchromatographie: 60…100 mM

HPLC – anwendungsorientierte Aspekte II



Problem:optimale Trennung basischer/saurer Stoffe bei höherem/niedrigerem pH;

aber: viele C-18-Materialien im alkalischen Bereich nicht stabil; im sauren Bereich

Hydrolyse (Säulenbluten, Verschlechterung Trennleistung)

Lösung:Einbau einer Vorsäule/kurzen C-18-Säule zwischen Pumpe und Injektor:

- alkalische Laufmittel ist mit Kieselgel gesättigt, Trennsäule wird nicht aufgelöst

- Hydrolyse erfolgt maßgeblich an Vorsäule

- Verunreinigungen gelangen nicht zur Trennsäule

Eluent Pumpe

Vorsäule Trennsäule

Detektor

HPLC – anwendungsorientierte Aspekte III



HPLC – anwendungsorientierte Aspekte IV

Reinigung von RP-Phasen

Problem: extrem stabile Bindung hydrophober Moleküle an RP-Phasen

Lösungsansätze:

- Injektion (ev. mehrfach) reiner Lösungsmittel (100…200 µL) – Achtung Salze!

- (Rück-)Spülen mit reinem Lösungsmittel (Achtung, Salze!)

- Aufwändigere Spülprozedur:

- Neubefüllung Säuleneingang

- Einsatz einer neuen Säule

50 mL heißes Wasser (40 – 60 °C)

50 mL Methanol

50 mL Acetonitril

30 mL Tetrahydrofuran

25 mL Methanol

25 mL mobile Phase

Au

fwan

d/K

oste

n


Vergleich von Kapazitätsfaktoren (definiert als (tR−t0)/t0),

dargestellt als Abstand vom Zentrum, bestimmt mittels

RPLC, MMLC, HILIC bzw. SFC für 7 hochpolare Stoffe

(logDOW bei pH 7.4)Quelle: T. Reemtsma et al., Environ. Sci. Technol. 2016, 50,

10308−10315

RPLC - reversed-phase LC

MMLC - mixed-mode LC

HILIC - hydrophilic interaction LC

SFC - supercritical fluid chromatography

Hydrophilic interaction liquid chromatography - HILIC

Paraquat (1,1′-Dimethyl-4,4′-bipyridinium)

Kontaktherbizid

logDOW bei pH 7.4 = -7,0

Metformin

Antidiabetikum

logDOW bei pH 7.4 = -3,7

Neu!


Quelle: B. Buszewski & S. Noga, Anal. Bioanal. Chem., 2012, 402, 231–247


Neu!


Neu!



Mobile Phasen, Elutrophe Reihe:

Aceton < Isopropanol = Propanol < Acetonitril< Ethanol < Dioxan < DMF = Methanol < Wasser

Ionische Zusätze:

NH4-Acetat / -Formiat (Ziel: Analyt in einfacher ionischer Form!)

Gradient:

Im Gegensatz zur RP-LC (Wasser → Lösungsmittel): Lösungsmittel → Wasser

RP-Bedingungen:LiChrospher RP-Select B, 250 mm34.6 mm I.D., 5 mm column; mobile phase acetonitrile–20 mM sodium pentanesulfonate (14:86), pH

3.5 with sulfuric acid

HILIC-Bedingungen: Zorbax NH column; mobile phase acetonitrile –5 mM potassium phosphate, pH 6.5 (65:35)

Quelle: B. Buszewski & S. Noga, Anal. Bioanal. Chem., 2012, 402, 231–247

Neu!


Chromatographie – IC

Schematische Darstellung eines Ionenchromatographie-Systems

Eluent Pumpe

Proben-

aufgabe

Vorsäule Trennsäule

DetektorAuffang-

gefäß

Registrier- bzw.

Auswerteeinheit

LC-Anwendungsbeispiel: Ionenchromatographie



Matrix:

- wenig belastete Wässer (Trink-, Grund-, Oberflächenwasser)

Konzentrationsbereiche:

- Fluorid 0,01 – 10 mg/L

- Chlorid 0,1 – 50 mg/L

- Nitrit 0,05 – 20 mg/L

- Orthophosphat 0,1 – 20 mg/L

- Bromid 0,05 – 20 mg/L

- Nitrat 0,1 – 50 mg/L

- Sulfat 0,1 – 100 mg/L

Störungen:

- organische Säuren (z. B. Malonsäure, Maleinsäure)

- Querempfindlichkeiten bei großen Konzentrationsunterschieden

- Schwebstoffe und organische Wasserinhaltsstoffe (Huminstoffe)

EN ISO 10304-1 (früher DIN 38405-19):

Bestimmung der gelösten Anionen Fluorid, Chlorid, Nitrit, Orthophosphat,

Bromid, Nitrat und Sulfat mittels Ionenchromatographie



Trennsäule:

- Anionenaustauscher niedriger Kapazität – Grundmaterial (Polystyrol/

Divinylbenzol-Copolymer, Polymethacrylate) mit Austauschergruppen

(quarternäre Ammoniumgruppen)Teilchengröße: 5 – 25 µm

Eluent:

- wässrige Lösungen von Salzen schwacher ein- oder zweibasiger Säuren

a) mit Suppressortechnik (z. B. Na2CO3/NaHCO3)

b) ohne Suppressortechnik (z. B. Kaliumhydrogenphthalat)

Detektoren:

I. Leitfähigkeitsdetektor, möglichst mit Suppressor

II. UV-Detektor oder Diodenarraydetektor

III. Elektrochemischer Detektor (Ionen müssen oxidierbar oder

reduzierbar sein), z. B. amperometrische Detektion

Bestimmung der gelösten Anionen Fluorid, Chlorid, Nitrit, Orthophosphat,

Bromid, Nitrat und Sulfat mittels Ionenchromatographie



Suppressor:

- Herabsetzung Leitfähigkeit des Eluenten nach der Säule

Probenvorbereitung:

- Filtration/Einmal-Kartuschen zur Entfernung von gelöster Organika (HS),

hohen Chlorid- oder Sulfatmengen, Verdünnung



Retentionsbestimmende Parameter in der Ionenaustausch-Chromatographie

Ladung

Regel: Je höher die Valenz des zu analysierenden Ions, desto größer die Retentionszeit.

Beispiel: tms(Nitrat) < tms(Sulfat)

(Orthophosphat: pH-abhängig!)

Größe

Regel: Je größer der Ionenradius des zu analysierenden Ions, desto größer die

Retentionszeit.

Beispiel: tms: F- < Cl- < Br- << I-

Polarisierbarkeit

Regel: Je höher die Polarisierbarkeit des Ions, desto größer die Retentionszeit.

Beispiel: tms(Sulfat) < tms (Thiocyanat)

Begründung: Der Ionenaustausch-Prozess wird durch Adsorptionsprozesse überlagert.



Elutionsreihenfolge der wichtigsten anorganischen Anionen


Chromatographie

Bestimmung von 6 polycyclischen

aromatischen Kohlenwasserstoffen

Isokratische Trennung der sechs

polycyclischen Aromaten

Fluoreszenzdetektion:

Anregung 365 nm,

Emission 470 nm

Arbeitsbedingungen:

Beispiel a)

• Säule: HS 5 HCODS (PAK-Spezialsäule); 125 x 4,6 mm

• Eluent: Acetonitril/Wasser (85 : 15)

• Flussrate: 1,8 mL/min

• Säulentemperatur: 21 °C

Beispiel b)

• Säule: Nucleosil 120-4 um PAK, 250 x 4 mm

• Eluent: Methanol/Tetrahydrofuran (80 : 20)

• Flussrate: 1,5 mL/min

• Säulentemperatur: 30 °C

Peakidentifizierung:

1) Fluoranthen

2) Benzo(b)fluoranthen

3) Benzo(k)fluoranthen

4) Benzo(a)pyren

5) Benzo(ghi)perylen

6) Indeno(1,2,3-cd)pyren


Wichtige Literatur

Meyer, V.: Praxis der Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie.

(Aarau: Salle, Sauerländer, 1992)

Unger, K. K.: Packings and stationary phases in chromatography techniques.

(New York: Dekker, 1990)

Engelhardt, H.: Practice of High Performance Liquid Chromatography.

(Berlin, Heidelberg: Springer, 1986)

Kromidas, S.: Practical Problem Solving in HPLC. (Weinheim: Wiley-VCH, 2000)

Weiß, K.: Ionenchromatographie.

(Weinheim: VCH, 1991)

Schomburg, G.: Gaschromatographie. Grundlagen – Praxis – Kapillartechnik.

(Weinheim: VCH, 1986)

Leibnitz, E., Struppe, H. G.: Handbuch der Gas-Chromatographie.

(Leipzig: Akad. Verl.ges. Geest und Portig KG, 1988)

Hübschmann, H.-J.: Handbuch der GC/MS. Grundlagen und Anwendung. (Weinheim, VCH,

1996)

Wagner, H., Blasius, E.: Praxis der elektrophoretischen Trennmethoden.

(Weinheim, VCH)

Funk, W.; Dammann, V., Vonderheid, C., Oehlmann, G.:

Statistische Methoden in der Wasseranalytik.

(Weinheim: VCH)


Chromatographie – GC

Gaschromatographie

Kennzeichen/allgemeine Aspekte

mobile Phase: inertes Trägergas

stationäre Phase: vor allem immobilisierte Flüssigkeiten, auf Träger

(poröser Feststoff) oder an Wandungen dünner

Röhren (Kapillargaschromatographie)

Phasensystem (=Kombination stationäre und mobile Phase) wird nur

durch stationäre Phase bestimmt (Gase unbegrenzt mischbar)

kontinuierlicher Strom der mobilen Phase über stationärer Phase –

kontinuierliche Verteilung der Probesubstanzen



Gaschromatographie

Abgase

Auswerte-

einheit

DetektorKapillarsäule

Injektor

Flussgeber

Reinigungs-

stufeev. Split

Säulenofen

(temperaturprogrammiert)



Gaschromatographie

Kennzeichen/allgemeine Aspekte

Trägergas

kaum Wechselwirkungen zu gasförmigen Gasbestandteilen

somit Selektivität nur durch stationäre Phase bestimmt

aber Einfluss auf:

• Trennleistung

• Zeitbedarf

• Detektierbarkeit der Probe

weitere Anforderungen: chemisch inert, hohe Reinheit

Kriterien wie Preis, Toxizität und Brennbarkeit beachten

hauptsächlich Stickstoff, Helium, Wasserstoff, (Argon)



stationäre Phase

Flüssigkeiten mit geringer Flüchtigkeit (hohes Molgewicht)

unpolare Säulen: nur van der WAALS-Wechselwirkungen

polare Säulen: auch Dipol-, Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen

Trennung erfolgt in Reihenfolge ansteigender Molekulargewichte

Faustformel: je höher Polarität der stationären Phase um so

ausgeprägter Selektivität

hochsiedende KWs Polysiloxane Polyglycole

Gaschromatographie - stationäre Phasen

Gepackte Säulen Kapillarsäulen


Quelle: http://chromatographie.ntk-landau.de/Saeulen_GC.htm

Gaschromatographie - stationäre Phasen

R = z. B.

- Methylgruppen (-CH3, unpolar)

- Phenylgruppen (-C6H5, etwas polar)

- Cyanopropyl-Gruppen (-(CH2)3-CN, stark polar)

- Vinyl (CH2=CH-)

(quervernetzbar)



Injektoren in der GC

Verbindung zur Säule

Einlass für das Trägergas

Einlass für die Probe

Verdampfungskammer

• Aufbau (Injektionsart, Materialien)

• Prozesse (Verdampfung, Vermischung,

Transport)

• Einspritzgeschwindigkeit

• Injektionstemperatur

• Septen, Liner, Inserts

Arten der Injektion

Direkt-

Injektion

Split-

Injektion

Split/Splitless-

Injektion

On-Column-

Injektion

…Heiße Probenaufgabesysteme Kaltaufgabesysteme



Injektoren in der GC



Vergleich isotherme GC – temperaturprogrammierte GC



Aufbau GC:

Versorgungseinrichtung Trägergas/Hilfsgase/Brenngase

Probenaufgabesystem (on column, Kaltnadel-, split/splitless)

Trennsäule/Säulenofen

Detektor:

• Wärmeleitfähigkeitsdetektor

Trägergas Helium (gute Wärmeleitfähigkeit)

Messung Verringerung Wärmeabgabe eines Heizdrahtes;

universell

• Flammenionisationsdetektor

Wasserstoff-Luft-Flamme, Analyt wird ionisiert, Ionenerfassung

mittels Kollektor (Stromfluss); universell, T > 100 °C

• Elektroneneinfangdetektor

Ionisation Trägergas: Stickstoff oder Argon (+ 5 % Methan),

Analyten: elektronegative Spezies, Aufnahme thermischer

Elektronen, Stromabnahme; selektiv

Vergleich

(ca. Detektions-

grenze)

400 pg absolut

10 … 100 pg

0,05 … 1 pg



KathodeAnode

(+)

M

e-

e-

e-

RCl

Ni63

β-

keine Spannung

Anode

(+)

Kathode

e-

e-

e-

RCl

Ni63

β-

Spannung angelegt

β-

= beta Teilchen

M = Trägergasmolekül

e-

= sekundäre Elektronen mit niedriger Energie

e-RCl = elektrophiles Molekül mit eingefangenem Elektron


Chromatographie

ECD Verhalten von verschiedenen Verbindungen

Chemische Gruppe rel. Empfindlichkeit

Kohlenwasserstoffe 1

Ether, Ester 10

Aliphatische Alkohole, Ketone, Amine, mono-Cl-,

mono-F-Verbindungen

100

Mono-Br-, di-Cl- und di-F-Verbindungen 1000

Anhydride und tri-Cl-Verbindungen 10 000

Mono-I-, di-Br-, poly-Cl- und poly-F-Verbindungen 100 000

Di-I-, tri-Br-, poly-Cl- und poly-F-Verbindungen 1 000 000



Aufbau GC:

Detektor:

• Stickstoff-Phosphor-Detektor

ähnlich FID, nur niedrigere Temperatur, bei Anwesenheit Rb

selektive Ionisation von N- und P-Verbindungen; selektiv

• Flammenphotometrischer Detektor

Verbrennung von S- und P-haltigen Substanzen:

Chemolumineszenz; selektiv

• Massenselektiver Detektor

Elektronenstoß- oder chemische Ionisation, teilweise

Bindungssprengung, für jedes Molekül charakteristische Fragmente,

Auftrennung in Magnet- oder Hochfrequenzwechselfeld:

Massenspektren (3D-Daten), Identifizierung im Scan-Modus,

Quantifizierung im SIM-Betrieb

• Atomemissionsdetektor, Elektrolytischer Leitfähigkeitsdetektor u. a.

Vergleich

(ca. Detektions-

grenze)

0,4 … 10 pg N

0,1 … 1 pg P

0,9 pg P

20 pg S

< 0,1 pg (SIM)

0,2 pg


Chromatographie

Ionenquelle

Detektor

Diagramm eines Quadrupol – Massenspektrometers

Die Ionen treten in Wechselwirkung mit dem elektrischen Feld,

welches durch die vier Quadrupolstäbe hervorgerufen wird und

werden entsprechend dem Masse/Ladungs-Verhältnis getrennt.


Chromatographie


(mainlib) Benzeneacetic acid, 2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]-

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

50

100

2839 51 63

77 89 107151

179

214

242

250

277

295

NH

Cl

Cl

O

OH

OC

Cl

NH

HN

O

O

OH

HN

O

OH

Cl

Cl

Cl

HN

Cl

HN

Cl

HN

Cl O

HN

Cl O

Cl

HN

Cl O

OH

28

HO

O

45

76

90

110

125

133136

145

149

201

215243

HN

Cl

Cl

250

259

278

NH

91

HN

Cl

Cl

179

Beispiel: Fragmentierung von Diclofenac (M = 296 g/mol)


Chromatographie

überkritisches Fluid:

- mobile Phase: kritische Zustandsform

- Zustand: weder Gas noch Flüssigkeit

- Zustand wird erreicht durch Erhöhung Druck und Temperatur

- die einzelnen Gase/Flüssigkeiten besitzen eine bestimmte kritische

Temperatur bzw. kritischen Druck, oberhalb dieser Punkte: überkritisches

Fluid (CO2: 31,3 °C und 7,3 Mpa)

Kennzeichen:

- gegenüber Flüssigkeiten:

• geringere Dichte

• niedrigere Viskosität

• höherer Diffusionskoeffizient

- oberhalb Tkritisch: auch bei weiterer Erhöhung des Drucks keine

Verflüssigung möglich

- überkritische Fluide sind kompressibel; gutes Strömungsverhalten

- Zunahme Lösungsvermögen mit steigendem Druck

SFC – Chromatographie mit überkritischen Phasen


Zustandsdiagramm von Kohlendioxid


Chromatographie

Anwendung:

- für Analyten, die auf Grund zu geringer Flüchtigkeit/hoher Thermolabilität

nicht mit GC und wegen Unbeständigkeit/schlechter Lösungseigenschaften

in üblichen Lösungsmitteln nicht mit der HPLC getrennt werden können

Gerätetechnik – Hauptmodule:

- Einrichtung zur Druckerzeugung, -regelung und –entspannung

- Pumpe, Injektionsventil (ähnlich HPLC)

- Trennsäule (HPLC oder GC)

- Detektor (HPLC oder GC)

Gradienttechnik:

- Zusammensetzung mobile Phase (vgl. HPLC)

- Temperatur (vgl. GC)

- Druck

- Dichte

- lineare Strömungsgeschwindigkeit

SFC – Chromatographie mit überkritischen Phasen


Chromatographie – CE

Begriffe:

- Elektrophorese: Trennung durch unterschiedliche Bewegung/Wanderung

von geladenen Teilchen im elektrischen Feld

- Ionophorese: Elektrophorese kleiner Ionen

- Kata-/Anaphorese: Elektrophorese von Kationen bzw. Anionen

- Trägerfreie E.: Trennung freier Lösung

- Träger-E.: Trennung bei Anwesenheit eines Trägermatrials (Gel,

Papier, Celluloseacetatfolie)

wichtige Einflussgrößen:

- Ionenbeweglichkeit, Funktion von:

• Temperatur

• Feldstärke

• Teilchenradius + Lösungsmittelmoleküle

• Ionenladung

• Ionenstärke der Lösung

• Dissoziationsgrad

• pH-Wert

• Reibungseffekte Lösungsmittel, Wandungen

Kapillar(zonen)elektrophorese CE (CZE)



- Kapillare: 20 – 200 cm lang, i.D. 25 – 200 µm

- u. a. Fused-silica-Kapillaren, Teflon

- 2 separate Puffersysteme mit angeschlossenen

Elektroden (bis 30 kV)

- geringer Strom: 5 – 250 µA

- spezielle Probenaufgabe

- HPLC-Detektoren insbesondere UVD, zunehmend MSD

- diverse Techniken (u. a. MEC, Isotachophorese,

isoelektrische Fokussierung)

Kapillarelektrophorese



Vergleich Ionenchromatographie - Kapillarelektrophorese

Vorteile CE im Vergleich zur IC

bessere simultane Trennung organischer

und anorganischer Ionen

Kurze Analysenzeiten

Kaum Probenvorbereitung, wenig

Matrixeffekte (Huminstoffe stören i. d. R.

nicht)

Hohe Reproduzierbarkeit

Nachteile CE

Geringerer dynamischer Bereich

(Linearität)

Konzentrationsabhängiger Shift der

Peakmaxima

Zeitverluste durch Spülung der

Kapillare

Geringe Empfindlichkeit aufgrund

niedriger Injektionsmengen


Analytik organischer Verbindungen - Summenparameter

Erfassung aller einzelnen organischen Komponenten in einem Wasser nicht möglich


Organische Wasserinhaltsstoffe – gekennzeichnet durch hohe Vielfalt,

Wirksamkeit in stark verschiedenen Konzentrationsbereichen, rasche

Veränderlichkeit, weiter Bereich der Molmasseverteilung

Organische Inhaltsstoffe

natürlich vorkommend anthropogen vorkommend


• allgemeine Definition: Huminstoffe sind refraktäre, höhermolekulare,

polydisperse und polyfunktionelle Substanzen biogenen Ursprungs

• Huminstoffe werden bei chemischen und biologischen Ab- und

Umbaureaktionen aus natürlichen organischen Substanzen gebildet

• keine einheitlichen, im Sinne der klassischen Chemie definierten

Verbindungen

• es kann weder eine Summenformel noch eine Struktur angegeben werden

• aquatische Huminstoffe machen ca. 50 – 80 % des DOC aus, im Allgemeinen

dominieren Fulvinsäuren

• Angaben zu den molaren Massen schwanken sehr stark und reichen von

500 g/mol bis 100.000 g/mol, wobei die Fulvinsäuren die niedrigeren

Werte aufweisen (500…2.000 g/mol)

Huminstoffe


C C

O

O

H

C

O

O

H

C O H O H

C O

R

H

C O

R

R

O CH3

aliphatische aromatische

Carboxylgruppe

aldehydische ketonische

Carbonylgruppe

alkoholische phenolische

Hydroxylgruppe

Methoxygruppe

Typische funktionelle

Gruppen in Huminstoffen

O

HO

O

OH

COOH

OH

COOH

HON

CH

COOH

R

O

O

O

HO

HN

CH

C

NH

R

O

C

N

CH CH2

O

C

C

C

OH

OH)4(H

OH

O

O

HO

O O

O

H

O

OH

COOH

COOH

Strukturvorschlag

Huminstoffe


Operationell definierte Unterscheidung (Bodenuntersuchungen)

Bodenmaterial

Unlösliche Fraktion Lösliche Fraktion (Extrakt)

Ansäuern auf

pH ≤ 2

Niederschlag Gelöste Fraktion

Humine

Huminsäuren Fulvinsäuren

Extraktion

Analytische Charakterisierung von Huminstoffen I


Summenbestimmungsmethoden

Warum? Vorteile?

- Vielzahl organischer WIS, auch wenn deren Einzelkonzentrationen nicht bestimmbar

- Schnelligkeit der Verfahren

- Aufwand relativ gering

- Einsatz u. a. Monitoring, Überwachung …

Grenzen/Probleme?

- einzelne Summenparameter – oft nur begrenzt Aussagen möglich (→ Kombination

diverser Analysenparameter)

- keine Aussagen über Art/Bewertung der einzelnen Verbindungen (→ zusätzlich

ausgewählte Einzelstoffanalysen – LC/GC - und wirkungsbezogene Analytik)

Kennzeichen

- Erfassung gemeinsamer stofflicher Strukturmerkmale oder Eigenschaften



Beispiele für Summen- und Gruppenparameter

(operationell definiert)

CSB (Chemischer Sauerstoffbedarf) – chemisch oxidierbare organische Substanzen

BSB (Biologischer Sauerstoffbedarf) – biologisch oxidierbare organische Substanzen

DOC (Dissolved Organic Carbon) – gelöste organische Substanzen

TOC (Total Organic Carbon) – Gesamtheit der gelösten und ungelösten organischen

Substanzen

AOX (adsorbierbare organische Halogen(X)-verbindungen) – chlor-, brom-, iodhaltige

organische Substanzen

AOS (adsorbierbare organische Schwefelverbindungen) – organische

Schwefelverbindungen

IOS (ionenpaarextrahierbare organische Schwefelverbindungen) – organische

Schwefelverbindungen (Sulfonsäuren)

Aromatische Amine – Anilin und Anilinderivate

Phenolindex – Phenole

Methylenblau-/Bismutaktive Substanzen – anionische / nichtionische Tenside

…



Methoden zur Ermittlung der Sauerstoffmenge, die zur Oxidation der

organischen Wasserinhaltsstoffe notwendig ist

Chemischer

Sauerstoffbedarf

Biochemischer

Sauerstoffbedarf

indirekte Verfahren

definierte Bedingungen erforderlich (Vergleichbarkeit)

Vollständigkeit der Reaktion häufig nicht gegeben



Biochemischer Sauerstoffbedarf

Definiert wird der biochemische Sauerstoffbedarf, BSBn, als die Masse an

gelöstem Sauerstoff, die von adaptierten Mikroorganismen beim oxidativen

Abbau der im Wasser enthaltenen organischen Stoffe unter festgelegten

Bedingungen innerhalb von n Tagen benötigt wird.

Chemischer Sauerstoffbedarf

Der chemische Sauerstoffverbrauch wird als die auf Sauerstoff umgerechnete

Menge an Oxidationsmitteln definiert, die bei der Oxidation organischer

Inhaltsstoffe des Wassers unter festgelegten Bedingungen benötigt wird. Das

verwendete Oxidationsmittel muss dabei angegeben werden.




Prinzip:

- Tätigkeit von Mikroorganismen (aerobe Bedingungen) Abbau organischer

Stoffe

- Verbrauch an Sauerstoff wird gemessen und angegeben

Durchführung:

Variante 1:

• Probe (20 °C) auf pH 7 – 8 einstellen, 2 h Standzeit bei anorganischen

sauerstoffzehrenden Stoffen (Fe(II))

• ev. diverse Verdünnungsreihen (mit luftgesättigtem Wasser)

• je nach Probe: Sättigung mit reinem Sauerstoff/Animpfen mit definierter

MO-Mengen (Kläranlagenablauf)

• Messung O2 (WINKLER oder elektrometrisch), t = 0

• wiederholte Messung nach verschiedenen Zeiten (BSB-Kurve)

• üblich: nach 5 Tagen O2-Restmenge bestimmen: Differenz = BSB5




Durchführung:

Variante 2:

• geschlossene Flasche: Teil Gas (Luft oder O2)/Teil Probe

• Messung (in Abhängigkeit von der Zeit):

1. Änderung Partialdruck (Maß für O2-Verbrauch)

2. CO2-Entstehung

• auch Messung Differenz CSB (t = 0) und CSB (t = n Tage)

Einflussfaktoren:

- Sauerstoffkonzentration (Luft: Sättigung ca. 9 mg/L)

- Nährstoffangebot

- Temperatur

- Lichteinwirkung

- Zeit

- Art der Wasserinhaltsstoffe




Praxis:

- vorrangig zur Abwasserbeurteilung

- Verfälschung durch toxische Stoffe

- Problem Nitrifikation (zeitlich später; Nitrifikationshemmer zusetzen)

- Zusammenhang zu Gewässergüteklassen:

- Grundwasseruntersuchung: Wirksamkeit Mineralisation in der

Bodenpassage

- Nachteil: langer Zeitbedarf

Gewässergüteklasse I II III IV

BSB5 [mg/L] 2 – 3 3 – 5,5 5,5 – 14 über 14




Prinzip:

- Umsetzung organischer Wasserinhaltsstoffe mit bestimmten Oxidationsmitteln

- Verbrauch an Oxidationsreagenz (Differenzmessung vor und nach der

Reaktion) = Maß für Menge an organischen Inhaltsstoffen

- Umrechnung auf Sauerstoff

- Oxidationsmittel: Kaliumdichromat K2Cr2O7

(Kaliumpermanganat KMnO4)



Oxidation mit Permanganat

- in stark alkalischem Medium:

MnO4- MnO4

2- E0 = 0,54 V

MnO4- + 1 e- MnO4

2-

- in schwach alkalischem bis neutralem Medium:

MnO4- MnO2 E0 = 0,58 V

MnO4- + 3 e- + 2 H2O MnO2 + 4 OH-

- in saurem Medium:

MnO4- Mn2+ E0 = 1,52 V

MnO4- + 5 e- + 8 H+ Mn2+ + 4 H2O E = 1,43 V

Oxidation mit Dichromat

Cr2O72- Cr3+ E0 = 1,36 V

Cr2O72- + 14 H+ + 6 e- 2 Cr3+ + 7 H2O E = 1,90 V




Vollständigkeit der Oxidation abhängig von:

- Art der organischen Stoffe

- Konzentration der organischen Stoffe

- pH-Wert

- Reaktionstemperatur

- Reaktionszeit

- Anwesenheit bestimmter anorganischer Stoffe



Permanganat – Verbrauch (Permanganat-Index)

- 10 min Erhitzen der angesäuerten Wasserprobe mit KMnO4 (definierter Überschuss)

im siedenden Wasserbad:

MnO4- + 5 e- + 8 H3O

+ Mn2+ + 12 H2O

- Restgehalt Permanganat wird mit bekanntem Überschuss an Oxalationen

umgesetzt:

MnO4- + 5 C2O2

2- + 16 H3O+ 2 Mn2

+ + 24 H2O + 10 CO2

- Restgehalt Oxalat mit Permanganat zurücktitriert – entspricht KMnO4-Verbrauch



Chemischer Sauerstoffbedarf (Permanganat-Verbrauch)

Hinweise:

- Umrechnung: 1 mg KMnO4 = 0,253 mg O2

- relativ empfindlich: 0,5 – 10 mg/L O2

- Anwendung für gering belastet Wässer

- Nichterfassung z. B. Tenside, Chlorkohlenwasserstoffe, niedere Fettsäuren

und Alkohole

- oxidiert werden z. B. Huminstoffe, Phenole

- Literatur: nur 20 – 25 % der Organika werden erfasst



Dichromat – Verbrauch

- Oxidation der organischen Stoffe durch Kaliumdichromat (bekannte Menge im

Überschuss) in stark schwefelsaurer Lösung

- Bedingungen: 2 Stunden bei (148 ± 3) °C mit Katalysator (Ag+)

Cr2O72- + 6 e- + 14 H3O

+ 2 Cr3+ + 21 H2O

- Titration des nichtverbrauchten Dichromates mit Ammoniumeisen(II)-sulfat, Indikator

Ferroin

Cr2O72- + 6 Fe2+ + 14 H3O

+ 2 Cr3+ + 6 Fe3+ + 21 H2O

- auch photometrisch bestimmbar (Küvettentests)



Chemischer Sauerstoffbedarf – (Dichromatverbrauch)

Hinweise:

- Umrechnung: 1 mg K2Cr2O7 = 0,163 mg O2

- Störungen durch Chlorid (Oxidation zu Chlor): Verhinderung durch Zusatz

Quecksilbersulfat (Maskierung)

- 95 – 97 % ige Oxidation der Organika, Rest beständige Spaltprodukte (CO,

CH4), z. T. N-haltige Heterocyclen

- relativ unempfindlich (> 15 mg/L)

- weitere Nachteile: relativ umständlich, zeitaufwendig, Anfall zu entsorgender

Mengen Quecksilber-, Chrom- und Silberionen

- Abwasserabgabengesetz: mittelfristig Ersatz CSB durch TOC

- ca. - Umrechnung: CSB (mg/L O2) = 3 x TOC (mg/L C); CSB/TOC = mittlerer

Ox.-grad!!

- sehr wichtig: Verhältnis BSB5/CSB (max. = 1), besonders bei Verfolgung

biologischer Behandlung (Quotient wird zunehmend kleiner)



Gesamter (Gelöster) Organischer Kohlenstoff (TOC)

und andere C – Parameter

direkte summarische Analysenverfahren

vollständige Oxidation organischer C-Verbindungen

Messung CO2, Ergebnisangabe: in mg/L Corg bzw. mmol/L Corg

Begriffe:

TC - Total Carbon

TOC - Total Organic Carbon

TIC/IC - (Total) Inorganic Carbon

DOC - Dissolved Organic Carbon

NDOC - Nondissolved Organic Carbon

POC - Purgeable Organic Carbon

NPOC - Nonpurgeable Organic Carbon

VOC - Volatile Organic Carbon

TC = TOC + IC DOC + NDOC = TOC POC + NPOC = TOC



D O C

Filtration (Membranfiltration Poren-Ø 0,45 µm)

Variante A

- Ansäuern (H3PO4)

- Überführen CO32-/HCO3

- in CO2

- Austreiben mit Purge-Gas

- entspricht NPOC

Variante B

- getrennte Bestimmung von DC

und DIC

- Differenz entspricht DOC



Oxidation der Kohlenstoffverbindungen

nasschemisch

- Oxidationsmittel z. B.

Kaliumdichromat,

Kaliumperoxodisulfat

oder Kaliumperiodat

- in schwefelsaurer Lösung

- hoher Zeitbedarf

UV-Licht

- i. a. mit Zusatz von

Oxidationsmittel (vgl. I)

oder Sauerstoff

- Temperatur ca. 60 °C

- schwebstofffrei

- z. T. nicht vollständig

thermisch

- erhöhte Temperatur

(650 – 1000 °C)

- Katalysator

- Sauerstoff (synth. Luft)

- praktisch vollständige

Oxidation

III III

Entstehung von CO2, H2O u. a. Verbrennungsprodukten

(Wasserabscheider, Trocknung)

Quantitative Detektion des CO2



Quantitative Detektion des CO2

- IR-Spektrometrie

- Acidimetrie

- CO2-selektive Elektrode

- Flammenionisationsdetektor

(nach Reduktion zu Methan)

- Wärmeleitfähigkeitsdetektor

- Absorption von IR-Licht

- IR-aktiv: Molekül mit Dipol (H2O, CO2 …)

- nichtdispersive IR-Spektroskopie

- CO2: starke Bande bei 2349 cm-1 (H2O: 3710 cm-1)

ND-IR-Detektor Quelle:http://www.esrl.noaa.gov/gmd/outreach/faq_cat-3.html



Anmerkung zum Parameter TOC / DOC

Probenvorbereitung:

- Membranfiltration: C-Eintrag

- Schwebstofferfassung: Verbrennungsmethode

- dabei Homogenisierung der Probe

IC-Entfernung:

- Purge-Zeit, pH-Wert einhalten

- mögliche Kontaminationen beachten

- Verlust flüchtiger Komponenten

Differenzmethode:

- nur bei höheren DOC-Gehalten

- Verhältnis IC/DOC geht in Fehler ein




Verbrennung 1000 °C:

- schnell, sicher, vollständig

- Peakform substanzunabhängig

- schlagartige Verdampfung der Wasserprobe

- C-Verdünnung, Abkühlung

- max. Injektionsvolumen: 100 µL

- Salzaufschluss – hoher Verschleiß

Verbrennung 680 °C:

- Katalysator: Platin

- Salze stören weniger, bis 2 mL injizierbar

- Auswertung über Peakfläche




UV/VUV-(Oxidationsmittel)-Oxidation:

- größere Probevolumina (> 10 mL)

- sehr gute Reproduzierbarkeit

- Salze stören

- z. T. unvollständiger Aufschluss (Kolloide)

Nachweisgrenzen:

- Verbrennung 680 °C: bis 50 µg/L

- UV/Persulfat: wenige µg/L

- entscheidend: Qualität Verdünnungswasser



Typische TOC - Bereiche

Abwasser 100 – 10.000 ppm C

Industrieabwasser 100 – 10.000 ppm C

Fluss-/Seewasser 2 – 20 ppm C

Meerwasser 0,3 – 2 ppm C

Grundwasser 0,4 – 10 ppm C

Trinkwasser 0,5 – 3 ppm C

Destilliertes Wasser 100 – 200 ppb C

Reinstwassersysteme 10 – 200 ppb C

Kesselspeisewasser 10 – 200 ppb C

ppm: part per million (mg/L)



Ox.stufe Beispiel CSB/TOC

+ 3 Oxalsäure 0,667

+ 2 Methansäure 1,333

+ 1 Zitronensäure 2,0

0 Formaldehyd 2,667

- 1 Buttersäure 3,333

- 2 Methanol 4,0

- 3 Ethan 4,667

- 4 Methan 5,333

CSB/TOC-Verhältnis = mittlere Oxidationsstufe des C (Gesamtheit aller

organischen Wasserinhaltsstoffe); Erfahrungswert ca. 3

667048

32

4

2 ,

C

O

TOC

CSB

Quelle: G. Gruber, Schriftenreihe zur Wasserwirtschaft, TU Graz,

1999.


Parameter Rohwasser Gereinigtes

Abwasser

CSB 200 - 600 25 - 75

BSB5 100 - 300 5 - 20

TOC 75 - 150 5 - 25

Typische Zu- und Ablaufkonzentrationen von Kläranlagen in mg/L

Quelle: G. Gruber: Der biologisch abbaubare Kohlenstoffgehalt in der Abwassertechnik – BTOC und BDOC als Alternative zum BSB. Schriftenreihe

zur Wasserwirtschaft, TU Graz, 1999.


LC-OCD (Liquid Chromatography – Organic Carbon Detection)

-weitere Aufschlüsselung des DOC:

Bild-Quelle: DOC-Labor Dr. Huber


LC/OCD

Anlagenbedingungen (LC/DOC)

Eluent Phosphat-Puffer: 28 mmol/l; pH 6,6

(1,25 g/l Na2HPO42H2O und 2,5 g/l KH2PO4)

Flußrate 1,0 ml/min (isokratisch)

Injektionsvolumen

Bestimmungsgrenze

2 ml (Chromatographie) und 0,2 ml (Säulenbypaß)

20 µg/l DOC (2 ml Injektionsvolumen)

Meßwert-

aufnahme

DOC-

Detektion

Probenaufgabe(automatisiert)

UV-

Detektion

Gelchromatographie

Kühlmantel

Kolbenpumpe

Eluent

S. A. Huber, F. H. Frimmel, Fres. J. Anal. Chem. 1992


LC/OCD



Fraktion 1 (Huminstoffe)

Fraktion der Huminstoffe – Fulvinsäuren

Fraktion 2 („Building Blocks“)

Huminstoff-Grundeinheiten (Vorläufer bzw. Abbauprodukte von Huminstoffen)

Fraktion 3 (Niedermolekulare Säuren)

niedermolekularen Säuren, Ketone oder Aldehyde

Fraktion 4 (Amphiphile Substanzen)

schwach hydrophobe bzw. amphiphile Stoffe; tensidisch wirkende, z.T. N-haltige

Verbindungen, wie z.B. Proteine, Peptide, Aminozucker

Fraktion 5 (Polysaccharide/Proteine)

hydrophiles, hochmolekulares Material, das mit dem Trenngel keine Wechselwirkungen

eingeht (gesättigte Strukturen, z. B. Polysaccharide und Proteine)

Fraktion 6 - Hydrophobe organische Stoffe (HOC)

stark hydrophobe Fraktion, wird nicht chromatographiert

LC/OCD


LC/OCD



Bestimmung der Absorption im Bereich der UV-Strahlung,

Spektraler Absorptionskoeffizient (DIN 38404-3)

- Spektrale Absorptionskoeffizient - relativ einfach und schnell bestimmbar

- Messung bei 254 nm: summarischen Erfassung von Verbindungen mit

chromophore Gruppen - Mehrfachbindungen oder π-Elektronensysteme (z. B.

Huminstoffe, Ligninverbindungen)

- Messung im sichtbaren Bereich (z. B. bei 436 nm) – Erfassung gefärbter

Wasserinhaltsstoffe (Huminstoffe oder Eisen- und Manganverbindungen)

- Angabe: auf Schichtdicke bezogen (Einheit zumeist m-1)

- für bestimmtes Gewässer - oftmals gute Korrelation zwischen SAK254 und DOC

- SSAK – Spezifische Absorptionskoeffient (Verhältnis SAK254/DOC); dient zur

weitergehenden Charakterisierung des DOC, Maß für die „Aromatizität“

C C C C C O C S C NN N

N O


λEmission λAnregung

Intensität

2D/3D-Fluoreszenzmessungen zur DOC-Charakterisierung

• Anregung Wasserprobe (filtriert) im Bereich 200 bis 700 nm

• Erhaltung einer Exzitations-Emissions-Matrix (EEM) durch Variation von λEx

• Zuordnung typischer Gruppen wie Humin-/Fulvinsäuren, Pigmente, Proteine

• Fraktionierung DOC nach chemischer Struktur (LC-OCD primär nach Größe)

• Probleme Quantifizierung: Streu-, Innerfilter-, Quenchingeffekte

• Lösungsansätze: automatische Spektrenfilter, mathematische Korrekturverfahren

Quelle: W. Schmidt, TZW Dresden


Chl A Chlorophyll A

PC Phycocyanin

PE Phycoerythrin

FC Fucoxanthin

Tyr Tyrosine

Trp Tryptophane

Phe Phenylalanine

EPS extracellular

polymeric

substances

FS fulvic acid

like

HS humic acid

like

Q-o Quinone (oxidized)

Q-s Semiquinone

Q-h Hydroquinone

HS/FSHS/FS

Chl a

Chl a

Chl a

PC

PE

Tyr

Tyr

Trp

Trp

EPS

EPS

Q-oQ-o

Q-s

Q-s

Q-s

Q-s/h

Q-s/hHS/FS

FC

FC

Biopolymers

Humic substances

Algae pigments

Phe

Quelle: W. Schmidt, TZW Dresden

2D/3D-Fluoreszenzmessungen zur DOC-Charakterisierung



Summenbestimmungsmethoden für organische Halogenverbindungen

beruhen auf drei grundlegenden Verfahrensschritten:

1. einer Anreicherung

2. der Überführung des organisch gebundenen Halogens in

Halogenide (Gasphase: Halogenwasserstoffe)

3. der quantitativen Bestimmung der Halogenidionen

Organische Halogenverbindungen



Unterscheidung der summarischen Bestimmungsverfahren

nach physikalischen Grundprinzipien

Probe

F/S-Trennung F/F-Trennung F/G-Trennung

Adsorption Extraktion Austreibung

AOX EOX POX



Methoden zur summarischen Bestimmung von Organohalogenverbindungen

Organohalogenverbindungenflüchtig, extrahierbar, adsorbierbar in Abwasser,

Oberflächenwasser und Trinkwasser

POX

Strippen

Austreiben bei 80 °C

mit Intertgas

EOX

Ausschütteln mit

einem

Extraktionsmittel

AOX

Adsorbieren an

Gemahlener

Aktivkohle

Desorption/Teil-

mineralisierung durch

Erhitzen im Rohrofen

Mineralisierung

Halogenidbestimmung



Organische Halogenverbindungen:

Summarische Erfassung mit der AOX-Methode

EN 1485 (DIN 38409 H14/H8)

Prinzip Durchführung

Probenahme:

- Glasgefäße, luftblasenfrei füllen

- pH-Einstellung mit HNO3 auf pH ~ 2

- Untersuchung möglichst rasch

- Lagerung dunkel, kühl

Anreicherung/Adsorption an Aktivkohle:

- 2 Methoden:

Schüttelmethode

(Batch-Verfahren)

Säulenmethode

(dynamisches Verfahren)





allgemeine Randbedingungen:

- Gehalt weiterer adsorbierbarer, nicht halogenierter Komponenten

- Gehalt anorganischer Halogenide (Chlorid)

- Meerwasseranalytik – SPE vorschalten

- Kontaktzeit Wasserprobe mit A-Kohle

- Qualität der Aktivkohle

Schüttelmethode:

- 100 mL Probe 1 Stunde mit 50 mg A-Kohle schütteln

- Zusatz von NaNO3/HNO3 (Auswaschen anorganischer Halogenide)

- Filtration über chloridfreie Polycarbonatmembranfilter

- Waschen des Filterkuchens mit NaNO3/HNO3-Lösung

- Filterkuchen + Filter zur Verbrennung

Vorteile:

- preiswert

- Analyse schwebstoffhaltiger Proben



AOX [µg/L]

A

Messbereich

größeres

Volumen

B

C

durch Verdünnung

erweiterter

Anwendungsbereich D

durch Mehrfach-

adsorption erweiterter

Anwendungsbereich

E

ausgeschlossener

Konzentrationsbereich

10 0001000100101

1

10

100

250

1000

10 000

DOC [mg/L]

Anwendungsbereiche für die AOX – Methode





Säulenmethode:

- zwei hintereinandergeschaltete Säulen Aktivkohle

(je 40 mg, dazwischen Keramikwolle)

- Probe (50 bis 100 mL) wird mit 3 mL/min über Säulen gepumpt,

anschließendes Spülen mit NaNO3/HNO3

- i. a. jede Säule einzeln verbrennen

Vorteile:

- geringere Blindwerte

- vollständigere Erfassung

- Kontrollmöglichkeiten





Verbrennung:

- Verbrennung von Filterrückstand + Filter (Schüttelmethode) bzw.

Säuleninhalt + Keramikwolle (Säulenmethode) im Quarzrohr bei

950 °C und Sauerstoffzufuhr

- Mineralisierung zu HCl, HBr und HI (ferner CO2, H2O …)

- Verbrennungsgase über Adsorber (konz. H2SO4)

Detektion:

- quantitative Erfassung der gebildeten Halogenkohlenwasserstoffe

mit verschiedenen Verfahren möglich, vorrangig Microcoulometrie

- Ausnutzung 1. FARADAYsches Gesetz: m = K · Q

(Stoffumsatz proportional Ladungsmenge)

- Voraussetzung: 100 %iger Stoffumsatz

- Berechnung Ladung aus Stromstärke und Elektrolysezeit

- coulometrische Titration: bei konstantem Strom wird Titrant erzeugt

(Ag+), der mit Analyt (Halogenid) reagiert





Detektion:

I. anodische Reagenzerzeugung Ag Ag+ + e-

II. chemische Fällungstitration Ag+ + X- AgX

Getrennte Erfassung von chlor-, brom- und iodorganischen Verbindungen:

- Ionenchromatographie, spezielle Methodik

- AOI (bedeutsam zur summarischen Erfassung von Röntgenkontrastmitteln)



Mineralisierungsgase

Pt-Katode

Ag-Anode

Ag/Hg2SO4



Vergleich von EOX und AOX für unterschiedliche Wässer

nach SCHNITZLER, M. et al.

Probe EOX

[µg/L]

AOX

[µg/L]

EOX/AOX

[%]

Rhein, Maxau

Main

Rhein, Düsseldorf

Wolfegger Aach

Abwasser A

Abwasser B

Abwasser C

34

51

30

50

490

740

1630

60

435

199

626

3425

3355

9685

57

12

15

8

14

22

17



AOF:

- ähnlich AOX, Schüttelmethode: bessere Ergebnisse

- Detektion nach Absorption in Citrat-Pufferlösung mit

ionenselektiver Elektrode

- Verschleiß Quarzrohr, Glasgeräte durch Bildung HF

(glasaggressiv)

AOS:

• Prinzip:

- ähnlich AOX, Adsorption an A-Kohle

- Entfernung anorganischer S-Komponenten (SO42-)

- Verbrennung: Entstehung SO2

- Entfernung gebildeter Halogenide (Ag-Wolle)

- Einleitung in microcoulometrische Titrationszelle

- Anwesenheit von Chlorat und Ag+

- SO2 reduziert Chlorat zu Chlorid: Quantifizierung

coulorimetrisch



AOS:

• Probleme:

- Schwefelarme A-Kohle (Preis, zusätzliche

Vorbehandlung)

- Bildung Schwefeltrioxid (muss unterbunden werden,

da nicht coulorimetrisch erfassbar)

SO2 + ½ O2 SO3

- hohe Temperatur, geringer O2-Partialdruck,

Anwesenheit eines Katalysators

- Nachweisgrenzen: ca. 2 µg Schwefel absolut,

Analysenzeit: 10 – 15 min



TN – Gesamtstickstoff

insgesamt 5 Parameter:

Gesamtstickstoff

Organisch gebundener

Stickstoff

Anorganische

Stickstoffverbindungen

- Nitrat

- Nitrit

- Ammonium

(KJELDAHL)

KJELDAHL:

- klassisches Verfahren

- Aufschluss organischer N-Verbindungen (Ox.-zahl: -3) mit

konz. Schwefelsäure (+ Katalysator)

- in Lauge: Bildung Ammoniak, destillative Abtrennung

- aufwendig, problematisch: z. B. Heterocyclen, hohe

Nitrit-/Nitratgehalte



Gesamtstickstoff

• Prinzip:

- Oxidation Wasserprobe bei hohen Temperaturen

- Bildung Stickstoffmonoxid, Trocknung Gasstrom

- Reaktion NO mit Ozon: Bildung angeregtes NO2*

- Desaktivierung unter Lichtabspaltung (= Chemo-

lumineszenz)

- Erfassung durch Photomultipler; quantitativ messbar

- Nachweisgrenzen: 0,5 – 1 mg/L, z. T. darunter

- Analysenzeit: ca. 5 min

- Probleme: hohe Salzfracht, z. T. Verschleppung



Schema der Gesamtstickstoffbestimmung durch Chemolumineszenz

O2

Probe

Pyrolyse

Trockner

Reaktor

Gasreiniger

Abluft

Ozonator

Photo-

multiplerElektrometer

Integrator

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Organische Wasserinhaltsstoffe · Arbeitsweise HPLC isokratisch die Eigenschaften der mobilen Phase...

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