Pathomorphologische Phänotypisierung und ... · Organ, im Schnitt 85% für ein Jahr, 65% für 5...

Aus dem Institut für Pathologie

der Medizinischen Hochschule Hannover

dem

Institut für Pathologie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

dem Forschungsbereich Biotechnologie

des Instituts für Tierzucht und Tierverhalten (FAL) Mariensee

Pathomorphologische Phänotypisierung und Expressionsanalyse von hCD59-transgenen Schweinen für Xenotransplantationen

PhD-THESE

Zur Erlangung des Grades eines

DOCTOR OF PHILOSOPHY

(PhD)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Stefanie Deppenmeier aus Lügde

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung:

1. Gutachter: Prof. Dr. H. H. Kreipe

Prof. Dr. A. D. Gruber, Ph.D

2. Gutachter: Prof. Dr. H. Niemann

3. Gutachter: Prof. Dr. E. Töpfer-Petersen

Externer Gutachter: Prof. Dr. H.-J. Hedrich

Tag der mündlichen Prüfung: 01.06.2005

In Liebe und Dankbarkeit

meiner Familie gewidmet

Vorab öffentlich präsentierte Teilergebnisse dieser Arbeit:

S. DEPPENMEIER, O. BOCK, M. MENGEL, A. D. GRUBER, H. H. KREIPE (2004):

Pathomorphologic and expression pattern analysis of human CD59-transgenic pigs

designed for xenotransplantation.

Abstract Proceedings of the 22nd Meeting of the European Society of Veterinary

Pathology, 15.-18. September, Olsztyn, Polen, S. 72

S. DEPPENMEIER, O. BOCK, M. MENGEL, H. NIEMANN, W. KUES, E. LEMME, D.

WIRTH, K. WONIGEIT, H.H. KREIPE (2005):

Health Status of transgenic pigs expressing the human complement regulatory

protein CD59

Transgenic Research, submitted

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Einleitung 2 2.1.1 Allotransplantation 2

2.1.2 Xenotransplantation – erste Versuche 2

2.1.3 Schweine als Organspender 3

2.2 Probleme und Risiken 4 2.2.1 Zoonosen 4

2.2.2 Transplantatabstoßung 6

2.2.3 Hyperakute Abstoßung 6

2.2.4 Akute Abstoßung 8

2.2.5 Chronische Abstoßung 9

2.3 Herstellung transgener Tiere 10 2.4 Lösungsansätze für die Transplantatabstoßung 11 2.4.1 Hemmung oder Ausschaltung des Gal-Epitops 11

2.4.2 Hemmung der xenoreaktiven Antikörper 13

2.4.3 Akkommodation und Toleranz 13

2.4.4 Hemmung der Komplementkaskade 14

2.4.5 Komplementregulatoren 15

2.5 CD59 und hCD59-transgene Tiere 18 2.5.1 CD59 im Menschen (hCD59) 18

2.5.2 CD59 im Schwein (pCD59) 19

2.5.3 CD59 bei anderen Tierarten 20

2.5.4 hCD59-transgene Tiere 20

2.6 Charakterisierung der Expression in transgenen Schweinen 21 2.6.1 Expression des hCD59-Transgens 22

2.6.2 Expression von mehreren Transgenen 24

2.6.3 Weitere Transplantationsversuche 26

2.7 Morphologische Phänotypen transgener Tiere 28 2.7.1 Ektopische Expression 29

2.7.2 Large Offspring Syndrome (LOS) 29

2.7.3 Kardiopulmonale und plazentale Phänotypen 30

2.7.4 Muskel- und Skelett-Phänotypen 31

2.7.5 Sonstige Phänotypen 31

2.8 Genkonstrukt 32 3 Ziel der Studie 34 4 Eigene Ergebnisse: Pathomorphologische Charakterisierung 35 4.1 Hintergrund und Bedeutung 35 4.2 Experimentelles Design 35 4.2.1 Material 35

4.2.2 Pathologisch-anatomische und histopathologische Beurteilung 38

4.2.3 Virologische Untersuchung 38

4.3 Ergebnisse und Interpretation 39 4.3.1 Virologische Untersuchung 39

4.3.2 Pathomorphologische Untersuchung 39

5 Eigene Ergebnisse: hCD59 - Proteinexpression 46 5.1 Hintergrund und Bedeutung 46 5.2 Experimentelles Design 46 5.2.1 Material 46

5.2.2 Herstellung der Multiblöcke 47

5.2.3 Durchführung der immunhistochemischen Färbung 47

5.2.4 Auswertung 49

5.3 Ergebnisse und Interpretation 49 5.3.1 hCD59-Proteinexpression 49

6 Eigene Ergebnisse: hCD59 - mRNA-Expression 57 6.1 Hintergrund und Bedeutung 57 6.2 Experimentelles Design 57 6.2.1 Material 57

6.2.2 Durchführung der RNA-Isolierung 58

6.2.3 Durchführung der cDNA-Synthese 59

6.2.4 Auswahl der Primer 60

6.2.5 Durchführung der Reversen Transkriptase – PCR 60

6.2.6 Auswertung 62

6.3 Ergebnisse und Interpretation 62 6.3.1 EF1α – mRNA – Expression 62

6.3.2 hCD59 – mRNA – Expression 63

6.3.3 Vergleich hCD59 – Protein und mRNA – Expression 67

7 Eigene Ergebnisse: hCD59 – DNA – Detektion 69

7.1 Hintergrund und Bedeutung 69 7.2 Experimentelles Design 69 7.2.1 Material 69

7.2.2 Durchführung der DNA – Isolierung 70

7.2.3 Auswahl der Primer 71

7.2.4 Durchführung der PCR 72

7.2.5 Auswertung 73

7.3 Ergebnisse und Interpretation 74 7.3.1 TNF – Expression 74

7.3.2 hCD59 – DNA – Expression 74

7.3.3 Vergleich hCD59 – Protein, mRNA und DNA 75

8 Diskussion 77 9 Zusammenfassung 91 10 Summary 93

11 Literaturverzeichnis 95 12 Anhang 123 13 Eidesstattliche Erklärung 127 14 Danksagung 129

Verzeichnis der in Text und Bild verwendeten Abkürzungen Abb. Abbildung

AVR Acute Vascular Rejection (Akute Abstoßung)

BALT Bronchus-assoziiertes lymphatisches Gewebe

bp Basenpaare

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CMV Cytomegalovirus

CVF Cobra Venom Factor

DAF Decay-accelerating Factor

DIC Disseminierte Intravasale Koagulopathie

DNA Desoxyribonukleinsäure

DXR Delayed Xenograft Rejection (Akute Abstoßung)

EF1α Elongation Factor 1α

EGFP Enhanced Green Flourescent Protein

Gal Galactose α1-3Galactose

HAR Hyperacute Rejection (Hyperakute Abstoßung)

HE Hämatoxylin-Eosin

HT H-Transferase / α 1-2 Fucosyltransferase

H2Kb murines MHC Klasse 1 Gen

ICAM-2 interzelluläres Adhäsionsmolekül-2

IRES Internal Ribosome Entry Side

KO nicht transgenes Kontrolltier

LCR Locus Control Region

Ln./Lnn. Lymphknoten (Singular/Plural)

LOS Large Offspring Syndrome

MAC Membrane attack complex

männl. männlich

MCP Membrane Cofactor Protein

MHC Major Histocompatibility Complex

MIEP Major Immediate-Early Promoter

mRNA messenger Ribonukleinsäure

NTA Transaktivator

PAA Polyacrylamid

PCR Polymerase Kettenreaktion

PCV II Porzines Circovirus Typ II

PDNS Porzines Dermatitis und Nephropathie Syndrom

PERV Porzine Endogene Retroviren

PNP Proliferative und Nekrotisierende Pneumonie

PNH Paroxysmale Nächtliche Hämoglobinurie

PMWS Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PRRSV Porzines respiratorisches und reproduktives Syndrom-Virus

RNA Ribonukleinsäure

RT-PCR Reverse Transkriptase - Polymerase Kettenreaktion

sCR1 löslicher Komplementrezeptor Typ 1

SPF spezifiziert pathogenfrei

Tab. Tabelle

TG transgenes Tier

TNF Tumornekrosefaktor

weibl. weiblich

XNA Xenoreactive Natural Antibodies

1

1 Einleitung

Der Fortschritt auf dem Gebiet der Transplantationschirurgie in den letzten

Jahrzehnten und der erhöhte Bedarf nach Transplantaten, haben in den letzten

Jahren zu einem Mangel an Spenderorganen geführt. Der wachsende Bedarf an

geeigneten Transplantaten hat in jüngster Zeit verstärkt zu einer Diskussion über die

Nutzung von tierischen Xenotransplantaten zum Zweck der Transplantation in

menschliche Patienten geführt. Auf der Suche nach einer geeigneten Spezies rückte

aufgrund eines niedrigen Zoonose-Risikos, relativ hoher Reproduktionsraten, zu

humanen Organen vergleichbarer Organgrößen und relativ geringer ethischer

Bedenken das Schwein in den Mittelpunkt der Diskussion.

Das größte Problem der Xenotransplantation stellt derzeit die hyperakute Abstoßung

der Transplantate dar, die innerhalb von Minuten zu einer Zerstörung des

Spenderorgans führt und im Wesentlichen auf der Komplementreaktion beruht. Um

das Problem der hyperakuten Abstoßung zu lösen, wurden transgene Schweine

erzeugt, die in ihrem Genom humane Komplementregulatoren tragen, um die

Komplementreaktion zu unterdrücken und damit die hyperakute Abstoßungsreaktion

zu unterbinden. Da die transgenen Schweine mangels besserer verfügbarer

Methoden über eine Mikroinjektion des Genkonstruktes, welches den humanen

Komplementregulator hCD59 beinhaltet, in den Vorkern einer befruchteten Zygote

erzeugt wurden, ist nicht sicher, ob das Genkonstrukt überhaupt in das porzine

Genom integriert wird und ob es zu einer Expression führt.

Ziel dieser Arbeit war es, zu klären, ob diese transgenen Schweine durch die

Insertion des humanen Genkonstruktes einen morphologisch manifesten Phänotyp

entwickeln und ob die Expression des Komplementregulators hCD59 auf DNA-

Ebene, mRNA-Ebene und Protein-Ebene in diversen Organen und Geweben erfolgt.

Diese Ergebnisse sollten einen wesentlichen Beitrag leisten zur Einschätzung der

Eignung von Organen dieser Tiere als Xenotransplantate für den Menschen.

2

2 Literaturübersicht

2.1 Einleitung 2.1.1 Allotransplantation Transplantationen zwischen Individuen der gleichen Spezies, also z.B. von Mensch

zu Mensch werden als Allotransplantationen bezeichnet. Auf diesem Gebiet sind in

den letzten Jahrzehnten beträchtliche Fortschritte gemacht worden. Von den

Patienten, die Allotransplantate erhalten, überleben, abhängig vom transplantierten

Organ, im Schnitt 85% für ein Jahr, 65% für 5 Jahre und 50% für 10 Jahre (COOPER

et al., 2002). Diese Erfolge führten zu einem erheblich gesteigerten Bedarf an

Spenderorganen. In den USA hat sich die Zahl der Menschen, die auf ein

Spenderorgan warten, im Zeitraum von 1990 bis 1999 von 21.914 auf 72.110

verdreifacht (UNITED NETWORK FOR ORGAN SHARING, 2000). In diesem

Zeitraum stieg die Zahl der Spenderorgane jedoch nur von 15.009 auf 21.175 an.

Während in den USA täglich 60 Patienten ein Spenderorgan erhalten, sterben täglich

17 Patienten, die auf der Warteliste für ein Spenderorgan stehen.

Dieses unausgeglichene Verhältnis zwischen dem Bedarf an Spenderorganen und

den zur Verfügung stehenden Organen hat in den letzten Jahren zu einer verstärkten

Suche nach einer alternativen Spenderorganquelle geführt.

2.1.2 Xenotransplantation – erste Versuche Die Xenotransplantation, also die Transplantation von Organen zwischen Individuen

verschiedener Spezies, stellt eine mögliche Alternative zur Allotransplantation dar.

Bereits im frühen 17. Jahrhundert wurden Bluttransfusionen von Tieren auf

Menschen durchgeführt (COOPER et al., 2002) und im 19. Jahrhundert wurden

diverse Organe, insbesondere Haut von Tieren, in Menschen transplantiert. Auch im

20. Jahrhundert wurden wiederholt Xenotransplantationen durchgeführt, doch bis auf

ein oder zwei Ausnahmen scheiterten all diese Versuche (TANIGUCHI und

COOPER, 1997). Die bemerkenswertesten Erfolge wiesen Reemtsma und seine

2 Literaturübersicht 3

Kollegen 1964 auf, die Schimpansennieren in Dialysepatienten transplantierten. Die

Überlebensraten der Empfänger lagen zwischen 11 Tagen und 2 Monaten. Ein

Patient überlebte sogar 9 Monate mit der Schimpansenniere und starb an einer

Elektrolytstörung, ohne dass die transplantierte Niere Anzeichen einer Abstoßung

aufwies (REEMTSMA et al., 1964). CZAPLIKI und BLONSKA transplantierten 1992

ein nicht-transgenes Schweineherz in einen Mann mit einer Herzinsuffizienz in Folge

eines Marfan-Syndroms, da sich der Zustand des Patienten akut verschlechterte.

Das Schweineherz arbeitete zunächst normal, doch nach knapp 24 Stunden verstarb

der Mann. Dabei zeigte das Herz keinerlei Abstoßungsreaktion, sondern erbrachte

lediglich nicht den nötigen Blutauswurf.

Insgesamt waren die Erfolge auf dem Feld der Xenotransplantation jedoch eher

bescheiden und fast alle Organe wurden von den Transplantatempfängern

abgestoßen.

2.1.3 Schweine als Organspender Wenn es um die Frage geht, welche Spezies sich für die Xenotransplantation eignen,

wird die Auswahl dadurch eingeschränkt, dass lediglich eine geringe Anzahl an

Tierarten die erforderlichen Organgrößen und die geeigneten anatomischen

Merkmale aufweisen. Weiterhin ist die Überlebenszeit der transplantierten Organe

umso kürzer, je größer die phylogenetische Distanz zwischen den beiden Spezies ist

(CHALINE et al., 1994). Aufgrund der Tatsache, dass nicht-menschliche Primaten,

insbesondere Altweltaffen, zoologisch den Menschen am nächsten stehen, wurden

sie zunächst als Organspender in Betracht gezogen. Es gibt jedoch eine Reihe von

Gründen, die gegen diese Primaten sprechen:

Zunächst einmal sind viele Primatenarten vom Aussterben bedroht und daher

geschützt. Eine gezielte Zucht von Primaten zum Zweck der Xenotransplantation

wäre auf Grund der langen Reproduktionsintervalle und der benötigten intensiven

Pflege teuer und aufwendig und wird zudem in der Bevölkerung häufig als unethisch

betrachtet. Ein weiterer, sehr wichtiger Grund ist, dass das Risiko der Übertragung

von Zoonosen, wie z.B. Hepatitis oder Herpes auf Grund der nahen

phylogenetischen Verwandschaft zu den Menschen sehr hoch ist. Zudem liegt die


Organgröße der meisten Affenarten unter der Organgröße von adulten,

menschlichen Organen, so dass fraglich ist, inwiefern eine vollständige Funktion

gewährleistet wäre (HAMMER et al., 1998).

Aus diesen Gründen wurde von den nicht-humanen Primaten als potentielle

Organspender wieder Abstand genommen und das Schwein rückte in den

Mittelpunkt. Die Organe von Schweinen und Menschen haben in etwa die gleiche

Größe und vergleichbare anatomische und physiologische Merkmale (HAMMER et

al., 1998). Die Zucht von Schweinen zum Zweck der Organspende wäre auf Grund

der recht kurzen Reproduktionsintervalle und der komplikationslosen Aufzucht

einfacher zu realisieren. Zudem werden Schweine als Organspender in der

Bevölkerung ethisch erheblich besser akzeptiert, da Schweine auch als

lebensmittelliefernde Tiere gezüchtet werden. Nicht zuletzt ist die Gefahr der

Übertragung von Zoonosen auf den Menschen bei Schweinen erheblich geringer,

wenn auch nicht gänzlich gebannt (HAMMER et al., 1998).

All diese Gründe sprechen für das Schwein als potentiellen Organspender.

Im Folgenden sollen die Probleme und Risiken der Xenotransplantation im

Allgemeinen und des Schweins als Organspender im Besonderen dargestellt

werden.

2.2 Probleme und Risiken 2.2.1 Zoonosen Auch wenn die Gefahr der Übertragung von Zoonosen auf den Menschen beim

Schwein geringer ist als bei nicht-humanen Primaten, gibt es dennoch eine Reihe

von Krankheitserregern, die eine Gefahr für den potentiellen Organempfänger

darstellen. Dies gilt insbesondere, wenn man in Betracht zieht, dass die

Organempfänger eine immunsuppressive Therapie erhalten und dadurch noch

anfälliger für Krankheitserreger jeglicher Art sind.

Bei den Zoonosen kommt den tierartspezifischen bakteriellen, mykotischen und

parasitären Infektionen eher eine untergeordnete Bedeutung zu. Hier läge das Risiko


am ehesten bei allgemeinen Infektionen im Rahmen einer Parasitose, einer

systemischen Mykose oder einer bakteriellen Sepsis mit relativ unspezifischen

Erregern wie z.B. Streptokokken oder Staphylokokken.

Das größte Risiko stellt eine Übertragung von viralen Erregern auf den Menschen

dar. Das Virus, das in den letzten Jahren am meisten für Aufsehen gesorgt hat, ist

das Porzine Endogene Retrovirus (PERV). Die Porzinen Endogenen Retroviren sind

für Schweine apathogene Viren, die in der porzinen DNA integriert sind und daher in

allen Schweinen nachweisbar sind. Die virale RNA wird in diversen

transplantationsrelevanten Organen, wie z.B. Herz, Lunge, Leber, Niere, Haut und

Pankreasinselzellen exprimiert (BLUSH et al., 2002). LANGFORD et al. zeigten 2001

eine Expression von PERV-RNA in allen untersuchten Organen von transgenen

Schweinen, wobei die Expressionslevel zwischen den einzelnen Organen sehr

differierten. Allerdings konnten sie keine Freisetzung von Virionen nachweisen.

Mittlerweile haben einige Arbeitsgruppen eine Infektion mit PERV von humanen

Zelllinien in vitro nachweisen können (LE TISSIER et al., 1997; WILSON et al., 1998;

MARTIN et al., 2000; SPECKE et al., 2001). Zudem entdeckten ERICSSON et al.

2003 humane Proteine, die als Rezeptoren für PERV funktionieren. NOD/SCID-

Mäuse (non-obese diabetic/ severe combined immunodeficiency), denen porzine

Pankreasinselzellen transplantiert wurden, zeigten eine Infektion mit PERV in

diversen Organen. OGLE et al. zeigten 2004 eine Fusion von Menschen- und

Schweinezellen nach einer Infusion von humanen hämatopoietischen Stammzellen

in Schweineuteri. Die Hybridzellen enthielten DNA von beiden Spezies und

exprimierten eine Mischung aus porzinen und humanen Proteinen. Die Hybridzellen

enthielten zudem PERV und waren auch in der Lage, PERV in einer Co-Kultur auf

rein humane Zellen zu übertragen. Diese Ergebnisse zeigen, dass PERV eine

ernstzunehmende Gefahr für Empfänger von Schweineorganen darstellen, wenn

auch eine Infektion von Menschen die porzine Gewebetransplantate, wie z.B.

Herzklappen erhalten haben, bislang nicht nachgewiesen werden konnte (HENEINE

et al., 1998; HERRING et al., 2001).

Aber auch andere virale Erreger, wie z.B. das porzine Hepatitis Virus E (YOO und

GIULIVI, 2000), das Porzine Cytomegalovirus (CLARK et al., 2003) oder die


Porzinen Circoviren Typ I und II (HATTERMANN et al., 2004) stellen mögliche

Zoonoserisiken dar.

Um die Infektionsgefahr so gering wie möglich zu halten, müssten die Schweine

strengen Kontrollen unterliegen und vor einer Organspende auf alle möglichen

Zoonoseerreger untersucht werden. In der gängigen Literatur existieren bereits

Vorschläge für Hygiene-Protokolle, die einer Xenotransplantation vorausgehen

sollten, um das Zoonoserisiko so gering wie möglich zu halten (ONIONS et al.,

2000).

2.2.2 Transplantatabstoßung Das größte Problem der Xenotransplantation ist die Transplantatabstoßung. Je nach

Dauer bis zur Abstoßung werden die Abstoßungsreaktionen als „hyperakute

Abstoßung“ (Hyperacute Rejection, HAR), „akute Abstoßung“ (Acute Vascular

Rejection, AVR / Delayed Xenograft Rejection, DXR) und „chronische Abstoßung“

bezeichnet.

Aufgrund der phylogenetischen Distanz zwischen Schweinen und Menschen wird

das porzine Transplantat vom Menschen hyperakut abgestoßen.

2.2.3 Hyperakute Abstoßung Die hyperakute Abstoßung (HAR) beschreibt die Abstoßung eines Spenderorgans

innerhalb von Minuten bis Stunden (COOPER et al., 1996).

Die hyperakute Abstoßung wird dadurch eingeleitet, dass präexistente, xenoreaktive

Antikörper an Epitope auf der Oberfläche des Spenderorgans binden. Das Epitop,

das in der Xenotransplantation die größte Rolle spielt, ist ein α-galactosyl-Epitop,

gegen das spezifische Antikörper gerichtet sind (GALILI et al., 1984). Genauer

handelt es sich bei diesem Epitop um den von der α 1-3-Galactosyltransferase

synthetisierten Zucker Galactose α 1-3Galactose, welcher spezifische anti-Gal-

Antikörper bindet. Das porzine α 1-3-Galactosyltransferase-Gen besteht aus

mindestens 10 Exons. 4 verschiedene Promotoren kontrollieren die Transkription des

Gens in porzinen Zellen (MERCIER et al., 2002). Die spezifischen anti-Gal-

Antikörper sind in Menschen und Altweltaffen in hohen Titern präexistent vorhanden,


da diese Spezies das Galactose α 1-3Galactose-Epitop nicht exprimieren (GALILI et

al., 1987). Neuweltaffen und andere Säuger exprimieren dagegen das Galactose α 1-

3Galactose-Epitop (GALILI et al., 1988). Somit bietet dieses Epitop auf dem Endothel

der Schweineorgane eine geeignete Angriffsstelle für die im Menschen präexistenten

anti-Gal-Antikörper. Der Grund für die kontinuierliche anti-Gal-Antikörperproduktion in

Menschen und Altweltaffen sind Gal α 1-3Gal-Epitope in Außenmembranen von

Bakterien, die im Intestinaltrakt von Menschen und Altweltaffen vorkommen und

damit einen ständigen Stimulus zur Antikörperproduktion darstellen (GALILI et al.,

1988). Die Theorie der Bindung von Anti-Gal-Antikörpern an das Gal α 1-3Gal-Epitop

konnte auch bereits in Transplantationsversuchen bewiesen werden (COLLINS et al.,

1995). Im Schwein wird das Gal α 1-3Gal-Epitop auf dem Gefäßendothel in allen

Organen exprimiert (DOR et al., 2004).

Bei den xenoreaktiven Antikörpern handelt es sich vorwiegend um IgM-Antikörper

(SANDRIN et al., 1993), die zu 80% spezifisch für die terminalen α-Galactose-

Determinanten sind (PARKER et al., 1994). Zudem gibt es eine kleine Subgruppe

von Antikörpern, die nicht gegen das Gal α 1-3Gal-Epitop gerichtet sind und daher

auch, wenn auch nur zu einem geringen Teil, zur hyperakuten Abstoßung beitragen

(ZHU, 2000).

Nachdem die xenoreaktiven IgM-Antikörper an die Gal α 1-3Gal-Epitope auf dem

Endothel gebunden haben, wird dadurch die Aktivierung der Komplementkaskade,

und zwar des klassischen Weges, eingeleitet. Nach Xenotransplantationsversuchen

konnten auf dem Endothel des Spenderorgans immunhistochemisch sowohl

Komponenten der Komplementkaskade als auch IgM nachgewiesen werden (PLATT

et al., 1991; DALMASSO et al., 1992). Weiterhin korrelierte die Lokalisation der Gal α

1-3Gal-Epitope mit der Lokalisation von IgM- und Membrane attack complex (MAC)-

Deposition (CHEN et al., 1999). Der MAC ist das Endprodukt der

Komplementkaskade und führt zu einer Endothelzellaktivierung und -schädigung und

einer anschließenden Thrombozytenaggregation mit einer Ausbildung von

Fibrinthromben und Infiltration von neutrophilen Granulozyten (PLATT et al., 1991).

Die Abstoßung des Spenderorgans erfolgt über eine Endothelzellschädigung und


Thrombosierung der Gefäße mit einer anschließenden ischämischen Infarzierung

des Organs (ROSE und COOPER, 2000).

Histopathologisch sind Spenderorgane, die hyperakut abgestoßen wurden,

gekennzeichnet durch massive interstitielle Blutungen und Ödeme sowie

Thrombosen mit einer konsekutiven Zerstörung des Parenchyms (ROSE et al., 1991;

SCHUURMAN et al., 2003).

2.2.4 Akute Abstoßung Nach Überwindung der hyperakuten Abstoßungsreaktion stellt die akute Abstoßung

die zweite und mittlerweile bedeutendste Hürde der Xenotransplantation dar. Die

akute Abstoßung wird in der Literatur mit den zwei Termini „Delayed Xenograft

Rejection“ (DXR) oder „Acute Vascular Rejection“ (AVR) bezeichnet (COOPER et al.,

1996). Diese Art der Abstoßung geschieht zumeist nach einigen Tagen bis Wochen.

Die akute Abstoßung stellt eine humorale Immunantwort dar, bei der vor allem IgM-

und IgG-Antikörper gegen das Gal-Epitop eine große Rolle spielen (LIN et al., 1998).

Im Fall der akuten Abstoßung handelt es sich dabei jedoch nicht um präexistente,

xenoreaktive Antikörper, sondern um induzierte Antikörper, die wiederum zur

Aktivierung der klassischen Komplementkaskade führen (LOSS et al., 2000). Es

kommt zu einer Aktivierung der Endothelzellen mit einer verstärkten Expression von

Adhäsionsmolekülen und Produktion von Cytokinen. Monozyten und natürliche

Killerzellen infiltrieren das Spenderorgan und es kommt zu einer

Entzündungsreaktion und Thrombose (BACH et al., 1996). ASHTON-CHESS et al.

konnten 2003 zusätzlich zu der humoralen Immunantwort eine zelluläre Reaktion

nachweisen, indem sie in abgestoßenen Xenotransplantaten Monozyten und

Makrophagen sowie CD8+ und CD4+ T-Lymphozyten nachwiesen. Zudem wurden

Interleukin 1α, Tumor-Nekrosefaktor α, Interferon γ und Granzym B nachgewiesen.

IERINO et al. zeigten 1998, dass systemische Koagulationsstörungen zu einer

disseminierten intravaskulären Gerinnung (DIC) in dem Spenderorgan führen. Dabei

kommt es zunächst zu einer Zerstörung von Kapillaren und Ausbildung einer so

genannten thrombotischen Mikroangiopathie (SHIMIZU et al., 2000). Insgesamt stellt

die akute Transplantatabstoßung ein multifaktorielles Geschehen dar, bei dem


natürliche Killerzellen, Monozyten, Thrombozyten und die Aktivierung des

Gerinnungssystems eine Rolle spielen.

Histologisch ist die akute Abtoßung gekennzeichnet durch großflächige

Parenchymnekrosen und Infarkte mit einzelnen Blutungen sowie durch massive

intravaskuläre Fibrinthromben. Sowohl die Infarkte als auch die Fibrinthromben

zeigen dabei verschiedene Organisationsstadien, was für eine langsame Entwicklung

der Abstoßung spricht (GODDARD et al., 2002). Etwa 24 Stunden nach der

Reperfusion des Organs sind erste Veränderungen in Form von Fibrindepositionen,

fibrinösen Mikrothromben und eine Verdickung des Endothels zu beobachten. Als

nächstes kommt es zu fokalen Ischämien, die häufig mit einer Infiltration von

Entzündungszellen in Gefäßwände und in das Interstitium assoziiert sind. In den

darauf folgenden Tagen entwickeln sich aus den Ischämien großflächige Nekrosen

mit Entzündungszellinfiltraten (PLATT et al., 1998).

2.2.5 Chronische Abstoßung Die chronische Abstoßung bezeichnet die Abstoßung des Spenderorgans nach

Wochen, Monaten oder Jahren. In der Xenotransplantation spielt sie bislang keine

große Rolle, da das Problem der akuten Abstoßung noch nicht überwunden ist, und

wird daher lediglich bei Knorpeltransplantaten beobachtet. Auch bei der chronischen

Abstoßung spielt das Gal-Epitop eine entscheidende Rolle. Das Epitop stimuliert B-

Lymphozyten zur Produktion von anti-Gal-IgG, die an die Xenotransplantat-Zellen

binden (GALILI et al., 1997) und zu einer zellulären Immunantwort von T-

Lymphozyten und Makrophagen führen (STONE et al., 1998). Nach der Entfernung

der Gal-Epitope aus den Knorpeltransplantaten wurden zwar keine anti-Gal-

Antikörper mehr gebildet, dafür kam es jedoch zur Produktion von Antikörpern, die

spezifisch gegen den porzinen Knorpel gerichtet waren. Diese Antikörper führten

jedoch im Vergleich zu den anti-Gal-Antikörpern zu einer geringeren

Entzündungsreaktion (STONE et al., 1998).


2.3 Herstellung transgener Tiere

Die Biotechnologie bietet vermehrt Möglichkeiten, um Organe und Gewebe von

Tieren gezielt und effektiv für den Menschen zu nutzen. Dabei kommen

verschiedene biotechnologische Techniken, wie z.B. das Klonen oder die Insertion

fremder Gene, zum Einsatz.

Während die gezielte Manipulation des Erbgutes durch homologe Rekombination

und das Klonen bei Mäusen seit Jahren etabliert ist, ist diese Technik bei den großen

Haussäugetieren wie Rindern oder Schweinen schwierig durchzuführen, da die

Nutzung embryonaler Stammzellen bei diesen Spezies nicht vollständig etabliert ist

(CAPECCHI, 2000).

Um die Abstoßung der Schweineorgane in der Xenotransplantation zu verhindern,

werden Schweine generiert, die menschliche Gensequenzen enthalten, die eine

Abstoßung hemmen sollen. Wird speziesfremde DNA in ein Genom eingefügt, so

spricht man von der Herstellung transgener Individuen. Die Herstellung von

transgenen Tieren erfolgte bislang über eine Mikroinjektion der fremden DNA in den

Vorkern einer befruchteten Zygote. Die Ausbeute bei diesem Verfahren ist sehr

gering, die Integration der fremden DNA-Sequenz in das Genom geschieht rein

zufällig, und das Expressionsmuster für das fremde Protein ist sehr variabel

(NIEMANN und KUES 2000).

Die Nutzung von Klonen oder der homologen Rekombination könnte die Effektivität

der Genmanipulation in Haussäugetieren erheblich verbessern. Doch auch wenn

Schweine (ONISHI et al., 2000) und andere Haussäuger (CAMPBELL et al., 1996;

CIBELLI et al., 1998) bereits erfolgreich geklont wurden, wird diese Technik noch

nicht routinemäßig eingesetzt. Insgesamt ist die reproduktive Biotechnologie beim

Schwein auch noch nicht so weit fortgeschritten wie bei Rindern oder Schafen

(NIEMANN und RATH, 2001).

Zusätzlich zu der Herstellung transgener Schweine durch Mikroinjektion ist es in den

letzten Jahren durch eine Kombination von homologer Rekombination und Klonen

gelungen, Tiere zu produzieren, bei denen das Hauptepitop der hyperakuten

Abstoßung ausgeknockt ist (LAI et al., 2002; RAMSOONDAR et al., 2003).


Die Herstellung von Knockout-Tieren könnte in Kombination mit dem Einfügen

transgener Gene in den nächsten Jahren zu einem großen Fortschritt auf dem

Gebiet der Xenotransplantation führen. Dabei wird vor allem die Fähigkeit, porzine

Gene spezifisch zu modifizieren, im Vordergrund stehen (PIEDRAHITA und MIR,

2004).

2.4 Lösungsansätze für die Transplantatabstoßung

Um die Abstoßung der Transplantate zu verhindern, wurden bislang verschiedenste

Methoden angewandt. Hier soll ein kurzer Überblick über dese Methoden gegeben

werden. Da die hyperakute Abstoßung in der Xenotransplantation zunächst das

größte Problem darstellt, zielen die Lösungsansätze zunächst auf die Überwindung

dieser Art der Abstoßung.

2.4.1 Hemmung oder Ausschaltung des Gal-Epitops Da das Gal-Epitop den initialen Angriffspunkt der xenoreaktiven Antikörper darstellt,

zielen viele Methoden darauf ab, dieses Epitop zu hemmen oder auszuschalten.

Eine Methode zu diesem Zweck ist die Infusion von synthetischen Oligosacchariden,

wie z.B. Galα1-3Galβ1-4GlcNAc oder Melibiose (GALILI et al., 1996). Die

synthetischen Oligosaccharide sollen die gegen das Gal-Epitop gerichteten

Antikörper binden und damit eine Bindung an das Endothel des Spenderorgans

verhindern. In Transplantationsversuchen konnte gezeigt werden, dass die

intravenöse Infusion von Galα1-3Gal Oligosacchariden eine hyperakute Abstoßung

verhindert (SIMON et al., 1998).

Ein weiter Ansatz ist der Verdau des terminalen α-Galactosylrests mit Hilfe eines

Enzyms (Glycosidase). Dadurch können die Antikörper das Epitop nicht mehr

erkennen und es kommt zu einer massiv reduzierten Bindung von XNAs

(LAVECCHIO et al., 1995; WATIER et al., 1996).

Ein weiterer Ansatz ist der Ersatz des Gal-Epitops durch das sogenannte H-Antigen,

welches durch α1-2Fucosyltransferase (H-Transferase/HT) synthetisiert wird. Die


Galactosyltransferase, die das Gal-Antigen synthetisiert, und die Fucosyltransferase

konkurrieren um die gleichen Substrate. Tiere, die transgen für die

Fucosyltransferase sind, produzieren daher weniger Gal-Epitope (SHARMA et al.,

1996).

Auch eine Herstellung von Mäusen und Schweinezellen, die transgen für α1-

2Fucosyltransferase und für α-Galactosidase waren, zeigte eine massiv reduzierte

Antikörperbindung (OSMAN et al., 1997). Dabei konkurriert die Fucosyltranferase mit

der Galactosyltransferase um Substrate, während die α-Galactosidase den

terminalen Galactosylrest des Gal-Epiops spaltet.

In den letzten Jahren wurde durch Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie

auch die Herstellung von Schweinen, bei denen das Gal-Epitop ausgeknockt ist,

möglich. Da bei Mäusen schon länger die Möglichkeit der homologen Rekombination

besteht, gelang es TEARLE et al. bereits 1996, eine α-1-3-Galactosyltransferase

knockout Maus zu erzeugen, die durch das fehlende Enzym das Gal-Epitop nicht

mehr exprimieren konnte. 2002 berichteten LAI et al. zum ersten Mal über die

Herstellung eines Schweins, bei dem ein Allel der α-1-3-Galactosyltransferase

ausgeknockt war. Auch die Arbeitsgruppe von DAI et al. generierte 2002 fünf Ferkel,

die nur ein Allel der α-1-3-Galactosyltransferase besaßen. 2003 wurden von

PHELPS et al. vier Schweine mit einem α-1-3-Galactosyltransferase Doppelknockout

produziert.

2003 gelang RAMSOONDAR et al. zudem das Klonen eines Ferkels, bei dem ein

Allel der α-1-3-Galactosyltransferase ausgeknockt ist und zusätzlich noch α-1-

2Fucosyltransferase synthetisiert wird.

Durch weitere Zucht mit den existierenden Gal-knockout-Tieren sollen in den

nächsten Jahren Linien mit Schweinen entstehen, die das Gal-Epitop nicht mehr

exprimieren. Expressionsanalysen und Transplantationsversuche müssen dann

klären, wie effektiv dieser Genotyp die Abstoßung von Xenotransplantaten hemmt.


2.4.2 Hemmung der xenoreaktiven Antikörper Ein anderer Ansatz zur Überwindung der hyperakuten Abstoßung ist die Hemmung

der präexistenten, xenoreaktiven Antikörper (XNAs).

Besonders in den ersten Jahren der Xenotransplantation wurde eine Hemmung der

XNAs durch eine Perfusion von diversen Schweineorganen mit dem Blut der

Empfänger erreicht. Dabei verblieben die Antikörper auf dem Endothel der

perfundierten Organe und im Blut der Empfänger wurde so eine Reduzierung der

XNAs erreicht (FISCHEL et al., 1990).

Eine mittlerweile häufiger verwendete Methode zu diesem Zweck ist die

Immunadsorption von Antikörpern mittels einer spezifischen Galα1-3Gal-

Immunaffinitätssäule (TANIGUCHI et al., 1996; XU et al., 1998). Diese Methode

führte auch ohne Immunsuppression der Empfänger zur Überwindung der

hyperakuten Abstoßung (MANEZ et al., 2000). Jedoch erreichten die Antikörper nach

einigen Tagen wieder ihre Ausgangswerte und führten so zu einer akuten

Abstoßung.

Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Produktion der anti-Gal-Antikörper

unspezifisch zu verhindern. Dies geschieht zumeist durch eine

Ganzkörperbestrahlung, Knochenmarkbestrahlung, Splenektomie oder durch eine

medikamentelle Immunsuppression (ALWAYN et al., 1999).

Mit all diesen Methoden konnte bisher zwar eine hyperakute, nicht jedoch eine akute

Abstoßungsreaktion verhindert werden. In den meisten Fällen werden diese

Methoden lediglich begleitend in Kombination mit anderen Verfahren eingesetzt.

2.4.3 Akkommodation und Toleranz In der Humanmedizin kommt es im Fall einer Blutgruppenunverträglichkeit zwischen

Organspender und Empfänger ebenfalls zu einer hyperakuten Abstoßung. Nach

einer Depletion der anti-AB0-Antikörper vor der Transplantation kam es zwar nach

der Organtransplantation wieder zu einem Anstieg dieser Antikörper im Blut, das

Organ wurde jedoch auf Grund einer sehr schwachen Immunantwort trotzdem nicht

abgestoßen. Dieses Phänomen wird als „Akkommodation“ bezeichnet (BACH et al.,

1991).


Dieses Phänomen wird in der Xenotransplantation genutzt, indem nicht nur eine

Depletion der XNAs (z.B. durch Betrahlung und Organperfusion) vor der

Transplantation durchgeführt wird, sondern zusätzlich noch Knochenmarkzellen des

Spenders in den Empfänger infundiert werden. Durch diese Methode entsteht ein

lymphohämatopoetischer, so genannter gemischter, xenogener Chimärismus in dem

Empfänger (AKSENTIJEVICH et al., 1992). Dieser Chimärismus führt zur Toleranz

der Xenotransplantate durch Entwicklung einer T-Zell-Toleranz. SABLINSKI et al.

zeigten 1997, dass durch eine solche Knochemarkinfusion und Elimination von XNAs

die hyperakute Abstoßung verhindern kann. Obwohl die hyperakute Abstoßung

verhindert werden kann, erreichen die XNA-Level bereits nach wenigen Tagen

wieder ihre Ausgangswerte (KOZLOWSKI et al., 1999) und auch der

lymphohämatopoetische Chimärismus ist nicht stabil und nach einigen Tagen nicht

mehr nachweisbar (TANAKA et al., 1994), so dass die Xenotransplantate schließlich

akut abgestoßen werden.

2.4.4 Hemmung der Komplementkaskade Eine weitere Möglichkeit der Hemmung der hyperakuten Abstoßung stellt die

Hemmung der Komplementkaskade dar, da sie hauptsächlich für die

Abstoßungsreaktion verantwortlich ist.

Eine Depletion der Komplementaktivität kann durch den Einsatz von Cobra Venom

Factor (CVF) erreicht werden. Das Cobra venom enthält ein C3b-Analogon, das mit

anderen Komponenten der alternativen Komplementkaskade einen Enzymkomplex

bildet, der zu einem massiven Verbrauch von C3, Faktor B und Komponenten des

Membrane attack complex (MAC) führt und dadurch die Komplementkaskade hemmt

(LEVENTHAL et al., 1993). Mehrere Transplantationsversuche haben gezeigt, dass

die hyperakute Abstoßungsreaktion durch CVF-Gabe verhindert werden kann

(LEVENTHAL et al., 1993; KOBAYASHI et al., 1997). Jedoch wird auch durch CVF

nur die hyperakute Abstoßung des Xenotransplantates gehemmt, während eine

akute Abstoßung weiterhin stattfindet. Zum einen könnten komplement-unabhängige

Mechanismen für die Abstoßung verantwortlich sein (KOBAYASHI et al., 1997), zum

anderen konnte auch durch die CVF-Therapie eine Deposition von Komplement in


dem Spenderorgan nicht vollständig verhindert werden (CHEN et al., 2004). Zudem

ist das CVF toxisch und führt zu systemischen Entzündungsreaktionen.

Ein anderes Verfahren nutzt die Komplementhemmung durch den rekombinanten,

löslichen Komplementrezeptor Typ 1 (sCR1). sCR1 hemmt den klassischen und den

alternativen Weg der Komplementkaskade (PRUITT et al., 1994). In

Transplantationsversuchen konnte sCR1 zwar die hyperakute Abstoßung hemmen,

doch die Organe wurden nach einigen Tagen akut abgestoßen (PRUITT et al.,

1997).

Eine weitere Methode der Hemmung der Komplementkaskade stellt C1 Inhibitor dar.

Dies ist ein Regulatorprotein, das die klassische Komplementkaskade hemmt, sobald

C1 durch schwache Aktivatoren wie z.B. Dextransulfat oder Nukleinsäuren aktiviert

wird. Allerdings ist sein Effekt begrenzt, sobald C1 durch starke Aktivatoren wie z.B.

Antigen-Antikörper-Komplexe aktiviert wird (DALMASSO und PLATT, 1993). Damit

ist C1 Inhibitor für das Gebiet der Xenotransplantation nur begrenzt geeignet.

2.4.5 Komplementregulatoren Die so genannten Komplementregulatoren stellen ein weiteres Prinzip zur

Verhinderung der hyperakuten Abstoßungsreaktion dar. Komplementregulatoren sind

Proteine, die auf der Oberfläche von Blutzellen, Endothelzellen und anderen Zellen

exprimiert werden und eine überflüssige oder autologe Komplementaktivierung

verhindern sollen. Dabei hemmen die Komplementregulatoren die

Komplementreaktion sehr speziesspezifisch, d.h. die porzinen

Komplementregulatoren können die humane Komplementkaskade nach einer

Transplantation nicht hemmen. Es gibt verschiedene Komplementregulatoren, die an

verschiedenen Lokalisationen der Komplementkaskade eingreifen (siehe Abb. 1).


Abb. 1: Angriffspunkte der Komplementregulatoren hCD46, hCD55 und hCD59 in der

Komplementkaskade (Abb.: Jason Dyer, 1998)

CD46 oder Membrane Cofactor Protein (MCP) zeigt eine weitreichende Verteilung im

menschlichen Körper und interagiert mit aktivierten C3- und/oder C4-Derivaten. Es

dient als Co-Faktor für den Abbau von C3b und C4b in eigenen Geweben und dient

durch die Inaktivierung von C3- und C5-Konvertasen (siehe Abb. 1) der Kontrolle der

Komplementaktivierung in eigenen Zellen. Im Schwein existiert ein porzines CD46-

Analogon (VAN DEN BERG et al., 1997), das sehr ähnliche Funktionen aufweist wie

das humane CD46.

Um die hyperakute Abstoßung zu hemmen, wurden Schweine generiert, die transgen

für das humane CD46 sind. Durch Transplantationsversuche mit Pavianen wurde

von DIAMOND et al. 2001 und ADAMS et al. 2001 gezeigt, dass die hyperakute


Abstoßung durch das CD46-Transgen verhindert wird. Die Komplementkaskade

wurde durch das humane Transgen an dem C3-Konvertase-Schritt gehemmt. In den

transplantierten Organen fanden sich weiter keine Ablagerungen von C5b oder

MAC. Obwohl in Transplantationsversuchen mit CD46 immer wieder eine weite

Verteilung und Expression des humanen Proteins in den Schweineorganen

nachgewiesen werden konnte und die Organe nach der Transplantation nicht

hyperakut abgestoßen wurden, gelang es bisher nicht, die akute Abstoßung zu

überwinden (LOVELAND et al., 2004).

CD55 oder Decay-Accelerating Factor (DAF) ist ein weiterer Komplementregulator,

der speziesspezifisch sowohl den klassischen als auch den alternativen Weg der

Komplementkaskade hemmt. Dabei hemmt CD55 ebenfalls, wie CD46, die

Aktivierung der C3- und C5-Konvertasen (SMITH UND SMITH, 2001).

Im Rahmen der Forschung auf dem Gebiet der Xenotransplantation wurden

Schweine generiert, die transgen für das humane CD55 sind. Diese Tiere

produzierten das CD55-Protein in einer Vielzahl von Organen und die hCD55-Level

waren dabei höher als im Menschen (COZZI et al., 1997). Dabei zeigten

CARRINGTON at al. 2001, dass ab einer gewissen Konzentration an hCD55-

Molekülen pro Zelle der protektive Effekt nicht mehr gesteigert werden kann. In

zahlreichen Schwein-zu-Primaten Transplantations- und Perfusionsversuchen konnte

demonstriert werden, dass die Expression von hCD55 in porzinen Organen eine

hyperakute Abstoßung verhindert (SCHMOECKEL et al., 1998; WATERWORTH et

al., 1998; COZZI et al., 2000; LUO et al., 2003). Obwohl in fast allen

Transplantationsversuchen die HAR durch hCD55 gehemmt werden konnte, wurden

bei einzelnen Tieren transgene Herztransplantate hyperakut abgestoßen

(SCHUURMAN et al., 2002). Wiederum gelang es jedoch nicht, die akute Abstoßung

der Organe zu überwinden.

Häufig werden die aufgeführten Methoden zur Verhinderung der

Transplantatabstoßung in Kombination genutzt. So werden z.B. transgene Organe in

Primaten transplantiert, die medikamentell immunsupprimiert sind und zusätzlich


noch eine Depletion der XNAs durch Immunaffinitätssäulen und/oder Bestrahlungen

erhalten haben.

Ein weiterer Komplementregulator ist das humane CD59. Da es sich bei den Tieren

der vorliegenden Studie um hCD59-transgene Schweine handelt, soll im Folgenden

genauer auf dieses Protein eingegangen werden.

2.5 CD59 und hCD59-transgene Tiere

2.5.1 CD59 im Menschen (hCD59) Das hCD59, auch Protectin genannt, wird durch ein einzelnes Gen kodiert, dass auf

Chromosom 11p13 lokalisiert ist (Qian et al., 2000). Das hCD59-Protein ist ein 20 kD

großes Membranprotein, das in großen Mengen im gesamten Organismus, vor allem

auf Lymphozyten und Granulozyten sowie auf Thrombozyten, Erythrozyten und

aktivierten T-Zellen nachgewiesen wurde und mittels Glycosyl Phosphatidylinositol

(GPI) in der Membran verankert ist (DAVIES et al., 1989). MERI et al. zeigten 1991

mittels Immunfloureszenzmikroskopie, dass hCD59 im Gefäßendothel des gesamten

Körpers, aber auch in extravaskulärem Gewebe vorkommt. Dabei zeigten duktale

Epithelien in Pankreas, Gallenblase und Speicheldrüse, Bronchien, Sammelrohre der

Nieren, die Epidermis und Synzytiotrophoblasten der Plazenta eine hCD59-

Expression.

hCD59 hemmt die Komplementreaktion relativ spät während der Kaskade, nämlich

vor der Ausbildung des Membrane Attack Complex (MAC) (DAVIES et al., 1989).

Dabei hemmt hCD59 den C9 Input in den C5b-8 und C5b-9 Komplex und blockiert

zusätzlich die funktionelle Aktivität des im C5b-9 Komplex inkorporierten C9 (MERI et

al., 1990; ROLLINS et al., 1990). So wird die Ausbildung des C5b-9 MAC verhindert.

Zusätzlich hat hCD59 noch eine co-stimulierende Aktivität für T-Zellen (MAHER et

al., 1998). Obwohl zunächst angenommen wurde, dass die komplementhemmende

Wirkung von CD59 streng speziesspezifisch war, zeigten VAN DEN BERG et al.

1994 an einer Untersuchung von CD59 in Menschen, Ratten, Schafen und


Schweinen, dass CD59 nicht so stark speziesspezifisch reagiert, wie bisher

angenommen wurde. Besonders das CD59 von Ratten und Schafen zeigte auch in

anderen Spezies (z.B. Meerschweinchen) eine protektive Wirkung.

Eine Fehlfunktion von hCD59 kann bei Menschen schwere Folgen haben. Ein

Beispiel dafür ist die Paroxysmale Nächtliche Hämoglobinurie (PNH), eine erworbene

hämatologische Erkrankung. Bei der PNH ist die Glycosyl Phosphatidylinositol-

Verankerung defekt und dadurch enthalten betroffene Blutzellen von PNH-Patienten

kein hCD59 oder hCD55. Aufgrund des Fehlens dieser Komplementregulatoren

kommt es zu einer autologen, komplementvermittelten Lyse von Erythrozyten und

Thrombozyten, die zu einer hämolytischen Anämie und Thrombose führt (QIAN et

al., 2000).

2.5.2 CD59 im Schwein (pCD59) Das porzine Ortholog zu hCD59, pCD59 wird durch ein einziges Gen kodiert, das in

enger Verbindung mit dem follikel-stimulierenden Hormon Beta Polypeptid (FSHB),

auf dem gleichen Chromosom wie das humane CD59 im Menschen lokalisiert ist

(MAHER et al., 1998). pCD59-Protein zeigt eine starke Expression ubiquitär im

Organismus. Am stärksten ist die pCD59-Expression auf den Endothelzellen von

Blutgefäßen. Aber auch Erythrozyten, ein Teil der mononukleären Zellen und

Granulozyten im Blut, Epithelien aller Organe, die graue Substanz im Gehirn und die

T-Zellen der Lymphfollikel in Lymphknoten und Milz zeigen eine starke pCD59-

Expression (HANNA et al., 1998). Im Unterschied zu dem humanen CD59 zeigen ein

Großteil der mononukleären Zellen im Blut, Thrombozyten sowie B-Zellen keine

pCD59-Expression. Das pCD59-Protein hat eine β-Faltblattstruktur und daher ist es

schwierig, die Domäne zu identifizieren, die für die komplementhemmende Wirkung

verantwortlich ist. Man nimmt jedoch an, dass die Aminosäure-Seitenketten zwischen

Position 42 und 58 für die Interaktion mit C8 oder C9 verantwortlich sind (MAHER et

al., 1998).

Der Wirkungsmechanismus von pCD59 entspricht dem Wirkungsmechanismus des

humanen CD59. Auch pCD59 hemmt die Ausbildung des MAC durch die Blockierung

der Interaktion von C5b-8 mit C9.


HANNA et al. zeigten 1998, dass das pCD59 in der Lage ist, auch humanes

Komplement zu hemmen, somit also auch nicht streng speziesspezifisch reagiert.

Die hyperakute Abstoßung durch humanes Komplement ist daher möglicherweise

auf eine nicht ausreichende Kapazität des pCD59 zurückzuführen.

2.5.3 CD59 bei anderen Tierarten Orthologe von hCD59 sind auch in vielen anderen Tierarten untersucht worden, wie

z.B. in Ratten, Mäusen, Schafen und Primaten. Im Allgemeinen weisen alle

Orthologe die gleiche Struktur im Hinblick auf das Molekulargewicht (18-20 kD) und

die GPI-Verankerung in der Membran auf. Auch die Verteilung in den bisher

untersuchten Spezies ist ähnlich, da CD59, mit einzelnen Variationen, ubiquitär auf

Blutzellen, Endothelien und Epithelien vorhanden ist.

Die Maus weist in ihrem CD59-Ortholog im Vergleich zum Mensch, zur Ratte und

zum Schwein eine Besonderheit auf: Während diese Spezies nur ein Gen für das

CD59 besitzen, sind in der Maus zwei Gene, CD59a und CD59b, nachgewiesen

worden. Während CD59a weit im gesamten Organismus exprimiert wird, wird CD59b

selektiv im Hoden der Mäuse exprimiert. Man nimmt an, dass die zwei CD59-Gene

der Maus verschieden reguliert sind und sich ihre physiologischen Aufgaben nicht

überschneiden (QIAN et al., 2000).

2.5.4 hCD59-transgene Tiere Da die Komplementreaktion den Hauptmechanismus der hyperakuten Abstoßung

darstellt, ist die Hemmung der Komplementkaskade ein Ansatz, um die Abstoßung

des Xenotransplantates zu verhindern. Da das porzine CD59 die

Komplementreaktion an den transplantierten Organen nur sehr begrenzt hemmen

kann, wurden Tiere generiert, die in ihren Organen das humane CD59 exprimieren.

Das hCD59 soll dann direkt auf den Xenotransplantaten die Aktivierung der

Komplementkaskade verhindern.

Da die Herstellung solcher transgener Schweine sehr teuer, ineffektiv und

zeitaufwendig ist, wurden auch hCD59-transgene Mäuse hergestellt, da sie schneller


und leichter zu generieren sind. An den hCD59-transgenen Mäusen wurde der

protektive Effekt des humanen Transgens getestet. In extrakorporalen Perfusionen

von transgenen Mäuseorganen mit humanem Serum zeigte das humane CD59 einen

protektiven Effekt. Weiterhin wurden porzine Nierenzellen (PK1-Zellen) mit humaner

CD59-cDNA transfiziert und auch hier zeigte sich ein protektiver Effekt bei Kontakt

mit humanem Serum (SOMERVILLE et al., 1994).

FODOR et al. gelang 1994 neben der Produktion von hCD59-transgenen Mäusen

auch die Herstellung eines hCD59-transgenen Schweins. Das Tier wurde mittels

Mikroinjektion eines hCD59-Konstruktes in die Pronuklei einer Zygote generiert. Als

genomische Expressionskassette diente dabei das murine MHC Klasse I Gen

(H2Kb).

Die Methode der Mikroinjektion stellte lange Zeit die einzige Methode dar, um

transgene Schweine zu produzieren. Die Nachteile der Mikroinjektion liegen in einer

geringen Effektivität und in einer zufälligen Integration des humanen Konstrukts, so

dass unklar ist, ob, wo und in welcher Quantität das humane CD59 integriert wird.

Zusätzlich können Positionseffekte des zufällig eingebauten Konstrukts

Auswirkungen auf den Phänotyp des Schweins haben (NIEMANN et KUES, 2000).

Nach der Etablierung von Klonen und Knockouts bei Schweinen kann jetzt eine

gezieltere Manipulation der Tiere erfolgen und in den nächsten Jahren wird die

Technik wahrscheinlich durch eine Kombination von Knock-outs und Transgenen

noch erheblich verbessert werden.

2.6 Charakterisierung der Expression in transgenen Schweinen

Nach der gelungenen Herstellung von transgenen Schweinen muss geklärt werden,

ob und in welcher Verteilung das humane Transgen in den Geweben und Organen

des Schweins exprimiert wird. Weiterhin gilt es zu untersuchen, ob das humane

Transgen durch Positions- oder andere Effekte zu einem morphologischen Phänotyp

bei den Tieren führt.


2.6.1 Expression des hCD59-Transgens

Ziel der Herstellung transgener Tiere ist häufig, eine möglichst ubiquitäre und starke

Expression des Transgens in den Organen und Geweben zu erreichen. Häufig hat

die Wahl des Promotors einen großen Einfluss auf das Verteilungsmuster und die

Expressionsstärke des Transgens, da einige Promotoren gewebsspezifisch sind.

FODOR et al. setzten 1994 für die Generierung von hCD59-transgenen Mäusen und

einem hCD59-transgenen Schwein ein murines MHC Klasse 1 Gen, H2Kb als

Promotor ein. H2Kb wird ubiquitär exprimiert und ist vor allem ein wichtiges

Endothelzell-Oberflächenantigen. Bei der Expressionsanalyse wiesen FODOR et al.

bei drei transgenen hCD59-Foundermäusen eine Expression von hCD59-Protein auf

dem Endothel von Blutgefäßen im Herz und auf dem Endokard nach. Um das

transgene Schwein nicht töten zu müssen, wurde von diesem Tier ein Stück

Schwanz untersucht und auch hier wurde eine Expression von hCD59-Protein in

Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen nachgewiesen.

Somit führte der eingesetzte H2Kb-Promotor zu einer Expression des Transgens in

einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben. Zudem waren Zellen des transgenen

Schweins bei Kontakt mit humanem Serum vor einer Komplementreaktion geschützt.

Auch DIAMOND et al. charakterisierten 1996 mehrere hCD59-transgene Schweine.

In der RNA-Analyse mittels Northern Blot zeigten die Tiere eine Expression von

hCD59-RNA in Leber, Herz, Niere, Lunge, Milz, Muskel, Haut und Pankreas, wobei

die Level des hCD59 etwa 10fach geringer waren als im Menschen. Das hCD59-

Protein wurde auch auf dem Endothel exprimiert, allerdings nur in größeren Gefäßen

und mit einem sehr viel schwächeren Signal als im Menschen. Trotzdem zeigten die

porzinen Endothelzellen nach Inkubation mit humanem Serum keine Zytotoxizität.

Bei einer heterotopen Transplantation von Herzen der hCD59-transgenen Schweine

in Paviane überlebten die transgenen Organe zwar nur etwas länger als die Herzen

der nicht-transgenen Kontrolltiere, aber dafür waren die histopathologischen

Merkmale der hyperakuten Abstoßung in den transgenen Herzen nicht so

ausgeprägt, und zudem zeigten die transgenen Herzen einen deutlich verringerten


Nachweis von MAC im Vergleich zu den Kontrollherzen. Diese Ergebnisse sprachen

dafür, dass trotz der geringen Expressionslevel von hCD59 ein gewisser protektiver

Effekt vorhanden war.

COWAN et al. generierten 1998 hCD59-transgene Mäuse, die das Transgen

entweder unter dem H2Kb-Promotor oder unter dem endothel-spezifischen,

humanen, interzellulären Adhäsionsmolekül-2-Promotor (ICAM-2) exprimierten. Die

Expressionsmuster der beiden Promotoren waren deutlich unterschiedlich: Alle

Leukozyten der H2Kb-Linie exprimierten hCD59 unterschiedlich stark, während die

ICAM-2-Linie hCD59 vorwiegend auf neutrophilen Granulozyten, aber nicht auf

Lymphozyten exprimierten. Hingegen zeigten kardiale Endothelzellen der ICAM-2-

Linie eine 25-30fach höhere hCD59-Expression als die H2Kb-Linie. Auch in

Perfusionsversuchen mit humanem Serum zeigten die ICAM-2-Herzen eine längere

Vitalität als die H2Kb-Herzen. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine hohe endotheliale

Expression von hCD59 eine bessere Protektivität bietet.

NIEMANN et al. untersuchten 2001 das Expressionsmuster von hCD59-transgenen

Schweinen, die das Transgen unter dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor

exprimierten. Der CMV-Promotor induzierte eine starke und ubiquitäre Expression in

einer Reihe von Zelllinien und transgenen Mäusen. In den transgenen Schweinen

führte der Promotor zu einer Expression von hCD59 in einer Reihe von Organen und

Geweben, wobei die Expressionslevel zwischen Linien verschiedener Founder

erheblich schwankte. Zwei Linien zeigten eine Expression von hCD59 in Herz,

Muskel, Lunge, Niere, Pankreas und Haut. Andere Linien exprimierten hCD59

lediglich im Pankreas. In der immunhistochemischen Untersuchung konnte eine

zelltyp-spezifische Expression dargestellt werden. Im Herz zeigten die

Kardiomyozyten eine starke Anfärbung, während die Endothelzellen weniger stark

reagierten. In der Haut färbte sich lediglich die Epidermis und in der Niere

vorwiegend die Tubulusepithelzellen. Zudem lag in der Niere ein sogenanntes

„patchy pattern“ vor, bei dem sich nur einzelne Areale positiv färbten. Bei einer

Inkubation von transgenen Fibroblasten und Endothelzellen mit humanem Serum


sowie bei einer extrakorporalen Nierenperfusion mit humanem Blut zeigte sich bei

den transgenen Zellen und Nieren eine deutlich ausgeprägte Protektion im Vergleich

zu den nicht-transgenen Zellen und Organen. Diese Ergebnisse zeigten, dass der

CMV-Promotor zu einer weit verteilten Expression von hCD59 führt, wenn auch nicht

in allen Organen und Zellen eine Expression nachgewiesen werden konnte.

Insgesamt führten alle eingesetzten Promotor zu der Expression des Transgens und

zu einem protektiven Effekt, wenn auch die Expression nicht immer ubiquitär

vorhanden war und nur die hyperakute Abstoßung, nicht jedoch die akute Abstoßung

gehemmt werden konnte.

2.6.2 Expression von mehreren Transgenen Um den protektiven Effekt noch zu steigern, werden transgene Tiere konstruiert, die

nicht nur ein Transgen, sondern mehrere Transgene exprimieren. Diese doppelt-

oder dreifach-transgenen Tiere sollen durch eine Kombination und/oder Addition der

Transgeneigenschaften zu einer höheren Xenotransplantatakzeptanz führen.

COSTA et al. untersuchten 1999 drei Mauslinien: Eine Mauslinie war doppelt

transgen für hCD59 und α1-2Fucosyltransferase (HT), eine Mauslinie war transgen

für hCD59 und besaß zusätzlich einen α1-3Gal-knockout und die dritte Linie war

doppelt transgen für hCD59 und HT und besaß zusätzlich noch einen knockout für

α1-3Gal. Als Promotor wurde ein β-actin-Promotor gewählt. Alle drei Linien zeigten

eine mRNA- und Protein-Expression der Transgene in allen untersuchten Organen.

Dabei gab es zwischen den drei Linien keine signifikanten qualitativen oder

quantitativen Unterschiede. In einer Untersuchung der Hemmung der Zytolyse durch

humanes Serum zeigte sich, dass die hCD59xHT-Kombination genauso effektiv war

wie die hCD59xα1-3Gal-ko-Kombination. Überraschenderweise war auch in der

dritten Linie, die doppelt transgen war und einen α1-3Gal-ko aufwies, die Protektion

nicht merklich verbessert.


COWAN et al. generierten 2000 dreifach-transgene Schweine, die unter dem H2Kb-

Promotor hCD59, hCD55 und HT exprimierten. In der Expressionsanalyse konnte

eine starke Expression von hCD59 und hCD55 in allen untersuchten Geweben und

Organen nachgewiesen werden, während HT nur sehr schwach exprimiert wurde

und zu keiner signifikanten Reduktion des Gal-Epitops führte. Bei einer

Transplantation von dreifach transgenen Nieren in nicht-immunsupprimierte Paviane

konnte die hyperakute Abstoßung dennoch gehemmt werden.

COSTA et al. erstellten 2002 hCD59/HT doppelt-transgene Schweine. Die Founder

der doppelt-transgenen Tiere exprimierten das jeweilige Transgen unter dem K2Kb-

oder dem CMV-Promotor. Die doppelt-transgenen Tiere zeigten ein

unterschiedliches Expressionsmuster. Während eine Linie eine starke Expression

beider Transgene zeigte, wies die andere Linie ein Mosaikmuster und eine schwache

Expression der Transgene auf. hCD59-mRNA konnte in allen untersuchten Geweben

mittels RT-PCR nachgewiesen werden. Die HT-mRNA-Expression wurde unter dem

CMV-Promotor in nahezu allen Geweben nachgewiesen, während unter dem H2Kb-

Promotor nur in der Milz eine Expression festgestellt wurde. Monozyten und

Endothelzellen der doppelt-transgenen Tiere zeigten bei Kontakt mit humanem

Serum eine deutlich bessere Protektion gegenüber einer Zytolyse als Zellen von

Tieren, die nur eines der beiden Transgene exprimieren. Diese Ergebnisse stehen im

Widerspruch zu den Ergebnissen von COWAN et al., 2000.

BYRNE et al. konstruierten 1997 transgene Schweine, die doppelt-transgen für die

Komplementregulatoren hCD59 und hCD55 waren. In der Expressionsanalyse dieser

Tiere wurde eine variierend starke Expression von hCD59 in allen untersuchten

Organen gefunden. Dabei waren die Expressionslevel niedriger als in humanen

Geweben. Die Expression von hCD55 war vom Verteilungsmuster ähnlich wie

hCD59, jedoch waren die Expressionslevel niedriger als bei hCD59 und auch

niedriger als in humanen Geweben. Trotz der geringen hCD55-Expression konnte in

Transplantationsversuchen mit Pavianen eine Hemmung der Komplementreaktion

nachgewiesen werden. Dabei waren sowohl C3 und C5b, als auch MAC in


reduzierten Mengen vorhanden. Diese Ergebnisse zeigen, dass beide

Komplementregulatoren an der Hemmung der Komplementkaskade beteiligt waren,

trotz der niedrigen Expression von hCD55.

CHEN et al. generierten 1999 ebenfalls hCD59/hCD55 doppelt-transgene Schweine,

die mit Hilfe von CD59 und CD55 humanen genomischen Klonen konstruiert wurden.

Immunhistochemisch wurde in den doppelt-transgenen Herzen Expressionlevel für

hCD59 und hCD55 nachgewiesen, die den in humanen Herzen in etwa entsprechen.

Nach heterotoper Herztransplantation zeigten beide Transgene einen protektiven

Effekt mit Hemmung der hyperakuten Abstoßung.

Insgesamt wurde bei der Konstruktion von doppelt-transgenen Tieren in den meisten

Fällen gezeigt, dass ein Transgen stärker exprimiert wurde als das andere (BYRNE

et al., 1997; ZHOU et al., 2002). Trotzdem zeigten beide Transgene einen

protektiven Effekt, wenn auch nur die hyperakute Abstoßung, nicht jedoch die akute

Abstoßung gehemmt werden konnte.

Auch für die beiden anderen Komplementregulatoren hCD55 und hCD46 wurden

Expressionsanalysen an transgenen Tieren durchgeführt. Dabei waren die

Expressionslevel teilweise höher als beim Menschen (COZZI et al., 1997). Doch

auch für diese Transgene gilt, dass sich der protektive Effekt auf die hyperakute

Abstoßung beschränkt.

2.6.3 Weitere Transplantationsversuche Mit Schweinen, die transgen für Komplementregulatoren sind, wurden mittlerweile

viele Transplantationsversuche durchgeführt, über die im Folgenden ein kurzer

Überblick gegeben werden soll.

1996 führten NORIN et al. orthotope Lungentransplantationen von hCD59-

transgenen Schweinen in Paviane durch und konnte zeigen, dass eine hyperakute


Abstoßung im Vergleich zu nicht-transgenen Organen (Abstoßung nach 3 Stunden

post operationem) verhindert wurde. Allerdings wurden die Xenotransplantate 12

Stunden post operationem akut abgestoßen.

1998 führten SCHMOECKEL et al. orthotope Herztransplantationen von hCD55

transgenen Schweinen in Paviane durch und zeigte, dass eine hyperakute

Abstoßung verhindert wurde und die Schweineherzen zunächst ihre physiologische

Funktion anfnahmen, bevor sie akut abgestoßen wurden.

ZAIDI et al. machten 1998 eine überraschende Beobachtung, als sie nach

Nierentransplantationen zwischen hCD55-transgenen Schweinen und

Cynomolgusaffen zwar keine hyperakute Abstoßung der Organe nachwiesen, aber

auch in den Kontrollgruppen mit nicht-transgenen Nieren die Nieren teilweise nicht

hyperakut abgestoßen wurden. Bereits 1995 hatten KAPLON et al. das gleiche

Phänomen nach Transplantationen von nicht-transgenen Schweinelungen in Paviane

beobachtet.

2000 erreichten COZZI et al. die bislang längste Überlebenszeit eines

Xenotransplantates. Nieren von hCD55-transgenen Schweinen wurden orthotop in

immunsupprimierte Cynomolgusaffen transplantiert. Eine Niere wurde erst nach 78

Tagen abgestoßen und 4 von 9 Tieren überlebten für 50 oder mehr Tage. Dabei

lagen die Nierenwerte wochenlang im physiologischen Bereich.

2000 schlossen LEVY et al. zwei humane Patienten mit einem akuten, totalen

Leberversagen an extrakorporale, hCD55- und hCD59-transgene Schweinelebern an

und konnten so einen Zeitraum von 6,5, bzw. 10 Stunden überbrücken, bis ein

Allotransplantat zur Verfügung stand. Damit zeigten sie, dass transgene

Schweineorgane zur Überbrückung der Wartezeit auf ein geeignetes Allotransplantat

genutzt werden könnten.


Insgesamt zeigen die bisher weltweit durchgeführten Versuche, dass trotz der

Fortschritte auf dem Gebiet der Erzeugung transgener Tiere und der knockout-

Technik die Erfolge auf dem Gebiet der Xenotransplantation bisher eher bescheiden

sind. Zwar gelingt es mittlerweile, die hyperakute Abstoßung der Xenotransplantate

zu verhindern, die Organe werden jedoch trotz der Expression von humanen

Transgenen oder Gal-knockouts immer noch akut abgestoßen. Man hofft, durch die

Kombination von Knockout-Technik und der Expression von humanen Transgenen in

den nächsten Jahren auch die akute Abstoßung zu überwinden.

2.7 Morphologische Phänotypen transgener Tiere

Die Manipulation am Genom von Tieren kann zur Ausprägung von

pathomorphologischen Phänotypen führen. Am besten ist dieses Phänomen bei

Mäusen erforscht, da bei dieser Spezies bereits seit Jahren gezielte Veränderungen

des Genoms vorgenommen werden können. In vielen Fällen ist ein morphologisch

manifester Phänotyp der Tiere geplant und erwünscht, z. B. wenn es um die

Erzeugung von Mausmodellen für bestimmte Krankheiten geht. Manchmal

entwickeln die Tiere jedoch einen im Vorfeld ungeplanten Phänotyp durch die

genetischen Veränderungen.

Bei den landwirtschaftlichen Nutztieren sind bislang nicht so viele Phänotypen

beschrieben worden, da bei ihnen die biotechnologischen Methoden noch nicht so

lange und so häufig eingesetzt werden. Trotzdem sind auch bei Schafen, Rindern

und Schweinen pathomorphologische Phänotypen in Folge genetischer

Manipulationen beschrieben worden. Besonders die Mikroinjektion birgt die Gefahr

ungeplanter Phänotypen, da der Einbau der mikroinjizierten DNA rein zufällig erfolgt

und dazu führen kann, dass das Transgen gar nicht exprimiert wird, verstärkt

exprimiert wird oder in einem anderen Organ oder Gewebe exprimiert wird als

ursprünglich geplant (ektopische Expression) (VAN REENEN et al., 1999). Zudem


kann das Transgen benachbarte Gene des Tieres beeinflussen und auch dadurch zu

einem spezifischen Phänotyp führen.

Auf die Ausprägung einiger Phänotypen soll im Folgenden genauer eingegangen

werden.

2.7.1 Ektopische Expression NIEMANN et al. generierten 1999 transgene Schafe, die den humanen

Gerinnungsfaktor Faktor VIII in ihrer Milch exprimieren sollten. Dies sollte mit einem

Milchdrüsen-spezifischen Promotor des ovinen beta-Lactoglobulin-Gens erreicht

werden. Zwar zeigten einige Tiere eine Expression des gewünschten Proteins in der

Milch, ein Tier exprimierte die mRNA jedoch zusätzlich noch ektopisch in Gehirn,

Herz, Milz, Niere und Speicheldrüse. Dies zeigte, dass der gewählte Promotor nicht

zu einer ausschließlichen Produktion des Transgens in der Milch führte.

1996 generierten MASSOUD et al. transgene Kaninchen, die humanes Erythropoetin

über einen Kaninchen Whey Acid Promotor in der Milchdrüse exprimieren sollten.

Die transgenen Kaninchen hatten einen abnormal erhöhten Gehalt an Erythrozyten,

konnten sich nicht fortpflanzen, produzierten keine Milch und starben sehr jung. In

den betroffenen Tieren wurde das Erythropoetin-Gen in niedrigen Mengen auch in

anderen Organen als der Milchdrüse produziert.

2.7.2 Large Offspring Syndrome (LOS) Bei Schafen und Rindern haben in vitro Technologien bereits häufig zum so

genannten Large Offspring Syndrome (LOS) geführt. Das deutlichste Symptom des

LOS ist das hohe Geburtsgewicht der Tiere. Dabei variieren die Geburtsgewichte

stark, ein doppelt erhöhtes Geburtsgewicht ist keine Seltenheit und es sind sogar

Geburtsgewichte bis zum fünffachen des Normalen beschrieben worden. Da häufig

eine Dystokie mit dem hohen Geburtsgewicht vergesellschaftet ist, müssen die

Lämmer bzw. Kälber oft per Kaiserschnitt entwickelt werden. Die Trächtigkeitszeit ist

häufig verlängert und unter der Geburt kommt es oftmals zu Atemschwierigkeiten,

Schwierigkeiten beim Saugen und zu plötzlichem perinatalen Tod. Während der

Trächtigkeit sind auch pränatale Verluste, besonders in der ersten Trächtigkeitshälfte


zu beobachten. Für einige Organe sind makroskopische Läsionen beschrieben

worden, wie z.B. vermehrte Muskelmasse, Muskelfaserveränderungen, zerebelläre

Dysplasie und Missbildungen des Skelettsystems und des Kopfes. Die

allometrischen Wachstumskoeffizienten für fetale Leber, Herz, Niere und Muskel sind

in von LOS betroffenen Schaffeten erhöht. Dies weist darauf hin, dass auch die

Entwicklung dieser Organe gestört sein könnte (YOUNG et al., 1998).

Das LOS ist bislang nur bei Rindern und Schafen beschrieben, während es bei

Schweinen und Mäusen nach der Anwendung von in vitro Technologien bisher nicht

aufgetreten ist.

2.7.3 Kardiopulmonale und plazentale Phänotypen 1998 klonten CIBELLI et al. Kälber aus fetalen Fibroblasten. Im Verlauf des

Versuches kam es bei einigen Kälbern zu Plazentationsstörungen in Form einer

Hydroallantois, vergrößerten Plazentomen und einer ödematiserten Chorioallantois

und Amnion. Ein abortiertes Kalb zeigte einen vergrößerten rechten Herzventrikel,

ein Lungenödem und stark vergrößerte Nabelgefäße. Ein lebend geborenes Kalb

verstarb im Alter von fünf Tagen mit einem vergrößerten rechten Herzventrikel, einer

pulmonalen Hypertension, einem Ductus arteriosus persistens, einer Lungenarterie,

die größer war als die Aorta und dreifach vergrößerten Nabelgefäßen.

HILL et al. untersuchten 1999 morphologische Phänotypen von dreizehn aus

Fibroblasten geklonten Kälbern und fanden ähnliche Befunde wie CIBELLI et al.

1998. Auch in ihren Untersuchungen stellten sie dilatative Kardiomyopathien,

pulmonale Hypertension, plazentale Ödeme und Hydroallantois fest. Außerdem

zeigten 8 Kälber ein neonatales respiratorisches distress Syndrom und ein Kalb wies

eine pulmonale Surfactant-Insuffizienz auf. Insgesamt standen bei den untersuchten

Kälbern kardiopulmonale Phänotypen, häufig im Zusammenhang mit

Plazentaveränderungen im Vordergrund. Es wurde vermutet, dass die Technik des

Klonens und/oder die Bedingungen der in vitro Embryokulturen für die Phänotypen

verantwortlich waren, der Mechanismus konnte jedoch nicht geklärt werden.


Ähnliche Phänotypen wie die oben beschriebenen beobachteten auch LAI et al. 2002

bei geklonten Ferkeln, die ein Allel des Gal-Epitops ausgeknockt hatten. Auch bei

diesen Tieren lagen ein dilatierter rechter Ventrikel und eine verdicktes Myokard vor.

Auch CARTER et al. beobachteten 2002 bei zwei von zehn EGFP (Enhanced Green

Flourescent Protein)-transgenen Ferkeln eine Herzinsuffizienz in Folge einer

dilatativen Kardiomyopathie des rechten Ventrikels.

2.7.4 Muskel- und Skelett-Phänotypen PARK et al. generierten 2001 mittels nukleärem Transfer transgene Schweine, die

das Enhanced Green Flourescent Protein (EGFP) unter der Kontrolle eines

Cytomegalovirus (CMV)-Promotors exprimierten. Die Ferkel zeigten

Beugesehnenkontrakturen an den Vorderbeinen und ein Tier wies eine bilaterale

tarsale Hyperextension auf. Diese Läsionen verschwanden jedoch innerhalb einiger

Tage wieder.

Auch LAI et al. beschrieben 2002 zusätzlich zu den kardialen Veränderungen in den

Ferkeln mit einem ausgeknockten Allel der α-1-3-Galactosyltransferase

Beugesehnenfehlbildungen. Zudem zeigten die Gal-knockout Ferkel im Vergleich zu

Kontroll-Ferkeln der gleichen Rasse geringere Geburtsgewichte (450g – 650 g,

Normalwert: ca. 860g). Im Gegensatz dazu konnten DAI et al., die ebenfalls 2002

Ferkel mit einem ausgenockten Allel der α-1-3-Galactosyltransferase produzierten,

bei ihren Tieren keinerlei pathomorphologische Veränderungen feststellen.

2.7.5 Sonstige Phänotypen SHAMAY et al. beschrieben 1992 die Produktion von sechs verschiedenen Linien

transgener Schweine, die in ihrer Milch murines Whey Acidic Protein in hohen Dosen

produzierten. In drei der sechs transgenen Linien zeigten die Säue eine stark

eingeschränkte Milchproduktion und unreifes Milchdrüsenparenchym. Dieses

Phänomen war bereits bei transgenen Mäusen, die ebenfalls das Whey Acidic

Protein in der Milchdrüse produzierten, als „Milchlos Phänotyp“ beschrieben worden.

SHAMAY et al. postulierten 2001, dass das Whey Acidic Protein zu einer


eingeschränkten Entwicklung und Funktion der Milchdrüse und damit zu dem

Milchlos Phänotyp führt.

2000 produzierten McCREATH et al. Schafe mittels nukleärem Transfer, die über

gene-targeting ein therapeutisches Transgen in dem ovinen α1(I)Prokollagen

(COL1A1)-Lokus exprimierten. Von den 14 lebend geborenen Lämmern starben 7

innerhalb der ersten 30 Lebensstunden und 4 weitere in den nächsten 12 Wochen.

Bei den verstorbenen Tieren ergaben die durchgeführten Sektionen eine Reihe von

Abnormalitäten. Obwohl sich kein konstantes Muster erkennen ließ, zeigte sich ein

hoher Anteil an Nierendefekten, wie z.B. Nierenbeckendilatation, und an Leber- und

Gehirnläsionen (nicht näher spezifiziert).

Insgesamt zeigen die Phänotypen, die nach genetischen Manipulationen auftreten

eine hohe Variabilität, häufig kann man aber auch spezifische Phänotypen

beobachten, die mit einem bestimmten Genotyp in Zusammenhang stehen. In den

meisten Fällen ist es jedoch schwierig zu bestimmen, welcher genaue Mechanismus

für die Entstehung eines Phänotyps verantwortlich ist.

2.8 Genkonstrukt

Die für die vorliegende Studie untersuchten transgenen Tiere wurden im Institut für

Tierzucht und Tierverhalten der FAL Mariensee durch Mikroinjektion der

Genkonstrukte in den Vorkern einer Zygote hergestellt (NIEMANN et al., 2001;

Konstruktsequenz siehe Anhang).

Die verwendeten Genkonstrukte bestanden aus einer bicistronischen Kassette, in der

der Komplementregulator hCD59 entweder mit EGFP (Enhanced Green Flourescent

Protein), oder mit NTA (Transaktivator, Lokalisation im Konstrukt: bp 445-951) über

ein IRES-Element (Internal Ribosome Entry Side) (Lokalisation im Konstrukt: bp 952-

1579) verbunden war und durch einen Cytomegalovirus (CMV)–Promotor getrieben


wurde. Der IRES-Sequenz folgte das Transkativator-Gen (Lokalisation im Konstrukt:

bp 1580-2380) und schließlich eine Poly-A Erkennungssequenz.

Das EGFP sollte durch die Floureszenz einer leichteren, floureszenzmikroskopischen

Detektion des Transgens dienen. Die IRES-Sequenz stellt einen internen

Zugangspunkt für die Initiation der Translation durch eukaryotische Ribosomen dar.

Das Transaktivator-Gen ist eine Fusion aus einem bakteriellen Tet-Repressor und

einer viralen VP 16 Domäne. Der Tet-Repressor bindet spezifisch an Tet-Operator-

Sequenzen im Promotor während die virale VP 16 Domäne interagiert und die

eukaryontische Polymerase II aktiviert. Auf diesem Weg erhöht der Transaktivator

die Expression. Zudem kann der Tet-Repressor des Transaktivators Tetrazyklin

binden, wodurch er seine Konformation ändert und dann nicht mehr an Tet-Operator-

Sequenzen bindet. Dadurch ist die VP 16 Domäne nicht mehr in der Nähe der

Polymerase II, deren Aktivierung ausbleibt, und so wird schließlich die Expression

verringert (FURTH et al., 1994).

34

3 Ziel der Studie

Diese Studie sollte mittels pathologisch-anatomischer und histopathologischer

Untersuchungen klären, ob die per Mikroinjektion erzeugten hCD59-transgenen

Schweine einen spezifischen pathomorphologischen Phänotyp aufwiesen, und ihn

gegebenenfalls beschreiben.

Weiterhin sollte mittels immunhistochemischer Untersuchungen mit einem

spezifischen hCD59-Antikörper geklärt werden, ob das humane Protein in den

porzinen Organen und Geweben exprimiert wurde und in welchen Zellen die

Expression nachweisbar war. In diesem Zusammenhang wurde auch das

Verteilungsmuster und die Intensität der hCD59-Proteinexpression beurteilt.

Des weiteren wurde mittels einer qualitativen Reversen-Transkriptase-PCR mit

einem spezifischen hCD59-Primer untersucht, ob die porzinen Organe und Gewebe

die hCD59-mRNA enthielten, welches Expressionsmuster für die mRNA vorlag und

ob dieses Muster mit dem Expressionsmuster für das hCD59-Protein übereinstimmt.

Eine qualitative PCR mit einem spezifischen hCD59-Primer diente dazu, die

Detektion und das Verteilungsmuster der hCD59-DNA in den verschiedenen

porzinen Organen und Geweben zu untersuchen. Auch hier wurde ein Vergleich des

DNA-Nachweises mit dem Expressionsmuster für das hCD59-Protein und die

hCD59-mRNA durchgeführt.

Diese Untersuchungen sollten wesentliche Hinweise zur Beantwortung der Frage

liefern, ob die untersuchten hCD59-transgenen Tiere als Spendertiere für

Organtransplantate für den Menschen in Frage kommen.

35

4 Eigene Ergebnisse:

Pathomorphologische Charakterisierung

4.1 Hintergrund und Bedeutung

Die pathomorphologische Charakterisierung der transgenen Tiere diente dazu, einen

möglicherweise vorhandenen Phänotyp zu identifizieren und zu beschreiben. Es ist

bekannt, dass genetische Manipulationen am Erbgut zu der Ausbildung eines

Phänotyps führen können.

Die Erstellung der transgenen Schweine mittels Mikroinjektion führt dazu, dass das

humane Konstrukt zufällig im Genom des Schweins integriert wird. Daher lässt sich

nicht sagen, wo die Insertionsstelle des Konstrukts liegt, und ob durch die Position

des Konstruktes möglicherweise porzine Gensequenzen durch so genannte

Positionseffekte beeinflusst werden. Diese Positionseffekte können dazu führen,

dass es zu einer Hemmung oder andersartigen Beeinflussung (z.B. einer verstärkten

Expression) von porzinen Gensequenzen kommt und dadurch möglicherweise ein

pathomorphologischer Phänotyp entsteht.

Um zu klären, ob die Integration des humanen Konstruktes zu der Ausbildung eines

Phänotyps geführt hat, wurde eine pathomorphologische Charakterisierung der

transgenen Tiere im Vergleich zu den nicht-transgenen Kontrolltieren durchgeführt.

4. 2 Experimentelles Design

4.2.1 Material Für die pathomorphologischen Untersuchungen wurden 19 transgene Schweine

(gekennzeichnet mit Kürzel TG und fortlaufender Nummer) und 9 nicht-transgene

Kontrollschweine (gekennzeichnet mit KO und fortlaufender Nummer) der Rasse

Deutsche Landrasse im Alter von 1 bis 32 Monaten untersucht. Beide Gruppen

4 Eigene Ergebnisse: Pathomorphologische Charakterisierung 36

wurden unter gleichen Bedingungen gehalten und es handelte sich bei den Tieren

um spezifiziert-pathogen-freie (SPF) Schweine (Tab. 1).

18 der 19 untersuchten Schweine waren transgen für hCD59. Ein Tier (TG23) war

transgen für den Komplementregulator hCD55 und diente als zusätzliche

Negativkontrolle. Bei dem Tier TG26 handelte es sich um ein doppelt transgenes

Tier, das sowohl den Komplementregulator hCD55, als auch hCD59 trug.

Die genauen Genotypen der einzelnen Schweine sowie Alter und Zuchtlinie der

untersuchten Tiere sind in Tabelle 1 dargestellt.


Tab. 1: Daten der untersuchten Tiere

Tier-Nr.

interne

Nummer

Sektions-datum

Alter

in Monaten

Ge-schlecht

Konstrukt Zucht-Linie

KO1 777/45 28.03.2001 ca. 8 Mon. männl. - -

KO2 n.b. 14.06.2001 n.b. männl. - -

KO3 n.b. 25.09.2001 n.b. männl. - -

KO4 956/15 19.03.2003 n.b. männl. - -

KO5 n.b. 20.08.2002 n.b. weibl. - -

KO6 n.b. 18.12.2002 n.b. weibl. - -

KO7 n.b. 27.05.2003 n.b. männl. - -

KO8 n.b. 10.07.2003 n.b. männl. - -

KO9 359/4 15.06.2004 ca. 1 Mon. männl. - -

TG1 886/5 28.03.2001 ca. 21 Mon. weibl. CD59+EGFP 8


TG4 886/31/1 14.06.2001 ca. 7 Mon. männl. CD59+EGFP 8


TG6 841/18 14.06.2001 ca. 18 Mon. männl. CD59+EGFP 5

TG7 160 24.09.2001 ca. 4 Mon. weibl. CD59+EGFP 5

TG8 161 24.09.2001 ca. 4 Mon. weibl. CD59+EGFP 5

TG12 198 19.03.2002 ca. 7 Mon. männl. CD59+NTA 21



TG15 886/16/6 20.08.2002 ca. 32 Mon. weibl. CD59 8



TG20 104 18.12.2002 ca. 25 Mon. männl. CD59+EGFP 8

TG21 237 27.05.2003 ca. 16 Mon. weibl. CD59+NTA 20


TG25 267 10.07.2003 ca. 12 Mon. weibl. CD59+NTA 20

TG26 364/9 15.06.2004 ca. 1 Mon. weibl. CD59+CD55 15x20

TG27 356/1 15.06.2004 ca. 1 Mon. männl. CD59 20

EGFP = Enhanced green flourescent protein

NTA = Transaktivator

n.b. = nicht bekannt


4.2.2 Pathologisch-anatomische und histopathologische Beurteilung Zur Untersuchung gelangten sowohl Foundertiere als auch Tiere der F1- und F2-

Generation.

Zum Zweck der pathologisch-anatomischen Untersuchung wurden die Schweine

mittels Elektroschock betäubt und durch Entblutung über die Vena jugularis getötet.

Anschließend wurden die Tiere seziert und alle Organe und Gewebe makroskopisch

beurteilt.

Für die histopathologische Untersuchung wurden Gewebeproben von folgenden

Organen und Geweben in 10%igem, gepufferten Formalin fixiert: Haut

(Innenschenkel), Skelettmuskulatur (M. gracilis), Herz (linke Ventrikelwand, rechte

Ventrikelwand, Septum), Lunge (Lobus cranialis, Lobus caudalis), Milz, Leber, Niere,

Harnblase, Pankreas, Gehirn (Kleinhirn, Großhirn), Schilddrüse, Lymphknoten (Ln.

pulmonalis, Ln. cervicalis superficialis, Lnn. ileofemorales und Lnn. mesenteriales),

Oesophagus, Magen, Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon und Aorta.

Von den beiden Tieren KO8 und TG25 wurden direkt nach der Tötung der Tiere

Herz, Lunge, Milz, Leber und Niere über zuführende Arterien mit 4°C kalter

Natriumchloridlösung perfundiert, um die Blutgefäße von Plasma zu befreien.

Nach 24 Stunden wurden die Organ- und Gewebeproben in Paraffin eingebettet und

von jedem Paraffinblock wurde ein 4 µm dicker Paraffinschnitt auf Objektträgern

angefertigt, entparaffiniert und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt.

Die histopathologische Auswertung erfolgte an einem Lichtmikroskop (Axioskop, Fa.

Zeiss, Göttingen).

4.2.3 Virologische Untersuchung

Von allen untersuchten Tieren wurde natives Material vom Lobus caudalis der Lunge

und von den Lungenlymphknoten zu Laboklin (Bad Kissingen) geschickt und dort

mittels PCR auf Porzines Circovirus Typ II (PCV II) und Porzines Respiratorisches

und Reproduktives Syndrom Virus (PRRSV) untersucht.


4.3 Ergebnisse und Interpretation

4.3.1 Virologische Untersuchung Es wurden 8 nicht-transgene Kontrolltiere und 17 transgene Tiere der Studie mittels

PCR auf PCV II und PRRSV untersucht.

Davon waren 6 Kontrolltiere (entspricht 75%) und 11 transgene Tiere (entspricht

65%) positiv für PCV II.

PRRSV konnte bei keinem untersuchten Tier nachgewiesen werden.

Die Tabelle 2 gibt einen Überblick über die PCV II – Untersuchungsergebnisse.

Tab. 2: PCV II – Untersuchungsergebnisse

Nicht-transgene Kontrolltiere Transgene Tiere PCV II- positiv KO1, KO2, KO4, KO6, KO7,

KO8 TG1, TG2, TG4, TG5, TG6, TG8, TG18, TG19, TG20, TG21, TG23

PCV II- negativ KO3, KO5 TG7, TG12, TG13, TG14, TG15, TG25

4.3.2 Pathomorphologische Untersuchung

In der pathomorphologischen Untersuchung konnte kein spezifischer Phänotyp für

die hCD59-transgenen Tiere nachgewiesen werden.

Allerdings wurden sowohl bei den nicht-transgenen Kontrolltieren als auch bei den

transgenen Tieren in verschiedenen Organen Läsionen (siehe Tab. 3 und Tab. 4)

festgestellt, die jedoch auf Grund der Tatsache, dass transgene Tiere und nicht-

transgene Kontrolltiere in gleicher Zahl und im gleichen Ausmaß betroffen waren, als

unspezifische Hintergrundpathologie interpretiert wurden.

Dabei ließen sich zwei Arten von Befunden differenzieren:

Einerseits lagen Befunde vor, die lediglich bei Einzeltieren diagnostiziert wurden, wie

z.B. Pneumonie (siehe Abb. 2), Epi- und Perikarditis, mesenteriale Verknöcherungen

(siehe Abb. 3) oder Nierenzysten. Von diesen Einzeltierbefunden waren die nicht-

transgenen Kontrolltiere und die transgenen Tieren in gleichem Ausmaß betroffen.

Eine genaue Auflistung dieser Einzeltierbefunde ist in Tab. 3 dargestellt.


Tab. 3: Einzeltierbefunde

Tier-Nr.

Alter Geschl. Kon-strukt

Linie Makroskopische Befunde Histologische Befunde

KO3 ? männl. - - Hoden: beidseitiger, abdominaler Kryptorchismus

histologische Untersuchung nicht durchgeführt

KO7 ? männl. - - Lunge: im rechten Spitzenlappen mittelgradige, fokale, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie

Lunge: mittelgradige, fokale, chronische, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie mit multifokalen Verkalkungen (siehe Abb. 2)

TG4 ca. 7Monate

männl. CD59 +EGFP

8 Magen: in der Pars proventricularis hochgradige, fokale, chronische, ulzerative Gastritis

Magen: hochgradige, chronische, ulzerative Gastritis mit Ausbildung von Granulationsgewebe Lunge: hochgradige, multifokale, follikuläre Hyperplasie peribronchialer Lymphfollikel

TG7 ca. 4Monate

weibl. CD59 +EGFP

5 Herz: hochgradige, generalisierte, chronische, fibroblastische bis fibröse Epi- und Perikarditis Lunge: geringgradige, multifokale, chronische, fibröse Pleuritis pulmonalis

Herz: hochgradige, chronische, fibröse Epi- und Perikarditis Lunge: geringgradige, chronische, fibröse Pleuritis

TG15 ca. 32Monate

weibl. CD59 8 Leber: mittelgradige, herdförmige, chronische Fibrose der Leberkapsel

Leber: mittelgradige, fokale, chronische Fibrose der Leberkapsel

TG20 ca. 25Monate

männl. CD59 +EGFP

8 ohne besonderen Befund Leber: mittelgradige, multifokale, akute Einzelzellnekrosen von Hepatozyten

TG23 ca. 24Monate

männl. CD55 +NTA

13 Mesenterium: spangenartige, multifokale, Verknöcherungen

Mesenterium: multifokale, chronische, metaplastische Verknöcherungen (siehe Abb. 3)

4 E

igene Ergebnisse: P

athomorphologische C

harakterisierung 40


Zum anderen lagen Befunde vor, die bei mehreren Tieren auftraten und überwiegend

erst in der histologischen Untersuchung auffielen, wie z.B. follikuläre Hyperplasie in

Lymphknoten, Balantidium coli-Befall oder Eisen-Depositionen in den

Ileofemorallymphknoten.

Diese Befunde waren stets lediglich in geringem Grad ausgeprägt und betrafen

wiederum die Kontrolltiere und die transgenen Tiere in gleicher Zahl und in gleichem

Ausmaß. Eine genaue Auflistung der Befunde, die bei mehreren Tieren auftraten, ist

in Tabelle 4 dargestellt.

Eine Auswahl der Läsionen ist in Abb. 4-7 illustriert.

Insgesamt fanden sich keine Hinweise auf einen spezifischen,

pathomorphologischen Phänotyp in den transgenen Tieren. Die Läsionen, die in der

makroskopischen und histologischen Untersuchung diagnostiziert wurden, stellten

lediglich Einzeltierbefunde dar, eine Häufung von spezifischen Befunden konnte

dabei nicht beobachtet werden.

Auch die Läsionen, die in mehreren Tieren beobachtet wurden, waren nicht nur bei

den transgenen Schweinen vorhanden, sondern wurden bei transgenen Tieren und

Kontrolltieren in gleicher Zahl und in gleichem Ausmaß vorhanden.


Tab. 4: Befunde bei mehreren Tieren Organ Histologischer Befund Betroffene Tiere Betroffene

Tiere (%) Haut geringgradige, multifokale, perivaskuläre

Infiltration mit Lymphozyten, Plasmazellen und einzelnen eosionophilen Granulozyten (siehe Abb. 4)

KO1, KO2, KO6, KO7 TG1, TG2, TG5, TG15, TG18, TG19, TG20, TG21

44% KO 47% TG

Leber geringgradige, multifokale, herdförmige Infiltration mit Lymphozyten, Makrophagen und einzelnen neutrophilen Granulozyten (siehe Abb. 5)

KO3, KO4, KO6, KO7, KO8 TG7, TG8, TG12, TG13, TG14, TG15, TG18, TG19, TG20, TG21, TG25

56% KO 58% TG

Niere geringgradige, multifokale, chronische, nichteitrige, interstitielle Nephritis

KO7 TG13, TG20, TG21

11% KO 16% TG

Colon im Lumen geringgradiger Nachweis von Balantidium coli (reaktionslos) (siehe Abb. 6)

KO2 TG5, TG6, TG7, TG18

11% KO 21% TG

Milz gering- bis mittelgradige, multifokale, follikuläre Hyperplasie

KO3

11% KO

multifokale, akute, frische Blutungen KO6, KO7 TG18, TG19, TG22, TG23, TG26

22% KO 26% TG

follikuläre Hyperplasie mit Follikelzentrumsreaktion

KO1, KO2, KO8 TG1, TG2, TG4, TG5, TG13, TG14, TG23, TG26

33% KO 42% TG

Ln. pulmo-nalis

Ödem und Sinushistiozytose KO4, KO6, KO7 TG5, TG7, TG8, TG13, TG15, TG18, TG19, TG21

33% KO 42% TG


KO2, KO3, KO4, KO5, KO6, KO8 TG4, TG5, TG7, TG12, TG13, TG15, TG18, TG19, TG20, TG21, TG23, TG25

67% KO 63% TG

Lnn. mesente-

riales

Ödem und Sinushistiozytose KO4, KO7, KO8, KO9 TG4, TG8, TG13, TG14, TG18, TG19, TG21, TG25, TG26

44% KO 47% TG

multifokale, akute, frische Blutungen TG18, TG19, TG23 16% TG follikuläre Hyperplasie mit Follikelzentrumsreaktion

KO2, KO4 TG4, TG12, TG13, TG14, TG20

22% KO 26% TG

Ödem und Sinushistiozytose KO2, KO3, KO5, KO6, KO7, KO9 TG4, TG5, TG6, TG7, TG8, TG13, TG14, TG26, TG27

66% KO 47% TG

Lnn. ileofe-morales

Eisen-Depositionen frei oder in Makrophagen in den Sinus (Berliner-Blau positiv) (siehe Abb. 7)

KO3, KO5, KO6, KO7, KO9 TG7, TG8, TG15, TG19, TG20, TG23, TG26, TG27

55% KO 42% TG


KO2 TG4

11% KO 5% TG

Ln. cervicalis

cran. superf.

Ödem und Sinushistiozytose KO2, KO4 TG5, TG7, TG8

22% KO 16% TG


Abb. 2: Mittelgradige, fokale, chronische, katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie mit multifokalen Verkalkungen (Pfeil), Tier KO7 (nicht-transgenes Kontrolltier), Balken = 100 µm

Abb. 3: Spangenartige, multifokale, metaplastische Verknöcherungen im Mesenterium (Pfeil), Tier TG23 (hCD55-transgenes Tier), Balken = 100µm


Abb. 4: Geringgradige, multifokale, perivaskuläre Infiltration mit Lymphozyten, Plasmazellen und einzelnen eosinophilen Granulozyten (Pfeile) in der Haut, Tier KO7 (nicht-transgenes Kontrolltier), Balken = 100 µm

Abb. 5: Geringgradige, herdförmige Infiltration mit Lymphozyten und Makrophagen (Pfeil) in der Leber, Tier TG20 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm


Abb. 6: Balantidium coli (Pfeil) im Lumen des Colons, Tier TG18 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm

Abb. 7: Eisendepositionen (Pfeil) im Randsinus des Ileofemorallymphknotens, Tier KO6 (nicht-transgenes Kontrolltier), Balken = 100 µm

46

5 Eigene Ergebnisse: hCD59 - Proteinexpression 5.1 Hintergrund und Bedeutung Die transgenen Tiere tragen das hCD59-Konstrukt, um im Fall einer

Xenotransplantation die hyperakute Abstoßung über eine Hemmung der

Komplementkaskade zu verhindern. CD59 wird normalerweise auf Blutzellen,

Epithelzellen und Endothelzellen exprimiert. Um einen protektiven Effekt gegen die

hyperakute Abstoßung zu erreichen, muss das hCD59-Protein in den transgenen

Organen, vor allem im Endothel, exprimiert werden.

Die Untersuchung der hCD59-Proteinexpression wurde durchgeführt, um

festzustellen, ob das hCD59-Protein exprimiert wird, in welchen Organen und in

welchen Zellen eine Expression vorliegt und ob die Expression konstant in allen

Organen und Tieren aller Linien vorhanden ist.

Dabei war vor allem der letztgenannte Punkt von Interesse, da durch die Herstellung

der Tiere per Mikroinjektion die Möglichkeit bestand, dass jedes Tier einen anderen

Genotyp und damit ein anderes Expressionsmuster aufweist. Zudem war zu klären,

ob der gewählte CMV-Promotor zu einer ubiquitären Expression in allen Organen

führt, oder ob er eine Gewebsspezifität besitzt.

5.2 Experimentelles Design 5.2.1 Material Für die Expressionsanalyse des hCD59-Proteins wurde eine immunhistochemische

Untersuchung mit einem monoklonalen Maus-anti-Human CD59 – Antikörper (Best.-

Nr. 33861A, Klon p282 (H19), Fa. BD PharMingen, Heidelberg) durchgeführt. Alle 19

transgenen und 9 nicht-transgenen Kontrolltiere wurden untersucht. Als

Ausgangsmaterial diente formalin-fixiertes, paraffin-eingebettetes Material von Haut,

Skelettmuskulatur, Herz, Lunge, Milz, Leber, Niere, Harnblase, Pankreas, Gehirn,

Schilddrüse, Lymphknoten (Ln. pulmonalis, Ln. cervicalis superficialis, Lnn.

5 Eigene Ergebnisse: hCD59 - Proteinexpression 47

ileofemorales und Lnn. mesenteriales), Oesophagus, Magen, Duodenum, Jejunum,

Ileum, Colon und Aorta.

Als Positivkontrolle diente humanes Tonsillargewebe. Als Negativkontrolle diente

Gewebe von nicht-transgenen Kontrolltieren und dem hCD55-transgenen (TG23)

Tier.

5.2.2 Herstellung der Multiblöcke Für die immunhistochemische Expressionsanalyse wurden Multiblöcke hergestellt.

Dafür wurden aus den Paraffinblöcken aus vorher markierten Lokalisationen mit

einer Stanze 0,6 mm große Gewebestanzen entnommen und in eine

Paraffinschablone eingesetzt, die dann zu einem Paraffinblock eingeschmolzen

wurde (VON WASIELEWSKI et al., 2002). Pro Organ und Gewebe wurden 2

Stanzproben entnommen. In jedem Multiblock war ein komplettes Spektrum an

Organ- und Gewebeproben eines Tieres enthalten.

5.2.3 Durchführung der immunhistochemischen Färbung An den Multiblöcken wurde eine immunhistochemische Untersuchung mit einem

monoklonalen Maus-anti-Human CD59-Antikörper (Fa. BD PharMingen, Heidelberg)

nach der Tyramin-Amplifikations-Methode (MENGEL et al., 1999) durchgeführt.

Zu diesem Zweck wurden 4 µm dicke Paraffinschnitte von den Multiblöcken auf

Super Frost blau – Objektträger (Fa. Omnilab, Bremen) gezogen. Die Objektträger

wurden für 15 Minuten bei 60°C in einen Wärmeschrank (Heraeus UT 5042 E, Fa.

Heraeus, Hanau) verbracht. Anschließend erfolgte eine Entparaffinierung in Xylol für

2 mal 10 Minuten auf einem Schüttler, dann wurden die Schnitte in einer

absteigenden Alkoholreihe (2x100%ig, 2x95%ig, 1x 70%ig, 1x 50%ig, 1x 20%ig, 3

Minuten je Konzentration) dehydriert und einmalig mit entionisiertem Wasser gespült.

Die Antigendemaskierung erfolgte durch eine 10minütige Inkubation mit Protease

XXIV (21.4 mg auf 50 ml Aqua dest, Fa. Sigma-Aldrich, München) im Wärmeschrank

bei 37°C. Die endogene Peroxidase wurde durch eine 10minütige Inkubation mit

3%igem H2O2 (in Tris/HCl pH 7.5, Ansatz siehe Anhang) blockiert. Eine Hemmung

von unspezifischen Bindungen erfolgte durch eine 10minütige Behandlung mit


Casein (0.5% in Tris/HCl (Ansatz siehe Anhang) Fa. Sigma, München). Um eine

unspezifische Bindung an endogenes Biotin zu hemmen, wurden die Schnitte je 10

Minuten mit Avidin und Biotin (Avidin/Biotin Blocking Kit, Fa. Vector, Burlingame,

USA) inkubiert. Anschließend wurde der monoklonale Maus-anti-Human CD59-

Antikörper (Best.-Nr. 33861A, Klon p282 (H19), Fa. BD PharMingen, Heidelberg) in

der Verdünnung 1:200 (in Bovinem Serumalbumin, BSA/Tris pH 7.6, Ansatz siehe

Anhang) aufgetragen über Nacht bei 4°C inkubiert.

Als Sekundärantikörper wurde ein biotinylierter Ziege-anti-Maus-Antikörper (Fa.

Zytomed, Berlin) in der Verdünnung 1:900 (in Bovinem Serumalbumin, BSA/Tris pH

7.6, Ansatz siehe Anhang) für eine halbe Stunde bei 37°C appliziert. Anschließend

wurden die Schnitte für 30 Minuten mit Horseradish Peroxidase-Komplex (Fa.

Zytomed, Berlin) in der Verdünnung 1:500 in BSA/Tris pH 7.6 (Ansatz siehe Anhang)

inkubiert. Zur Verstärkung der Reaktion erfolgte daraufhin eine Applikation von

biotinyliertem Tyramin mit 0.003%igem H2O2 für 10 Minuten. Dafür wurde eine

Stammlösung aus 6.2 mg Tyramin hydrochlorid (Fa. Sigma, München), 8 ml 50 mM

Boratpuffer pH 8.0 und 20 mg Sulpho-NHS-LC-Biotin (Fa. Pierce, Rockford, USA)

hergestellt und aliquotiert. Von der Stammlösung wurde eine Gebrauchslösung aus

1800 µl Tris/HCl-Puffer pH 7.5 (Ansatz siehe Anhang), 10 µl Tyramin-Stammlösung

und 5.4 µl 3% H2O2 angesetzt und verwandt. Anschließend erfolgte eine 30minütige

Inkubation mit Avidin-biotinylierter alkalischer Phosphatase (Fa. Zytomed, Berlin) in

der Verdünnung 1:300 in Tris-Puffer, pH 7.8 (Ansatz siehe Anhang) im

Wärmeschrank bei 37°C. Zur Anfärbung wurde das Chromogen Fast Red (1 mg

Fast Red Salz auf 1ml Fast Red Puffer, Fa. Sigma-Aldrich, München) verwandt und

für 8 Minuten auf die Schnitte aufgetragen. Anschließend wurden die Schnitte mit

entionisiertem Wasser gewaschen, mit Mayer’s Hämalaun (1:3 verdünnt in

entionisiertem Wasser, Fa. Merck, Darmstadt) für 2 Minuten gegengefärbt, in

fließendem Leitungswasser für 10 Minuten gebläut und anschließend mit 37°C

warmer Kayser’s Glycerin Gelantine (Fa. Merck, Darmstadt) eingedeckt.

Zwischen den einzelnen Reaktionsschritten wurden die Schnitte mit Tris-Puffer pH

7.8 (Ansatz siehe Anhang) gewaschen.


5.2.4 Auswertung Die Auswertung der immunhistochemischen Färbung erfolgte semiquantitativ an

einem Lichtmikroskop (Axioskop, Fa. Zeiss, Göttingen). Dazu wurde ein Score von –

bis +++ benutzt, bei dem eine negative Reaktion mit – bewertet wurde, eine schwach

positive Reaktion in einzelnen (bis ca. 30%) Zellen mit +, eine mittelstark positive

Reaktion in ca. 30-60% der Zellen mit ++ und eine stark positive Reaktion in ca. 60-

100% der Zellen mit +++. Dabei wurde die Art der angefärbten Zellen sowie der

Anteil der positiven Zellen beurteilt. Zeigten Organe oder Gewebe in den

Multiblöcken eine positive Reaktion, so wurde die immunhistochemische Färbung

nochmals an größeren Organ- und Gewebeschnitten durchgeführt, um das

Verteilungsmuster der angefärbten Zellen besser beurteilen zu können. Alle

immunhistochemischen Färbungen und Untersuchungen wurden zweimal

durchgeführt, um eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

5.3 Ergebnisse und Interpretation 5.3.1 hCD59-Proteinexpression Von den 18 untersuchten, hCD59-transgenen Tieren zeigten 13 Tiere eine

Expression des hCD59-Proteins in verschiedenen Organen und Geweben. Dabei

war auffällig, dass keines der Tiere eine hCD59-Proteinexpression in allen Organen

aufwies. Vielmehr zeigten alle untersuchten Tiere die Proteinexpression nur in einem

Teil der Organe und Gewebe. Dabei zeigte sich eine starke Variation der

exprimierenden Organe zwischen den einzelnen Tieren.

Weiterhin ließ sich das bemerkenswerte Phänomen beobachten, dass in den

Kardiomyozyten, der Niere, den Skelettmuskelzellen und der Tunica muscularis des

Ösophagus die hCD59-Proteinexpression ein so genanntes „patchy pattern“ aufwies.

Dieses Muster war dadurch gekennzeichnet, dass sich innerhalb des Gewebes nur

einzelne Zellen anfärbten, während direkt benachbarte Zellen keine Anfärbung

zeigten.


Folgende Zelltypen zeigten eine intrazytoplasmatische, positive Reaktion für das

hCD59-Protein:

In Haut, Herz (siehe Abb. 8), Lunge, Milz, Leber, Niere (siehe Abb. 10), Harnblase,

Gehirn (siehe Abb. 9), Skelettmuskulatur, Ösophagus, Duodenum, Jejunum, Ileum

und Colon war die hCD59-Proteinexpression im Zytoplasma von Endothelzellen

kleiner und mittelgroßer Gefäße nachweisbar.

Das Pankreas einiger Tiere wies eine positive Reaktion im Zytoplasma von Azinus-

Zellen des exokrinen Pankreas und Inselzellen des endokrinen Pankreas auf, wobei

die Azinus-Zellen des exokrinen Pankreas von Tier TG15 ein „patchy pattern“

aufwiesen (siehe Abb. 14).

Im Herz zeigte sich bei einem Tier (TG7) zudem eine Anfärbung des randständigen

Zytoplasmas einzelner Kardiomyozyten („patchy pattern“) (siehe Abb. 12).

In der Niere eines Tieres (TG1) zeigten einzelne Glomerula in den Endothelzellen

der Kapillarschlingen und afferenten Arterien eine positive Anfärbung (siehe Abb.

10). Dabei wiesen aber nur einzelne Glomerula eine Anfärbung auf („patchy

pattern“).

In der Skelettmuskulatur und der Tunica muscularis des Ösophagus einiger Tiere

wiesen die Myozyten ebenfalls eine zytoplasmatische Reaktion im bereits

beschriebenen „patchy pattern“ auf (siehe Abb. 13).

Die Lunge zeigte zudem eine positive Anfärbung der Alveolarepithelzellen Typ I und

Typ II (siehe Abb. 11).

Eine genaue Beschreibung der hCD59-Proteinexpression ist in Tabelle 5 dargestellt.

Bei allen untersuchten nicht-transgenen Kontrolltieren und dem hCD55-transgenen

Tier konnte immunhistochemisch keine hCD59-Proteinexpression nachgewiesen

werden. Dies zeigte, dass der gewählte Antikörper spezifisch für humanes hCD59 ist

und nicht mit porzinem CD59 kreuzreagierte.

Das humane Tonsillargewebe zeigte eine positive Reaktion.


Tab. 5: hCD59-Proteinexpression 5 Eigene E

rgebnisse: hCD

59 – Proteinexpression 51

Haut

Herz

Lunge Milz

Leber

Niere

Harn-blase

Pan-kreas

Gehirn

Skelett-mus-

kulatur

Ösopha-

gus

Duode-

num

Jejunum

Ileum

Colon

TG 1 (hCD59)

+ Endothel

- ++Alveolar- epithel

- - ++Endothel

- - - - - - - - -

TG 4 (hCD59)

- +Endothel

++ Alveolar-epithel

- - - ++Endothel

- - - +Endothel

- - - ++Endothel

TG 6 (hCD59)

++ Endothel

++ Endothel

- + Endothel

+ Endothel

- +Endothel

+++ Azinus-Zellen, endokrin

++ Endothel

- ++Endothel

- + - ++Endothel

TG 7 (hCD59)

+ Endothel

+ Kardio- myozyten

++ Alveolar-epithel

- - - - - - - - - - - -

TG 8 (hCD59)

- ++ Endothel

+++ Alveolar-epithel

- +Endothel

- - +Azinus-Zellen

++ Endothel

- ++Endothel

+ Endothel

- ++Endothel

++ Endothel

TG 15 (hCD59)

++ Endothel

++(+) Endothel

++ Alveolar-epithel

- - ++Endothel

- + Azinus-Zellen

+++ Endothel

++ Endothel

- - - - -

TG18 (hCD59)

+++ Endothel

+ Endothel


- - +Endothel

- - - ++Myozyten

++ Myozyten

- - - ++Endothel

TG 19 (hCD59)

++ Endothel

++ Endothel


- ++Endothel

+ Endothel

- - - +Myozyten

- - - - -

TG 20 (hCD59)

+++ Endothel

+ Endothel

++ Alveolar-epithel

- - +Endothel

- - - - - - - - -

TG 21 (hCD59)

- - - - - - - - - ++Myozyten

++ Myozyten

- - - -

TG 25 (hCD59)

- - - - - - - - - + Myozyten

+ Myozyten

- - - -

TG 26 (hCD59

+ hCD55)

- - - - - - - - - + Myozyten

+ Myozyten

- - - -

TG 27 (hCD59)

- - - - - - - - - +Myozyten

+ Myozyten

- - - -

Zahl und Intensität der positiven Zellen: +++ stark ++ mittel + schwach - negativ


Abb. 8: Positive hCD59-Proteinexpression in Endothelzellen (Pfeil) im Herz, Tier TG8 (hCD59-transgenes Tier, Balken = 100 µm

Abb. 9: Positive hCD59-Expression in Endthelzellen (Pfeil) in der weißen Substanz des Gehirns, Tier TG15 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm


Abb. 10: Positive hCD59-Proteinexpression im Endothel der Glomerulumkapillaren (Pfeil) und im Endothel in einer afferenten Arterie (Pfeilspitze), Tier TG1 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm

Abb. 11: Positive hCD59-Proteinexpression in einem Typ II-Pneumozyt (Pfeil) und Typ I-Alveolarepithelzellen (Pfeilspitze) der Lunge, Tier TG8 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm


Abb. 12: Positive hCD59-Proteinexpression randständig im Zytoplasma eines Kardiomyozyten (Pfeil), mit fehlender Proteinexpression der benachbarten Kardiomyozyten („patchy pattern“), Tier TG7 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm

Abb. 13: Positive hCD59-Proteinexpression in einem Myozyten der Skelettmuskulatur (Pfeil) mit

fehlender Proteinexpression der benachbarten Myozyten („patchy pattern“), Tier TG21 (hCD59-

transgenes Tier), Balken = 100 µm


Abb. 14: Positive hCD59-Proteinexpression in einzelnen Azinus-Zellen des exokrinen Pankreas (Pfeile) mit fehlender Expression in den benachbarten Zellen („patchy pattern“), und negativer Reaktion der Endothelzellen, Tier TG15 (hCD59-transgenes Tier), Balken = 100 µm

56

6 Eigene Ergebnisse: hCD59 – mRNA – Expression 6.1 Hintergrund und Bedeutung Die immunhistochemische Untersuchung hatte ergeben, dass die hCD59-transgenen

Tiere ein sehr inhomogenes Proteinexpressionsmuster zeigten. Alle Tiere

exprimierten das hCD59-Protein nur in einem Teil ihrer Organe und Gewebe, wobei

die exprimierenden Organe und Gewebe zwischen den einzelnen Tieren stark

variierten. Zudem zeigten die Kardiomyozyten, die Skelettmuskelzellen und die

Zellen der Tunica muscularis des Ösophagus mit dem „patchy pattern“ ein sehr

ungewöhnliches Expressionsmuster.

Um zu klären, ob das uneinheitliche Expressionsmuster nur auf der Proteinebene

vorhanden war, oder ob es auf einer ebenso variierenden mRNA-Expression beruht,

wurde eine qualitative mRNA-Expressionsanalyse mittels Reverser Transkriptase -

Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt.

6.2 Experimentelles Design 6.2.1 Material Als Ausgangsmaterial für die hCD59-mRNA-Expressionsanalyse diente formalin-

fixiertes, paraffin-eingebettetes Material von Herz, Lunge, Milz, Leber, Niere,

Pankreas, Gehirn, Skelettmuskulatur und Ösophagus. Zum Zweck der hCD59-

mRNA-Expressionsanalyse wurde eine qualitative Reverse-Transkriptase-PCR

durchgeführt. Alle 18 hCD59-transgenen Tiere wurden untersucht. Dafür wurden aus

dem formalin-fixiertem, paraffin-eingebetteten Material eine RNA-Isolierung (BOCK

et al., 2001) und eine anschließende cDNA-Synthese durchgeführt.

Als Positivkontrollen dienten humanes Nierengewebe sowie Zellen, die mit dem in

die transgenen Schweine mikroinjizierten Konstrukt transfiziert waren. Als

Negativkontrollen dienten Proben, in die bei der cDNA-Synthese keine Reverse

6 Eigene Ergenisse: hCD59 – mRNA - Expression 57

Trankriptase pipettiert wurde (-RT), Proben von einem hCD55-transgenen Schwein

(TG23), Proben von einem nicht-transgenen Kontrolltier (KO5) sowie Proben, in die

keine cDNA gegeben wurde.

6.2.2 Durchführung der RNA-Isolierung Von den Paraffinblöcken wurden 8-10 15 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt und

ohne Entparaffinierung oder Dehydrierung in ein 1.5 ml Eppendorf-Mikro-

Reaktionsgefäß überführt. Dazu wurden 750 µl Digestion solution (Ansatz siehe

Anhang), 5.25 µl beta-Mercaptoethanol (Fa. Merck, Darmstadt) und 300 µl

Proteinase K (20 mg/ml, Merck, Darmstadt) gegeben und im Thermoshaker

(Thermomixer compact, Fa. Eppendorf, Wesseling-Berzdorf) bei 55°C und 1400 rpm

verdaut.

Am nächsten Tag folgte eine Zentrifugation bei 4°C und 13000 g für 5 Minuten,

wodurch die Probe in eine Paraffinkappe, einen klaren Überstand und unverdautes

Material am Boden des Mikro-Reaktionsgefäßs getrennt wurde. 1000 µl Überstand

wurden in ein neues, 2 ml Eppendorf-Mikro-Reaktionsgefäß überführt und 100 µl 3M

Natrium-Acetat mit pH 5.2, 630 µl Roti-Aqua-Phenol (Fa. Roth, Karlsruhe) und 270 µl

Chloroform (Fa. J.T. Baker, Deventer) dazupipettiert. Daraufhin erfolgte eine

15minütige Phasentrennung auf Eis und eine anschließende Zentrifugation bei 4°C

und 13000 g für 20 Minuten. Nach der organischen RNA-Extraktion wurde der

wässrige Überstand in ein neues Eppendorf-Mikro-Reaktionsgefäß überführt und mit

1 Volumen Isopropanol und 1 µl Glykogen als RNA-Carrier versetzt. Die

anschließende Fällung erfolgte über Nacht bei -20°C.

Am darauf folgenden Tag erfolgte eine Zentrifugation bei 4°C und 13000 g für 20-30

Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet mit eisgekühltem,

70%igem Ethanol gewaschen und anschließend unter dem Abzug getrocknet.

Anschließend wurde das RNA-Pellet in 40 µl H2O/DEPC gelöst, mit 4 µl (1/10

Volumen) 3M Natrium-Acetat mit pH 5.2 (Ansatz siehe Anhang) und 110 µl (2,5

Volumen) 100%igem Ethanol versetzt und über Nacht präzipitiert.

Am nächsten Tag erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 4°C und 13000 g für 20-30

Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das RNA-Pellet mit eisgekühltem,


70%igem Ethanol gewaschen und anschließend unter dem Abzug getrocknet.

Anschließend wurde das RNA-Pellet in 40 µl H2O/DEPC gelöst und 2 µl von dem

Ansatz in 98 µl in H2O/DEPC zur Messung der optischen Dichte verdünnt.

Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte mit einem UV-DU®640

Spectrophometer (Fa. Beckmann) bei 260 und 280 nm.

Die nicht verwendete RNA wurde nochmals präzipitiert und bei -20°C gelagert.

6.2.3 Durchführung der cDNA-Synthese Die Konzentration an RNA für die cDNA-Synthese betrug 1 µg RNA / µl H2O/DEPC.

Für den DNAse-Verdau wurden 1 µl RQ1 10x DNAse-Puffer (400mM Tris/HCl,

100mM MgSO4, 10mM CaCl2, Fa. Promega, Mannheim) und 1 µl RQ1 DNAse (pro U

RQ1) (Fa. Promega, Mannheim) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten im

Biometra Personal Cycler (Version 3.26, Fa. Biometra, Göttingen) inkubiert.

Anschließend erfolgte die Zugabe von 1 µl RQ1 stop solution (20mM EGTA, Fa.

Promega, Mannheim) und 1 µl pd(N)6-Random Hexamer (Fa. Amersham, Freiburg)

und eine Inkubation bei 70°C für 10 Minuten im Biometra Personal Cycler. Danach

wurden die Proben für einige Minuten auf Eis gekühlt und je Mikro-Reaktionsgefäß 4

µl 5x1st strand buffer (250mM Tris/HCl, 375mM KCl, 15mM MgCl2, Fa. Invitrogen,

Karlsruhe), 2 µl 0.1M DTT (Dithiothreitol, Fa. Invitrogen, Karlsruhe), 1 µl 10mM dNTP

Mix (je 10 µmol dATP, dCTP, dGTP, dTTP pro 1.0 ml, Fa. Fermentas, St. Leon-Rot)

und 0.5 µl Ribonuclease Inhibitor (40u/µl, Fa. Fermentas, St. Leon-Rot)

hinzugegeben. Es folgte eine Inkubation im Biometra Personal Cycler bei 25°C für 10

Minuten. Anschließend wurde in jedes Mikro-Reaktionsgefäß 1 µl (= 200 U)

Superscript II RNase H- Reverse Transkriptase (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) pipettiert

und im Biometra Personal Cycler bei 42°C für 50 Minuten und dann bei 70°C für 15

Minuten zur Inaktivierung des Enzyms belassen.

Anschließend wurde die cDNA bei -20°C gelagert.


6.2.4 Auswahl der Primer Die Primerpaare für die hCD59-mRNA-Expressionsanalyse mittels RT-PCR wurden

basierend auf dem mikroinjizierten Konstrukt gewählt (siehe Anhang). Dabei

basierten die Sequenzen der Primerpaare auf der Region des Konstruktes, welches

für das hCD59 kodierte (Fa. Sigma-ARK, Steinheim):

Forward Primer hCD59: 5’ GGTCATAGCCTGCAGTGCTACA 3’ (bp 541-562 im

Konstrukt)

Reverse Primer hCD59: 5’ AAATCAGATGAACAATTGACGGC 3’ (bp 595-617 im

Konstrukt)

Das Produkt wies eine errechnete Größe von 77 Basenpaaren auf.

Als Housekeeping-Gen wurde EF1α gewählt (GRUBER und LEVINE, 1997), die

Primerpaare hatten folgende Sequenzen (Fa. Sigma-Genosys, Steinheim):

Forward Primer EF1 α: 5’ CAAAAAYGACCCACCAATGG 3’

Reverse Primer EF1 α: 5’ GGCCTGGATGGTTCAGGATA 3’

Das Produkt wies eine errechnete Größe von 68 Basenpaaren auf (GenBank

Accession number XM203909).

Die Primer wurden mit Hilfe der Primer Express software Version 1.0 (Applied

Biosystems, Foster City, USA) ausgewählt.

6.2.5 Durchführung der Reversen Transkriptase – PCR Für die RT-PCR wurde ein Mastermix mit 25 µl Reaktionsvolumen angesetzt. Der

Einsatz an cDNA betrug 3.0 µg für die hCD59-Analyse und 2.5 µg für die EF1α-

Analyse. Der Mastermix wurde folgendermaßen angesetzt:


Reagenz µl pro Mikro-Reaktionsgefäß

hCD59

µl pro Mikro-Reaktionsgefäß

EF1α

H2O-Ampuwa (dest. Wasser, Fa.

Fresenius Kabi, Bad Homburg)

16.4 µl 15.9 µl

10 x Puffer

(Invitrogen, Karlsruhe)

2.5 µl 2.5 µl

25 mmol MgCl2

(Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

1.5 µl 2.5 µl

10 mM dNTP Mix

(Fa. Fermentas, St. Leon-Rot)

0.5 µl 0.5 µl

Primer F + R (10 pmol/ µl) 1.0 µl 1.0 µl

Platinum Taq DNA Polymerase 5U/ µl


0.1 µl 0.1 µl

cDNA 3.0 µl 2.5 µl

Die Durchführung der RT-PCR erfolgte im Gene Amp Cycler PCR System 9700 (Fa.

PE Applied Biosystems, Foster City, USA) mit folgendem Programm:

94°C 5 Minuten (Aktivierung der Taq-Polymerase und initiale Denaturierung)

94°C 30 Sekunden (Denaturierung der DNA)

60°C 30 Sekunden (Annealing der Primer)

72°C 30 Sekunden (Elongation des Amplifikates)

72°C 5 Minuten (Finale Elongation)

4°C halten

Dabei wurde Schritt 2-4 in 40 Zyklen wiederholt.

Nach der Durchführung der RT-PCR im Cycler wurden die Proben mit Ladepuffer (6x

Loading Dye, 0.09% Bromphenolblau, 0.09% Xylen Cyanol FF, 60% Glycerol, 60mM

EDTA Fa. Fermentas, St. Leon-Rot) gemischt und auf ein 6%iges PAA-Gel

(Polyacrylamid-Gel, Rotiphorese-Gel, Fa. Roth, Karlsruhe, Ansatz siehe Anhang)


aufgetragen. Als Marker wurde pBR 322 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker (Fa. Fermentas,

St. Leon-Rot) verwendet. An das Gel wurde eine Spannung von 160 V angelegt

(GIBCO BRL Electrophoresis Power Supply ST 606, Fa. GIBCO/Invitrogen,

Karlsruhe). Als Puffer wurde 1xTE-Puffer (Ansatz siehe Anhang) verwendet. Das Gel

wurde anschließend für 5 Minuten in Ethidiumbromid (1 ml 1%ige Stammlösung (10

mg/ml, Fa. Roth, Karlsruhe) in 1 Liter H2O) inkubiert, um die Produkte anschließend

auf einem UV-Tisch (Flourescent Table, Fa. Renner GmbH, Dannstadt)

dokumentieren zu können (CCD Module).

6.2.6 Auswertung Die untersuchten Organe und Gewebe wurden anhand der Banden (= PCR-

Produkte) hinsichtlich des qualitativen Expressionsmusters (Nachweis der hCD59-

mRNA in den untersuchten verschiedenen Organen und Geweben) sowie

hinsichtlich der Bandenstärke in den verschiedenen untersuchten Proben beurteilt.

Dabei wurden Organe und Gewebe ohne sichtbare Bande mit – beurteilt, schwache

Banden mit +, mittelstarke Banden mit ++ und starke Banden mit +++. Alle

Untersuchungen wurden zweimal durchgeführt, um eine Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse zu gewährleisten.



6.3.1 EF1α – mRNA - Expression Alle untersuchten hCD59-transgenen Tiere, das hCD55-transgene Tier (TG23) und

das nicht-transgene Kontrolltier (KO5) zeigten eine deutliche Expression von EF1α in

allen untersuchten Organen (siehe Abb. 16). Dieses Ergebnis spricht dafür, dass

mRNA mit den eingesetzten Methoden in allen Organen und Geweben nachweisbar

war.

6.3.2 hCD59 - mRNA – Expression Von den 18 untersuchten hCD59-transgenen Tieren wiesen 3 Tiere (TG18, TG19,

TG25) eine Expression von hCD59-mRNA in allen untersuchten Organen auf.

12 Tiere (TG1, TG2, TG7, TG8, TG12, TG13, TG14, TG15, TG20, TG21, TG26,

TG27) zeigten, wie in der Proteinanalyse, eine hCD59–mRNA–Expression nur in

einem Teil der untersuchten Organe und Gewebe (siehe Abb. 16).

3 Tiere (TG4, TG5, TG6) wiesen in der RT-PCR keine hCD59-mRNA-Expression in

allen untersuchten Organen und Geweben auf.

Die genaue Verteilung der hCD59-mRNA-Expression in den verschiedenen Organen

und Geweben sowie die Bandenstärken sind in Tabelle 6 dargestellt.

Die humanen Nierenproben und die Proben aus den mit dem Konstrukt transfizierten

Zellinien zeigten eine deutliche hCD59-mRNA-Expression.

Das nicht-transgene Kontrolltier, das hCD55-transgene Tier, die Proben ohne

Reverse Transkriptase und die Proben ohne Template waren in allen untersuchten

Organen und Geweben negativ für hCD59-mRNA.

Dies spricht für die Spezifität der verwendeten Primerpaare (siehe Abb. 15).


Tab. 6: hCD59 – mRNA – Expression

Herz Lunge Milz Leber Niere Pan-kreas Gehirn

Skelett-mus-

kulatur Ösopha

-gus

KO5 (Kontr.)

- - - - - - - - -

TG 1 (hCD59)

- - + - +++ - - - -

TG 2 (hCD59)

- - ++ - - - - - -

TG 4 (hCD59)

- - - - - - - - -

TG 5 (hCD59)

- - - - - - - - -

TG 6 (hCD59)

- - - - - - - - -

TG 7 (hCD59)

++(+) ++(+) - ++ - n.d. n.d. - -

TG 8 (hCD59)

- + - ++ - - ++ - -

TG 12 (hCD59)

- + +(+) - + - - - -

TG 13 (hCD59)

- - - - + + - + +

TG 14 (hCD59)

- - ++ ++ ++ + + - -

TG 15 (hCD59)

++ ++ ++ - - - + - ++

TG18 (hCD59)

+++ ++ ++ ++ ++ ++ +(+) +++ +++

TG 19 (hCD59)

++(+) +++ +++ +++ +++ +(+) +++ +++ +++

TG 20 (hCD59)

++ + +++ - +++ - + + ++

TG 21 (hCD59)

+ ++ ++(+) (+) ++(+) - - +++ ++(+)

TG 23 (hCD55)

- - - - - - - - -

TG 25 (hCD59)

++(+) ++ ++ +++ ++ ++ n.d. +++ +++

TG 26 (hCD59

+ hCD55)

- - - - - - - +(+) +

TG 27 (hCD59)

- +(+) - - ++ - - ++ +

Bandenintensität: +++ stark ++(+) stark bis mittel ++ mittel

+(+) mittel bis schwach + schwach (+) sehr schwach

- negativ

n.d. nicht durchgeführt


Abb. 15: Spezifität der verwendeten Primer: positive hCD59-mRNA-Expression (Produkt: 77bp) in der humanen Niere, den hCD59-transfizierten Zellen und den hCD59-transgenen Organen, negative Reaktion in Proben ohne Reverse Transkriptase (-RT), ohne Template und in nicht-transgenen Organen Ethidiumbromid-gefärbtes Polyacrylamidgel, im UV-Licht fotografiert

Abb. 16: Beispiel eines variierendes mRNA-Expressionsmuster in Tier TG14: positive hCD59-mRNA-Expression (Produkt: 77 bp) in Milz, Leber, Niere, Pankreas und Gehirn; keine Expression in Herz, Lunge, Skelettmuskel und Oesophagus; hCD59-Zellen als Positivkontrolle, nicht-transgene Organe und Proben ohne Reverse Transkriptase (-RT) oder ohneTemplate als Negativkontrolle EF1α als Housekeeping-Gen in allen Proben positiv (Produkt: 68 bp) Ethidiumbromid-gefärbtes Polyacrylamidgel, im UV-Licht fotografiert


6.3.3 Vergleich hCD59 – Protein - und mRNA - Expression Vergleicht man die Expression von dem hCD59-Protein mit der Expression der

hCD59-mRNA (Tabelle 7), so wird deutlich, dass es folgende Gruppen gibt:

1) Tiere, bei denen sowohl hCD59-Protein als auch hCD59-mRNA nachweisbar

waren

(TG1, TG7, TG8, TG15, TG18, TG19, TG20, TG21, TG25, TG26)

2) Tiere, bei denen hCD59-mRNA, aber kein hCD59-Protein nachweisbar war

(TG2, TG12, TG13, TG14, TG27)

3) Tiere, bei denen hCD59-Protein, aber keine hCD59-mRNA nachweisbar war

(TG4, TG6)

4) Tiere, bei denen weder hCD59-Protein noch hCD59-mRNA nachweisbar war

(TG5)

Tab. 7: Vergleich Expression von hCD59-Protein und hCD59-mRNA

Tier-Nummer hCD59 - Protein hCD59 - mRNA KO5 (Kontrolle) - - TG1 + Teil der Organe + Teil der Organe TG2 - + Teil der Organe TG4 + Teil der Organe - TG5 - - TG6 + Teil der Organe - TG7 + Teil der Organe + Teil der Organe TG8 + Teil der Organe + Teil der Organe TG12 - + Teil der Organe TG13 - + Teil der Organe TG14 - + Teil der Organe TG15 + Teil der Organe + Teil der Organe TG18 + Teil der Organe + alle Organe TG19 + Teil der Organe + alle Organe TG20 + Teil der Organe + Teil der Organe TG21 + Teil der Organe + Teil der Organe TG23 (hCD55) - - TG25 + Teil der Organe + alle Organe TG26 + Teil der Organe + Teil der Organe TG27 - + Teil der Organe

66

7 Eigene Ergebnisse: hCD59 – DNA – Detektion 7.1 Hintergrund und Bedeutung Die Untersuchung der hCD59-Protein- und hCD59-mRNA-Expression hatte gezeigt,

dass auch in der hCD59-mRNA-Expression ein sehr variables Muster vorherrschte.

Der nächste Schritt lag darin, die hCD59-DNA nachzuweisen, um festzustellen, ob

auch die Konstrukt-DNA nur in einem Teil der Organe nachweisbar war, was auf das

Vorliegen eines Chimärismus in den transgenen Tieren hindeuten könnte. Weiterhin

gab es Tiere, die die hCD59-mRNA, aber nicht das hCD59-Protein exprimierten, was

auf eine Störung, Hemmung oder Blockade der Translation hinweisen könnte. Es war

also von Interesse, ob es auch Tiere gab, in denen hCD59-DNA nachweisbar war,

obwohl die hCD59-mRNA in diesen Organen nicht nachgewiesen werden konnte.

Diese Fragestellung war besonders im Hinblick auf eine mögliche

Trankskriptionsstörung oder –hemmung, oder eine fehlende Transkription

interessant. Und zuletzt existierten auch Tiere, die das hCD59-Protein exprimierten,

obwohl die hCD59-mRNA nicht nachgewiesen werden konnte. Es war zu bedenken,

ob hier vielleicht die mRNA nur eine kürzere Halbwertszeit hatte, oder ob die

Immunhistochemie möglicherweise unspezifisch reagiert hatte.

Aus diesen Gründen wurde an 6 ausgewählten Tieren aus den 3 genannten Gruppen

ein Nachweis der hCD59-DNA durchgeführt, um zu klären, ob die Konstrukt-DNA in

allen Organen und Geweben integriert war, oder ob auch hier eine Variation bestand.

7.2 Experimentelles Design 7.2.1 Material Zum Zweck der hCD59-DNA-Detektion wurde eine qualitative PCR durchgeführt. Als

Ausgangsmaterial diente formalin-fixiertes, Paraffin-eingebettetes Material von Herz,

Lunge, Milz, Leber, Niere, Pankreas, Gehirn, Skelettmuskulatur und Ösophagus. Für

7 Eigene Ergebnisse: hCD59 – DNA - Detektion 67

die hCD59-DNA-Detektion wurden 6 hCD59-transgene Schweine (TG4, TG6, TG8,

TG14, TG18, TG19) exemplarisch untersucht. Dabei handelte es sich bei den Tieren

TG4 und TG6 um Tiere, die das hCD59-Protein exprimierten, aber keine Expression

der hCD59-mRNA gezeigt hatten. TG8 und TG14 waren Tiere, die in der Protein-

und in der mRNA-Analyse eine Expression von hCD59 in einem Teil der Organe

gezeigt hatten. TG18 und TG19 hatten in der Proteinanalyse nur in einem Teil der

Organe positiv reagiert, in der RT-PCR jedoch eine Expression von hCD59-mRNA in

allen Organen gezeigt.

Zunächst wurde DNA isoliert und anschließend eine qualitative PCR durchgeführt.

Als Positivkontrollen dienten Zellen, die mit dem in die transgenen Schweine

mikroinjizierten Konstrukt transfiziert waren. Als Negativkontrollen dienten Proben

von einem nicht-transgenen Kontrolltier (KO5) sowie Proben, in die kein Template

(DNA) gegeben wurde.

7.2.2 Durchführung der DNA – Isolierung Von den Paraffinblöcken wurden 8-10 15 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt und

ohne Entparaffinierung oder Rehydrierung in ein 1.5 ml Eppendorf-Mikro-

Reaktionsgefäß verbracht. Dazu wurden 1000 µl Proteinase K-Puffer (Ansatz siehe

Anhang) und 50 µl Proteinase K (20 mg/ml, Merck, Darmstadt) pipettiert und im

Thermoshaker (Thermomixer compact, Fa. Eppendorf, Wesseling-Berzdorf) bei 55°C

und 1400 rpm verdaut.

Am nächsten Tag folgte eine Zentrifugation bei 4°C und 13000 g für 5 Minuten. 1000

µl Überstand wurden in ein neues 2 ml Eppendorf-Mikro-Reaktionsgefäß überführt

und 750 µl Phenol-Chloroform (Roti-Phenol/C/I, Fa. Roth, Karlsruhe) dazugegeben.

Daraufhin erfolgte eine Zentrifugation bei Raumtemperatur und 13000 g für 10

Minuten. Der wässrige Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Mikro-

Reaktionsgefäß überführt und erneut mit 750 µl Phenol-Chloroform (Roti-Phenol/C/I,

Fa. Roth, Karlsruhe) versetzt und wieder bei Raumtemperatur und 13000 g für 10

Minuten zentrifugiert. Diese Phenol-Chloroform-Extraktion wurde wiederholt, bis

keine weiße Interphase mehr zu sehen war. Dann wurden zu dem klaren Überstand

5 µl RNAse A (10 mg/ml) gegeben und bei 37°C und 800 rpm im Thermoshaker für


45 Minuten inkubiert. Anschließend wurde eine erneute Phenol-Chloroform-

Extraktion durchgeführt. Danach wurde der wässrige Überstand mit 750 µl

Chloroform (Fa. J.T. Baker, Deventer) versetzt und bei Raumtemperatur und 13000 g

für 3 Minuten zentrifugiert. Zu dem Überstand wurden anschließend 1/10 Volumen

3M Natrium-Acetat mit pH 7.0 / 100 µg/ml Dextran (Ansatz siehe Anhang) und 2.5

Volumen 100%iges Ethanol pipettiert und über Nacht bei -20°C eine Fällung

durchgeführt.

Am nächsten Tag erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 4°C und 13000 g für 20-30

Minuten. Der Überstand wurde abgenommen und das DNA-Pellet mit 70%igem

Ethanol gewaschen und anschließend unter dem Abzug getrocknet. Anschließend

wurde das DNA-Pellet in 100 µl 1x TE-Puffer (Ansatz siehe Anhang) gelöst und 2 µl

von dem Ansatz in 98 µl in H2O/DEPC zur Messung der optischen Dichte verdünnt.

Anschließend erfolgte die Messung der optischen Dichte mit einem UV-DU®640

Spectrophometer (Fa. Beckmann) bei 260 und 280 nm. Die DNA wurde mit 1x TE-

Puffer verdünnt, bis sie eine Konzentration von 50 ng/µl aufwies.

Die nicht verwendete DNA wurde anschließend bei -20°C gelagert.

7.2.3 Auswahl der Primer Für die hCD59-DNA-Detektionsanalyse wurden die gleichen Primer wie für die

hCD59-mRNA-Expressionsanalyse benutzt, da das Konstrukt im Gegensatz zum

humanen CD59-Gen keine Introns aufweist. (Fa. Sigma-ARK, Steinheim):

Forward Primer hCD59: 5’ GGTCATAGCCTGCAGTGCTACA 3’ (bp 541-562 im

Konstrukt)

Reverse Primer hCD59: 5’ AAATCAGATGAACAATTGACGGC 3’ (bp 595-617 im

Konstrukt)

Das Produkt wies eine errechnete Größe von 77 Basenpaaren auf.

Als Housekeeping-Gen wurde TNF gewählt (GRIERSON et al., 2004), die

Primerpaare hatten folgende Sequenzen (Fa. Sigma-Genosys, Steinheim):

Forward Primer TNF: 5’ ATAGTATGAGGAGGACTCGCTGAGC 3’

Reverse Primer TNF: 5’ ACATCCCATCTGTCCATGAGGTT 3’


Das Produkt wies eine errechnete Größe von 94 Basenpaaren auf (GenBank

Accession number X54001).

Die Primer wurden mit Hilfe der Primer Express software Version 1.0 (Applied

Biosystems, Foster City, USA) ausgewählt.

7.2.4 Durchführung der PCR Für die PCR wurde ein Mastermix mit 25 µl Reaktionsvolumen angesetzt. Der

Einsatz an DNA betrug 250 ng für die hCD59-Analyse und 250 ng für die TNF-

Analyse. Der Mastermix wurde folgendermaßen angesetzt:

Reagenz µl pro Mikro-Reaktionsgefäß

hCD59

µl pro Mikro-Reaktionsgefäß

TNF

H2O-Ampuwa (dest. Wasser, Fa.

Fresenius Kabi, Bad Homburg)

15.5 µl 14.5 µl

10 x Puffer


2.5 µl 2.5 µl

25 mmol MgCl2


1.5 µl 2.5 µl

10 mM dNTP Mix

(Fa. Fermentas, St. Leon-Rot)

0.5 µl 0.5 µl

Primer (10 pmol/ µl) 1.0 µl 1.0 µl

Platinum Taq DNA Polymerase 5 U/ µl


0.05 µl 0.05 µl

DNA (50 ng/µl) 5.0 µl 5.0 µl


Die Durchführung der PCR erfolgte im Gene Amp Cycler PCR System 9700 (Fa. PE

Applied Biosystems, Foster City, USA) mit folgendem Programm:

94°C 5 Minuten (Aktivierung der Taq-Polymerase und initiale Denaturierung)

94°C 30 Sekunden (Denaturierung der DNA)

60°C 30 Sekunden (Annealing der Primer)

72°C 30 Sekunden (Elongation des Amplifikates)

72°C 5 Minuten (Finale Elongation)

4°C halten

Dabei wurden Schritt 2-4 in 40 Zyklen wiederholt.

Nach der Durchführung der PCR im Cycler wurden die Proben mit Ladepuffer (6x

Loading Dye, 0.09% Bromphenolblau, 0.09% Xylen Cyanol FF, 60% Glycerol, 60mM

EDTA, Fa. Fermentas, St. Leon-Rot) gemischt und auf ein 6%iges PAA-Gel

(Polyacrylamid-Gel, Rotiphorese-Gel, Fa. Roth, Karlsruhe, Ansatz siehe Anhang)

aufgetragen. Als Marker wurde pBR 322 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker (Fa. Fermentas,

St. Leon-Rot) verwendet. An das Gel wurde eine Spannung von 160 V angelegt

(GIBCO BRL Electrophoresis Power Supply ST 606, Fa. GIBCO/Invitrogen,

Karlsruhe). Als Puffer wurde 1xTE-Puffer verwendet (Ansatz siehe Anhang). Das Gel

wurde anschließend für 5 Minuten in Ethidiumbromid (1 ml 1%ige Stammlösung (10

mg/ml, Fa. Roth, Karlsruhe) in 1 Liter H2O) verbracht, um die PCR-Produkte

anschließend auf einem UV-Tisch (Flourescent Table, Fa. Renner GmbH,

Dannstadt) dokumentieren zu können (CCD Module).

7.2.5 Auswertung Die untersuchten Organe und Gewebe wurden anhand der Banden (= PCR-

Produkte) hinsichtlich der qualitativen Detektion (Nachweis der hCD59-DNA in den

untersuchten verschiedenen Organen und Geweben) beurteilt. Dabei wurden

negative Reaktionen (keine Bande) mit – und positive Reaktionen mit + beurteilt. Alle

Untersuchungen wurden zweimal durchgeführt, um eine Reproduzierbarkeit der

Ergebnisse zu gewährleisten.



7.3.1 TNF – Expression In allen untersuchten Tieren konnte in allen untersuchten Organen und Geweben

TNF (siehe Abb. 17) nachgewiesen werden. Dies zeigt, dass die isolierte DNA

vorhanden war.

7.3.2 hCD59 – DNA – Expression Die qualitative PCR zeigte in allen untersuchten Organen und Geweben der 6 Tiere

einen deutlichen Nachweis von hCD59-DNA (siehe Abb. 17).

Das nicht-transgene Kontrolltier zeigte keine hCD59-DNA-Detektion, was für eine

Spezifität der gewählten Primerpaare spricht.

Abb. 17: deutlicher hCD59-DNA-Nachweis (Produkt: 77 bp) in allen untersuchten Organen und Geweben in Tier TG14 (gleiches Tier wie in Abb. 12) TNF als Housekeeping-Gen in allen Proben positiv (Produkt: 94 bp) Ethidiumbromid-gefärbtes Polyacrylamidgel, im UV-Licht fotografiert.


7.3.3 Vergleich hCD59 – Protein, mRNA und DNA Die Detektion der hCD59-DNA zeigte, dass in allen untersuchten Tieren die hCD59-

DNA in allen Organen und Geweben nachgewiesen wurde, unabhängig davon, ob

bei dem jeweiligen Tier hCD59-Protein oder hCD59-mRNA exprimiert wurde oder

nicht. Der genaue Vergleich zwischen der Expression von hCD59- Protein, -mRNA

und –DNA ist in Tabelle 8 aufgeführt.

Tab. 8: Vergleich Expression von hCD59-Protein, -mRNA und -DNA Tier-Nr. Organ hCD59-Protein hCD59-mRNA hCD59-DNA

Herz - - - Lunge - - - Milz - - - Leber - - - Niere - - - Pankreas - - - ZNS - - - Muskel - - -

KO5

Oesophagus - - - Herz + - +++ Lunge + - +++ Milz - - +++ Leber - - +++ Niere - - +++ Pankreas - - +++ ZNS - - +++ Muskel - - +++

TG4

Oesophagus + - +++ Herz + - +++ Lunge - - +++ Milz + - +++ Leber + - +++ Niere - - +++ Pankreas + - +++ ZNS + - +++ Muskel - - +++

TG6

Oesophagus - - +++ Herz + - +++ Lunge + + +++ Milz - - +++ Leber + ++ +++ Niere - - +++ Pankreas + - +++ ZNS + ++ +++ Muskel - - +++

TG8

Oesophagus - - +++


Tier-Nr. Organ hCD59-Protein hCD59-mRNA hCD59-DNA Herz - - +++ Lunge - - +++ Milz - ++ +++ Leber - ++ +++ Niere - ++ +++ Pankreas - + +++ ZNS - + +++ Muskel - - +++

TG14

Oesophagus - - +++ Herz + +++ +++ Lunge + ++ +++ Milz - ++ +++ Leber - ++ +++ Niere + ++ +++ Pankreas - ++ +++ ZNS - +(+) +++ Muskel + +++ +++

TG18

Oesophagus + +++ +++ Herz + ++(+) +++ Lunge + +++ +++ Milz - +++ +++ Leber + +++ +++ Niere + +++ +++ Pankreas - ++ +++ ZNS - +++ +++ Muskel + +++ +++

TG19

Oesophagus - +++ +++ Bandenintensität: +++ stark ++(+) stark bis mittel ++ mittel

+(+) mittel bis schwach + schwach (+) sehr schwach

- negativ

74

8 Diskussion

Der Mangel an humanen Spenderorganen hat in den letzten Jahren zu einem

verstärkten Interesse an Xenotransplantaten geführt. Um die hyperakute Abstoßung

der Xenotransplantate zu verhindern, wurden transgene Schweine erzeugt, die den

humanen Komplementregulator hCD59 als Transgen tragen.

In der durchgeführten Studie wurden die hCD59-transgenen Schweine dahingehend

untersucht, ob sie einen spezifischen, pathomorphologischen Phänotyp aufweisen.

Zudem wurde eine Expressionsanalyse durchgeführt um zu klären, ob und in

welchen Organen und Geweben die hCD59-DNA, die hCD59-mRNA und das

hCD59-Protein nachweisbar ist. Da es sich bei den untersuchten transgenen

Schweinen um Tiere handelte, die zum Zweck der Xenotransplantation generiert

wurden, ist eine starke und möglichst ubiquitäre Expression des Transgens von

entscheidender Bedeutung um eine hyperakute Abstoßung des Xenotransplantates

zu verhindern.

Da das porzine Circovirus Typ II (PCV II) mittlerweile in großen Teilen der

Schweinepopulation verbreitet ist (KRAKOWKA et al., 2001) und zu

pathomorphologischen Läsionen in betroffenen Tieren führen kann, wurden alle

transgenen Schweine und Kontrolltiere mittels PCR auf PCV II und auf das Porzine

Respiratorische und Reproduktionssyndrom Virus (PRRSV) untersucht. 75% der

Kontrolltiere und 65% der transgenen Tiere waren positiv für PCV II, während in

keinem Tier PRRSV nachgewiesen werden konnte. PCV II wurde das erste Mal 1991

in Kanada nachgewiesen und hat sich in großen Teilen der Schweinepopulation

verbreitet. Während die meisten Tiere das Virus tragen, ohne klinische Symptome

oder pathomorphologische Läsionen zu zeigen, kann PCV II unter bestimmten

Bedingungen zu verschiedenen Krankheitsbildern führen. Vor allem nach einer

Aktivierung des Immunsystems kann PCV II zum so genannten Post Weaning

Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS), der wohl bekanntesten PCV II-

assoziierten Erkrankung, führen (KRAKOWKA et al., 2001). Das

pathomorphologische Bild des PMWS umfasst folgende Läsionen: Klinisch fallen die

8 Diskussion 75

betroffenen Tiere durch Kümmern und Ikterus auf. Die Lymphknoten sind

generalisiert vergrößert und zeigen histologisch eine lymphozytäre Depletion mit

Nachweis von Histiozyten und Riesenzellen sowie intrazytoplasmatischen,

basophilen Einschlüssen. Gelegentlich weisen die Lymphknoten auch Nekrosen und

vaskuläre Thromben auf. In der Lunge findet sich eine interstitielle Pneumonie, teils

mit einer lymphatischen Depletion des bronchus-assoziierten lymphatischen

Gewebes (BALT). Die Leber weist lympho-histiozytäre Infiltrationen der Portalfelder,

Einzelzellnekrosen von Hepatozyten, Vakuolisierung von Hepatozyten und

Karyomegalie auf. In einigen Fällen kann es zu schweren Läsionen mit perilobulärer

Fibrose und massivem Verlust von Hepatozyten mit konsekutivem Ikterus kommen.

Zudem können gering- bis mittelgradige, lympho-histiozytäre Infiltrationen in nahezu

allen Organen vorkommen. In den Nieren wird gelegentlich eine interstitielle Nephritis

beobachtet. All diese Läsionen können einzeln oder gemeinsam bei dem PMWS

auftreten. Zu den weiteren Erkrankungen, die PCV II-assoziiert sind, gehören das

porzine Dermatitis und Nephropathie-Syndrom (PDNS), Störungen der Reproduktion,

die proliferative und nekrotisierende Pneumonie (PNP) und der kongenitale Tremor

(SEGALÉS et al., 2004). Die aufgeführten, PCV II-assoziierten Läsionen und

Erkrankungen sind zu berücksichtigen, wenn es um die Bewertung der

pathomorphologischen Untersuchung der transgenen Tiere geht.

Zur weiteren Abklärung eines spezifischen, pathomorphologischen Phänotyps wurde

eine pathologisch-anatomische und histologische Untersuchung der Organe und

Gewebe der transgenen Tiere durchgeführt. Dabei zeigten sich zwei Kategorien von

Veränderungen: Zum einen lagen Läsionen vor, die nur in einzelnen Tieren

diagnostiziert werden konnten, zum anderen gab es Befunde, die bei mehreren

Tieren festgestellt wurden.

Zu den Einzeltierläsionen (Tab. 3) gehören entzündliche Veränderungen, die

höchstwahrscheinlich durch virale oder bakterielle Infektionen verursacht wurden. Im

Vordergrund stehen hier die katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie, die interstitielle

Pneumonie sowie die Pleuritis und Epi- und Perikarditis. Diese entzündlichen

Veränderungen wurden sowohl in einem nicht transgenen Kontrolltier (KO7) als auch

in einem transgenen Tier (TG7) diagnostiziert. Derartige Veränderungen kommen

8 Diskussion 76

regelmäßig in Schweinebeständen vor und sind in der Regel durch Infektionen mit

bakteriellen Erregern bedingt. Bronchopneumonien können beim Schwein durch

verschiedene Bakterien verursacht werden. Pasteurella multiocida, Actinobacillus

pleuropneumoniae, Haemophilus spp., Acarnobacterium pyogenes, Bordetella

bronchiseptica und Salmonella cholerasuis gehören hier zu den am häufigsten

nachzuweisenden Pathogenen (JUBB et al., 1993). Dabei entstehen bakterielle

Infektionen oftmals erst sekundär nach einer primären, viralen Atemwegsinfektion.

Als lungenpathogene Erreger von interstitiellen Pneumonien spielen beim Schwein

vor allem Mycoplasma hyopneumoniae, Influenzaviren, porzines respiratorisches

Coronavirus, PRRSV und PCV II eine Rolle (DAHME, E. u. E. WEISS 1999). Auch

Pleuritis und Epi- und Perikarditis entstehen überwiegend durch bakterielle

Infektionen der Tiere. Hier sind vor allem Haemophilus- und Mycoplasmen-

Infektionen von Bedeutung. Um die genaue Ursache der entzündlichen

Veränderungen in den untersuchten Tieren zu klären, wäre eine mikrobiologische

Untersuchung von nativen Proben der betroffenen Organe nötig gewesen. Da die

Läsionen jedoch chronischer Natur waren und die ursprünglich verantwortlichen

Erreger in solch chronischen Prozessen häufig nicht mehr nachweisbar sind, wurde

auf die Durchführung einer mikrobiologischen Untersuchung verzichtet. Insgesamt

fanden sich jedoch keine Hinweise darauf, dass die transgenen Tiere anfälliger für

Infektionskrankheiten sind, da nur zwei transgene Tiere und auch ein Kontrolltier

fokale, entzündliche Veränderungen aufwiesen. Ein transgenes Tier (TG15) wies

eine fokale Fibrose der Leberkapsel auf. Auch diese Läsion werden in der

Schweinepopulation häufig beobachtet und sind meistens Folge von

Parasitenwanderungen, wie bespielsweise durch Ascaris suum. Derartige

Veränderungen können aber auch auftreten, ohne dass eine klare Ursache gefunden

wird. In den betroffenen Tieren fanden sich keine Parasiten oder andere Hinweise

auf die Ursache der Läsionen, aber auch hier handelte es sich um ein chronisches

Geschehen. Ein Tier (TG4) zeigte eine ulzerative Gastritis. Diese Veränderung stellt

einen regelmäßigen Befund in Schweinebeständen dar und die Ätiologie dieser

Erkrankung ist noch nicht geklärt. Stress und auch die Fütterung der Tiere scheinen

aber in einigen Fällen an der Ätiologie beteiligt zu sein (JUBB et al., 1993). Auch im

8 Diskussion 77

vorliegenden Fall konnte die Ursache der Läsion nicht geklärt werden. Ein

transgenes Schwein (TG23) wies im Mesenterium bandartige Verknöcherungen auf.

Diese mesenterialen Ossifikationen sind ein regelmäßiger Befund im Sektionsgut von

Schweinen. Die Verknöcherung ist wahrscheinlich metaplastischer Natur und die

Ursache für die Metaplasie ist noch nicht geklärt, ein Zusammenhang mit chronisch-

reparativen Prozessen, insbesondere mit Narbenbildungen nach Laparotomien oder

Kastrationen ist jedoch wahrscheinlich (DAHME, E. u. E. WEISS 1999). Das

betroffene Tier war weder kastriert, noch ist bei ihm eine Laparotomie durchgeführt

worden, so dass hier die Ursache der metaplastischen, mesenterialen

Verknöcherungen unklar bleibt. Ein Kontrolltier (KO3) zeigte einen beidseitigen,

abdominalen Kryptorchismus. Dieser Zustand, der durch einen ausbleibenden

Hodenabstieg nach der Geburt entsteht, ist ebenfalls ein regelmäßiger

Spontanbefund in Schweinebeständen. Die Ursache für das Ausbleiben des

Hodenabstiegs ist ebenfalls noch nicht geklärt.

Insgesamt repräsentieren die in der Studie diagnostizierten Einzeltierläsionen das

normale Spektrum der Befunde in Schweinebeständen. Dabei zeigten sowohl nicht

transgene Kontrolltiere als auch transgene Schweine diese Läsionen. Interessant ist

die Frage, warum die Tiere diese Läsionen, besonders die offenbar infektiös

bedingten Veränderungen aufwiesen, obwohl es sich um spezifiziert-pathogen-freie

(SPF) Tiere handelt. Das erklärt sich dadurch, dass SPF-Tiere nicht keimfrei

aufgezogen werden, wie z.B. Gnotobioten, sondern lediglich frei von

anzeigepflichtigen Erkrankungen und spezifischen Keimen sind. Bei den in der

Studie diagnostizierten Läsionen handelt es sich jedoch um Infektionskrankheiten

durch Erreger, die in nahezu allen Schweinepopulationen vorhanden sind und nicht

zu Seuchen oder anzeigepflichtigen Erkrankungen führen. Daher ist es erklärbar,

dass die Tiere, obwohl sie spezifisch-pathogen-frei sind, trotzdem

Infektionskrankheiten aufweisen können. Diese Situation ist dahingehend

problematisch, dass die durchgeführte Studie nicht standardisierbar ist und

undefinierten Bedingungen unterlag. Andererseits spiegelt die Studie dadurch

Feldbedingungen wieder, und zudem liegt durch die Infektionskrankheiten ein

natürlicher Challenge des Phänotyps der Tiere vor. Es ist durchaus denkbar, dass

8 Diskussion 78

ein Phänotyp in einem Tier unter sterilen Bedingungen nicht auftritt, während er bei

einer körperlichen Belastung des Tieres, wie beispielsweise einer

Infektionserkrankung, zum Ausdruck kommt.

Außer den Einzeltierläsionen existierten zudem pathomorphologische Befunde, die in

mehreren Tieren nachgewiesen wurden (Tab. 4).

Dazu zählen unter anderem geringgradige, multifokale, überwiegend lympho-

plasmazelluläre Infiltrationen in der Haut, in der Leber und in der Niere. Derartige

Infiltrationen in diversen Organen werden unter anderem beim Post-weaning-

multisystemic-wasting-syndrome nach einer PCV II-Infektion beobachtet. Die

betroffenen Tiere sind allerdings nur zu einem Teil positiv für PCV II. Auch die PCV

II-negativen Tiere zeigen die herdförmigen Infiltrationen. Derartige geringgradige

Infiltrationen werden allerdings häufig bei histologischen Untersuchungen festgestellt.

Sie haben keine klinische Relevanz und die Ursache ist zumeist unklar. Auch in den

vorliegenden Fällen konnte die Ätiologie der Infiltrate nicht geklärt werden. Weiterhin

zeigten 6 Tiere einen Befall mit Balantidium coli im Colon. Bei Balantidien handelt es

sich um Protozoen, die als Kommensalen im Caecum oder Colon der Tiere leben.

Bei einer Schädigung der Gewebe durch andere Einflüsse können Balantidien

allerdings auch zu einer opportunistischen Invasion führen (JUBB et al., 1993). In

allen betroffenen Tieren der Studie lagen die Balantidien allerdings reaktionslos im

Colonlumen, so dass ihnen höchstwahrscheinlich keine pathogene Bedeutung

zukommt. In der Milz sowie in allen untersuchten Lymphknoten mehrerer Tiere fand

sich eine follikuläre Hyperplasie mit Follikelzentrumsreaktion. Die follikuläre

Hyperplasie der Milz ist Ausdruck der immunbiologischen Leistung dieses Organs

und die Follikelzentrumsreaktion spricht für die Synthese von Antikörpern. Dabei tritt

die follikuläre Hyperplasie zumeist bei chronischen, infektiösen Prozessen auf

(DAHME, E. u. E. WEISS 1999). Einige der Tiere wiesen chronische, entzündliche

Veränderungen in der Lunge oder dem Herzbeutel auf und erklären somit die

lymphatische Aktivierung. Die meisten Tiere jedoch zeigten keinerlei Heinweise auf

infektiöse Prozesse, so dass die follikuläre Hyperplasie in diesen Tieren

wahrscheinlich eher die Reaktion auf allgemeine, unspezifische Reize darstellt. Da

die untersuchten Tiere nicht keimfrei gehalten wurden, hatten sie jederzeit Kontakt zu

8 Diskussion 79

ubiquitären Keimen. Ein weiterer Befund in den untersuchten Lymphknoten war ein

Ödem und eine Sinushistiozytose. Diese Befunde können bei einer PCV II-Infektion

auftreten, aber auch Ausdruck einer unspezifischen Immunstimulation sein. Da die

betroffenen Tiere wieder nur zu einem Teil PCV II-positiv waren, sprechen die

Befunde hier eher für eine allgemeine, unspezifische Immunantwort. In den

Ileofemorallymphknoten von einigen Tieren fanden sich multifokal Siderophagen

(Berliner-Blau positiv) in den Randsinus. Dieses Phänomen resultiert daraus, dass

Ferkeln in den ersten Lebenstagen eine Eisensubstitution in die Kniefalte verabreicht

wird, um einer Anämie vorzubeugen. Bei den Siderophagen in den Lymphknoten

handelt es sich also um Makrophagen, die das injizierte Eisen phagozytiert haben.

Die Siderophagen in Lymphknoten werden regelmäßig angetroffen und stellen einen

Nebenbefund ohne klinische Relevanz dar. Weiterhin fanden sich in den

Lymphknoten mehrerer untersuchter Tiere multifokale, frische Blutungen. Da es sich

um ein akutes Geschehen ohne Hinweise auf Blutresorption handelte, ist dieser

Befund wahrscheinlich agonal im Rahmen der Tötung der Tiere entstanden.

Obwohl mehr als die Hälfte der untersuchten Tiere positiv für PCV II waren, fanden

sich keine Hinweise auf ein klinisch oder pathologisch manifestes PMWS. In Bezug

auf Xenotransplantationen muss jedoch berücksichtigt werden, dass PCV II eine

potentielle Zoonose für den Transplantatempfänger darstellt (HATTERMANN et al.,

2004). Daher sollten alle potentiellen Organspender auf mögliche Zoonoseerreger,

wie z.B. PCV II untersucht werden.

Insgesamt zeigen sowohl die Einzeltierbefunde als auch die Befunde in mehreren

Tieren kein bestimmtes Muster, so dass keine Hinweise auf einen spezifischen,

pathomorphologischen Phänotyp vorliegen. Dafür spricht auch, dass nicht-transgene

Kontrolltiere und transgene Tiere in gleicher Anzahl und im gleichen Ausmaß von

den Läsionen betroffen sind.

Die Ergebnisse der Expressionsanalyse der transgenen Tiere zeigten, dass die

hCD59-DNA in allen untersuchten Tieren nachweisbar war. Die hCD59-mRNA und

das hCD59-Protein hingegen zeigten eine starke Variabilität in ihrer Expression. Die

Expression variierte dabei sowohl zwischen den verschieden Linien als auch

8 Diskussion 80

zwischen verschiedenen Tieren der gleichen Linie. Auch innerhalb eines Tieres

wiesen die einzelnen Organe eine stark unterschiedliche Expression auf.

Die Tatsache, dass in allen untersuchten transgenen Tieren hCD59-DNA

nachgewiesen werden konnte, spricht für eine erfolgreiche Integration des

Konstruktes in das porzine Genom. Dass die Negativkontrollen und das untersuchte

nicht-transgene Kontrolltier keine DNA-Detektion zeigten, spricht für die Spezifität der

Primer und lässt falsch-positive Ergebnisse in den transgenen Tieren sehr

unwahrscheinlich erscheinen. Das wirft die Frage auf, warum das Konstrukt zwar

erfolgreich in das porzine Genom integriert wurde und zu einem ubiquitären hCD59-

DNA-Nachweis führt, aber nicht zu einer ebensolchen ubiquitären RNA- und Protein-

Expression.

Eine mögliche Erklärung für die inkonsistente Expression des Transgens ist der

Einfluss von Positionseffekten. Die in der Studie untersuchten Schweine wurden

mittels Mikroinjektionstechnik generiert. Bei dieser Methode erfolgt die Integration

des Konstrukts in das porzine Genom rein zufällig und daher ist nicht

vorauszusehen, ob benachbarte Gene einen Einfluss auf das integrierte Transgen

und seine Expression haben. Positionseffekte können eine Expression des

Transgens völlig hemmen, aber auch zu einem unerwarteten Expressionsmuster

führen. Weiterhin ist es möglich, dass bestimmte Regionen des Genoms eher zu

einer Transgenexpression führen als andere (CLARK et al., 1994). Um zu klären, ob

Positionseffekte eine Rolle bei der Expression des benutzten hCD59-Transgens

spielen, müsste in jedem Tier analysiert werden, an welchen Lokalisationen des

porzinen Genoms das Transgen integriert wurde. Da dies bislang nicht untersucht

wurde, kann eine Beteiligung von Positionseffekten an dem inkonsistenten

Expressionsmuster nicht ausgeschlossen werden. FESTENSTEIN et al. konnten

1996 zwei Arten von Positionseffekten unterscheiden: Einerseits eine verringerte

Expression in allen Geweben, andererseits eine variierende Expression, bei der das

Gen nur in einem Teil der Zellen exprimiert wird. Das zuletzt genannte Phänomen ist

in der Literatur bereits wiederholt als „Variegation“ beschrieben worden. Die

Variegation wurde bereits in Drosophila und Hefen beschrieben, wo eine Variation

der Genexpression mit einer Translokation von einem normalen, euchromatischen

8 Diskussion 81

Gen zu einem im Centromer gelegenen Heterochromatin korreliert war

(EISSENBERG, J. C., 1989; ALLSHIRE et al., 1994). FESTENSTEIN et al. konnten

1996 mittels Floureszenz in situ Hybridisierung in transgenen Mäusen zeigen, dass

in Mauslinien mit einer variierenden Expression das Transgen in

heterochromatischen Regionen nahe des Centromers lokalisiert war. Weiterhin

konnte diese Arbeitsgruppe zeigen, dass eine Inaktivierung von Genen mit einer

geschlossenen Chromatin-Konfiguration korrelierte. Dies spricht dafür, dass eine

Integration des Transgens im heterochromatischen Centromer, sowie eine

geschlossene Chromatin-Konfiguration zu einer gestörten Expression und damit zur

Variegation führen. Eine Lösung dieses Problems könnten Locus control regions

(LCR) sein. Dabei handelt es sich um Sequenzen, die zu einer starken und

gewebsspezifischen Expression des Transgens, unabhängig von Positionseffekten

führen. FESTENSTEIN et al. zeigten 1996, dass transgene Mäuse, die zusätzlich zu

dem Transgen eine flankierende LCR trugen, keine Variegation zeigten, auch wenn

das Transgen im Centromer lokalisiert war. Dabei führte die LCR wahrscheinlich zu

einer offenen statt einer geschlossenen Chromatin-Konfiguration. Ob die variierende

Expression in der Studie mit einer Lokalisation des Transgens im Heterochromatin

verbunden war und es sich bei der Variation um eine echte Variegation handelt,

wurde nicht untersucht. Es ist aber denkbar, dass derartige Positionseffekte eine

Rolle bei der inkonsistenten mRNA- und Proteinexpression spielen.

Ein weiterer Mechanismus, der die Transgenexpression negativ beeinflussen kann

ist die DNA-Methylierung. Durch eine Methylierung von bestimmten Regionen in der

DNA kommt es zu einer reversiblen Ausschaltung dieser Gene (TYCKO, 1997).

Mehrere Studien konnten bereits zeigen, dass die Methylierung mit der integrierten

Kopienzahl des Transgens zunimmt. So könnte die Anzahl der Kopien über eine

verstärkte Methylierung einen Einfluss auf die Expressionsstärke oder das

Expressionsmuster haben. Ob dieser Mechanismus im vorliegenden Fall

verantwortlich ist, konnte jedoch nicht geklärt werden, da eine Methylierungsanalyse

nicht durchgeführt wurde. Die Anzahl der Transgenkopien könnte auch auf rein

quantitativen Weg einen positiven Einfluss auf die Expression haben, indem z.B.

mehr integrierte Transgenkopien zu einer stärkeren Expression führen (CLARK et al.,

8 Diskussion 82

1994). Durch die erhöhte Anzahl von Kopien wäre auch der Transktivator mehrfach

integriert, und da dieser zu einer verstärkten Expression führt, wäre auch eine

Beeinflusung der Expression auf diesem Weg denkbar. Eine quantitative Analyse der

hCD59-mRNA ist geplant, es liegen jedoch noch keine konkreten Ergebnisse vor.

In transgenen Mäusen wurden Locus control regions (LCR) identifiziert, die zu einer

starken und gewebsspezifischen Expression von Transgenen in den Mäusen geführt

haben. Durch die LCRs ist die Expression dabei unabhängig von der

Integrationsstelle des Transgens und kann so Positionseffekten entgegenwirken.

Weiterhin ist bekannt, dass der Promotor einen großen Einfluss auf die Expression

des Transgens hat. Viele Promotoren besitzen eine Gewebsspezifität und führen nur

in bestimmten Organen zu einer Expression des Transgens (FODOR et al., 1994,

COWAN et al., 1998). Der in dieser Studie gewählte CMV-Promotor induzierte in

früheren Studien eine starke und ubiquitäre Expression in Zelllinien und transgenen

Mäusen (BOSHART et al., 1985; FURTH et al., 1991), und auch NIEMANN et al.

wiesen 2001 mit dem CMV-Promotor eine Expression von hCD59 in vielen, wenn

auch nicht in allen Organen und Geweben nach. Ein weiterer Grund, der gegen eine

Gewebsspezifität des CMV-Promotors als alleinige Ursache der variierenden

Expression spricht, ist die Tatsache, dass die Expression der hCD59-mRNA und des

Proteins nicht auf bestimmte Organe oder Gewebe begrenzt ist, sondern variierend

in allen untersuchten Organen und Geweben nachgewiesen werden konnte. Dies

lässt auf eine ubiquitäre Expression des CMV-Promotors schließen, erklärt aber nicht

die starken Variationen zwischen den einzelnen Tieren und den verschiedenen

Organen und Geweben.

Eine weitere denkbare Ursache für die uneinheitliche Expression ist die Ausbildung

eines Chimärismus in den transgenen Tieren in dem Sinne, dass das Konstrukt nicht

in Zellen aller Organe und Gewebe integriert wurde, sondern nur ein einem Teil der

Zellen vorhanden ist. Diese Hypothese ist jedoch äußerst unwahrscheinlich, da die

hCD59-DNA in allen untersuchten Organen und Geweben nachgewiesen wurde, was

für eine erfolgreiche Integration des Konstruktes spricht. Zudem wären von einem

Chimärismus nur Tiere der F1-Generation betroffen, da sich bei erneuter Kreuzung

der Tiere der Chimärismus aufheben würde. In der Studie fand sich das variierende

8 Diskussion 83

Expressionsmuster jedoch sowohl in Tieren der F1-Generation als auch in Tieren der

F2-Generation.

Einige Tiere wiesen in einem Teil der Organe zwar eine Expression der hCD59-

mRNA auf, exprimierten in diesen Organen jedoch nicht immer das hCD59-Protein.

Eine genaue Ursache hierfür wurde nicht gefunden, aber es ist denkbar, dass die

mRNA zwar transkribiert, aber nicht translatiert wurde.

Da die hCD59-DNA in allen untersuchten Tieren nachgewiesen wurde, die

Expression der mRNA und des Proteins jedoch stark schwankte, liegt wahrscheinlich

eine Störung der Transkription und/oder der Translation in den Tieren vor. Eine

genaue Ursache oder ein Mechanismus dieser Störung konnte jedoch in den

untersuchten Tieren bislang nicht geklärt werden.

Bei zwei Tieren (TG4, TG6) wurde immunhistochemisch zwar hCD59-Protein

nachgewiesen, aber keine hCD59-mRNA. Auch in den Tieren mit einer variierenden

mRNA- und Proteinexpression zeigten einige Organe eine Proteinexpression ohne

den Nachweis von mRNA. Die Synthese des Proteins ist jedoch nur möglich, wenn

entsprechende mRNA vorhanden ist.

Eine mögliche Erklärung für diese widersprüchlichen Ergebnisse ist, dass die

hCD59-mRNA und das hCD59-Protein möglicherweise unterschiedliche

Halbwertszeiten haben. Wenn das Protein eine längere Halbwertszeit besitzt, wäre

es möglich, dass das Protein noch nachweisbar ist, obwohl die mRNA bereits

abgebaut ist. Da bislang nichts über die Halbwertszeiten von hCD59-mRNA und -

Protein bekannt ist, kann diese Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden.

Eine weitere Möglichkeit ist, dass die Immunhistochemie zum Teil falsch positive

Ergebnisse geliefert hat. Während die Anfärbung der Kardiomyozyten und der

Myozyten im Skelettmuskel eindeutig positiv war, war die Anfärbung des Endothels

auf Grund einer unspezifischen Anfärbung des Blutplasmas nicht immer eindeutig.

Da es sich bei den Organen und Geweben, in denen das Protein, aber nicht die

mRNA nachgewiesen wurde, immer um endotheliale Proteinexpression handelte,

kann die Möglichkeit einer falsch positiven Anfärbung nicht ausgeschlossen werden.

8 Diskussion 84

Um diese Möglichkeit zu überprüfen, wurden die Organe von zwei Tieren (KO8,

TG25) direkt nach der Organentnahme perfundiert, um die Blutgefäße von

Blutplasma zu befreien und dadurch eine unspezifische Anfärbung zu verhindern.

Auf Grund der Organgröße war eine vollständige Perfusion, vor allem der kleineren

Blutgefäße jedoch nicht möglich, so dass die Möglichkeit einer unspezifischen

Anfärbung auch auf diesem Weg nicht völlig ausgeschlossen werden konnte.

Ein weiteres Phänomen, das bei der Expressionsanalyse beobachtet wurde, ist das

so genannte „patchy pattern“ der hCD59-Proteinexpression im Herz, Skelettmuskel

und der Niere von einigen Tieren. Dabei zeigten einige Zellen der Organe eine

deutliche hCD59-Proteinexpression, während direkt benachbarte Zellen keine

Proteinexpression aufwiesen (Abb. 12, Abb. 13, Abb. 14). Ein ähnliches

Expressionsmuster beobachteten auch CHARREAU et al. 1996 in hCD59-

transgenen Ratten. Die Ratten dieser Studie exprimierten das hCD59 ebenfalls unter

der Kontrolle eines CMV-Promotors. Insgesamt zeigten die transgenen Ratten von

CHARREAU et al. 1996 eine starke hCD59-Proteinexpression in vielen Organen und

Geweben, wie z.B. im Pankreas, Herz, Gehirn, Niere, Skelettmuskel und dem

Intestinaltrakt. Im Gegensatz zur vorliegenden Studie wiesen die Tiere jedoch kein

hCD59-Protein in Endothelzellen auf. Zudem wurde immunhistochemisch ein

„patchy pattern“ des Proteins im Herz und in der Niere nachgewiesen. Auch

BASKAR et al. wiesen ein sehr variables Expressionsmuster nach Einsatz eines

CMV-Promotors nach. In ihrer Studie konstruierten sie lacZ-transgene Mäuse, die

das Transgen unter der Kontrolle des HCMV (human cytomegalovirus) MIEP (major

immediate-early Promotor) Promotors exprimierten. Immunhistochemisch konnten

sie das lacZ-Protein nur in 19 von 29 untersuchten Organen und Geweben

nachweisen, wobei Herz und Muskel ein „patchy pattern“ aufwiesen (BASKAR et al.,

1996).

Diese Expressionsmuster ähneln dem Expressionsmuster des hCD59-Proteins

hinsichtlich des „patchy patterns“ in der vorliegenden Studie, wenn auch die

Verteilung der Proteinexpression in den verschiedenen Organen und Geweben nicht

identisch ist. Da in den aufgeführten Studien ebenfalls ein CMV-Promotor die

8 Diskussion 85

Expression des Transgens kontrollierte, ist es gut denkbar, dass dieser Promotor

eine gewisse Zellspezifität besitzt, die in dem eigentümlichen „patchy pattern“ zum

Ausdruck kommt. Bislang ist nicht bekannt, welche Kriterien die positiven Zellen von

den negativen Zellen unterscheiden, so dass ungeklärt bleibt, auf welche Zelltypen

sich die Spezifität bezieht. Um das Pänomen des „patchy patterns“ auszuschalten,

könnte die Verwendung eines anderen Promotors sinnvoll sein.

Auch die Verteilung der Transgenexpression nach Einsatz eines CMV-Promotors ist

in den verschiedenen Studien sehr unterschiedlich. Auch COWAN et al. konnten

1998 zeigen, dass das Expressionsmuster eines Transgens stark von dem

eingesetzten Promotor abhängt. Das humane Cytomegalovirus ist in der Lage, ein

großes Spektrum an Organen und Geweben zu infizieren (z.B. Zellen in

Speicheldrüse, Lunge, Leber, Pankreas, Niere, Auge, Ohr, Plazenta,

Verdauungstrakt, Herz, Ovarien, Nebennieren, Gehirn, Schilddrüse und Haut). Dabei

befällt das Cytomegalovirus die unterschiedlichsten Zelltypen, unter anderem auch

Endothelzellen und Epithelien (FIELDS 2001). Diese Fähigkeit des Cytomegalovirus,

ein großes Spektrum an Zelltypen, Organen und Geweben zu infizieren, macht man

sich zunutze, um mit Hilfe des Cytomegalovirus-Promotors eine möglichst ubiquitäre

Expression des Transgens zu erreichen. Obwohl die Untersuchungen zur

Transgenexpression nach Einsatz des CMV-Promotors unterschiedlicher

Arbeitsgruppen bislang unterschiedliche Verteilungsmuster aufwiesen, konnte in der

vorliegenden Studie eine Expression des hCD59-Proteins in nahezu allen

untersuchten Organen und Geweben nachgewiesen werden.

Die Expression des hCD59-Proteins in Endothelzellen ist von besonderer Bedeutung

für den protektiven Effekt des Transgens. NIEMANN et al. konnten 2001 bereits an

den in der Studie verwendeten transgenen Tieren nachweisen, dass das hCD59 in

Fibroblasten und Endothelzellen aus der Aorta der transgenen Schweine zu einer

erheblich herabgesetzten Sensitivität gegenüber humanen Antikörpern und

humanem Komplement führte. Weiterhin zeigten Nieren der transgenen Tiere bei

einer ex vivo Perfusion mit humanem Blut eine deutlich längere Überlebenszeit als

Nieren von nicht-transgenen Kontrolltieren. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass

das eingesetzte hCD59-Transgen einen protektiven Effekt bietet.

8 Diskussion 86

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in der Studie untersuchten hCD59-

transgenen Schweine durch die Integration der humanen DNA keinen spezifischen,

pathomorphologischen Phänotyp entwickelten.

Die hCD59-DNA konnte in allen untersuchten Organen und Geweben nachgewiesen

werden, was für eine erfolgreiche Integration des eingesetzten Konstrukts in das

porzine Genom spricht.

Die Expression der hCD59-mRNA und des hCD59-Proteins wies jedoch eine starke

Variabilität zwischen den verschiedenen Linien, zwischen Tieren einer Linie sowie

zwischen verschiedenen Organen und Geweben jedes einzelnen Tieres auf. Zudem

wurde in der Skelettmuskulatur, im Herz und in der Niere ein so genanntes „patchy

pattern“ der Proteinexpression beobachtet.

Diese stark variierende Expression ist ein Problem, das vor dem Einsatz der Tiere für

Xenotransplantationen noch gelöst werden muss, da die Organe, die keine hCD59-

Proteinexpression aufweisen, wahrscheinlich hyperakut abgestoßen würden.

Das eingesetzte Transgen konnte in bereits durchgeführten Versuchen

Schweinenieren vor einer hyperakuten Abstoßung durch humanes Blut schützen

(NIEMANN et al., 2001), doch eine akute Abstoßung der Organe konnte nicht

verhindert werden.

Vor einem erfolgreichen Einsatz von transgenen Schweineorganen für die

Xenotransplantation ist noch viel Forschungsarbeit erforderlich, doch vielleicht kann

der Einsatz anderer Promotoren, die Etablierung von α-1-3-Galactosyltransferase

knockout-Schweinen oder der Einsatz mehrerer Transgene zu weiteren Fortschritten

auf dem Gebiet der Xenotransplantation führen.

87

9 Zusammenfassung

Stefanie Deppenmeier

Pathomorphologische Phänotypisierung und Expressionsanalyse von hCD59-transgenen Schweinen für Xenotransplantationen

Der Mangel an humanen Spenderorganen für Transplantationen hat in den letzten

Jahren zu einem gesteigerten Interesse an der Xenotranplantation von

Schweineorganen geführt. Um eine hyperakute Abstoßung der porzinen

Spenderorgane zu verhindern, wurden mittels Mikroinjektion transgene Schweine

konstruiert, die ein Konstrukt mit dem humanen Komplementregulator hCD59 unter

der Kontrolle eines Cytomegalovirus (CMV)-Promotors tragen. Dieses Konstrukt soll

die Abstoßung des Spenderorgans über eine Hemmung der Aktivierung der

Komplementkaskade verhindern.

Die durchgeführten Untersuchungen ergaben keinen Hinweis auf einen spezifischen,

pathomorphologischen Phänotyp der transgenen Tiere. Einige Tiere zeigten

pathomorphologische Läsionen, die jedoch als „unspezifische“ Hintergrundpathologie

interpretiert wurden. Alle untersuchten Tiere wiesen eine Detektion der hCD59-DNA

in allen untersuchten Organen und Geweben auf. Die hCD59-mRNA und das

hCD59-Protein zeigte eine breite Verteilung in den untersuchten Organen und

Geweben und konnte in Herz, Lunge, Milz, Leber, Niere, Pankreas, Gehirn,

Skelettmuskel und Verdauungstrakt nachgewiesen werden. Dabei variierte die

Expression der mRNA und des Proteins stark zwischen den verschiedenen Linien,

zwischen Tieren einer Linie sowie zwischen verschiedenen Organen und Geweben

jedes einzelnen Tieres. Im Herz, in der Niere und im Skelettmuskel zeigte die

Expression zudem ein „patchy pattern“, indem sich nur einzelne Zellen der Organe

distinkt positiv anfärbten. Es ist möglich, dass für dieses Expressionsmuster die so

genannte „Variegation“ verantwortlich ist, die durch eine Translokation eines Gens

verursacht wird und bereits in Hefen, Drosophila und Mäusen beschrieben wurde.

9 Zusammenfassung 88

Die ubiquitäre hCD59-DNA-Detektion spricht für eine erfolgreiche Integration des

hCD59-Konstrukts, während die mRNA- und Protein-Expression eine starke

Variation aufweist. Insgesamt führt der eingesetzte CMV-Promotor jedoch zu einer

weitreichenden Expression des Transgens in den verschiedenen Organen und

Geweben.

Insgesamt ist der Einsatz der transgenen Schweine für Xenotransplantationen

problematisch, solange das hCD59-Protein ein variierendes Expressionsmuster

aufweist, da Organe und Gewebe die das Protein nicht exprimieren wahrscheinlich

hyperakut abgestoßen würden.

89

10 Summary

Stefanie Deppenmeier

Pathomorphologic phenotyping and expression pattern analysis of hCD59-transgenic pigs designed for xenotransplantation

The shortage of human donor organs in recent years has led to an increasing interest

in the xenotransplantation of porcine organs. To prevent the hyperacute rejection of

the porcine donor organs, transgenic pigs were designed via microinjection of a

cytomegalovirus (CMV)-Promotor driven construct that contained the human

complement regulator hCD59. This construct should overcome the rejection of the

donor organ by inhibiting the activation of the complement cascade.

The accomplished examinations gave no hints to a specific pathomorphologic

phenotype in the transgenic animals. Some animals showed pathomorphologic

lesions, but these were interpreted as background pathology. All animals examined

had a detection of hCD59-DNA in all organs and tissues examined. The hCD59-

mRNA and the hCD59-protein showed a wide distribution in the organs and tissues

examined and could be detected in heart, lung, spleen, liver, kidney, pancreas, brain,

skeletal muscle and the intestinal tract. The mRNA und protein expression showed a

large variation between animals of different lines, between animals of one line and

between different organs and tissues of individual animals.

In addition, in heart, kidney and skeletal muscle the protein expression showed a

patchy expression pattern with only single positively staining cells within the organs.

It is possible, that the so called „variegation“, which is caused by a translocation of a

gene and was described already in yeast, Drosophila and mice, is responsible for

the described expression pattern.

The ubiquitous hCD59-DNA detection demonstrates the successful integration of the

hCD59-construct, whereas the expression of the mRNA and the protein shows a

large variation. All in all the CMV-Promotor leads to an extensive expression of the

transgene in different organs and tissues.

10 Summary 90

Taken together, the application of transgenic pigs is problematic as long as the

hCD59-protein has a varying expression pattern, since organs and tissues which do

not express the protein would probably be rejected hyperacutely.

91

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119

12 Anhang 9.1 Tris-Puffer Stammlösung:

121.14 g Trishydroxymethyl-aminomethan (Fa. Merck, Darmstadt)

in 1700 ml entionisiertem Wasser lösen

pH 7.6 einstellen

9 ml Tween20 hinzufügen

auf 2000 ml mit entionisiertem Wasser auffüllen

Gebrauchslösung:

350g NaCl pro analysis (Fa. Merck, Darmstadt)

+ 16 l entionisiertem Wasser

+ 2 l Tris-Stammlösung

auf 20 l auffüllen

9.2 Tris/HCl-Puffer 8.16 g NaCl pro analysis (Fa. Merck, Darmstadt)

+ 12.1 g Trishydroxymethyl-aminomethan (Fa. Merck, Darmstadt)

+ 700 ml Aqua dest.

pH 7.5 einstellen mit 37%iger HCl

auf 1000 ml auffüllen

9.3 Digestion solution 100 g Guanidin Thiocyanat (Fa. Fluka, Seelze)

+ 6 ml 1M Tris/HCl (pH 7.6)

+ 4.2 ml 97%iges Natrium-N-Lauryl-Sarcosine

auf 200 ml mit H2O/DEPC auffüllen

12 Anhang 120

9.4 3M Na-Acetat pH 5,2 24.6 g Na-Acetat in 80 ml H2O/DEPC lösen

pH 5.2 mit konzentrierter Essigsäure einstellen

mit H2O/DEPC auf 100 ml auffüllen

9.5 3M Na-Acetat pH7 /100 µg/ml Dextran 50 ml 3M Na-Acetat pH7 (Fa. Sigma, Seelze)

+ 25 µl 20%iges Dextran T500000

9.6 Proteinase K-Puffer 25 ml Trishydroxymethyl-aminomethan (Fa. Merck, Darmstadt) pH 8.1 100 mM

+ 24.65 ml H2O

+ 100 µl 0.5 M EDTA

+ 250 µl Tween20

9.7 1xTE-Puffer 270 g Trishydroxymethyl-aminomethan (Fa. Merck, Darmstadt)

+ 137 g Borsäure

+ 100 ml 0.5 M EDTA pH 8

auf 20 l mit entionisiertem Wasser auffüllen

9.8 6%iges PAA-Gel 6%ige PAA-Stammlösung:

78 ml 38% Acrylamid-Stocksolution (Rotiphorese-Gel 40, Fa. Roth, Karlsruhe)

+ 50 ml 10xTBE für Polyacrylamid-Gele

+ 371 ml entionisiertes Wasser

12 Anhang 121

Gel:

30 ml 6%ige PAA-Stammlösung

+ 375 µl 10%iges Ammoniumpersulfat (Fa. AppliChem, Darmstadt)

+ 15 µl Tetramethylethylendiamin (Fa. Fluka, Seelze)

15 Minuten polymerisieren lassen

Füllung der Gelkammer mit 10xTBE-Puffer für Acrylamidgele

9.9 10xTBE-Puffer für Acrylamidgele 54 g Tris

+ 27.5 g Borsäure

+ 20 ml 0.5M EDTA pH8

mit destiliertem Wasser auf 500 ml auffüllen

9.10 BSA/Tris-Puffer 12.1 g Tris

+ 35 g NaCl

+ 9 ml Tween

+ 20 g Bovines Serumalbumin (Fa. Biomol, Hamburg)

mit entionisiertem Wasser auf 2 l auffüllen

pH 7.6 einstellen

12 Anhang 122

9.11 Ausschnitt aus der hCD59/NTA-Konstruktsequenz CTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG AGAAAATGGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC 60

TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG TTTACCACTC CCTATCAGTG ATAGAGAAAA 120

GTGAAAGTCG AGTTTACCAC TCCCTATCAG TGATAGAGAA AAGTGAAAGT CGAGTTTACC 180

ACTCCCTATC AGTGATAGAG AAAAGTGAAA GTCGAGTTTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG 240

AGAAAAGTGA AAGTCGAGTT TACCACTCCC TATCAGTGAT AGAGAAAAGT GAAAGTCGAG 300

CTCGGTACCC GGGTCGAGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGCC TATATAAGCA GAGCTCGTTT 360

AGTGAACCGT CAGATCGCCT GGAGACGCCA TCCACGCTGT TTTGACCTCC ATAGAAGACA 420

CCGGGACCGA TCCAGCCTCC GCGGCCCCGA ATTCAGGTTC TGTGGACAAT CACAATGGGA 480

ATCCAAGGAG GGTCTGTCCT GTTCGGGCTG CTGCTCGTCC TGGCTGTCTT CTGCCATTCA 540

GGTCATAGCC TGCAGTGCTA CAACTGTCCT AACCCAACTG CTGACTGCAA AACAGCCGTC 600

AATTGTTCAT CTGATTTTGA TGCGTGTCTC ATTACCAAAG CTGGGTTACA AGTGTATAAC 660 hCD59

AAGTGTTGGA AGTTTGAGCA TTGCAATTTC AACGACGTCA CAACCCGCTT GAGGGAAAAT 720

GAGCTAACGT ACTACTGCTG CAAGAAGGAC CTGTGTAACT TTAACGAACA GCTTGAAAAT 780

GGTGGGACAT CCTTATCAGA GAAAACAGTT CTTCTGCTGG TGACTCCATT TCTGGCAGCA 840

GCCTGGAGCC TTCATCCCTA AGTCAACACC AGGAGAGCTT CTCCCAAACT CCCCGTTCCT 900

GCGTAGTCCG CTTTCTCTTG CTGCCACATT CTAAAGGCTT GATATTTTCC AAGCTTTTAA 960

AACAGCTCTG GGGTTGTACC CACCCCAGAG GCCCACGTGG CGGCTAGTAC TCCGGTATTG 1020

CGGTACCCTT GTACGCCTGT TTTATACTCC CTTCCCGTAA CTTAGACGCA CAAAACCAAG 1080

TTCAATAGAA GGGGGTACAA ACCAGTACCA CCACGAACAA GCACTTCTGT TTCCCCGGTG 1140

ATGTCGTATA GACTGCTTGC GTGGTTGAAA GCGACGGATC CGTTATCCGC TTATGTACTT 1200

CGAGAAGCCC AGTACCACCT CGGAATCTTC GATGCGTTGC GCTCAGCACT CAACCCCAGA 1260 IRES-Sequenz

GTGTAGCTTA GGCTGATGAG TCTGGACATC CCTCACCGGT GACGGTGGTC CAGGCTGCGT 1320

TGGCGGCCTA CCTATGGCTA ACGCCATGGG ACGCTAGTTG TGAACAAGGT GTGAAGAGCC 1380

TATTGAGCTA CATAAGAATC CTCCGGCCCC TGAATGCGGC TAATCCCAAC CTCGGAGCAG 1440

GTGGTCACAA ACCAGTGATT GGCCTGTCGT AACGCGCAAG TCCGTGGCGG AACCGACTAC 1500

TTTGGGTGTC CGTGTTTCCT TTTATTTTAT TGTGGCTGCT TATGGTGACA ATCACAGATT 1560

GTTATCATAA AGCGAATTGG ATTGCGGCCG CATGTCTAGA TTAGATAAAA GTAAAGTGAT 1620

TAACAGCGCA TTAGAGCTGC TTAATGAGGT CGGAATCGAA GGTTTAACAA CCCGTAAACT 1680

CGCCCAGAAG CTAGGTGTAG AGCAGCCTAC ATTGTATTGG CATGTAAAAA ATAAGCGGGC 1740

TTTGCTCGAC GCCTTAGCCA TTGAGATGTT AGATAGGCAC CATACTCACT TTTGCCCTTT 1800

AGAAGGGGAA AGCTGGCAAG ATTTTTTACG TAATAACGCT AAAAGTTTTA GATGTGCTTT 1860

ACTAAGTCAT CGCGATGGAG CAAAAGTACA TTTAGGTACA CGGCCTACAG AAAAACAGTA 1920 Transaktivator-Gen

TGAAACTCTC GAAAATCAAT TAGCCTTTTT ATGCCAACAA GGTTTTTCAC TAGAGAATGC 1980

ATTATATGCA CTCAGCGCTG TGGGGCATTT TACTTTAGGT TGCGTATTGG AAGATCAAGA 2040

GCATCAAGTC GCTAAAGAAG AAAGGGAAAC ACCTACTACT GATAGTATGC CGCCATTATT 2100

ACGACAAGCT ATCGAATTAT TTGATCACCA AGGTGCAGAG CCAGCCTTCT TATTCGGCCT 2160

TGAATTGATC ATATGCGGAT TAGAAAAACA ACTTAAATGT GAAAGTGGGT CCGCGTACAG 2220

CCGCGCGCGT ACGAAAAACA ATTACGGGTC TACCATCGAG GGCCTGCTCG ATCTCCCGGA 2280

CGACGACGCC CCCGAAGAGG CGGGGCTGGC GGCTCCGCGC CTGTCCTTTC TCCCCGCGGG 2340

ACACACGCGC AGACTGTCGA CGGCCCCCCC GACCGATGTC AGCCTGGGGG ACGAGCTCCA 2400

CTTAGACGGC GAGGACGTGG CGATGGCGCA TGCCGACGCG CTAGACGATT TCGATCTGGA 2460 Poly-A

CATGTTGGGG GACGGGGATT CCCCGGGTCC GGGATTTACC CCCCACGACT CCGCCCCCTA 2520

…

123

14 Danksagung

Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. Hans Kreipe für die Bereitstellung des

interessanten Themas bedanken sowie für die fachliche Unterstützung und die

hilfreichen Anregungen.

Ich danke auch den anderen Mitgliedern meiner Betreuungsgruppe, Prof. Dr. Achim

Gruber, Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen und Prof. Dr. Heiner Niemann für ihr

Interesse an meinem Projekt und die anregenden Diskussionen in netter

Atmosphäre.

Bei Prof. Dr. Achim Gruber möchte ich mich außerdem für seine tiermedizinisch-

fachliche Unterstützung bedanken sowie für die Möglichkeit, in seiner Arbeitsgruppe

mitzuarbeiten.

Ich bedanke mich auch bei Prof. Dr. Oliver Bock für die geduldige Hilfe und fachliche

Beratung bei der PCR und für die Unterstützung im Endspurt dieser These.

Dr. Michael Mengel danke ich für die Hilfe bei der Etablierung der

Immunhistochemie.

Christina Koop, Sanja Galgoci und Martina Erbs möchte ich für die geduldige und

unermüdliche Unterstützung im Labor und die nette Arbeitsatmosphäre danken.

Ich bedanke mich bei meinen Mädels für eine tolle Zeit im Studium, die mir

unvergesslich bleiben wird.

Ich danke meiner Familie für die jahrelange liebevolle Unterstützung und Ermutigung

und das Verständnis bei allen Herausforderungen auf meinem bisherigen Weg.

Und last but not least bedanke ich mich bei Olli für seine große Geduld und

Hilfsbereitschaft und dafür, dass er immer da ist um mich wieder aufzumuntern.

Pathomorphologische Phänotypisierung und ... · Organ, im Schnitt 85% für ein Jahr, 65% für 5...

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