Peptid-Funktionalisierte

Gold(III)-Komplexe

als Substrat für

Matrix-Metalloprotease 2

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Chemie und Biochemie

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

M. Sc. Jan Christoph Dittrich

aus Meerbusch

Bochum Oktober 2013

Diese Arbeit wurde zwischen Oktober 2009 bis zum Oktober 2013 unter Anleitung von Herrn

Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte im Lehrstuhl für Anorganische Chemie I − Bioanorganische

Chemie in der Fakultät für Chemie und Biochemie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.

Referent: Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte

Koreferent: Prof. Dr. Ingo Ott

Tag der mündlichen Prüfung: 29.November 2013

Meiner Familie

Danksagung

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Nils Metzler-Nolte danke ich herzlich für das Thema, das mir entgegenge-

brachte Vertrauen, die anregenden fachlichen Diskussionen und alle großartigen Gespräche.

Herrn Prof. Dr. Ingo Ott für seine Bereitschaft bei meiner Dissertation als Koreferent zur Ver-

fügung zu stehen und alle die gute Zeit die ich mit ihm und seiner Arbeitsgruppe auf Konfe-

renzen verbringen durfte.

Meinen Praktikanten Frau Barbara Hoffknecht, Frau Maike Wiemann, Herrn Martin Strack,

Frau Janine Parthier, Herrn Florian Seidel und Herrn Dennis Pache möchte ich für ihre Mithil-

fe beim Anfertigen der Verbindungen danken und die gute Zeit die wir im Labor verbracht

haben.

Frau Prof. Dr. Chiara Chabrele und insbesondere Frau Saskia Neukirchen danke ich für die

Möglichkeit mit dem Syro Multiple Peptide Synthesizer der Firma Syro 2000 zu arbeiten und

mir bei dem Gerät mit Rat und Tat zur Seite zu stehen.

Frau Prof. Dr. Martina Havenith-Newen und ganz besonders Frau Dr. Meike Mischo danke

ich für das Anfertigen und Auswerten der Ramanspektren. Herrn Dr. Pablo Nieto danke ich

für die Berechnungen der Schwingungsbande, welche eine Auswertung erst möglich gemacht

haben.

Herrn Dr. Klaus Merz danke ich für die Messung der Röntgenstrukturdaten und seine Hilfe

bei der Auswertung.

Frau Nicole Ray danke ich für ihre Hilfe bei allen administrativen Problemen.

Herrn Dr. Bauke Albada danke ich für seine Hilfe mit den HPLC-Anlagen und guten fachli-

chen Gespräche.

Frau Andrea Ewald danke ich für ihren Einsatz rund um das ESI-Massenspektrometer, für die

Messungen die sie für mich angefertigt hat und ganz besonders für ihren schnellen Reparatu-

ren, wenn doch mal etwas defekt war.

Danksagung

Frau Anna Sosniak und Frau Barbara Hoffknecht danke ich für alle angefertigten MALDI-

Spektren.

Herrn Jochen Lügger danke ich ganz herzlich für seinen Einsatz bei allen technischen Prob-

lemen im Labor und den Erklärungen die ich zusätzlich dazu erhalten habe.

Frau Annegret Knüfer möchte ich meinen Dank für ihre Anstrengungen aussprechen, für alle

Reparaturen am Liberty Mikrowellen Peptid Synthesizer

Dr. Christiane Klare danke ich für ihr Engagement für mehr Sicherheit im Labor.

Herrn Gregor Barchan und Herrn Martin Gartmann danke ich für ihren Einsatz bei allen

NMR-Spektrometern.

Frau Sabine Bendix danke ich für die Messungen der Elementaranalyse.

Den Mitgliedern des Lehrstuhles für Anorganische Chemie I danke ich für die angenehme

Arbeitsatmosphäre mit vielen spannenden wissenschaftlichen Diskussionen und ganz beson-

ders danke ich Herrn Dr. Nicola Alzakhem, Frau Anna Sosniak und Frau Jessica Wahsner, die

mich beim anfertigen des schriftlichen Teils der Arbeit besonders unterstützt haben.

Und nicht zuletzt danke ich meiner Familie und meinen Freunden, die mich sehr unterstützt

haben.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ........................................................................................................................... 1 2. Aufgabenstellung ............................................................................................................. 12 3. Ergebnisse ........................................................................................................................ 14

Der Gold(III)-Komplex ........................................................................................................ 14

Mögliche Modifizierung zur Kopplung von Peptiden ......................................................... 15

Funktionalisierung des Phenylringes ................................................................................... 16

Einfügung einer Alkylkette .............................................................................................. 18

Methylester ....................................................................................................................... 20

Funktionalisierung des Pyridinringes ................................................................................... 21

Transmetallierung ............................................................................................................. 23

Verwendung von Bipyridin als Ligand ............................................................................ 23

Peptide ...................................................................................................................................... 26

Bindung der Peptide direkt zum Gold(III)-Zentrum ........................................................ 26

HSAB Prinzip ....................................................................................................................... 26

Austausch der Chloridliganden ............................................................................................ 26

Suche nach einem Peptidbindungsmotive ........................................................................ 27

Zusammenfassung der Suche nach einem Peptidbindungsmotive ................................... 29

Stabilitätstest in der Abspaltlösung ...................................................................................... 29

Ergänzung des Bindungsmotives um einen geladen Peptidteil ............................................ 30

Orthogonal geschützt Glutaminsäure ................................................................................... 32

Kupferkatalysierte [3+2] Cycloaddition ............................................................................... 32

[3+2] Cycloaddition der Teilsequenzen ........................................................................... 34

Zusammenfassung [3+2] Cycloaddition der Teilsequenzen ............................................ 36

[3+2] Cycloaddition der kompletten Sequenz .................................................................. 36

Zusammenfassung [3+2] Cycloaddition der kompletten Sequenz ................................... 38

Bessere Löslichkeit in Wasser .............................................................................................. 38

Zusammenfassung Bessere Löslichkeit in Wasser ........................................................... 41

300 potentielle Bindungsmotive ........................................................................................... 41

Bindenden Aminosäuren .................................................................................................. 42

Abstandsaminosäuren ....................................................................................................... 43

Aufbau der Sequenz ......................................................................................................... 43

Synthese ........................................................................................................................... 44

Analyse ............................................................................................................................. 45

Inhaltsverzeichnis

II

Farbe der Harzkugeln ....................................................................................................... 45

Farbe im Fluoreszenzmikroskop ...................................................................................... 45

Ramanspektroskopie ........................................................................................................ 46

Auswertung des 300 Peptide Projekts .................................................................................. 49

Auswertung der Farbe ...................................................................................................... 49

Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie ........................................................................ 50

Auswertung der Ramanspektren ...................................................................................... 51

Diskussion zu dem 300 Peptideprojekt ............................................................................ 52

Stabilität in Lösung .............................................................................................................. 53

Zusammenfassung des 300 Peptideprojekts ..................................................................... 58

Mehr Abstandsaminosäuren ................................................................................................. 58

Bindung über eine α-Helix ............................................................................................... 64

Erhöhung der Löslichkeit in Wasser ................................................................................ 66

Zusammenfassung der Kettenverlängerung ..................................................................... 68

16 Peptide ............................................................................................................................. 69

[3+2] Cycloaddition mit dem stabilen Bindungsmotiv ........................................................ 72

Andere Bindungsmotive in der [3+2] Cycloaddition ....................................................... 74

Zusammenfassung der [3+2] Cycloaddition mit dem stabilen Bindungsmotiv ............... 79

[3+2] Cycloadditionen ohne Kupferkatalysator ................................................................... 79

Orthogonale Bindung über ein Imin ..................................................................................... 83

Direkter Weg ........................................................................................................................ 85

4. Zusammenfassung ............................................................................................................ 90 5. Experimentalteil ............................................................................................................... 94

Material ................................................................................................................................ 94

Methoden .............................................................................................................................. 96

Synthesen ............................................................................................................................. 98

Synthese von 2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid 1 ..................................................... 98

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichlorid 2 ................................................. 99

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-säure 3 ...................................................................... 100

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-säure-1´-gold(III)trichlorid 4 ................................... 101

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-acrylsäure 6 .............................................................. 102

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäure 7 ........................................................... 103

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäure-1-gold(III)trichorid 8 ........................... 104

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-acrylat 10 .................................................................. 105

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester 11 ...................................... 106

Inhaltsverzeichnis

III

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester-1-gold(III)trichorid 12 ...... 107

Synthese von 4-Brom-2-Phenylpyridin 14 ..................................................................... 108

Synthese von 4-Brom-2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichorid 15 .................................... 110

Synthese von 2-Phenylquinolin-4-methylcarboxylat-1´-chloromercury 17................... 111

Synthese von Methyl-6,6´-dimethyl-[2,2´-bipyridin]-4-carboxylat-1-gold(III)trichloride

19 .................................................................................................................................... 112

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´-golddiaceatat 20 .................................................... 113

Synthese von 2-Phenylpyridin-1-gold(III)tribromid 650 ............................................... 114

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´gold(II)dibromid 651 .............................................. 115

Synthese von Tetraethylammoniumtetrachloroaurat(III) ............................................... 116

Synthese von Tetraethylammoniumtetrabromoaurat(III) ............................................... 117

Synthese von Tetraethylammoniumphenyltrichloroaurat(III) 652................................. 118

Synthese von Tetraethylammoniumphenyltribromoaurat(III) 653 ................................ 119

Synthese von Pyridin-1-gold(III)trichlorid 654 ............................................................. 120

Synthese von Pyridin-1-gold(III)tribromid 655 ............................................................. 121

Synthese von Bipyridin-1,1´gold(III)dichlorid tetrachloroaurat(III) 656 ...................... 122

Synthese von Bipyridin-1,1´gold(III)dibromid tetrabromoaurat(III) 657 ...................... 123

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)ethanditihol 658 ........................................ 124

Peptide: ............................................................................................................................... 125

Festphasen Peptidsynthese ............................................................................................. 126

Kopplung von AuPhPyCl2 mit Peptiden ............................................................................ 134

Vor dem 300 Peptidprojekt ............................................................................................ 134

[3+2] Cycloaddition ....................................................................................................... 135

300 Peptidprojekt ........................................................................................................... 136

Nach dem 300 Peptidprojekt .......................................................................................... 137

Literatur .................................................................................................................................. 140 Anhang ................................................................................................................................... 146

Nomenklatur ................................................................................................................... 146

300 Peptidprojekt ........................................................................................................... 147

Abkürzungen

IV

Abkürzungen

A, Ala Alanin

Ac Acetat

AcO2 Acetanhydrid

ACN Acetonitril

AuPhPyCl2 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichlorid

AS Aminosäure

B, Pal3 3-(3-Pyridin)-alanin

Boc tert-Butylcarbamat

C, Cys Cystein

°C Grad Celsius

cm-1

reziproke Zentimeter

CPP cell-penetrating peptides

d Duplett

D, Asp Asparaginsäure

δ chemische Verschiebung

Δ, Aib 2-Aminoisobutansäure

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

dd Duplett vom Duplett

DET Diethylether

DFT Dichtefunktionaltheorie

DIBAL Diisobutylaluminiumhydrid

DIPEA N,N-Diisopropylethylamin

Dmab 4-((1-4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-methybutyl)amino)-benzyl

DMF N,N-Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DMSO-d6 deuteriertes Dimethylsulfoxid

DNS Desoxyribonukleinsäure

E, Glu Glutaminsäure

ECM Extrazellularmatrix

EDT 1,2-Ethandithiol

ESI Elektrosprayionisation

EtOH Ethanol

F, Phe Phenylalanin

FDA Food and Drug Administration

Fmoc 9-Fluorenylmethyl

g Gram

G, Gly Glycin

Γ Methyladipoylchlorid

Gew.-% Massenprozent

h Stunde

H, His Histidin

HBTU

2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexafluorophosphate

HIV Humane Immundefizienz-Virus

H2O Wasser

Abkürzungen

V

HOBT 1-Hydroxybenzotriazole

HP homing peptide

HPLC high performance liquid chromatography

HSAB hard and soft acids and bases

Hz Hertz

J Kopplungskonstante

J, Pal4 3-(4-Pyridin)-alanin

K, Lys Lysin

KHMDS Kaliumhexamethyldisilizan

l Liter

L, Leu Leucin

LC liquid chromatography

m Multiplett

mW Megawatt

M molar

M, Met Methionin

MALDI matrix assisted laser desorption ionization

MB Macro Beads

mbar Millibar

MeOH Methanol

mg Milligram

MHz Megahertz

min Minuten

ml Milliliter

mm Millimeter

µl Mikroliter

µm Mikromter

mmol Millimol

MMP Matrix-Metalloproteasen

mol Mol

MS Massenspektroskopie

m/z Masse geteilt durch die Ladung

nm Nanometer

NMR nuclear magnetic resonance

NMP N-Methyl-2-pyrrolidon

O Azidoessigsäure

OtBu tertiäre-Butylgruppe

P, Pro Prolin

Π, Pen 4-Pentinsäure

Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl

PDA photo diode array

PhPy 2-Phenylpyridin

ppm parts per million

% Prozent

q Quartett

R, Arg Arginin

RNS Ribonukleinsäure

RT Raumtemperatur

s strong

Abkürzungen

VI

Die Peptide der Gold(III)-Biokonjugate werden im Einbuchstabencode und die gesamte Ver-

bindung wird ohne Ladung aus Gründen der Übersichtlichkeits wiedergegeben.

s Singulett

SPPS solid phase peptide synthesis

t Triplett

TBTA Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin)

TBTU O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium tetrafluoroborat

t-Butanol 2-Methyl-2-propanol

td Triplett vom Duplett

TFA trifluoroacetic acid

THF Tetrahydrofuran

TIS Triisopropylsilan

TOF time of flight

Trt Triphenylmethyl

UV Ultraviolett

Vol.-% Volumenprozent

w weak

Y, Tyr Thyrosin

Z, Dap 2,3-Diaminopropionsäure

Einleitung

Seite | 1

1. Einleitung

In Deutschland wird traditionell zwischen der organischen und der anorganischen Chemie

unterschieden. Die organische Chemie ist demnach die Chemie der belebten, die anorganische

Chemie, die der unbelebten Materie. 1828 zeigte Friedrich Wöhler jedoch schon, dass sich der

organische Harnstoff aus den beiden anorganischen Edukten Ammoniumsulfat und

Kaliumcyanat darstellen lässt.1

Viele Metalle, die der anorganischen Chemie zugerechtet werden, werden von den Lebewesen

auf diesem Planeten genutzt. Zum einen sind dies die Alkali und Erdalkali Elemente Natrium,

Magnesium, Kalium und Calcium, die unter anderem als Elektrolyte eine entscheidende Rol-

le spielen und letzteres natürlich entscheidend für den Knochenaufbau ist.2-4

Zum anderen

sind dies Übergangsmetalle wie Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Kobalt, Kupfer, Zink und

Molybdän. Diese machen nur einen geringen Prozentsatz der Masse eines Lebewesens aus,

sind jedoch von entscheidender Bedeutung für das jeweilige Lebewesen. Das jeweilige Metall

besitzt besondere Eigenschaften, welche so von keinem anderen Element geboten werden.5-8

Als Beispiel kann hier das Eisen angeführt werden. 4-5 g enthält der menschliche Körper

durchschnittlich. Es gibt diverse eisenhaltige Enzyme wie Peroxidasen, Zytochrome und die

Katalase, es kommt in Eisentransportern wie dem Transferrin vor, es liegt gespeichert im

Ferritin und Hämosiderin vor, und Eisen ist zur temporären Sauerstoffbindung im Myoglobin

und Hämoglobin vorhanden.9

Die menschlichen Hämoglobintypen haben sich zum Beispiel im Verlauf der Evolution zu

einem hervorragenden Sauerstofftransporter entwickelt. Es bindet Sauerstoff bei einem hohen

Sauerstoffpartialdruck und einem relativ hohen pH-Wert. Sinkt der Partialdruck und der pH-

Wert, dann wird das vorher gebundene Sauerstoffmolekül wieder abgeben. So kann der Sau-

erstoff von der Lunge mit hohem Sauerstoffpartialdruck in Bereiche mit geringem Partial-

druck, wie den Muskeln, transportiert werden. Mit einem Anstieg der Kohlenstoffdioxidkon-

zentration im Blut sinkt der pH-Wert, was eine Sauerstoffabgabe durch das Hämoglobin wei-

ter begünstigt.10

Das Hämoglobin besteht aus jeweils zwei verschiedenen Untereinheiten. Die eine Unterein-

heit wird als α, die andere als β bezeichnet. Jeweils zwei verschiedene Untereinheiten bilden

ein Dimer, zwei Dimere bilden das Hämoglobin. Jede Untereinheit wird aus 141 bis 146

Einleitung

Seite | 2

Aminosäuren gebildet. Die Untereinheit besteht zusätzlich noch aus einem Hämmolekül. Im

Zentrum dieses Moleküls befindet sich ein Eisen(II)-Ion, welches von den vier Stickstoffato-

men der Porphyrine in der äquatorialen Ebene gehalten wird.

N

NN

N

Fe

OH

O

OH

O

Abbildung 1-1: Hämmolekül

Zusätzlich hält die Aminosäure Histidin, das Eisenion in axialer Ebene. Die letzte freie Bin-

dungsstelle am Eisen wird für die end-on Sauerstoffbindung genutzt. Die Untereinheit kann in

einer deoxygenierten Form vorliegen, die so genannte T-Form (tense) und in der R-Form

(relaxed), die dann oxygeniert ist. In der T-Form wird das Eisen(II)-Ion aus der äquatorialen

Ebene der Porphyrine zum Histidin hin verschoben. Durch die Bindung eines Sauerstoffmo-

leküls an das Eisen(II)-Ion wird diese zum Eisen(III)-Ion oxidiert und der Ionenradius des

Eisens nimmt ab. Das Eisen befindet sich durch die Oxidierung in der R-Form. Der kleinere

Ionenradius der R-Form sorgt dafür, dass sich das Eisen(III)-Ion in der Ebene befindet, wobei

ein weiteres Histidin eine Wasserstoffbrückenbindung zum end-on am Eisen gebundenen

Sauerstoff ausbildet und damit die Bewegung des Eisens unterstützt.11

+ O2

- O2 N

NN

NFe

OO

OO R4

R3

HNOR2

NH

N

O

R1

HN

OR5

N

NO

R6

OO

H

N

NN

N FeOO

OO R4

R3

HNOR2

NH

N

O

R1

HN

OR5

N

NO

R6

H

Abbildung 1-2: Wirkungsweise von Hämoglobin

Einleitung

Seite | 3

Durch Veränderungen der Umgebung, wie dem pH-Wert und der Sauerstoffkonzentration,

wird die quartäre Struktur des Proteins beeinflusst und eine Bindung in Bereichen mit hoher

Sauerstoffkonzentration nach dem oben beschriebenen Prinzip begünstigt.

Dieses Beispiel veranschaulicht, dass schon während der Evolution die einzigartigen Eigen-

schaften der Metalle ihre lebensnotwendige Anwendung gefunden haben. Es ist deswegen

nahe liegend, diese Eigenschaften auch in der Medizin zu verwenden.

Dies wurde auch schon in vorchristlicher Zeit getan, wo zum Beispiel schon vor 2500 Jahren

Kupferverbindungen zur Desinfektion von Wasser verwendet wurde.12

Seit dem 6. Jahrhundert vor Christus werden Quecksilberverbindungen in der traditonellen

chinesischen und indischen Medizin verwendet. 13-15

Seit dem 18. Jahrhundert werden Amalgane in der Zahnmedizin verwendet, wo sie wegen

ihrer Härte geschätzt werden, jedoch geht ihre Verwendung inzwischen aufgrund von mögli-

chen toxischen Nebeneffekten wieder zurück.16, 17

1859 wurde beschrieben, dass die Gabe von Lithiumionen bei rheumatischen Erscheinungen

helfen kann. Seit 1949 wird Lithiumbromid als erstes modernes Antikonvulsivum bei Epilep-

sie eingesetzt.18

Manisch-depressiv erkrankte Menschen lassen sich sehr gut mit Lithiumsalz

behandeln. Nicht nur helfen die Mittel bei akuten Phasen der Krankheit, sondern sie helfen

auch langfristig.19, 20

Neue technische Möglichkeiten können zur Entwicklung von neuen Medikamenten führen. So

zog die Entwicklung der Röntgengeräte einen Bedarf nach Kontrastmitteln nach sich. Rönt-

genstrahlung wird von besonders elektronenreichen Verbindungen gebremst. Es war deswe-

gen nahe liegend, Metall mit hohen Ordnungszahlen mit in Betracht zu ziehen. Heute werden

unter anderem bariumhaltige Verbindungen als Kontrastmittel bei Röntgenuntersuchungen

verwendet.21

Die Entdeckung der Radioaktivität öffnete die Möglichkeit, diese zu Therapie- und Diagnose-

zwecken einzusetzen.22

Das häufigste in der Diagnostik eingesetzte Isotop ist das

99mTechnetium.

23 Es können jedoch auch Isotope des Galliums, des Indiums, des Kupfers und

des Yttriums verwendet werden.24

In der Therapie können Isotope des Strontiums, Zinns,

Einleitung

Seite | 4

Rheniums, Samariums und Holmiums Anwendung finde.25

Die Entwicklung moderner che-

mischer Synthesen führte dazu, dass nicht nur radioaktive Substanzen für die Therapie entwi-

ckelt wurden.

So war das erste Mittel, welches gezielt von einem Chemiker zur Behandlung von Krankhei-

ten entwickelt wurde, Salvarsan. Der Entwickler Paul Ehrlich sprach deswegen auch von ei-

nem Chemotherapeutikum.26, 27

Salvarsan enthält das Halbmetall Arsen. Es war das erste Mit-

tel, welches eine Behandlung von Syphilis möglich machte.28-30

Die Struktur von Salvarsan ist

nicht genau bestimmt, da es wohl in verschieden Modifikationen vorliegt, die sich schnell

ineinander umlagern. Am häufigsten scheint es als Trimer und als Pentamer vorzuliegen.31

Abbildung 1-3: Salvarsan

Dieser Erfolg von Salvarsan führt dazu, dass die strukturelle Vielseitigkeit der Metallkomple-

xe auch in anderen Bereichen der Medizin zur gezielten Entwicklung von metallhaltigen

Chemotherapeutika genutzt wird. So werden unter anderem Ruthenium-, Rhodium-, Rheni-

um- und Osmiumverbindungen als onkologische Chemotherapeutika getestet und etliche die-

ser Komplexe zeigen vielversprechende Resultate in Zelltests.32, 33

Abbildung 1-4: Vielversprechende Übergangsmetall Chemotherapeutika

Einleitung

Seite | 5

Einige dieser Verbindungen wurden auch schon in klinischen Studien getestet, was die Frage

nach dem Wirkmechanismus dieser Verbindungen aufwirft. Die Zytostatika wirken nicht alle

auf dieselben Zellbestanteile des malignomen Gewebes und der Mechanismus ist in allen Fäl-

len schwer aufzuklären. Einige der Verbindungen scheinen gegen Proteine im Zytosol zu wir-

ken, andere Verbindungen wirken gegen Zellorganellen, wie zum Beispiel den Mitochondrien

und bei einigen Verbindungen wirkt die Freisetzung von Kohlenstoffmonoxid. Sehr häufig

lässt sich eine Interkalation der Verbindungen mit der DNS beobachten, welche dann eine

Duplikation der DNS verhindert. Diese Hinderung stört den Stoffwechsel der Zelle und es

kommt Final zur Apoptose.34-36

Cisplatin gehört zu den anorganischen Zytostatika, die mit der DNS interkalieren und so die

Apoptose einleitet. Es eines der gebräuchlichsten anorganische Zytostatika und hat seine Zu-

lassung schon 1978 von der FDA (Food and Drug Administration) erhalten.37

Abbildung 1-5: Cisplatin

Es dringt bis in den Zellkern vor, die Chloridliganden werden ausgetauscht und das Platin

bindet an zwei Purine, die zu benachbarten Guanosinen der DNS gehört. Dies stört die Fal-

tung, Transkription und Duplikation der DNS und führt am Ende zur Apoptose.38

Der große Erfolg von Cisplatin führte zur Entwicklung weiterer Platin basierter Zytostatika,

von den Oxaliplatin39

und Carboplatin40

eine weltweite Zulassung erhalten haben. Bei beiden

Verbindungen ist der Wirkmechanismus anders als bei Cisplatin, mit diesen beiden Verbin-

dungen können karzinogene Gewebe behandelt werden, welche nicht auf Cisplatin reagieren.

Abbildung 1-6: links Oxaliplatin und rechts Carboplatin

Es gibt jedoch weitere Gewebe, welche auf bisher keine Therapie ansprechen. Gegen diese

Tumore werden weitere Cisplatinderivate entwickelt. Zu diesen Neuentwicklungen gehören

unter anderem das Pyriplatin und das Phenanthriplatin. Beide Verbindungen werden gerade

auf ihre Wirksamkeit und Verträglichkeit getestet.41

Einleitung

Seite | 6

Pt

H3N NH3

Cl N

Pt

H3N NH3

Cl N

Abbildung 1-7: links Pyriplatin und rechts Phenanthriplatin

Eine weitere Behandlungsmöglichkeit von resistentem karzinogenem Gewebe ist es, das zyto-

toxische wirksame Metall zu wechseln. Zu den potentiellen Metallen gehört das Gold, wel-

ches mit der Ordnungsnummer 79 nur eine Ordnungsnummer weiter im Periodensystem steht

als das Platin. Gold wird schon seit der Antike eine heilende Wirkung nachgesagt. Diese

nachgesagte Wirksamkeit zieht sich durch alle Kulturen, jedoch lässt sich kein wissenschaftli-

cher Effekt bei der Anwendung von gediegenem Gold gegen irgendeine Krankheit nachwei-

sen.42

Gold Legierungen werden lediglich für Prothesen wie zum Beispiel in der Zahnmedizin

verwendet.43

Für eine Anwendung als Chemotherapeutikum kommt vornämlich in Komplexen gebundenes

Gold in Frage. Die stabilen Oxidationsstufen des Goldes sind (I) und (III). Gold(I)-Verbin-

dungen haben in der Regel zwei linear gebundene Liganden, Gold(III)-Komplexe besitzt zu-

meist vier quadratisch planar gebundene Liganden. Als Liganden kommen häufig Halogenide,

Phosphine, Thiole, Thioether, Alkohole, das Stickstoffatom von N-heterocyclen und verschie-

den Bindungen zu Kohlenstoffatomen vor. Zu den Kohlenstoffbindungen gehört die Bindung

an ein Kohlenstoffatom eines konjugierten Systems, an Carbene sowie end-on und side-on an

Alkine.44, 45, 46

Das erste von Robert Koch entdeckte auf Gold basierende Chemotherapeutikum, ist eine klas-

sische anorganische Verbindung. Koch konnte zeigen, dass Kaliumdicyanoaurat(I) eine bakte-

riostatische Wirkung hat.47

Als Chemotherapeutikum werden Goldverbindungen gegen rheumatische Arthritis eingesetzt.

Zu den verwendeten Verbindungen gehört Aurothioglucose (Solganol), Aurothiomalat

(Myocrisin), Aurothiosulfat (Sanocrysin), Aurothiopropanolsulfonat (Allocrysin) und

(3,4,5,6-Tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosato)(trieethylphosphan)gold(I) (Auranofin).

Rheumatische Arthritis kann zurzeit nicht geheilt werden, die antirheumatischen Goldkom-

plexe verlangsamen jedoch den Krankheitsverlauf und senken Knochen- und Knorpelschäden,

Einleitung

Seite | 7

welche mit der Krankheit einhergehen. Auranofin ist das einzige hier aufgeführte

Chrysotherapeutikum, welches oral verabreicht werden kann.48

Abbildung 1-8: Goldhaltige Wirkstoffe

Neben der Verwendung in der Chrysotherapie gibt es auch Versuchsergebnisse, die darauf

hinweisen, dass Goldkomplexe als Antimalariamittel, als Antibiotika, gegen HIV und wie

oben schon erwähnt, als Therapeutika in der Onkologie eingesetzt werden können.42, 48

Bei

den bisher untersuchten Gold(I)-Verbindungen reichert sich das Gold in den Mitochondrien

an, es scheint also nicht der gleiche Wirkmechanismus wie beim oben beschriebenen Cis-

platin vorzuliegen. Auch eine Hemmung der Thioredoxinreductase liegt bei den getesteten

zytotoxischen Gold(I)-Komplexen vor.49-51

Glutathion-S-transferase kann von Auranofin

adressiert werden und so zytotoxisch wirken.52

Da Gold(III)-Verbindungen isoelektronisch und isosterisch zu Platin(II)-Verbindungen und

damit zu Cisplatin sind, gibt es die Hoffnung, dass bei den Gold(III)-Verbindungen eine ähn-

lich potente Verbindung gefunden werden kann. Beide Metalle haben eine d8 Elektronenkon-

figuration und bilden quadratisch planere Komplexe. Gold(III) und Platin(II) gehen ähnliche

Substitutionsreaktionen ein. Es gibt jedoch auch zwei große Unterschiede. Erstens sorgt die

zusätzliche positive Ladung am Goldion dafür, dass nicht dieselben Liganden genutzt werden

können wie beim Cisplatin, ohne ein geladenes Molekül zu erhalten. Zweitens haben

Gold(III)-Ionen eine größere Tendenz Reduktionsreaktionen einzugehen.53-55

Diverse Gold(III)-Komplexe können, ähnlich zu Cisplatin, mit der DNS interkalieren und die

DNS dadurch spalten.56, 57

Es wurde jedoch auch gezeigt, dass einfach und zweifach geladene

Einleitung

Seite | 8

Gold(III)-Verbindungen an nucleophilen Heteroatome von L-Histidin, Inosin, Inosin-5′-

monophosphat und Guanosin-5′-monophosphat binden können. Moleküle wie diese kommen

häufig in der Zelle vor und verhindern eine Migration der Gold(III)-Komplexe zum Zell-

kern.58

Auch ein Wirken auf Selenoproteine, thiolhaltige Proteine, die Thioredoxinreductase

und Mitochondrien werden als möglicher Wirkort für Gold(III)-Verbindungen diskutiert. Dies

wäre analog zu Gold(I)-Komplexen.42, 48, 59

Möglich ist auch eine Wirkung auf das Proteasom

oder die Veränderung verschiedener Kinasen.60

Aktuell werden Gold(III)-Komplexe mit N-

heterocyclischen-, S-heterocyclischen-, Carben-, Phosphin- und Chloridliganden als antiproli-

ferative Wirkstoffe getestet, wobei die Häufigkeit der N-heterocyclischen Liganden besonders

auffällt.33, 61-66

Dieses besonders gute Bindungsverhalten wurde genutzt um das N-heterocyclische, häufig in

der Biologie verwendete, Porphyrin mit einem Gold(III)-Komplexe zu einem Biokonjugaten

umzusetzen und so einen weiteren potenten Tumorwirkstoff zu erzeugen.67

Dabei sind Bio-

konjugate Verbindungen aus mindestens zwei Molekülen, die die Eigenschaft der beiden ein-

zelnen Moleküle in der neuen Verbindung vereinigen. Eins der Moleküle muss eine biologi-

sche Funktion innehaben.68

Ein weiteres biologisch aktives Moleküle können Aminosäureketten sein, die mit dem

Gold(III)-Komplexe verbunden werden können, um ein neues Biokonjugat zu erzeugen. Zur

Gewinnung dieser Aminosäureketten gibt es zwei Möglichkeiten:

Erstens gibt es die heute übliche Technik zur Gewinnung von Aminosäureketten durch re-

kombinante Proteine. Diese ermöglicht über Genveränderungen gezielt alle denkbaren Protei-

ne zu erzeugen, bei welchen die Peptide schon zu einem Protein gefalten sind. Jedoch ist die

Darstellung von Proteinen auf diese Weise teuer, aufwendig und zeitintensiv.69-71

Die zweite vorher entwickelte, günstigere und verhältnismäßig schnelle Möglichkeit zeigte

Merrifield 1963 auf und erhielt 1984 hierfür den Nobelpreis.72

Merrifield entwickelte die

Möglichkeit kurze Peptide an einem, in den verwendeten Lösungsmitteln, unlöslichem Harz

darzustellen.73

Die Sequenz wird Baustein für Baustein aufgebaut. Um ein Peptid mittels der

Festphasenpeptidsynthese (SPPS) darzustellen, wird das verwendete Harz in dem für die Syn-

these verwendete Lösungsmittel quellen gelassen. Es folgenden die Schritte Entschützung,

Waschung, Kopplung und wieder Waschung für jeden zu koppelnden Baustein. Sobald die

Einleitung

Seite | 9

gewünschte Kettenlänge erreicht ist, folgen Entschützung, Waschung, Abspaltung und das

Aufreinigen.74, 75

quellen des Harzes

entschützen

waschen

koppeln

waschen

entschützen

nächster Baustein

waschen

abspalten

aufreinigen Abbildung 1-9: Schritte in der SPPS

Von großer Bedeutung für die Festphasenpeptidsynthese sind orthogonale Reaktionssysteme.

Eine Orthogonalität ist dann gegeben, wenn es zwei oder mehr voneinander unabhängigen

Funktionalitäten gibt, an der Reaktionen durchgeführt werden können. Die Reaktionen müs-

sen unabhängig und in beliebiger Reihenfolge voneinander durchgeführt werden können. Bei

der Festphasenpeptidsynthese werden häufig Säure/Base Reaktionen genutzt. Das Entschüt-

zen wird dann mittels einer Base durchgeführt, das Abspalten mittels einer Säure. Es kann

auch genau anders herum vorgegangen werden. Die Seitenketten sind mit Schutzgruppen ge-

schützt, welche erst unter den Abspaltbedingungen gespalten werden oder sogar orthogonal

zum Entschützen und Abspalten geschützt sind. Die Seitenschutzgruppen sind während des

gesamten Peptidaufbaus permanent am Harz geschützt, im Gegensatz zum temporär geschütz-

ten Peptidende, an dem die Schutzgruppe vor jedem Kopplungsschritt abgespalten wird.76-78

Mit der SPPS können Peptide aufgebaut werden, die die Fähigkeit haben, die Plasmamembran

von Zellen zu durchdringen. Diese Zellmembran durchdringenden Peptide (CPPs) sind fast

alle positiv geladen, um mit negativ geladen Glykosaminoglykanen und vor allem den

Phospholipiden in der Zellmembran wechselwirken zu können. Durch diese Wechselwirkung

haben die Peptide die Eigenschaft in die Zelle zu gelangen, wobei der Mechanismus nicht

genau aufgeklärt ist. Es sind eine Vielzahl von Sequenzen mit dieser Eigenschaft bekannt,

dabei sind alle Sequenzen zwischen 5-30 Aminosäuren lang, zum Beispiel ist eine der ein-

Einleitung

Seite | 10

fachsten CPPs das Polyarginin79

. Die Fähigkeit der Sequenzen in die Zelle zu gelangen und

daneben noch weitere Stoffe mit in die Zelle zu transportieren, wird heute genutzt Plasmid-

DNS, Oligonucleotide, RNS-Fragmente, Proteine, Peptide, Kontrastmittel, Wirkstoffe und

sogar Nanopartikel, welche sich in Mizellen befinden, in die Zelle zu befördern. Die Sequen-

zen selber haben keinen Effekt auf die Zelle, sie sind nicht selektiv, sondern wandern durch

jede Zellmembran.80-83

Um bei den CPPs eine Selektivität zu erhalten, werden diesem Peptid weitere Aminosäuren

angehängt. Diese neuen Peptidabschnitte sind spezifisch für die Zielzelle. Bei diesem heute

gängigen Vorgehen, ist also ein Abschnitt des Peptides für die Erkennung der Zielzelle zu-

ständig, der andere Abschnitt für den Transport in die Zelle. An das gesamte Peptid können

dann die oben schon erwähnten Substanzen gebunden werden und in die Zelle transportiert

werden.84, 85

Der CPP-Abschnitt sorgt jedoch weiterhin für einen Transport auch in andere

Zellen.86

Eine Erweiterung dieser Möglichkeit mit CPPs selektiv karzinogene Zellen zu markieren,

haben Jiang et al. 2004 vorgestellt, als sie ein Fluorophoren mit einem Peptid verknüpften.

Das Peptid bestand aus einem positiv geladen CPP-Abschnitt, dann einem durch die Matrix-

Metalloprotease 2 (MMP2) schneidbaren Stück und einem negativ geladenem Abschnitt, um

den CPP-Abschnitt zu inaktivieren. Um das CPP zu aktivieren, musste der negativ geladene

Abschnitt durch Schneiden bei der MMP-Schnittsequenz von diesem CPP-Abschnitt getrennt

werden.87

Bei der gerade beschrieben Arbeit wurde genutzt, dass MMPs häufig bei karzinogenen Zellen

überexprimiert werden. Gebärmutter-, Lungen-, Prostata- und Brusttumore werden von Zellen

ausgelöst, welche MMP2 (Gelatinase-A) und MMP9 (Gelatinase-B) überexprimieren.88-91

Diese beiden MMPs scheinen von entscheidender Bedeutung für die Metastasenbildung zu

sein. Gelatinasen sind für die finale Degeneration der Fasern des Kollagens verantwortlich.92

MMP2 ist die am häufigsten überexprimierte MMP bei allen untersuchten carcinogen Zel-

len.93

Sequenzen, die von MMP2 gespalten werden, können mit sechs Aminosäuren recht

kurz sein.94

MMPs gehören zu einer Familie von strukturverwandten, Zink enthaltenden

Endopeptidasen. Die Gesamtheit aller MMPs ist dadurch in der Lage nahezu alle Verbindun-

gen der Extrazellularmatrix (ECM) abzubauen. MMPs spielen bei gesunden Zellen eine wich-

tige Rolle im physologischen Abbau der ECM, sind an der Gewebemorphogenese, der Gewe-

Einleitung

Seite | 11

bereparatur und der Angiogenese maßgeblich beteiligt.95

MMPs sind jedoch wie oben schon

angedeutet bei pathologischen Veränderungen, die mit einem massiven Abbau der ECM im

Zusammenhang stehen, von großer Bedeutung. Hier zu zählen: rheumatische Arthritis, Arth-

rose, Lungenemphysem, Atherosklerose, Multiple Sklerose, Parodontitis, autoimmunen Bla-

senbildung der Epidermis und bei der Tumorausbreitung und der Metastasenbildung. 95-98

Es gibt aktuell viele Versuche das Wissen über die Beteiligung von MMPs bei der Krank-

heitsentstehung zu nutzen. So werden Inhibitoren für MMPs entwickelt, die sowohl bei Ent-

zündungen als auch bei Tumoren in klinischen Studien getestet werden.99-102

Weniger häufig

werden Moleküle, die von MMPs geschnitten werden sollen, eingesetzt um einen Wirkstoff

freizusetzen.103

So wird der Artikel von Jiang et al.87

bis heute als Beispiel angegeben, wie

eine größere Selektivität von CPPs erreicht werden kann.104, 105

Von Goun et al. wurde das

Konzept adaptiert und CPPs für den Wirkstofftransport genutzt, jedoch wurden keine durch

eine MMP schneidbare Sequenz gewählt, sondern dies sollte durch ein Prostata spezifisches

zelluläres Antigen erfolgen.106

Das von Jiang et al.87

vorgestellte Konzept wurde nur von

Nguyen et al. Wieder aufgegriffen und als Möglichkeit der Bildgebung bei Tumoroperationen

vorgestellt.107

Somit ist es eine interessante neue Idee das Konzept von Jiang et al.87

wieder

aufzugreifen und die Peptidsequenz nicht mit einer Verbindung zur Bildgebung auszustatten,

sondern das Peptid mit einem Gold(III)-Metallkomplex zu einem Biokonjugat zu verknüpfen

und somit die Möglichkeit zu schaffen, den Metallkomplex gezielt gegen karzinogenes Ge-

webe einzusetzen.

Aufgabenstellung

Seite | 12

2. Aufgabenstellung

Abbildung 2-1: Aufgabenstellung des Projekts

In dieser Arbeit soll ein Biokonjugat erzeugt werden, dass selektiv zytotoxisch gegen MMP2

überexprimierende karzinogene Zellen wirkt. Um diese Wirkung zu erzeugen soll das

Konjugat aus vier Teilen bestehen: Dem Gold(III)-Komplex, einem Sequenzteil mit fünf Ar-

gininen, einem von MMP2 spaltbaren Abschnitt und fünf Glutaminsäuren. Alle vier Teile

sollen sich an einer Peptidsequenz befinden.

1. Der Gold(III)-Komplex soll für die zytotoxische Wirkung des Biokonjugates sorgen.

Hierfür muss ein wirksamer Gold(III)-Komplex in der Literatur gefunden werden

und die große Herausforderung wird es sein, diesen Komplex mit der Peptidsequenz

zu verbinden.

2. Die positiv geladenen Arginine sollen die Zellgängigkeit und damit die Wirkung des

Moleküls erhöhen, diese CPP-Sequenz soll den Gold(III)-Wirkstoff in die Zelle

transportieren.

3. Der von MMP2 spaltbare Abschnitt soll für die Selektivität in Kombination mit dem

vierten Teil sorgen. Dieser Abschnitt soll verhindern, dass das Biokonjugat von Zel-

len aufgenommen werden kann. Das Biokonjugat kann erst aufgenommen werden,

wenn es in einen Bereich der ECM mit erhöhter MMP2 Konzentration kommt.

Aufgabenstellung

Seite | 13

4. Die negativ geladenen Glutaminsäuren sollen sich an die positiv geladenen Arginine

anlagern. Durch die Anlagerung soll die gesamte Verbindung neutral geladen sein.

Erst wenn der dritte Teil der Verbindung von MMP2 gespalten worden ist, trennt

sich der Sequenzteil mit den Glutaminsäuren vom Rest des Biokonjugats. Der Rest

kann dann von Zellen aufgenommen werden.

Ergebnisse

Seite | 14

3. Ergebnisse

Der Gold(III)-Komplex

Analog zu dem bekanntesten anorganischen Chemotherapeutikum Cisplatin,108

wurde nach

einer zytotoxischen Gold(III)-Verbindung gesucht, welche in Tests schon ihr Potential gegen

karzinogene Zelllinien gezeigt hatte.109

Für die Zelltests muss die Verbindung stabil gegen-

über Wasser als Lösungsmittel des Organismus sein, der Komplex darf nicht leicht oxidier-

oder reduzierbar sein, stabil gegenüber Sauerstoff sein und die Verbindung sollte einen gut

modifizierbaren Liganden besitzen.110, 111

Abbildung 3-1: Umsetzung von Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat mit 2-Phenylpyridin zu

2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid

Von Constable und Leese wurde 1989 die Synthese von der Verbindung 2-Phenylpyridin-

1,1´-gold(III)dichlorid 2 [AuPhPyCl2] beschrieben.112

Der Komplex 2 hat die oben geforder-

ten Eigenschaften.

Für die Synthese dieser Verbindung 2 wurde Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat und 2-

Phenylpyridin in Wasser und Acetonitril oder Ethanol zusammen gegeben, so dass sich die

Gold-Stickstoff Bindung ausbildete und 2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid 1 erhalten wur-

de. Verbindung 1 wurde für die Cyclometallierung in Wasser und Acetonitril in der Siedehit-

ze umgesetzt.

Ergebnisse

Seite | 15

Abbildung 3-2:

1H NMR-Spektrum von AuPhPyCl2 in DMSO-d6

Vom gelbfarbenen Produkt wurde ein 1H NMR Spektrum gemessen. Das

1H NMR Spektrum

ist in Abbildung 3-2 dargestellt. Der Vergleich mit dem 1H NMR Spektrums aus der Litera-

tur112

weist auf die Bildung von AuPhPyCl2 2 hin. Dieser Eindruck wurden vom 13

C NMR

Spektrum und der Elementaranalyse unterstützt.

Mögliche Modifizierung zur Kopplung von Peptiden

Abbildung 3-3: Position zur Bindung des Peptids

Es gibt nun zwei mögliche Strategien, wie ein Peptid mit dem Komplex AuPhPyCl2 2 zu ver-

binden ist. Die Sequenz kann entweder mit dem organischen Liganden verbunden werden

Ergebnisse

Seite | 16

oder durch Austausch der Chloridliganden direkt mit dem Gold(III)-Ion gekoppelt werden. Da

eine zu Cisplatin analoge Verbindung generiert werden sollte und es bei diesem Chemothera-

peutikum zwei gebundene Chloride am Metallion gibt, die für dessen Wirksamkeit wichtig

sind, sollte zuerst der Ligand modifiziert werden. Der Ligand kann sowohl am Phenylring, als

auch am Pyridinring modifiziert werden.

Funktionalisierung des Phenylringes

Zuerst sollte der Phenylring des Liganden von AuPhPyCl2 2 modifiziert werden. Für diese

Modifizierung des Liganden steht eine ganze Reihe von organischen Synthesen zur Verfü-

gung.113-115

Zum Beispiel kann eine Carbonsäure am Phenylring eingefügt werden.

Abbildung 3-4: Syntheseroute zu 2-Phenylpyridin-3´-säure-1,1´gold(III)dichlorid

Zur Darstellung der modifizierten Verbindung wurde eine Suzuki-Kupplung zwischen 2-

Brompyridin und Carboxybenzolboronsäure durchgeführt.116

Das so erhaltene Produkt 3 wur-

de in Ethanol gelöst und mit Hydrogentetrachloroaurat(III)-Lösung zusammen gegeben. Von

dem aus dieser Reaktion erhalten gelbfarbenen Rückstand wurde ein 1H NMR Spektrum auf-

genommen.

Ergebnisse

Seite | 17

Abbildung 3-5: 1H NMR-Spektrum von 2-Phenylpyridin-3´-säure-1´-gold(III)trichlorid in DMSO-d6

Das Spektrum des Produktes besitzt die gleiche Anzahl von Protonensignalen, wie das

1H NMR Spektrum von 2-Phenylpyridin-3´-säure 3, jedoch sind die Signale hochfeldverscho-

ben. Dies ist ein Indiz für die Bildung einer Bindung vom Goldatom zum Stickstoffatom der

2-Phenylpyridin-3´-säure-1´-gold(III)trichlorid 4. Es wurde eine Elementaranalyse von dem

Produkt gemessen. Die Elementaranalyse bestätigt die Bildung von Produkt 4, wobei die

Ausbeute bei 58 % lag.

Mehrere Versuche für die Herstellung der cyclometalierten Verbindung 5 aus Verbindung 4

bei den Bedingungen zur Synthese von Verbindung 2 waren nicht erfolgreich. Auch eine Ver-

änderung in der Reaktionszeit und ein Wechsel des Lösungsmittels von Acetonitril zu Ethanol

sorgten für das gleiche Ergebnis. Die analytischen Daten der so erhaltenen Produkte, zeigten

ein Gemisch von verschiedenen Verbindungen an, wobei die Daten nicht auf die Entstehung

vom gewünschten Produkt hindeuteten und das Produkt 5 nicht isoliert werden konnte.

Der elektronenziehende Effekt der Carbonsäure kann die Umsetzung von Verbindung 4 zu

Verbindung 5 hemmen und möglicherweise konnte Verbindung 5 deswegen nicht isoliert

werden.

Ergebnisse

Seite | 18

Einfügung einer Alkylkette

Zwei Wege wurden probiert, um den elektronenziehenden Effekt der Carbonsäure auf den

Aromaten zu senken. In beiden Wegen sollten einige Kohlenstoffatome zwischen dem Aro-

maten und der Carbonsäure eingefügt werden. Im ersten Weg sollte sich eine freie Carbonsäu-

re am Liganden befinden, beim zweiten Weg sollte die Carbonsäure methylgeschützt sein.

Der Vergleich zwischen geschützter und nicht geschützter Carbonsäure sollte den Einfluss der

Säure auf die Cyclometallierung zeigen.

Abbildung 3-6: Syntheseweg für 2-Phenylpyridin-3´-propansäure-1,1´-gold(III)dichorid

Für den ersten Weg wurden 4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd und Malonsäure in Pyridin gelöst

und Piperidin als Base zugegeben, um 2-Phenylpyridin-3´-acrylsäure 6 zu erhalten.117

Die

Reduktion der Doppelbindung der Alkylkette mit Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle,

sollte das konjugierte System von Verbindung 6, welches über den ganzen Liganden bis zur

Carbonsäure reichte, unterbrechen. Die Carbonsäure hätte durch dieses konjugierte System

einen Einfluss auf die Ausbildung der Gold-Kohlenstoffbindung haben können. Die so erhal-

tene 2-Phenylpyridin-3´-propansäure 7 sollte nun mit dem Stickstoffatom zum Gold(III)-Ion

binden und wurde in Acetonitril gelöst, mit Hydrogentetrachloroaurat(III) in Wasser gelöst,

zusammen gegeben. Das erhaltene Rohprodukt wurde säulenchromatographisch getrennt.

Von dem gelbfarbenen Produkt wurde ein 1H NMR Spektrum gemessen.

Ergebnisse

Seite | 19

Abbildung 3-7: DMSO-d6 aufgenommenes 1H NMR-Spektrum von Verbindung 8

Die Signale sind im Vergleich zur 2-Phenylpyridin-3-´propansäure 7 tieffeldverschoben. Aus

den Integralen ergibt sich die gleiche Anzahl von Protonen, wie bei Verbindung 7. Bei dem

1H NMR Spektrum von Verbindung 4 ist diese Verschiebung schon zu beobachten. Das

Spektrum passt damit zu 2-Phenylpyridin-3´-propansäure-1-gold(III)trichorid 8. Das Produkt

wurde in 46.6 % Ausbeute erhalten. Damit das Produkt 8 eine Bindung zwischen dem

Goldatom und dem Kohlenstoffatom 1´ ausbildet und ein zweizähnig gebundener Gold(III)-

Komplex entsteht, wurde analog zum Erhalt von Produkt 2 gearbeitet. In der Dünnschicht-

chromatographie konnte jedoch kein Produktpunkt ausgemacht werden, es waren sehr viele

verschiedene Produkte entstanden. Dies bestätigte sich auch im 1H NMR Spektrum. Eine

Veränderung der Reaktionszeit, Reaktionstemperatur und ein Wechsel von Acetonitril zu

Ethanol sorgte auch nicht für das Entstehen von 2-Phenylpyridin-3´-propansäure-1,1´-

gold(III)dichorid 8 als Produkt.

Ergebnisse

Seite | 20

Methylester

Abbildung 3-8: Schema für 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester-1,1´-gold(III)trichorid

Für den zweiten Weg wurde mit einer Wittig-Reaktion in Tetrahydrofuran (Essigsäureme-

thylester)triphenylphosphoniumchlorid und 4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd mit Hilfe von

Kaliumhexamethyldisilizan umgesetzt. Die orangefarbene Reaktionssuspension wurde säulen-

chromatographisch aufgetrennt und Phenylpyridin-3´-acrylat 10 erhalten. Das konjugierte

System von Verbindung 10 wurde analog zum Erhalt von Verbindung 7 in einer Wasserstoff-

atmosphäre zusammen mit Palladium auf Aktivkohle in Ethanol gerührt und 2-Phenylpyridin-

3´-propansäuremethylester 11 erhalten. Dieser Methylester 11 wurde mit Hydrogentetra-

chloroaurat(III)hydrat umgesetzt. Nach der Reinigung der Reaktionsmischung wurde ein Pro-

dukt erhalten. Von diesem Produkt wurde ein 1H NMR Spektrum gemessen.

Ergebnisse

Seite | 21

Abbildung 3-9:

1H NMR-Spektrum in DMSO-d6 von Verbindung 12

Das 1H NMR Spektrum des isolierten Produktes zeigte tieffeldverschoben Signale, im Ver-

gleich zu den Signalen von Verbindung 11. Die gleichen Beobachtungen sind schon bei Ver-

bindung 4 und 8 gemacht worden. Damit entspricht das 1H NMR Spektrum der Erwartung für

2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester-1-gold(III)trichorid 12. Dies wird durch die Ele-

mentaranalyse gestützt, die Ausbeute betrug 38.4 % und war damit geringer als im unge-

schützten Fall.

Zur Bildung der Gold-Kohlenstoff Bindung wurde Verbindung 12 in Wasser und Acetonitril

zum Sieden erhitzt. Es wurde analog zur Darstellung von Produkt 2 gearbeitet. Vom so erhal-

tenen Rückstand wurden Dünnschichtchromatogramme und ein 1H NMR Spektrum angefer-

tigt. 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester-1,1´-gold(III)trichorid 13 konnte nicht in

diesen entdeckt werden. Durch eine Veränderung der Temperatur, der Zeit oder eines Wech-

sels von Acetonitril zu Ethanol konnte Verbindung 13 auch nicht erhalten werden.

Funktionalisierung des Pyridinringes

Die bis dahin vorgenommen Veränderungen waren alle am Phenylring vorgenommen worden.

Dies hatte nicht zu den gewünschten Produkten geführt. Nach der Bindung der Goldspezies

zum Stickstoffatom des Pyridins, war jeweils die Gold-Kohlenstoffbindung nicht erreicht

Ergebnisse

Seite | 22

worden, wenn der Phenylring des Kohlenstoffatoms einen weiteren Liganden trug. Eine wei-

tere Möglichkeit war die Modifizierung des Pyridinringes. Es sollte so geprüft werden, ob

eine Veränderung am Pyridinring einen weniger starken Einfluss auf die Eigenschaften des

Phenylringes hatte. Aus diesem Grund sollte das Phenylpyridin mit einem Bromatom an der

vierten Position des Pyridinring dargestellt werden. Dieser Ligand sollte dann mit Hydrogen-

tetrachloroaurat(III) umgesetzt werden. Analog zu Verbindung 2 sollte dann 4-Brom-2-Phe-

nylpyridin-1,1´gold(III)dichlorid 16 erhalten werden. Das Bromatom ist eine gute Abgangs-

gruppe und kann für eine Vielzahl von weiteren Reaktionen genutzt werden. Das Bromatom

kann zum Beispiel in einer nucleophilen bimolekularen Substitution durch ein Azid ausge-

tauscht werden.118, 119

Das Azid könnte dann in einer [3+2] Cycloaddition mit einem Peptid

mit terminalem Alkin gekoppelt werden.120

Das Bromatom eignet sich ebenfalls für eine me-

tallorganische C-C Verknüpfungsreaktion.121, 122

Abbildung 3-10: Syntheseroute zu 4-Brom-2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichorid

Für die Darstellung des neuen Liganden wurde ein Grignardreagenz aus Magnesiumspänen

und Brombenzol in Tetrahydrofuran hergestellt. Diese Mischung wurde langsam in eine Mi-

schung aus 4-Brompyridin in Tetrahydrofuran gegeben. Nach der Aufarbeitung wurde 4-

Brom-2-Phenylpyridin 14 erhalten.

Ligand 14 wurde in Acetonitril gelöst und mit Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat umge-

setzt. Durch Aufarbeitung der Reaktion wurde ein Feststoff erhalten. Von diesem wurde ein

1H NMR-Spektrum aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen der

1H NMR-Signale

sind wie bei den Verbindungen 4, 8 und 11. Dies lässt vermuten, dass sich 4-Brom-2-Phenyl-

pyridin-1-gold(III)trichorid 15 in 27.6 % Ausbeute gebildet hatte.

Verbindung 15 wurde dann in einer Mischung aus 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Aceto-

nitril bis zum Sieden erhitzt. Auf diese Weise sollte eine Bindung zwischen dem Goldatom

und Kohlenstoffatom 1´ entstehen. Jedoch konnte Verbindung 16 nicht isoliert werden. Ana-

lytische Daten zeigten, dass nur wieder Verbindung 15 isoliert werden konnte und kein Um-

satz bei der Reaktion erfolgt war.

Ergebnisse

Seite | 23

Transmetallierung

Bei den bisherigen Versuchen war kein Ligand erhalten worden, der das Gold(III)-Ion cyclo-

metalliert gebunden hatte. Pritchard et al. hat 2000 einen sehr ähnlichen Verbindung zu

AuPhPyCl2 2 veröffentlicht.123

Die dort veröffentlichte Gold(III)-Verbindung hat jedoch an-

stelle des Pyridinringes ein Quinolinsystem mit einer methylgeschützten Carbonsäure. Es

wird beschrieben, dass die so erhaltene Gold(III)-Verbindung zusätzlich noch eine erhöhte

Löslichkeit in Wasser aufweisen soll, was eine Anforderung an das hier verwendete System

war. Mit Hilfe einer Transmetallierung wurde diese Verbindung erhalten. Bei dieser

Transmetallierung ist das Kohlenstoffatom, welches die Bindung zu Goldatom eingehen soll,

an Quecksilber gebunden und so für die Reaktion aktiviert.123

Abbildung 3-11: 4-(4-(methoxycarbonyl)quinolin-2-yl)benzen-1-ylium-1,1´-gold(III)dichorid

Zur Darstellung dieser Verbindung wurde Quecksilber(II)acetonat zusammen mit 4-(4-(me-

thoxycarbonyl)quinolin-2-yl)benzen-1-ylium in Ethanol über Nacht in der Siedehitze gerührt.

Nach der Behandlung mit Lithiumchlorid und der Aufarbeitung der Reaktionslösung wurde

das Produkt mittels 1H und

13C NMR-Spektroskopie untersucht. Der Vergleich der Spektren

mit den Literaturspektren123

zeigt den Erhalt von Verbindung 17. Verbindung 17 in

Dichlormethan wurde zusammen mit einer äquimolaren Menge von Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat in Acetetonitril gerührt. Das erhalten Rohprodukt wurde mittels NMR-

Spektroskopie untersucht. Die Auswertung des 1H NMR-Spektrums ergab, dass es sich um

Verbindung 17 handelte. Verbindung 18 konnte nicht erhalten werden.

Verwendung von Bipyridin als Ligand

Da der Weg den Pyridinring zu modifizieren ebenfalls zu keiner für das Projekt nutzbare Ver-

bindung geführt hatte, wurde nach einer weiteren Alternative gesucht, den Liganden zu ver-

ändern. Die bisherigen Zielverbindungen waren nicht entstanden, da sich die Gold-

Ergebnisse

Seite | 24

Kohlenstoff-bindung nicht ausbildete. Um diese Widrigkeit nun zu umgehen, wurde ein

Bipyridinderivat genutzt. Dieses Bipyridinderivat besitzt einen Methylester, bei welchem

schon gezeigt werden konnte, dass er nach Verseifung an Peptide gekoppelt werden kann.124,

125

Abbildung 3-12: Reaktion zu Methyl-6,6'-dimethyl-[2,2'-bipyridin]-4-carboxylat-1-gold(III)trichlorid

Methyl-6,6'-dimethyl-[2,2'-bipyridin]-4-carboxylat wurde mit einer äquimolaren Menge an

Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat in einem Lösungsmittelgemisch aus einem Teil Wasser

und einem Teil Acetonitril gerührt.

Abbildung 3-13: Kristallstruktur von 19 gezeichneten mit 50 % Wahrscheinlichkeit für die thermischen

Ellipsoiden und der Übersichlichkeit wegen weggelassen Wasserstoffatomen. Ausgewählten Bindungslän-

gen (Å) und Winkeln (°) sind:Au(1)-N(1) 2.088(6), Au(1)-Cl(1) 2.275(3), Au(1)-Cl(3) 2.283(3), Au(1)-Cl(2)

2.289(3), N(1)-C(1) 1.335(11), N(1)-C(5) 1.388(11), N(2)-C(11) 1.340(10), C(11)-C(5) 1.468(10), N(1)-Au(1)-

Cl(1) 179.5(2), N(1)-Au(1)-Cl(3) 89.6(2), Cl(1)-Au(1)-Cl(3) 90.78(11), N(1)-Au(1)-Cl(2) 89.1(2), Cl(1)-

Au(1)-Cl(2) 90.55(11), Cl(3)-Au(1)-Cl(2) 176.58(10), C(1)-N(1)-Au(1) 118.4(5), C(5)-N(1)-Au(1) 120.3(5),

N(2)-C(11)-C(5) 116.9(8)

Ergebnisse

Seite | 25

Das gelbfarbenen Produkt wurde mittels 1H NMR-Spektroskopie und kristallographisch un-

tersucht. Die 1H NMR-Spektroskopie Untersuchungen ergibt eine ähnliche chemische Ver-

schiebung, wie sie schon bei 4, 8, 11 und 15 zu beobachten waren. Dies deutet auf den Erhalt

von Methyl-6,6'-dimethyl-[2,2'-bipyridin]-4-carboxylat-1-gold(III)trichlorid 19 hin. Die Kris-

tallstruktur bestätigt diesen Eindruck und zeigt keine Entstehung einer Bindung vom

Goldatom zum Stickstoffatom des substituierten Aromaten. Auch in diesem Fall verhindert

der Methylester die Reaktion am Aromaten.

Ergebnisse

Seite | 26

Peptide

Bindung der Peptide direkt zum Gold(III)-Zentrum

Nachdem die Modifizierung des Liganden nicht zu einer nutzbaren Verbindung geführt hatte,

gibt es nun die oben beschriebene Möglichkeit, die Peptide direkt an das an das Gold(III)-

Zentrum zu binden.

HSAB Prinzip

Es wurde nun eine Aminosäure gesucht, welche eine Seitenfunktionalität besitzt, die nach

dem HSAB Prinzip126

eine stabile Bindung zum Gold(III)-Ion ausbilden kann. Im HSAB

Prinzip werden Ionen nach ihrer Härte eingeteilt. Je nachdem wie groß der Ionenradius ist,

wie hoch die Ladung jeweils ist und wie gut das Ion polarisierbar ist, wird es zu den harten

oder weichen Ionen gezählt. Wenn ein Ion positiv geladen ist, wird es zu den Säuren gezählt.

Negativ geladene Ionen werden als Base betrachtet. Es wird dann angenommen, dass weiche

Säuren eher mit weichen Basen reagieren und harte Säuren mit harten Basen. Das Gold(III)-

Ion hat zwar eine höhere Ladung und es hat eine geringere Polarisierbarkeit als zum Beispiel

ein Gold(I)-Ion, aber es besitzt immer noch einen großen Ionenradius, da es zu den späten

Übergangsmetallen gehört. Es wird deswegen noch zu den weichen Säuren gezählt. Es wurde

also nach einer Aminosäure als Bindungspartner gesucht, die in ihrer Seitenkette eine weiche

Base als Bindungspartner besitzt. Es fielen deswegen alle Aminosäuren mit einer harten Sei-

tenfunktionalität wie zum Beispiel Lysin und Asparaginsäure als Bindungspartner weg. Bei

Thiolen ist bekannt, dass sie als weiche Basen sehr gut zum Gold binden.127

Cystein trägt in

der Seitengruppe diese Funktionalität. Um diese Aminosäure sollte deswegen eine Sequenz

dargestellt werden. Da die Peptidsequenz zweizähnig binden sollte, wurden jeweils immer

zwei Cysteine verwendet.

Austausch der Chloridliganden

Da es nicht sicher zu sein schien, dass die Chloridionen eine ausreichend gute Abgangsgrupe

waren, wurde das 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)acetonat 20 aus Silberacetonat und

AuPhPyCl2 2 erzeugt. Die Chloridionen erwiesen sich im Laufe der Versuche jedoch als aus-

Ergebnisse

Seite | 27

reichend gute Abgangsgruppe und auf die Erzeugung des Acetonats 20 wurde verzichtet. Die

Verknüpfung des AuPhPyCl2 2 mit Peptiden ist durch den Austausch der Chloridliganden und

der Bindung von Seitengruppen der Peptide direkt zum Gold(III)-Ion in guter Ausbeute zu

erreichen. Es schien wichtig, dass auch das Peptid den Goldkomplex zwei zähnig band. Da-

durch sollte eine in Lösung stabile Verbindung erzeugt werden.

Suche nach einem Peptidbindungsmotiv

Die erste synthetisierte Sequenz war Ac-CC-NH2 21. Diese Sequenz wurde mit AuPhPyCl2 2

in Wasser und Acetonitril umgesetzt und eine analytische HPLC Messung wurde vom Pro-

dukt angefertigt. Das nach der analytischen HPLC erhalten Chromatogramm gab eine Viel-

zahl von Produkten wieder. Es wurde eine Kombination von analytischer HPLC und Massen-

spektroskopie durchgeführt. Eine HPLC-Anlage wurde vor das Massenspektrometer geschal-

tet. Keines der so erhalten Massenspektren hatte die erwartete Massen für das Produkt

Ac-CC-NH2AuPhPy 22.

Eine mögliche Erklärung, dass sich Ac-CC-NH2AuPhPy 22 nicht gebildet hatte, war der Ab-

stand zwischen den beiden Cysteinen. Der beiden Cysteine waren möglicherweise zu nah bei-

sammen, die Bindungswinkel waren deswegen ungünstig. Um den Abstand zwischen den

beiden Cysteinen zu vergrößern, wurden Glycin, Prolin und Phenylalanin zwischen den bei-

den Cysteinen in der Sequenz ergänzt. Glycin ist die einfachste achirale Aminosäure ohne

funktionelle Seitenkette und ist damit gut als Abstandsaminosäure geeignet. Prolin ist die ein-

zige Aminosäure, die mit einem sekundären Amin im Peptidrückgrat bindet. Dies macht das

Rückgrat weniger flexibel und zwingt die Sequenz in einen bestimmten Winkel. Um das Pep-

tid bei einer Wellenlänge von 254 nm besser in der HPLC detektieren zu können, wurde als

Abstandsaminosäure Phenylalanin in die Sequenz eingebaut, es konnte so auch heraus gefun-

den werden, ob eine sterisch anspruchsvoller natürliche Aminosäure eine Reaktion von

Gold(III)-Komplex 2 verhindert. Es wurden somit folgende drei Sequenzen synthetisiert:

Nummer Name

23 Ac-CGC-NH2

24 Ac-CPC-NH2

25 Ac-CFC-NH2 Tabelle 3-1

Diese Sequenzen wurden mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt, um die Produkte aus Abbildung 3-14

zu erhalten.

Ergebnisse

Seite | 28

Abbildung 3-14: Ac-CGC-NH2AuPhPy (links), Ac-CPC-NH2AuPhPy (mitte)

und Ac-CFC-NH2AuPhPy (rechts)

Die erhalten Produkte wurden mit der analytischen HPLC und dem ESI-MS untersucht.

Exemplarisch ist das Chromatogramm von Verbindung 26 in Abbildung 3-15 wiedergegeben.

Abbildung 3-15: HPLChromatogramm vom Rohprodukt Ac-CGC-NH2AuPhPy 26

Das Chromatogramm zeigt einen Peak bei einer Retentionszeit 17.1 min. Dies ließ auf die

Entstehung von nur einem Produkt schließen, welches in allen drei Fällen fast quantitativ er-

halten worden ist. Der intensive Peak zu Beginn der Messung kommt durch die Verwendung

von DMSO zum Lösen des Produktes zustande. Das Massenspektrum des Produktes ist in

Abbildung 3-16 gezeigt.

Ergebnisse

Seite | 29

Abbildung 3-16: ESI-Massenspektrum von Ac-CGC-NH2AuPhPy 26.

Als Lösungsmittel wurde DMSO verwendet

Das Massenspektrum gibt ein starkes Massensignal bei m/z = 672 an. Dies entspricht der

Masse des protonierten Produktes Ac-CGC-NH2AuPhPy 26. Beide Chloride wurden durch

die Thiole vom Cystein ersetzt. Aus diesem Ergebnis wird geschlossen, dass eine Abstands-

aminosäure wichtig für eine Cyclometallierung durch die Peptidsequenz von AuPhPyCl2 2 ist.

Es ist somit ein Peptidbindungsmotiv für AuPhPyCl2 2 gefunden worden.

Zusammenfassung der Suche nach einem Peptidbindungsmotiv

Die Ergebnisse für die Verbindungen 27 und 28 sind entsprechend. Der veränderte Bin-

dungswinkel, durch den Austausch von Glycin mit Prolin, scheint keinen Einfluss auf die

chelatisierenden Eigenschaften der Sequenzen zu haben und es kann auch als Bindungsmotiv

genutzt werden. Dasselbe gilt für das sterisch anspruchsvolle Phenylalanin, welches keine

hindernde Wirkung auf die Bildung von Produkt 28 hat.

Stabilitätstest in der Abspaltlösung

Es waren drei ähnliche Bindungsmotive gefunden worden, die alle eine Bindung zu

AuPhPyCl2 2 aufbauen. Wenn Ac-CFC-NH2AuPhPy 28 unter Abspaltbedingungen stabil ist,

Ergebnisse

Seite | 30

dann kann die komplette Sequenz an fester Phase synthetisiert werden. Cystein könnte dann

mit orthogonalen Schutzgruppen in der Sequenz synthetisiert werden. Diese orthogonalen

Schutzgruppen könnten an fester Phase abgespalten werden und AuPhPyCl2 2 könnte gekop-

pelt werden. Danach könnte das Peptid mit dem gebunden Gold(III)-Komplex 2 abgespalten

werden und das gewünschte Biokonjugat würde erhalten.

Als Test für diese Möglichkeit wurde Konjugat 28 in die Abspaltlösung gegeben und für

sechs Stunden geschüttelt. In die Lösung wurde - 70 °C Diethylether zum Fällen des Produk-

tes gegeben. Von dem Rückstand wurde eine analytische HPLC-Messung durchgeführt. Der

Peak bei 22.9 min ist nicht mehr vorhanden. Im Chromatogramm sind viele, zum Teil sehr

wenig intensive neue Peaks zu beobachten. Von dem Rückstand wurde ein ESI-

Massenspektrum aufgenommen. Keines der Signale passt zum Ac-CFC-NH2AuPhPy 28. Es

ist nötig AuPhPyCl2 2 in Lösung an die Peptide zu koppeln, um die gewünschten Biokonjuga-

te zu erhalten.

Ergänzung des Bindungsmotives um einen geladen Peptidteil

Das kurze Bindungsmotiv CFC sollte nun direkt mit den beiden geladen Teilen der langen

Sequenz synthetisiert werden. Hierdurch sollte herausgefunden werden, ob der Gold(III)-

Komplex 2 nicht an irgendwelche Funktionalitäten der langen Peptidsequenz binden kann.

Zum einen wurde das Bindungsmotiv mit fünf Argininen, zum anderen das Bindungsmotiv

mit fünf Glutaminsäuren synthetisiert.

Abbildung 3-17: Ac-CFCRRRRR-NH2AuPhPy

Ergebnisse

Seite | 31

Die Sequenz Ac-CFCRRRRR-NH2 29 wurde zusammen mit Verbindung 2 umgesetzt. Vom

Produkt wurden eine analytische HPLC und ein ESI-Massenspektrum gemessen.

Abbildung 3-18: HPLChromatogramm vom Rohprodukt 30

Das Chromatogramm der analytischen HPLC zeigte die Bildung eines neuen intensiven Peaks

und mehrerer weniger intensiven Peaks. Die Eduktesignale waren nicht mehr zu erkennen.

Das Massenspektrum vom intensivsten Peak wies ein Signal bei m/z = 772 aus. Das Isoto-

penmuster des Signals war in m/z = 0.5 Schritten aufgeteilt. Dies deutet auf ein zweifach

geladenes Kation hin. Die Masse passte zu Ac-CFCRRRRR-NH2AuPhPy 30. Arginin mit

Guanidin als Funktionalität scheint die Gold-Thiol Bindung nicht zu beeinflussen. Es sind

keine weiteren Produkte entstanden. Das Produkt konnte in 69 % Ausbeute erhalten werden.

Abbildung 3-19: Ac-CFCEEEEE-NH2AuPhPy

Ergebnisse

Seite | 32

Es wurde nun Ac-CFCEEEEE-NH2 31 mit AuPhPyCl2 2 zur Reaktion gebracht. Mit dem

Rückstand wurde ein analytischer HPLC Lauf gemessen. Es wurde auch ein Massenspektrum

aufgenommen. Das Chromatogramm hatte sehr viele Peaks, die teilweise ineinander übergin-

gen. Die Bestimmung der genauen Anzahl war damit nicht möglich. Im Massenspektrum wa-

ren sehr viele verschiedene Massen zu erkennen, keine der Massen konnte

Ac-CFCEEEEE-NH2AuPhPy 32 zugeordnet werden. Das Produkt 32 konnte nicht hergestellt

worden. Die Carbonsäure der Glutaminsäure scheint ebenfalls eine bindende Funktionalität

für AuPhPyCl2 2 zu sein. Es musste eine andere Syntheseroute gefunden werden.

Orthogonal geschützt Glutaminsäure

Die Carbonsäure der Glutaminsäure sollte nun orthogonal geschützt werden. So könnte die

ganze Sequenz am Harz synthetisiert werden und dann abgespalten werden, so dass nur noch

die Seitenketten der Glutaminsäuren geschützt sind. Diese Sequenz könnte dann mit

AuPhPyCl2 2 umgesetzt werden und die Seitenketten der Glutaminsäuren selektiv entschützt

werden. Als Schutzgruppe für die orthogonale Schützung der Seitenketten der Glutaminsäu-

ren kann 4-((1-4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-methybutyl)amino)-benzyl (Dmab)

genutzt werden. Diese Schutzgruppe ist sowohl Säure stabil als auch Base stabil. Zum Ab-

spalten der Schutzgruppe wird eine Hydrazinlösung verwendet.128, 129

Versuche mit der Verbindung Ac-CFCE(ODmab)E(ODmab)-NH2 33 ergaben jedoch, dass

die Goldbindung zum Schwefel unter den reduktiven Abspaltebedingungen mit 2 Gew.-%

Hydrazinlösung für die orthogonale Schutzgruppe nicht stabil ist.

Kupferkatalysierte [3+2] Cycloaddition

Eine weitere Möglichkeit ist die [3+2] Cycloaddition zwischen einem Azid und einem termi-

nalen Alkin. Dies ist eine orthogonale Reaktion zu allen Funktionalitäten der natürlichen

Aminosäuren.76

Die Reaktion kann in Anwesenheit aller natürlichen Aminosäuren ablaufen,

ohne von den Seitengruppen der Aminosäuren beeinflusst zu werden oder sogar mit diesen zu

reagieren. Das als Katalysator bei dieser Reaktion verwendete zytotoxische Kupfer, muss vom

Produkt abgetrennt werden.130, 131

Ergebnisse

Seite | 33

Für die [3+2] Cycloaddition muss die eine Peptidsequenz mit einem terminalen Alkin verse-

hen werden, die andere Sequenz mit einem Azid. Es wurde entschieden, das terminale Alkin

an die Sequenz zu binden, welche mit AuPhPyCl2 2 reagieren sollte. Dementsprechend sollte

das Azid an die zu koppelnde Sequenz gebunden werden.

Abbildung 3-20 Schematische Darstellung der [3+2] Cycloaddition

In beiden Fällen wurden die funktionellen Gruppen an den N-Terminus der Sequenz gekop-

pelt. Die Sequenzen wurden mittels der SPPS synthetisiert und im letzten Kopplungsschritt

wurde bei der einen Sequenz 4-Pentinsäure, bei der anderen Sequenz Azidessigsäure verwen-

det. Die 4-Pentinsäure ist kommerziell erhältlich. Azidessigsäure wurde aus der Bromessig-

säure und Natriumazid dargestellt.132

Aus der Literatur ist bekannt, dass terminale Alkine mit Goldionen reagieren können und

Komplexe mit diesen bilden.133, 134

Es wurde dennoch entschieden, erst zu versuchen

AuPhPyCl2 2 an eine Sequenz mit terminalem Alkin zu koppeln. AuPhPyCl2 2 sollte nicht an

eine Sequenz mit einem Azid gekoppelt werden, da Azide sehr gute Abgangsgruppen sind

Ergebnisse

Seite | 34

und es so zu unerwünschten Nebenreaktionen hätte kommen können. Eine mögliche Reaktion

wäre der Austausch eines Chloridliganden von AuPhPyCl2 2 durch das Azid.135, 136

Abbildung 3-21: ΠCFC-NH2AuPhPy

Für den Test, ob das terminale Alkin am Ende der Sequenz mit dem Gold(III)-Komplex rea-

giert, wurden äquimolare Mengen ΠCFC-NH2 34 und AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Das erhalten

gelbfarbene Produkt wurde mit der analytischen HPLC und dem ESI-Massenspektrometer

analysiert. Das Chromatogramm hat einen Peak bei 20.9 min, im Massenspektrum sind ein

Signal bei m/z = 822 und ein Signal bei m/z = 800 zu beobachten. Das Ergebnis der analyti-

schen HPLC deutet auf die Entstehung von nur einem Produkt hin, welches quantitativ erhal-

ten wird. Die erste gemessene Masse entspricht [35+Na]+, die zweite Masse entspricht dem

protonierten ΠCFC-NH2AuPhPy 35. Das terminale Alkin am Ende der Peptidsequenz beein-

flusst die Entstehung vom Produkt 35 nicht, es reagiert nicht mit AuPhPyCl2 2. Da Produkt 35

ohne großen Aufwand zu erhalten war und die Darstellung der Sequenzen mit dem Azid am

N-Terminus auch ohne Widrigkeiten gelang, konnten beiden Teile nun in einer [3+2]

Cycloaddition mit einander zur Reaktion gebracht werden.

[3+2] Cycloaddition der Teilsequenzen

Als erstes sollte die [3+2] Cycloreaktion zwischen ΠCFC-NH2AuPhPy 35 und den einzelnen

Abschnitten der kompletten Sequenz des Projektes probiert werden. Es wurden deswegen

folgende Peptide dargestellt:

Nummer Name

36 ORRRRR-NH2

37 OPLGLYAL-NH2

38 OEEEEE-NH2 Tabelle 3-2

Ergebnisse

Seite | 35

Durch die Tests mit den einzelnen Abschnitten sollten synthetische Herausforderungen leich-

ter lokalisierbar sein.

Beim positiv geladenen Abschnitt konnten die Guanidine der Argininreste an den Kupferkata-

lysator binden und so eine Reaktion verhindern. Das Kupfer(II)sulfat, als Katalysatorquelle

wurde deswegen im dreifachen Überschuss zugegeben.

Der durch MMP2 spaltbare Abschnitt hat außer Tyrosin keine koordinativen Funktionen,

sondern nur aliphatische Gruppen in den Seitenketten, jedoch wurde aus Gründen der Ver-

gleichbarkeit derselbe Überschuss an Katalysator zugegeben.

Als drittes wurde der Abschnitt mit den Glutaminsäuren in der orthogonalen [3+2] Cyclo-

addition umgesetzt. Diese Sequenz mit den Glutaminsäuren hatte bei der direkten Umsetzung

keine spezifische Bindung zum Gold(III)-Komplex gezeigt und die [3+2] Cycloaddition soll

nun zeigen, ob so eine Bindung zwischen Peptid und Gold(III)-Komplex möglich ist.

Da das Bindungsmotiv mit dem Gold(III)-Komplex kaum in den üblichen Lösungsmittelen

der kupferkatalysierten [3+2] Cycloaddition, wie zum Beispiel Wasser, THF oder Aceton

löslich ist, wurden neben Wasser bei dieser Reaktion auch DMSO verwendet.

Abbildung 3-22: Produkte der [3+2] Cycloaddition der drei Abschnitte mit ΠCFC-NH2AuPhPy 35

Die Produkte der [3+2] Cycloaddition wurden an der präperativen HPLC separiert. Von dem

Hauptprodukt wurden eine analytische HPLC und ein Massenspektrum gemessen. Das Chro-

mtogramm hat immer nur ein Signal und im Massenspektrum sind die jeweiligen Signale der

Produkte zu erkennen. Die Signale sind in Tabelle 3-3 abgebildet.

Ergebnisse

Seite | 36

Nummer Signal bei m/z

39 1680, 841

40 1628, 815, 545

41 1545, 774 Tabelle 3-3

Zusammenfassung [3+2] Cycloaddition der Teilsequenzen

Es konnten alle drei Abschnitte erfolgreich in knapp 15 % Ausbeute umgesetzt werden, ohne

das die Funktionalitäten in den Seitenketten zu Schwierigkeiten bei der Umsetzung geführt

haben. Es konnte nun versucht werden mit der [3+2] Cycloaddition alle drei Abschnitte zu-

sammen mit ΠCFC-NH2AuPhPy 35 zu verbinden.

[3+2] Cycloaddition der kompletten Sequenz

Die erfolgreich verlaufene [3+2] Cycloaddition zwischen ΠCFC-NH2AuPhPy 35 und den drei

Abschnitten 36, 37 und 38 zeigt, dass es keine Probleme mit den Funktionalitäten in den Se-

quenzen gibt. Es sollten nun probiert werden, die einzelnen Abschnitte zusammen als kom-

plette Sequenz 42 mit ΠCFC-NH2AuPhPy 35 zu verbinden. Neben Sequenz 42 sollten noch

zwei weitere Sequenzen 43 und 44 in einer [3+2] Cycloaddition verbunden werden. Alle drei

Peptidsequenzen unterscheiden sich nur in dem durch MMP2 spaltbaren Bereich und es sollte

ermittelt werden, ob ein Unterschied in der Reaktivität besteht.

Abbildung 3-23: Produkte der [3+2] Cycloaddition von drei kompletten Sequenzen mit

ΠCFC-NH2AuPhPy 35

Es wurden dieselben Reaktionsbedingungen für die [3+2] Cycloaddition, wie schon bei den

einzelnen Abschnitten gewählt. Von den drei Ansätzen wurde mit der präperativen HPLC

jeweils der größte Peak separiert und eine analytische HPLC-Messungen und ein ESI-

Ergebnisse

Seite | 37

Massenspektrum angefertigt. Von Verbindung 45 ist das analytische Chromatogramm in Ab-

bildung 3-24 exemplarisch wiedergegeben.

Abbildung 3-24: HPLChromatogramm von der gereinigten Verbindung 45

Dieses HPLChromatogramm lässt darauf schließen, dass nur eine Verbindung vorliegt. In

Abbildung 3-25 ist das zugehörige ESI-MS zu erkennen.

Abbildung 3-25: ESI-MS Verbindung 45. Als Lösungsmittel wurde DMSO verwendet

Ergebnisse

Seite | 38

Im Massenspektrum sind drei Signale hervorgehoben. Das erste Signal von einer zweifach

geladenen Spezies liegt bei m/z = 1527, das zweite einer dreifach geladenen Verbindung bei

m/z = 1019 und das dritte Signal einer vierfach geladenen Verbindung bei m/z = 765. Alle

drei Signale können der Zielverbindung 45 zugeordnet werden. Die Daten von Verbindung 46

und 47 sind entsprechend. Aus den Daten konnte gefolgert werden, dass alle drei Sequenzen

erfolgreich mit ΠCFC-NH2AuPhPy 37 umgesetzt werden konnten und es wurden jeweils um

die 10 % Ausbeute erhalten.

Zusammenfassung [3+2] Cycloaddition der kompletten Sequenz

Damit sind gleich drei Verbindungen synthetisiert worden, die der Zielverbindung des Projek-

tes entsprechen. In allen drei Verbindungen ist ein Gold(III)-Komplex für die zytotoxische

Wirkung vorhanden, der an eine längere Peptidsequenz gebunden ist. Die längere

Peptidsequenz besteht aus dem positiv geladen, einem durch MMP2 spaltbaren und dem ne-

gativ geladen Abschnitt.

Bessere Löslichkeit in Wasser

Die über die [3+2] Cycloaddition dargestellten Verbindungen 43, 46 und 47 sind die ersten

Biokonjugate, welche die Zielsetzung dieser Arbeit erfüllten. Bisher sind die Verbindungen

jedoch so schlecht in Wasser löslich, dass sie immer erst in DMSO gelöst werden mussten.

Um diese Verbindungen besser in Wasser lösen zu können und so HPLC-Anwendungen und

Zelltests zu vereinfachen, sollte der besonders schlecht lösliche Teil um das Edukt 35 modifi-

ziert werden. Zwei Teile von Verbindung 35 konnten verändert werden, um eine höhere Lös-

lichkeit in Wasser zu erreichen. Zum einen der Ligand am Gold(III)-Ion und zum anderen das

Bindungsmotiv. Es hatte sich schon herausgestellt, dass es aufwendiger war, den Liganden als

das Bindungsmotiv zu verändern. Aus diesem Grund sollte die Abstandsaminosäure des Bin-

dungsmotivs erneut verändert werden. In diesem Fall sollte sie verändert werden, um die Lös-

lichkeit in Wasser zu erhöhen. Es wurde nun eine neue Abstandsaminosäure benötigt, die

nicht an den Gold(III)-Komplex koordiniert und eine hohe Löslichkeit der neuen Verbindung

in Wasser bewirkte. Aus den Versuchen mit Verbindung 30 ist die hohe Löslichkeit von Ar-

ginin in Wasser bekannt. Die Versuche haben auch ergeben, dass die Guanidingruppe nicht an

AuPhPyCl2 2 bindet.

Ergebnisse

Seite | 39

Abbildung 3-26: ΠCRC-NH2AuPhPy

Für die Darstellung dieser besser wasserlöslichen Verbindung wurde das neue Bindungsmotiv

ΠCRC-NH2 48 zusammen mit einer äquimolaren Menge an AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Von der

Reaktionslösung wurde nach einer Stunde eine analytische HPLC durchgeführt. Das Chroma-

togramm der analytischen HPLC hat einen Peak bei 17.9 min. Es ist sonst kein Peak zu er-

kennen und es wurde ein Produkt quantitativ erhalten. Es ist nur eine Verbindung aus der Re-

aktion hervorgegangen. Es wurde ein ESI-MS durchgeführt. Das Spektrum hat zwei Signale.

Das eine Signal ist bei m/z = 809 und das andere bei m/z = 406. Diese beiden Signale ent-

sprechen dem Produkt 49 mit einfacher Ladung und mit zweifacher Ladung.

Es ist versucht worden ΠCRC-NH2AuPhPy 49 direkt mit der Verbindung ORRRRRPL-

GLYALEEEEE-NH2 42 in einer [3+2] Cycloaddition umzusetzen. Die Reaktion wurde unter

den oben genutzten Bedingungen mehrfach durchgeführt. Mit der analytischen HPLC wurden

Reaktionskontrollen durchgeführt. In den Chromatogrammen ist der Peak von ORRRRR-

PLGLYALEEEEE-NH2 42 weiter vorhanden, während der Peak von ΠCRC-NH2AuPhPy 49

an Intensität verliert, entstehen viele neue wenig intensive Peaks. Keine dieser Reaktionen

führte zu dem erwarteten Produkt der [3+2] Cycloaddition. Durch die Beobachtungen in der

analytischen HPLC wurde vermutet, ΠCRC-NH2AuPhPy 49 könne in Lösung nicht stabil

sein. Zur Überprüfung dieses Verdachtes wurde etwas ΠCRC-NH2AuPhPy 49 in Wasser ge-

löst. Von dieser Lösung wurden in Zeitabständen analytische HPLC Läufe gemessen.

Ergebnisse

Seite | 40

Abbildung 3-27: HPLChromatogramme von ΠCRC-NH2AuPhPy 49

Es ist zu erkennen, dass der einzige Peak im Chromatogramm sich langsam in viele weniger

intensive Peaks umwandelte. Dies geschah innerhalb von sechs Stunden, einer für Anwen-

dungen auf Zellen relevanten Zeit. ΠCRC-NH2 48 koppelte zwar an 2-Phenylpyridin-

1,1´gold(III)dichlorid 2, jedoch entstand kein stabiles Konjugat in Lösung. Das dies noch

nicht bei den Verbindungen: Ac-CGC-NH2AuPhPy 25, Ac-CPC-NH2AuPhPy 27,

Ac-CFC-NH2AuPhPy 29 und ΠCFC-NH2AuPhPy 35 beobachtet worden war, kann an der

geringen Löslichkeit dieser Verbindungen in Wasser gelegen haben. Im Gegensatz zur gerin-

gen Stabilität in Lösung, war Verbindung ΠCRC-NH2AuPhPy 49 im trockenen Zustand über

Tage stabil.

Die geringe Stabilität in Lösung von Verbindung 49 kann an den TFA-Gegenionen liegen.

Die TFA-Ionen befinden sich durch die Abspaltungsbedingungen und die HPLC-Reinigung

an der Peptidsequenz und möglicherweise sorgten diese für die Instabilität von

ΠCRC-NH2AuPhPy 49 in Lösung. Um die TFA-Gegenionen von Verbindung 49 zu trennen,

wurde der Anteil von TFA in den HPLC-Lösungsmitteln von 0.1 Vol.-% auf 0.01 Vol.-%

gesenkt. Danach wurden eine mobile Phasen auf der HPLC mit 0.1 Vol.-% Essigsäure bezie-

hungsweise mit 10 mmol/l Ammoniumacetat verwendet. Anschließend wurde

ΠCRC-NH2AuPhPy 49 auf eine Ionenaustauschersäule gegeben, welche die TFA-Gegenionen

Ergebnisse

Seite | 41

binden sollte. Keines dieser Verfahren sorgte für eine Erhöhung der Stabilität von dem Kom-

plex ΠCRC-NH2AuPhPy 49.

Zusammenfassung Bessere Löslichkeit in Wasser

Da das Bindungsmotiv von zwei Cysteinen mit einer Abstandsaminosäure zu keiner in Lö-

sung stabilen Verbindung in Kombination mit dem 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)-Komplex

führt, wurde beschlossen ein neues Bindungsmotiv zu suchen.

300 potentielle Bindungsmotive

Um eine Peptidsequenz zu finden, die einen stabilen Komplex mit AuPhPyCl2 2 bildet, sollten

mehrere Sequenzen in einem kombinatorischen Projekt ausprobiert werden.137

Die neuen Se-

quenzen sollten wieder aus den drei oben schon verwendeten Komponenten, bindenden Ami-

nosäuren, Abstandsaminosäure zwischen den beiden bindenden Aminosäuren und am C-

Terminus die 4-Pentinsäure, aufgebaut werden. Es ergibt sich folgender allgemeiner Aufbau:

Π bindende AS1 Abstands AS2 bindende AS3 Harz

Die 4-Pentinsäure soll bei den über das Projekt gefundenen stabilen Bindungsmotiven wieder

für die [3+2] Cycloaddition genutzt werden. In Abbildung 3-28 sind alle Monomere für das

Kombinatorische Projekt dargestellt.

Ergebnisse

Seite | 42

Abbildung 3-28: Valenzstrichformel mit Einbuchstabencode und Namen der Monomere

Bindende Aminosäuren

Dass Cystein zu AuPhPyCl2 2 binden kann, ist durch die bisher durchgeführten Versuche be-

kannt. In der Kombination mit einer anderen bindenden Aminosäure sollte ein stabiler neuer

Gold(III)-Komplex erzeugt werden. Im nachfolgenden werden die verwendeten bindenden

Aminosäuren aufgeführt.

Methionin ist die einzige andere natürliche Aminosäure mit einem Schwefelatom in der Sei-

tenkette. Das Schwefelatom befindet sich in einem Thioether und dient damit nur über die

freien Elektronenpaare als potentieller Bindungspartner für das Gold(III)-Zentrum.138-140

Die beiden unnatürlichen Aminosäuren 3-(3-Pyridin)-alanin und 3-(4-Pyridin)-alanin wurden

wegen des Pyridins in der Seitenfunktion gewählt. Das Pyridin ist bekannt für seine Fähigkeit

an Gold(III)-Komplexe zu binden.141, 142

Sie unterscheiden sich in der Stellung des Stickstoff-

atoms im Pyridinring. Dadurch wird der Bindungswinkel beeinflusst, was einen Einfluss auf

das Bindungsmotiv hat.

Ergebnisse

Seite | 43

Histidin ist eine natürliche Aminosäure mit einem N-heterocyclischen Aromaten und ähnelt

damit den Pyridinen der zuletzt genannten unnatürlichen Aminosäuren.

Das primäre Amin in der Seitenkette des Lysin und die unnatürlichen 2,3-Diaminopropion-

säure sollen eine Bindung zum Gold(III)-Ion ausbilden.143, 144

Die beiden Aminosäuren unter-

scheiden sich in der Länge der Alkylkette. Dies sollte einen Einfluss auf den Bindungswinkel

haben.

Asparaginsäure und Glutaminsäure sollten durch ihre Carbonsäure in der Seitengruppe eine

Bindung zum Goldatom vom AuPhPyCl2 2 ausbilden können.145

Nach dem HSAB Prinzip

sollte dies zwar nicht wahrscheinlich sein,126

jedoch hatten die Versuche bei Verbindung 32

gezeigt, dass die Carbonsäuren sehr wohl eine Bindung zum Gold(III)-Komplex aufbauen

konnten. Die unterschiedliche lange Alkylkette sollte, analog zu dem oben genannten Fall mit

den primären Aminen, zu unterschiedlichen Bindungsverhältnissen führen und damit beein-

flussen, ob eine Bindung zu Goldatom ausgebildet werden kann.

Alanin wurde als Blindprobe ausgewählt, welche keine Bindung durch ihre Funktionalität

ausbilden kann.

Abstandsaminosäuren

Es wurden drei verschiedene Abstandsaminosäuren ausgewählt. Die erste Abstandsaminosäu-

re ist Glycin. Glycin wurde als einfachste Aminosäure, welches lediglich ein Wasserstoffatom

in der Seitengruppe besitzt, verwendet. Die Zweite ist Prolin, die einzige natürliche Amino-

säure mit sekundärem Amin, wurde verwendet um die Bindungswinkel zu verändern. Analog

zu Verbindung 26 sollte hiermit herausgefunden werden, ob auch der Winkel einen Einfluss

auf die Bindung von der Peptidsequenz zum AuPhPyCl2 2 hat. Als dritte Abstandsaminosäure

wurde Leucin verwendet, da diese Aminosäure durch die Isopropylfunktion als Seitengruppe

einen gewissen sterischen Anspruch hat.

Aufbau der Sequenz

In der Tabelle 3-4 ist der Aufbau der Sequenzen wiedergegeben. Die Sequenzen sollten an

einem Harz ohne Linker dargestellt werden.

Ergebnisse

Seite | 44

Π-AS1-AS2-AS3-Harz

Π AS1 AS2 AS3

4-Pentinsäure A,B,C,D,E,H,J,K,M,Z G,P,L A,B,C,D,E,H,J,K,M,Z Tabelle 3-4: Schematischer Aufbau der Sequenzen am Harz im Einbuchstabencode

Die Peptide sind von N-Terminus beginnend wie folgt aufgebaut: Die 4-Pentinsäure, es folgt

eine der bindende Aminosäure, dann kommt eine Abstandsaminosäure, wieder eine bindende

Aminosäure und am C-Terminus befindet sich das Harz. In diesem Projekt wurden jede mög-

liche Kombinationen synthetisiert, dafür wurden alle zehn Möglichkeiten von AS1 verwendet,

während AS2 und AS3 nicht verändert wurden. Dann wurde eine neue AS3, bei gleichbleiben-

der AS2, verwendet und wieder alle zehn Möglichkeiten von AS1 in dieser Kombination dar-

gestellt. Nachdem alle 100 Kombinationen von AS1 und AS3 synthetisiert waren, wurde AS2

gewechselt und alle Möglichkeiten in dieser Zusammensetzung dargestellt. Das ganze wurde

dann für die dritte Abstandsaminosäure AS2 wiederholt und alle 100 hierbei möglichen Kom-

bination synthetisiert.

Synthese

Die Synthese der Peptidsequenzen wurden an einem Syro Multiple Peptid Synthesizer der

Firma Syro 2000 ausgeführt, wobei an einem Tentagal Macro Beads Harz gearbeitet wurde.

Jede einzelne Harzkugel hatte eine Partikelgröße zwischen 280 µm und 320 µm und eine Be-

ladung von 0.24 mmol/g. Die Lösungen mit den natürlichen Aminosäuren wurden in dem

Gerät in ihre vorgesehen Postion gesetellt, die unnatürlichen Aminosäuren, zu den auch die 4-

Pentinsäure gezählt wurde, wurden an Positionen gestellt, die vorher im Programm des Syn-

thesizer für sie eingestellt worden waren. Die Kupplungen wurden im fünffachen Überschuss

durchgeführt. Die Kupplungen jeder Aminosäuren wurden doppelt durchgeführt, damit ge-

währleistet war, dass jedes Peptid in maximaler Ausbeute am Harz vorhanden war. Dies ist

entscheidend, da eine Überprüfung der Beladung und der Reinheit der Sequenzen am Harz

nicht möglich ist. Nach der Synthese der Peptidsequenzen am Synthesizer wurde manuell

weiter gearbeitet. Die Seitenschutzgruppen der einzelnen Aminosäure wurden, wenn die Se-

quenz mindestens ein Methionin oder ein Cystein beinhaltete, mit einer Abspaltlösung mit

EDT behandelt, welches die Bildung von Disulfidbrücken unterbinden soll. Bei allen anderen

Sequenzen wurde der Abspaltlösung kein EDT zugegeben. Da das Harz keinen Linker besitzt,

blieben die Sequenzen am Harz gebunden und nur die Seitenschutzgruppen von den einzelnen

Ergebnisse

Seite | 45

Aminosäuren wurden abgespalten. Das Harz wurde gewaschen. Anschließend wurde die

Hälfte des Harzes aus den einzelnen Spritzen heraus genommen und in eine zweite 2 ml

Spritze mit Polypropylenfilter gegeben. In diese zweite Spritze wurde AuPhPyCl2 2 gegeben

und mit jeweils beiden Spritzen parallel weiter gearbeitet.

Analyse

Bei der Synthese war ein Harz ohne Linker verwendet worden. Dies sollte die Reinigung der

einzelnen Sequenzen und vor allem die Analytik beschleunigen. Eine schnelle Analytik ist bei

kombinatorischen Projekten häufig die größte Herausforderung.146, 147

Zur analytischen Auf-

klärung wurde von allen Harzkugeln die Farbe bestimmt, aus allen Spritzen wurden einige

Harzkugeln unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht und jede Sequenzen mit Glycin als

Abstandsaminosäure und Behandlung mit AuPhPyCl2 2 wurden unter dem Ramanspektro-

meter untersucht.148-150

Farbe der Harzkugeln

Die Farbe jeder Harzkugel wurde visuell und damit qualitativ bestimmt. Die Farbe der Kugel

mit und ohne Behandlung von AuPhPyCl2 2 konnten verglichen werden. Auf diese Weise

wurde ein Indiz erhalten, ob der Gold(III)-Komplex gebunden worden war, da AuPhPyCl2 2

gelbfarben ist. Violettfarbene sind ein Hinweis darauf, dass sich kolloidales Gold gebildet

hat.151

Dieses kann sowohl die Raman wie auch die Fluoreszenzmikroskopie beeinflussen.

Der Vergleich ist innerhalb von wenigen Augenblicken möglich.

Farbe im Fluoreszenzmikroskop

Die Untersuchungen am Fluoreszenzmikroskop sind bei vorbereiteten Proben innerhalb von

einer Minute möglich und damit stellte die Fluoreszenzmikroskopie ein sehr schnelles Verfah-

ren dar. Im UV-Licht des Fluoreszenzmikroskops wurde die Farbe der Harzkugeln qualitativ

bestimmt. Es wurden Kugeln beobachtet, welche blaufarben, blaufarben mit

gold/gelbfarbenen Rand, blaufarben mit schwach gold/gelbfarbenen Rand und farblos sind.

Beispiele für alle Fälle sind in den nächsten Abbildungen 3-29 und 3-30 gegeben.

Ergebnisse

Seite | 46

Abbildung 3-29: Fluoreszenzmikroskopaufnahme von ΠCGC-MB 50 auf der linken Seite und

ΠCGC-MBAuPhPy 350 auf der rechten Seite

Abbildung 3-30 Fluoreszenzmikroskopaufnahme von ΠCGD-MBAuPhPy 390 auf der linken Seite und

ΠZGE-MBAuPhPy 406 auf der rechten Seite

Da es sich nur um einen qualitativen Vergleich mit dem Fluoreszenzmikroskop bei den ge-

bundenen Gold(III)-Komplexen handelt, wurde ein quantitatives Verfahren bei einer aussage-

kräftigen großen Gruppe von Harzkugeln benötigt.

Ramanspektroskopie

Die Ramanspektroskopie stellt ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung der Schwin-

gungsbande von Molekülen dar.152, 153

Es wurden die Schwingung der ersten 100 mit

Ergebnisse

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AuPhPyCl2 2 behandelten Sequenzen von Meike Mischo aus der Physikalischen Chemie II

der Ruhr Universität Bochum untersucht und damit alle Bindungsmotive mit Glycin als Ab-

standsaminosäure und alle Kombinationen der bindenden Aminosäuren. Somit waren alle

Bindungsmotive ohne einen starren Bindungswinkel und ohne sterischen Anspruch abgedeckt

und sollten so bei der Bewertung der aus der Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Daten unter-

stützend wirken. Durch die im Ramanspektrometer erhalten Daten ist es möglich, Aussagen

über die Bindungsverhältnisse am der Sequenz am Harz zu tätigen. Für die Zuordnung der

einzelnen Banden wurden folgende Vergleichsverbindungen dargestellt:

Nummer Name

1 2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid

2 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)dichlorid

650 2-Phenylpyridin-1-gold(III)tribromid

651 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)dibromid

652 Tetraethylammoniumphenyltrichloroaurat(III)

653 Tetraethylammoniumphenyltribromoaurat(III)

654 Pyridin-1-gold(III)trichlorid

655 Pyridin-1-gold(III)tribromid

656 Bipyridin-1,1´gold(III)dichlorid tetrachloroaurat(III)

657 Bipyridin-1,1´gold(III)dibromid tetrabromoaurat(III)

658 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)ethandtihiol Tabelle 3-5: Verbindung zur Aufklärung der Ramanbanden

Die Verbindungen 1, 2, 652, 654 und 656 sind gemessen worden, um die Schwingungen des

2-Phenylpyridins zuordnen zu können und die Schwingung der Bindungen zum Goldatom.

Zur Bestimmung der Schwingungen der am Gold gebunden Chloride wurden die analogen

Verbindungen mit Bromid Liganden dargestellt. Verbindung 658 soll die Verschiebungen der

Schwingung bei einer Bindung zu einer Peptidsequenz wiederspiegeln.

Zur Aufklärung der Schwingungsbanden wurden folgende Verbindungen noch zusätzlich von

Dr. Pablo Nieto aus der Physikalischen Chemie II der Ruhr Universität Bochum

quantenmechanisch berechnet, um die Spektren simulieren zu können: 2-Phenylpyridin-

1,1´gold(III)dichlorid 2, 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)dibromid 651 und 2-Phenylpyridin-

1,1´gold(III)ethandtihiol 658. Die Rechnungen wurden von in der Dichtefunktionaltheorie

(DFT) durchgeführt. Sie wurden in einem Gaussian09 Code, mit der Berichtigung C.01 unter

Benutzung des Hybridaustauschfunktionals B3LYP ausgeführt. Alle Elektronen der Hetero-

atome und der Chloratome wurden mit den Basissätzen 6-31G(d`) und VTZ berechnet. Mit

dem gleichen Basissätzen wurden die Elektronen der Bromatome berechnet, wobei sie mit

Pseudopotentialen behandelt wurden, um die Validität der Ergebnisse zu erhöhen. Die Elekt-

Ergebnisse

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ronen der Goldatome wurden als Pseudopotentiale mit dem LANL2DZ Basissatz berechnet.

Alle Vibrationsschwingungen wurden ebenfalls mit Gaussian09 berechnet.

Durch die Vergleichsspektren wurden die Banden bei: 276 cm-1

, 374 cm-1

und 666 cm-1

ge-

funden, um sie für die Bestimmung zu nutzen, ob der Gold(III)-Komplex gebunden ist. Alle

drei Banden kommen durch Schwingungen in der Ebene des Phenylpyridinliganden zustande.

Die Banden wurden in drei Kategorien eingeteilt: schwach, mittel und stark. In Abbildung 3-

31 sind zwei gemessene Spektren, eines nach der Behandlung mit dem Gold(III)-Komplex

und eines ohne Behandlung, dargestellt. Die genutzten Banden sind in der Abbildung mar-

kiert.

Abbildung 3-31: Ramenspektren von der Sequenz ΠCGC-MB 59 ohne (schwarz) und mit (rotfarben)

Behandlung mit AuPhPyCl2 2

Bei vorbereiteten Proben ist es innerhalb von 20 Minuten möglich eine Probe zu messen. Da-

mit stellt die Ramanspektroskopie das aufwendigste hier verwendete Verfahren dar, jedoch ist

die Messgeschwindigkeit noch akzeptabel für ein kombinatorisches Projekt.

Ergebnisse

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Auswertung des 300 Peptide Projekts

Über die Auswertung der Daten des kombinatorischen Projektes sollten nun ein stabiles Bin-

dungsmotiv ermittelt werden. Hierfür wurde die Bestimmung der Farbe der Harzkugel ge-

nutzt, die Daten des Fluoreszenzmikroskops und die Ramanspektren.

Auswertung der Farbe

Die meisten Harzkugeln sind farblos, wenige schwach gelbfarben, nach der Behandlung ohne

AuPhPyCl2 2. Mit AuPhPyCl2 2 behandelte Harzkugeln konnten farblos, gelbfarben oder vio-

lettfarben sein.

Farblose Harzkugeln sind ein Anzeichen für die Abwesenheit des Gold(III)-Komplexes, wenn

die Kugeln gelbfarben sind, dann ist dies ein Indiz für seine Anwesenheit. Jedoch konnten die

Kugeln auch gelbfarben ohne die Behandlung mit AuPhPyCl2 2 sein. Um dies zu klären wur-

den die beiden anderen Messverfahren eingesetzt. Die beiden anderen Messverfahren konnten

jedoch von den violettfarbenen Harzkugeln behindert werden, da diese Färbung auf kolloida-

les Gold hindeutet und die Fluoreszenz von Goldnanopartikeln bekannt ist.151

Bei den Ab-

standsaminosäuren Glycin und Prolin sind jeweils 13 Peptisequenzen violettfarben im sicht-

baren Wellenlängenbereich. Bei Leucin ist es eine Sequenz mehr. In Tabelle 3-6 ist die Häu-

figkeit von bindenden Aminosäuren in violettfarbenen Peptidsequenzen aufgelistet.

Bindende

AS

Vorkommen in

violetten Sequenzen

Z 19

A 17

K 15

D 11

E 6

J 6

B 3

H 2 Tabelle 3-6: Vorkommen von Bindendenaminosäuren in violettfarbenen Sequenzen

Es fällt auf, dass bei keiner der Sequenzen mit Methionin und Cystein sich die violette Farbe

ausgebildet hat. Wie häufig sich die Färbung bei welchen bindenden Aminosäuren gebildet

hat, ist ein für die Stabilität der Bindung der funktionellen Gruppe zum Gold(III)-Komplex

Ergebnisse

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wichtiges Indiz. Umso häufiger sich kolloidalles Gold bei einer Aminosäure gebildet hat, um-

so ungünstiger ist diese als Bindungspartner. Nach dieser Theorie sind die beiden, mit primä-

ren Aminen in der Seitengruppe ausgestatteten Aminosäuren 2,3-Diaminopropionsäure und

Lysin die ungünstigsten. Alanin ist fast ebenso ungünstig. Bei dieser Aminosäure ist nicht die

Funktionalität in der Seitenkette für die Reduktion verantwortlich. Möglicherweise liegt es

daran, dass aus der Peptidsequenz, welche einen zweizähnigen Liganden bilden sollte, ein

einzähniger Ligand geworden ist. Dieser Ligand stabilisierte den Gold(III)-Komplex 2 dann

nicht mehr in ausreichendem Maße und es bildete sich kolloidales Gold. Die nächsten beiden

Aminosäuren, die bei Verwendung zur Bildung der violetten Farbe führen können, sind Aspa-

raginsäure und Glutaminsäure. Die Carbonsäure in der Seitengruppe, scheint in manchen Fäl-

len ebenfalls zur Bildung von elementarem Gold beigetragen zu haben. Schwach scheint der

Effekt bei den drei aromatischen Aminosäuren 3-(4-Pyridin)-alanin, 3-(3-Pyridin)-alanin und

Histidin ausgeprägt gewesen zu sein. Cystein und Methionin scheinen demnach den

Gold(III)-Komplex 2 zu stabilisieren. Demnach ergibt sich folgende Reihenfolge für die Sta-

bilität:

Z ≈ A ≈ K < D < E ≈ J < B ≈ H < C ≈ M

instabil stabil

Auswertung der Fluoreszenzmikroskopie

Die im visuellen getätigte Negativkontrolle für die Stabilität der Gold(III)-Peptidkomplexe

sollte mit der Fluoreszenzmikroskopie durch eine Positivkontrolle bestätigt werden. Es wur-

den folgende Kugeln im UV-Licht beobachtet: blaufarbene Kugeln, blaufarbene Kugeln mit

gelbfarbenem Rand, farblose Kugeln, gelbfarbene Kugel und blaufarbene Kugeln mit

schwach gelbfarbenen Rand.

Im UV-Licht sind alle Kugeln ohne Behandlung mit AuPhPyCl2 2 blaufarben, daraus wird

geschlossen, dass auch die blaufarbenen Harzkugeln nach AuPhPyCl2 2 Behandlung nicht den

Komplex gebunden haben. Dieser Eindruck wird durch die Farbe im sichtbaren Bereich ge-

stützt, denn diese Kugeln sind fast immer farblos, mal leicht gelbfarben.

Ergebnisse

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Harzkugeln, die blaufarben mit einem gelbfarbenen Rand im UV-Licht des Fluoreszenzmik-

roskops sind, haben fast immer eine gelbe Farbe im visuellen Bereich. Vermutlich binden

diese Kugeln den Gold(III)-Komplex.

Beim Vergleich der Sequenzen fällt auf, dass es zu meist keinen Unterschied gibt, welche

Abstandsaminosäure verwendet worden ist, bei gleichen bindende Aminosäuren ist im Prinzip

das Ergebnis sowohl im visuellen-, als auch im UV-Bereich dasselbe. Dieses Prinzip ist für

Prolin nicht so stark ausgeprägt. Während 18 Sequenzen mit Prolin nach den Fluoreszenzda-

ten den Gold(III)-Komplex 2 nicht binden, kam es zur Bindung bei Glycin oder Leucin. Für

Glycin und Leucin war dies nur bei jeweils drei Sequenzen der Fall. Eine Erklärung hierfür ist

der veränderte Winkel in der Sequenz durch das Prolin.

Zweimal binden Peptidsequenzen mit Glycin als Abstandsaminosäure, wenn die gleichen Se-

quenzen mit Prolin oder Leucin nicht koppelten. Zwei Sequenzen mit Prolin taten das selbige.

Bei Leucin sind es fünf Sequenzen, welche nach den Fluoreszenzdaten den Gold(III)-

Komplex 2 zu binden schienen, während die gleichen Sequenzen mit Glycin oder Prolin dies

nicht beobachten lassen. Eine mögliche Erklärung für diese etwas höhere Bindefähigkeit des

Leucins ist der durch die Isopropylgruppe leicht veränderte Bindungswinkel.

Auswertung der Ramanspektren

Da die Auswertung der Fluoreszenzspektren nur qualitativ und nicht quantitativ ist und eine

Zuordnung der selten vorkommenden farblosen Kugeln und gelbfarbene Kugel sowie der

häufiger vorkommenden blaufarbene Kugeln mit schwach gelbfarbenen Rand nicht möglich

ist, wurden von den ersten 100 Sequenzen, welche mit AuPhPyCl2 2 behandelt worden waren,

Ramanspektren gemessen.15

Die quantitativen Ramanspektren zeigen, dass nur die Kugeln

blaufarbene Kugeln mit gelbfarbenen Rand bei allen drei Banden eine mittlere oder eine star-

ke Ausprägung der Banden haben. Diese Kugeln haben den Gold(III)-Komplex gebunden.

Dies trifft auf folgende Verbindungen zu:

Nummer Name

350 ΠCGC-MBAuPhPy

351 ΠMGC-MBAuPhPy

354 ΠDGC-MBAuPhPy

355 ΠEGC-MBAuPhPy

356 ΠZGC-MBAuPhPy

Ergebnisse

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357 ΠBGC-MBAuPhPy

360 ΠCGM-MBAuPhPy

361 ΠMGM-MBAuPhPy

362 ΠHGM-MBAuPhPy

365 ΠEGM-MBAuPhPy

366 ΠZGM-MBAuPhPy

367 ΠBGM-MBAuPhPy

369 ΠKGM-MBAuPhPy

370 ΠCGH-MBAuPhPy

371 ΠMGH-MBAuPhPy

380 ΠCGA-MBAuPhPy

381 ΠMGA-MBAuPhPy

391 ΠMGD-MBAuPhPy

400 ΠCGE-MBAuPhPy

401 ΠMGE-MBAuPhPy

410 ΠCGZ-MBAuPhPy

411 ΠMGZ-MBAuPhPy

431 ΠMGJ-MBAuPhPy

441 ΠMGK-MBAuPhPy Tabelle 3-7: Verbindungen die den Gold(III)-Komplex binden

Wird das Auftreten der einzelnen bindenden Aminosäuren gezählt, dann kann folgende Liste

für die Stabilität der bindenden Aminosäuren daraus abgeleitet werden:

A ≈ J < D ≈ K ≈ B < E ≈ Z ≈ H < C < M

instabil stabil

Diskussion zu dem 300 Peptideprojekt

Die beiden in dem Projekt erstellten Stabilitätslisten zeigen, dass Cystein und Methionin die

beiden günstigsten Aminosäuren sind, um AuPhPyCl2 2 zu binden. Sequenzen mit günstigen

Aminosäuren sind in Tabelle 3-7 abgebildet. Die Tabelle 3-7 ist aus den Daten der Fluores-

zenzspektren und vor allem aus den Ramanspektren erstellt worden. Es ergeben sich aus den

Daten somit viele Verbindungen, die den Gold(III)-Komplex gebunden haben. Aus diesen

Verbindungen wurde die Stabilitätsliste erstellt. Bei der Zuordnung zur zweiten Liste, wurden

einige Verbindungen nicht berücksichtigt. Die Verbindungen ΠDGM-MBAuPhPy 373,

ΠCGB-MBAuPhPy 429 und ΠMGB-MBAuPhPy 430 haben einen gold/gelbfarbenen Rand

bei der Betrachtung im UV-Licht des Fluoreszenzmikroskops. Im Raman Spektrum sind bei

den Verbindungen die ersten beiden Banden mittel ausgeprägt, jedoch ist bei ihnen die Bande

bei 666 cm-1

nur schwach ausgeprägt. ΠAGM-MBAuPhPy 372 zeigt, trotz des Randes, nur

bei 374 cm-1

eine mittlere Bande. Die anderen Banden sind schwach ausgeprägt. Schwach

Ergebnisse

Seite | 53

sind alle Banden, trotz eines gold/gelbfarbenen Randes, bei den Verbindungen

ΠHGC-MBAuPhPy 361, ΠAGC-MBAuPhPy 362, ΠJGM-MBAuPhPy 377,

ΠCGD-MBAuPhPy 399 und ΠCGJ-MBAuPhPy 439. Die Verbindungen ΠJGE-MBAuPhPy

417, ΠDGJ-MBAuPhPy 443, ΠEGJ-MBAuPhPy 444, ΠBGJ-MBAuPhPy 446 und

ΠJGJ-MBAuPhPy 447 sind im UV-Licht des Fluoreszenzmikroskops blaufarben oder blau-

farben mit schwachem gold/gelbfarbenen Rand, haben jedoch neben den beiden schwachen

Banden 276 cm-1

und 374 cm-1

, auch eine mittlere Bande bei 666 cm-1

. ΠHGH-MBAuPhPy

381 und ΠEGH-MBAuPhPy 384 sind blaufarben beziehungsweise blaufarben mit schwach

gold/gelbfarbenen Rand, haben jedoch eine mittlere Bande bei 276 cm-1

. Das blaufarbene

ΠAGZ-MBAuPhPy 422 hat eine mittlere Band bei 374 cm-1

im Spektrum. ΠJGC-MBAuPhPy

367 und ΠCGE-MBAuPhPy 409 mit schwach gold/gelbfarbenen Rand hat mittlere Banden

bei allen drei Referenzwerten. Es kommen besonders häufig bei den Abweichungen die bei-

den Aminosäuren 3-(4-Pyridin)-alanin und Cystein vor. Jeweils eine als besonders günstige

und eine nicht besonders stabil eingeordnete Aminosäure. Lysin ist bei keiner abweichenden

Sequenz vorhanden, 2,3-Diaminopropionsäure befindet sich nur in einer. Die anderen Amino-

säuren sind gleich häufig in den Sequenzen vorhanden.

Bei den Sequenzen gibt es einen gemeinsamen Trend in allen Messmethoden, jedoch entzie-

hen sich einige Sequenzen diesem Trend. Dies kann dadurch zustande gekommen sein, dass

einige Banden als schwach einsortiert werden, aber doch schon fast die Größe einer mittleren

Bande erreicht haben. Dies erklärt zum Teil die oben abweichenden Werte zwischen Fluores-

zenzmikroskopie und Ramanspektroskopie. Eine weitere Erklärung für die Abweichung sind

störende Teilchen, wie zum Beispiel die violettfarbenen Goldnanopartikel. Die Bildung von

anderen Spezies ist daneben denkbar, die dann eine Bande bei 276 cm-1

, 374 cm-1

oder

666 cm-1

haben.

Stabilität in Lösung

Bei der Synthese der 300 Peptidsequenzen am Harz ohne Linker sind sehr viele potentielle

Bindungsmotive entdeckt worden. Um diese Entdeckungen unter dem Fluoreszenzmikroskop

und im Ramanspektrometer zu stützen, wurden einige der potentiell bindenden Peptidse-

quenzen an einem Harz mit Linker dargestellt. Diese potentiell bindenden Peptidsequenzen

müssen mit AuPhPyCl2 2 in Lösung getestet werden, um die langfristige Stabilität des entste-

Ergebnisse

Seite | 54

henden Adduktes zu klären und eine in der Praxis verwendbare Sequenz zu finden. Wichtig

für die Praxis ist ein Bindungsmotiv, welches über mehrere Tage in Lösung stabil ist.

Zur Einschränkung der Auswahl der möglichen stabilen Bindungsmotive, wurden nur Se-

quenzen mit einem Glycin als Abstandsaminosäure AS2 gewählt. Es wurde also nicht aus al-

len 300 Peptiden ausgewählt, sondern nur aus den ersten 100 Peptiden. Von diesen 100 Se-

quenzen wurden dann solche Peptide ausgewählt, die intensive Hinweise zur Bindung des

Gold(III)-Komplexes 2 im Fluoreszenzmikroskop oder im Ramanspektrometer geliefert ha-

ben. Zwei Sequenzen wurden ausgewählt, da sich bei ihnen das Harz violett gefärbt hatte. Es

ergaben sich folgende Sequenzen:

Nummer Name

659 ΠCGC-NH2

660 ΠMGC-NH2

661 ΠEGC-NH2

662 ΠZGC-NH2

663 ΠBGC-NH2

664 ΠCGM-NH2

665 ΠZGM-NH2

666 ΠJGM-NH2

667 ΠKGM-NH2

668 ΠCGH-NH2

669 ΠMGH-NH2

670 ΠCGA-NH2

671 ΠMGA-NH2

672 ΠZGD-NH2

673 ΠKGD-NH2

674 ΠCGZ-NH2

675 ΠDGZ-NH2

676 ΠZGZ-NH2

677 ΠCGB-NH2

678 ΠBGB-NH2

679 ΠJGB-NH2

680 ΠCGJ-NH2

681 ΠMGK-NH2 Tabelle 3-8 Sequenzen für Tests in Lösung

Diese Sequenzen wurden mittels der Festphasenpeptidsynthese dargestellt, vom Harz abge-

spalten und in Lösung mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Es wurde immer nach einer Stunde und

nach fünf Stunden eine analytische HPLC-Messung von der Reaktionslösung durchgeführt.

Ergebnisse

Seite | 55

Abbildung 3-32 ΠCGZ-NH2AuPhPy

Als eine exemplarische Verbindung von dieser Testreihe wird ΠCGZ-NH2AuPhPy 682 hier

gezeigt.

Abbildung 3-33: HPLChromatogramme vom der Reaktionslösung mit AuPhPyCl2 2 und ΠCGZ-NH2 674.

Der Peak bei 18.2 min entspricht ΠCGZ-NH2AuPhPy 682

Das Chromatogramm nach einer Stunde stellt einen wenig intensiven Peak bei 12.7 min und

einen stärker intensiven Peak bei 18.2 min da. Nach fünf Stunden ist der Peak bei 12.7 min

verschwunden. Es sind dafür viele neue Peaks entstanden. Die stärksten dieser neuen Peaks

liegen bei 17.7 min und 18.6 min. Von dem Peak bei 18.2 min wurde ein ESI-Massenspekt-

rum aufgenommen. Das Spektrum hatte ein Signal bei m/z = 693. Dies entspricht dem

protonierten ΠCGZ-NH2AuPhPy 682.

Ergebnisse

Seite | 56

ΠCGZ-NH2AuPhPy 682 war bei der Reaktion als Produkt entstanden. Es zersetzte sich je-

doch und es entstanden neue Produkte. Dies war bei vielen der eingesetzten Sequenzen zu

beobachten.

Abbildung 3-34: ΠEGC-NH2AuPhPy

Sehr viel seltener trat ein Fall wie ΠEGC-NH2AuPhPy 683 auf. Dies ist ein anderes Beispiel

was bei der Reaktion der Peptidsequenz ΠEGC-NH2 661 mit AuPhPyCl2 2 in einer Mischung

aus einem Teil Wasser und einem Teil Acetonitril passieren konnte.

Abbildung 3-35: HPLChromatogramme vom der Reaktionslösung mit AuPhPyCl2 2 und ΠEGC-NH2 661.

Der Peak bei 17.5 min kann ΠEGC-NH2AuPhPy 683 zugeordnet werden

Es wurden wieder von der Reaktionslösung zwei analytische HPLC-Messungen durchgeführt.

Eine Messung wurde nach einer Stunde, die andere nach fünf Stunden durchgeführt. Im Chro-

matogramm der Messung nach einer Stunde sind mehrere Peaks zu erkennen. Die drei inten-

Ergebnisse

Seite | 57

sivsten Peaks waren nach 16.5 min, 17.5 min und 18.5 min. Nach fünf Stunden ist das Signal

bei 16.5 min gänzlich verschwunden und die beiden anderen Signale sind noch zu erkennen.

Der Peak nach 17.5 min wurde isoliert und mittels eines ESI-MS charakterisiert. Es ist ein

Signal bei m/z = 735 zu beobachten. Dieses Signal entspricht der Masse von

ΠEGC-NH2AuPhPy 683. Die Verbindung 683 wurde in Wasser gelöst und eine analytische

HPLC wurde nach einer halben Stunde von der Lösung gemessen. Das Chromatogramm ent-

spricht dem oben gezeigten der Reaktionslösungsmessung nach fünf Stunden. In Lösung ist

ΠEGC-NH2AuPhPy 683 somit nicht stabil.

Durch Zugabe von AuPhPyCl2 2 zu den oben gezeigten Peptiden und nach der Charakterisie-

rung mittels der analytischen HPLC und der ESI-MS konnten folgende Verbindungen erhal-

ten werden:

Nummer Name

684 ΠCGC-NH2AuPhPy

685 ΠMGC-NH2AuPhPy

683 ΠEGC-NH2AuPhPy

686 ΠZGC-NH2AuPhPy

687 ΠBGC-NH2AuPhPy

688 ΠCGM-NH2AuPhPy

689 ΠZGM-NH2AuPhPy

690 ΠJGM-NH2AuPhPy

691 ΠKGM-NH2AuPhPy

692 ΠCGH-NH2AuPhPy

693 ΠMGH-NH2AuPhPy

694 ΠCGA-NH2AuPhPy

695 ΠMGA-NH2AuPhPy

696 ΠKGD-NH2AuPhPy

682 ΠCGZ-NH2AuPhPy

697 ΠDGZ-NH2AuPhPy

698 ΠZGZ-NH2AuPhPy

699 ΠCGB-NH2AuPhPy

700 ΠJGB-NH2AuPhPy

701 ΠCGJ-NH2AuPhPy

702 ΠMGK-NH2AuPhPy Tabelle 3-9: Sequenzen die den Gold(III)-Komplex binden

Der Reaktionsverlauf zur Synthese dieser Verbindungen wurden immer nach einer und nach

fünf Stunden mit der analytischen HPLC kontrolliert. Die meisten der Kontrollen zur Synthe-

se dieser Verbindungen verhielten sich, analog zum oben beschrieben Fall für

ΠCGZ-NH2AuPhPy 682. Das Produkt bildete sich am Anfang und zersetzte sich dann in Ne-

benprodukte. Ein sehr viel seltenerer Fall verlief analog zu ΠEGC-NH2AuPhPy 683. Es sind

Ergebnisse

Seite | 58

im Chromatogramm nach einer Stunde viele Peaks zu erkennen, deren Anzahl nach fünf

Stunden abgenommen hat.

Zusammenfassung des 300 Peptideprojekts

Von den Peptidsequenzen in Lösung haben fast alle AuPhPyCl2 2 gebunden. Keine der

Peptidsequenzen bindet jedoch den Gold(III)-Komplex 2 über längere Zeit stabil. Es ist durch

das Kombinatorische Projekt herausgefunden worden, dass von den eingesetzten bindenden

Aminosäuren: Alanin, Asparaginsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, Cystein, Glutaminsäure,

Histidin, Lysin, Methionin, 3-(3-Pyridin)-alanin und 3-(4-Pyridin)-alanin zum AuPhPyCl2 2

koordinierten und lediglich das als Blindprobe eingesetzte Alanin überhaupt nicht gebunden

hat. Die beiden mit Carbonsäurefunktion eingesetzten Aminosäuren Glutaminsäure und Aspa-

raginsäure bauten die instabilste Bindung zum AuPhPyCl2 2 auf. Die über die Stickstoffatome

koordinierenden Aminosäuren Lysin, Histidin, 3-(3-Pyridin)-alanin, 3-(4-Pyridin)-alanin und

2,3-Diaminopropionsäure binden etwa gleich stabil zum Gold(III)-Komplex 2. Es fällt jedoch

tendenziell ein Unterschied zwischen Lysin und 2,3-Diaminopropionsäure auf. Beide tragen

ein primäres Amin als Bindungspartner und unterschieden sich nur in der Länge der Alkylket-

te. Trotzdem schien 2,3-Diaminopropionsäure etwas besser zu binden. Dies kann an den güns-

tigeren Bindungswinkeln durch die kürzere Alkylkette gelegen haben. Histidin, 3-(3-Pyridin)-

alanin und 3-(4-Pyridin)-alanin wichen kaum bei den Untersuchungen voneinander ab. Me-

thionin und Cystein erwiesen sich als die Aminosäuren, welche die stabilste Bindung zum

AuPhPyCl2 2 aufgebaut haben. Cystein erwies sich hierbei als noch etwas stärker in seiner

Bindefähigkeit.

A < E ≈ D < K ≈ Z < H ≈ B ≈ J < M < C

instabil stabil

Mehr Abstandsaminosäuren

Das Projekt der 300 Peptidsequenzen hat eine Vielzahl von neuen Bindungsmotiven hervor-

gebracht. Jedoch bildete keines der Bindungsmotive einen über fünf Stunden stabilen Kom-

plex mit AuPhPyCl2 2, aber es wurden gezeigt wie gut die bindenden Aminosäuren zum

Gold(III)-Komplex binden. Dadurch hat sich bei den bisher getätigten Versuche Cystein als

die beste bindende Aminosäure herausgestellt. Eine mögliche Ursache, warum

ΠCGC-NH2AuPhPy 684 dennoch keinen stabilen Komplex hervorgebracht hat, kann eine zu

Ergebnisse

Seite | 59

hohe Spannung im Peptidrückgrat sein. Diese Vermutung kann durch das Hinzufügen mehre-

rer Abstandsaminosäuren bestätigt werden.

Abbildung 3-36: ΠCGGC-NH2AuPhPy

Als erstes wurde eine Sequenz mit zwei Glycinen als Abstandsaminosäure zwischen den bei-

den bindenden Cysteinen synthetisiert. Diese Sequenz ΠCGGC-NH2 703 wurde mit

AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Von der Reaktionslösung wurde nach einer Stunde, nach fünf Stun-

den, nach 24 Stunden und nach 75 Stunden jeweils eine analytische HPLC Messung durchge-

führt.

Abbildung 3-37: HPLChromatogramme der Reaktionslösung mit AuPhPyCl2 2 und ΠCGGC-NH2 703.

Der Peak bei 18.6 min entspricht ΠCGGC-NH2AuPhPy 704

Ergebnisse

Seite | 60

Das Chromatogramm für die Messung nach einer Stunde hat zwei Peaks. Der erste Peak wird

bei 12.5 min beobachtet und der zweite Peak kann bei 18.6 min erkannt werden. Der Peak bei

12.5 min verliert im Vergleich zum Peak bei 18.6 min an Intensität. Nach 24 Stunden ist der

Peak nach 12.5 min gänzlich verschwunden, der Peak bei 18.6 min jedoch immer noch zu

erkennen, dafür sind mehrere Peaks um 15.1 min entstanden. Die Peaks um 15.1 min sind bei

75 Stunden noch intensiver geworden. Vom Peak bei 18.6 min wurde ein ESI- Massenspekt-

rum aufgenommen. Dieses Massenspektrum lässt eine Masse von m/z = 767 beobachten.

Diese Masse passte zur protonierten Verbindung 704.

Die abstandhaltende Glycinkette zu verlängern, schien die Fähigkeit der Sequenz zu erhöhen

einen stabilen Komplex mit AuPhPyCl2 2 auszubilden. ΠCGGC-NH2 703 bildete im Ver-

gleich zu ΠCGC-NH2 659 einen stabileren Komplex aus. Die Chromatogramme von Kom-

plex ΠCGGC-NH2AuPhPy 704 zeigen, dass die Verbindung 704 sich immer noch zersetzt.

Aufgrund dieser Zersetzung wurde die Kette noch um eine weitere Aminosäure verlängert.

Abbildung 3-38: ΠCGGGC-NH2AuPhPy

ΠCGGGC-NH2 705 wurde zusammen mit Verbindung 2 in einer Lösungsmittelmischung aus

Wasser und Acetonitril zusammen gebracht. Es wurden erneut zeitabhängige Messungen auf

der analytischen HPLC durchgeführt.

Ergebnisse

Seite | 61

Abbildung 3-39: HPLChromatogramm der Reaktionslösung zur Verbindung ΠCGGGC-NH2AuPhPy

706. Der Peak bei 17.8 min entspricht dem Produkt 706

Alle Chromatogramme geben einen Peak bei 17.8 min wieder. Es sind in allen Chroma-

togrammen nur Spuren von anderen Produkten zu erkennen. Bei diesem Versuch war also

eine stabile Verbindung generiert worden, die nicht mehr dazu neigte sich in wässrigen Lö-

sungen zu zersetzen. Diese Verbindung wird quantitativ erhalten.

Ergebnisse

Seite | 62

Abbildung 3-40: ESI-Massenspektrum von ΠCGGGC-NH2AuPhPy 706. Es ist in Wasser und Acetonitril

aufgenommen

Von dem Produkt bei 17.8 min wurde ein ESI-Massenspektrum gemessen. Im Spektrum ist

ein Signal mit der Masse von m/z = 824 zu erkennen. Die Massen kann dem protonierten

ΠCGGGC-NH2AuPhPy 706 zugeordnet werden. Damit ist die stabile Verbindung gefunden,

nach der durch viele Tests gesucht worden war.

Abbildung 3-41: ΠCGGGGC-NH2AuPhPy

Dieses interessante Ergebnis warf nun die Frage auf, was bei einer weiteren Verlängerung der

Kette der Abstandsaminosäuren aus Glycinen passieren würde. Aus diesem Grund wurde

Ergebnisse

Seite | 63

ΠCGGGGC-NH2 707 synthetisiert. ΠCGGGGC-NH2 707 wurde dann mit AuPhPyCl2 2 um-

gesetzt.

Abbildung 3-42: HPLChromatogramme der Reaktionslösung von ΠCGGGGC-NH2 707 und AuPhPyCl2

2. Der Peak bei 17.0 min kann ΠCGGGGC-NH2AuPhPy 708 zugeordnet werden

Es wurden die gleichen zeitabhängigen Messungen wie zuvor an der analytischen HPLC

durchgeführt. Das erste Chromatogramm, welches eine Stunde nach Reaktionsbegin aufge-

zeichnet worden war, hat einen intensiven Peak bei 17.0 min und einen sehr schwachen bei

15.4 min. Im Chromatogramm nach fünf Stunden sind beide Peaks immer noch zu beobach-

ten, jedoch hat der Peak bei 17.0 min schon eine Schulter gebildet. Diese Schulter ist nach

24 Stunden zu einem eigenen Peak angewachsen. 75 Stunden nachdem Start der Reaktion war

der Peak bei 17.0 min weniger intensiv als der Peak, welcher sich aus der Schulter entwickelt

hat. Es sind dazu auch viele neue Peaks entstanden. Von dem Signal bei 17.0 min wurde eine

ESI-MS Messung durchgeführt. Das Signal im Massenspektrum liegt bei m/z = 881. Dies

entspricht der protonierten Verbindung ΠCGGGGC-NH2AuPhPy 708. ΠCGGGGGC-NH2

709 wurde als Peptidsequenz mit der längsten Abstandsaminosäure Sequenz synthetisiert.

Nach der Reaktion wurden vergleichbare zeitabhängige HPLC-Messungen durchgeführt.

Ergebnisse

Seite | 64

Abbildung 3-43: Chromatogramm der Reaktionslösung mit ΠCGGGGGC-NH2 709 und AuPhPyCl2 2

In allen Chromatogrammen sind eine Vielzahl von Peaks festzustellen. Es wurde eine

LC-ESI-MS angefertigt. Keines der Signale kann ΠCGGGGGC-NH2 AuPhPy 710 zugeordnet

werden.

Bindung über eine α-Helix

Durch die bisherigen Versuche ist festgestellt werden, dass Cystein die stärkste Bindung zu

AuPhPyCl2 2 ausgebildet hat. Die Cysteine müssen den richtigen Abstand zueinander haben.

Dies wurde durch die Verlängerung der Ketten mit Glycinen als Abstandsaminosäure gezeigt.

Möglicherweise bildeten die Peptidketten α-Helices. In diesem Fall wäre die Position der

Cysteine in der Spirale entscheidend für seine Bindefähigkeit zum Gold(III)-Komplex 2. Ob

das Peptid ΠCGGGC-NH2 706 über eine α-Helix zum Gold(III)-Komplex 2 bindet, sollte

über die nicht native Aminosäure 2-Aminoisobutansäure herausgefunden werden. Diese Ami-

nosäure zwingt die Peptidsequenz in eine α-helicale Struktur. Falls es immer noch zu einem

stabilen Komplex zwischen dem neuen Peptid und AuPhPyCl2 2 kommen sollte, dann wäre

dies ein Indiz für eine α-helicale Struktur der Peptidsequenz.

Ergebnisse

Seite | 65

Abbildung 3-44: Links wurde ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 712, rechtes die Valenzstrichformel, der

Einbuchstabencode und der Name von 2-Aminoisobutansäure

AuPhPyCl2 2 und ΠCGΔGC-NH2 711 wurden zur Reaktion gebracht. Die üblichen analyti-

schen HPLC-Messungen mit den standardisierten Zeitabständen wurden durchgeführt.

Abbildung 3-45: Reaktionslösung mit AuPhPyCl2 2 und ΠCGΔGC-NH2 711. Der Peak bei 18.2 min ent-

spricht ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 712

Das erste Chromatogramm hat zwei Peaks. Einen wenig intensiven Peak bei 14.3 min und

einen intensiven Peak bei 18.2 min. Fünf Stunden später ist der Peak 14.3 min verschwunden

und ein neuer Peak bei 19.2 min ist entstanden. Nach 24 Stunden sind sehr viele Peaks um die

beiden Peaks bei 18.2 min und 19.2 min zu erkennen. Die beiden entstandenen Produkte zer-

setzten sich in viele neue Verbindungen. 75 Stunden nach Beginn der Reaktion verstärkte sich

Ergebnisse

Seite | 66

dieser Effekt noch. Von dem Peak bei 18.2 min war ein ESI-MS aufgenommen worden. Das

Signal liegt bei m/z = 852. Dies entspricht der protonierten Masse von

ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 712.

Nach diesen Ergebnissen scheint keine Peptid α-Helix den GoldKomplex 2-Phenylpyridin-

1,1´gold(III) stabil zu binden. Wenn die Sequenz in die Struktur einer α-Helix durch 2-Ami-

noisobutansäure gezwungen wurde, entstand zwar ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 712, jedoch ist

dies das kinetisch stabile Produkt, doch nicht das thermodynamisch stabilste.

ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 712 zersetzte sich wieder und es entstehen viele neue Produkte. Die

Peptidsequenz ΠCGGGC-NH2 706 scheint nicht in einer α-helicalen Struktur in

ΠCGGGC-NH2AuPhPy 707 vorzuliegen.

Erhöhung der Löslichkeit in Wasser

Nachdem der erste Versuch eine neue Abstandsaminosäure in das Bindungsmotiv 706 nicht

zu einer neuen stabil chelatisierenden Sequenz geführt hatte, sollte das Peptid weiter modifi-

ziert werden. Das Bindungsmotiv sollte so modifiziert werden, dass es besser in Wasser lös-

lich sein sollte. Die Löslichkeit von ΠCGGGC-NH2AuPhPy 707 in Wasser ist nur mäßig,

schon bei Konzentrationen von 1 mol/l fällt es aus Lösung aus. Um höhere Löslichkeit in

Wasser zu erreichen, sollten analog zu Verbindung ΠCRC-NH2AuPhPy 49 die Glycine durch

Arginin ausgetauscht werden.

Abbildung 3-46: ΠCRRRC-NH2AuPhPy

Ergebnisse

Seite | 67

ΠCRRRC-NH2 713 wurde zur Erzeugung der besser in Wasser löslichen Sequenz mit

AuPhPyCl2 2 zusammen gegeben. Von der so erzeugten gelbfarbene Lösung wurde erneut

nach einer, nach fünf, nach 24 Stunden und nach 75 Stunden eine analytische HPLC-Mes-

sung durchgeführt.

Abbildung 3-47: Reaktionslösung von ΠCRRRC-NH2 713 und AuPhPyCl2 2. Der Peak bei 16.6 min kann

ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 zugeordnet werden

Alle Chromatogramme haben einen Peak bei 16.6 min. Sie haben daneben nur Spuren von

anderen Peaks. Damit wird ein Produkt in quantitativer Ausbeute erhalten.

Ergebnisse

Seite | 68

Abbildung 3-48: ESI-Massenspektrum von ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714. Gemessen in Wasser und Aceto-

nitril

Es wurde von der neuen Verbindung ein ESI Massenspektrum aufgenommen. Das Spektrum

hat ein Signal bei m/z = 561. Dies entspricht der zweifach geladenen Masse von

ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714. Damit ist es gelungen, ein stabiles und gut in Wasser lösliches

Biokonjugat darzustellen.

Zusammenfassung der Kettenverlängerung

Die Kettenverlängerung mit zwei weiteren Abstandsaminosäuren sorgt für eine höhere Stabi-

lität der Verbindungen in Wasser. Erneut instabiler in Waser wird das Konjugat bei einer wei-

teren Verlängerung der Kette, damit scheinen die Cysteine das AuPhPyCl2 2 am besten mit

drei Abstandsaminosäuren binden zu können. Wird die Nomenklatur für α-Helices verwendet,

dann würde die Bezeichnung i+(i+3) für das günstigste Peptid lauten. Hierbei steht das „i“ für

jeweils ein bindendes Cystein und die Zahl für die Anzahl der Abstandsaminosäuren. Die

Versuche mit 2-Aminoisobutansäure deuten darauf hin, dass das bindende Peptid jeweils

nicht über eine α-Helix an das AuPhPyCl2 2 bindet. Es scheint keinen Einfluss auf das

Konjugat zu haben, wenn sterisch anspruchsvolle Gruppen an den Abstandsaminosäuren ge-

bunden sind. Dies war durch die Verwendung von Arginin zu beobachten. Aus allen bisher

herhalten Ergebnissen wird geschlossen, dass die Struktur des Peptides aus Kettenlänge und

Freiheitsgraden des Peptidrückgrats von genauso entscheidender Bedeutung ist, wie die Aus-

Ergebnisse

Seite | 69

wahl der zum Gold(III)-Komplex 2 bindenden Aminosäuren. Wenn ΠCRRRC-NH2AuPhPy

714 in DMSO gelöst wurde, dann konnte die Zersetzung des Produktes in Chromatogrammen

von analytischen HPLC-Messungen beobachtet werden. DMSO war ein ungeeignetes Lö-

sungsmittel für die Verbindung ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714. Das Lösungsmittel hat evidenten

Einfluss auf die Stabilität der Verbindungen.

16 Peptide

ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 bindet als stabile und gut in Wasser lösliche Sequenz. Diese Se-

quenz 713 ist über die beiden Cysteine an den Gold(III)-Komplex gebunden. Was passiert

nun, wenn eines der beiden Cysteine durch eine der anderen oben getesteten bindenden Ami-

nosäuren ausgetauscht wird? Wird eine weitere stabile Sequenz gefunden? Um eine Antwort

auf diese Fragen zu erhalten, wurden alle 16 möglichen Sequenzen dargestellt, bei der die

eine bindenden Aminosäure Cystein ist und andere bindende Aminosäure entweder Aspara-

ginsäure, 2,3-Diaminopropionsäure, Glutaminsäure, Histidin, Lysin, Methionin,

3-(3-Pyridin)-alanin oder 3-(4-Pyridin)-alanin sind. Die Blindprobe Alanin wurde nicht ver-

wendet, da sie oben keine stabilisierenden Eigenschaften gezeigt hat. Es wurden folgende

Peptide synthetisiert:

Änderung der C-Terminal

bindenden AS

Änderung der N-Terminal

bindenden AS

ΠCRRRB-NH2 715 ΠBRRRC-NH2 716

ΠCRRRD-NH2 717 ΠDRRRC-NH2 718

ΠCRRRE-NH2 719 ΠERRRC-NH2 720

ΠCRRRH-NH2 721 ΠHRRRC-NH2 722

ΠCRRRJ-NH2 723 ΠJRRRC-NH2 724

ΠCRRRK-NH2 725 ΠKRRRC-NH2 726

ΠCRRRM-NH2 727 ΠMRRRC-NH2 728

ΠCRRRZ-NH2 729 ΠZRRRC-NH2 730 Tabelle 3-10: Die Sequenzen der 16 Sequenzen

Jedes der Peptide wurde in Lösung mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Von den gelbfarbenen Reak-

tionslösungen wurden zeitabhängige analytische HPLC-Messungen durchgeführt. In den

Chromatogrammen nach einer Stunde ist bei allen Verbindungen, bei welchen Cystein näher

am C-Terminus sitzt, nur ein Peak zu erkennen. Dies ist bei den anderen Sequenzen nur bei

ΠCRRRD-NH2 717 und ΠCRRRH-NH2 721 der Fall. In allen Chromatogrammen ist über die

ersten drei Zeiten ein intensiver Peak zu beobachten. Bei den Sequenzen mit Cystein in der

Ergebnisse

Seite | 70

Nähe des N-Terminus ist nur in Kombination mit Histidin und Lysin der intensivste Peak

nach 75 Stunden immer noch gut auszumachen und es sind jeweils nur zwei neue Peaks zu

erkennen. Wenn Cystein in der Nähe des C-Terminus ist, dann gilt das gerade beschriebene

bei allen Aminosäuren außer bei Asparaginsäure und Glutaminsäure. Zwischen den beiden

Aminosäuren 3-(3-Pyridin)-alanin und 3-(4-Pyridin)-alanin konnte kein Unterschied ausge-

macht werden. In beiden Fällen ist es wieder günstiger, wenn Cystein in der Nähe des C-

Terminus befindlich ist. Methionin in den Sequenzen zeigt bei den Addukten ähnliche Stabili-

tät, mit der gleichen Anzahl und Intensität der Nebenpeaks in den Chromatogrammen, wie die

nicht nativen Aminosäuren 2,3-Diaminopropionsäure, 3-(3-Pyridin)-alanin und 3-(4-Pyridin)-

alanin. Ein ESI-Massenspektrum wurde jeweils vom Hauptpeak, der sich zuerst gebildet hat-

te, aufgenommen. Diese geben jeweils ein starkes Signal für ein zweifach geladenes Ion an.

Diese Signale können in allen Fällen dem Addukt aus Peptid und Gold(III)Komplex 2 zuge-

ordnet werden. Nach 75 Stunden wurden LC-ESI-MS Läufe gemessen. Mit den so erhalten

Signalen wurde festgestellt, dass einige Peaks der Masse der jeweiligen Zielverbindung plus

der Masse von Wasser, 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III) oder Peptid zugeordnet werden können.

Änderung der C-Terminal

bindenden AS mit AuPhPy

Änderung der N-Terminal

bindenden AS mit AuPhPy

ΠCRRRB-NH2AuPhPy 731 ΠBRRRC-NH2AuPhPy 732

ΠCRRRD-NH2AuPhPy 733 ΠDRRRC-NH2AuPhPy 734

ΠCRRRE-NH2AuPhPy 735 ΠERRRC-NH2AuPhPy 736

ΠCRRRH-NH2AuPhPy 737 ΠHRRRC-NH2AuPhPy 738

ΠCRRRJ-NH2AuPhPy 739 ΠJRRRC-NH2AuPhPy 740

ΠCRRRK-NH2AuPhPy 741 ΠKRRRC-NH2AuPhPy 742

ΠCRRRM-NH2AuPhPy 743 ΠMRRRC-NH2AuPhPy 744

ΠCRRRZ-NH2AuPhPy 745 ΠZRRRC-NH2AuPhPy 746 Tabelle 3-11: Sequenzen mit 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)-Ligand

Aus den Chromatogrammen ergab sich dann folgende Reihenfolge der AS für die Stabilität

der Verbindungen:

E ≈ D < B ≈ J ≈ Z ≈ M < H < K

instabil stabil

Allerdings spielt für die Stabilität die Position des Cysteins in der Sequenz eine Schlüsselrol-

le. Die Verbindungen mit Cystein in der Nähe des C-Terminus sind stabiler, als die mit Cys-

tein in der Nähe des N-Terminus. Mögliche Erklärungen hierfür sind eine Abschirmung der

N-terminalen Aminosäure durch die 4-Pentinsäure und das benachbarte Arginin oder ein

günstiges herausstehen des C-terminalen Cysteins aus der Sequenz. Keine der neuen Verbin-

Ergebnisse

Seite | 71

dungen ist in den Versuchen so stabil wie ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714. Cystein ist bei drei

Abstandsaminosäuren der günstigste Ligand.

Ergebnisse

Seite | 72

[3+2] Cycloaddition mit dem stabilen Bindungsmotiv

Abbildung 3-49: Reaktionsgleichung der [3+2] Cycloreaktion zwischen ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 und

ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42

Mit ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 ist eine stabile Verbindung erhalten worden, mit der die

[3+2] Cycloaddition versucht werden konnte. Als Reaktionspartner wurde ORRRRRPLG-

LYALEEEEE-NH2 42 ausgewählt, um die angestrebte Zielverbindung darzustellen. In der

Tabelle 3-12 sind die verwendeten Reaktionsbedingungen wiedergegeben:

Lösungsmittel Kupferquelle Hilfsreagenz Base

H2O/ACN Kupfersulfat Natriumascorbat

H2O/t-Butanol Kupfersulfat Natriumascorbat

H2O/Aceton Kupfersulfat Natriumascorbat

THF Kupfersulfat Natriumascorbat

H2O/ACN Kupfersulfat Natriumascorbat Triethylamin

H2O/t-Butanol Kupfersulfat Natriumascorbat Triethylamin

THF Kupfersulfat Natriumascorbat DIPEA

H2O/t-Butanol Kupferiodid

H2O/t-Butanol Kupferiodid Natriumascorbat

H2O/ACN CuI(Ph3P)3 TBTA DIPEA

DMF CuI(Ph3P)3 TBTA DIPEA

Ergebnisse

Seite | 73

Tabelle 3-12: Verwendeten Reaktionsbedingungen der [3+2] Cycloaddition zwischen

ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 und ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42

Da ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 in DMSO nicht stabil ist, konnten nicht genau dieselben

Reaktionsbedingen der [3+2] Cycloaddition zwischen ΠCFC-NH2AuPhPy 34 und Verbin-

dung 42 verwendet werden. Anstelle der vorher verwendeten Lösungsmittelmischung aus

Wasser und DMSO, wurde die Reaktion in Wasser mit Acetonitril, Wasser mit t-Butanol,

Wasser und Aceton und reinem Tetrahydrofuran probiert.154, 155

Alle Ansätze wurden mittels

analytischer HPLC und ESI-MS untersucht. Aus diesen Untersuchungen lässt sich schließen,

dass keine der Reaktionsbedingungen zu dem angestrebten Produkt geführt hat.

Möglicherweise binden die Seitenfunktionalitäten der verwendeten Peptide den eingesetzten

Kupferkatalysator. Es wurden deswegen mehr Äquivalente des Kupferkatalysators in ver-

schiedenen Lösungsmitteln genutzt. Diese Ansätze wurden mit den oben schon beschriebenen

Methoden analysiert und das gleiche Ergebnis wurde beobachtet.

Weil die Verwendung von mehr Äquivalenten des Kupferkatalysators nicht zum gewünschten

Produkt geführt hatte, wurde gehofft durch Beschleunigung der Reaktion in der Mikrowelle

die angestrebte Zielverbindung zu erhalten.156

Deswegen wurde eine Mischung aus den bei-

den Edukten, Natriumascorbat, Kupfer(II)sulfat, Wasser und Acetonitril in der Mikrowelle

umgesetzt. Anschließend wurde eine analytische HPLC-Messung durchgeführt.Das so erhal-

ten Chromatogramm besitzt sehr viele Peaks. Beide Edukte wurden in viele Nebenprodukte in

der Mikrowelle zersetzt. Das angestrebte Produkt wurde nicht erhalten.

Nachdem die Edukte sich in der Mikrowelle zersetzt hatten, sollte die Synthese unter stärker

basischen Reaktionsbedingungen zum Produkt führen.157-159

Als Base wurde dafür

Triethylamin und DIPEA genutzt. In den angefertigten analytischen HPLChromatogrammen

und den ESI-Massenspektren konnte das Produkt nicht ausgemacht werden.

Der Zusatz von Base hatte erneut nicht zu der Zielverbindung geführt, eventuell wurde das

verwendet Kupfer(II)sulfat unter den verwendeten Reaktionsbedingungen nicht zum Kup-

fer(I)-Katalysator reduziert. Es wurde deswegen Kupfer(I)iodid als Kupfer(I)-Quelle verwen-

det.160, 161

Das Kupfer(I)iodid wurde mit beiden Edukten in Wasser und t-Butanol gelöst. Von

der Reaktionsmischung wurden in regelmäßigen Abstanden analytische HPLC-Messungen

Ergebnisse

Seite | 74

durchgeführt. Die Messungen haben kein neues intensives Hauptsignal, welches auf das Ge-

lingen der [3+2] Cycloaddition schließen lässt.

Das Kupfer(I)iodid wurde durch Triethylphosphitkupfer(I)iodid ersetzt. Der Ligand am Kup-

fer sollte verhindern, dass das Kupfer mit den Funktionalitäten der Seitengruppe an der Pep-

tidsequenz reagierte.162

Als Hilfsreagenz wurde TBTA zugegeben. Dieses sollte den gleichen

Effekt wie Natriumascorbat haben und die Oxidation und eine Disproportionierung verhin-

dern. Eine Reaktionskontrolle wurde mit der analytischen HPLC durchgeführt. Es waren die

Edukt Peaks zu erkennen und einige wenig intensive neue Peaks. Es entstand kein neuer in-

tensiver Peak. Es wurden LC-ESI-MS aufgenommen. In keinem der Spektren waren Massen-

signale zu erkennen, welche dem Produkt zugeordnet werden konnten.

Andere Bindungsmotive in der [3+2] Cycloaddition

Da der Versuch mit dem neuen Katalysator ebenfalls nicht zum Produkt geführt hatte, wurde

ein störender Einfluss der Arginine am ΠCRRRC-NH2AuPhPy 714 auf die Reaktion vermu-

tet. Um dies zu überprüfen wurde die Reaktion mit ΠCGGGC-NH2AuPhPy 706 und

ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42 durchgeführt. Es wurden erneut verschieden Lösungs-

mittel ausprobiert. Es wurden Reaktionskontrollen mit der analytischen HPLC durchgeführt.

Keines der Chromatogramme zeigt andere Peaks, als die der Eduktpeaks. Es sind keine neuen

Produkte entstanden. Die angefertigten ESI-Massenspektren bestätigen diesen Eindruck.

Die Reaktion wurde mit Triethylphosphitkupfer(I)iodid und TBTA in DMF wiederholt. Es

wurden analytische HPLC-Messungen durchgeführt. Diese geben keinen neuen Hauptpeak

neben den beiden Eduktpeaks in den Chromatogrammen an. Es sind nur viele wenig intensive

Peaks zu erkennen. Es wurde eine LC-ESI-MS-Messung durchgeführt. In dem Spektrum sind

keine der zu erwartenden Massen für das Produkt zu beobachten.

Da es offensichtlich nicht am Arginin lag, dass die Reaktion nicht ablief, wurde überlegt wel-

cher Parameter noch verändert werden könnte, um eine ähnliche Verbindung wie

ΠCFC-NH2AuPhPy 34 darzustellen, mit welchem die [3+2] Cycloaddition abgelaufen war.

Aus diesem Grund wurden drei Phenylalanin als Abstandsaminosäuren gewählt.

Ergebnisse

Seite | 75

Abbildung 3-50: ΠCFFFC-NH2AuPhPy

Es wurde die Peptidsequenz ΠCFFFC-NH2 747 in einer Mischung aus Wasser und Acetonitril

zusammen AuPhPyCl2 2 gekoppelt. Von der Reaktionslösung wurde eine analytische HPLC-

Messung durchgeführt. Diese ergibt einen Peak bei 24.3 min. Von dem Peak wurde ein Mas-

senspektrum angefertigt. Das Massenspektrum hat ein Signal bei m/z = 1094. Dieses Massen-

signal kann dem protonierten ΠCFFFC-NH2AuPhPy 748 zugeordnet werden, damit wurde

das Produkt quantitatv erhalten. ΠCFFFC-NH2AuPhPy 748 war kaum in Wasser, Acetonitril,

Aceton, THF und t-Butanol löslich. Aus diesem Grund wurde die [3+2] Cycloaddition in

DMF mit TBTA und Triethylphosphitkupfer(I)iodid ausgeführt. Eine Reaktionskontrolle

wurde an der analytischen HPLC durchgeführt. Diese zeigte keinen Peak, welcher zum Pro-

dukt passen kann.

Abbildung 3-51: ΠCFRFC-NH2AuPhPy

Da ΠCFFFC-NH2AuPhPy 748 schlecht in vielen Lösungsmitteln löslich war, wurde die Ver-

bindung ΠCFRFC-NH2 749 mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Das gelbfarbene Produkt wurde mit

der analytischen HPLC und dem ESI-Massenspektrometer untersucht. Das Chromatogramm

hat einen Peak bei 19.6 min, im Massenspektrum ist ein Signal bei m/z = 552 zu beobachtet.

Das Signal gehört zu einem zweifach geladenen Produkt. Das Ergebnis der analytischen

HPLC deutet auf die Entstehung von nur einem Produkt hin. Das Signal im ESI-

Ergebnisse

Seite | 76

Massenspektrum entspricht dem zweifach geladen ΠCFRFC-NH2AuPhPy 750, welches quan-

titativ erhalten worden ist.

ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42 wurde nun mit ΠCFRFC-NH2AuPhPy 750 Kupfersulfat

und Natriumascorbat in Wasser und Acetonitril umgesetzt. Es wurden Proben entnommen

und mit Hilfe der analytischen HPLC untersucht. Es waren Peaks bei den Zeiten der Edukte

zu erkennen. Es waren einige neue Peaks zu erkennen. Die neu entstandenen Peaks wurden

im ESI-Massenspektrometer untersucht. Die erwartete Produktmasse konnte nicht in den

Spektren gefunden werden.

Abbildung 3-52: ΠCGRGC-NH2AuPhPy

Das Phenylalanin schien nicht die [3+2] Cycloadditionsreaktion zu unterstützen. Es wurde

deswegen eine neue Sequenz mit einer Mischung der bisher genutzten Abstandsaminosäuren

verwendet. Es sollten zwei Glycin und ein Arginin genutzt werden. Das Glycin war eine ein-

fache Aminosäure, welche bei allen weiteren Synthesen keinen negativen Einfluss auf die

reaktiven Eigenschaften der Sequenz haben sollte und die hydrophoben Eigenschaften der

neuen Verbindung kaum erhöhte. Das Arginin sollte die Löslichkeit der neuen Verbindung in

Wasser erhöhen. Für die Synthese wurde die Sequenz ΠCGRGC-NH2 751 zusammen mit

Verbindung 2 gegeben.

Ergebnisse

Seite | 77

Abbildung 3-53: HPLChromatogramm vom Rohprodukt ΠCGRGC-NH2AuPhPy 752

Von der Lösung wurde eine HPLC-Messung durchgeführt. Im Chromatogramm der analyti-

schen HPLC kann die Bildung eines neuen Peaks beobachtet werden. Dies lässt auf die Ent-

stehung eines Produktes schließen, welches in quantitativer Ausbeute erhalten wird. Die

Eduktesignale sind nicht mehr zu erkennen.

Ergebnisse

Seite | 78

Abbildung 3-54: ESI-MS ΠCGRGC-NH2AuPhPy 752 in Wasser und Acetonitril

Von dem Signal wurde ein ESI-Massenspektrum aufgenommen. Ein Signal im Massenspekt-

rum weist ein Signal bei m/z = 462 aus, ein anderes Signal liegt bei m/z = 923. Das Isotopen-

muster des ersten Signals ist in m/z = 0.5 Schritten aufgeteilt. Dies deutete auf ein zweifach

geladens Kation hin. Das zweite Signal gehörte zu einer einfach geladenen Spezies. Die Mas-

sen passen zu ΠCGRGC-NH2AuPhPy 752. Es ist damit drittes neues Bindungsmotiv gefun-

den worden, das ein stabiles, gut in Wasser lösliches Biokonjugat formt.

Für die [3+2] Cycloaddition zwischen ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42 und

ΠCGRGC-NH2AuPhPy 752 wurden erneut Kupfer(II)sulfat und Natriumascorbat in Wasser

und Acetonitril verwendet. Es wurden Reaktionskontrollen mit der analytischen HPLC durch-

geführt. Keines der Chromatogramme hat einen neuen hohen Peak, welcher auf die Entste-

hung des Produktes schließen lässt. ESI-Massenspektren wurden angefertigt. Die angefertig-

ten ESI-Massenspektren haben keine der für das Produkt zu erwarten Massensignale.

Die Cycloaddition wurde mit Triethylphosphitkupfer(I)iodid und TBTA in DMF wiederholt.

Es wurden analytische HPLC-Messungen durchgeführt. Diese geben keinen neuen intensiven

Peak neben den beiden Eduktpeaks in den Chromatogrammen an. Es waren nur viele wenig

intensive Peaks zu erkennen. Es wurde ein ESI-MS-Messung durchgeführt. In dem Spektrum

sind keine der zu erwartenden Massen für das Produkt zu beobachten.

Ergebnisse

Seite | 79

Zusammenfassung der [3+2] Cycloaddition mit dem stabilen Bindungsmotiv

Keine der Kupferkatalysierten [3+2] Cycloadditionen hat zu dem erwarteten Produkt geführt.

Die Variation der Lösungsmittel, der Hilfsreagenzien und der Kupfer(I)quelle führt nicht zum

[3+2] Cycloreaktionsprodukt. Das Edukt mit dem gebundenen Gold(III)-Komplex wurde ver-

ändert, da ein störender Einfluss der Funktionalitäten in den Seitenketten vermutet wurde. So

wurde ebenfalls nicht das angestrebte Produkt synthetisiert. Möglicherweise konnte das Kup-

fer(I) aus sterischen Gründen die Reaktion nicht katalysieren.

[3+2] Cycloadditionen ohne Kupferkatalysator

Die 4-Pentinsäure sollte aus diesem Grund durch ((1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-

yl)methyl (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonat 753 ersetzt werden. Diese Verbindung besteht

aus einem Achtring mit einem Alkin. Durch die Ringspannung geht dieser Achtring [3+2]

Cycloadditionenreaktion ohne Kupferkatalysator ein.163

Abbildung 3-55: ((1R,8S,9s)-bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-yl)methyl (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonat

H-CGRGC-Rink AM Harz wurde an SPPS synthetisiert. Die Fortschritte in der Synthese der

Peptidsequenz wurden mittels des Kaisertestes überprüft.164

Anderthalb Äquivalente von Ver-

bindung 753 wurden wie eine Aminosäure an fester Phase an die Sequenz gebunden. Die Se-

quenz wurde vom Harz mit Hilfe einer Trifluoressigsäurelösung abgespalten und mit - 70 °C

Diethylether ausgefällt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, eingefroren und lyophilisiert.

Von dem schaumartigen Produkt wurden eine analytische HPLC-Lauf und ein ESI-LC-MS

gemessen. Im Chromatogramm ist ein intensiver Peak bei 2.5 min zu erkennen. Im Spektrum

können diesem die Massen m/z = 247 und m/z = 493 zugeordnet werden. Diese entsprechen

Ergebnisse

Seite | 80

dem Peptid ohne das Alkin 753. Das Produkt war nicht auszumachen. Das Alkin scheint unter

den Abspaltebedingungen nicht stabil an das Peptid gebunden worden zu sein.

Aus diesem Grund sollte erst die Sequenz H-CGRGC-NH2 754 synthetisiert werden. Pep-

tidsequenz 754 sollte dann mit AuPhPyCl2 2 in den oben verwendeten Bedingungen zu Ver-

bindung H-CGRGC-NH2AuPhPy 755 umgesetzt werden. Verbindung 755 sollte dann unter

basischen Bedingungen mit Verbindung 753 reagieren.

Abbildung 3-56: Darstellung von Peptid mit Cyclooctaalkin 753

H-CGRGC-NH2 754 wurde zusammen mit einer äquimolaren Menge von AuPhPyCl2 2 in

einem Lösungsmittelgemisch aus einem Teil Wasser und einem Teil Acetonitril zusammen

gegeben. Es wurde eine analytische HPLC-Messung vorgenommen. Das Chromatogramm hat

zwei Peaks. Der erste Peak entspricht der Retentionszeit der Peptidsequenz. Der zweite Peak

wurde in der ESI-Massenspektroskopie untersucht. Das Spektrum zeigt zwei Signale. Das

erste Signal liegt bei m/z = 597 und das zweite Signal bei m/z = 1193. Das erste Signal gehör-

te zu einer zweifach geladen Spezies. Die Massen der beiden Signale passten zu

H-CGRGC-NH2AuPhPy 755 mit einem zusätzlich gebunden AuPhPyCl2 2 ohne die beiden

Chloridliganden. Das Produkt H-CGRGC-NH2AuPhPy 756 wurde nicht beobachtet.

Ergebnisse

Seite | 81

Offensichtlich reagierte das Peptid jeweils mit zwei Gold(III)-Komplexen. Eine mögliche

freie Bindungsstelle war das endständige Amin des Peptidrückgrats. Die Guanidingruppe und

die Amide hatten bisher in keinem Experiment eine besondere Affinität zum Gold(III)-

Zentrum gezeigt.

Zur Umgehung der Nebenreaktion wurde die Fmoc-Schutzgruppe 758 auf der Peptidsequenz

belassen. Die Sequenz mit der Fmoc-Schutzgruppe 758 wurde mit AuPhPyCl2 2 zur Reaktion

gebracht. Es wurden ein analytischer HPLC-Lauf und ein ESI-Massenspektrum gemessen.

Das Chromatogramm hat einen Produkt Peak, im Spektrum sind eine einfach und eine zwei-

fach geladene Spezies zu erkennen, welche beide zur Masse von m/z = 1064 passten. Die Er-

gebnisse stimmen mit den Erwartungen für Verbindung Fmoc-CGRGC-NH2AuPhPy 759

überein.

Die Fmoc-Schutzgruppe sollten vom Fmoc-CGRGC-NH2AuPhPy 759 abgespalten werden.

Hierfür wurde Fmoc-CGRGC-NH2AuPhPy 759 in verschiedene Lösungen mit den Basen

Piperidin, DIPEA, Triethylamin und Kaliumhydroxid gegeben. Von allen Ansätzen wurden

analytische HPLC-Messungen durchgeführt und es wurden von einigen Proben ESI-LC-MS-

Messungen aufgenommen. Es konnte beobachtet werden, dass in den Chromatogrammen die

Anzahl der Peaks mit der Erhöhung der Basenkonzentration zu nahm. Keine der ESI-LC-MS-

Messungen lässt die Masse der Fmoc-entschützen Spezies beobachten.

Erst den Gold(III)-Komplex 2 zu koppeln und dann die Fmoc-Schutzgruppe abzuspalten ist

nicht gelungen. Bei zu niedrigen Basekonzentrationen wurde die Fmoc-Schutzgruppe nicht

abgespalten, bei zu hohen Konzentrationen bilden sich neue Verbindungen. Die freie

Guanidingruppe konnte eine reaktive Stelle für Nebenreaktionen gewesen sein. Nebenreakti-

onen können auch an den Thiolen der Cysteine mit dem vormals gebunden 2-Phenylpyridin-

1,1´gold(III) stattgefunden haben, wenn der Gold(III)-Komplex durch stark basische Bedin-

gungen abgespalten worden war. Das freie 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III) würde dann auch

wieder Nebenreaktionen eingegangen sein. Sobald die Fmoc-Schutzgruppe nicht mehr am

Amin gebunden ist, könnte das Amin auch mit diversen reaktiven Spezies in der

Abspaltlösung reagieren.

Ein neuer Weg zur Synthese von Verbindung 757 musste gefunden werden. Das Peptid 754

sollte ohne Fmoc-Schutzgruppe vom Harz abgespalten werden. Das Peptid 754 sollte darauf

so behandelt werden, dass sich zwischen den beiden Thiolen in der Sequenz intramolekulare

Ergebnisse

Seite | 82

Thiolbrücken ausbildeten. Alkin 753 sollte dann unter leicht basischen Bedingungen gekop-

pelt werden. Anschließend würden die Thiolbrücke gebrochen werden, um dann diese Ver-

bindung mit AuPhPyCl2 2 umzusetzen.

Abbildung 3-57: Alternative Route zu Peptid mit Cyclooctaalkin 753

Nach der Synthese und Aufreinigung der Peptidsequenz 754 wurde diese in eine Lösung aus

Wasser und DMSO gelöst. Es wurde in viel Lösungsmittel gearbeitet. Die große Verdünnung

sollte eine intramolekulare Reaktion durch den Luftsauerstoff bevorzugen.165, 166

Von der

Reaktionslösung wurden in regelmäßigen Abständen kleine Proben genommen. Mit diesen

Proben wurde ein Ellmanstest durchgeführt.167

Färbte sich die Probe gelbfarben, ist dies ein

Hinweis auf die Anwesenheit von freien Thiolen. Sobald der Ellmanstest negativ ausfiel,

wurde das Lösungsmittel entfernt. Der Rückstand wurde über die präperative HPLC aufge-

reinigt. Die gesammelte Fraktion wurde einer analytischen HPLC-Messung und einem ESI-

Massenspektrums Aufnahme unterzogen. Da die Ergebnisse des Massenspektrums identisch

zum Peptid ohne Disulfidbrücke sind, wurde erneut ein Ellmanstest durchgeführt. Der Ell-

manstest blieb farblos. Aus dem Test wurde geschlossen, dass keine freien Thiole mehr im

Ergebnisse

Seite | 83

Peptid vorhanden waren. Das cyclisierte Produkt 754 wurde in Lösung mit DIPEA und dem

Alkin 753 zusammen gegeben. Eine analytische HPLC Messung wurde von der Reaktionslö-

sung gemessen. Das Chromatogramm hat mehrere neue Peaks. Bei der Retentionszeit der

Peptidsequenz ist kein Peak mehr erkennbar. Die neuen Peaks wurden mittels ESI-MS unter-

sucht. Einer der Peaks hat ein zweifach geladenes Massesignal von m/z = 350. Dies entspricht

der Masse vom zweifach geladenen, nicht mehr cyclisierten Produkt 760. Ein erneut durchge-

führter Ellmanstest wurde gelbfarben. Es hatten sich freie Thiole gebildet. Die Destabilisie-

rung der Disulfidbrücke und das damit verbundene Auftreten von freien Thiolen, erklärt die

große Anzahl an weiteren Produkten, die im Chromatogramm zu beobachten sind. Hierdurch

wurde nur eine sehr geringe Ausbeute erreicht.

Orthogonale Bindung über ein Imin

Die Syntheseroute zur Darstellung eines Gold(III)-Komplexes an einem Peptid mit der Alkin-

verbindung 753 hatte sich als nicht besonders ergiebig erwiesen. Es musste eine neue Mög-

lichkeit der Kopplung der lange Peptidsequenz ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 42 gefun-

den werden. Nun wurde überlegt die beiden Sequenzteile mittels eines Imins zu verbinden.

Das Imin sollte sich aus einem Amin der einen Sequenz und dem Aldehyd der anderen Se-

quenz bilden. Für den Erhalt der Sequenz mit dem Amin wurde bei der Synthese der langen

Sequenz auf die Kopplung der Azidoessigsäure verzichtet. So wurde folgende Sequenz erhal-

ten: H-RRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 761. Das Aldehyd sollte entsprechend an der Sequenz

mit dem Gold(III)-Komplex 2 gebunden sein. Dafür sollte die Peptidsequenz mit einem Ester

abschließen, welcher dann zum Aldehyd reduziert werden sollte. Diese Sequenz mit Aldehyd

sollte mit AuPhPyCl2 2 zur Reaktion gebracht werden. Das Aldehyd könnte dann mit dem

Amin zum Halbaminal reagieren. Die reversible Reaktion zum Halbaminal könnte in einer

irreversiblen Reaktion zum Imin reduziert werden.

Ergebnisse

Seite | 84

Abbildung 3-58: Der Aldehyd haltige Gold(III)-Komplex

Die Sequenz H-CGRGC-Rink AM wurde dargestellt und mit Methyladipoylchlorid und

DIPEA am Harz behandelt. Nach dem Waschen des Harzes, wurde eine DIBAL-Lösung in n-

Hexan zum Harz gegeben.168

Erneut wurde das Harz gewaschen und dann wurde die

Peptidsequenz abgespalten. Von dem so erhaltenen Produkt wurde eine analytische HPLC-

Messung aufgenommen. Das Chromatogramm hat mehrere Peaks, wobei ein besonders inten-

siver Peak hervorsticht. Dieser Peak wurde isoliert und mit dem ESI-Massenspektrum analy-

siert. Das Produkt hat eine Masse von m/z = 636. Dies entspricht der Verbindung

ΓCGRGC-NH2 762. Von dem Rohprodukt wurde ein ESI-LC-MS gemessen. Die Massen der

Sequenz, bei der der Ester von ΓCGRGC-NH2 762 zum Aldehyd reduziert war, konnte dabei

nicht entdeckt werden. Die Kopplung von Methyladipoylchlorid hatte gut funktioniert, nicht

jedoch die Reduktion des Esters zum Aldehyd. Der Versuch der Reduktion des Esters zum

Aldehyd am Harz wurde deswegen mit DIBAL in Toluol wiederholt. Es führte zum gleichen

Ergebnis. Der Wechsel zu Dichlormethan brachte ebenso keine Veränderung. Die dreifache

Behandlung mit DIBAL in Toluol führte ebenfalls nicht zum reduzierten Aldehyd Produkt.

Eine Behandlung von abgespaltenen ΓCGRGC-NH2 762 mit DIBAL in Toluol führte eben-

falls nicht zu dem erwartet Produkt mit Aldehyd.

Ergebnisse

Seite | 85

Möglicherweise war die Reduktion aus sterischen Gründen nicht am Harz möglich, deswegen

wurde ΓCGRGC-NH2 762 mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Von der Reaktionslösung wurden

eine analytische HPLC-Messung und ein ESI-Massenspektrum aufgenommen. In der HPLC-

Messung war ein Peak zu erkennen. Dieser Peak hatte im ESI-MS ein zweifach geladenes

Massesignal von m/z = 493. Dieses Massensignal entsprach dem zweifach geladenen Produkt

ΓCGRGC-NH2AuPhPy 763, welches in guter Ausbeute erhalten werden konnte.

ΓCGRGC-NH2AuPhPy 763 wurde DIBAL behandelt. Von der Reaktionslösung wurde ein

ESI-LC-MS gemessen. Das Chromatogramm gibt einen intensiven Hauptpeak wieder. Das

Massensignal dieses Peaks liegt bei m/z = 493. Dies entspricht dem Edukt

ΓCGRGC-NH2AuPhPy 763. Keine der anderen Spezies entspricht dem aus dem Methylester

entstanden Aldehyd Produkt. Es war nicht gelungen ein Aldehyd am Bindungsmotiv zu er-

zeugen und damit die Zielverbindung über eine Iminkopplung darzustellen.

Direkter Weg

Da auch über die Iminkopplung nicht die Zielverbindung dargestellt werden konnte, sollte das

Produkt über die Behandlung der ganzen Sequenz mit AuPhPyCl2 2 erhalten werden. Von der

ganzen Sequenz hatte es sich gezeigt, dass nur die Carbonsäuren der Seitenketten der Gluta-

minsäuren zum AuPhPyCl2 2 binden können. Falls dies passieren sollte, dann müssten die

Carbonsäuren orthogonal geschützt werden. Jedoch sollte zuerst die einfachste Möglichkeit

probiert werden und alle Sequenzen mit ungeschützten Aminosäuren verwendet werden. Erst

sollten der positiv geladene Sequenzteil mit den Argininen und der von MMP2 spaltbare Se-

quenzteil jeweils inklusive des Cysteinbindungsmotives dargestellt werden. Es sollte so her-

ausgefunden werden, ob bei den dort verwendeten Aminosäuren neue synthetische Probleme

auftraten.

Ergebnisse

Seite | 86

Abbildung 3-59: Oben Ac-CGRGCRRRRR-NH2AuPhPy und unten

Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2AuPhPy

Die Sequenzen Ac-CGRGCRRRRR-NH2 764 und Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2 765

wurden dargestellt und gereinigt. Die Peptidsequenzen wurden dann jeweils zusammen mit

AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Nach einer Stunde wurden analytische HPLC-Messungen durchge-

führt. In beiden Chromatogrammen war jeweils ein intensiver Peak zu erkennen. Beim Ansatz

mit der Sequenz Ac-CGRGCRRRRR-NH2 764 liegt der Peak bei 14.1 min. Beim zweiten

Ansatz mit Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2 765 ist der Peak bei 17.0 min zu erkennen.

Die beiden Peaks wurden an der präperativen HPLC von allen sehr weniger intensiven Peaks

getrennt. Von den erhaltenen Produkten wurden MALDI-Massenspektren aufgenommen.

Beim Ansatz mit Ac-CGRGCRRRRR-NH2 764 sind drei Massensignale zu erkennen. Das

erste Signal liegt bei m/z = 1315, das zweite Signal bei m/z = 1512 und das dritte Signal bei

m/z = 1665. Das dritte Signal kann der Verbindung Ac-CGRGCRRRRR-NH2AuPhPy 766

zugeordnet werden. Das zweite Signal entspricht dieser Verbindung ohne 2-Phenylpyridin

und das erste Signal stimmt mit der Zielverbindung 766 ohne 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)

überein. Das Spektrum von dem Ansatz mit Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2 765 hat

drei Signale. Diese sind bei m/z = 2043, m/z = 2238 und m/z = 2393. Das Signal bei

m/z = 2393 entspricht Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2AuPhPy 767. Die anderen bei-

den Signale entsprechen analog zu Verbindung 766 diesem Produkt ohne 2-Phenylpyridin-

Ergebnisse

Seite | 87

1,1´gold(III) beziehungsweise ohne 2-Phenylpyridin. Das jeweils die Produktmassen ohne

2-Phenylpyridin-1,1´gold(III) und ohne 2-Phenylpyridinzu erkennen gewesen sind, hat etwas

mit der Ionisierungsart des MALDI-Massenspektrometers zu tun. Das Metallionen und Li-

ganden von Metallionen abgespalten werden, ist eine Eigenart dieser Methode.169, 170

Die Carbonsäuren der Glutaminsäuren konnten ebenfalls eine Bindung zum Gold(III)-

Komplex 2 aufbauen. Es war aus diesem Grund nicht gelungen Verbindung 32 zu synthetisie-

ren. Jedoch war das Bindungsmotiv im Laufe dieser Arbeit optimiert. Die optimierte

Peptidsequenz bot AuPhPyCl2 2 eine bessere Bindungsgeometrie. Durch diese verbesserte

Bindungsgeometrie war es potentielle Möglich, dass freie Carbonsäuren in der Sequenz vor-

handen waren und AuPhPyCl2 2 dennoch an der vorgesehen Bindungsstelle zur

Peptidsequenz gebunden wurde.

Abbildung 3-60: Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy

Zur Überprüfung dieser Theorie wurde die Sequenz Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-

EEEEE-NH2 768 zusammen gegeben mit AuPhPyCl2 2. Von der Lösung wurde eine HPLC-

Messung durchgeführt. Das Chromatogramm der HPLC gibt die Bildung mehrerer neuer

Peaks wieder. Einer dieser neuen Peaks sticht durch sein besonders großflächiges Integral

hervor. Das analytische HPLChromatogramm nach der Reinigung auf der preparativen HPLC

ist in Abbildung 3-61 dargestellt.

Ergebnisse

Seite | 88

Abbildung 3-61: HPLChromatogramm von Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy 769

Das so erhaltene Produkt wurde in Wasser mit einem geringen Anteil von Acetonitril gelöst.

Um die Stabilität des Produktes in Lösung zu prüfen, wurde es für vier Stunden in Wasser

gegeben. Es wurde eine analytische HPLC-Messung durchgeführt. Es ist nur ein Peak bei

15.5 min zu erkennen. Es handelt sich um eine Verbindung die in Wasser stabil ist.

Ergebnisse

Seite | 89

Abbildung 3-62: MALDI-Massenspektrum von

Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy 769

Das Produkt wurde im MALDI-Massenspektrum untersucht. Das Spektrum gab drei Produkt-

signale an. Das erste Signal war bei m/z = 2688, das zweite Signal lag bei m/z = 2885 und das

dritte Signal wurde bei m/z = 3038 erkannt. Das Signal bei m/z = 3038 konnte der Verbin-

dung Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy 769 zugeordnet werden, welches

in 26 % Ausbeute erhalten worden ist. Die zwei anderen Signale waren durch die Ionisierung

im MALDI-Massenspektrometer entstanden. Es handelte sich bei der Masse von m/z = 2885

wahrscheinlich um das Produkt ohne 2-Phenylpyridin und bei der Masse von m/z = 2688 um

das Produkt ohne 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III). Damit ist der Gold(III)-Komplex an der

langen Sequenz dargestellt und die Zielverbindung dieser Arbeit erfolgreich synthetisiert.

Zusammenfassung

Seite | 90

4. Zusammenfassung

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Komplex AuPhPyCl2 2 und seiner Funktionalisierung

mit einem Peptid. Das Peptid kann entweder über den Liganden oder direkt über das Metall-

atom selber mit dem Gold(III)-Komplex 2 verknüpft werden. Im Laufe der Untersuchungen

zeigte es sich, dass ein Bindungsmotiv aus zwei Cysteinen und einer Abstandsaminosäure für

die Verknüpfung zum Gold(III)-Ion günstig ist. Das AuPhPyCl2 2 konnte über dieses Bin-

dungsmotiv erfolgreich zu folgenden Verbindungen umgesetzt werden:

Nummer Name

26 Ac-CGC-NH2AuPhPy

27 Ac-CPC-NH2AuPhPy

28 Ac-CFC-NH2AuPhPy

30 Ac-CFCRRRRR-NH2AuPhPy Tabelle 4-1: Sequenzen mit Gold(III)-Komplex

Bei Sequenzen mit dem Bindungsmotiv und freien Carbonsäuren band der Gold(III)-Komplex

jedoch unspezifisch an die Sequenz, so dass kein reines Biokonjugat erhalten wurde. Dieses

Biokonjugat konnte dann über die orthogonale Kupferkatalysierte [3+2] Cycloaddition aus

dem Edukt ΠCFC-NH2AuPhPy 35 mit terminalem Alkin und den in folgender Tabelle ange-

geben Sequenzen mit einem Azid erhalten werden:

Nummer Name

36 ORRRRR-NH2

37 OPLGLYAL-NH2

38 OEEEEE-NH2

42 ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2

43 ORRRRRPLGLLEEEEE-NH2

44 ORRRRRLGLYLEEEEE-NH2 Tabelle 4-2: Sequenzen mit terminalem Azid

Als Test Verbindungen wurden 39, 40 und 41 mittels der [3+2] Cycloaddition aus den Ab-

schnitten 36, 37 und 38 erzeugt und die kompletten Sequenzen führten zu den Biokonjugate

45, 46 und 47 aus Abbildung 4-1. Diese letzten drei Biokonjugate entsprechen der in der Auf-

gabenstellung gesuchten Verbindung. Damit schien das Projekt zu einem erfolgreichen Ab-

schluss gebracht worden zu sein und lediglich ihre Löslichkeit in Wasser sollte erhöht wer-

den.

Zusammenfassung

Seite | 91

Abbildung 4-1: [3+2] Cycloadditionprodukte dreier kompletter Sequenzen mit ΠCFC-NH2AuPhPy 35

Um die Löslichkeit der Sequenzen in Wasser zu erhöhen, wurde ΠCRC-NH2AuPhPy 49 mit

terminalem Alkin synthetisiert. Diese Verbindung 49 war gut in Wasser löslich, es zeigte sich

aber eine geringe Stabilität in Lösung bei dieser Art von Bindungsmotiv.

Zur Verbesserung der Stabilität wurden viele neue Kombinationen von bindenden Aminosäu-

ren getestet. Es wurden dafür 300 verschieden Peptide an einem Harz ohne Linker syntheti-

siert und mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt. Die vielversprechensten Peptide hiervon wurden an

einem Harz mit Linker synthetisiert, in Lösung mit AuPhPyCl2 2 umgesetzt und dabei wurden

unter anderen folgenden Verbindungen dargestellt:

Nummer Name

682 ΠCGZ-NH2AuPhPy

683 ΠEGC-NH2AuPhPy

684 ΠCGC-NH2AuPhPy

685 ΠMGC-NH2AuPhPy

686 ΠZGC-NH2AuPhPy

687 ΠBGC-NH2AuPhPy

688 ΠCGM-NH2AuPhPy

689 ΠZGM-NH2AuPhPy

690 ΠJGM-NH2AuPhPy

691 ΠKGM-NH2AuPhPy

692 ΠCGH-NH2AuPhPy

693 ΠMGH-NH2AuPhPy

694 ΠCGA-NH2AuPhPy

695 ΠMGA-NH2AuPhPy

696 ΠKGD-NH2AuPhPy

697 ΠDGZ-NH2AuPhPy

698 ΠZGZ-NH2AuPhPy

699 ΠCGB-NH2AuPhPy

Zusammenfassung

Seite | 92

700 ΠJGB-NH2AuPhPy

701 ΠCGJ-NH2AuPhPy

702 ΠMGK-NH2AuPhPy Tabelle 4-3: Gold(III)-Sequenzen aus dem 300 Peptidprojekt

Die Stabilität blieb bei diesen neuen Verbindungen unverändert. Um eine verbesserte Stabili-

tät herbei zu führen, wurden erneut viele Verbindungen getestet. Bei diesen Verbindungen

wurde im Bindungsmotiv die Anzahl der Abstandsaminosäuren erhöht und es wurden erneut

viele verschiedene Kombinationen von bindenden Aminosäuren ausprobiert. Durch diese

Modifizierungen wurden viele neue Substanzen mit höherer Stabilität synthetisiert:

Nummer Name

704 ΠCGGC-NH2AuPhPy

708 ΠCGGGGC-NH2AuPhPy

712 ΠCGΔGC-NH2AuPhPy

731, 733,

735, 737,

739, 741,

743, 745

ΠCRRRX1-NH2AuPhPy

732, 734,

736, 738,

740, 742,

744, 746

ΠX1RRRC-NH2AuPhPy

X1 = B, D, E, H, J, K, M oder Z

Tabelle 4-4: Optimierte Gold(III)-Sequenzen

Diese Substanzen waren zwar stabiler in Lösung, aber nicht über 75 Stunden. Dieses Kriteri-

um erfüllten folgende Verbindungen jedoch erfolgreich:

Nummer Name

706 ΠCGGGC-NH2AuPhPy

714 ΠCRRRC-NH2AuPhPy

748 ΠCFFFC-NH2AuPhPy

750 ΠCFRFC-NH2AuPhPy

752 ΠCGRGC-NH2AuPhPy

763 ΓCGRGC-NH2AuPhPy Tabelle 4-5: Stabilste Gold(III)-Sequenzen

Als stabilstes Bindungsmotiv haben sich in dieser Arbeit Sequenzen gezeigt, die aus zwei

bindenden Cysteinen und drei flexiblen Abstandsaminosäuren bestehen. Die Abstandsamino-

säuren können mit allen aliphatischen Aminosäuren frei kombiniert werden und verleihen den

Biokonjugat eine große Variabilität im Bindungsmotiv. Mit diesem neuen Typ von Bin-

dungsmotiv wurden zahlreiche orthogonale Reaktionen durchgeführt. Zum Schluss zeigte

Zusammenfassung

Seite | 93

sich, dass das neue Bindungsmotiv auch in Anwesenheit von Carbonsäuren selektiv ohne

[3+2] Cycloaddition zum Gold(III)-Komplex bindet und folgende neue Biokonjugate konnten

erfolgreich synthetisiert werden:

Nummer Name

766 Ac-CGRGCRRRRR-NH2AuPhPy

767 Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYAL-NH2AuPhPy

769 Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy Tabelle 4-6: Gold(III)-Biokonjugate

Das Biokonjugat 769 erfüllt dabei die Vorgabe einen Gold(III)-Komplex mit einer

Peptidsequenz, aus einem positiv geladenen Arginin, einem durch MMP2 spaltbaren und ei-

nem negativ geladenen Glutaminsäure Teil zu funktionalisieren.

Abbildung 4-2: Zielverbindung Ac-CGRGCRRRRRCPLGLYALEEEEE-NH2AuPhPy

Das Projekt ist damit zu einem synthetisch erfolgreichen Ende gebracht worden und die neuen

Biokonjugate können pharmakologisch getestet werden.

Experimentalteil

Seite | 94

5. Experimentalteil

Material

Name Lieferant CAS-Nummer

Ammoniumacetat J.T.Baker [631-61-8]

Ammoniumchlorid J.T.Baker [12125-02-9]

((1R,8S,9S)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-

yl)methyl(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)carbonat

SynAffix

2,2´-Bipyridin ABCR [366-18-7]

Brombenzol Merck [108-95-4]

2-Brompyridin Aldrich [109-04-6]

4-Brompyridin Hydrochlorid Aldrich [19524-06-2]

4-Carboxybenzolboronsäure ChemPur [14047-29-1]

o-Chloranilin Aldrich [2435-53-2]

DIBAL in Hexan Aldrich [1191-15-7]

DIBAL in Toluol Alfa Aesar [1191-15-7]

Essigsäure (49-51%) HPLC Sigma-Aldrich [64-19-7]

(Essigsäuremethylester)triphenylphosphoniumchlorid ABCR [2181-97-7]

Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat ChemPur [16961-25-4]

Kaliumhexamethyldisilizan 0.5 M in Toluoln Aldrich [40949-94-8]

Kaliumhydroxid J.T.Baker [1310-58-3]

Kaliumtetrabromoaurat(III) ChemPur [14323-32-1]

Kupfer(I)iodid Aldrich [7681-65-4]

Kupfer(II)sulfat Pentahydrat Aldrich [7758-99-8]

Lithiumchlorid Merck [7447-41-8]

Magnesiumspäne Riedele de Haën [7439-95-4]

Magnesiumsulfat Aldrich [7487-88-9]

Malonsäure ABCR [141-82-2]

Methyl-2-phenylquinolin-4-carboxylat Aldrich [4546-48-9]

Mercaptoethanol Aldrich [60-24-2]

Natriumacetat Trihydrat Aldrich [6131-90-4]

Natriumascorbat Across [134-03-2]

Natriumcarbonat J.T.Baker [24551-51-7]

Natriumhydroxid J.T.Baker [1310-73-2]

Palladium auf Aktivkohle Fluka [7440-05-3]

Palladium(0)tetrakis(triphenylphosphin) ABCR [14221-01-3]

Phenylhydraziniumchlorid Aldrich [71-91-0]

2-Phenylpyridin Aldrich [1008-89-5]

Piperidin ABCR/biosolve [141-82-2]

Pyridin J.T.Baker [110-86-1]

4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd Aldrich [127406-56-8]

Quecksilber(II)acetat Acros [1600-27-7]

Silberacetat Fluka [563-63-3]

Sinapinsäure Bruker [530-59-6]

Tetraethylammoniumbromid Aldrich [71-91-0]

Tetraethylammoniumchlorid Aldrich [56-34-8]

Triethylamin J.T.Baker [121-44-8]

Experimentalteil

Seite | 95

Triethylphosphitkupfer(I)iodid Lehrstuhl [51717-23-8]

Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin) Lehrstuhl [510758-28-8]

Wasserstoff Air Liquid [1333-74-0] Tabelle 5-1

Name Abkürzung Code Lieferant CAS-Nummer

Acetanhydrid Ac2O Aldrich [108-24-7]

1,2-Ethandithiol EDT Alfa Aesar [540-63-6]

Fmoc-Aib-OH Aib Δ Iris [62-57-7]

Fmoc-Gly-OH Gly G Iris [29022-11-5]

Fmoc-L-Ala-OH Ala A novabiochem [04-12-1006]

Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH Asp D Iris [71989-14-5]

Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH Arg R Iris/Biosolve [154445-77-9]

Fmoc-L-Cys(Trt)-OH Cys C Iris [103213-32-7]

Fmoc-L-Dap(Boc)-OH Dap Z Iris [162558-25-0]

Fmoc-L-Glu(ODmab)-OH Glu E Iris [268730-86-5]

Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH Glu E Iris [71989-18-9]

Fmoc-L-His(Trt)-OH His H novabiochem [109425-51-6]

Fmoc-L-Leu-OH Leu L Iris/Biosolve [35661-60-0]

Fmoc-L-Lys(Boc)-OH Lys K Iris [71989-26-9]

Fmoc-L-Pal3-OH Pal3 B Iris [175453-07-3]

Fmoc-L-Pal4-OH Pal4 J Iris [169555-95-7]

Fmoc-L-Phe-OH Phe F Iris [35661-40-6]

Fmoc-L-Pro-OH Pro P Iris [71989-31-6]

Fmoc-L-Met-OH Met M novabiochem [71989-28-1]

2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-

tetramethyl-

uronium hexafluorophosphate HBTU Biosolve [94790-37-1]

1-Hydroxybenzotriazole HOBT molekula [2592-95-2]

Methyladipoylchlorid Γ ABCR [35444-44-1]

N,N-Diisopropylethylamin DIPEA Aldrich [7087-68-5]

O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-

tetramethyluronium tetrafluoroborat TBTU Iris [125700-67-6]

4-Pentinsäure Pen Π Aldrich/ABCR [6089-09-04]

Triisopropylsilan TIS Aldrich [6485-79-6] Tabelle 5-2

Lösungsmittel Abkürzung Lieferant

Aceton VWR

Acetonitril ACN J.T.Baker/ Biosolve

Dichlormethan DCM Fisher

Diethylether DET J.T.Baker

N,N-Dimethylformamid DMF Roth/ biosolve

Dimethylsulfoxid DMSO J.T.Baker

Essigsäure VWR

Ethanol EtOH Aldrich

n-Hexen VWR

Methanol MeOH J.T.Baker

Experimentalteil

Seite | 96

N-Methyl-2-pyrrolidon NMP Roth/ Biosolve

Salzsäurelösung 37 % J.T.Baker/ VWR

Tetrahydrofuran THF VWR

Trifluoressigsäure TFA Acros/ Alfa Aesar/ Biosolve Tabelle 5-3

Methoden

Jede kommerziell erhalten Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet, außer es

ist in der Vorschrift anders vermerkt. Bei jeder Luft empfindlichen Reaktion unter Schutzgas

wurden standard Schlenktechniken verwendet.

Die NMR-Messungen wurden auf folgenden Geräten der Firma Bruker durchgeführt: DPX

200, DPX 250 und DRX 400. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur. Die chemische

Verschiebung (δ) wird in ppm bezogen auf TMS und das das nicht vollständig deuterierte

Lösungsmittel angegeben. Die Multiplizitäten sind wie folgt abgekürzt: Singulett = s, Duplett

= d, Triplett = t, Quartett = q, Duplett vom Duplett = dd , Triplett vom Duplett = td, Multiplett

= m.

Alle Elementaranalysen wurden auf einer Vario EL Elementar Hanau im C,H,N,S-Modus

durchgeführt.

Als Zentrifuge wurde eine Universal 320 R von Hettich Zentrifugen genutzt.

An einem automatisierten Bruker Autoflex MALDI-TOF Massenspektrometer wurden die

MALDI Massenspektren gemessen. Als Matrix wurde Sinapinsäure verwendet, die Spektren

wurden im positiven Modus, in der Reflektoreinstellung gemessen.

Die ESI Massenspektren wurden auf einem Bruker Esquire 6000 Massenspektrometer gemes-

sen. Die Proben wurden Manuel aufgegeben. Es wurde meist im positiven (ESI+), manchmal

auch im negativen (ESI-) gemessen. Das Verhältnis von Masse geteilt durch die Ladung (m/z)

wird als dimensionslose Zahl angegeben.

Die HPLC-MS Versuche wurden an einem Agilent 1100, welches am Bruker Esquire 6000

Massenspektrometer angeschlossen war, durchgeführt. Die Agilent 1100 beinhaltete ein Pro-

ben Automation. Als Säule wurde ein Agilent Zorbax SB-C18 2.7 µm (2.1 x 5.0 mm) ver-

wendet. Die Chromatogramme wurden bei 220 nm aufgenommen. Das Laufmittel bestand aus

Wasser mit 0.05 % Trifluoressigsäure und Acetonitril. Der Gradient begann bei 100 % Was-

Experimentalteil

Seite | 97

ser mit TFA und nach 10 min wurden 100 % Acetonitril verwendet. Es wurden für 2 min

100 % Acetonitril verwendet, um dann innerhalb von 6 min wieder auf 100 % Wasser mit

TFA umzuschalten.

Die analytischen HPLC Versuche wurden an einem Knauer HPLC Instrument durchgeführt.

Es wurden zwei verschieden Lösungsmittelgemische verwendet. Das erste Lösungsmittelge-

misch A besteht aus 95 % Wasser, 5 % Acetonitril und 0.1 % Trifluressigsäure. Lösungsmit-

telgemisch B besteht aus 95 % Acetonitril, 5 % Wasser und 0.1 % Trifluoressigsäure. Alle

analytischen HPLC Versuche wurden im Gradientenverfahren durchgeführt. Jede Messung

dauerte 40 min. Die ersten 5 min wurde 100 % von Gemisch A verwendet, dann startete der

Gradient und nach 25 min wurden für 5 min 100 % von Lösungsmittelgemisch B genutzt, um

dann nach 35 min wieder für 5 min100 % von Lösungsmittelgemisch A zu nutzen. Es wurde

bei einem Fluss von 1 ml/min gearbeitet. Die Chromatogramme wurden bei 214 nm und bei

254 nm aufgenommen. Als Säulenmaterial wurde eine Dr. Maisch Reprosil-C18-AQ (250 x

4.6 mm), Knauer Eurospher II 100-5 C18A (250 x 4 mm), und eine Dr. Maisch ReproSil-Pur

C8 5 µm (250 x 4.6 mm) genutzt.

Die semipräperative HPLC Aufreinigungen wurden auf dem Knauer HPLC Instrument

durchgeführt. Es wurde mit einer Merck LiChrospher® 100 RP-18e 10 µm (250 x 10 mm) bei

einer Flussrate von 5 ml/min gearbeitet. Beim Gradienten wurde zuerst mit 100 % von Ge-

misch A für 5 min gearbeitet, dann wurde innerhalb von 20 min der Gradient auf 100 % von

Lösungsmittelgemisch B umgestellt. Für 10 min wurde dann mit 100 % von Gemisch B gear-

beitet. Innerhalb von 5 min wurde die mobile Phase wieder auf 100 % Gemisch A umgestellt

und so für die letzten 5 min der Aufreinigung belassen. Die Detektion erfolgte bei 214 nm und

bei 254 nm.

Präperative HPLC Reinigung wurden auf einer Varian ProStar 210 mit PDA Detektor durch-

geführt. Die Versuche wuden bei einer Flussrate von 20 ml/min durchgeführt. Als stationäre

Phase wurde eine HIBAR Lichrospher 100 RP-18e (250 x 25 mm) verwendet. In den ersten 5

min wurde eine mobile Phase von 100 % Lösungsmittelgemisch A genutzt. Nach 5 min wurde

der Anteil von Lösungsmittelgemisch B sukzessive erhöht, bis er in Minute 25 des Laufes

99 % von Lösungsmittelgemisch B erreicht hatte. Es wurde dann für 5 min 99 % von Ge-

misch B gepumpt, um danach innerhalb von 5 min wieder 100 % von Gemisch A zu pumpen.

Es wurde dann für die letzten 5 min der Reinigung bei 100 % von Gemisch A gepumpt.

Experimentalteil

Seite | 98

Das genutzte Fluoreszenzmikroskop ist ein IX-81 Olympus. Die Anregung erfolgte bei

330 nm – 385 nm, die Emission erfolgte bei > 420 nm.

Mikrowellereaktionen wurden in einem CEM Discover Mikrowellengerät ausgeführt.

Es wurde ein WITec Alpha300 R/A/S Ramanspektrometer verwendet. Alle Messungen wur-

den mit einem Laser bei 785 nm bei 200 mW durchgeführt. Die jeweilige Bande kann

schwach ausgeprägt sein, dann ist die Bande mit einem „w“ gekennzeichnet. Falls die Bande

mittel ausgeprägt ist, ist sie mit einem „m“ gekennzeichnet. Alle mit einem „s“ gekennzeich-

neten Banden, sind stark ausgeprägt.

Synthesen

Synthese von 2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid 1

250 mg (0.7353 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 20 ml Wasser gelöst.

Es bildete sich eine gelbfarbene Lösung. 0.13 ml (0.8834 mmol) 2-Phenylpyridin wurden in

20 ml Ethanol gelöst und langsam in die erste Lösung getropft. An der Eintropfstelle bildete

sich umgehend ein gelbfarbener Niederschlag. Die Suspension wurde für zwei Stunden ge-

rührt. Der Feststoff wurde von der Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 232.5 mg (0.5088 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloroaurat-

(III)hydrat: 69.2 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 9.30 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.48 (td, J = 7.8, 1.2 Hz 1H),

8.12 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.99 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.91 – 7.80 (m, 4H), 7.76 (t, J = 6.5 Hz,

1H).

Experimentalteil

Seite | 99

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichlorid 2

232.5 mg (0.5088 mmol) 2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichlorid 1 wurden in einer Mischung

aus 20 ml Wasser und 20 ml Acetonitril suspendiert. Die Suspension wurde refluxiert, wobei

eine gelbfarbene Lösung entstandt. Die Lösung wurde für vier Stunden in der Siedehitze ge-

rührt. Langsam wurde die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Es entstand ein

gelbfarbener Niederschlag. Der Feststoff wurde von der Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 94.6 mg (0.2247 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-1-

gold(III)trichlorid 1: 44.2 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 9.52 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.46 – 8.37 (m, 2H), 7.97 (d, J =

7.8 Hz, 1H), 7.85 – 7.73 (m, 2H), 7.48 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.9 Hz, 1H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 183.5, 168.2, 149.3, 129.1, 127.5, 127.0, 126.1, 125.5,

124.9, 124.2, 122.9

Elementaranalyse (kalkuliert in Klammern): C 31.26 (31.30), N 3.26 (3.32), H 1.96 (1.91)

Experimentalteil

Seite | 100

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-säure 3 116

2-Brompyridin wurde destilliert. 939.5 µl (9.64 mmol) der Fraktion, welche bei einer Bad-

temperatur von 125 °C, einer Kopftemperatur von 74 °C und einem Druck von 16 mbar erhal-

ten wurden, wurden zusammen mit 1.6 g (9.64 mmol) Carboxybenzolboronsäure und

578.4 mg (0.482 mmol) Palladium(0)tetrakis(triphenylphosphin) in 100 ml Acetonitril und

100 ml 0.4 M Natriumcarbonatlösung suspendiert. Die Lösung wurde 20 min mit Stickstoff

durchblasen. Die Lösung wurde für 20 Stunden refluxiert. Die Suspension wurde heiß filtriert.

Es blieb ein gelbfarbener Rückstand im Filter. Die Lösung war leicht gelbfarben. Sie wurde

bis zur Hälfte eingeengt, wobei sich ein farbloser Schaum bildete. Die Lösung wurde dreimal

mit etwa 200 ml Dichlormethan gewaschen. Die wässrige Phase war gelbfarben, ihr wurden

3 ml konzentrierte Salzsäurelösung zugegeben. Es bildete sich eine Trübung der Lösung. Die

Lösung wurde über Nacht bei – 20 °C gelagert. Die Suspension wurde aufgetaut und der farb-

lose Niederschlag wurde von der Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 1.75 g (8.81 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Brompyridin: 91.4 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 8.31-8.19 (m, 4H), 8.10 (d, J = 8.4

Hz, 2H), 7.73 (td, 6.4 Hz, 2.2 Hz, 1H).

Experimentalteil

Seite | 101

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-säure-1´-gold(III)trichlorid 4

500 mg (2,51 mmol) 2-Phenylpyridin-3´-säure 3 wurden in 30 ml Ethanol gelöst. 675.7 mg

(2 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 30 ml Wasser gelöst und zur ersten

Lösung gegeben. Es entstand eine gelbfarbenen Suspension. Die Suspension wurde über

Nacht gerührt. Die Suspension wurde zentrifugiert, der Rückstand wurde getrocknet.

Ausbeute: 581.5 mg (1.1608 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-3´-säure 3:

58 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.76 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 8.14 –

8.09 (m, 4H), 7.55 (t, J = 5.6 Hz, 1H).

Elementaranalyse (kalkuliert in Klammern): C 28.56 (28.68), N 2.73 (2.79), H 1.73 (1.81)

Experimentalteil

Seite | 102

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-acrylsäure 6 117

1.5 g (8.19 mmol) 4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd wurden in 20 ml Pyridin gelöst. In die

gelbfarbene Lösung wurden 2.56 g (24.58 mmol) Malonsäure und 200 µl Piperidin gegeben.

Die Lösung wurde auf 100 °C erhitzt und für 24 Stunden gerühert. Nach dem die Lösung

Raumtemperatur erreicht hatte, wurden 100 ml 18 Vol.-% Salzsäurelösung zugegeben. Es

bildete sich ein farbloser Schaum. Die Suspension wurde gefiltert. Das Filtrat wurde dreimal

mit 50 ml Dichlormethan gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Ammoniumchlorid auf

einen pH-Wert von 6.5 eingestellt und es wurde fünfmal mit 50 ml Dichlormethan extrahiert.

Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt und das Produkt über wenig Kieselgel

mit einem Laufmittel aus 12.5 Teilen Dichlormethan und einem Teil Methanol gereinigt.

Ausbeute: 382.7 mg (1.6991 mmol) bezogen auf das eingesetzte 4-(2-Pyridin)phenyl-3-

aldehyd: 20.7 %

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.44 (s, 1H), 8.68 (dq, J = 4.6, 0.8 Hz, 1H), 8.12 (d, J =

8.4 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.88 (td, J = 7.8, 1.8 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H),

7.65 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.36 (td, J = 6.4, 1.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 16.0 Hz, 1H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 167.5, 149.6, 143.2, 140.1, 137.2, 134.8, 129.7, 128.6,

127.1, 126.9, 126.1, 122.9, 120.1, 119.8

Elementaranalyse (kalkuliert in Klammern): C 74.55 (74.65), N 6.26 (6.22), H 4.65 (4.92)

Experimentalteil

Seite | 103

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäure 7

In einen Schlenkkolben wurden 150 mg (0.666 mmol) 2-Phenylpyridin-3´-acrylsäure 6 gege-

ben und in 20 ml Ethanol suspendiert. In die Suspension wurde für 10 min Stickstoff eingelei-

tet. Es wurden 17 mg einer Mischung aus einem Teil Palladium und neun Teilen Aktivkohle

in die Suspension gegeben. Mittels einer Wasserstrahlpumpe wurde der Druck im Kolben

vermindert. Nun wurde an den Schlenkkolben Wasserstoffgas angeschlossen und der Kolben

mit dem Gas geflutet. Nach 40 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre wurde etwas Kieselgel

zugegeben und das Lösungsmittel entfernt. Das Rohprodukt wurde über wenig Kieselgel mit

einem Laufmittel aus neun Teilen Dichlormethan und einem Teil Methanol gereinigt.

Ausbeute: 116.5 mg (0.513 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-3´-acrylsäure

6: 77 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.64 (dt, J = 4.8, 0.8 Hz 1H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.94

– 7.81 (m, 2H), 7.40 – 7.26 (m, 3H), 2.88 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.58 (t, J = 7.5 Hz, 2H).

N

O

OH

6C14H11NO2

225 g/mol

H2

H2

2 g/mol

PalladiumAktivkohle N

O

OH

7C14H13NO2

227 g/mol

Experimentalteil

Seite | 104

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäure-1-gold(III)trichorid 8

100 mg (0.4404 mmol) 2-Phenylpyridin-3´-propansäure 7 wurden in 5 ml Acetonitril gelöst.

119 mg (0.3523 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 5 ml Wasser gelöst.

Beide Lösungen wurden zusammen gegeben und für drei Stunden gerührt. Das Lösungsmittel

wurde entfernt. Das Rohprodukt wurde über Kieselgel und einem Laufmittel aus neun Teilen

Dichlormethan und einem Teil Methanol getrennt.

Ausbeute: 86.8 mg (0.1641 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat: 46.6 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.82 (dt, J = 5.6, 0.9 Hz, 1H), 8.45 (td, J = 8.0, 1.5 Hz, 1H),

8.29 (dt, J = 8.0, 0.7 Hz, 1H), 7.93 (dt, J = 8.4, 1.6 Hz, 2H), 7.84 (td, J = 6.6, 1.0 Hz, 1H),

7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 2.92 (dd, J = 13.7, 6.3 Hz, 2H),, 2.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 164.3, 150.1, 144.7, 140.5, 137.6, 135.1, 129.3, 128.7,

127.4, 126.6, 126.4, 123.4, 122.1, 119.7

Experimentalteil

Seite | 105

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-acrylat 10

In einen Schlenkkolben wurden 100 ml Tetrahydrofuran vorgelegt. In dem Lösungsmittel

wurden 2.04 g (5.5 mmol) (Essigsäuremethylester)triphenylphosphoniumchlorid suspendiert.

9.9 ml (4.95 mmol) Kaliumhexamethyldisilizan als 0.5 M Lösung in Toluol wurden der farb-

losen Suspension zugegeben. Es wurden 500 mg (2.75 mmol) 4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd

zugegeben. Es entstand eine orangefarbene Reaktionssuspension. Die Säulenchromato-

graphische Auftreinigung erfolgt über neutrales Aluminiumoxid und als mobile Phase wurde

eine Mischung aus Dichlormethan mit 0.25 % Methanol verwendet.

Ausbeute: 62.2 mg (0.28 mmol) bezogen auf das eingesetzte 4-(2-Pyridin)phenyl-3-aldehyd:

9.5 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.73 – 8.65 (m, 1H), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 (d, J =

8.1 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 7.3, 1.8 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.4, 2H), 7.72 (d, J = 16.1, 1H), 7.38

(td, J = 6.2, 1.1 Hz 1H), 6.73 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 166.9, 149.7, 143.6, 140.4, 137.4, 134.5, 129.9, 128.7,

127.4, 127.0, 126.5, 123.3, 120.5, 120.2, 52.2

Experimentalteil

Seite | 106

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester 11

In einen Schlenkkolben wurden 50 mg (0.2092 mmol) 2-Phenylpyridin-3´-acrylat 10 gegeben

und in 20 ml Ethanol suspendiert. In die Suspension wurden für 10 min Stickstoff eingeleitet.

Es wurden 5.3 mg einer Mischung aus einem Teil Palladium und neun Teilen Aktivkohle in

die Suspension gegeben. Mittels einer Wasserstrahlpumpe wurde der Druck im Kolben ver-

mindert. An den Schlenkkolben wurde Wasserstoffgas angeschlossen und der Kolben mit

dem Gas geflutet. Nach 43 Stunden unter Wasserstoffatmosphäre wurde etwas Kieselgel zu-

gegeben und das Lösungsmittel entfernt. Das Rohprodukt wurde über neutrales Kieselgel mit

einem Laufmittel aus Dichlormethan mit 0.25 % Methanol gereinigt.

Ausbeute: 44.3 mg (0.1838 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-3´-acrylat 11:

87.9 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.69 (d, J = 4.5, 1H), 8.09 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 8.07 (d,

J = 7.61 Hz, 1H), 7.88 (dd, J = 7.5, 2.0 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 9.1, 2H), 7.41 (t, J = 5.6 Hz 1H),

2.91 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H).

Experimentalteil

Seite | 107

Synthese von 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester-1-gold(III)trichorid 12

32.4 mg (0.1344 mmol) 2-Phenylpyridin-3´-propansäuremethylester 11 wurden in 3 ml Ace-

tonitril gelöst. 36.5 mg (0.1075 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 3 ml

Wasser gelöst. Beide Lösungen wuden zusammen gegeben und für drei Stunden gerührt. Das

Lösungsmittel wurde entfernt. Das Rohprodukt wurde über neutrales Aluminiumoxid und

einem Laufmittel aus hundert Teilen Dichlormethan und einem Teil Methanol getrennt.

Ausbeute: 22.4 mg (0.0413 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat: 38.4 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.85 (dt, J = 4.7, 1.2 Hz, 1H), 8.46 (td, J = 8.5, 1.1 Hz, 1H),

8.25 (dt, J = 6.3, 0.3 Hz, 1H), 7.99 (dt, J = 8.2, 1.0 Hz, 2H), 7.86 (td, J = 5.6, 1.9 Hz, 1H),

7.63 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H).

Elementaranalyse (kalkuliert in Klammern): C 33.16 (33.08), N 2.46 (2.57), H 2.69 (2.78)

Experimentalteil

Seite | 108

Synthese von 4-Brom-2-Phenylpyridin 14

2.1067 g (11.7 mmol) Magnesiumspäne wurden in einen Schlenkkolben in 4 ml Tetrahydro-

furan suspendiert. Der Mischung wurden langsam 1.22 ml (11.7 mmol) Brombenzol zuge-

tropft. Die Lösung wurde für eine Stunde refluxiert.

In einem zweiten Schlenkkolben wurden 750 mg (4.78 mmol) 4-Brompyridin Hydrochlorid in

50 ml Tetrahydrofuran suspendiert. Der Kolben wurde auf -78 °C gekühlt und es wurde für

eine halbe Stunde gerührt. Die erste nun graufarbene Lösung wurde langsam in die Suspensi-

on getropft. Es wurde eine halbe Stunde nach dem zu tropfen weiter bei -78 °C gerührt. Es

werden 705 µl (5.58 mmol) Phenylchlorformiat in 5 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Die

gelbfarbene Lösung wurde eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde

in einen Kolben mit 20 Gew.-% Ammoniumchloridlösung bei 0 °C gegeben. Es wurde drei-

mal mit 30 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten Diethyletherphasen wurden mit 50 ml

Wasser gewaschen, mit 50 ml 10 Vol.-% Salzsäurelösung und wieder mit 50 ml Wasser ge-

waschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel

wurde evaporiert und das zurückbleibende gelbfarbene Öl wurde für 20 Stunden getrocknet.

Das Öl wurde in einem Schlenkkolben in 30 ml Toluol gelöst. Der Lösung wurden 1.451 g

(5.95 mmol) o-Chloranilin in 20 ml Eisessig zugegeben. Die rotfarbene Lösung wurde für

22 Stunden gerührt. Es wurden 40 ml einer 10 Gew.-% Natriumhydroxidlösung zugegeben.

Die Lösung färbte sich tief dunkel rotfarben und es bildete sich ein schwarzfarbener Nieder-

schlag. Die Suspension erwärmt sich. Sie wurde durch Celite gefiltert. Das Filtrat wurde

dreimal mit 50 ml Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde dreimal mit 10 Vol.-%

Salzsäurelösung extrahiert. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden dreimal mit 50 ml

Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat

getrocknet, gefiltert und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Der orangefar-

bene Rückstand wurde getrocknet.

Experimentalteil

Seite | 109

Ausbeute: 607.3 mg (2.6067 mmol) bezogen auf das eingesetzte 4-Brompyridin: 54.5 %

1H NMR (200 MHz, CD2Cl2) δ 8.08 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.63 – 7.54 (m, 2H), 7.51 (dd, J =

1.6, 0.4 Hz 1H), 7.06 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 1.8 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 1.8 Hz, 1H).

13C NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ 156.3, 151.6, 138.7, 133.9, 131.2, 129.6, 128.7, 127.9, 127.6,

127.3, 123.5

Experimentalteil

Seite | 110

Synthese von 4-Brom-2-Phenylpyridin-1-gold(III)trichorid 15

100 mg (0.4292 mmol) 4-Brom-2-Phenylpyridin 14 werden in 3 ml Acetonitril gelöst. Es ent-

stand eine braunfarbene Lösung. 121.79 mg (0.3605 mmol) Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat wurden in 3 ml Wasser gelöst. Es entstand eine gelbfarbene Lösung. Die erste

Lösung wurde in die zweite Lösung gegeben, es entstand schlagartig ein gelbfarbener Nieder-

schlag. Die Suspension wurde für eine Stunde gerührt. Die Suspension wurde gefiltert. Der so

gewonnen Feststoff wurde getrocknet.

Ausbeute: 53.27 mg (0.0996 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat: 27.6 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 14.94 (s, 1H), 8.59 (dd, J = 5.6, 0.4 Hz, 1H), 8.33 (d, J =

1.5 Hz, 1H), 8.13 – 8.09 (m, 1H), 8.07 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 5.5, 1.8 Hz, 1H), 7.57

– 7.48 (m, 3H).

13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 164.2, 158.2, 139.3, 133.7, 132.1, 130.4, 129.3, 128.5,

128.1, 127.6, 123.1

Experimentalteil

Seite | 111

Synthese von 2-Phenylquinolin-4-methylcarboxylat-1´-chloromercury 17 123

In einen 250 ml Kolben wurden 11 g (0.0344 mol) Quecksilber(II)acetat in 40 ml Ethanol

suspendiert. Es wurden 9.044 g (0.0344 mol) Methyl-2-phenylquinolin-4-carboxylat in 40 ml

Ethanol suspendiert und in den 250 ml Kolben gegeben. Das Gefäß in dem das Methyl-2-

phenylquinolin-4-carboxylat suspendiert war, wurde dreimal mit 20 ml Ethanol gespült. Die

Spüllösungen wurde in den 250 ml Kolben gegeben. Die leicht gelbfarbene Suspension wurde

für 12 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Es wurden 80 ml Ethanol zur Suspension

zugegeben. Die Partikel in der Suspension waren farblos, das Lösungsmittel war gelbfarben.

Die heiße Suspension wurde durch einen Faltenfilter in eine Methanollösung aus 50 ml Me-

thanol und 2.0218 g (0.04816 mol) Lithiumchlorid gefiltert. Es entsteht ein farbloser Nieder-

schlag, die Lösung war leicht gelbfarben. Der farblose Feststoff wurde von der Lösung ge-

trennt, dreimal mit 50 ml Wasser und dreimal mit 50 ml Ethanol gewaschen. Der Feststoff

wurde getrocknet.

Ausbeute: 9.7103 g (0.0196 mol) bezogen auf das eingesetzte Methyl-2-phenylquinolin-4-

carboxylat: 56.6 %

1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 8.59 (s, 1H), 8.43 (t, J = 2.1 Hz 1H), 8.37 (t, J = 2.2 Hz, 1H),

8.01 (t, J = 1.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.42 – 7.38 (m, 3H), 7.04 (d, J = 1.7 Hz,

1H), 4.01 (s, 3H).

13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 148.3, 140.9, 128.3, 129.3, 128.6, 138.3, 155.0, 110.9, 124.9,

125.6, 131.1, 128.2, 130.9, 136.7, 147.9, 166.5, 53.1

Experimentalteil

Seite | 112

Synthese von Methyl-6,6´-dimethyl-[2,2´-bipyridin]-4-carboxylat-1-

gold(III)trichloride 19 171

20 mg (0.0826 mmol) Methyl 6,6'-dimethyl-[2,2'-bipyridine]-4-carboxylat und 27.92 mg

(0.0826 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in einer Mischung aus 5 ml Was-

ser und 5 ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wurde zwei Stunden gerührt. Das Lösungsmittel

wurde im Unterdruck eingeengt. Es entstand ein gelbfarbener Niederschlag. Der Feststoff

wurde von der Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 8.5 mg (0.0156 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloroau-

rat(III)hydrat: 18.9 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.73 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.42 – 8.36 (m, 2H), 8.12 (d, J =

8.1 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 5.9, 3.1 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.5 Hz,

1H), 7.33 (td, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H).

Experimentalteil

Seite | 113

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´-golddiaceatat 20

100 mg (0.23 mmol) 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichlorid 2 wurden in 500 ml Aceton ge-

löst. Durch die farblose Lösung wurden 10 min Stickstoff geblasen. Es wurden 86.7 mg

(0.5077 mmol) Silberacetat zugegeben. Die Suspension wurde filtriert. Das Filtrat wurde ein-

geengt, bis ein graufarbener Niederschlag entstanden war. Dieser Niederschlag wurde von der

Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 21.1 mg (0.045 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-1,1´-

gold(III)dichlorid 2: 19.6 %

1H NMR (250 MHz, DMSO-d6) δ 8.55 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 8.41 (m, 2H), 7.93 (d, J = 6.7 Hz,

1H), 7.72 (td, J = 7.8, 3.3 Hz, 1H), 7.48 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.12 (d, J

= 7.5 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.99 (s, 3H).

Experimentalteil

Seite | 114

Synthese von 2-Phenylpyridin-1-gold(III)tribromid 650

100 mg (0.1813 mmol) Kaliumtetrabromoaurat(III) wurden in 5 ml Wasser gelöst. 31.1 µl

(0.2175 mmol)) 2-Phenylpyridin wurden in 5 ml Ethanol gelöst und langsam in die erste

dunkelrotfarbene Lösung getropft. Es entstand ein gelbfarbener Schaum. Die Lösung wurde

für drei Stunden gerührt. Es hatte sich ein rotfarbener Niederschlag gebildet, dieser wurde

vom Überstand getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 76.4 mg (0.1296 mmol) bezogen auf das eingesetzte Kaliumtetrabromoaurat(III):

71.6 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.42 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 8.62 (t, J = 8.1, 1H),

8.25 (dt, J = 7.4, 1.2 Hz 1H), 8.11 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 8.01 – 7.90 (m, 4H), 7.85 (t, J = 7.2 Hz,

1H).

Experimentalteil

Seite | 115

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´gold(II)dibromid 651

76.4 mg (0.1296 mmol) 2-Phenylpyridin-1-gold(III)tribromid 650 wurden in einer Mischung

aus 15 ml Wasser und 15 ml Acetonitril suspendiert. Die Suspension wurde sechs Stunden

refluxiert, wobei eine rotfarbene Lösung entstand. Langsam wurde die Lösung auf Raumtem-

peratur abgekühlt. Es entstand ein gelbfarbener Niederschlag. Der Feststoff wurde von der

Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 17.26 mg (0.0339 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-1-

gold(III)tribromid 650: 26 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.73 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 8.42 – 8.36 (m, 2H), 8.12 (d, J =

8.1 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 7.6, 1.6 Hz, 1H), 7.77 (td, J = 5.9, 3.1 Hz, 1H), 7.46 (t, J = 7.5 Hz,

1H), 7.33 (td, J = 8.0, 1.6 Hz, 1H). 13

C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 185.1, 155.7, 145.2, 132.4, 127.9, 127.5, 126.1, 125.9,

125.6, 124.9, 124.3

Experimentalteil

Seite | 116

Synthese von Tetraethylammoniumtetrachloroaurat(III) 172

0.2 g (0.51 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 30 ml Ethanol gelöst. Zur

gelbfarbenen Lösung wurden 84.28 mg (0.51 mmol) Tetraethylammoniumchlorid zugegeben.

Es fiel ein gelbfarbener Feststoff aus, welcher von der Lösung getrennt wurde und aus Etha-

nol umkristallisiert wurde. Der Feststoff wurde getrocknet.

Ausbeute: 147 mg (0.31 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloroau-

rat(III)hydrat: 62 %

Experimentalteil

Seite | 117

Synthese von Tetraethylammoniumtetrabromoaurat(III) 172

Bei einer Temperatur von 55 °C wurden zu einer Lösung von 0.2 g (0.51 mmol)

Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat in 30 ml Ethanol, 1.0671 g (0.51 mmol)

Tetraethylammoniumbromid in 20 ml Ethanol gegeben. Die vorher gelbfarbene Lösung färbte

sich bei der Zugabe schlagartig dunkel rotfarben. Die Suspension wurde bei 55 °C für zwei

Stunden gerührt. Der violettfarbene Feststoff wurde von der Lösung getrennt, in Ethanol

umkristallisiert und getrocknet.

Ausbeute: 253 mg (0.3936 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloroau-

rat(III)hydrat: 77.1 %

Experimentalteil

Seite | 118

Synthese von Tetraethylammoniumphenyltrichloroaurat(III) 652 173

In einen 50 ml Kolben werden 144.61 (0.3097 mmol) Tetraethylammoniumtetrachloroau-

rat(III) in 20 ml Ethanol suspendiert. Die leicht gelbfarbene Suspension wurde auf 50 °C er-

hitzt. In einem zweiten 50 ml Kolben wurde eine Suspension aus 44.83 mg (0.3097 mmol)

Phenylhydraziniumchlorid in 20 ml Ethanol angesetzt. Diese Mischung wurde in dem ersten

Kolben mit beigegeben. Die so entstandene Suspension wurde für drei Stunden gerührt und

heiß gefiltert. Die Lösung wurde für 12 Stunden bei -20 °C gelagert. Es hatte sich ein

gelbfarbener Feststoff gebildet, welcher von der Lösung getrennt und getrocknet wurde.

Ausbeute: 8.72 mg (0.0171 mmol) bezogen auf das eingesetzte Tetraethylammoniumtetra-

chloroaurat(III): 5.5 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 7.62 – 7.49 (m, 5H), 3.27 (q, J = 8.4 Hz, 8H), 1.25 (t, J =

6.8 Hz, 12H).

Experimentalteil

Seite | 119

Synthese von Tetraethylammoniumphenyltribromoaurat(III) 653 173

120 mg (0.1866 mmol) Tetraethylammoniumtetrabromoaurat(III) wurden in 5 ml Ethanol

suspendiert. Die Suspension wurde auf 45 °C erhitzt. Es wuden zu dieser Mischung 30.01 mg

(0.2084 mmol) Phenylhydraziniumchlorid in 5 ml Ethanol gegeben. Die rotfarbene Reakti-

onssuspension wurde gelbfarben während den fünf Stunden bei der sie bei 45 °C erhitzt wur-

de. Die Mischung wurde warm gefiltert und für drei Tage bei – 18 °C gelagert. Es war ein

gelbfarbener Niederschlag entstanden. Dieser wurde von der Lösung getrennt und getrocknet.

Ausbeute: 12.56 mg (0.0196 mmol) bezogen auf das eingesetzte Tetraethylammoniumtetra-

bromoaurat(III): 10.5 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 7.94 – 7.78 (m, 5H), 3.26 (q, J = 9.2 Hz, 8H), 1.23 (t, J =

7.3 Hz, 12H).

Experimentalteil

Seite | 120

Synthese von Pyridin-1-gold(III)trichlorid 654 174, 175

10.4 mg (0.0306 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 0.5 ml Wasser gelöst.

Zur gelbfarbenen Lösung wurden 0.5 ml Acetonitril und 100 µl Pyridin gegeben. Die Lösung

wurde für acht Stunden gerührt. Teile des Lösungsmittels wurden im Unterdruck entfernt. Die

Lösung wurde für drei Tage bei -18 °C gelagert. Der entstanden Niederschlag wurde von der

Lösung getrennt und vorsichtig mit Wasser und Acetonitril gewaschen.

Ausbeute: 3.2 mg (0.0084 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloro-

aurat(III)hydrat: 27.4 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.25 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 8.61 – 8.48 (m, 3H)

Experimentalteil

Seite | 121

Synthese von Pyridin-1-gold(III)tribromid 655

7.6 mg (0.0138 mmol) Kaliumtetrabromoaurat(III) wurden in 0.5 ml Wasser gelöst. Zur

rotfarbenen Lösung wurden 100 µl Pyridin und 0.5 ml Acetonitril gegeben. Die Lösung wur-

de vier Stunden gerührt. Die Lösung wurde für sieben Tage bei -18 °C gelagert. Der Nieder-

schlag wurde von der Lösung getrennt, mit Wasser und Acetonitril mit Bedacht gewaschen

und anschließend getrocknet.

Ausbeute: 2.7 mg (0.0053 mmol) bezogen auf das eingesetzte Kaliumtetrabromoaurat(III):

38.4 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.34 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 8.74 – 8.56 (m, 3H)

Experimentalteil

Seite | 122

Synthese von Bipyridin-1,1´gold(III)dichlorid tetrachloroaurat(III) 656 112, 176

32 mg (0.2042 mmol) Bipyridin wurden in 3 ml Acetonitril gelöst und 53.4 mg

(0.1571 mmol) Hydrogentetrachloroaurat(III)hydrat wurden in 3 ml Wasser gelöst. Die zweite

Lösung wurde der ersten Lösung zugegeben. Es bildete sich ein gelbfarbener Niederschlag.

Dieser wurde von der Lösung getrennt. Der Feststoff wurde mit Wasser und Acetonitril gewa-

schen und danach getrocknet.

Ausbeute: 94,4 mg (0.1241 mmol) bezogen auf das eingesetzte Hydrogentetrachloroaurat-

(III)hydrat: 79.1 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.42 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 8.92 (t, J = 4.8, 1H),

8.74 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 7.6, 5.3 Hz, 1H)

Experimentalteil

Seite | 123

Synthese von Bipyridin-1,1´gold(III)dibromid tetrabromoaurat(III) 657

In 2 ml Acetonitril wurden 9.3 mg (0.0594 mmol) Bipyridin gelöst.23.4 mg (0.0424 mmol)

Kaliumtetrabromoaurat(III) wurden in 2 ml Wasser gelöst. Die Lösungen wurden zusammen

gegeben. Der entstande rotfarbene Niederschlag wurde von der Lösung getrennt. Er wurde

vorsichtig mit Wasser und Acetonitril gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 15.1 mg (0.0146 mmol) bezogen auf das eingesetzte Kaliumtetrabromoaurat(III):

34.5 %

1H NMR (200 MHz, DMSO-d6) δ 9.62 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 9.03 (t, J = 3.1, 1H),

8.82 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 8.34 (dd, J = 7.2, 4.8 Hz, 1H)

Experimentalteil

Seite | 124

Synthese von 2-Phenylpyridin-1,1´gold(III)ethanditihol 658 171, 177

15.6 mg (0.0371 mmol) 2-Phenylpyridin-1,1´-gold(III)dichlorid (2) wurden in 3 ml einer Mi-

schung aus 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril suspendiert. Es wurden 100 µl 1,2-

Ethandithiol zugeben. Die vorher leicht gelbfarbene Suspension wurde intensiver gelbfarben.

Die Mischung wurde sechs Stunden gerührt. Der Feststoff wurde von der Lösung getrennt

und mit Wasser und Acetonitril gewaschen, bis der typische Geruch von 1,2-Ethandithiol

nicht mehr wahr zu nehmen war. Der Feststoff wurde getrocknet.

Ausbeute: 8.4 mg (0.019 mmol) bezogen auf das eingesetzte 2-Phenylpyridin-1,1´-

gold(III)dichlorid 2: 51.1 %

1H NMR (200 MHz, DMSO) δ 9.52 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.44 – 8.35 (m, 2H), 7.95 (d, J = 7.6

Hz, 1H), 7.82 – 7.69 (m, 2H), 7.43 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.7 Hz, 1H) 3.01 – 2.94 (m,

4H).

Experimentalteil

Seite | 125

Peptide:

Abbildung 5-1: Verwendete natürliche Aminosäuren

Experimentalteil

Seite | 126

Abbildung 5-2: Verwendete unnatürliche Säuren

Abbildung 5-3: Schutzgruppen

Festphasen Peptidsynthese

Alle manuellen Synthesen wurden an einem Rink Amid AM Harz mit einem mesh zwischen

100-200 ausgeführt. Es wurden drei verschieden Chargen mit den Beladungen 0.69 mmol/g,

0.71 mmol/g und 0.73 mmol/g verwendet. Alle drei Chargen wurden von Novabiochem erhal-

ten. Die Peptidlösung bestand aus 70 Vol.-% N,N-Dimethylformamid und 30 Vol.-%

N-Methyl-2-pyrrolidon. Es wurde in folgenden Schritten gearbeitet:

Experimentalteil

Seite | 127

1. Das Harz wurde in der Peptidlösung für eine halbe Stunde quellen gelassen.

2. Mit einer Lösung aus 20 Vol.-% Piperidin in der Peptidlösung wurde das Harz für

10 min geschüttelt.

3. In die Spritze mit dem Harz wurde dreimal zum Waschen die Peptidlösung gezogen.

4. Die Spritze wurde erneut für 10 min mit der Lösung aus 20 Vol.-% Piperidin in der

Peptidlösung gewaschen.

5. Fünfmal wurde das Harz mit der Peptidlösung gewaschen.

6. In ein verschließbares Gefäß wurden vier Äquivalente der zu koppelnde Aminosäure,

HOBT und TBTU gegeben. Es wurde wenig der Peptidlösung zugegeben, niemals so

viel, dass das Volumen der verwendeten Spritze überschritten wurde. Sobald sich eine

Lösung gebildet hatte, wurden vier Äquivalente DIPEA zugegeben und der Inhalt so-

fort in die Spritze gezogen. Die Spritze wurde für 40 min bis 60 min geschüttelt.

7. Fünfmal wurde das Harz mit der Peptidlösung gewaschen.

8. Die Schritte 2. bis 8. wurden wiederholt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht war

und die gewünschte Sequenz synthetisiert war.

9. Das Harz wurde fünfmal mit DCM gewaschen. Das Abspalten erfolgte für mindestens

sechs Stunden in einer Lösung aus 92 Vol.-% TFA, 2.5 Vol.-% Wasser und

5.5 Vol.-% TIS, bei allen Peptide welche mindestens ein Methionin oder ein Cystein

enthalten, wurde eine Mischung aus 90 Vol.-% TFA, 2.5 Vol.-% EDT, 2.5 Vol.-%

Wasser und 5 Vol.-% TIS verwendet. Wenn sich das Harz und die Abspaltlösung bei

der Zugabe gelbfärbten, dann wurde wenig TIS zugegeben. Die Lösung wurde in ein

Plastikgefäß mit Deckel gegeben. In die Spritze wurde TFA gezogen und ebenfalls in

das Gefäß gegeben. In das Gefäß wurde Diethylether mit einer Temperatur von

- 70 °C gegeben. Es fiel ein farbloses Pulver aus, welches von der Lösung, in einer

Zentrifuge Rotina 46 von Hettich mit getrennt wurde. Abschließend wurde die Lösung

dekantiert und der feste Rückstand wurde zweimal mit DET bei - 70 °C gewaschen

und mit Zentrifugieren und Dekantieren von dem Lösungsmittel getrennt. Das Pulver

wurde in einer Mischung aus Wasser und ACN gelöst und in flüssigem Stickstoff ein-

gefroren. Die eingefrorene Lösung wurde lyophilisiert. Es wurde ein farbloses schau-

martiges Pulver erhalten.

Bei Kettenlängen über fünf Aminosäuren wurden doppelte Kopplungen durchgeführt. Das

bedeutet nach Schritt 7. wurde Schritt 6. mit der gleichen Aminosäure wiederholt. Es folgt

Experimentalteil

Seite | 128

dann erneut Schritt 7. und mit Schritt 8. wurde die nächste Aminosäure gekoppelt. In der

nachfolgenden Tabelle 5-4 werde die so erhalten Sequenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

754 H-CGRGC-NH2 2.5 493 494 [M+H]+,

247 [M+2H]2+

761 H-RRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 16.3 2170 2171 [M+H]+,

1084 [M+2H]2+

,

723 [M+3H]3+

,

543 [M+4H]4+

Tabelle 5-4

Für die Acetylierung des endständigen Amins der Sequenz, wurde nach dem letzten

Reaktionsschritt das Harz fünfmal mit 70 % N,N-Dimethylformamid und 30 % N-

Methyl-2-pyrrolidon gewaschen, die Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin, wie bei den

Schritten 2. bis 4. beschrieben, abgespalten. Nach dem Entschützungsschritt wird das

Harz fünfmal mit der Peptidlösung gewaschen und mit einer Lösung aus 0.5 M AcO2,

0.125 M DIPEA und 0.015 M HOBT in DMF für 15 min geschüttelt. Die Lösung

wurde verworfen und eine frische Lösung mit selber Zusammensetzung wurde in die

Spritz aufgezogen und für 15 min geschüttelt. Das Harz wurde fünfmal mit

Peptidlösung gewaschen. Die Abspaltung der Sequenz und das Entschützen der Sei-

tenschutzgruppen erfolgten wie unter Schritt 9. beschrieben. In der nachfolgenden Ta-

belle 5-5 werde die so erhalten Sequenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC C18 [min] Masse [g/mol] ESI+/-

[m/z]

21 Ac-CC-NH2 4.3 265 266 [M+H]+

25 Ac-CFC-NH2 17.0 412 413 [M+H]+

31 Ac-CFCEEEEE-NH2 17.3 1057 1058 [M+H]+

29 Ac-CFCRRRRR-NH2 15.0 1193 597 [M+H]2+

,

398 [M+2H]3+

23 Ac-CGC-NH2 LC 4.9 322 345 [M+Na]+,

323 [M+H]+,

321 [M]-

24 Ac-CPC-NH2 LC 5.5 362 363 [M+H]+

Tabelle 5-5

Die Azidoessigsäure wurde wie eine natürliche Aminosäure, was in Schritt 6. beschrieben ist,

an das Ende der Sequenz gekoppelt. Es folgte ein fünfmaliges waschen mit der Peptidlösung

und das Abspalten aus Schritt 9.. In der nachfolgenden Tabelle 5-6 werde die so erhalten Se-

quenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

40 OEEEEE- NH2 12.8 745 374 [M+2H]2+

Experimentalteil

Seite | 129

38 OPLGLYAL-NH2 20.8 827 828 [M+H]+

36 ORRRRR-NH2 11.9 880 441 (M+H)2+

42 ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 15.9 2253 2254 [M+H]+,

1128 [M+2H]2+

,

752 [M+3H]3+

,

564 [M+4H]4+

Tabelle 5-6

Die 4-Pentinsäure wurde wie in Schritt 6. beschrieben an das Sequenzende gekoppelt. Die

4-Pentinsäure wurde wie eine natürliche Aminosäure verwendet. Es folgte ein fünfmaliges

waschen mit der Peptidlösung. Mit Schritt 9. wurde fortgefahren. In der nachfolgenden Tabel-

le 5-7 werde die so erhalten Sequenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

34 ΠCFC-NH2 17.1 450 451 [M+H]+

747 ΠCFFFC-NH2 20.3 744 745 [M+H]+

749 ΠCFRFC-NH2 17.6 753 754 [M+H]+,

377 [M+2H]2+

703 ΠCGGC-NH2 13.2 417 418 [M+H]+

706 ΠCGGGC-NH2 14.8 474 475 [M+H]+

707 ΠCGGGGC-NH2 13.2 531 532 [M+H]+

709 ΠCGGGGGC-NH2 11.8 588 589 [M+H]+

751 ΠCGRGC-NH2 13.0 573 574 [M+H]+

711 ΠCGΔGC-NH2 15.8 502 503 [M+H]+

48 ΠCRC-NH2 14.5 459 460 [M+H]+,

231 [M+2H]2+

713 ΠCRRRC-NH2 12.4 771 771 [M]+,

386 [M+H]2+

Tabelle 5-7

In der nachfolgenden Tabelle 5-8 wurden die Sequenzen genau wie letzten Abschnitt be-

schrieben erhalten, jedoch wurde in der analytischen HPLC eine C8-Säule verwendet.

Nr. Sequenz HPLC

C8 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

659 ΠCGC-NH2 13.5 360 361 [M+H]+

660 ΠMGC-NH2 13.8 388 389 [M+H]+

661 ΠEGC-NH2 13.6 386 387 [M+H]+

662 ΠZGC-NH2 12.9 343 344 [M+H]+

663 ΠBGC-NH2 16.5 405 406 [M+H]+

664 ΠCGM-NH2 13.4 388 389 [M+H]+

665 ΠZGM-NH2 12.7 371 372 [M+H]+

666 ΠJGM-NH2 13.4 433 434 [M+H]+

667 ΠKGM-NH2 13.9 413 414 [M+H]+

668 ΠCGH-NH2 13.5 394 395 [M+H]+

669 ΠMGH-NH2 15.1 422 423 [M+H]+

670 ΠCGA-NH2 15.7 328 329 [M+H]+,

Experimentalteil

Seite | 130

351 [M+Na]+

671 ΠMGA-NH2 14.0 356 357 [M+H]+

672 ΠZGD-NH2 13.9 355 356 [M+H]+

673 ΠKGD-NH2 14.1 397 398 [M+H]+

674 ΠCGZ-NH2 15.0 343 344 [M+H]+

675 ΠDGZ-NH2 13.6 355 356 [M+H]+

676 ΠZGZ-NH2 13.2 326 327 [M+H]+,

349 [M+Na]+

677 ΠCGB-NH2 15.4 405 406 [M+H]+

678 ΠBGB-NH2 14.5 450 451 [M+H]+

679 ΠJGB-NH2 14.7 450 451 [M+H]+

680 ΠCGJ-NH2 15.4 405 406 [M+H]+

681 ΠMGK-NH2 13.3 413 414 [M+H]+

Tabelle 5-8

In der nachfolgenden Tabelle 5-9 wurden die Sequenzen genau wie vorletzten Abschnitt be-

schrieben erhalten, jedoch wurden in der analytischen HPLC manchmal eine C8- und

manchmal eine C18-Säule verwendet.

Nr. Sequenz HPLC

[min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

716 ΠBRRRC-NH2 12.1(C18) 816 817 [M+H]+,

409 [M+2H]2+

715 ΠCRRRB-NH2 13.6(C8) 816 409 [M+2H]2+

,

273 [M+3H]3+

717 ΠCRRRD-NH2 13.2(C8) 783 784 [M+H]+,

393 [M+2H]2+

719 ΠCRRRE-NH2 13.7(C8) 797 798 [M+H]+,

400 [M+2H]2+

267 [M+3H]3+

721 ΠCRRRH-NH2 11.5(C18) 805 806 [M+H]+,

404 [M+2H]2+

,

270 [M+3H]3+

723 ΠCRRRJ-NH2 13.4(C8) 816 817 [M+H]+,

409 [M+2H]2+

,

273 [M+3H]3+

725 ΠCRRRK-NH2 13.3(C8) 796 399 [M+2H]2+

,

267 [M+3H]3+

727 ΠCRRRM-NH2 14.4(C8) 799 401 [M+2H]2+

729 ΠCRRRZ-NH2 13.5(C8) 754 755 [M+H]+,

378 [M+2H]2+

,

253 [M+3H]3+

718 ΠDRRRC-NH2 13.4(C8) 783 784 [M+H]+,

393 [M+2H]2+

,

263 [M+3H]3+

720 ΠERRRC-NH2 5.8(C18) 797 798 [M+H]+,

400 [M+2H]2+

722 ΠHRRRC-NH2 12.1(C18) 805 404 [M+2H]2+

,

270 [M+3H]3+

Experimentalteil

Seite | 131

724 ΠJRRRC-NH2 11.1(C18) 816 817 [M+H]+,

408 [M+2H]2+

,

273 [M+3H]3+

726 ΠKRRRC-NH2 6.3(C18) 796 797 [M+H]+,

399 [M+2H]2+

,

267 [M+3H]3+

728 ΠMRRRC-NH2 12.9(C18) 799 800 [M+H]+,

401 [M+2H]2+

730 ΠZRRRC-NH2 2.7(C18) 754 755 [M+H]+,

378 [M+2H]2+

,

253 [M+3H]3+

Tabelle 5-9

Die automatische Peptidsynthese erfolgte an einem CEM Liberty Mikrowellen Peptid Synthe-

sizer. An dem Gerät können zwei Ansatzgrößen synthetisiert werden: 0.1 mmol und

0.25 mmol. Bei allen Synthesen wurde ein Rink Amid AM Harz mit einem mesh zwischen

100-200 verwendet. Es wurden drei verschieden Chargen mit den Beladungen 0.69 mmol/g,

0.71 mmol/g und 0.73 mmol/g verwendet. Alle drei Chargen werden von Novabiochem erhal-

ten. Alle benötigten Massen und Volumen wurden von der Software PepDriver berechnet.

Das Harz wurde für die Synthese in ein Gefäß eingewogen und in N,N-Dimethylformamid für

eine halbe Stunde quellen gelassen. Die berechneten Massen an Aminosäuren wurden in spe-

zielle Gefäße eingewogen und in den vorgegebenen Mengen einer Lösung aus 70 Vol.-%

N,N-Dimethylformamid und 30 Vol.-% N-Methyl-2-pyrrolidon gelöst. Sobald die Aminosäu-

ren gelöst waren, wurden sie an die vorgesehen Halterungen geschraubt. In eine Schraubde-

ckelflasche aus Glass wurde die Lösung zur Fmoc-Entschützung aus 20 Vol.-% Piperidin in

DMF gegeben und an das Gerät angeschlossen. Die vorgegebene Menge an Aktivatorlösung

aus HOBT und TBTU in DMF wurden mittels einer Schraubdeckelflasche an das Gerät ange-

schlossen. Dasselbe wurde mit der Aktivatorbase DIPEA in NMP gemacht. Nachdem alle

Lösungen angeschlossen waren, konnte das Gerät gestartet werden. Das fertige Peptid am

Harz befand sich in demselben Gefäß an dem auch schon das Harz selber angeschlossen wor-

den war. Das mit Peptid beladene Harz wurde in 5 ml Polypropylenspritzen mit einem Filter

bei 0.1 mmol Ansätzen und bei 0.25 mmol Ansätzen in eine 10 ml Spritze gegeben. Es gab

vier Möglichkeiten weiter fortzufahren.

1) Die Fmoc-Entschütze Sequenz wurde zweimal mit einer Lösung aus 0.5 M AcO2,

0.125 M DIPEA und 0.015 HOBT in DMF für 15 min behandelt. Zwischen dem ers-

ten und dem zweiten Anwenden wurde das Harz fünfmal mit der Peptidlösung gewa-

schen. In der nachfolgenden Tabelle 5-10 werde die so erhalten Sequenzen mit allen

Daten aufgeführt.

Experimentalteil

Seite | 132

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

32 Ac-CFCEEEEE-NH2 17.3 1057 1058[M+H]+

33 Ac-CFCE(ODmab)E(ODmab)-NH2 19.8 1292 1293 [M+H]+,

647 [M+2H]+

29 Ac-CFCRRRRR-NH2 15.0 1193 597 [M+H]2+

,

398 [M+2H]3+

764 Ac-CGRGCRRRRR-NH2 11.0 1314 660 [M+2H]2+

,

440 [M+3H]3+

,

330 [M+4H]4+

,

765 Ac-CGRGCRRRRRPLGLYAL-NH2 15.6 2041 682 [M+3H]3+

,

512 [M+4H]4+

768 Ac-CGRGCRRRRR

PLGLYALEEEEE-NH2

15.5 2686 897 [M+3H]3+

,

673 [M+4H]4+

,

539 [M+5H]5+

Tabelle 5-10

2) Alle Syntheseschritte wurden mit natürlichen Aminosäuren am Synthesizer durchge-

führt. Nach der Fmoc-Abspaltung und der Überführung in die Spritzen, wurden vier

äquivalente an Azidoessigsäure, HOBT, TBTU in einer Mischung aus 70 Vol.-%

DMF und 30 Vol.-% NMP in die Spritze gezogen, sobald dieser Mischung auch vier

äquivalente DIPEA zugegeben waren. Die Spritze mit der Mischung wurde für 40

min geschüttelt, dann wurde fünfmal mit der Lösung aus 70 Vol.-% DMF und 30

Vol.-% NMP gewaschen. In der nachfolgenden Tabelle 5-11 werde die so erhalten

Sequenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

38 OEEEEE-NH2 12.8 745 374 [M+2H]2+

37 OPLGLYAL-NH2 20.8 827 828 [M+H]+

44 ORRRRRLGLYLEEEEE-NH2 17.8 2182 2183 [M+H]+,

1091 [M+2H]2+

,

730 [M+3H]3+

,

550 [M+4H]4+

,

441 [M+5H]5+

43 ORRRRRPLGLLEEEEE-NH2 15.5 2019 2020 [M+H]+,

1012 [M+2H]2+

,

676 [M+3H]3+

,

509 [M+4H]4+

,

409 [M+5H]5+

42 ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 15.9 2253 2254 [M+H]+,

1128 [M+2H]2+

,

752 [M+3H]3+

,

564 [M+4H]4+

36 ORRRRR-NH2 11.9 880 441 (M+H)2+

Tabelle 5-11

Experimentalteil

Seite | 133

3) Die Sequenz wurden wie oben beschrieben am Synthesizer dargestellt. Nach der

Fmoc-Abspaltung und der Überführung in die Spritzen, wurden vier äquivalente an

4-Pentinsäure, HOBT, TBTU in der Peptidlösung in die Spritze gezogen, sobald die-

ser Lösung auch vier äquivalente DIPEA zugegeben waren. Die Spritze mit der Mi-

schung wurde für 40 min geschüttelt, dann wurde fünfmal mit der Peptidlösung ge-

waschen. In der nachfolgenden Tabelle 5-12 werde die so erhalten Sequenzen mit al-

len Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+/-

[m/z]

34 ΠCFC-NH2 17.1 450 451 [M+H]+

703 ΠCGGC-NH2 14.9 417 418 [M+H]+

706 ΠCGGGC-NH2 14.8 474 475 [M+H]+

751 ΠCGRGC-NH2 13.0 573 574 [M+H]+

48 ΠCRC-NH2 14.5 459 460 [M+H]+,

231 [M+2H]2+

713 ΠCRRRC-NH2 12.4 771 771 [M]+,

386 [M+H]2+

Tabelle 5-12

4) Die komplette Sequenz wurde am CEM Liberty Mikrowellen Peptid Synthesizer dar-

gestellt. Um die 4-Pentinsäure zu koppeln wurde der Halter für die Aminosäure Serin

verwendet. Im Programm PepDriver wurde in der Sequenz Serin anstelle der

4-Pentinsäure eingestellt. Die von der Software berechnete Menge an Serin wurde

durch die die molare Masse von Serin dividiert und mit der molare Masse von 4-

Pentinsäure multipliziert. Die so berechnete Masse von 4-Pentinsäure wurde einge-

wogen, in das Vorratsgefäß gegeben und in der von der Software für das Serin ange-

gebenen Menge Lösungsmittel gelöst. In der nachfolgenden Tabelle 5-13 werde die

so erhalten Sequenzen mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

703 ΠCGGC-NH2 14.9 417 418 [M+H]+

706 ΠCGGGC-NH2 14.8 474 475 [M+H]+

713 ΠCRRRC-NH2 12.4 771 771 [M]+,

386 [M+H]2+

Tabelle 5-13

Sobald die Sequenz fertig war und das Harz in der Spritze war, wurde fünfmal mit

Dichlormethan gewaschen. Das Harz wurde dann für mindestens sechs Stunden in einer Lö-

sung aus 92 Vol.-% TFA, 2.5 Vol.-% Wasser und 5.5 Vol.-% TIS, bei allen Peptide welche

mindestens ein Methionin oder ein Cystein enthalten mit einer Mischung aus 90 Vol.-% TFA,

Experimentalteil

Seite | 134

2.5 Vol.-% EDT, 2.5 Vol.-% Wasser und 5 Vol.-% TIS behandelt. Wenn sich das Harz und

die Lösung bei der Zugabe gelbfärbten, dann wurde wenig TIS zugegeben. Die Lösung wurde

in ein Plastikgefäß mit Deckel gegeben. In die Spritze wurde TFA gezogen und ebenfalls in

das Gefäß gegeben. In das Gefäß wurde Diethylether mit einer Temperatur von - 70 °C gege-

ben. Es fiel ein farbloses Pulver aus, welches von der Lösung, in einer Zentrifuge mit ab-

schließendem dekantieren, getrennt wird. Das Pulver wurde zweimal mit DET bei - 70 °C

gewaschen und mit Zentrifugieren und Dekantieren von dem Lösungsmittel getrennt. Das

Pulver wurde in einer Mischung aus Wasser und ACN gelöst und in flüssigem Stickstoff ein-

gefroren. Die eingefrorene Lösung wurde lyophilisiert. Es wurde ein farbloses schaumartiges

Pulver erhalten.

Kopplung von AuPhPyCl2 mit Peptiden

Vor dem 300 Peptidprojekt

Äquimolare Mengen von AuPhPyCl2 (2) wurden in einem Kolben mit jeweils einer der fol-

genden Verbindungen: Ac-CFC-NH2 (27), Ac-CFCRRRRR-NH2 (29), Ac-CGC-NH2 (23),

Ac-CPC-NH2 (25), ΠCFC NH2 (33) und ΠCRC-NH2 (48) zusammen gegeben. In den Kolben

wurden zwischen 2 ml und 15 ml einer Lösungsmittelmischung aus 50 Vol.-% Wasser und

50 Vol.-% Acetonitril gegeben. Die entstehende Suspension wurde für mindestens eine Stun-

de gerührt. In den Kolben mit den Verbindungen 29 und 48 entstand nach kurzer Zeit eine

gelbfarbene Lösung, in allen andern Kolben war eine gelbfarbene Suspension zu beobachten.

Das Lösungsmittel wurde am Lyophilisator entfernt. Das erhalten gelbfarbene Pulver wurde

an der präperativen HPLC gereinigt. In der nachfolgenden Tabelle 5-14 werde die so erhalten

Verbindung mit allen Daten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

28 Ac-CFC-NH2AuPhPy 22.9 761 762 [M+H]+,

381 [M+H]2+

82

30 Ac-CFCRRRRR-NH2

AuPhPy

17.0 1542 772 [M+H]2+

69

26 Ac-CGC-NH2AuPhPy 18.7 671 672 [M+H]+,

629 [M-Ac]+

84

27 Ac-CPC-NH2AuPhPy 19.2 711 712 [M+H]+,

669 [M-Ac]+

80

34 ΠCFC-NH2AuPhPy 20.9 799 822 [M+Na]+, 86

Experimentalteil

Seite | 135

800 [M+H]+

49 ΠCRC-NH2AuPhPy 17.9 808 809 [M+H]+,

406 [M+H]2+

84

Tabelle 5-14

[3+2] Cycloaddition

In einen Schlenkkolben wurde ΠCFC-NH2 (34) zusammen mit entweder ORRRRR-NH2 (36),

OPLGLYAL-NH2 (38), OEEEEE-NH2 (40), ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2 (42),

ORRRRRPLGLL EEEEE-NH2 (44) oder ORRRRRLGLYLEEEEE-NH2 (45) gegeben. Zu

den beiden Substanzen wurden sechs Äquivalente Natriumascorbat und drei Äquivalente

Kupfersulfat gegeben. Alles wurde in einer Mischung aus einem Teil Wasser und einem Teil

DMSO gelöst. 15 Minuten wurde durch die Lösung Stickstoff geleitet. Der Kolben wurde

verschlossen und für 48 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde teilweise entfernt und das

Produkt an der präperativen HPLC gereinigt. Die Fraktionen wurden am Lyophilisator ge-

trocknet. In der nachfolgenden Tabelle 5-15 werde die so erhalten Verbindung mit allen Da-

ten aufgeführt.

Nr. Sequenz

HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

41 ΠCFC-NH2AuPhPy

triazoladukt

OEEEEE- NH2

18.4 1544 1545 [M+H]+,

774 [M+2H]2+

12

40 ΠCFC-NH2AuPhPy

triazoladukt

OPLGLYAL-NH2

21.8 1627 1628 [M+H]+,

815 [M+2H]2+

,

545 [M+3H]3+

13

39 ΠCFC-NH2AuPhPy

triazoladukt

ORRRRR-NH2

17.2 1679 1680 [M+H]+,

841 [M+2H]2+

16

45 ΠCFC-NH2AuPhPy

triazoladukt

ORRRRRPLGLYALEEEEE-NH2

16.6 3052 1527 [M+H]2+

,

1019 [M+2H]3+

,

765 [M+3H]4+

13

46 ΠCFC-NH2AuPhPy

triazoladukt

ORRRRRPLGLL EEEEE-NH2

20.3 2818 2819 [M+H]+,

1411[M+2H]2+

,

942 [M+3H]3+

,

709 [M+4H]4+

,

569 [M+5H]5+

8

47 ΠCFC-NH2AuPhPy

Tiazoladukt

ORRRRRLGLYLEEEEE-NH2

20.0 2884 2885 [M+H]+,

1444 [M+2H]2+

,

964 [M+3H]3+

,

725 [M+4H]4+

,

582 [M+5H]5+

9

Tabelle 5-15

Experimentalteil

Seite | 136

300 Peptidprojekt

Die Synthesen für die kombinatorischen Untersuchungen wurden an Tenta Gel Macrobeads

mit einer Beladung von 0.24 mmol/g durchgeführt. Die Synthese der Peptide erfolgte an ei-

nem Syro Multiple Peptide Synthesizer der Firma Syro 2000 in 2 ml Spritzen mit einem

Polypropylenfilter. Für die Synthese wurden die Aminosäuren in einer Lösung aus 1-

HydroΠybenzotriazole und 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-uronium hexa-

fluorophosphate in 70 Vol.-% N,N-Dimethylformamid und 30 Vol.-% N-Methyl-2-pyrrolidon

gelöst. Die Aminosäure, 1-HydroΠybenzotriazole und 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-

tetramethyl-uronium hexafluorophosphate waren in äquimolaren Konzentration in der Lösung

vorhanden. Die Lösungen mit den natürlichen Aminosäuren wurden an vorgesehen Postionen

gestellt. Die unnatürlichen Aminosäuren, zu den auch die 4-Pentinsäure gezählt wird, wurden

an Positionen gestellt die vorher im Programm des Synthesizer für sie eingestellt worden wa-

ren. N,N-Diisopropylethylamine wurde in N-Methyl-2-pyrrolidon gelöst und an seine Positi-

on gestellt. Piperidin wurde in 70 Vol.-% N,N-Dimethylformamid und 30 Vol.-% N-Methyl-

2-pyrrolidon gelöst und positioniert. Das Harz wurde in 2 ml Spritzen mit Filter eingewogene,

die Spritzen wurden ohne Stempel mit der Spitze nach unten in den Synthesizer gestellt. Die

Platte auf der bis zu 24 Spritzen gleichzeitig positioniert werden konnten, hatte ein Schlauch

System, über welchen der Inhalt aus den Spritzen abgesaugt und direkt verworfen werden

konnte. Diese Platte konnte auch vom Synthesizer geschüttelt werden für eine bessere

Durchmischung in den Spritzen. Alle vorher positionierten Lösungen wurden automatisch

vom Synthesizer in einem Saugrüssel aufgenommen und von oben, wo normalerweise der

Stempel sitzen würde, in die Spritze gegeben. Der Saugrüssel wurde vor der der Aufnahme

einer neuen Substanz mit N,N-Dimethylformamid gewaschen. Alle Waschschritte in den

Spritzen wurden ebenfalls in reinem N,N-Dimethylformamid durchgeführt. Die Kupplungen

jeder Aminosäuren wurden doppelt durchgeführt. Die Kopplungen wurden im fünffachen

Überschuss durchgeführt. Die Fmoc-Entschützung erfolgte mittels einer 40 Vol.-%

Piperidinlösung in der Peptidlösung. Die Waschschritte zwischen den einzelnen Synthese-

schritten wurden in reinem DMF durchgeführt. Nach dem letzten Kopplungsschritt mit der 4-

Pentinsäure wurden die Spritzen aus dem Synthesizer entnommen und das Harz wurde fünf-

mal mit Dichlormethan gewaschen. Alle Peptide, welche mindestens ein Methionin oder ein

Cystein enthalten, wurden für zehn Stunden in einer Mischung aus 94 Vol.-% TFA,

2.5 Vol.-% EDT, 2.5 Vol.-% Wasser und 1 Vol.-% TIS, alle anderen in einer Mischung aus

95 Vol.-% TFA, 2.5 Vol.-% Wasser und 2.5 Vol.-% TIS behandelt. Wenn die Lösung bei der

Experimentalteil

Seite | 137

Zugabe der Mischung gelbfarben wurden, dann wurde wenig TIS zugegeben. Die Peptide

wurden fünfmal mit Diethylether gewaschen und getrocknet. Die Spritzen wurden geöffnet,

die Hälfte des Harzes wurde entnommen und in eine zweite 2 ml Spritze mit

Polypropylenfilter gegeben. In diese zweite Spritze wurde eine Spatelspitze AuPhPyCl2 (2)

gegeben. Alle Spritzen wurden wieder verschlossen und der Inhalt der Spritzen in einer Mi-

schung aus 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril für 5 Stunden geschüttelt. Der In-

halt wurde dreimal mit 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril, dreimal mit

Dimethylsulfoxid, dreimal 50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril und dreimal mit

Diethylether gewaschen. Die Farben der einzelnen Harzkugeln wurden bestimmt. Aus allen

Spritzen wurden einige Harzkugeln unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Alle Se-

quenzen mit Glycin als Abstandsaminosäure und Behandlung mit AuPhPyCl2 (2) wurden un-

ter dem Ramanspektrometer untersucht.

Nach dem 300 Peptidprojekt

In einen Kolben wurde AuPhPyCl2 (2) äquimolare Mengen von der zu koppelenden

Peptidsequenz gegeben. Zu den Substanzen wurde eine Lösungsmittelmischung aus

50 Vol.-% Wasser und 50 Vol.-% Acetonitril gegeben. Die entstehende gelbfarbene Lösung

wurde für mindestens eine Stunde gerührt. Am Lyophilisator wurde das Lösungsmittel ent-

fernt und das Produkt an der präperativen HPLC gereinigt. In der nachfolgenden Tabelle 5-16

sind die Ergebnisse der Testsequenzen aus dem 300 Peptidprojekten aufgeführt.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

684 ΠCGC-NH2AuPhPy 18.2 709 710 [M+H]+ 92

685 ΠMGC-NH2AuPhPy 19.1 738 739 [M+H]+ 31

683 ΠEGC-NH2AuPhPy 17.5 735 735 [M]+ 6

686 ΠZGC-NH2AuPhPy 16.8 692 693 [M+H]+ 45

687 ΠBGC-NH2AuPhPy 18.6 755 756 [M+H]+ 16

688 ΠCGM-NH2AuPhPy 17.3 738 739 [M+H]+ 46

689 ΠZGM-NH2AuPhPy 16.8 721 722 [M+H]+ 12

690 ΠJGM-NH2AuPhPy 13.8 784 785 [M+H]+ 47

691 ΠKGM-NH2AuPhPy 18.1 763 664 [M+H]+ 23

692 ΠCGH-NH2AuPhPy LC 1.5 743 744 [M+H]+ 12

693 ΠMGH-NH2AuPhPy 16.3 772 773 [M+H]+ 4

694 ΠCGA-NH2AuPhPy 19.3 678 679 [M+H]+ 34

695 ΠMGA-NH2AuPhPy 20.8 707 708 [M+H]+ 2

696 ΠKGD-NH2AuPhPy 16.2 746 747 [M+H]+ 8

682 ΠCGZ-NH2AuPhPy 18.2 692 693 [M+H]+ 21

Experimentalteil

Seite | 138

697 ΠDGZ-NH2AuPhPy 18.2 704 705 [M+H]+ 83

698 ΠZGZ-NH2AuPhPy 14.8 675 676 [M+H]+ 6

699 ΠCGB-NH2AuPhPy 19.6 755 756 [M+H]+ 18

700 ΠJGB-NH2AuPhPy 16.2 801 802 [M+H]+ 2

701 ΠCGJ-NH2AuPhPy 16.8 755 756 [M+H]+ 65

702 ΠMGK-NH2AuPhPy 16.5 763 664 [M+H]+ 7

Tabelle 5-16

In der nachfolgenden Tabelle 5-17 sind die Daten der Verlängerung der Kette zwischen den

bindenden Aminosäuren aufgelistet.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

704 ΠCGGC-NH2AuPhPy 18.6 766 767 [M+H]+ 56

706 ΠCGGGC-NH2AuPhPy 17.8 823 824 [M+H]+ 82

708 ΠCGGGGC-NH2AuPhPy 17.0 880 881 [M+H]+ 45

712 ΠCGΔGC-NH2AuPhPy 18.2 851 852 [M+H]+ 74

714 ΠCRRRC-NH2 AuPhPy 16.8 1120 561 [M+2H]2+

89 Tabelle 5-17

In der nachfolgenden Tabelle 5-18 werden die Ergebnisse aus dem 16 Peptideprojekt aufgelis-

tet.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

732 ΠBRRRC-NH2 AuPhPy 15.2 1166 584 [M+2H]2+

,

390 [M+3H]3+

69

731 ΠCRRRB-NH2 AuPhPy 14.9 1166 584 [M+2H]2+

,

390 [M+3H]3+

42

733 ΠCRRRD-NH2 AuPhPy 16.0 1132 1133 [M+H]+,

567 [M+2H]2+

,

379 [M+3H]3+

75

735 ΠCRRRE-NH2 AuPhPy 14.4 1146 1147 [M+H]+,

578 [M+2H]2+

,

383 [M+3H]3+

39

737 ΠCRRRH-NH2 AuPhPy 15.5 1155 578 [M+2H]2+

69

739 ΠCRRRJ-NH2 AuPhPy 15.5 1166 584 [M+2H]2+

,

390 [M+3H]3+

59

741 ΠCRRRK-NH2 AuPhPy 15.7 1145 574 [M+2H]2+

,

383 [M+3H]3+

62

743 ΠCRRRM-NH2 AuPhPy 16,5 1149 575 [M+2H]2+

,

384 [M+3H]3+

51

745 ΠCRRRZ-NH2 AuPhPy 15.4 1103 553 [M+2H]2+

38

734 ΠDRRRC-NH2 AuPhPy 15.5 1132 1133 [M+H]+,

567 [M+2H]2+

,

379 [M+3H]3+

67

736 ΠERRRC-NH2 AuPhPy 15.6 1146 575 [M+2H]2+

,

383 [M+3H]3+

72

738 ΠHRRRC-NH2 AuPhPy 14.8 1155 578 [M+2H]2+

, 75

Experimentalteil

Seite | 139

386 [M+3H]3+

740 ΠJRRRC-NH2 AuPhPy 15.2 1166 584 [M+2H]2+

,

390 [M+3H]3+

72

742 ΠKRRRC-NH2 AuPhPy 15.0 1145 574 [M+2H]2+

,

383 [M+3H]3+

78

744 ΠMRRRC-NH2 AuPhPy 16.1 1149 575 [M+2H]2+

,

384 [M+3H]3+

70

746 ΠZRRRC-NH2 AuPhPy 15.1 1103 553 [M+2H]2+

72 Tabelle 5-18

In der nachfolgenden Tabelle 5-19 werden die Daten zur Alternativen bei der [3+2] Cyclo-

adition aufgelistet.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

Ausbeute

[%]

759 Fmoc-CGRGC-NH2AuPhPy 21.2 1064 1065 [M+H]+,

532 [M+2H]2+

78

748 ΠCFFFC-NH2AuPhPy 24.3 1093 1094 [M+H]+ 89

750 ΠCFRFC-NH2AuPhPy 19.6 1102 552[M+2H]2+

84

752 ΠCGRGC-NH2AuPhPy 17.3 922 923 [M+H]+,

462 [M+2H]2+

79

Tabelle 5-19

In der nachfolgenden Tabelle 5-20 sind die Finalen drei Verbindung wieder gegeben.

Nr. Sequenz HPLC

C18 [min]

Masse

[g/mol]

ESI+

[m/z]

MALDI

[m/z]

Ausbeute

[%]

766 Ac-CGRGC

RRRRR-

NH2AuPhPy

14.1 1662 1666

[M],

1513

[M-PhPy],

1315

[M-AuPhPy]

64

767 Ac-

CGRGCRRRR

RPLG

LYAL-

NH2AuPhPy

17.0 2390 2043

[M],

2241

[M-PhPy],

2394

[M-AuPhPy]

53

769 Ac-

CGRGCRRRR

RPLG

LYALEEEEE-

NH2AuPhPy

15.5 3035 761

[M+4H]4+

,

609

[M+5H]5+

3038

[M],

2885

[M-PhPy],

2668

[M-AuPhPy]

26

Tabelle 5-20

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Anhang

Anhang

Nomenklatur

Die Peptidsequenzen werden mit dem Einbuchstabencode benannt.

Name Einbuchstabencode

Alanin A

2-Aminoisobutansäure Δ

Arginin R

Asparaginsäure D

Azidoessigsäure O

Cystein C

2,3-Diaminopropionsäure Z

Glutaminsäure E

Glycin G

Histidin H

Leucin L

Lysin K

Methionin M

Methyladipoylchlorid Γ

4-Pentinsäure Π

Phenylalanin F

Prolin P

3-(3-Pyridin)-alanin B

3-(4-Pyridin)-alanin J

Thyrosin Y Tab.: Angabe der Namen und des Einbuchstabencodes der verwendeten natürlichen und unnatürlichen Amino-

säuren.

Die Peptide werden immer von der linken Seite beim N-Terminus nach rechts zum

C-Terminus aufgeschrieben. Bei einem acetylierten N-Terminus wird ein „Ac-“ an die linke

Seite zu Beginn geschrieben, bei einem Amid am C-Terminus werden der Endung „-NH2“

angehängt und ein „-MB“ wenn sich die Sequenz nach am Harz befindet. Wenn es sich um

eine Peptidsequenz handelt, die mit AuPhPyCl2 (2) zur Reaktion gebracht worden ist, dann

werden die Aminosäuren, deren Seitengruppen den Komplex gebunden haben sollte, unter-

strichen. Der Sequenz wird ein „AuPhPy“ angehängt. Pentinsäure wird in den Sequenzen mit

einem „Π“ abgekürzt. Azidessigsäure wird mit einem „O“ abgekürzt. Geladen Gold(III)-

Peptidbiokonjugate werden ohne Ladung wiedergegeben.

Anhang

300 Peptidprojekt

Nr. Sequenz Farbe

Farbe im

Fluoreszenz-

mikroskop

Nr. Sequenz Farbe

Farbe im

Fluoreszenz-

mikroskop

50 ΠCGC farblos blau 200 ΠCPE farblos blau

51 ΠMGC farblos blau 201 ΠMPE farblos blau

52 ΠHGC farblos blau 202 ΠHPE farblos blau

53 ΠAGC farblos blau 203 ΠAPE farblos blau

54 ΠDGC farblos blau 204 ΠDPE

leicht

gelb blau

55 ΠEGC farblos blau 205 ΠEPE farblos blau

56 ΠZGC farblos blau 206 ΠZPE farblos blau

57 ΠBGC farblos blau 207 ΠBPE

leicht

gelb blau

58 ΠJGC farblos blau 208 ΠJPE gelb blau

59 ΠKGC farblos blau 209 ΠKPE farblos blau

60 ΠCGM farblos blau 210 ΠCPZ farblos blau

61 ΠMGM farblos blau 211 ΠMPZ farblos blau

62 ΠHGM farblos blau 212 ΠHPZ farblos blau

63 ΠAGM farblos blau 213 ΠAPZ farblos blau

64 ΠDGM farblos blau 214 ΠDPZ farblos blau

65 ΠEGM farblos blau 215 ΠEPZ farblos blau

66 ΠZGM farblos blau 216 ΠZPZ farblos blau

67 ΠBGM farblos blau 217 ΠBPZ farblos blau

68 ΠJGM farblos blau 218 ΠJPZ

leicht

gelb blau

69 ΠKGM farblos blau 219 ΠKPZ farblos blau

70 ΠCGH farblos blau 220 ΠCPB farblos blau

71 ΠMGH farblos blau 221 ΠMPB farblos blau

72 ΠHGH farblos blau 222 ΠHPB

leicht

gelb blau

73 ΠAGH farblos blau 223 ΠAPB

leicht

gelb blau

74 ΠDGH farblos blau 224 ΠDPB gelb blau

75 ΠEGH farblos blau 225 ΠEPB farblos blau

76 ΠZGH farblos blau 226 ΠZPB farblos blau

77 ΠBGH farblos blau 227 ΠBPB farblos blau

78 ΠJGH farblos blau 228 ΠJPB gelb blau

79 ΠKGH farblos blau 229 ΠKPB farblos blau

80 ΠCGA farblos blau 230 ΠCPJ farblos blau

81 ΠMGA farblos blau 231 ΠMPJ farblos blau

Anhang

82 ΠHGA farblos blau 232 ΠHPJ farblos blau

83 ΠAGA farblos blau 233 ΠAPJ farblos blau

84 ΠDGA farblos blau 234 ΠDPJ

leicht

gelb blau

85 ΠEGA farblos blau 235 ΠEPJ farblos blau

86 ΠZGA farblos blau 236 ΠZPJ farblos blau

87 ΠBGA farblos blau 237 ΠBPJ

leicht

gelb blau

88 ΠJGA farblos blau 238 ΠJPJ

leicht

gelb blau

89 ΠKGA farblos blau 239 ΠKPJ

leicht

gelb blau

90 ΠCGD farblos blau 240 ΠCPK farblos blau

91 ΠMGD farblos blau 241 ΠMPK farblos blau

92 ΠHGD farblos blau 242 ΠHPK farblos blau

93 ΠAGD farblos blau 243 ΠAPK farblos blau

94 ΠDGD farblos blau 244 ΠDPK farblos blau

95 ΠEGD farblos blau 245 ΠEPK farblos blau

96 ΠZGD farblos blau 246 ΠZPK farblos blau

97 ΠBGD farblos blau 247 ΠBPK farblos blau

98 ΠJGD farblos blau 248 ΠJPK farblos blau

99 ΠKGD farblos blau 249 ΠKPK farblos blau

100 ΠCGE farblos blau 250 ΠCLC farblos blau

101 ΠMGE farblos blau 251 ΠMLC farblos blau

102 ΠHGE farblos blau 252 ΠHLC farblos blau

103 ΠAGE farblos blau 253 ΠALC farblos blau

104 ΠDGE farblos blau 254 ΠDLC farblos blau

105 ΠEGE farblos blau 255 ΠELC farblos blau

106 ΠZGE farblos blau 256 ΠZLC farblos blau

107 ΠBGE farblos blau 257 ΠBLC farblos blau

108 ΠJGE farblos blau 258 ΠJLC farblos blau

109 ΠKGE farblos blau 259 ΠKLC farblos blau

110 ΠCGZ farblos blau 260 ΠCLM farblos blau

111 ΠMGZ farblos blau 261 ΠMLM farblos blau

112 ΠHGZ farblos blau 262 ΠHLM farblos blau

113 ΠAGZ farblos blau 263 ΠALM farblos blau

114 ΠDGZ farblos blau 264 ΠDLM farblos blau

115 ΠEGZ farblos blau 265 ΠELM farblos blau

116 ΠZGZ farblos blau 266 ΠZLM farblos blau

117 ΠBGZ farblos blau 267 ΠBLM farblos blau

118 ΠJGZ farblos blau 268 ΠJLM farblos blau

Anhang

119 ΠKGZ farblos blau 269 ΠKLM farblos blau

120 ΠCGB farblos blau 270 ΠCLH farblos blau

121 ΠMGB farblos blau 271 ΠMLH farblos blau

122 ΠHGB farblos blau 272 ΠHLH farblos blau

123 ΠAGB farblos blau 273 ΠALH farblos blau

124 ΠDGB farblos blau 274 ΠDLH farblos blau

125 ΠEGB farblos blau 275 ΠELH farblos blau

126 ΠZGB farblos blau 276 ΠZLH farblos blau

127 ΠBGB farblos blau 277 ΠBLH farblos blau

128 ΠJGB farblos blau 278 ΠJLH farblos blau

129 ΠKGB farblos blau 279 ΠKLH farblos blau

130 ΠCGJ

leicht

gelb blau 280 ΠCLA farblos blau

131 ΠMGJ

leicht

gelb blau 281 ΠMLA farblos blau

132 ΠHGJ

leicht

gelb blau 282 ΠHLA farblos blau

133 ΠAGJ

leicht

gelb blau 283 ΠALA farblos blau

134 ΠDGJ

leicht

gelb blau 284 ΠDLA farblos blau

135 ΠEGJ

leicht

gelb blau 285 ΠELA farblos blau

136 ΠZGJ gelb blau 286 ΠZLA farblos blau

137 ΠBGJ gelb blau 287 ΠBLA farblos blau

138 ΠJGJ

leicht

gelb blau 288 ΠJLA farblos blau

139 ΠKGJ

leicht

gelb blau 289 ΠKLA farblos blau

140 ΠCGK farblos blau 290 ΠCLD farblos blau

141 ΠMGK farblos blau 291 ΠMLD farblos blau

142 ΠHGK farblos blau 292 ΠHLD farblos blau

143 ΠAGK farblos blau 293 ΠALD farblos blau

144 ΠDGK farblos blau 294 ΠDLD farblos blau

145 ΠEGK farblos blau 295 ΠELD farblos blau

146 ΠZGK farblos blau 296 ΠZLD farblos blau

147 ΠBGK farblos blau 297 ΠBLD farblos blau

148 ΠJGK farblos blau 298 ΠJLD farblos blau

149 ΠKGK farblos blau 299 ΠKLD farblos blau

150 ΠCPC farblos blau 300 ΠCLE farblos blau

151 ΠMPC farblos blau 301 ΠMLE farblos blau

152 ΠHPC farblos blau 302 ΠHLE farblos blau

153 ΠAPC farblos blau 303 ΠALE farblos blau

Anhang

154 ΠDPC farblos blau 304 ΠDLE farblos blau

155 ΠEPC farblos blau 305 ΠELE farblos blau

156 ΠZPC farblos blau 306 ΠZLE farblos blau

157 ΠBPC farblos blau 307 ΠBLE farblos blau

158 ΠJPC farblos blau 308 ΠJLE farblos blau

159 ΠKPC farblos blau 309 ΠKLE farblos blau

160 ΠCPM farblos blau 310 ΠCLZ farblos blau

161 ΠMPM farblos blau 311 ΠMLZ farblos blau

162 ΠHPM farblos blau 312 ΠHLZ farblos blau

163 ΠAPM farblos blau 313 ΠALZ farblos blau

164 ΠDPM farblos blau 314 ΠDLZ farblos blau

165 ΠEPM farblos blau 315 ΠELZ farblos blau

166 ΠZPM farblos blau 316 ΠZLZ farblos blau

167 ΠBPM farblos blau 317 ΠBLZ farblos blau

168 ΠJPM farblos blau 318 ΠJLZ farblos blau

169 ΠKPM farblos blau 319 ΠKLZ farblos blau

170 ΠCPH farblos blau 320 ΠCLB farblos blau

171 ΠMPH farblos blau 321 ΠMLB farblos blau

172 ΠHPH farblos blau 322 ΠHLB farblos blau

173 ΠAPH farblos blau 323 ΠALB farblos blau

174 ΠDPH farblos blau 324 ΠDLB farblos blau

175 ΠEPH farblos blau 325 ΠELB farblos blau

176 ΠZPH farblos blau 326 ΠZLB farblos blau

177 ΠBPH farblos blau 327 ΠBLB farblos blau

178 ΠJPH farblos blau 328 ΠJLB farblos blau

179 ΠKPH farblos blau 329 ΠKLB farblos blau

180 ΠCPA farblos blau 330 ΠCLJ farblos blau

181 ΠMPA farblos blau 331 ΠMLJ farblos blau

182 ΠHPA farblos blau 332 ΠHLJ farblos blau

183 ΠAPA farblos blau 333 ΠALJ farblos blau

184 ΠDPA farblos blau 334 ΠDLJ farblos blau

185 ΠEPA farblos blau 335 ΠELJ farblos blau

186 ΠZPA

leicht

gelb blau 336 ΠZLJ

leicht

gelb blau

187 ΠBPA

leicht

gelb blau 337 ΠBLJ

leicht

gelb blau

188 ΠJPA

leicht

gelb blau 338 ΠJLJ

leicht

gelb blau

189 ΠKPA farblos blau 339 ΠKLJ farblos blau

190 ΠCPD gelb blau 340 ΠCLK farblos blau

191 ΠMPD farblos blau 341 ΠMLK farblos blau

Anhang

192 ΠHPD

leicht

gelb blau 342 ΠHLK farblos blau

193 ΠAPD gelb blau 343 ΠALK farblos blau

194 ΠDPD

leicht

gelb blau 344 ΠDLK farblos blau

195 ΠEPD

leicht

gelb blau 345 ΠELK farblos blau

196 ΠZPD

leicht

gelb blau 346 ΠZLK farblos blau

197 ΠBPD

leicht

gelb blau 347 ΠBLK farblos blau

198 ΠJPD

leicht

rot blau 348 ΠJLK

leicht

gelb blau

199 ΠKPD

leicht

gelb blau 349 ΠKLK farblos blau Tab.: Die linke und die rechte Tabelle geben alle am Harz synthetisierten Sequenzen an.

Nummer

Sequenz

mit

AuPhPy

Farbe

Farbe im Fluoreszenz-

mikroskop

Ramanspektrometer

276 c

m-1

374 c

m-1

666 c

m-1

350 ΠCGC gelb gelber Rand s s s

351 ΠMGC gelb gelber Rand s m m

352 ΠHGC gelb gelber Rand w w w

353 ΠAGC gelb gelber Rand w w w

354 ΠDGC gelb gelber Rand m m m

355 ΠEGC gelb gelber Rand m m m

356 ΠZGC gelb gelber Rand s s s

357 ΠBGC gelb gelber Rand s s s

358 ΠJGC gelb schwach gelber Rand m m m

359 ΠKGC gelb schwach gelber Rand w w w

360 ΠCGM gelb gelber Rand m m m

361 ΠMGM gelb gelber Rand m m m

362 ΠHGM gelb gelber Rand m m m

363 ΠAGM gelb gelber Rand w m w

364 ΠDGM gelb gelber Rand m m w

365 ΠEGM gelb gelber Rand m m m

366 ΠZGM gelb gelber Rand m m m

367 ΠBGM gelb gelber Rand m m m

368 ΠJGM gelb gelber Rand w w w

369 ΠKGM gelb gelber Rand m m m

370 ΠCGH gelb gelber Rand s m m

371 ΠMGH gelb gelber Rand m s s

372 ΠHGH gelb blau m w w

Anhang

373 ΠAGH farblos blau w w w

374 ΠDGH rötlich/violett blau w w w

375 ΠEGH farblos schwach gelber Rand m w w

376 ΠZGH violett blau w w w

377 ΠBGH farblos blau w w w

378 ΠJGH farblos blau w w w

379 ΠKGH farblos blau w w w

380 ΠCGA gelb gelber Rand m m m

381 ΠMGA gelb gelber Rand m m m

382 ΠHGA farblos blau w w w

383 ΠAGA violett blau w w w

384 ΠDGA farblos blau w w w

385 ΠEGA farblos blau w w w

386 ΠZGA violett farblos w w w

387 ΠBGA farblos blau w w w

388 ΠJGA farblos blau w w w

389 ΠKGA violett blau w w w

390 ΠCGD gelb gelber Rand w w w

391 ΠMGD gelb gelber Rand m m m

392 ΠHGD farblos blau w w w

393 ΠAGD farblos blau w w w

394 ΠDGD farblos blau w w w

395 ΠEGD farblos gelb w w w

396 ΠZGD violett farblos w w w

397 ΠBGD farblos blau w w w

398 ΠJGD farblos blau w w w

399 ΠKGD farblos blau w w w

400 ΠCGE gelb schwach gelber Rand m m m

401 ΠMGE gelb gelber Rand m m m

402 ΠHGE farblos schwach gelber Rand w w w

403 ΠAGE farblos blau w w w

404 ΠDGE farblos gelb w w w

405 ΠEGE farblos gelb w w w

406 ΠZGE farblos gelb w w w

407 ΠBGE farblos blau w w w

408 ΠJGE farblos blau w w m

409 ΠKGE farblos blau w w w

410 ΠCGZ gelb gelber Rand m m m

411 ΠMGZ gelb gelber Rand m m m

412 ΠHGZ farblos blau w w w

413 ΠAGZ violett blau w m w

414 ΠDGZ farblos blau w w w

415 ΠEGZ farblos blau w w w

416 ΠZGZ violett blau w w w

417 ΠBGZ farblos blau w w w

418 ΠJGZ farblos blau w w w

419 ΠKGZ leicht violett blau w w w

Anhang

420 ΠCGB gelb gelber Rand m m w

421 ΠMGB gelb gelber Rand m m w

422 ΠHGB farblos blau w w w

423 ΠAGB farblos blau w w w

424 ΠDGB farblos blau w w w

425 ΠEGB farblos blau w w w

426 ΠZGB farblos blau w w w

427 ΠBGB farblos blau w w w

428 ΠJGB farblos blau w w w

429 ΠKGB farblos blau w w w

430 ΠCGJ gelb gelber Rand w w w

431 ΠMGJ gelb gelber Rand m m m

432 ΠHGJ gelb blau w w w

433 ΠAGJ farblos blau w w w

434 ΠDGJ violett schwach gelber Rand w w m

435 ΠEGJ gelb schwach gelber Rand w w m

436 ΠZGJ farblos blau w w w

437 ΠBGJ gelb blau w w m

438 ΠJGJ gelb blau w w m

439 ΠKGJ farblos blau w w w

440 ΠCGK gelb schwach gelber Rand w w w

441 ΠMGK gelb gelber Rand m m m

442 ΠHGK farblos schwach gelber Rand w w w

443 ΠAGK violett blau w w w

444 ΠDGK leicht gelb gelb w w w

445 ΠEGK farblos blau w w w

446 ΠZGK violett blau w w w

447 ΠBGK farblos blau w w w

448 ΠJGK farblos blau w w w

449 ΠKGK violett blau w w w Tab.: Angabe aller am Harz synthetisierten Sequenzen mit Glycin als Abstandsaminosäure nach der Behandlung

mit AuPhPyCl2 (2).

Nr. Sequenz

mit

AuPhPy

Farbe Farbe im

Fluoreszenz-

mikroskop

Nr. Sequenz

mit

AuPhPy

Farbe Farbe im

Fluoreszenz-

mikroskop

450 ΠCPC farblos

schwach

gelber Rand 550 ΠCLC

leicht

gelb gelber Rand

451 ΠMPC

leicht

gelb

schwach

gelber Rand 551 ΠMLC

leicht

gelb gelber Rand

452 ΠHPC

leicht

gelb gelber Rand 552 ΠHLC

leicht

gelb gelber Rand

453 ΠAPC farblos

schwach

gelber Rand 553 ΠALC farblos gelber Rand

454 ΠDPC farblos

schwach

gelber Rand 554 ΠDLC farblos gelber Rand

455 ΠEPC farblos gelber Rand 555 ΠELC farblos schwach

Anhang

gelber Rand

456 ΠZPC farblos

schwach

gelber Rand 556 ΠZLC farblos gelber Rand

457 ΠBPC farblos

schwach

gelber Rand 557 ΠBLC farblos gelber Rand

458 ΠJPC farblos

schwach

gelber Rand 558 ΠJLC farblos

schwach

gelber Rand

459 ΠKPC gelb gelber Rand 559 ΠKLC farblos gelber Rand

460 ΠCPM gelb gelber Rand 560 ΠCLM

leicht

gelb gelber Rand

461 ΠMPM gelb gelber Rand 561 ΠMLM

leicht

gelb gelber Rand

462 ΠHPM farblos gelber Rand 562 ΠHLM gelb gelber Rand

463 ΠAPM farblos gelber Rand 563 ΠALM farblos blau

464 ΠDPM gelb gelber Rand 564 ΠDLM gelb gelber Rand

465 ΠEPM farblos blau 565 ΠELM gelb gelber Rand

466 ΠZPM farblos

schwach

gelber Rand 566 ΠZLM gelb

schwach

gelber Rand

467 ΠBPM farblos blau 567 ΠBLM farblos gelber Rand

468 ΠJPM farblos

schwach

gelber Rand 568 ΠJLM gelb blau

469 ΠKPM gelb gelber Rand 569 ΠKLM gelb gelber Rand

470 ΠCPH gelb gelber Rand 570 ΠCLH

leicht

gelb

schwach

gelber Rand

471 ΠMPH farblos gelber Rand 571 ΠMLH farblos

schwach

gelber Rand

472 ΠHPH farblos blau 572 ΠHLH

leicht

gelb

schwach

gelber Rand

473 ΠAPH farblos

schwach

gelber Rand 573 ΠALH farblos

schwach

gelber Rand

474 ΠDPH farblos

schwach

gelber Rand 574 ΠDLH

leicht

gelb blau

475 ΠEPH gelb

schwach

gelber Rand 575 ΠELH farblos gelber Rand

476 ΠZPH gelb

schwach

gelber Rand 576 ΠZLH gelb gelber Rand

477 ΠBPH farblos

schwach

gelber Rand 577 ΠBLH

leicht

gelb blau

478 ΠJPH farblos blau 578 ΠJLH farblos blau

479 ΠKPH farblos blau 579 ΠKLH farblos blau

480 ΠCPA farblos blau 580 ΠCLA gelb gelber Rand

481 ΠMPA

leicht

gelb gelber Rand 581 ΠMLA

leicht

gelb gelber Rand

482 ΠHPA farblos gelber Rand 582 ΠHLA farblos gelber Rand

483 ΠAPA

dunkel

violett blau 583 ΠALA farblos blau

484 ΠDPA violett farblos 584 ΠDLA farblos blau

485 ΠEPA violett blau 585 ΠELA farblos blau

Anhang

486 ΠZPA gelb gelber Rand 586 ΠZLA violett farblos

487 ΠBPA farblos

schwach

gelber Rand 587 ΠBLA violett blau

488 ΠJPA farblos blau 588 ΠJLA farblos blau

489 ΠKPA

leicht

violett blau 589 ΠKLA violett blau

490 ΠCPD gelb blau 590 ΠCLD gelb gelber Rand

491 ΠMPD farblos blau 591 ΠMLD gelb gelber Rand

492 ΠHPD farblos gelber Rand 592 ΠHLD farblos gelber Rand

493 ΠAPD

leicht

violett blau 593 ΠALD violett blau

494 ΠDPD farblos farblos 594 ΠDLD violett hellblau

495 ΠEPD farblos gelb 595 ΠELD farblos blau

496 ΠZPD farblos blau 596 ΠZLD violett gelb

497 ΠBPD farblos blau 597 ΠBLD farblos blau

498 ΠJPD violett blau 598 ΠJLD farblos blau

499 ΠKPD violett blau 599 ΠKLD farblos blau

500 ΠCPE farblos blau 600 ΠCLE gelb gelber Rand

501 ΠMPE farblos blau 601 ΠMLE gelb gelber Rand

502 ΠHPE farblos blau 602 ΠHLE farblos blau

503 ΠAPE violett blau 603 ΠALE farblos blau

504 ΠDPE farblos gelb 604 ΠDLE

leicht

violett blau

505 ΠEPE farblos blau 605 ΠELE farblos blau

506 ΠZPE farblos blau 606 ΠZLE violett gelb

507 ΠBPE farblos blau 607 ΠBLE farblos blau

508 ΠJPE gelb

schwach

gelber Rand 608 ΠJLE farblos blau

509 ΠKPE farblos gelb 609 ΠKLE farblos blau

510 ΠCPZ farblos blau 610 ΠCLZ gelb gelber Rand

511 ΠMPZ farblos blau 611 ΠMLZ gelb gelber Rand

512 ΠHPZ farblos blau 612 ΠHLZ gelb blau

513 ΠAPZ violett blau 613 ΠALZ farblos blau

514 ΠDPZ farblos blau 614 ΠDLZ farblos blau

515 ΠEPZ farblos gelb 615 ΠELZ

leicht

violett blau

516 ΠZPZ farblos blau 616 ΠZLZ violett blau

517 ΠBPZ farblos blau 617 ΠBLZ farblos blau

518 ΠJPZ farblos blau 618 ΠJLZ violett blau

519 ΠKPZ violett blau 619 ΠKLZ violett blau

520 ΠCPB farblos blau 620 ΠCLB gelb gelber Rand

521 ΠMPB

leicht

gelb blau 621 ΠMLB gelb gelber Rand

522 ΠHPB gelb blau 622 ΠHLB farblos blau

523 ΠAPB gelb

schwach

gelber Rand 623 ΠALB farblos blau

524 ΠDPB leicht blau 624 ΠDLB farblos blau

Anhang

gelb

525 ΠEPB violett blau 625 ΠELB farblos blau

526 ΠZPB

leicht

violett blau 626 ΠZLB

leicht

gelb gelb

527 ΠBPB farblos blau 627 ΠBLB farblos blau

528 ΠJPB farblos blau 628 ΠJLB farblos blau

529 ΠKPB gelb gelber Rand 629 ΠKLB farblos blau

530 ΠCPJ

leicht

gelb blau 630 ΠCLJ gelb gelber Rand

531 ΠMPJ gelb blau 631 ΠMLJ gelb gelber Rand

532 ΠHPJ

leicht

gelb blau 632 ΠHLJ farblos gelber Rand

533 ΠAPJ farblos farblos 633 ΠALJ farblos blau

534 ΠDPJ violett farblos 634 ΠDLJ farblos blau

535 ΠEPJ gelb blau 635 ΠELJ farblos blau

536 ΠZPJ farblos blau 636 ΠZLJ farblos gelb

537 ΠBPJ farblos blau 637 ΠBLJ farblos blau

538 ΠJPJ farblos blau 638 ΠJLJ farblos blau

539 ΠKPJ violett blau 639 ΠKLJ farblos blau

540 ΠCPK farblos blau 640 ΠCLK gelb gelber Rand

541 ΠMPK farblos blau 641 ΠMLK gelb gelber Rand

542 ΠHPK farblos blau 642 ΠHLK farblos blau

543 ΠAPK farblos blau 643 ΠALK farblos blau

544 ΠDPK

leicht

gelb blau 644 ΠDLK farblos blau

545 ΠEPK farblos blau 645 ΠELK farblos blau

546 ΠZPK farblos blau 646 ΠZLK violett blau

547 ΠBPK farblos hellblau 647 ΠBLK farblos blau

548 ΠJPK farblos blau 648 ΠJLK

leicht

violett blau

549 ΠKPK farblos blau 649 ΠKLK violett blau Tab.: Der linke Block beinhaltet alle am Harz synthetisierten Sequenzen mit Prolin als Abstandsaminosäure nach

der Behandlung mit AuPhPyCl2 (2), der rechte Block alle mit Leucin als Abstandsaminosäure.

Kristalldaten von Verbindung 19

Identification code shelxl

Empirical formula C7 H7 Au0.50 Cl1.50 N O

Formula weight 272.79

Temperature 293(2) K

Wavelength 0.71075 A

Crystal system, space group Orthorhombic, Pbca

Anhang

Unit cell dimensions a = 7.436(6) A alpha = 90 deg.

b = 19.681(15) A beta = 90 deg.

c = 23.366(17) A gamma = 90 deg.

Volume 3420(5) A^3

Z, Calculated density 16, 2.120 Mg/m^3

Absorption coefficient 9.079 mm^-1

F(000) 2064

Crystal size 0.15 x 0.12 x 0.05 mm

Theta range for data collection 2.71 to 25.00 deg.

Limiting indices -8<=h<=8, -23<=k<=23, -27<=l<=27

Reflections collected / unique 27239 / 3002 [R(int) = 0.0910]

Completeness to theta = 25.00 99.8 %

Absorption correction Empirical

Max. and min. transmission 0.6596 and 0.3429

Refinement method Full-matrix least-squares on F^2

Data / restraints / parameters 3002 / 0 / 200

Goodness-of-fit on F^2 1.129

Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0418, wR2 = 0.0863

R indices (all data) R1 = 0.0722, wR2 = 0.1010

Extinction coefficient 0.00007(4)

Largest diff. peak and hole 0.965 and -1.135 e.A^-3

Table 2. Atomic coordinates ( x 10^4) and equivalent isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3) for shelxl.

U(eq) is defined as one third of the trace of the orthogonalized

Uij tensor.

________________________________________________________________

x y z U(eq)

________________________________________________________________

Anhang

Au(1) 7502(1) 3295(1) 773(1) 39(1)

Cl(1) 7540(4) 2259(1) 1205(1) 65(1)

Cl(2) 10117(3) 3588(2) 1227(1) 58(1)

Cl(3) 4985(4) 3004(1) 270(1) 73(1)

O(1) 6460(12) 5601(4) 3195(3) 73(2)

O(2) 7627(11) 6232(3) 2499(3) 61(2)

N(1) 7491(10) 4245(3) 376(3) 34(2)

N(23) 5647(9) 4176(3) 1438(3) 39(2)

C(14) 8024(17) 6756(5) 2897(5) 75(4)

C(2) 7942(11) 4900(5) -462(4) 41(2)

C(4) 6944(12) 5425(5) 396(4) 41(2)

C(11) 6484(11) 4751(4) 1285(3) 34(2)

C(1) 7988(12) 4283(5) -172(4) 42(2)

C(6) 8642(16) 3652(5) -474(4) 60(3)

C(9) 6375(11) 5171(5) 2239(3) 36(2)

C(8) 5523(11) 4578(5) 2398(4) 41(2)

C(13) 6805(13) 5679(5) 2708(4) 45(2)

C(3) 7426(12) 5478(4) -165(3) 43(2)

C(5) 6986(11) 4821(5) 680(3) 40(2)

C(10) 6874(12) 5259(5) 1679(4) 40(2)

C(12) 4272(13) 3420(5) 2130(4) 51(3)

C(7) 5173(12) 4087(4) 1991(3) 37(2)

________________________________________________________________

Table 3. Bond lengths [A] and angles [deg] for shelxl.

_____________________________________________________________

Au(1)-N(1) 2.088(6)

Au(1)-Cl(1) 2.275(3)

Au(1)-Cl(3) 2.283(3)

Au(1)-Cl(2) 2.289(3)

O(1)-C(13) 1.178(10)

O(2)-C(13) 1.339(11)

O(2)-C(14) 1.419(12)

N(1)-C(1) 1.335(11)

N(1)-C(5) 1.388(11)

N(23)-C(11) 1.340(10)

N(23)-C(7) 1.352(10)

C(14)-H(14A) 0.9600

C(14)-H(14B) 0.9600

C(14)-H(14C) 0.9600

C(2)-C(3) 1.388(12)

C(2)-C(1) 1.391(12)

C(2)-H(2A) 0.9300

C(4)-C(5) 1.363(12)

C(4)-C(3) 1.364(11)

C(4)-H(4A) 0.9300

C(11)-C(10) 1.388(11)

C(11)-C(5) 1.468(10)

C(1)-C(6) 1.510(12)

C(6)-H(6A) 0.9600

Anhang

C(6)-H(6B) 0.9600

C(6)-H(6C) 0.9600

C(9)-C(10) 1.371(11)

C(9)-C(8) 1.379(12)

C(9)-C(13) 1.517(12)

C(8)-C(7) 1.379(12)

C(8)-H(8A) 0.9300

C(3)-H(3A) 0.9300

C(10)-H(10A) 0.9300

C(12)-C(7) 1.510(12)

C(12)-H(12A) 0.9600

C(12)-H(12B) 0.9600

C(12)-H(12C) 0.9600

N(1)-Au(1)-Cl(1) 179.5(2)

N(1)-Au(1)-Cl(3) 89.6(2)

Cl(1)-Au(1)-Cl(3) 90.78(11)

N(1)-Au(1)-Cl(2) 89.1(2)

Cl(1)-Au(1)-Cl(2) 90.55(11)

Cl(3)-Au(1)-Cl(2) 176.58(10)

C(13)-O(2)-C(14) 116.5(8)

C(1)-N(1)-C(5) 121.3(7)

C(1)-N(1)-Au(1) 118.4(5)

C(5)-N(1)-Au(1) 120.3(5)

C(11)-N(23)-C(7) 119.0(7)

O(2)-C(14)-H(14A) 109.5

O(2)-C(14)-H(14B) 109.5

H(14A)-C(14)-H(14B) 109.5

O(2)-C(14)-H(14C) 109.5

H(14A)-C(14)-H(14C) 109.5

H(14B)-C(14)-H(14C) 109.5

C(3)-C(2)-C(1) 118.6(8)

C(3)-C(2)-H(2A) 120.7

C(1)-C(2)-H(2A) 120.7

C(5)-C(4)-C(3) 122.0(9)

C(5)-C(4)-H(4A) 119.0

C(3)-C(4)-H(4A) 119.0

N(23)-C(11)-C(10) 121.9(8)

N(23)-C(11)-C(5) 116.9(8)

C(10)-C(11)-C(5) 121.2(8)

N(1)-C(1)-C(2) 120.7(8)

N(1)-C(1)-C(6) 119.5(8)

C(2)-C(1)-C(6) 119.8(8)

C(1)-C(6)-H(6A) 109.5

C(1)-C(6)-H(6B) 109.5

H(6A)-C(6)-H(6B) 109.5

C(1)-C(6)-H(6C) 109.5

H(6A)-C(6)-H(6C) 109.5

H(6B)-C(6)-H(6C) 109.5

C(10)-C(9)-C(8) 119.2(8)

C(10)-C(9)-C(13) 123.3(9)

Anhang

C(8)-C(9)-C(13) 117.4(8)

C(9)-C(8)-C(7) 119.6(8)

C(9)-C(8)-H(8A) 120.2

C(7)-C(8)-H(8A) 120.2

O(1)-C(13)-O(2) 123.9(9)

O(1)-C(13)-C(9) 124.5(10)

O(2)-C(13)-C(9) 111.7(8)

C(4)-C(3)-C(2) 119.4(8)

C(4)-C(3)-H(3A) 120.3

C(2)-C(3)-H(3A) 120.3

C(4)-C(5)-N(1) 118.0(7)

C(4)-C(5)-C(11) 122.9(9)

N(1)-C(5)-C(11) 119.1(8)

C(9)-C(10)-C(11) 119.0(8)

C(9)-C(10)-H(10A) 120.5

C(11)-C(10)-H(10A) 120.5

C(7)-C(12)-H(12A) 109.5

C(7)-C(12)-H(12B) 109.5

H(12A)-C(12)-H(12B) 109.5

C(7)-C(12)-H(12C) 109.5

H(12A)-C(12)-H(12C) 109.5

H(12B)-C(12)-H(12C) 109.5

N(23)-C(7)-C(8) 121.3(8)

N(23)-C(7)-C(12) 115.7(7)

C(8)-C(7)-C(12) 123.0(8)

_____________________________________________________________

Symmetry transformations used to generate equivalent atoms:

Table 4. Anisotropic displacement parameters (A^2 x 10^3) for shelxl.

The anisotropic displacement factor exponent takes the form:

-2 pi^2 [ h^2 a*^2 U11 + ... + 2 h k a* b* U12 ]

_______________________________________________________________________

U11 U22 U33 U23 U13 U12

_______________________________________________________________________

Au(1) 53(1) 26(1) 38(1) 2(1) -5(1) 3(1)

Cl(1) 93(2) 31(1) 71(2) 15(1) -5(2) 10(2)

Cl(2) 57(2) 72(2) 46(1) 8(1) -14(1) -5(1)

Cl(3) 80(2) 36(1) 103(2) -2(2) -42(2) -7(2)

O(1) 124(7) 64(5) 30(4) -3(3) 5(4) -14(5)

O(2) 93(5) 35(4) 54(4) -12(3) 9(4) -5(5)

N(1) 50(4) 19(3) 34(4) -5(3) -11(4) 9(4)

N(23) 45(4) 26(4) 45(4) -2(3) 2(4) -7(3)

C(14) 110(10) 36(6) 78(8) -8(5) 29(7) -11(6)

C(2) 50(6) 35(5) 37(5) 7(4) 0(4) -3(4)

C(4) 56(6) 24(5) 42(5) 5(4) 6(4) 10(4)

C(11) 36(5) 30(5) 35(5) -4(4) -4(4) 7(4)

C(1) 60(6) 36(5) 29(5) -2(4) -5(4) 6(4)

Anhang

C(6) 92(8) 46(7) 42(6) -7(5) 10(6) 13(6)

C(9) 42(5) 38(5) 30(4) -5(4) 6(4) 7(4)

C(8) 42(5) 40(6) 41(5) 3(4) 3(4) 2(4)

C(13) 52(5) 47(6) 36(5) 1(4) -5(4) 8(5)

C(3) 58(6) 30(5) 40(5) 5(4) -4(5) 3(5)

C(5) 36(5) 55(7) 29(4) 14(4) 0(3) 15(4)

C(10) 43(5) 35(6) 41(5) 4(4) 8(4) -2(4)

C(12) 60(6) 51(6) 42(5) 4(4) 3(5) -13(5)

C(7) 42(5) 30(5) 37(5) 8(4) -1(4) 4(4)

_______________________________________________________________________

Anhang

Table 5. Hydrogen coordinates ( x 10^4) and isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3) for shelxl.

________________________________________________________________

x y z U(eq)

________________________________________________________________

H(14A) 8608 7124 2703 112

H(14B) 8804 6582 3190 112

H(14C) 6928 6915 3068 112

H(2A) 8250 4923 -847 49

H(4A) 6575 5813 591 49

H(6A) 8591 3273 -216 90

H(6B) 9860 3718 -598 90

H(6C) 7891 3563 -800 90

H(8A) 5187 4509 2777 49

H(3A) 7409 5899 -348 51

H(10A) 7466 5652 1564 47

H(12A) 4158 3155 1788 76

H(12B) 3100 3505 2287 76

H(12C) 4985 3177 2405 76

________________________________________________________________