Pharmakokinetische und pharmakodynamische Untersuchungen ... · Pharmakodynamik von Naproxen...

Pharmakokinetische und pharmakodynamische

Untersuchungen zu selektiven und nicht selektiven

Cyclooxygenasehemmern

Den naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Olga Cheremina

aus Kysyl / Russland

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität

Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 19.06.09

Vorsitzender

der Promotionskommission: Professor Dr. E. Bänsch

Erstberichterstatter: Professor Dr. R. Troschütz

Zweitberichterstatter: Professor Dr. Dr. K. Brune

Für meinen Sohn

Inhaltverzeichnis 1

Inhaltverzeichnis

Inhaltverzeichnis.......................................................................................................................1

Abkürzungsverzeichnis............................................................................................................6

1 Zusammenfassung ...........................................................................................................7

2 Summary .........................................................................................................................10

3 Einleitung.........................................................................................................................13

3.1 Cyclooxygenase ........................................................................................................14

3.2 Isoformen der COX ...................................................................................................15

3.3 Produkte des Cyclooxygenaseweges: Prostaglandine und Thromboxane.................16

3.3.1 Prostaglandin E2 ................................................................................................16

3.3.2 Thromboxan B2..................................................................................................17

3.4 Hemmung der Prostaglandinsynthese als Wirkungsmechanismus antipyretischer

Analgetika.............................................................................................................................17

3.4.1 Saure Antipyretika .............................................................................................17

3.4.2 Nicht saure Antipyretika.....................................................................................18

3.4.2.1 Wirkungmechanismus von Metamizol ........................................................19

3.4.2.2 Wirkungmechanismus von Paracetamol ....................................................22

3.5 Cyclooxygenasehemmer ...........................................................................................24

3.5.1 Nicht selektive Cyclooxygenasehemmer............................................................25

3.5.1.1 Thrombozytenhemmende und potenziell kardioprotektive Wirkung von

Naproxen ..................................................................................................................26

3.5.2 Selektive Cyclooxygenasehemmer ....................................................................27

3.5.2.1 Lumiracoxib ein hochselektiver COX-2-Hemmer........................................29

4 Ziele..................................................................................................................................31

4.1 Untersuchungen zum Wirkungmechanismus von Metamizol .....................................31

4.2 Untersuchungen zur Wirkungsmechanismus von Paracetamol .................................32

4.3 Entwicklung und Validierung einer analytischen Methode zur Bestimmung von

Lumiracoxib in Plasma von menschlichen Probanden ..........................................................32

4.4 Untersuchungen zur COX-2-Hemmung durch Lumiracoxib in verschiedenen

Dosierungen .........................................................................................................................32

4.5 Untersuchung zur thrombozytenhemmenden und potenziell kardioprotektiven Wirkung

von Naproxen .......................................................................................................................32

5 Experimenteller Teil ........................................................................................................34

5.1 Materialien.................................................................................................................34

5.1.1 Lösungen...........................................................................................................34

5.1.2 Chemikalien.......................................................................................................35

Inhaltverzeichnis 2

5.1.3 Verbrauchsmaterialien.......................................................................................36

5.1.4 Geräte ...............................................................................................................37

5.1.5 Software ............................................................................................................38

5.1.6 Medikamente .....................................................................................................38

5.2 Methoden ..................................................................................................................39

5.2.1 Pharmakokinetische Untersuchungen................................................................39

5.2.2 Pharmakodynamische Untersuchungen ............................................................39

5.2.2.1 COX-1-Aktivität im menschlichen Vollblut ..................................................40

5.2.2.2 COX-2-Aktivität im menschlichen Vollblut ..................................................40

5.2.2.3 Quantifizierung der Konzentration von Prostanoid im Vollblut mittels ELISA ..

..................................................................................................................40

5.2.2.3.1 Messung von TXB2 .................................................................................40

5.2.2.3.2 Messung von PGE2 ................................................................................41

5.2.3 Korrelationsanalyse zwischen Pharmakodynamik und Pharmakokinetik............41

5.2.3.1 Pharmakodynamische Analyse ..................................................................41

5.2.3.2 Pharmakokinetische Analyse .....................................................................42

5.2.3.3 Berechnung der Korrelation zwischen Pharmakodynamik und

Pharmakokinetik............................................................................................................42

5.2.4 Validierung einer analytischen Methode ............................................................43

5.2.4.1 Spezifität und Selektivität ...........................................................................43

5.2.4.2 Linearität ....................................................................................................43

5.2.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze ..........................................................44

5.2.4.4 Richtigkeit ..................................................................................................44

5.2.4.5 Präzision ....................................................................................................44

5.2.4.6 Wiederfindung (Recovery)..........................................................................45

5.2.4.7 Stabilität .....................................................................................................45

5.3 Studien......................................................................................................................46

5.3.1 Klinisch-pharmakologische Untersuchungen zur Pharmakokinetik und

Pharmakodynamik von Metamizol.....................................................................................46

5.3.1.1 Studienziel .................................................................................................46

5.3.1.2 Studiendesign ............................................................................................46

5.3.1.3 Probandenpopulation .................................................................................46

5.3.1.4 Studienmedikation .....................................................................................46

5.3.1.5 Studienplan................................................................................................47

5.3.1.6 In-vitro Untersuchungen.............................................................................47

5.3.1.6.1 Wirkungen von Metamizol Metaboliten auf die COX-1 und COX-2-Aktivität

im menschlichen Vollblut ...........................................................................................47

Inhaltverzeichnis 3

5.3.1.7 Ex-vivo Untersuchungen ............................................................................48

5.3.1.7.1 Hemmung der COX-Aktivitäten in Blut nach einmaliger oraler Gabe von

Metamizol ...............................................................................................................48

5.3.1.7.2 Bestimmung von 4-MAA und 4-AA im menschlichen Plasma .................48


Pharmakodynamik von Paracetamol .................................................................................49

5.3.2.1 Studienziel .................................................................................................49

5.3.2.2 Studiendesign ............................................................................................49



5.3.2.5 Studienplan................................................................................................49

5.3.2.6 In vitro Untersuchungen .............................................................................50

5.3.2.6.1 Wirkungen von Paracetamol auf COX-1 und COX-2-Aktivität im

menschlichen Vollblut................................................................................................50

5.3.2.6.2 Effekt von Paracetamol auf COX-2-Aktivität im Human rekombinante

COX-2 ...............................................................................................................50

5.3.2.6.3 Effekt von Paracetamol auf COX-2-Aktivität in humanen Blutmonocyten51

5.3.2.6.4 Effekt von Paracetamol auf die COX-2-Expression in humanen

Blutmonocyten mittels Westernblot-Analyse..............................................................51

5.3.2.7 Ex-vivo Untersuchungen ............................................................................52

5.3.2.7.1 Hemmung der COX-Aktivitäten nach einmaliger oraler Gabe von

Paracetamol 1000 mg ...............................................................................................52

5.3.2.7.2 Bestimmung von Paracetamol in menschlichem Plasma ........................53


Pharmakodynamik von Lumiracoxib..................................................................................54

5.3.3.1 Studienziel .................................................................................................54

5.3.3.2 Studiendesign ............................................................................................54



5.3.3.5 Studienplan................................................................................................54

5.3.3.6 Hemmung der COX-2-Aktivität durch Lumiracoxib ex-vivo .........................55

5.3.3.7 Bestimmung von Lumiracoxib in menschlichem Plasma. ...........................55

5.3.3.8 Statistik ......................................................................................................55


Pharmakodynamik von Naproxen .....................................................................................57

5.3.4.1 Studienziel .................................................................................................57

5.3.4.2 Studiendesign ............................................................................................57

Inhaltverzeichnis 4



5.3.4.5 Studienplan................................................................................................57

5.3.4.6 Hemmung der COX-Aktivitäten durch Naproxen 200mg zweimal am Tag für

7 Tage bei menschlichen Probanden. ...........................................................................58

5.3.4.7 Bestimmung von Naproxen in menschlichem Plasma................................58

6 Ergebnisse.......................................................................................................................60

6.1 Klinisch-pharmakologische Untersuchungen zur Pharmakokinetik und

Pharmakodynamik von Metamizol ........................................................................................60

6.1.1 In-vitro Wirkungen von 4-MAA und 4-AA auf die COX-1 und COX-2-Aktivität in

menschlichem Vollblut ......................................................................................................60

6.1.2 Ex-vivo Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität in menschlichem Vollblut

nach einmaliger Einnahme von Metamizol ........................................................................60

6.1.3 Pharmakokinetik von Metamizolmetaboliten nach oraler Gabe von Metamizol in

den Dosierungen von 500 mg und 1000 mg......................................................................62

6.1.4 Korrelation zwischen Plasmakonzentration von 4-MAA und ex-vivo-Hemmung

der COX-Isoformen...........................................................................................................64


Pharmakodynamik von Paracetamol.....................................................................................66

6.2.1 In-vitro Wirkung von Paracetamol auf die COX-1- und COX-2-Aktivität in

menschlichem Vollblut ......................................................................................................66

6.2.2 Pharmakokinetik von Paracetamol nach einmaliger oraler Gabe von 1000 mg

Paracetamol......................................................................................................................66

6.2.3 Ex-vivo-Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität in menschlichem Vollblut

nach einmaliger Einnahme von 1000 mg Paracetamol......................................................68

6.2.4 Korrelation zwischen den Plasmakonzentrationen von Paracetamol und den ex-

vivo-Hemmungen von COX-1 und COX-2.........................................................................69

6.2.5 In-vitro-Wirkung von Paracetamol auf die COX-2-Aktivität von humanem

rekombinanten Enzym und Blutmonozyten .......................................................................71

6.2.6 In-vitro-Wirkung von Paracetamol auf die COX-2-Expression ............................71

6.3 Entwicklung und Validierung einer HPLC-UV Methode zur Bestimmung der

Konzentrationen von Lumiracoxib in menschlichem Plasma .................................................73

6.3.1 Methodenentwicklung ........................................................................................73

6.3.1.1 Standardlösungen......................................................................................73

6.3.1.2 Probenaufarbeitung und Messung .............................................................74

6.3.2 Validierung.........................................................................................................75

6.3.2.1 Spezifität, Linearität und Bestimmungsgrenze............................................75

Inhaltverzeichnis 5

6.3.2.2 Repräsentative Chromatogramme .............................................................76

6.3.2.3 Intra-day und - Inter-day-Präzision .............................................................77

6.3.2.4 Wiederfindung............................................................................................78

6.3.2.5 Stabilität .....................................................................................................79


Pharmakodynamik von Lumiracoxib......................................................................................80

6.4.1 Pharmakokinetik von Lumiracoxib nach oraler Gabe .........................................80

6.4.2 Ex-vivo-Hemmung der COX-2-Aktivität nach oraler Gabe von Lumiracoxib .......82

6.4.3 Korrelation zwischen den Lumiracoxibplasmakonzentrationen und der ex-vivo

COX-2-Hemmung .............................................................................................................84


Pharmakodynamik von Naproxen .........................................................................................85

6.5.1 Pharmakokinetik von Naproxen und ex-vivo-Hemmung der COX-1- und COX-2-

Aktivität nach einmaliger oraler Gabe von 220 mg Naproxen Natrium bei gesunden

Probanden ........................................................................................................................85

6.5.2 Pharmakokinetik von Naproxen und ex-vivo-Hemmung der COX-1 und COX-2-

Aktivität nach oraler Gabe von 220 mg Naproxen Natrium im Steady-state.......................86

6.5.3 Korrelation zwischen den Naproxenplasmakonzentrationen und ex-vivo-

Hemmungen der COX-Isoformen......................................................................................88

7 Diskussion.......................................................................................................................90

7.1 Untersuchungen zum Wirkungmechanismus von Metamizol .....................................90

7.2 Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Paracetamol ...............................94

7.3 Entwicklung und Validierung einer analytischen Methode zur Bestimmung von

Lumiracoxib in Plasma von menschlichen Probanden ..........................................................98

7.4 Untersuchungen zur COX-2-Hemmung durch Lumiracoxib in verschiedenen

Dosierungen .........................................................................................................................99

7.5 Untersuchung zur thrombozytenhemmende und potenziell kardioprotektive Wirkung

von Naproxen .....................................................................................................................101

8 Schlussfolgerungen......................................................................................................103

9 Literaturverzeichnis ......................................................................................................104

10 Lebenslauf .....................................................................................................................116

11 Veröffentlichungen .......................................................................................................118

Danksagung ..........................................................................................................................120

Abkürzungsverzeichnis 6

Abkürzungsverzeichnis

AA Arachidonsäure

4-AA 4-Aminoantipyrin

ASS Acetylsalicylsäure

AUC Area under the curve = Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve

AWEC Area within the effect-time curve = Effekt-Zeitkurve

Cmax maximale Plasmakonzentration

COX Cyclooxygenase

DMSO Dimethylsulfoxid

ELISA enzyme-linked immunoassay = Enzym-gekoppelter Immunoassay

EMEA European Medicines Agency

h hour = Stunde

H2O Wasser aus Milli-Q-Anlage

HPLC High performance liquid chromatography

i.v. intravenös

M Molar (mol/l)

4-MAA 4-Methylaminoantipyrin

min Minute

mM millimolar (mmol/l)

µM mikromolar (µmol/l)

nm Nanometer

NSAR nicht steroidale Antirheumatika

NSAID non-steroidal anti-inflammatory drugs, siehe NSAR

OD optische Dichte

PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PG Prostaglandin

PGE2 Prostaglandin E2

r.p.m rounds per minute = Umdrehungen pro Minute

SD Standard deviation = Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat

SEM Standard error of mean = Standardfehler

tmax Zeit zur maximalen Plasmakonzentration

TXB2 Thromboxan B2

v/v Volumen pro Volumen

ZNS Zentralnervensystem

Zusammenfassung 7

1 Zusammenfassung

Die nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR) wurden schon viele Jahre therapeutisch eingesetzt,

bevor ihr Wirkmechanismus erkannt wurde. Ihre Wirkung beruht im Wesentlichen auf einer

unselektiven Hemmung der beiden bekannten Cyclooxygenaseisoformen (COX-1 und COX-2).

Dadurch wird die Synthese von Prostaglandinen und Thromboxanen gehemmt. Diese

Substanzen stellen wichtige Mediatoren für Schmerz- und Entzündungsreaktionen dar. Sie

erfüllen darüber hinaus Schutzfunktionen in zahlreichen Organen des menschlichen Körpers,

z.B in der Magen- Darmschleimhaut, den Nieren und den Blutgefäßen. In den 90-er Jahren

wurden selektiven COX-2-Hemmer (Coxibe), als Analgetika mit niedrigerer gastrointestinalen

Toxizität im Vergleich zu den traditionellen NSARs, entwickelt.

Der Schwerpunkt dieser Dissertation wurde auf die Hemmung der peripheren Cyclooxygenasen

in menschlichen Blutzellen durch die Vertreter von selektiven und nichtselektiven COX-

Inhibitoren gelegt. Die in dieser Dissertation verwendete Methode erlaubt aus der gleichen

Blutprobe (ex-vivo) die Wirkstoffkonzentration (Pharmakokinetik) sowie die durch diese

Konzentration ausgelöste Hemmung beider Cyclooxygenasen (Pharmakodynamik) zu

bestimmen. Die Hemmung der COX-Aktivitäten wurde mittels enzymgekoppelten

Immunadsorptionstest (ELISA) bestimmt, wobei das koagulationsinduzierte Thromboxan B2

(TXB2) und das Lipopolysaccharid-induzierte Prostaglandin E2 (PGE2) ex-vivo und in-vitro im

menschlichen Vollblut als Marker der COX-1 und COX-2 Aktivität herangezogen wurden.

Aufgrund der Analyse von Ausmaß und Dauer der COX-2-Hemmung konnte die kleinste

effektive analgetische Dosis und das entsprechende Dosisintervall bestimmt werden. Durch

diese Erkenntnisse könnte man Überdosierungen und damit verbundene Nebenwirkungen

vermeiden. Hinsichtlich der Analyse der COX-1-Hemmung diente eine relevante Hemmung der

Thrombozytenaggregation (über 95%) als erhöhtes Risiko für Blutungen sowie als Prognose zur

Kardioprotektion eines Medikamentes.

Die gleichzeitige Analyse der Pharmakokinetik und Pharmakodynamik den untersuchten

Wirkstoffen nach der oralen Einnahme von Medikamenten ermöglichte verschiedene

Fragestellungen zu untersuchen.

Zunächst wurden die Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Metamizol und

Paracetamol als Vertreter der nicht sauren Analgetika durchgeführt. Diese Medikamente üben

analgetische und antipyretische Effekte aus, weisen jedoch keine nennenswerte

entzündungshemmende Wirkkomponente sowie nur geringe gastrointestinale Nebenwirkungen

auf. Dagegen besitzen saure Analgetika potente analgetische, antipyretische und

antiphlogistische Eigenschaften und führen z.T. zu schweren gastrointestinalen und renalen

Nebenwirkungen.

Zusammenfassung 8

Metamizol ist ein Prodrug und wird im Organismus zu 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA)

hydrolisiert, das weiter zu 4-Aminoantipyrin (4-AA) demethyliert wird. Die vorliegende Studie mit

Metamizol ist die erste, die ex-vivo beim Menschen die Selektivität von Metamizol zu den

peripheren COX-Enzymen sowie die Bedeutung der entsprechenden Metamizolmetaboliten (4-

MAA und 4-AA) untersuchte. Die Pharmakokinetiken der Metaboliten und die ex-vivo COX-

Hemmungen wurden bei fünf Probanden bestimmt, die einzelne orale Dosen von 500 oder

1000 mg Metamizol erhielten. Es zeigte sich, dass Metamizol in therapeutischer Dosierung eine

anhaltende Hemmung der beiden COX-Isoformen durch 4-MAA verursacht. Die COX-2-

Hemmung über 80% wurde bereits mit einer Dosierung von 500 mg erreicht. Nach Dosierung

von 1000 mg wurde eine über 95%-ige TXB2-Hemmung bei einigen Probanden gemessen.

Höhere Einzeldosen erscheinen aufgrund dieses Befundes nicht effektiver sein, erhöhen aber

das Risiko von unerwünschten Effekten.

Die Tatsache, dass Paracetamol funktionell einem selektiven COX-2 Hemmer ähnelt, führte zur

Überprüfung der Hypothese, dass Paracetamol bevorzugt über eine Hemmung von COX-2

analgetisch wirkt. Dafür wurden die Pharmakokinetik von Paracetamol und die ex-vivo COX-

Hemmung bei fünf Probanden bestimmt, die 1000 mg als einmalige orale Dosis erhielten.

Zusätzlich wurden in-vitro-Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob die Expression oder

Aktivität von COX-2 in Blutmonozyten nach oraler Paracetamolgabe beeinflusst wird. In-vitro

sowie ex-vivo zeigte Paracetamol eine 4-fach höhere Selektivität für COX-2-Hemmung. Nach

der oralen Gabe des Medikamentes (1000 mg) wurde COX-2 (83%) im Vergleich zu COX-1

(56%) deutlich effektiver gehemmt. Mittels weiterer in-vitro Versuche konnte nachgewiesen

werden, dass Paracetamol die COX-2-Aktivität beeinflußt jedoch nicht die Expression von COX-

2 in Blutmonozyten.

Weiterhin wurde die COX-2-Hemmung durch den selektiven COX-2-Inhibitor Lumiracoxib

untersucht. Unter den im Jahr 2007 verfügbaren COX-2-Inhibitoren war Lumiracoxib der einzige

Arzneistoff für den in einer großen Patientenstudie Vorteile hinsichtlich gastrointestinaler

Nebenwirkungen bei Patienten mit Osteoarthritis demonstriert werden konnten. Dennoch wurde

im August 2007 von Fällen berichtet, in denen sich schwerwiegende lebertoxische

Nebenwirkung nach Lumiracoxibeinnahme in höheren Dosierungen (200 mg, 400 mg pro Tag)

zeigte. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob eine ausreichende schmerzlindernde

COX-2-Hemmung (80%) auch nach oraler Einnahme von 50 mg erreicht werden kann. Um

dieses Ziel zu erreichen wurde eine Methode zur Bestimmung von Lumiracoxib im

menschlichen Plasma entwickelt und validiert. Anschließend wurde eine randomisierte, dreifach

cross-over Studie mit vier Probanden, die einmalig 50 mg, 100 mg oder 200 mg Lumiracoxib

eingenommen hatten, durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Lumiracoxib innerhalb

eines Zeitraums von 1 bis 1,5 Stunden nach Applikation zur kompletten Hemmung der COX-2-

Aktivität bei allen untersuchten Dosierungen führte. Die schmerzlindernde Hemmung der COX-

Zusammenfassung 9

2 (80%) wurde bis zu 6 Stunden bereits bei der kleinsten untersuchten Dosierung festgestellt,

bis zu 8 Stunden bei 100 mg und bis zu 10 Stunden bei 200 mg. Daraus folgt, dass Lumiracoxib

in der Dosierung von 50 mg eine vollständige und anhaltende COX-2-Hemmung hervorruft.

Sinnvolle therapeutische Effekte müssten aufgrund dieser Befunde bereits in der Dosierung von

100 mg erreichbar sein.

Anschließend wurde eine Untersuchung mit dem nicht selektiven COX-Hemmer Naproxen

durchgeführt um die immer wieder postulierte kardioprotektive Wirkung von Naproxen zu

untersuchen. Es ist bekannt, dass Naproxen beide Enzyme effektiv hemmt, er hat dazu eine

lange Halbwertzeit, deswegen könnte eine langandauernde Hemmung von TXB2 Synthese über

95% ein möglicher Mechanismus für die kardioprotektive Wirkung sein. Dafür wurde eine Studie

mit vier Probanden durchgeführt, die 220 mg Naproxen Natrium zweimal täglich für 7 Tage

einnahmen. Die stärkste Hemmung der COX-1 ergab sich mit 94% nach der ersten

Tabletteneinnahme und mit 93% im Steady-state. Stärkere Hemmung als 95% wurde bei zwei

von vier Probanden nach der Einzeldosis und bei einem von vier Probanden im Steady - state

beobachtet. Daraus folgt, dass Naproxen in OTC (rezeptfreie) Dosierung mögliche aber keine

zuverlässige kardioprotektive Wirkung hat.

Summary 10

2 Summary

The nonsteroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) had been in use for years before their mode

of action became known. Their activity is based largely on the non-selective inhibition of the two

known cyclooxygenases (COX-1 and COX-2), which results in a reduction of prostaglandins

and thromboxanes, both of which are important mediators of pain and inflammation. In addition,

they play a protective role in many organs of the human body - for example in gastrointestinal

mucosa, in the kidney and blood vessels. In the 1990s, selective inhibitors of the COX-2

enzyme (coxibs) were developed as analgesics with a lower gastrointestinal toxicity than

traditional NSAIDs.

The major focus of the present dissertation was the investigation of the inhibition of the

peripheral cyclooxygenases in human blood cells by members of selective and nonselective

COX-inhibitors. The method employed in this study makes it possible to determine, in one and

the same blood sample, both the concentration of the active agent (pharmacokinetics) and the

inhibition of the two cyclooxygenases at that concentration (pharmacodynamics). The inhibition

of the COX activities was determined by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA),

using the coagulation-induced thromboxane B2 (TXB2) and the lipopolysaccharide-induced

prostaglandin E2 (PGE2), measured ex vivo and in vitro in human whole blood, as indices of

COX-1 and COX-2 activity.

An analysis of the extent and duration of COX-2 inhibition made it possible to determine the

minimal analgesic dose and the dosing interval. This knowledge might help to avoid overdosing

related side effects. In the case of COX-1 inhibition a clinically relevant inhibition of platelet

aggregation was used as an indication of whether a drug may be the cause of an elevated risk

of bleeding or provide cardioprotection.

The simultaneous analysis of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the substances

investigated following oral administration of the drugs made it possible to study a number of

questions.

First, the mode of action of metamizol (dipyrone) and paracetamol (acetaminophen) as

representatives of the non-acidic analgesics was investigated. These drugs have analgesic and

antipyretic activities, but no appreciable anti-inflammatory effects and only mild gastrointestinal

side effects. In contrast, acidic analgesics have potent analgesic, antipyretic and anti-

inflammatory properties and in some cases may cause severe gastrointestinal and renal side

effects.

Metamizol is a prodrug and is hydrolysed in the organism to 4-methylamnioantipyrine (4-MAA),

which is then demethylated to 4-aminoantipyrine (4-AA). The present study is the first to

Summary 11

investigate, ex-vivo in humans, the selectivity of metamizol for the peripheral COX enzymes and

the significance of the corresponding metabolites (4-MAA und 4-AA). The pharmacokinetics of

the metabolites and ex vivo COX inhibition were investigated in volunteers receiving metamizol

at single oral doses of 500 or 1000 mg. It was found that metamizol in therapeutic doses brings

about sustained inhibition of both COX isoforms via 4-MAA. Even the lower dose (500 mg)

results in a COX-2 inhibition of more than 80%. At a dose of 1000 mg a greater than 95%

inhibition of TXB2 was seen in some volunteers. Higher single doses would thus not appear to

be more effective, but would increase the risk of undesirable side effects.

The fact that paracetamol (acetaminophen) has an action similar to that of a selective COX-

inhibitor, prompted us to investigate the hypothesis that its analgesic activity might be mediated

by the inhibition of COX-2. To this end ex vivo COX inhibition and the pharmacokinetics of

paracetamol were assessed in five volunteers receiving single oral 1000 mg dose. In addition, in

vitro experiments were done to establish whether the expression or activity of COX-2 in blood

monocytes is influenced by oral paracetamol. Paracetamol showed a 4-fold greater selectivity

towards COX-2 inhibition, both in vitro and ex vivo. After administration of the drug the activity of

COX-2 was inhibited considerably more strongly (83%) than that of COX-1 (56%). Further in

vitro experiments showed that while paracetamol influenced COX-2 activity it had no influence

on the expression of COX-2 in blood monocytes.

COX-2 inhibition by the selective COX-2 inhibitor lumiracoxib was also investigated. In a study

involving a large number of patients, lumiracoxib showed to have advantages in terms of

gastrointestinal side effects in patients with osteoarthritis. Nevertheless, in August 2007 a

number of patients were reported to have developed severe liver problems following high daily

doses of lumiracoxib (200 mg, 400 mg). The present study investigated the question whether an

oral dose of 50 mg could also achieve adequate COX-2 inhibition (80%). For this purpose a

method for the determination of lumiracoxib in human plasma was developed and validated. A

randomised cross-over study was then done on four volunteers who had taken a single dose of

50 mg, 100 mg or 200 mg lumiracoxib. It was shown that all three doses resulted in complete

inhibition of COX-2 activity within a period of 1 to 1.5 hours. The analgesic effect of COX-2

inhibition (over 80%) persisted for 6 hours at the smallest analysed dose investigated, for 8

hours at a dose of 100 mg, and for 10 hours at 200 mg. This implies that Lumiracoxib at a dose

of 50 mg produces complete and sustained COX-2 inhibition. On the basis of these data, a dose

of 100 mg should suffice to achieve an acceptable therapeutic effect.

A further investigation was carried out with a non-selective COX-inhibitor – naproxen, to study

its potential cardioprotective action. It is known that naproxen effectively inhibits both COX-

enzyme isoforms and has a long half life. Hence, a possible mechanism of its cardioprotective

action might be prolonged inhibition of TXB2 synthesis above 95%. To investigate this, four

Summary 12

subjects were given a twice daily dose of 220 mg naproxen sodium for 7 days. The maximum

COX-1 inhibition after the first dose was 94% and at steady state 93%. A greater than 95%

inhibition was observed in two of four volunteers at time of maximal plasma concentration after

the first dose and in one of four volunteers throughout the 12-hour dose interval at steady-state.

Thus, a cardioprotective effect of over-the-counter doses of naproxen is possible but not reliably

certain.

Summary 13

The results may be summarised as follows:

• Via its metabolite 4-MAA, metamizol (dipyrone) dose-dependently inhibits the two COX

enzymes to an appreciable extent in vitro and ex vivo in the blood of volunteers. The

rapid and profound inhibition of COX-2 in human blood monocytes supports the

assumption that the analgesic action of metamizol is mediated by peripheral

mechanisms. In this connection no COX-1/COX-2 selectivity was observed. With regard

to the observed COX-1 inhibition it is assumed that physicochemical factors (lack of

acidity) are responsible for the superior gastrointestinal tolerability of metamizol as

compared with acidic COX inhibitors. The good tissue penetration properties of

metamizol suggest that, in the CNS, too, it inhibits COX-2 sufficiently to produce an

analgesic effect. Since a single dose of 1 g metamizol has a prolonged effect, larger

doses would appear unnecessary.

• Paracetamol (acetaminophen) inhibited COX-2 by more than 80%, i.e. to a degree

comparable with that seen with non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and

selective COX-2 inhibitors. On the other hand, a relevant COX-1 inhibition (at least

95%), as is necessary for the suppression of platelet function, was not observed. In vitro

and ex vivo paracetamol revealed an approximately 4-fold higher selectivity for COX-2.

In view of its substantial COX-2 inhibition, recently defined cardiovascular warnings

against the use of COX-2 inhibitors should also be considered for this substance.

• Lumiracoxib at a dose of 50 mg elicits complete and prolonged COX-2 inhibition. It

would appear meaningful to consider using lumiracoxib for pain therapy at therapeutic

doses of not more than 100 mg.

• The administration of naproxen sodium at OTC doses was associated with a profound

inhibition of both COX enzymes. Although in some volunteer an anticoagulant, i.e.

cardioprotective effect of COX-1 inhibition was observed already at OTC dose, reliable

cardioprotection probably requires a dose of ca. 1 g a day.

In the light of the results presented here, a critical review of the “usual” doses of

cyclooxygenase inhibitors would appear justified.

Einleitung 14

3 Einleitung

3.1 Cyclooxygenase

Die Cyclooxygenase (COX), auch Prostaglandin-H-Synthase (PGHS) genannt, ist ein Enzym,

das die Umsetzung der Arachidonsäure (AA) zu wichtigen Botenstoffen katalysiert. Der Name

der Arachidonsäure leitet sich von der Erdnuss (Arachis hypogaea) her, aus der die AA zuerst

isoliert wurde. Arachidonsäure (all-cis-5,8,11,14-Eicosatetraensäure) wird aus den

Membranphospholipiden durch die Phospholipase (PLA2) freigesetzt und kann über die

Cyclooxygenase und Lipoxygenase weiter verstoffwechselt werden. Durch die Katalyse der

Lipoxygenase entstehen Leukotriene, durch die Cyclooxygenase werden Prostaglandine und

Thromboxane synthetisiert. Neben Prostaglandinen werden aus Arachidonsäure auch andere

Fettsäureprodukte, wie z.B. Epoxyeicosatriensäuren (EET), Isoprostane (IP),

Endocannabinoide, Lipoxine (LX) und Hepoxiline (HX) gebildet. Sie alle werden unter dem

Begriff Eicosanoide zusammengefasst, da sie alle von der Fettsäure Prostansäure, die aus 20

(griech: eikosi) Kohlenstoffatomen aufgebaut ist, abgeleitet sind.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Arachidonsäurekaskade. Die Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2 verstoffwechseln die Arachidonsäure zu Prostaglandinen, Prostazyklin und Thromboxan in zwei aufeinander folgenden Reaktionen. Dabei wird zuerst die AA durch die Endoperoxidsynthase-Reaktion zu Prostaglandin G2 (PGG2) umgewandelt. Dann vermittelt die Peroxidase-Reaktion die Umwandlung zu Prostaglandin H2. Inhibitoren der Cyclooxygenase hemmen dabei die Endoperoxidsynthase-Reaktion.

Die Cyclooxygenase ist ein bifunktionelles Enzym und besitzt daher zwei aktive Zentren

(Hawkey, 1999). Als Endoperoxid-Synthase (Cyclooxygenase-Reaktion) oxidiert und zyklisiert

PGH2

Arachidonsäure

Endoperoxidsynthase-Reaktion

PGG2

Peroxidase-Reaktion

PGF2α

PGD2

PGE2

PGI2

TXA2

COX

Einleitung 15

sie die AA zum Prostaglandin G2 (PGG2), wobei der charakteristische Cyclopentanring der

Prostaglandine entsteht. Ein zweites katalytisches Zentrum der COX, die Peroxidase, reduziert

die Peroxidgruppe am C-15 zum Alkohol. Das dadurch entstandene Prostaglandin H2 (PGH2)

wird durch gewebespezifische Enzyme weiter zu den verschiedenen Substanzen, wie

Prostaglandinen (PGE, PGF und PGD), Prostazyklin (PGI), und Thromboxan (TXA)

transformiert (Abbildung 1).

3.2 Isoformen der COX

Zurzeit sind zwei COX-Isoformen, die COX-1 und COX-2 bekannt. Beide Isoenzyme

unterscheiden sich in ihrer Gewebeverteilung und der Regulation ihrer Expression. Die COX-1-

Isoform wird in fast allen Geweben einschließlich Gastrointestinaltrakt, Thrombozyten,

Endothelzellen und Nieren konstitutiv exprimiert (Crofford, 1997) und ist vor allem an

physiologischen Funktionen, wie z.B. die Protektion der Magenschleimhaut, die Kontrolle des

renalen Blutflusses und die Plättchenaggregation beteiligt. Im Gegensatz zu der überall

vorkommenden COX-1 findet man COX-2 unter physiologischen Bedingungen nur in wenigen

Geweben wie ZNS (Beiche et al., 1996), Niere (Harris et al., 1994; Catella-Lawson et al., 1999;

McAdam et al., 1999), weibliche Reproduktionsgewebe (Kniss, 1999) und Magen (Zimmermann

et al., 1998). Alle anderen Gewebe produzieren das Enzym lediglich bei Bedarf, so nach

unterschiedliche Stimuli wie z.B. proinflammatorische Zytokine (Mitchell et al., 1994),

Wachstumsfaktoren (DeWitt et al., 1993), Endotoxine und Tumorpromotoren (Lee and Ip, 1992),

sowie als Antwort auf Stress durch chemische Reizung, Verletzung, UV-Bestrahlung, bakterielle

Infektion usw. Da es bei solchen Stressreaktionen meist zu Entzündungen kommt, gilt COX-2

als „proinflammatorisches Notfallenzym“. Zum anderen spielt die COX-2 eine wichtige Rolle bei

der Wund- bzw. Ulkusheilung und bei der Regulierung des Augeninnendruckes (Hinz and Brune,

2002).

Beide Isoformen zeigen eine ca. 60 %-ige Homologie in ihrer Aminosäuresequenz (Vane et al.,

1998). Sie bestehen aus ca. 600 Aminosäuren (Smith et al., 1996), wobei die COX-1 576

Aminosäuren, und die COX-2 587 Aminosäuren enthält. Beide Isoformen besitzen ähnliche

aktive Zentren, einen langen und engen, tunnelartigen, hydrophoben Kanal an dessen Ende die

Enzymreaktionen katalysiert werden (Garavito, 1996). Der wichtigste Unterschied liegt in der

Tertiärstruktur der katalytischen Zentren beider Enzyme. Durch den Austausch von Isoleucin

(Ile) gegen das kleinere Valin (Val) bei der COX-2 an der Position 523 wird die Bindungstasche

der COX-2 gegenüber der COX-1 um 25 % größer (Smith et al., 2000; Garavito et al., 2002;

Gupta et al., 2004). Die größere Bindungstasche der COX-2 wurde bei der Entwicklung von

selektiven COX-2-Inhibitoren (siehe Abschnitt 3.5.2) ausgenutzt (Hinz and Brune, 2002).

Einleitung 16

Zusätzlich zu diesen gut charakterisierten Isoformen wurden mehrere Splicevarianten von

COX-1 und COX-2 in verschiedenen Geweben nachgewiesen (Simmons et al., 2004). Für eine

katalytisch aktive COX-1-Variante, die in Hunden entdeckt wurde und durch Paracetamol

gehemmt wurde (Chandrasekharan et al., 2002), konnten in weiteren genetischen

Untersuchungen jedoch gezeigt werden, dass diese Variante beim Menschen nur ein Protein

mit geringer COX-Homologie und ohne COX-Aktivität darstellt (Kis et al., 2005). Daher ist

dieses Protein beim Menschen vermutlich nicht an der Prostaglandin-Biosynthese beteiligt.

3.3 Produkte des Cyclooxygenaseweges: Prostaglandine und

Thromboxane

Die Produkte, die unter der katalytischen Wirkung der COX-Enzyme gebildet werden, sind unter

anderen die Prostaglandine und Thromboxane. Sie werden auch unter dem Begriff Prostanoide

zusammengefasst. Die Prostanoide sind wegen ihrer raschen metabolischen Inaktivierung nur

für wenige Sekunden bis Minuten am Ort ihrer Bildung wirksam und müssen also ständig neu

synthetisiert werden.

3.3.1 Prostaglandin E2

Das Prostaglandin E2 (PGE2) ist ein primäres Prostaglandin, das aus PGH2 durch die PGE-

Synthase entsteht. Zurzeit sind drei PGE-Synthasen, die Membran-gebundene (mikrosomale)

PGE-Synthase-1 (mPGES-1) (Jakobsson et al., 1999), die Membran-gebundene (mikrosomale)

PGE-Synthase-2 (mPGES-2) (Murakami et al., 2003) und die cytosolische PGE-Synthase

(cPGES) bekannt (Tanioka et al., 2000). mPGES-1 ist funktionell an COX-2 gekoppelt und kann

genauso wie COX-2 durch proinflammatorische Stimuli (IL-1β) hochreguliert werden

(Stichtenoth et al., 2001; Korotkova et al., 2005). Die hauptsächlich im Gehirn vorkommende

zytostolische PGE-Synthase (cPGES) ist dagegen funktionell an COX-1 gebunden und wird wie

diese konstitutiv exprimiert (Tanioka et al., 2000). Die mPGES-2 kann zusammen sowohl mit

COX-1 als auch mit COX-2 vorkommen (Murakami et al., 2003). Es wird vermutet, dass die

physiologische PGE2-Funktionen vorwiegend durch cPGES / mPGES-2 / COX-1 und die

pathophysiologische PGE2-Funktionen durch das mPGES-1 / COX-2-System vermittelt werden

(Helliwell et al., 2004).

PGE2 kann viele und teilweise gegensätzlichen Wirkungen, wie z.B. eine Kontraktion oder

Relaxation von glatten Muskeln verursachen, eine Stimulation oder Suprimierung der Sekretion

von Hormonen hervorrufen. Diese sind auf die PGE-Rezeptor-Subtypen: EP1, EP2, EP3 und

EP4 zurückzuführen. (Bos et al., 2004). Eine Aktivierung des EP1-Rezeptors führt zur

Kontraktion glatter Muskelzellen in den Bronchien und dem Gastrointestinaltrakt (Narumiya et

al., 1999). Eine Aktivierung des EP2-Rezeptors ruft dagegen eine Relaxation von glatten

Einleitung 17

Muskelzellen in den Bronchien, im Gastrointestinaltrakt und in Blutgefäßen hervor. Eine

Aktivierung des EP3-Rezeptors führt zur Hemmung der Magensäureproduktion, einer

verstärkten Uteruskontraktion in der Schwangerschaft (Mutschler E., 2001). Darüber hinaus ist

der EP3-Rezeptor im Hypothalamus an der Induktion des Fiebers beteiligt (Nakamura et al.,

1999). Der EP4-Rezeptor vermittelt eine vermehrte Schleimsekretion des Magens und hält den

Ductus arteriosus Botalli offen (Mutschler E., 2001). Im Bereich des Intestinaltraktes ist u.a. das

PGE2 von zytoproliferativer Bedeutung. Es wurde berichtet, dass exogenes Prostaglandin E2 die

Proliferation von Stammzellen intestinaler Krypten stimuliert (Cohn et al., 1997).

3.3.2 Thromboxan B2

Das Thromboxan B2 (TXB2) ist ein stabiler Metabolit des Thromboxan A2 (TXA2), das in

physiologischer Umgebung eine äußerst instabile Verbindung ist. Das Thromboxan A2 wird von

der Thromboxansynthase, das zu den Cytochrom P450 Isoenzymen gehört (Wang and

Kulmacz, 2002), in den Thrombozyten gebildet. TXA2 vermittelt die Plättchenaggregation und

die Kontraktion glatter Muskelzellen in den Blutgefäßen und den Bronchien über den TXA2-

Rezeptor. Mit einer Halbwertzeit von 30 Sekunden zerfällt es nicht enzymatisch zu dem stabilen,

aber inaktiven TXB2 (Hamberg et al., 1975; Needleman et al., 1976), das man nach

Blutkoagulation messen kann. Im Urin wurden zahlreiche Metabolite des TXB2 nachgewiesen,

vor allem jedoch 2,3-Dinor-TXB2 and 11-Dehydro-TXB2.

3.4 Hemmung der Prostaglandinsynthese als

Wirkungsmechanismus antipyretischer Analgetika

Antipyretische Analgetika sind chemisch heterogene Medikamente, die sich aus

pharmakologischer und physikochemischer Sicht in zwei Gruppen einteilen lassen: saure und

nicht saure Antipyretika.

3.4.1 Saure Antipyretika

Zu den sauren Analgetika gehören die Pharmaka, die neben analgetischen und antipyretischen

Effekten in höherer Dosierung auch durch eine ausgeprägte antiphlogistische Wirkung

charakterisiert sind. Nach der Entdeckung der antiinflammatorischen Wirkung der

Glucocorticoide im Jahre 1949 werden die antiphlogistisch wirkenden sauren antipyretischen

Analgetika auch kollektiv als nicht steroidale Antiphlogistika bezeichnet ("nonsteroidal

antiinflammatory drugs", NSAIDs, NSAR). Die entsprechenden Substanzen sind schwache

Säuren (pKA-Wert 3-5,5) wie z.B. Acetylsalicylsäure, 2-Arylpropionsäuren (Profen),

Arylessigsäuren und heterozyklische Ketoenolsäuren. Sie weisen eine ausgeprägte Polarität

sowie eine hochgradige Bindung an Plasmaproteine (>90%) auf (Hinz and Brune, 2007).

Einleitung 18

1971 klärte John R. Vane den Wirkmechanismus von NSAR auf und teilte sich dafür 1982 den

Nobelpreis für Physiologie und Medizin mit den Drs. Sune Bergstrom, Bengt Samuelson. Vane

zeigte, dass die sauren antiphlogistischen Analgetika durch Hemmung der Cyclooxygenase zur

Reduktion proinflammatorischer Prostaglandine führen (Vane, 1971). Die Prostaglandine

erhöhen im traumatisierten Gewebe die Empfindlichkeit von feiner Nervenendigungen

(Nozizeptoren) auf andere Stimuli, indem sie normalerweise nicht erregbare polymodale

Rezeptoren („silent nociceptors“) in einen Zustand leichter Erregbarkeit überführen. Die NSAR

normalisieren die erhöhte Empfindlichkeit Nozizeptoren im geschädigten Gewebe. Die

entsprechenden analgetischen Substanzen üben insofern im strengen Sinne keinen

analgetischen Effekt aus, sondern wirken durch Modulierung der Sensitivität polymodaler

Nozizeptoren „antihyperalgetisch“ (Schaible and Grubb, 1993).

Die Arbeitsgruppe um Brune zeigte anhand radiographischer Studien, dass sich die sauren

Analgetika besonders im Blut, in Leber, Milz und Knochenmark, aber auch in Kompartimenten

mit saurem extrazellulärem pH-Wert, insbesondere in den entzündeten Geweben, in der Wand

des oberen Gastrointestinaltrakts und in den Sammelrohren der Nieren, anreichern (Brune,

1974; Brune et al., 1976; Rainsford et al., 1981). Die Akkumulation saurer Analgetika im

entzündeten Gewebe wird als entscheidender Faktor ihrer antiinflammatorischen Effekte

angesehen. Im entzündeten Gewebe verhindern die sauren NSAR die pathologische

Überproduktion von Prostaglandinen und damit die vor allem von PGE2 ausgelösten

entzündlichen Reaktionen (Brune and Zeilhofer, 1999).

3.4.2 Nicht saure Antipyretika

Nicht saure Analgetika (Paracetamol, Pyrazolinone) üben analgetische und antipyretische

Effekte aus, besitzen jedoch keine nennenswerte antiphlogistische Wirkkomponente. Ihre

Vertreter sind gering polar, neutral (Paracetamol) oder schwach alkalisch (Pyrazolinone) und

nur geringgradig an Plasmaproteine gebunden. Sie verteilen sich schnell und homogen im

Organismus und penetrieren auch die Blut-Hirn-Schranke (Brune et al., 1980). Ebenso weisen

sie nicht die für saure Analgetika typischen Nebenwirkungen im Magen-Darm-Trakt, in der

Niere und bei der Blutgerinnung auf.

Die genaueren Beschreibungen zum Wirkmechanismus von nicht sauren Analgetika erfolgen in

den Abschnitten 3.4.2.1 und 3.4.2.2. Jedoch ist der genaue analgetische

Wirkungsmechanismus dieser Substanzklasse bisher noch nicht vollständig geklärt.

Einleitung 19

3.4.2.1 Wirkungmechanismus von Metamizol

Chemische Bezeichnung: Natrium-[(1,5-dimethyl-3-oxo-

2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-4-yl)-

N-methylamino]methansulfonat

Synonym: Dipyron, Noramidopyrin, Novaminsulfon

Summenformel: C13H16O4N3NaS

Molekulargewicht: 351,4 g/mol

Abbildung 2: Strukturformel von Metamizol Natrium.

Metamizol ist ein häufig verschriebenes, potentes spasmolytisches Analgetikum und

Antipyretikum (Carlsson et al., 1986; Vlahov et al., 1990). Ein antiphlogistischer Effekt tritt

jedoch erst bei höheren Dosierungen auf (Gelgor et al., 1992). Indikationen für dieses

Medikament sind starke akute und chronische Schmerzen, sowie Tumorschmerzen (Aventis,

2003). Auf Grund der krampflösenden Wirkung wird es zudem häufig bei kolikartigen

Schmerzen im Gastrointestinaltrakt und Urogenitaltrakt eingesetzt. Die Anwendung ist

beschränkt auf Schmerzzustände, bei denen eine Therapie mit NSAR nicht ausreichend ist.

Diese Anwendungsbeschränkung und die Einführung der Verschreibungspflicht im Jahre 1987

sind Folgen des in den 70er Jahren entdeckten Zusammenhangs zwischen der Einnahme von

Metamizol und dem Auftreten einer Agranulozytose. Als Folge der daraus entstandenen

kontroversen Diskussion über das Nutzen-Risiko-Potential von Metamizol ist der Arzneistoff in

vielen Ländern gänzlich vom Markt verschwunden. Währenddessen kommt dieser Arzneistoff

besonders in Entwicklungsländern zur Anwendung und ist dort ohne Verschreibung erhältlich.

Die Inzidenz dieser unerwünschten Effekte ist dennoch seltener als bei den NSAR (Maj and

Centkowski, 2004; Ibanez et al., 2005). Somit ist Metamizol ein weitgehend sicheres

Medikament, dessen analgetische Potenz mit schwachen Opiaten vergleichbar ist.

Metamizol ist in oralen und rektalen Darreichungsformen verfügbar (Aventis, 2003). Durch

Einführung einer Sulfonsäurestruktur und Bildung des Natriumsalzes konnte eine waserlösliche

Formulierung erzielt werden. Dies erlaubt auch intravenöse Applikationen dieses Medikamentes.

Da nach schneller intravenöser Injektion von Metamizol Schockreaktionen mit tödlichem

Ausgang beschrieben worden sind, sollte die Substanz langsam injeziert und unter strenger

Indikationsstellung i.v. eingesetzt werden.

Der Metabolismus von Metamizol im Körper führt über zahlreiche Biotransformationsprodukte.

Nach der oralen Verabreichung von Metamizol-Natriumsalz (Prodrug von Metamizol)

(Abbildung 2) erfolgt eine schnelle nicht enzymatische Hydrolyse im Gastrointestinaltrakt zu 4-

NN

NCH3

CH3 O

CH2SO3Na

CH3

Einleitung 20

Methylaminoantipyrin (4-MAA) (Abbildung 3, links), das nahezu vollständig resorbiert wird.

(Brune, 1988). Anschließend wird 4-Methylaminoantipyrin zu 4-Formylaminoantipyrin (4-FAAP)

enzymatisch oxidiert (Noda et al., 1976), sowie zu 4-Aminoantipyrin (4-AA) (Abbildung 3,

rechts) demethyliert, das durch eine polymorphe N-Acetyl-Transferase in der Leber zum

4-Acetylaminoantipyrin (4-AAA) acetyliert wird. Das Ausmaß dieses Metabolisierungsschrittes

ist vom Acetylierungsphänotyp des Patienten abhängig (Zylber-Katz et al., 1992). Diese vier

Hauptmetaboliten (4-MAA, 4-AA, 4-FAAP, 4-AAA) von Metamizol stellen ungefähr 65% der

verabreichten Dosis dar (Volz and Kellner, 1980). In sehr geringem Maße wird 4-Aminoantipyrin

auch zum atypischen Metaboliten 4-Hydroxyantipyrin umgesetzt (Reinhardt et al., 2006). Nach

hohen Dosen kann im Urin der rot gefärbte, jedoch harmlose Metabolit Rubazonsäure

nachgewiesen werden (Reinhardt et al., 2006).

Abbildung 3: Strukturformeln der untersuchten Metamizolmetaboliten: 4-Methylaminoantipyrin (links) und 4-Aminoantipyrin (rechts).

4-MAA und sein demethyliertes Derivat 4-AA werden als pharmakologisch wichtigste Metabolite

diskutiert (Weithmann and Alpermann, 1985). Sie sind, chemisch gesehen, schwach basische

Amine. Aus diesem Grund findet eine Anreicherung im leicht sauren, entzündeten Gewebe wohl

kaum statt. (Frolich et al., 1986). Daher kann man wahrscheinlich nur bei Dosierungen, die

oberhalb des therapeutischen Bereichs liegen, eine antiphlogistische Wirkung beobachten.

Weiterhin sind 4-MAA und 4-AA hydrophil und verteilen sich gleichmäßig in allen wässrigen

Kompartimenten. Sie werden bis zu 58 % bzw. 48 % an Plasmaproteine gebunden. Ihre

Plasmahalbwertzeiten variieren interindividuell sehr stark. Sie ist im Falle des 4-AA vom

Acetylierungsphänotyp abhängig und liegt deshalb im Bereich von 3,7 bis 8,1 Stunden. Die von

enzymatischen Reaktionen unabhängige Plasmahalbwertzeit des 4-MAA ist mit ca 2,5 Stunden

dagegen relativ kurz (Zylber-Katz et al., 1992).

Bis jetzt wurde angenommen, dass die antinozizeptive Wirkung von Metamizol wenigsten zum

Teil über einen Wirkmechanismus im zentralen Nervensytem vermittelt wird. (Carlsson et al.,

1986; Gelgor et al., 1992; Neugebauer et al., 1994; Shimada et al., 1994; Tortorici and Vanegas,

1995; Beirith et al., 1998). Da 4-MAA als auch 4-AA die Blut-Hirn-Schranke sehr gut

überwinden können, werden nach oraler Einnahme von Metamizol (1000 mg) maximale

Konzentrationen von 5-30 µg/ml (4-MAA) bzw. 1-7 µg/ml (4-AA) in der cerebrospinalen

NN

NCH3

CH3 O

CH3

H

NN

NCH3

CH3 O

H

H

Einleitung 21

Flüssigkeit erreicht. (Cohen et al., 1998). In Übereinstimmung damit wurde eine zeitabhängige

Senkung der Thromboxan B2-Konzentrationen in der cerebrospinalen Flüssigkeit bei Patienten,

die Metamizol erhalten hatten, nachgewiesen (Levy et al., 1998). Das unterstützt ebenfalls

einen zentral vermittelten Wirkungsmechanismus von Metamizol, der erstmalig von Tomek

bereits 1955 vermutet wurde. (Tomek, 1955). Die Hemmung der Prostaglandinsynthese wurde

zusätzlich dazu auch an anderen Orten des zentralen Nervensystems festgestellt. (Dembinska-

Kiec, 1976; Yaksh et al., 2001). Eine Bindung von 4-MAA, 4-AA bzw. Metamizol an Opioid-

Rezeptoren ist dagegen eher unwahrscheinlich. (Masuko et al., 1979; Goldenberg and De Boni,

1983).

Es wurde jedoch gezeigt, dass Metamizol auch die periphere Synthese von Eicosanoiden

einschließlich TXB2 in menschlichen Blutplättchen inhibiert. (Eldor et al., 1984; Weithmann and

Alpermann, 1985; Frolich et al., 1986; Geisslinger et al., 1996).

Eine periphere Wirkungsweise wurde 1985 von Lorenzetti postuliert, da er eine durch Carageen,

PGE2, Isoprenalin und Calciumchlorid ausgelöste Hyperalgesie durch Metamizol unterdrückten

konnte. Dabei wurde hauptsächlich PGE2 die Hauptrolle für die Hyperalgesie zugeschrieben.

(Lorenzetti and Ferreira, 1985). Weitere Studien konnten eine Hemmung der PGE2-Synthese in

menschlicher Magenschleimhaut (Peskar et al., 1986) und eine Absenkung der PGE2-

Konzentration im Magensaft nachweisen. (Frolich et al., 1986). Untersuchungen an Astrozyten

und Makrophagen zeigten, dass 4-MAA ein vergleichbares Hemmpotential der

Prostaglandinsynthese in beiden Zelltypen aufwies. (Lanz et al., 1986). In Übereinstimmung mit

diesen früheren Erkentnissen verhindert Metamizol, wie vor kurzem gezeigt wurde, die

enzymatischen Aktivitäten der beiden Cyclooxygenasen-Isoformen sowohl in gereinigten

Enzymen, als auch in verschiedenen peripheren Zellen (Campos et al., 1999).

Einleitung 22

3.4.2.2 Wirkungmechanismus von Paracetamol

Chemische Bezeichnung: 4´-Hydroxyacetanilid

Synonym: Acetaminophen

Summenformel: C8H9NO2


Abbildung 4: Strukturformel von Paracetamol

Paracetamol, ist eines der weltweit am meisten verwendeten freiverkäuflichen, antipyretischen

und analgetischen Arzneimittel. Es wird als Therapeutikum erster Wahl gegen den

Osteoarthrose-assoziierten Schmerz (Schnitzer, 2002) empfohlen. Paracetamol gehört zu den

Aniliden und ist ein p-Aminophenol-Derivat. Es kann oral, rektal und intravenös appliziert

werden. Nach oraler Gabe erfolgt eine schnelle und vollständige Resorption sowie

gleichmäßige Verteilung in alle Gewebe. Die Inaktivierung erfolgt in der Leber durch die schnell

sättigbare Konjugation an Glucuron- oder Schwefelsäure. Ein geringerer Teil wird über das

Cytochrom P-450 Enzyme zum giftigen N-Acetyl-p-benzochinonimin metabolisiert, das über

Glutathion entgiftet und an Cystein gebunden ausgeschieden wird. Bei Überdosierung steht

nach gewisser Zeit nicht genügend Cystein für die Entgiftung zur Verfügung. Die Elimination

erfolgt mit einer HWZ von ca. zwei Stunden hauptsächlich renal. Paracetamol besitzt bei

therapeutischer Dosierung (4 g pro Tag bei Erwachsenen, 15 mg pro kg Körpergewicht am Tag

bei Kindern) keine nennenswerten Nebenwirkungen. Bei akuter Überdosierung (bei Dosen über

10 g pro Tag) tritt Hepatotoxizität auf, die zu schweren, meist tödlich verlaufenden

Leberzellnekrosen führt (Prescott et al., 1971). Trotz der Tatsache, dass Paracetamol schon vor

100 Jahren entdeckt wurde sowie auch seit ungefähr 50 Jahren vielfältig verwendet wird, ist der

komplette Wirkungsmechanismus immer noch unklar. Es wird allgemein angenommen, dass

Paracetamol zentral wirkt und bestenfalls ein schwacher Inhibitor der durch COX-1 und COX-2

vermittelten Prostaglandinsynthese ist (Botting, 2000). Dieses Konzept beruht auf der frühen

Arbeit von Flower und Vane, die zeigten, dass Paracetamol die Prostaglandin-Synthese im

Gehirn zehnfach stärker hemmt als in der Milz (Flower et al., 1972). Jedoch wurde diese

Entdeckung durch spätere Studien (Lanz et al., 1986; Warner et al., 2004) nicht bestätigt.

Außerdem stellte es sich heraus, dass Paracetamol keine messbare Inhibition der Bildung von

Prostaglandinen in aufgeschlossenen Zellpräparationen jedoch aber eine deutliche Hemmung

in intakten Zellen hervorruft (Graham and Scott, 2005).

Lucas et al. konnten zeigen, dass die Reduktion der nervalen Prostaglandin-Synthese durch

Paracetamol nicht auf transkriptioneller Ebene sondern auf Proteinebene reguliert wird (Lucas

et al., 2005). Als weitere Einflussgröße konnte die zelluläre Konzentration an Peroxiden

identifiziert werden. Bei niedriger Peroxidkonzentration ist das COX-Inhibitionspotential des

Einleitung 23

Paracetamols deutlich größer, da hohe Peroxidkonzentration die reduzierenden Eigenschaften

von Paracetamol antagonisieren und gleichzeitig die COX in einen höheren Oxidationszustand

überführen (Lucas et al., 2005). Auf Grundlage der pH-Abhängigkeit wurde ebenfalls

vorgeschlagen, dass Paracetamol keine Affinität zum aktiven Zentrum der COX habe, sondern

die COX durch Reduktion der aktiven oxidierten Form in die inaktive Form überführe (Lucas et

al., 2005). Da das Nervensystem über einen niedrigen Oxidationsstatus verfügt, könnte das

eine plausible Erklärung für die Wirkung im zentralen Nervensystem sein.

Auch wurde die Annahme, dass die Wirkung von Paracetamol auf die Hemmung von COX-3

zurückzuführen ist (Chandrasekharan et al., 2002), aus verschiedenen Gründen (Kis et al.,

2005) verworfen. Dies erfolgte vor allem aufgrund der Tatsache, dass die Existenz einer

funktionellen menschlichen COX-3 in Frage gestellt wurde. Im Falle der COX-3, ein Produkt des

COX-1 Genes, führt der Verbleib des Intron 1 in der COX-3 mRNA zu einem kürzeren, nicht

funktionellen Protein (Dinchuk et al., 2003; Schwab et al., 2003a).

Qin et al. berichteten über eine niedrige Expression von drei Splice-Varianten der COX-1 in

menschlichen Geweben (Qin et al., 2005). Es konnte aber kein relevanter Unterschied

zwischen der Paracetamol-vermittelten Hemmung von COX-1 und der Intron 1-enthaltenden

Splicevariante nachgewiesen werden. Obwohl die Aktivität der caninen COX-3 vollständig durch

Paracetamol inhibierbar ist, trifft diese Erklärung für die pharmakologischen Wirkungen des

Paracetamols beim Menschen nicht zu (Schwab et al., 2003b; Lucas et al., 2005). Deshalb wird

die Forschung auf dem Gebiet der Identifizierung der Wirkmechanismen von Paracetamol

weiter fortgesetzt.

Einleitung 24

3.5 Cyclooxygenasehemmer

Die fibersenkend wirkenden Analgetika werden als Cyclooxygenaseinhibitoren (COX-Inhibitoren,

COX-Hemmer) bezeichnet, weil sie ihre Wirkung über eine periphere und / oder zentrale

Hemmung der Cyclooxygenase entfalten. Je nach den bevorzugt gehemmten Isoenzymen

werden nicht selektive und selektive Inhibitoren unterschieden.

Die analgetischen, antipyretischen und antiphlogistischen Wirkungen nicht steroidaler

Antirheumatika (NSAR) beruhen im Wesentlichen auf einer unselektiven Hemmung der beiden

bekannten Cyclooxygenaseisoformen COX-1 und COX-2. Deswegen werden diese

Medikamente auch als nicht selektive Cyclooxygenase-Inhibitoren bezeichnet. Seit einiger Zeit

steht neben den traditionellen nicht steroidalen antiinflammatorischen Substanzen die Klasse

der selektiven COX-2-Hemmer (Coxibe) zur Verfügung. Eine Substanz wird als ein selektiver

COX-2-Inhibitor betrachtet, wenn sie die COX-2 hemmt, aber keine klinisch relevante COX-1-

Hemmung in therapeutischen Dosen verursacht.

Die 3D-Strukturen der COX-1 und COX-2, die mit Hilfe von Röntgenstrukturanalysen ermittelt

wurden, ermöglichten Einblicke in den molekularen Wirkmechanismus von NSAR. Diese

Erkenntnisse führten auch zu einem verbesserten Verständnis darüber wie die Selektivität von

Hemmstoffen erreicht wird. Die Daten zeigten, dass NSAR den hydrophoben Enzymkanal der

COX-1 in der Mitte blockieren. Dies wird über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem

Arzneistoff und dem polarem Arginin an der Position 120 vermittelt. Arginin ist an dieser

Position sowohl in COX-1 als auch in COX-2 vorzufinden. Kritisch für die Selektivität von COX-

Hemmer ist die Aminosäureposition 523. In COX-1 befindet sich an dieser Stelle ein Isoleucin

wogegen in COX-2 ein Valin vorzufinden ist. Der Unterschied an dieser Position führt dazu,

dass die COX-2 selektiv durch Coxibe gehemmt werden kann (Hawkey, 1999).

Für die Bestimmung der COX-1 / COX-2-Selektivität hat sich der von Patrono und Mitarbeitern

beschriebene „Vollblutassay“ als vorteilhaft erwiesen. (Patrignani et al., 1994). Mit diesem

Assay (siehe Abschnitt 5.2.2) wird die COX-1- und COX-2-Aktivität eines Hemmstoffes an

klinisch relevanten humanen Blutzellen bestimmt (COX-1: Thrombozyten bei der Blutgerinnung,

COX-2: Monozyten nach Lipopolysaccharidstimulation). Dieser Test ermöglicht die

Untersuchung der COX-Selektivität unter physiologischen Bedingungen bei denen die

Plasmaproteinbindung berücksichtigt wird. (Patrignani et al., 1997).

Einleitung 25

3.5.1 Nicht selektive Cyclooxygenasehemmer

Untersuchungen mit dem in Abschnitt 5.2.2 beschriebenen Versuchsystem zeigten, dass keines

der derzeit therapeutisch eingesetzten NSAR die COX-2 selektiv hemmt (Patrignani et al.,

1997). Einige Substanzen (Diclofenac, Aceclofenac, Meloxicam) weisen eine bevorzugte

Hemmung des COX-2-Enzyms auf und können deshalb als präferentielle Hemmer der COX-2

betrachtet werden (Tabelle 1) (Hinz and Brune, 1999).

Tabelle 1: Relative Potenz einiger analgetischer, antipyretischer, antiphlogistischer Wirkstoffe hinsichtlich ihrer COX-1 und COX-2- Hemmungen.

Substanz COX-1 / COX-2 IC50-Ratio

Ibuprofen 0,50

Naproxen 0,56

S-Ketoprofen 0,61

Flurbiprofen 1,00

Indomethacin 1,90

Piroxicam 3,10

Meloxicam 11,16

Nimesulid 17,70

Diclofenac 18,90

Die IC50-Werte wurden ex-vivo mittels des humanen Vollblutassays (siehe Abschnitt 3.5) bestimmt. Die Daten stammen aus der Arbeit von Patrignani (Patrignani et al., 1997). Für die aufgeführten Substanzen ist das Verhältnis der COX-1- zur COX-2-Hemmung angegeben (Quotient IC50 COX-1 bzw. IC50 COX-2). Ist der Quotient größer als 1, dann ist diese Substanz durch eine vergleichsweise stärkeren COX-2-Hemmung gekennzeichnet.

Als unerwünschte Begleiterscheinungen der nicht selektiven COX-Inhibitoren, die sich

besonders im Bereich des oberen Gastrointestinaltraktes manifestieren, treten

Schleimhautschädigungen, petechiale Blutungen, Erosionen sowie Ulzerationen auf (Graham

and Smith, 1988; Langman, 1989; McCarthy, 1989; Cheatum et al., 1999).

Einleitung 26

3.5.1.1 Thrombozytenhemmende und potenziell kardioprotektive Wirkung

von Naproxen

Chemische Bezeichnung: (S)-2-(6'-Methoxy-2'-naphthyl)-propionsäure

Synonym: Naproxenum

Summenformel: C14H14O3


Abbildung 5: Strukturformel von Naproxen

Das Arylpropionsäurederivat Naproxen ist ein gut verträgliches NSAR mittlerer Wirkstärke. Es

wird nach oraler Gabe des Natriumsalzes rasch und gut resorbiert, maximale

Plasmakonzentration wird bereits nach einer Stunde erreicht. Infolge der langen

Serumhalbwertzeit von 13-18 Stunden braucht Naproxen auch bei chronischen entzündlichen

Schmerzen nur ein- bis zweimal täglich eingenommen zu werden.

Im Laufe der letzten Jahre entwickelten sich Bedenken hinsichtlich der kardiovaskulären

Sicherheit von selektiven Cyclooxygenase-2-Hemmern und nicht steroidalen Antirheumatika bei

höheren Dosierungen (FitzGerald and Patrono, 2001; Tegeder and Geisslinger, 2006; Hinz and

Brune, 2007). Tatsächlich konnte in gut geplanten, Plazebo-kontrollierten Studien gezeigt

werden, dass die langfristige Einnahme von COX-2-Hemmern bei Patienten, die anamnestisch

ein kolorektales Adenom aufwiesen, mit erhöhten kardiovaskulären Nebenwirkungen in

Verbindung gebracht wurden (Bresalier et al., 2005; Solomon et al., 2005). Außerdem konnte

bei Patienten mit einem erhöhten kardiovaskulären Risiko die Kurzzeitbehandlung mit

Valdecoxib oder Parecoxib mit einer höheren Anzahl von starken thromboembolischen

Ereignissen assoziiert werden (Nussmeier et al., 2005).

Obwohl keine plazebokontrollierten, randomisierten Studien durchgeführt wurden, um das

kardiovaskuläre Risiko von traditionellen NSAR zu untersuchen, zeigten bevölkerungsbasierte

Fall-Kontroll-Studien deutlich, dass der gegenwärtige Gebrauch von COX-2 Hemmstoffen und

traditionellen NSAR mit einer erhöhten Anzahl von Myokardinfarkten assoziiert war (Hippisley-

Cox and Coupland, 2005). Außerdem demonstrierte die kürzlich veröffentlichte MEDAL-Studie,

dass NSAR (Diclofenac) und COX-2-Hemmer (Etoricoxib) ein vergleichbares kardiovaskuläres

Risikopotential aufwiesen (Cannon et al., 2006). Deshalb wurde vorgeschlagen, dass keine

Unterscheidung zwischen diesen Gruppen von Medikamenten hinsichtlich der kardiovaskulären

Toxizität notwendig ist. Die ursprüngliche Annahme, dass NSAR durch die Hemmung der

prothrombotischen COX-1 zur Senkung des kardiovaskulären Risikos führen sollte, konnte nicht

bestätig werden, weil die COX-1-Aktivität in Thrombozyten über 95% unterdrückt werden muss,

um die Hemmung der Thrombozytenaggregation hervorzurufen (Reilly and FitzGerald, 1987).

Einleitung 27

Jedoch wurde in einer Meta-Analyse gezeigt, dass das Auftreten von ernsten vaskulären

Ereignissen von Naproxen mit Placebo vergleichbar ist (Kearney et al., 2006).

3.5.2 Selektive Cyclooxygenasehemmer

Viele unerwünschte Effekte der NSAR wie z.B. Magen- und Darm-Ulzerationen, Blutungen und

Thrombozytenfunktionsstörungen wurden mit einer Hemmung der COX-1-abhängigen

protektiven Prostaglandine assoziiert, wohingegen die erwünschten therapeutischen,

antientzündlichen, schmerzlindernden und fiebersenkenden Effekte dieser Verbindungen mit

einer Hemmung der COX-2-abhängigen proinflammatorischen Prostaglandine in Verbindung

gebracht wurden. Als Folge entstand die Hypothese, dass die selektive Hemmung der COX-2

die traditionellen therapeutischen Wirkungen der NSAR ohne deren unerwünschten

Nebenwirkungen hervorrufen könnte. Diese Idee führte letztlich zur Entwicklung von selektiven

COX-2-Hemmstoffen.

Die selektiven COX-2-Inhibitoren, die sich zurzeit in klinischer Anwendung befinden, sind

Celecoxib (Sulfonamid), Etoricoxib (Methylsulfon) und Parecoxib, ein intravenös applizierbares

Prodrug von Valdecoxib (Sulfonamid).

Tabelle 2: Relative Potenz der selektiven COX-Inhibitoren hinsichtlich ihrer COX-1- und COX-2- Hemmungen.

Substanz COX-1 / COX-2 IC50-Ratio

Celecoxib 30

Etoricoxib 344

Lumiracoxib 515

Die Daten wurden ex-vivo mit dem humanen Vollblutassay generiert (Brune and Hinz, 2004). Lumiracoxib weist dabei die höchste COX-2-Selektivität auf, gefolgt von Etoricoxib und Celecoxib.

Die nicht saure COX-2-Hemmer Celecoxib und Etoricoxib verteilen sich homogen im Körper.

Aufgrund seiner hohen Lipophilie wird Celecoxib relativ langsam und unvollständig resorbiert.

Etoricoxib wird dagegen schnell resorbiert, jedoch langsam aus dem Körper eliminiert (t1/2: ca.

20–26 h). (Hinz et al., 2006). Die unterschiedlichen Pharmakokinetiken der Coxibe sind

Grundlage für die verschiedenen Indikationen der entsprechenden COX-2-Hemmstoffe. So ist

z.B. Celecoxib für die Behandlung von akuten Schmerzen aufgrund seiner langsamen

Resorption und des variablen First-pass-Metabolismus ungeeignet. Hingegen erscheint

Etoricoxib aufgrund seiner langen Plasmahalbwertszeit besonders für Indikationen, bei denen

eine verlängerte Wirkdauer (akute Gichtarthritis, rheumatische Arthritis) erforderlich ist, sehr

Einleitung 28

vielversprechend. Parecoxib, als ein intravenös applizierbares Coxib ist für die Behandlung des

postoperativen Schmerzens gut geeignet. Ein anderer hochselektiver Cyclooxygenase-2-

Hemmer, der für die symptomatische Behandlung von Osteoarthritis und akutem Schmerz

verwendet wurde ist das Phenylacetylsäurederivat Lumiracoxib (Bannwarth and Berenbaum,

2007). Lumiracoxib wurde in Januar 2007 in Deutschland zugelassen, jedoch bereits im

Dezember 2007 wieder vom Markt zurückgenommen.

Einleitung 29

F Cl

NH

COOH

H3C

3.5.2.1 Lumiracoxib ein hochselektiver COX-2-Hemmer

Chemische Bezeichnung: 2-((2-chloro-6-fluorophenyl)amino)-

5-methyl- Benzenessigsäure

Synonym: COX189, Prexige®

Summenformel: C15H13ClFNO2


Abbildung 6: Strukturformel von Lumiracoxib

Lumiracoxib unterscheidet sich von anderen existierenden selektiven COX-2-Hemmer durch

das Fehlen eines Schwefelanteils und durch eine Carboxylgruppe wodurch es leicht saure

Eigenschaften (pKa 4,7) aufweist. Als ein chemisches Analogon zu Diclofenac besitzt

Lumiracoxib im Vergleich zu den anderen selektiven COX-2-Inhibitoren (Abschnitt 3.5.2)

einzigartige pharmakokinetische Eigenschaften. Es wird rasch resorbiert (tmax 2 h), besitzt eine

relativ kurze Plasmahalbwertzeit (Brune and Hinz, 2004) und weist anhaltend (12 bis 24 h nach

Einnahme) hohe Konzentrationen in der Synovial-Flüssigkeit bei Patienten mit rheumatoider

Arthritis auf (Scott et al., 2004). Lumiracoxib wird durch die Oxidation von Cytochrom P450 2C9

nahezu vollständig metabolisiert (Mangold et al., 2004). Die Hauptmetaboliten von Lumiracoxib

im Plasma, die durch die Oxidation der 5-Methyl-Gruppe, oder Hydroxylierung seines

dihaloaromatischen Rings entstehen, sind der 5-Carboxy, 4'-Hydroxy und 4'-Hydroxy-5-Carboxy

Derivat (Esser et al., 2005).

Unter den verfügbaren COX-2-Hemmstoffen ist Lumiracoxib der einzige Arzneistoff für den in

einer großen Patientenstudie Vorteile hinsichtlich gastrointestinaler Nebenwirkungen bei

Patienten mit Osteoarthritis demonstriert werden konnten. Lumiracoxib senkte dabei im

Vergleich zu Ibuprofen und Naproxen die Häufigkeit von Ulkuskomplikationen im oberen

Bereich des Gastrointestinaltraktes um mehr als 70% (Schnitzer et al., 2004b).

In mehreren Ländern wurde Lumiracoxib mit den Dosierungen von 200 mg und 400 mg zur

Behandlung der Osteoarthritis bzw. des akuten Schmerzens zugelassen. Im Falle beider

Dosierungen wurde die für die COX-2-Hemmung notwendige Plasmakonzentration deutlich

überschritten (Cheremina et al., 2006; Hinz et al., 2007). Diese Beobachtung stimmt mit einer

bereits veröffentlichten klinischen Studie überein. Dabei wurden Patienten mit einer Knie- oder

Hüftosteoarthritis hinsichtlich der Lumiracoxibdosis randomisiert. Die Patienten nahmen

Lumiracoxib von 50 mg, 100 mg oder 200 mg zweimal täglich oder 400 mg einmal täglich und

dabei wurde eine vergleichbare Schmerzlinderung beobachtet (Schnitzer et al., 2004a).

Bedauerlicherweise fehlt eine systematische Analyse bezüglich der dosisabhängigen

therapeutischen Effekte von Lumiracoxib.

Einleitung 30

Im August 2007 hat Australia´s Therapeutic Goods Administration die Zulassung von

Lumiracoxib auf Grund von acht Fällen von Lebertoxizität, einschließlich zweier Todesfälle

zurückgenommen. Diese Patienten hatten Lumiracoxib in täglichen Dosen von ≥ 200 mg

eingenommen (Therapeutic Goods Administration, 13. August 2007; Burton, 2007). Obwohl die

Daten des Herstellers (Novartis, 2007) darauf schließen lassen, dass die in Europa

zugelassene Dosierung von einmal täglich 100 mg Lumiracoxib im Vergleich zu anderen NSAR

nicht mit einem erhöhten hepatischen Risiko assoziiert ist (Rubenstein and Laine, 2004), hat die

European Medicines Agency (EMEA) ebenfalls wegen einiger nicht tödlicher Fälle von

Lebertoxizitäten die Rücknahme von Lumiracoxib im Dezember 2007 empfohlen (European

edicines gency, 13 Dezember 2007).

Ziele 31

4 Ziele

Korrelationsanalysen zwischen pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Parametern

aus menschlichen Blutproben ermöglichen es verschiedene Zielsetzungen zu untersuchen. Das

primäre Bestreben war es, einen Beitrag zur Aufklärung der COX-inhibierenden Eigenschaften

der nicht sauren Antipyretika Metamizol und Paracetamol nach oraler Gabe und somit zu ihrem

Wirkungsmechanismus zu leisten. Ein weiteres Ziel war die Untersuchung des Einflusses der

verschiedenen Dosierungen von Lumiracoxib auf die Dauer und das Ausmaß der COX-2-

Hemmung nach einmaliger oraler Einnahme, um die kleinste effektive Dosis für die

analgetische Wirkung zu bestimmen. Zuvor musste deshalb eine analytische Methode zur

Bestimmung von Lumiracoxibplasmakonzentration entwickelt und validiert werden. Als letzte

Fragestellung wurde die thrombozytenhemmende und potenziell kardioprotektive Wirkung des

nicht selektiven sauren Antipyretikums Naproxen, untersucht. Genauere Beschreibung der

Zielsetzungen erfolgt im Weiteren.

4.1 Untersuchungen zum Wirkungmechanismus von Metamizol

Auf der Basis von IC50-Werten, die in in-vitro-Studien von Campos (Campos et al., 1999)

ermittelt wurden, kann man vermuten, dass Metamizol auch in-vivo eine selektive COX-2-

Hemmung hervorrufen könnte - eine potentiell wichtige Frage, die das reduzierte Risiko

gastrointestinaler Blutungen nach Verabreichung von Metamizol im Vergleich zu

Acetylsalicylsäure und anderen NSAR erklären könnte (Laporte and Carne, 1987; Laporte et al.,

1991). Jedoch fehlte bisher der Nachweis aus in-vivo Studien. Weiterhin bestand Unklarheit

bezüglich der Hemmung peripherer COX-Enzyme durch Metamizol. Dementsprechend fehlt

immer noch eine ausführliche vergleichende Analyse, die sich mit der Selektivität,

Dosisabhängigkeit und Dauer der Hemmung peripherer COX-Enzyme in Probanden nach oraler

Verabreichung von Metamizol beschäftigt. Überdies, trotz der wohlbekannten hemmenden

Wirkung des Metaboliten 4-Methylaminoantipyrin (4-MAA) sowie der Inaktivität der Metaboliten

4-Acetylaminoantipyrin und 4-Formylaminoantipyrin auf die Produktion von Prostanoiden

(Weithmann and Alpermann, 1985) bleibt die Frage unbeantwortet, ob 4-Aminoantipyrin (4-AA)

nach Einnahme von Metamizol zur Hemmung der Eicosanoiden-Bildung beiträgt (Levy et al.,

1995). Aus all diesen Gründen untersuchte die vorliegende Studie den Beitrag der

Hauptmetaboliten (4-MAA und 4-AA) zum Wirkungsmechanismus von Metamizol hinsichtlich

der Hemmung der Prostanoid-Synthese.

Ziele 32

4.2 Untersuchungen zur Wirkungsmechanismus von Paracetamol

Das pharmakologische Profil von Paracetamol ist dem der selektiven COX-2 Hemmer (Coxibe)

sehr ähnlich. Wie Coxibe, ruft Paracetamol bei oralen empfohlenen Einzeldosen keine toxische

Wirkung im Gastrointestinaltrakt hervor (Garcia Rodriguez and Hernandez-Diaz, 2001), hemmt

nicht die Thrombozytenaggregation (Mielke, 1981; Catella-Lawson et al., 2001) und provoziert

kaum Bronchokonstriktionen in Aspirin-empfindlichen Asthmatikern (Jenkins et al., 2004). Die

Tatsache, dass Paracetamol funktionell den Coxiben ähnlich ist, führte zur Untersuchung der

Hypothese, ob Paracetamol durch selektive COX-2 Hemmung wirkt.

4.3 Entwicklung und Validierung einer analytischen Methode zur

Bestimmung von Lumiracoxib in Plasma von menschlichen

Probanden

Um die Plasmakonzentrationen von Lumiracoxib in weitere Studie zu bestimmen, wurde es

nötig eine passende dafür Methode zu entwickeln und zu validieren.

4.4 Untersuchungen zur COX-2-Hemmung durch Lumiracoxib in

verschiedenen Dosierungen

Berichte über eine dosisabhängige Lebertoxizität von Lumiracoxib führten in jüngster Zeit zu

einem gesteigerten Interesse an einer Behandlung mit niedrig dosiertem Lumiracoxib.

In Anbetracht des gastrointestinalen Vorteiles von Lumiracoxib, seiner offenbar

dosisabhängigen hepatischen Toxizität (Schnitzer et al., 2004b) sowie einer möglichen

Überdosierung in einigen Ländern bei langfristigem Gebrauch, wurden Dosierungen unter

100 mg für die Schmerztherapie in Betracht gezogen. Die deshalb durchgeführte vorliegende

Studie ist eine Analyse, die die Dauer und das Ausmaß der COX-2-Hemmung in Abhängigkeit

von der Lumiracoxibdosis (50 mg, 100 mg bzw 200 mg) untersuchte.

4.5 Untersuchung zur thrombozytenhemmenden und potenziell

kardioprotektiven Wirkung von Naproxen

Während der letzten Jahre, wurde eine potenzielle kardioprotektive Wirkung für die 2-

Arylpropionsäure Naproxen diskutiert. Eine Meta-Analyse von 138 veröffentlichten und

unveröffentlichten, randomisierten Untersuchungen (Kearney et al., 2006) deutete daraufhin,

dass das Auftreten von ernsten vaskulären Ereignissen zwischen einem COX-2-Hemmer und

Ziele 33

jedem NSAR außer Naproxen ähnlich ist, und dass das Risiko von Naproxen mit Placebo

vergleichbar ist. Da in publizierten Studien bereits vorgeschlagen wurde, dass die 95%-ige

Hemmung der TXB2-Synthese im Serum die Thrombozytenfunktion maßgeblich beeinflußt

(Reilly and FitzGerald, 1987), könnte ein möglicher Mechanismus für die potenzielle

kardioprotektive Wirkung von Naproxen die ausgeprägte und lang andauernde Hemmung der

COX-1 sein.

Die vorliegende Studie untersuchte, ob Dosierungen von freiverkäuflichem (OTC) Naproxen

Natrium eine ausreichende COX-1-Hemmung nach einmaliger Gabe und im Steady-state

erzeugen können. Parallel dazu wurde auch die COX-2-Hemmung untersucht.

Experimenteller Teil 34

5 Experimenteller Teil

5.1 Materialien

5.1.1 Lösungen

Natriumacetat Puffer 30 mM 2,46 g Natriumacetat in 1 l H2O, mit Essigsäure auf pH 5,6

einstellen

Phosphatpuffer 20 mM 3,12 g Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat in 1 l H2O, mit

Phosphorsäure auf pH 2,5 einstellen

PBS pH=7,4 NaCl 40 g

KCl 1 g

KH2PO4 1 g

Na2HPO4 × 12H2O 14,5 g

In 1 l H2O, autoklavieren

SDS-Polyacrylamidgel 10% Acrylamid 30 % / Bis 37,5 : 1 10,0 ml

1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 1,5 ml

SDS 10 % 300 µl

Tetramethylethylendiamin 12,0 µl

Milliporwasser 11,9 ml

Ammoniumperoxodisulfat 10 % 300 µl

Solubilisierungspuffer HEPES pH 7,4 50 mM

NaCl 150 mM

EDTA 1 mM

Triton® X-100 1 % (v/v)

Glyzerin 10 % (v/v)

Phenylmethylsulfonyl Fluorid 1 mM

Leupeptin 1 µg/ml

Aprotinin 10 µg/ml

Magermilchlösung Milchpulver 5 % in PBS

Trichloressigsäure 0,05 % Trichloressigsäure 0,5 g in 1 l H2O


5.1.2 Chemikalien

Acetaminophen Sigma, Steinheim, Deutschland

Acetonitril (HPLC Grade) Merk, Darmstadt, Deutschland

Antipyrin Sigma, Steinheim, Deutschland

Aspirin Sigma, Steinheim, Deutschland

ß-actin Calbiochem, Bad Soden, Deutschland

COX Inhibitor Screening Assay Cayman Chemicals, Ann Arbor,

Massachussets, USA

COX-2-Antikörper BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland

Diethylether (für LC) Merk, Darmstaft, Deutschland

Dimethylsulfoxid Merk, Darmstaft, Deutschland

Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merk, Darmstaft, Deutschland

Essigsäure Merk, Darmstadt, Deutschland

Fab-spezifische Antimaus IgG Sigma, Steinheim, Deutschland

Flurbiprofen Sigma, Steinheim, Deutschland

Kaliumdihydrogensphosphat Merk, Darmstaft, Deutschland

Lumiracoxib Novartis, East Hanover, USA

Lipopolysaccharid von Escherichia coli

(Serotyp 026:B6) Sigma, Steinheim, Deutschland

Methanol Merk, Darmstadt, Deutschland

Methylaminoantipyrin Sanofi-Aventis, Frankfurt/Main, Deutschland

Natriumazetat Sigma, Steinheim, Deutschland

Natriumdihydrogensphosphat Dihydrat Merk, Darmstaft, Deutschland

Natriumhydroxid Merk, Darmstadt, Deutschland

Nifluminsäure Sigma, Deisenhofen, Deutschland

n-Hexan Merk, Darmstadt, Deutschland

Perchlorsäure Merk, Darmstadt, Deutschland

PGE2 Enzyme Immunoassay Kit Cayman Chemicals, Ann Arbor,

Massachussets, USA

RPMI-1640 Medium Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Salzsäure Merk, Darmstadt, Deutschland

Trichloressigsäure Fluka, Steinheim, Deutschland

TXB2-Enzyme Immunoassay Kit Cayman Chemicals, Ann Arbor,

Massachussets, USA

Wasser aus Milli-Q-Anlage Millipore, Neu-Isenburg

Westernblot-Detektionsreagenzien Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland


5.1.3 Verbrauchsmaterialien

Adapter Combitips plus 50 ml Eppendorf AG, Hamburg

Bechergläser SCHOT Duran

Blut-Monovetten mit Heparin Saarstedt, Nümbrecht

Blut-Monovetten mit EDTA, Saarstedt, Nümbrecht

Blut-Monovetten neutral Saarstedt, Nümbrecht

Braunüle B.Braun, Melsungen

Cutasept® F BODE CHEMIE, Hamburg

Einmalspritze 2 ml B.Braun, Melsungen

Eppendorf Pipetten Eppendorf AG, Hamburg

Falkon Tube 14 ml Falcon Becton Dickinson and

Company Labware, Heidelberg

Injektionsnadel: grün, gelb B.Braun, Melsungen

Injektionspflaster Paul Hartmann AG, Heidenheim

Multiadapter Sarstedt, Nümbrecht

Multipette® plus Eppendorf AG, Hamburg

Multipetteaufsätze: Combitips plus 0,5/ 5/ 10 /50 ml Eppendorf AG, Hamburg

Obturator 20GA 1,1*30 mm Beckton Dickinson, Spanien

Pasteur-Pipetten Glas 15 mm VWR International

Pipettenspitze 10 µl, 200 µl, Sarstedt, Nümbrecht

Pipettenspitze 1000 µl Eppendorf AG, Hamburg

Reagenzgläser Soda, gl. Rand, rd. Boden VWR International

Reagiergefäß 1,5 ml Sarstedt, Nümbrecht

Röhre mit Verschluß 101×16,5 mm Sarstedt, Nümbrecht

Tupfer Paul Hartmann AG, Heidenheim

Venenkatheterverband Beckton Dickinson, Spanien

Venenwerweilkanüle 20GA 1,1*30 mm Beckton Dickinson, Spanien


5.1.4 Geräte

Autosampler, Model 231 Gilson, Abimed

Blotkammer Protean®, BIO-RAD

Dilutor, Model 401 Gilson, Abimed

Elektrophoresekammer Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland

Elektronische Analysenwaage AE 260

Delterange® Mettler Waage GmbH, Schweiz

HPLC-Pumpe Spectra System P 4000 Finnigan MAT

HPLC-System (Entgaser, Säulenofen) Finnigan MAT

HPLC-Säule CC125/4 Nucleosil 120-3 C8 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

HPLC-Säule CC125/4 Nucleodur C18 Pyramid,

3 µmol/l Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

HPLC-Säule CC125/4 Nucleosil 120-3 C18 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Laborwaage PE 3600 Mettler Waage GmbH, Schweiz

optischen Scanner Gel Doc 2000; Bio-Rad-Laboratories,

Hercules, CA

Photometer für 96-well Platten DIAS, Dynatech Laboratories

pH Meter Model pH 211 HANNA Instruments, Portugal

SHAKER DRS-12 Sky-Line ELMI LTF LabortechnikGmbH & CO.KG,

Wasserburg, Deutschland

Ultraschalbad Bioblock Scientific, Deutschland

UV-Detektor Spectra 100 Spectra-Physics, San Jose, CA, USA

Überkopfschüttler GFL 3025 GmbH für Labortechnik, Burkwedel,

Deutschland

Vorsäule CC 8 / 4 Nucleodur C8 3µ Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Vorsäule CC 8 / 4 Nucleosil C8 3µ Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Vorsäule CC 8 / 4 Nucleosil C18 3µ Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Wasseraufbereitungssystem TKA TKA GmbH Niederelbert

Wasserbad und Thermostat GmbH für Labortechnik, Burkwedel,

Deutschland

Zentrifuge 5810R Eppendorf AG, Hamburg


5.1.5 Software

Borwin Version 1,5 Jasco, Groß-Umstadt

Exel Microsoft, Unterschleißheim

Multi-Analyst Programm, Version 1.1 Bio-Rad-Laboratories, Hercules, CA

PRISM Version 3.0 GraphPad, San Diego, CA, USA

WinNonlin Version 3.3 Pharsight, Gebirgssicht, CA, USA

Word Microsoft, Unterschleißheim

5.1.6 Medikamente

Arzneistoff Wirkstoff Hersteller

Novalgin® Filmtabletten 500 mg Metamizol Sanofi-Aventis, Frankfurt am

Main, Deutschland

Paracetamol-ratiopharm® 500 mg Paracetamol Ratiopharm GmbH, Ulm,

Deutschland

Prexige® 100mg Filmtabletten Lumiracoxib Novartis Pharma GmbH,

Nürnberg, Deutschland

Aleve® 200 mg Naproxen Bayer Vital GmbH,

Leverkusen, Deutschland


5.2 Methoden

5.2.1 Pharmakokinetische Untersuchungen

Die Quantifizierung von Arzneistoffen und deren Metabolite in Plasma erfolgte in allen in dieser

Dissertation beschriebenen Studien mit Hilfe von Hochleistungsflüssigkeitschromatography mit

ultravioletem Detektor (HPLC-UV-Methoden).

HPLC stellt ein Trennverfahren dar, bei dem die Probenflüssigkeit mittels einer flüssigen Phase

(Eluent) unter hohem Druck über die stationäre Phase (Trennsäule) transportiert wird. Wenn die

stationäre Phase unpolar ist, geht es um umgekehrt (engl.: "reversed") Phase (RP). Die RP-

HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. 70 % aller analytischen HPLC-Trennungen und

alle Methoden in dieser Arbeit sind RP-Trennungen. Als mobile Phase werden meist

Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril oder Methanol eingesetzt. In allen

vorliegenden Untersuchungen wurde isokratische Trennung verwendet, bei der die

Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich bleibt. Bei

Gradiententrennungen wird dagegen die Polarität des Fließmittelgemisches während der

Analyse verändert. Elutionskraft bei RP-HPLC steigt mit senkender Polarität des Eluentes, weil

da der Eluent in grösserer Konkurrenz zur festen Phase ist. Besondere Anwendung findet die

RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten, die auf Normalphasen zu hohe

Retentionszeiten aufweisen würden. Die Darstellung des Ergebnisses der Stofftrennung erfolgt

in Form eines Chromatogrammes, einer Elutionskurve. Sie stellt die Abhängigkeit für die Menge

(Konzentration) der eluierten Substanzen von der Zeit dar.

Zur Detektion wurde UV / VIS-Spektrometer verwendet. Die UV / Vis-Spektroskopie ist eine

Spektroskopie, die elektromagnetische Wellen des ultravioletten (UV: 1-380 nm) und des

sichtbaren (VIS: 380-780 nm) Lichts nutzt.

5.2.2 Pharmakodynamische Untersuchungen

In dieser Arbeit wurde der Einflüss von selektiven und nicht selektiven COX-Inhibitoren auf die

Aktivität der Cyclooxygenasen in Vollblut, das das periphere Kompartiment im menschlichen

Körper repräsentiert, untersucht.

COX-1 und COX-2 Aktivitäten im Vollblut wurden nach der Methode von Patrignani et al.

bestimmt (Patrignani et al., 1994). Diese Methode gibt einen direkten Aufschluss über das

inhibitorische Potential einer Substanz bezüglich COX-1 indem die Hemmung der

Thromboxansynthese von aktivierten Thrombozyten während der Blutgerinnung untersucht wird.

Das Hemmpotential einer Substanz bezüglich COX-2 wird durch die Hemmung der

Prostaglandin E2-Synthese in Lipopolysaccharid-induzierten Monozyten bestimmt. Dieser Test


ermöglicht die Untersuchung der COX-Aktivität unter physiologischen Bedingungen bei denen

u.a. die Plasmaproteinbindung berücksichtigt wird.

Das Blut wurde durch Venenpunktion von gesunden Freiwilligen gewonnen, die zwei Wochen

vor der Blutentnahme keine NSAR genommen hatten.

5.2.2.1 COX-1-Aktivität im menschlichen Vollblut

Aliquoten des Vollblutes ohne Antikoagulans (500 µl) wurden unmittelbar nach der

Blutentnahme in die Reagenzgläser übertragen. Für die in-vitro-Versuche wurden die

Reagensgläser mit Testagent oder PBS (als Kontrolle) versetzt. Blutproben sind im Wasserbad

eine Stunde bei 37°C geronnen. Serum wurde durch Zentrifugation bei 1500×g, 4°C und 5

Minuten getrennt und Thromboxan B2-Konzentrationen wurden gemessen.

5.2.2.2 COX-2-Aktivität im menschlichen Vollblut

Für die in-vitro-Versuche wurden die Reagensgläser mit Testagent oder PBS (als Kontrolle)

versetzt. Blut von Probanden wurde in Heparinbeschichteten Röhrchen gesammelt und in die

Reagenzgläser übertragen. Weiterhin wurden die Blutproben mit LPS (10 µg/ml) und ASS

(10 µg/ml) 24 Stunden bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde das Plasma

durch Zentrifugation bei 1500×g, 4°C und 5 Minuten abgetrennt und PGE2-Konzentration wurde

bestimmt.

5.2.2.3 Quantifizierung der Konzentration von Prostanoid im Vollblut mittels

ELISA

ELISA ist ein Assay, der auf Immunfixation der gesuchten Substanz an mit spezifischem,

monoklonalen Antikörper gegen diese Substanz beschichteter Oberfläche einer Kunststoffplatte

basiert. Nicht fixierte Substanzen werden abgewaschen. Ein Enzym-markierter

Sekundärantikörper wird in einem Sandwichverfahren an das gebundene Substrat gebunden.

Das markierende Enzym ist in der Lage, zugegebenes Substrat unter Farbumschwung

umzusetzen. Die Intensität des Farbumschlages kann photometrisch bestimmt werden und

korreliert mit der Konzentration der zu bestimmenden Substanz.

5.2.2.3.1 Messung von TXB2

Es wurde ein kommerziell erhältliches Fertigkit von Cayman Chemicals (Ann Arbor,

Massachussets, USA) verwendet.

Die Messplatte wurde gebrauchsfertig geliefert. Proben- und Waschpuffer wurden als

Trockensubstanz geliefert und mussten nach Herstellervorgabe in H2O gelöst werden. Tracer


(Konjugat) und Antikörper wurden ebenfalls nach Herstellervorgabe im Probenpuffer gelöst.

Eine Verdünnungsreihe des Standards von 1000 bis 7,8 pg/ml wurde nach Herstellervorgabe

mit dem Assaypuffer angesetzt. Die 96-Well-Platte wurde mit Nullwert, 50 µl des Standards und

50 µl Probe / Well als Dreifachbestimmung befüllt, die Proben ggf. vorher nach Bedarf mit

Probenpuffer verdünnt. Nach Zugabe von 50 µl Antikörper und 50 µl Konjugat / Well wurde die

Platte mit Plastikfilm zugedeckt und 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wurde die Flüssigkeit abgekippt, die Platte fünf Mal mit Waschpuffer gewaschen, getrocknet, mit

200 µl des Ellmann´s Reagent / Well befüllt und zugedeckt bei Raumtemperatur auf dem

Schüttler 60 bis 90 Minuten inkubiert (entwickelt). Dann wurde die Platte im Bereich von 405 bis

420 nm abgelesen. Die Berechnung der endgültigen Konzentrationen erfolgte mit Hilfe

spezieller Exel-Tabelle.

5.2.2.3.2 Messung von PGE2

Es wurde ein kommerziell erhältliches Fertigkit von Cayman Chemicals (Ann Arbor,

Massachussets, USA) verwendet.

Die Messplatte wurde gebrauchsfertig geliefert. Proben- und Waschpuffer wurden als

Trockensubstanz geliefert und mussten nach Herstellervorgabe in H2O gelöst werden. Tracer

(Konjugat) und Antikörper wurden ebenfalls nach Herstellervorgabe im Probenpuffer gelöst.

Eine Verdünnungsreihe des Standards von 1000 bis 7,8 pg/ml wurde nach Herstellervorgabe

mit dem Assaypuffer angesetzt. Die 96-Well-Platte wurde nach Plan mit Nullwert, 50 µl des

Standards und 50 µl Probe / Well als Dreifachbestimmung befüllt. Die Proben wurden vorher

nach Bedarf mit Probenpuffer verdünnt. Nach Zugabe von 50 µl Antikörper und 50 µl Konjugat /

Well wurde die Platte mit Plastikfilm zugedeckt und 18 Stunden bei 4°C im Kühlschrank

inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgekippt, die Platte fünf Mal mit Waschpuffer

gewaschen, getrocknet, mit 200 µl des Ellmann´s Reagent / Well befüllt und zugedeckt (im

Dunklen) bei Raumtemperatur auf dem Schüttler 60 bis 90 Minuten inkubiert (entwickelt). Dann

wurde die Platte im Bereich von 405 bis 420 nm abgelesen. Die Berechnung der endgültigen

Konzentrationen erfolgte mit Hilfe spezieller Exel-Tabelle.

5.2.3 Korrelationsanalyse zwischen Pharmakodynamik und

Pharmakokinetik

5.2.3.1 Pharmakodynamische Analyse

Das Ausmaß der COX-1 oder COX-2-Hemmung wurde als die Prozentänderung der

Eicosanoidkonzentration im Blut (COX-1: TXB2; COX-2: PGE2) in verschiedenen Zeitpunkte

nach der Medikamentengabe im Vergleich zu Eicosanoidkonzentrationen vor der

Medikamentengabe berechnet. Im Fall von COX-2 wurden die PGE2-Werte, die ohne LPS-


Induktion gemessen wurden, von LPS-induzierten PGE2-Werten substrahiert. Die maximale

Hemmung der COX Isoformen und Zeit, um dies zu erreichen, wurde direkt von den Wirkungs-

Zeitkurven erhalten. Die Fläche unter der Wirkungs-Zeitkurven (AWECs) von 0 bis bestimmten

Zeitpunkt nach Dosisverabreichung wurde mit Hilfe der linearen trapezoidal-Regel berechnet.

5.2.3.2 Pharmakokinetische Analyse

Plasmakonzentration-Zeitkurven von untersuchten Medikamenten und deren Metabolite (Studie

mit Metamizol) wurden durch nicht kompartimentale Analyse bestimmt, wozu die WinNonlin

Version 3,3 (Pharsight, Gebirgssicht, CA, USA,) benutzt wurde. Die maximale

Plasmakonzentrationen (Cmax) und die Zeiten bis zu Cmax (tmax) wurden direkt von der

individuellen Plasmakonzentration gegen Zeitkurven ermittelt. Die Fläche unter der

Plasmakonzentration-Zeitkurve bis zur letzten quantitativen Plasmakonzentration (AUCt) wurde

mittels der linearen trapezoidalen Methode errechnet.

5.2.3.3 Berechnung der Korrelation zwischen Pharmakodynamik und

Pharmakokinetik

Für das Bewerten der Korrelation zwischen Plasmakonzentrationen von Medikamenten und

Änderungen in COX-1 oder COX-2-Hemmung wurden Plasmakonzentrations-Aktivitätskurven

mittels einer sigmoidalen Regression mit variablem Enstieg errechnet. Die IC50-Werte für die

COX-1 bzw. COX-2-Hemmung wurden mit Hilfe der PRISM® Version 3,0 (GraphPad, San Diego,

CA, USA) bestimmt.


5.2.4 Validierung einer analytischen Methode

Unter Validierung versteht man den Nachweis und die Dokumentation der Zuverlässigkeit einer

Methode für die Bestimmung eines Analyten in einer definierten Matrix. Die

Methodenvalidierung in der Bioanalytik muss zeigen, dass eine bestimmte Methode zur

Quantifizierung eines Analyten in einer biologischen Matrix, wie beispielsweise Plasma bzw.

Serum verlässlich und reproduzierbar ist.

In dieser Arbeit wurde die Validierung einer neu entwickelten Methode auf der Basis der von

Shah (2000) zusammengefassten Richtlinien der Konferenz „Analytical methods validation:

Bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies“ (Shah et al., 2000) durchgeführt.

Versuchsreihen zur Spezifität, Linearität, Präzision und Richtigkeit sind für bioanalytische

Methoden von essentieller Bedeutung.

5.2.4.1 Spezifität und Selektivität

Spezifität ist die Fähigkeit einer Methode, eine bestimmte Substanz ohne Verfälschung durch

andere in der Probe vorhandene Komponenten zu erfassen und sie somit eindeutig zu

identifizieren.

Selektivität ist die Fähigkeit einer Methode, verschiedene nebeneinander zu bestimmende

Analyten ohne gegenseitige Störungen oder Störungen durch andere endogene oder exogene

Substanzen (Verunreinigungen, Abbauprodukte, Matrix) zu erfassen.

Spezifität und Selektivität wurde nachgewiesen, indem man Leerplasmaproben von sechs

verschiedenen Probanden untersucht hat.

5.2.4.2 Linearität

Die Linearität beschreibt die Fähigkeit einer Methode, über einen festgelegten

Konzentrationsbereich Ergebnisse zu erbringen, die eine direkte Proportionalität zur

Analytkonzentration aufweisen. Der Nachweis der Linearität erfolgt über eine graphische

Auswertung mit Angabe der Regressionsfunktion und des Korrelationskoeffizienten.

Bei einer linearen Regression hängen die Werte linear voneinander ab. Daraus lässt sich

folgende Regressionsgleichung ermitteln:

y = a * x + b

a = Steigung

b = Ordinatenabschnitt

Zur Bestimmung der Linearität der Eichgeraden (kleine, mittlere, große) wurden jeweils fünf

Eichkonzentrationen pro Gerade analysiert. Die einzelnen Eichkonzentrationen wurden jeweils

dreifach bestimmt.


5.2.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) ist die kleinste erfaßbare Menge des Analyten in

einer Probe. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze muß das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt

werden. An der Nachweisgrenze soll das Signal größer als das dreifache Grundrauschen sein.

Die Bestimmungsgrenze (Limit of Quantification, LOQ), auch Quantifizierungsgrenze genannt,

ist die kleinste quantifizierbare Konzentration, die noch mit hinreichender Präzision und

Richtigkeit ermittelt werden kann. In der chromatographischen Praxis gilt das neunfache

Rauschen als Bestimmungsgrenze, wonach also folgendes gilt: Bestimmungsgrenze = 3 x

Nachweisgrenze. Signale, die diese Bedingung nicht erfüllen, können somit nicht korrekt

quantifiziert werden und müssen bei der Auswertung entsprechend gekennzeichnet werden.

Die Präzision, berechnet als Variationskoeffizient innerhalb Proben einer Konzentration, die als

Bestimmungsgrenze dient, sollte nicht größer als 20% sein, die Richtigkeit um nicht mehr als ±

20% vom Sollwert abweichen.

5.2.4.4 Richtigkeit

Unter Richtigkeit versteht man das Maß der Übereinstimmung zwischen dem gemessenen Wert

und einem als richtig angesehenen Wert (Sollwert). Zur Bestimmung der Richtigkeit wurden

sieben verschiedenen Lumiracoxibkonzentrationen (10, 50, 100, 500, 1000, 5000 und 10000

ng/ml) jeweils 5-fach extrahiert und gemessen. Aus den Ergebnissen der Untersuchungen, die

an drei unterschiedlichen Analysentagen wiederholt worden sind, wurde die relative Fehler

([Mittelwert der Analysenergebnisse x 100 / eingesetzte Konzentration] - 100) in Prozent

errechnet.

5.2.4.5 Präzision

Die Präzision (Reproduzierbarkeit der Methode) beschreibt die Streuung der einzelnen Werte

um den Mittelwert, wobei zufällige Fehler erfasst werden. Das Maß für die Präzision wird als

eine relative Standardabweichung (Variationskoeffizient) der Meßergebnisse in % angegeben.

Es wird zwischen einer “Intra-day” Präzision und einer “Inter-day” Präzision unterschieden. Mit

der Intra-day-Präzision soll die Streuung der Meßergebnisse, die durch Aufarbeitung und

Messung mehrerer aus einem Pool stammender Aliquote an einem Tag resultiert, festgestellt

werden. Damit soll ermittelt werden, ob die Aufarbeitung einer Serie von Proben zu gleichen

Ergebnissen führt.

Die Inter-day-Präzision zeigt die Streuung der Meßergebnisse von Tag zu Tag. Dadurch soll die

Streuung der Meßergebnisse mehrerer aus einem Pool stammender Aliquote an

unterschiedlichen Tagen ermittelt werden. Diese Streuung zeigt, ob die Art der Aufarbeitung


von Proben an unterschiedlichen Tagen divergiert und inwieweit das Gerät, das zur Messung

der Proben verwendet wird, von Tag zu Tag Schwankungen zeigt.

Zur Bestimmung der Intra-day-Präzision und -Richtigkeit des Messverfahrens wurden jeweils

fünf Proben bei sieben verschiedenen Lumiracoxibkonzentrationen über den gesamten

Messbereich analysiert. Dafür wurden mit 50%-igem wässrigen Methanol Verdünnungen der

Stammlösungen von Lumiracoxib hergestellt, mit denen Leerplasmaproben versetzt wurden, so

dass Plasmakonzentrationen von 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 und 10000 ng/ml Lumiracoxib

resultierten. Diese Proben wurden wie unten beschrieben (Abschnitt 6.3.1.2) aufgearbeitet und

in einer Serie mit dem HPLC - UV System vermessen. Zur Bestimmung der Inter-day-Präzision

und -Richtigkeit wurde dieses Verfahren an zwei weiteren Tagen wiederholt. Ergebnisse der

Untersuchungen, die an drei unterschiedlichen Analysentagen wiederholt worden sind, wurde

die relative Standardabweichung (Variationskoeffizient = Standardabweichung x 100 / Mittelwert

der Analysenergebnisse) ermittelt. Die Präzision der Konzentrationsmessungen im

Konzentrationsbereich außerhalb der Bestimmungsgrenze sollte nicht mehr als 15% betragen,

die Richtigkeit sollte nicht um mehr als ± 15% vom Sollwert abweichen.

5.2.4.6 Wiederfindung (Recovery)

Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde der Prozentsatz der absoluten Peakhöhen von

Lumiracoxib der aufgearbeiteten Proben der Validierung von den jeweiligen Peakhöhen nach

Einspritzen von Standardlösungen der entsprechenden Konzentrationen berechnet.

5.2.4.7 Stabilität

Die Stabilität einer Substanz in biologischem Material ist von den Lagerungsbedingungen, den

chemischen Eigenschaften, sowie der Probenmatrix abhängig. Müssen Proben über einen

längeren Zeitraum gelagert werden, bevor sie analysiert werden können, sollte die Stabilität der

zu bestimmenden Substanzen gesichert sein. Die Stabilität von Lumiracoxib wurde bei sieben

verschiedenen Konzentrationen (je Dreifachbestimmung) im Plasma nach 5 Wochen bei -70°C

gemessen.


5.3 Studien

5.3.1 Klinisch-pharmakologische Untersuchungen zur Pharmakokinetik

und Pharmakodynamik von Metamizol

5.3.1.1 Studienziel

Die vorliegende Studie erforschte den Beitrag von Metamizolmetaboliten (4-MAA und 4-AA)

zum Wirkungsmechanismus von Metamizol hinsichtlich der Prostanoid-Synthese in Vollblut.

5.3.1.2 Studiendesign

Zuerst wurde eine in-vitro-Analyse beider Verbindungen bezüglich der Aktivität der COX-

Enzyme in menschlichem Vollblut durchgeführt. Als Weiteres wurde den Vergleich der Kinetik

von 4-MAA und 4-AA und die begleitende ex-vivo-Hemmung der COX-Enzyme bei gesunden

männlichen Probanden gemacht, die klinisch empfohlene orale Dosen von entweder 500 mg

oder 1000 mg Metamizol erhielten. Dabei handelte es sich um eine zweifach Cross-over nicht

Plazebokontrolierte Probandenstudie. Die Studie wurde am Lehrstuhl für Pharmakologie und

Toxikologie der Universität Erlangen-Nürnberg im Februar-März 2006 durchgeführt.

5.3.1.3 Probandenpopulation

An der Studie nahmen 5 männliche Probanden im Alter von 39 bis 65 (durchschnittlicher Alter:

44,8 Jahre) mit einer Körpermasse 70,2 ± 3,0 kg (mean ± SEM) teil. Alle Probanden waren die

approbierten Ärzte am Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie.

Voraussetzung für die Teilnahme war das Einverständnis des Probanden und keine Einnahme

von NSAR zwei Wochen vor der ersten Blutentnahme. Die Ausschlusskriterien entsprachen den

in der Fachinformation für Novalgin® genannten Gegenanzeigen.

5.3.1.4 Studienmedikation

Als Studienmedikation wurde Novalgin® Filmtabletten (Sanofi-Aventis, Frankfurt am Main,

Deutschland) verwendet, das von einer öffentlichen Apotheke bezogen wurde. 1 Tablette

enthält 500 mg Metamizol. Die Probanden nahmen klinisch empfohlene Dosen von 500 mg

oder 1000 mg Metamizol ein.


5.3.1.5 Studienplan

Die Probanden erhielten im Abstand von Minimum 1 Woche einmalig 1 Tablette oder 2

Tabletten von Novalgin® Filmtabletten. Die Prüfmedikation wurde nüchtern mit 150 ml Wasser

zwischen 8:00 und 9:00 Uhr verabreicht. Eine Stunde später wurde Frühstück gereicht. Venöse

Blutproben wurden mit einer Verweilkanüle unmittelbar vor der Tabletteeinnahme (Zeitpunkt 0)

und 0,25; 0,75; 1,5; 3; 5; 8 und 12 Stunden nach der Medikation abgenommen. Für die

Bestimmung von Metamizolmetaboliten wurden die heparinisierten Blutproben zentrifugiert und

die Aliquote vom Plasma wurden bei -20°C bis zu zwei Wochen gelagert.

5.3.1.6 In-vitro Untersuchungen

5.3.1.6.1 Wirkungen von Metamizol Metaboliten auf die COX-1 und COX-2-Aktivität im

menschlichen Vollblut

COX-1: Blut wurde von gesunden Blutspendern entnommen, die zwei Wochen lang vor

Blutentnahme keinen NSAR eingenommen hatten. Aliquote von Vollblut (ohne Antikoagulans)

wurden sofort in Reagenzgläser mit Testsubstanzen (4-MAA bzw 4-AA: 0,01; 0,1; 0,3; 1; 3; 10;

30; 100 oder 300 µmol/l) oder Kontrolle (PBS mit DMSO) pipettiert. Die Endkonzentrationen von

DMSO in Reaktionsgemisch waren 0,1% (v/v) [für Konzentrationen von 0,01-100 µmol/l und

seine Kontrolle] und 0,3% (v/v) [für 300 µmol/l bzw. Kontrolle]. Das Blut wurde für 1 Stunde bei

37°C inkubiert. Das Serum wurde durch Zentrifugation abgetrennt und die Serum-TXB2-

Konzentrationen wurden bestimmt.

COX-2: Aliquote von heparinisiertem Blut von gesunden Blutspendern wurden mit LPS (10

µg/ml) plus Testsubstanzen (4-MAA bzw 4-AA: 0,01; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; 100 oder 300 µmol/l)

oder Kontrolle (PBS mit DMSO) für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Aktivität der

Blutplättchen-COX-1 wurde durch Zusatz von Aspirin (10 µg/ml) am Anfang der Inkubation

unterdrückt. Das Plasma wurde bei Zentrifugation abgetrennt und anschließend wurde PGE2-

Konzentrationen in Plasma gemessen.

Für beide COX-Assays wurden Konzentrations-Aktivitätskurven durch eine sigmoidale

Regression mit dem variablen Anstieg errechnet. Die IC50-Werte wurden durch den Gebrauch

der PRISM Version 3.0 (GraphPad, San Diego, CA) bestimmt. Die COX-1- bzw. COX-2-

Hemmung wurde als die prozentualle Änderung von Plasmaeicosanoiden (COX-1: TXB2;

COX-2: PGE2) in Gegenwart von Metamizol berechnet. Im Fall vom COX-2 wurden basale

PGE2-Werte von jedem PGE2-Wert in der LPS- und LPS / Metamizol-behandelten Gruppen vor

der Berechnung der Prozentänderung abgezogen.


5.3.1.7 Ex-vivo Untersuchungen

5.3.1.7.1 Hemmung der COX-Aktivitäten in Blut nach einmaliger oraler Gabe von

Metamizol

COX-1: Sofort nach den Blutentnahmen wurden Vollblutproben ohne Antikoagulans für 1

Stunde bei 37°C inkubiert, anschließend zentrifugiert, und die Serum-TXB2-Konzentrationen

bestimmt.

COX-2: Sofort nach den Blutentnahmen wurden heparinisierte Vollblutproben mit 10 µg/ml LPS

für 24 Stunden bei 37° inkubiert. Die Blutplättchen-COX-1-Aktivität wurde durch Zusatz von

Aspirin (10 µg/ml) am Beginn der Inkubation unterdrückt. Das Plasma wurde durch

Zentrifugation abgetrennt und die PGE2-Konzentrationen wurden bestimmt.

5.3.1.7.2 Bestimmung von 4-MAA und 4-AA im menschlichen Plasma

Die Metamizolmetaboliten wurden mit einer modifizierten Methode (Agundez et al., 1994)

analysiert. Für die Probenaufarbeitung wurden 0,2 ml 1 M Natrium Hydroxid und 0,1 ml interner

Standard (10 µg Antipyrin / ml destilliertes Wasser) zu 0,5 ml Plasma hinzufügt. Als

Extraktionsmittel wurde 4 ml Chloroform verwendet. Die Reagenzgläser wurden verschlossen

und die Proben wurden in einem Shaker für 5 min über Kopf geschüttelt und anschließend in

einer Kühlzentrifuge (Eppendorf 5810R) bei 4000 r.p.m. für eine Dauer von 5 Minuten bei 4°C

zentrifugiert. Die organische Phase wurde in einen Reagenzglas überführt und wurde bei

Zimmertemperatur unter einem Strom des Stickstoffes evaporiert. Der Rückstand wurde in

150 µl FM aufgelöst und 100 µl wurde für HPLC-Analyse benutzt. Die Substanzen wurden

mittels RP-Säule 125/4 Nucleodur C18 Pyramid, 3 µmol/l (Macherey-Nagel, Düren,

Deutschland) und eine C18 Vorsäule (3 µmol/l) getrennt. Die mobile Phase bestand aus einer

87:13 (v/v) Mischung von 30 mM Natriumacetat (pH-Wert = 5,6) und Acetonitril. Der Fluss war

1 ml/min. UV-Detektion wurde auf 257 nm gesetzt. 4-AA und 4-MAA wurden eluiert bei 9 min

bzw. 12 min. Die Retentionszeit von Antipyrin (interner Standard) war 7,6 min. Linearität der

Standardkurven wurde über einen Konzentrationsbereich von 50 bis 20 000 ng/ml bestimmt.

Der Messbereich wurde in zwei kleinere Messbereiche (50 - 1000 und 1000 - 20 000 ng/ml)

aufgeteilt.



und Pharmakodynamik von Paracetamol

5.3.2.1 Studienziel

Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Paracetamol hinsichtlich der Prostanoid-

Synthese in Vollblut.


Zuerst wurde eine in-vitro-Wirkung von Paracetamol auf die Aktivität der COX-Enzyme in

menschlichem Vollblut durchgeführt. Dann wurde ex-vivo-Hemmung der COX-Enzyme und die

begleitende Kinetik von Paracetamol bei gesunden männlichen Probanden, die klinisch

empfohlene orale Dosen von 1000 mg Paracetamol erhielten, analysiert. Eine nicht Plazebo-

kontrolierte Probandenstudie wurde am Lehrstuhl für Pharmakologie und Toxikologie der

Universität Erlangen-Nürnberg im November-Dezember 2006 durchgeführt.


In die Studie wurden 5 männliche Probanden im Alter von 39 bis 65 Jahren (durchschnittliches

Alter: 44,8 Jahre) mit einer Körpermasse 69 ± 2,9 kg (mean ± SEM) eingeschlossen. Alle

Probanden waren die approbierten Ärzte am Institut für Experimentelle und Klinische

Pharmakologie und Toxikologie. Voraussetzung für die Teilnahme war das Einverständnis des

Probanden und keine Einnahme von NSAR zwei Wochen vor der ersten Blutentnahme. Die

Ausschlusskriterien entsprachen den in der Fachinformation für Paracetamol-ratiopharm®

genannten Gegenanzeigen.


Als Studienmedikation wurde Paracetamol-ratiopharm® 500 (ratiopharm GmbH, Ulm,

Deutschland) verwendet, das von einer öffentlichen Apotheke bezogen wurde. 1 Tablette

enthält 500 mg Paracetamol. Die Probanden nahmen 1000 mg Paracetamol (2 Tabletten).

5.3.2.5 Studienplan

Die Prüfmedikation wurde nüchtern mit 150 ml Wasser zwischen 8:00 und 8:30 Uhr verabreicht.

Eine Stunde später wurde ein Frühstück gereicht. Venöse Blutproben wurden mit einer

Verweilkanüle unmittelbar vor der Tabletteeinnahme (Zeitpunkt 0) und 0,25; 0,75; 1,5; 3; 5; 8;


10 und 24 Stunden nach der Medikamentgabe abgenommen. Für die Paracetamolbestimmung

wurden die heparinisierten Blutproben zentrifugiert und die Aliquote vom Serum wurden bei

-20°C bis zu einer Woche gelagert.

5.3.2.6 In vitro Untersuchungen

5.3.2.6.1 Wirkungen von Paracetamol auf COX-1 und COX-2-Aktivität im menschlichen

Vollblut

COX-1: Blut wurde von gesunden Blutspendern, die zwei Wochen lang vor Blutentnahme

keinen NSAR genommen hatten, entnommen. Aliquote von Vollblut (ohne Antikoagulans)

wurden sofort in Reagenzgläser mit Testsubstanz (Paracetamol 0,1; 1; 10; 30; 100; 300 oder

1000 µmol/l) oder Kontrolle (PBS mit DMSO) überführt. Endkonzentrationen von DMSO im

Reaktionsgemisch waren 0,1% (v/v). Dann wurde Blut für 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurde Serum bei Zentrifugation getrennt um Serum-TXB2-Konzentrationen zu

bestimmen.

COX-2: Aliquoten von heparinisiertem Blut von gesunden Blutspendern wurden mit LPS (10

µg/ml) plus Testsubstanz (Paracetamol 0,1; 1; 10; 30; 100; 300 oder 1000 µmol/l) oder Kontrolle

(PBS mit DMSO) für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Aktivität der Blutplättchen-COX-1

wurde durch Zusatz von Aspirin (10 µg/ml) am Anfang der Inkubation unterdrückt. Plasma

wurde durch Zentrifugation getrennt und anschließend wurde zur quantitativen PGE2-

Bestimmung verwendet.

Für beide COX-Assays wurden Konzentrations-Aktivitätskurven durch eine sigmoidale

Regression mit dem variablen Anstieg errechnet. Die IC50-Werte wurden durch den Gebrauch

der PRISM Version 3.0 (GraphPad, San Diego, CA, die USA) bestimmt. Die COX-1 oder COX-2

Hemmung wurde als die prozentualle Änderung von Plasmaeicosanoiden (COX-1: TXB2; COX-

2: PGE2) in Gegenwart von Paracetamol berechnet. Im Fall vom COX-2 wurden basale PGE2-

Werte von jedem PGE2-Wert in der LPS- und LPS / Paracetamol-behandelten Gruppen vor der

Berechnung der Prozentänderung abgezogen.

5.3.2.6.2 Effekt von Paracetamol auf COX-2-Aktivität im Human rekombinante COX-2

Die hemmende Wirkung von Paracetamol auf die humane rekombinante COX-2 wurde mittels

des COX-Inhibitor-Screening-Assay from Cayman gemessen. Die Versuche wurden gemäß den


Angaben des Herstellers durchgeführt, wobei eine 12-minutige Inkubationszeit des Enzyms mit

Paracetamol verwendet wurde. Der Assay bestimmt direkt PGF2α, das durch die Zinnchlorid-

Reduktion des COX-2 gebildeten PGH2 produziert wird.

5.3.2.6.3 Effekt von Paracetamol auf COX-2-Aktivität in humanen Blutmonocyten

Mononuklearen Zellen wurden aus heparinisiertem Vollblut von gesunden Blutspendern durch

Dichtegradientenzentrifugation mit Histopaque-1077 isoliert. (Hinz et al., 2000).

In einer 48-Well Zellkulturplatten wurden 1 x 106 Zellen pro Well ausgesät und bei

Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert. Nichtadhärente Zellen wurden durch Waschen

entfernt. Die adhärenten Monocyten wurden in serumfreiem RPMI-1640 Medium bei 37°C und

5% CO2 kultiviert. Um die Wirkung von Paracetamol auf die COX-2-Aktivität zu bewerten,

wurden die Monocyten mit Acetylsalicylsäure (250 µmol/l) für 2,5 Stunden inkubiert, um die

endogene COX-Aktivität zu hemmen. Danach wurden Zellen gründlich gewaschen und

anschließend mit dem Vehicle (Gruppe 1) oder 10 µg/ml LPS (Gruppen 2 und 3) für 18 Stunden

inkubiert. Nach dem Mediumwechsel wurden Kontrolle (Gruppen 1 und 2) oder 100 µmol/l

Paracetamol (Gruppe 3) zu den Zellen hinzugefügt. Nach einer 90-minutigen Inkubationszeit

wurden die Zellkulturüberstände entnommen und die PGE2-Konzentrationen bestimmt. Die

COX-2-Hemmung wurde als die prozentualle Änderung der PGE2-Konzentration in LPS /

Paracetamol-behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, die nur mit LPS behandelt

wurden, berechnet. Zu diesem Zweck wurden die basalen PGE2-Werte (Gruppe 1) von jedem

Wert in den Gruppen 2 und 3 abgezogen.

5.3.2.6.4 Effekt von Paracetamol auf die COX-2-Expression in humanen Blutmonocyten

mittels Westernblot-Analyse

In einer 6-Well Platte wurden 5 x 106 mononukleare Zellen pro Well ausgesät und bei

Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert. Nach dem Abwaschen von nicht adhärenten Zellen,

wurden adhärente Monocyten entweder mit Kontrolle, Paracetamol (100 µmol/l), LPS (10 µg/ml)

oder LPS plus Paracetamol für 24 Stunden inkubiert. Später wurden Zellen gewaschen,

geerntet und durch Zentrifugation pelletiert. Die Zellen wurden mittels Ultraschall im

Solubilisierungspuffer lysiert und bei 10 000 r.p.m. für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände

wurden für die Westernblot-Analyse verwendet. Um Proteine mittels der SDS-

Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) bzw. Westernblot zu analysieren, werden die

Proben vorher einer proteindenaturienden Behandlung unterzogen. Dabei werden die Proteine

durch SDS-Behandlung denaturiert und bekommen im Verhältnis zu ihrem Molekulargewicht

eine konstante negative Ladung.


Die Proteine werden durch die Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgrund ihrer

unterschiedlichen Molekulargewichte aufgetrennt. Dabei migrieren Proteine mit geringerem

Molekulargewicht nach Anlegen einer Spannung schneller zur Anode als Proteine mit höherem

Molekulargewicht.

Die Auftragelösungen wurden in die Probentaschen des Gels pipettiert und durch Anlegen einer

konstanten Spannung im Bereich von 35 V bis 200 V auf einem 10%-igen SDS-Gel aufgetrennt.

Als “Blotten” wird der Transfer von Proteinen von einem SDS-Polyacrylamidgel auf eine

Nitrocellulose- oder Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran unter Anlegen einer Spannung

oder einer Stromstärke bezeichnet. Der Transfer der Proteine erfolgte auf Nitrocellulose in der

einer Miniblotkammer (Protean®, Biorad). Darauf folgte das Blockieren der Membranen mit 5 %

Milchpulver in PBS. Zur Detektion des zu untersuchenden Proteins wird ein spezifischer

Primärantikörper verwendet, an den sich wiederum ein sekundärer Peroxidase-gekoppelter

Antikörper anlagert. Als Primärantikörper wurden ein spezifischer COX-2-Antikörper oder ein

Antikörper gegen ß-actin, das als interne Kontrolle diente, verwendet. Als Sekundärantikörper

diente ein Meerrettich-Peroxidase-konjugierter Fab-spezifische Antimaus IgG. Zum Abschluss

wurden die Membranen mit dem Westernblot-Detektionsreagenzien inkubiert. Die COX-2 wurde

mittels Chemilumineszenz auf einem Film visualisiert. Die densitometrische Analyse der COX-2

Band-Intensitäten (normalisiert zu ß-actin) wurden durch einen optischen Scanner (Gel Doc

2000; Bio-Rad-Laboratories, Hercules, CA) und das Multi-Analyst Programm, Version 1.1 (Bio-

Rad-Laboratories, Hercules, CA) durchgeführt.

5.3.2.7 Ex-vivo Untersuchungen

5.3.2.7.1 Hemmung der COX-Aktivitäten nach einmaliger oraler Gabe von Paracetamol

1000 mg

COX-1: Sofort nach Blutentnahme wurden Vollblutproben ohne Antikoagulantien für 1 Stunde

bei 37°C inkubiert, anschließend zentrifugiert, und die Serum-TXB2-Konzentrationen wurden

bestimmt.


für 24 Stunden bei 37° inkubiert. Die Blutplättchen COX-1-Aktivität wurde mit Zusatz von Aspirin

(10 µg/ml) am Anfang von Inkubation unterdrückt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation

abgetrennt und PGE2- Konzentrationen wurden bestimmt.


5.3.2.7.2 Bestimmung von Paracetamol in menschlichem Plasma

Paracetamol wurde nach einer vorher veröffentlichte Methode (Lau and Critchley, 1994)

analysiert. Für die Kalibrierungsstandard und Probenaufarbeitung wurden 0,2 ml 10% wässrige

Perchlosäure zu 0,2 ml Plasma hinzugefügd, vortexed für 10 sec. und anschließend in einer

Kühlzentrifuge (Eppendorf 5810R) bei 4000 r.p.m. für eine Dauer von 5 Minuten bei 5°C

zentrifugiert. Klare Überstände (50 µl jeder) wurden direkt ins HPLC System mit einer RP-Säule

CC 125/4 Nucleosil 120-3 C18 (Machery-Nagel, Düren, Deutschland) und eine Vorsäule CC 8/4

Nucleosil C18 injeziert. Das Fliesmittel bestand aus 96:4 (v/v) Mischung von 20 mM

Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat (pH = 2,5) und Acetonitril. Der Fluss war 0,9 ml/min. UV-

Detektion wurde auf 254 nm gesetzt. Retentionszeit von Paracetamol war 7,0 Minuten.

Paracetamol-Konzentrationen wurden als Equivalent von den Peakflächen berechnet. Die

Linearität der Standardkurven wurde von 0,2 bis 40 µg/ml mit Regressionskoeffizienten größer

als 0,999 bewiesen.



und Pharmakodynamik von Lumiracoxib

5.3.3.1 Studienziel

Die vorliegende Studie liefert eine vergleichende Analyse zu Pharmakokinetiken, zur

Dosisabhängigkeit und Dauer der COX-2-Hemmung bei Probanden nach der einmaligen oralen

Verabreichung von Lumiracoxib in Dosen von 50, 100 oder 200 mg.


Es handelte sich um eine dreifache Cross-over Probandenstudie, die am Lehrstuhl für

Pharmakologie und Toxikologie der Universität Erlangen-Nürnberg im September-November

2007 durchgeführt wurde.


In die Studie wurden 4 Probanden (drei Männer und eine Frau) im Alter von 27 bis 41 Jahren

(durchschnittliches Alter: 36,8 Jahre) mit einer Körpermasse 70,0 ± 3,9 kg (mean ± SEM)

eingeschlossen. Alle Probanden waren die approbierten Ärzte am Institut für Experimentelle

und Klinische Pharmakologie und Toxikologie. Voraussetzung für die Teilnahme war das

Einverständnis des Probanden und keine Einnahme von NSAR zwei Wochen vor der ersten

Blutentnahme. Die Ausschlusskriterien entsprachen den in der Fachinformation für Prexige®



Als Studienmedikation wurde Lumiracoxib (Prexige, Novartis Pharma, Nürnberg, Deutschland)

verwendet, das von einer öffentlichen Apotheke bezogen wurde. 1 Tablette enthält 100 mg

Lumiracoxib. Die Probanden nahmen Lumiracoxib in Dosierungen von 50 mg (die Hälfte der

100 mg Tablette), 100 mg oder 200 mg (zwei 100 mg Tabletten).

5.3.3.5 Studienplan

Die Probanden erhielten im Abstand von zwei Wochen einmalig Prüfdosierungen (50 mg,

100 mg bzw. 200 mg) von Lumiracoxib. Die Prüfmedikation wurde nüchtern mit 150 ml Wasser

zwischen 8:00 und 9:00 Uhr verabreicht. Venöse Blutproben wurden mit einer Verweilkanüle

unmittelbar vor der Tabletteeinnahme (Zeitpunkt 0) und 0,25; 0,75; 1,5; 3; 5; 8, 10 und 24


Stunden nach der Medikation abgenommen. Für die Bestimmung von Lumiracoxib wurden die

heparinisierten Blutproben zentrifugiert und die Aliquote vom Plasma wurden bei -20°C bis zu

einer Woche gelagert.

5.3.3.6 Hemmung der COX-2-Aktivität durch Lumiracoxib ex-vivo

Sofort nach den Blutentnahmen wurden heparinisierte Vollblutproben mit 10 µg/ml LPS für 24

Stunden bei 37° inkubiert. Die Blutplättchen COX-1-Aktivität wurde mit Zusatz von Aspirin (10

µg/ml) am Anfang von Inkubation unterdrückt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation

abgetrennt und PGE2- Konzentrationen wurden bestimmt.

5.3.3.7 Bestimmung von Lumiracoxib in menschlichem Plasma.

Lumiracoxib wurde nach einer neu entwickelten und validierten Methode mittels HPLC–UV

(Cheremina et al., 2006) analysiert (Abschnitt 6.3).

Für die Probenaufarbeitung und Kalibrierungsstandard wurden 0,5 ml 0,1 M Salzsäure und 0,1

ml interner Standard (100 µg/ml Nifluminsäure in Methanol) zu 1 ml Plasma hinzugefügt.

Anschließend wurde 4 ml Mischung n-Hexan:Diethylether 70:30 (v/v) gegeben. Die

Reagenzgläser mit der Mischung wurden in einem Shaker für 10 min über Kopf geschüttelt und

anschließend in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf 5810R) bei 4000 r.p.m. für eine Dauer von 10

Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die organische Phase wurde in einen Reagenzglas überführt und

wurde bei Raumtemperatur unter einem Strom des Stickstoffes evaporiert. Der Rückstand

wurde in 150 µl Methanol:Wasser 50:50 (v:v) aufgelöst, vortext und 100 µl wurde in HPLC-

Anlage injeziert. Die Substanzen wurden mittels RP-Säule CC 125/4 Nucleosil 120-3 C8

(Machery-Nagel, Düren, Germany) und eine Vorsäule CC 8/4 Nucleosil C8 3µ getrennt. Die

mobile Phase bestand aus einer Mischung vom Acetonitril und 0,05 % Trichloressigsäure 35:65

(v/v). Der Fluss war 1,0 ml/min. UV-Detektion wurde auf 270 nm gesetzt. Lumiracoxib wurde bei

16,9 min und Nifluminsäure bei 10,4 min eluiert. Linearität der Standardkurven wurde über

einen Konzentrationsbereich von 10 bis 10 000 ng/ml, mit Regressionskoeffizienten größer als

0,997 bewiesen.

5.3.3.8 Statistik

Potenziale Unterschiede in pharmakodynamischen Parametern in verschiedenen Zeitintervalen

(0,25 bis 5, 8, 12 oder 24 Stunden nach Medikamentverabreichung für durchschnittliche

Hemmungen; 0 bis 5, 8, 12 oder 24 Stunden nach der Medikamentverabreichung für AWEC-

Werte) der drei Gruppen (50 mg gegen 100 mg; 50 mg gegen 200 mg; 100 mg gegen 200 mg)


wurden vom Student´s paired t-Test bewertet. A P-Wert weniger als 0,05 wurde als signifikant

betrachtet. Statistische Analysen wurden mit PRISM® Version 3.0 (GraphPad, San Diego, CA,

USA) durchgeführt.



und Pharmakodynamik von Naproxen

5.3.4.1 Studienziel

Die vorliegende Studie untersuchte, ob Dosierungen von freiverkäuflichem (OTC) Naproxen

Natrium eine für Thrombozytenaggregation ausreichende TXB2-Hemmung nach einmaliger

Gabe und im Steady-state (200 mg Naproxen zweimal am Tag für 7 Tage) und dadurch

mögliche kardioprotektive Wirkung erzeugen können.


Es handelte sich um eine mehrfachdosierte nichtverblindete Probandenstudie, die am Lehrstuhl

für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Erlangen-Nürnberg im Dezember 2006 - Mai

2007 durchgeführt wurde.


In die Studie wurden 4 Probanden (drei Männer und eine Frau) im Alter von 26 bis 66 Jahren

(durchschnittliches Alter: 44,8 Jahre) mit einer Körpermasse 75,8 ± 7,1 kg (mean ± SEM)

eingeschlossen. Alle Probanden waren die approbierten Ärzte am Institut für Experimentelle

und Klinische Pharmakologie und Toxikologie. Voraussetzung für die Teilnahme war das

Einverständnis des Probanden und keine Einnahme von NSAR zwei Wochen vor der ersten

Blutentnahme. Die Ausschlusskriterien entsprachen den in der Fachinformation für Aleve®



Als Studienmedikation wurde Naproxen Natrium 220 mg (entspricht den 200 mg Naproxen,

Aleve®, Bayer, Germany), das von einer öffentlichen Apotheke bezogen wurde. Die Probanden

nahmen 1 Tablette zweimal täglich für 7 Tage ein.

5.3.4.5 Studienplan

Am 1. Tag wurde die Prüfmedikation nüchtern zwischen 8:00 und 8:30 Uhr verabreicht. Venöse

Blutproben wurden mit einer Verweilkanüle unmittelbar vor der Tabletteeinnahme (Zeitpunkt 0)

und 1, 3, 6 und 12 Stunden nach der Medikamentgabe abgenommen. In den Tagen 2 bis 5

wurde Blut sofort vor der Einnahme der Morgendosis, d.h. 12 Stunden nach der Abenddosis


abgenommen. Um Recovery von COX-Enzymen nach der Beendigung der

Naproxeneinnahmen zu untersuchen, wurden zusätzliche Blutproben am Tag 8 (12 und 24

Stunden nach der letzten Dosis) und Tag 9 (36 Stunden nach der letzten Dosis) abgenommen.

Tabelle 3: Protokoll über Einnahme von Naproxen Natrium 220 mg 2 Mal/Tag und Blutentnahme

Tag 1 Mo

2 Di

3 Mi

4 Do

5 Fr

6 Sa

7 So

8 Mo

9 Di

Zeit der Tabletteeinahme

8:00

20:00

8:00

20:00

8:00

20:00

8:00

20:00

8:00

20:00

8:00

20:00

8:00

20:00

Zeit der Blutentnahme

8:00

9:00

11:00

14:00

20:00

8:00

8:00

8:00

8:00

8:00

20:00

8:00

Für die Naproxenbestimmung wurden die heparinisierten Blutproben zentrifugiert und die

Plasmaaliquoten wurden bei -20°C bis zu zwei Wochen gelagert.

5.3.4.6 Hemmung der COX-Aktivitäten durch Naproxen 200 mg zweimal am

Tag für 7 Tage bei menschlichen Probanden.

COX-1: Sofort nach Blutentnahme wurden Vollblutproben ohne Antikoagulans für 1 Stunde bei

37°C inkubiert, anschließend zentrifugiert, und die Serum-TXB2-Konzentrationen wurden

bestimmt.


für 24 Stunden bei 37° inkubiert. Die Blutplättchen COX-1-Aktivität wurde mit Zusatz von Aspirin

(10 µg/ml) am Anfang von Inkubation unterdrückt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation

abgetrennt und PGE2-Konzentrationen wurden bestimmt.

5.3.4.7 Bestimmung von Naproxen in menschlichem Plasma

Für die Kalibrierungsstandard und Probenaufarbeitung für Naproxenbestimmung wurden 0,1 ml

1 M Salzsäure und 0,025 ml interner Standard (200 µg/ml Flurbiprofen in Methanol) zu 0,25 ml

Plasma hinzugefügt. Anschließend wurde 3 ml Mischung n-Hexan:Diethylether (80:20 v/v)


gegeben, die Reagenzgläser mit der Mischung in einem Shaker für 5 min über Kopf geschüttelt

und anschließend in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf 5810R) bei 4000 r.p.m. für eine Dauer von

5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die organische Phase wurde in einen Reagenzglas überführt

und wurde bei Raumtemperatur unter einem Strom des Stickstoffes evaporiert. Der Rückstand

wurde in 200 µl Fließmittel aufgelöst und 50 µl wurde für HPLC-Analyse benutzt. Die

Substanzen wurden mittels RP-Säule CC 125/4 Nucleosil 120-3 C8 (Machery-Nagel, Düren,

Germany) und eine Vorsäule CC 8/4 Nucleosil C8 3µ getrennt. Die mobile Phase bestand aus

einer Mischung vom Methanol und Wasser 60:40 (v/v) (pH = 3,1). Der Fluss war 0,7 ml/min.

UV-Detektion wurde auf 230 nm gesetzt. Naproxen wurde bei 4,5 min und Ibuprofen bei 6,5 min

eluiert. Linearität der Standardkurven wurde über einen Konzentrationsbereich von 1 bis 50

µg/ml mit Regressionskoeffizienten größer als 0,999 bewiesen.

Ergebnisse 60

6 Ergebnisse

6.1 Klinisch-pharmakologische Untersuchuingen zur

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Metamizol

6.1.1 In-vitro Wirkungen von 4-MAA und 4-AA auf die COX-1 und COX-2-

Aktivität in menschlichem Vollblut

Durch Zugabe von Metamizol in steigender Konzentration zum Vollblut und anschliessender

Bestimmung von Thromboxan und Prostaglandin E2, lasst sich das Ausmaß der peripheren

COX-1- und COX-2-Inhibition abschätzen. Der Versuch zur Bestimmung der hemmenden

Wirkung der Metamizolmetaboliten (4-MAA und 4-AA) auf die COX-1- bzw. COX-2-Aktivität

zeigte, dass die beiden Metabolite eine konzentrationsabhängige Hemmung der beiden COX-

Isoformen hervorrufen konnten (Tabelle 4). Aber keiner von beiden Metaboliten übte eine

beträchtliche (> 2-fache) Selektivität zu einem COX-Isoenzym aus. Die IC50-Werte nach der

Inkubation mit 4-MAA waren im Vergleich zu diesen nach der Inkubation mit 4-AA ungefähr 8,2-

fach für COX-1 bzw. 9-fach für COX-2 kleiner.

Tabelle 4: In-vitro-Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität durch MAA und AA im menschlichen Vollblut-Assay. Die Daten wurden aus drei verschiedenen in-vitro Experimenten mit jeweils unterschiedlichen Blutproben gewonnen.

Metabolit

IC50 COX-1 (µmol/l)

IC50 COX-2 (µmol/l)

4-MAA

2,55 ± 1,3 4,65 ± 2,4

4-AA

20,79 ± 6,1 41,81 ± 16,5

Die Daten sind als Mittelwert ± SEM angegeben.

6.1.2 Ex-vivo Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität in menschlichem

Vollblut nach einmaliger Einnahme von Metamizol

Die COX-1- bzw. COX-2-Hemmung, die im Vollblut von Probanden nach der oralen Gabe von

Metamizol in den Dosierungen von 500 mg oder 1000 mg bestimmt wurde, ist in Abbildung 7

gezeigt. Die Verabreichung von Metamizol in den Dosierungen von 500 mg bzw. 1000 mg

verursachte eine deutliche Hemmung der beiden COX-Isoformen. Dabei zeigte sich bei einer

Dosierung von 1000 mg eine bedeutend stärkere maximale bzw. mittlere COX-1-Hemmungen

Ergebnisse 61

0 2 4 6 8 10 12

0

25

50

75

100

500 mg Metamizol1000 mg Metamizol

Zeit (h)

CO

X-1

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

95% Hemmung

im Vergleich zur Gabe von 500 mg Metamizol (Abbildung 7). Überdies war die AWEC in der

500 mg Gruppe im Vergleich zum jeweiligen Wert in der 1000 mg Gruppe (Tabelle 5)

bedeutend niedriger.

Ebenfalls konnte moderate Zunahme der AWEC für die COX-2 in der 1000 mg Gruppe im

Vergleich zur 500 mg Gruppe beobachtet werden (Tabelle 5). Jedoch war dieser Unterschied

statistisch nicht signifikant. Ebenso gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied für die

COX-1- und COX-2-Hemmung innerhalb einer Dosierungsgruppe.

A

B

Abbildung 7: Die Hemmung der COX-1- bzw. COX-2-Aktivität nach oraler Einnahme von Metamizol in den Dosierungen von 500 mg und 1000 mg. Die eingefügte horizontale Linie stellt in Abbildung A die COX-1-Hemmung von 95% bzw. in Abbildung B die COX-2-Hemmung von 80% dar.

0 2 4 6 8 10 12

0

20

40

60

80

100


80% Hemmung

Zeit (h)

CO

X-2

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

Ergebnisse 62

Tabelle 5: Pharmakodynamische Parameter der Metamizol-vermittelten COX-1- und COX-2-Hemmung bei fünf Probanden nach der oralen Einnahme von entweder 500 mg oder 1000 mg Metamizol.

COX-1-Hemmung

Zeit bis maximale Hemmung

(h)

Maximale Hemmung

(%)

Durchschnittliche Hemmung 0-12 h

(%)

AWEC0-12 h (%⋅h)

Metamizol 500 mg

1,1 ± 0,2

94,4 ± 0,8

72,9 ± 5,0

861,9 ± 72,0

Metamizol 1000 mg

0,9 ± 0,2

97,4 ± 0,4**

85,5 ± 3,4*

1020,3 ± 55,0*

COX-2-Hemmung

Zeit bis maximale Hemmung

(h)

Maximale Hemmung

(%)

Durchschnittliche Hemmung 0-12 h

(%)

AWEC0-12 h (%⋅h)

Metamizol 500 mg

3,0 ± 1,3

86,6 ± 3,6

62,0 ± 7,8

759,4 ± 69,7

Metamizol 1000 mg

1,7 ± 0,4

94,0 ± 1,8

73,8 ± 2,9

860,9 ± 56,9

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM von fünf Probanden angegeben. * P < 0,05; ** P < 0,01 vs. 500 mg Metamizol-Gruppe (Student´s paired t-test).

6.1.3 Pharmakokinetik von Metamizolmetaboliten nach oraler Gabe von

Metamizol in den Dosierungen von 500 mg und 1000 mg

Nach der oralen Applikation von entweder 500 mg oder 1000 mg Metamizol an jeweils fünf

Probanden wurden die AUCs und Plasmakonzentrations-Zeitkurven von 4-MAA und 4-AA

bestimmt. Die Plasmakonzentrations-Zeitkurven sind in Abbildung 8 gezeigt.

Die maximalen Plasmakonzentrationen von 4-MAA wurden bei der Dosierung 500 mg oder

1000 mg Metamizol nach 1,7 und 1,2 Stunden gemessen, wohingegen 4-AA die maximalen

Plasmakonzentrationen erst nach 3,1 bzw. 5,2 Stunden erreichte (Tabelle 6). Überdies fielen im

Vergleich zu 4-MAA die entsprechenden Plasmakonzentrationen von 4-AA aufgrund der

terminalen Halbwertzeiten von 6,3 h. (500 mg) und 5,7 h (1000 mg) deutlich langsamer ab

Ergebnisse 63

(Tabelle 6). Die Verdopplung der Metamizoldosis führte für die Metabolite 4-MAA und 4-AA zu

einer Zunahme der AUC um das 5- bzw 3,2-fache.

A

B

Abbildung 8: Plasmakonzentrations-Zeitkurven von 4-MAA (A) und 4-AA (B) nach oraler Gabe von 500 mg oder 1000 mg Metamizol an fünf Probanden. Es sind die Mittelwerte ± SEM aufgetragen. 4-MAA wies im Vergleich zu 4-AA kürzere Zeiten zu Erreichen der maximalen Plasmakonzentration und terminale Halbwertszeiten auf.

Die Plasmakonzentrationen von 4-AA waren zu allen Zeitpunkten unter den in-vitro bestimmten

IC50-Werten für die COX-1- und COX-2-Hemmung (Tabelle 4 und Abbildung 8 B). Andererseits

blieben die Plasmakonzentrationen von 4-MAA für 8 Stunden (500 mg) bzw. 12 Stunden

(1000 mg) über den in-vitro bestimmten IC50-Werten für die beiden Isoenzyme (Abbildung 8 A).

Die Plasmakonzentrationen von 4-MAA, die über oder im Bereich der IC50-Werte für die COX-

Hemmung lagen, wurden im Zeitraum von 15 min nach Einnahme von 500 mg: (3,12 µmol/l)

oder 1000 mg: (6,47 µmol/l) gemessen (Abbildung 8 A).

0 5 10 15 20 25

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Zeit (h)

[4-M

AA

] (µ

M)

0 5 10 15 20 25

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0


Zeit (h)

[4-A

A]

(µM

)

Ergebnisse 64

Tabelle 6: Pharmakokinetische Parameter von 4-MAA und 4-AA von fünf Probanden nach der oralen Einnahme von 500 mg oder 1000 mg Metamizol

4-MAA

Cmax (µmol/l) tmax (h)

AUCt (µmol⋅h/l)

t1/2 (h)

Metamizol 500 mg

13,6 ± 2,0 1,7 ± 0,4 75,7 ± 16,3 3,2 ± 0,6

Metamizol 1000 mg

59,1 ± 19,5 1,2 ± 0,2 381,6 ± 125,9 3,5 ± 0,5

4-AA

Cmax (µmol/l) tmax (h)

AUCt (µmol⋅h/l)

t1/2 (h)

Metamizol 500 mg

2,5 ± 0,7 3,1 ± 0,87 31,0 ± 11,9 6,3 ± 1,0

Metamizol 1000 mg

7,4 ± 2,7 5,2 ± 0,8 99,1 ± 43,6 5,7 ± 1,2

6.1.4 Korrelation zwischen Plasmakonzentration von 4-MAA und ex-vivo-

Hemmung der COX-Isoformen

Der Zusammenhang zwischen der 4-MAA Plasmakonzentrationen und der ex-vivo-Hemmung

von COX-1 und COX-2 wurde mittels grafischer Analyse untersucht (Abbildung 9). Dadurch war

die ex-vivo-Bestimmung der notwendigen Plasmakonzentrationen (IC50) für eine 50%-ige

Hemmung der jeweiligen COX-Isoform möglich. Für die COX-1 konnte ein IC50-Wert von 1,03

µmol/l 4-MAA bestimmt werden. Der IC50-Wert für die COX-2-Hemmung war mit 0,87 µmol/l nur

geringfügig niedriger als der IC50-Wert für die COX-1. Die sigmoidale Hemmkurve von 4-MAA

für COX-1 zeigte, dass bei den meisten Plasmakonzentrationen von 4-MAA bereits eine 50 %-

ige Hemmung der COX-1 erreicht wurde. Nur im Falle von fünf Plasmakonzentrationen wurde

eine COX-1-Hemmung unter 50 % beobachtet (Abbildung 9 A). Diese Plasmakonzentrationen

wurden bei zwei Probanden 12 Stunden bzw. bei drei Probanden 24 Stunden nach der

Ergebnisse 65

Einnahme von Metamizol gemessen. Bei der COX-2 verteilten sich die Plasmakonzentrationen

über den gesamten Hemmbereich (Abbildung 9 B).

A

B

Abbildung 9: Korrelation zwischen der ex-vivo-Hemmung von COX-1- (A) und COX-2-Aktivität (B) und den Plasmakonzentrationen von 4-MAA. Für die Bestimmung der ex-vivo IC50-Werte wurden Plasmakonzentrationen von 4-MAA und entsprechende COX-Hemmungen nach oraler Gabe von Metamizol in Dosierung von 500 mg und 1000 mg eingeschlossen. Die Daten wurden von fünf Probanden gewonnen.

-7,5 -6,5 -5,5 -4,5 -3,5

0

25

50

75

100

IC50 = 1,03 µmol/l

log [4-MAA] (mol/l)

CO

X-1

-Hem

mu

ng

(%

)

-7,5 -6,5 -5,5 -4,5 -3,5

0

25

50

75

100

IC50 = 0,87 µmol/l

log [4-MAA] (mol/l)

CO

X-2

-Hem

mu

ng

(%

)

Ergebnisse 66

6.2 Klinisch-pharmakologische Untersuchuingen zur

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Paracetamol

6.2.1 In-vitro Wirkung von Paracetamol auf die COX-1- und COX-2-Aktivität

in menschlichem Vollblut

Analog zur Aktivitätsbestimmung der peripheren COX im Vollblut nach Metamizolzugabe wurde

die Suppression der COX-1- und COX-2-Aktivität durch die Zugabe von Paracetamol in

verschiedenen Konzentrationen zu Vollblutproben untersucht (siehe Abschnitt 5.3.2.6.1). Als

Aktivitätsmaß für die COX-1 wurde Thromboxan B2 bzw. für die COX-2 Prostaglandin E2

bestimmt. Der in-vitro-Versuch zeigte, dass Paracetamol eine konzentrationsabhängige

Hemmung der beiden COX-Isoformen hervorruft (Tabelle 7). Paracetamol beeinflusste die

COX-2 jedoch deutlich effektiver als die COX-1. Auf Grundlage des Quotienten aus den IC50-

Werten, dem sogenannten Selektivitätsquotient, zeigte Paracetamol eine 4,4-fach höhere

Selektivität zu COX-2.

Tabelle 7: In-vitro-Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität durch Paracetamol im menschlichen Vollblut-Assay. Die Daten wurden aus vier verschiedenen in-vitro Experimenten mit jeweils unterschiedlichen Blutproben gewonnen.

COX-1 IC50 (µmol/l) 113,7 ± 17,2

COX-2 IC50 (µmol/l) 25,8 ± 1,8

Selektivitätsquotient (COX-1/COX-2) 4,4

Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM angegeben.

6.2.2 Pharmakokinetik von Paracetamol nach einmaliger oraler Gabe von

1000 mg Paracetamol

Nach der oralen Applikation von 1000 mg Paracetamol an jeweils fünf Probanden wurden die

Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Paracetamol bestimmt (Abbildung 10).

Die durchschnittlichen Plasmakonzentrationen von Paracetamol blieben unter den in-vitro

bestimmten IC50-Wert für die COX-1-Hemmung innerhalb des gesamten Zeitraums der Studie.

Jedoch lagen die Plasmakonzentrationen von Paracetamol für mindestens 5 Stunden nach der

Medikamenteneinnahme über dem in-vitro bestimmten IC50-Wert für die COX-2-Hemmung

(Abbildung 10).

Ergebnisse 67

Abbildung 10: Plasmakonzentrationen (µmol/l) von Paracetamol nach oraler Gabe von 1000 mg. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM von fünf Probanden dargestellt. 24 Stunden nach Medikamenteneinahme waren die Paracetamolplasmakonzentrationen nur bei drei von fünf Probanden detektierbar. Die zugefügten horizontalen Linien repräsentieren die in-vitro bestimmten IC50-Werte von Paracetamol für COX-1 und COX-2 (Tabelle 7).

Die pharmakokinetischen Parameter von Paracetamol sind in Tabelle 8 präsentiert.

Tabelle 8: Pharmakokinetische Parameter von Paracetamol von fünf Probanden nach Einnahme von 1000 mg Paracetamol.

tmax (h) 1,25 ± 0,5

Cmax (µmol/l) 104,8 ± 24,0

Quotient (Cmax / COX-1 IC50) 0,92

Quotient (Cmax / COX-2 IC50) 4,06

AUCt (µmol*h/l) 416,1 ± 29,0

t1/2 (h) 4,47 ± 0,6

Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM von fünf Probanden angegeben.

Um das Hemmpotential von Paracetamol in-vivo aus den in-vitro bestimmten IC50-Werten

abschätzen zu können, wurden diese mit der Cmax von Paracetamol ins Verhältnis gesetzt

(Tabelle 8). Je größer dieser Quotient ist, desto wahrscheinlicher ist es, dass die entsprechende

COX-Isoform effektiv in-vivo gehemmt wird. Die Quotienten waren für die COX-1: 0,92,

dagegen für die COX-2: 4,06. Es kann also angenommen werden, dass die COX-2 in-vivo

0 4 8 12 16 20 24

0

20

40

60

80

100

120IC50 COX-1

IC50 COX-2

Zeit (h)

[Par

acet

amo

l](µ

mo

l/L

)

Ergebnisse 68

durch Paracetamol in therapeutischen Dosierungen gehemmt wird. Dagegen ist keine effektive

Hemmung von COX-1 durch Paracetamol in-vivo zu erwarten.

6.2.3 Ex-vivo-Hemmung der COX-1 und COX-2-Aktivität in menschlichem

Vollblut nach einmaliger Einnahme von 1000 mg Paracetamol

Die Hemmung von COX-1 (A) bzw. COX-2-Aktivität (B), die ex-vivo im Vollblut von Probanden

nach der oralen Einnahme von Paracetamol in der Dosis von 1000 mg gemessen wurde sind in

Abbildung 11 gezeigt.

A

B

Abbildung 11: Zeitabhängige ex-vivo-Hemmung von COX-1- (A) und COX-2-Aktivität (B) nach einmaliger oralen Einnahme von 1000 mg Paracetamol. Es sind die Mittelwerte ± SEM von fünf Probanden aufgetragen. Die Hemmung der COX-Isoformen ist in Prozent zur Basisaktivität (Basislinie) angegeben. Die Basisaktivität wurde direkt vor der Paracetamoleinnahme bestimmt. Die maximale Hemmung der COX-1 und COX-2 durch Paracetamol war bei 55,8 ± 4,9 % bzw. 83,2 ± 6,5 %.

0 4 8 12 16 20 24

0

20

40

60

80

100

120

Zeit (h)

CO

X-1

Akt

ivit

ät(%

Bas

isli

nie

)

0 4 8 12 16 20 24

0

20

40

60

80

100

120

Zeit (h)

CO

X-2

Akt

ivit

ät(%

Bas

isli

nie

)

Ergebnisse 69

Die pharmakodynamischen Parameter sind in der Tabelle 9 präsentiert. Diese Daten zeigten

eine deutliche Hemmung der COX-2 mit einer maximalen Hemmung von 83% sowie einer

durchschnittlichen Hemmung von 66% innerhalb der ersten fünf Stunden nach

Paracetamoleinnahme (Tabelle 9 und Abbildung 11). Die COX-1 wurde dagegen nur bis

maximal 56 % der Basisaktivität gehemmt (Tabelle 9). Die Zeiten zur maximalen Hemmung der

COX-1 (0,95 h) und COX-2 (1,65 h) entsprachen der tmax (1,25 h) von Paracetamol (Tabelle 8

und Tabelle 9).

Tabelle 9: Pharmakodynamische Parameter von fünf Probanden nach der oralen Einnahme von 1000 mg Paracetamol.

COX-1-Hemmung COX-2-Hemmung

Zeit bis zur maximalen Hemmung (h) 0,95 ± 0,24 1,65 ± 0,86

Maximale Hemmung (%) 55,8 ± 4,9 83,2 ± 6,5

Durchschnittliche Hemmung

0,25-5 hours (%) 37,4 ± 4,4 66,2 ± 4,7


0,25-24 hours (%) 29,8 ± 4,7 47,5 ± 2,1

AWEC0-5 hours (% · h) 181,9 ± 16,8 323,9 ± 16,5

AWEC0-24 hours (% · h) 500,3 ± 123,7 640,8 ± 81,9

IC50 (µmol/l) 105,2 26,3 Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM von fünf Probanden, die 1000 mg Paracetamol eingenommen haben, aufgetragen

6.2.4 Korrelation zwischen den Plasmakonzentrationen von Paracetamol

und den ex-vivo-Hemmungen von COX-1 und COX-2

Der Zusammenhang zwischen den Plasmakonzentrationen von Paracetamol und der ex-vivo-

Hemmung von COX-1 und COX-2 wurde mittels grafischer Analyse untersucht. Dadurch war es

möglich, die ex-vivo IC50-Werte für die Hemmung der beiden COX-Isoformen durch

Paracetamoleinnahme zu bestimmen. Für die COX-1 wurde ein IC50-Wert von 105,2 µmol/l, für

die COX-2 ein IC50-Wert von 26,3 µmol/l errechnet. Diese IC50-Werte stellen ein Maß für die

Hemmung der COX-Isoformen in-vivo dar, da die Enzymaktivität im Vollblut der Probanden

nach der Medikamenteneinnahme bestimmt wurde. Die dadurch errechneten ex-vivo IC50-Werte

(Abbildung 10) waren vergleichbar mit den in-vitro IC50-Werten von Paracetamol für die

Hemmung der COX-1 (113,7 µmol/l) bzw. COX-2 (25,8 µmol/l) (Tabelle 7). Diese Tatsache

Ergebnisse 70

weist auf eine sehr gute Vergleichbarkeit zwischen den Methoden der in-vitro- und ex-vivo-

Aktivitätsbestimmung der COX-Isoformen im menschlichen Vollblut hin. Die

Plasmakonzentrationen von Paracetamol verteilten sich gleichmäßig über den gesamten

Hemmbereich von COX-1 und COX-2. Dabei ist ebenfalls erkennbar, dass die Hemmung der

COX-2 bei den entsprechenden Plasmakonzentrationen eine sigmoidale Kurve aufweist.

Dagegen ist der sigmoidale Verlauf im Falle der COX-1 geringer ausgeprägt, da bei den

maximalen Plasmakonzentrationen nach einmaliger therapeutischer Dosierung von 1000 mg

Paracetamol noch keine 100 %ige Hemmung erreicht wurde (Abbildung 12). Weiterhin war

auffällig, dass eine hohe Variabilität für die COX-Inhibition bei den niedrigen

Plasmakonzentrationen auftrat (Abbildung 12). Dagegen war die Variabilität der Hemmung in

den höheren Konzentrationsbereichen weitaus geringer.

A

B

Abbildung 12: Korrelation zwischen der ex-vivo-Hemmung von COX-1- (A) und COX-2-Aktivität (B) und den Plasmakonzentrationen von Paracetamol. Für die Bestimmung der ex-vivo IC50-Werte wurden Paracetamolplasmakonzentrationen und entsprechende COX-Hemmungen nach oraler Gabe von 1000 mg Paracetamol aufgetragen. Die Daten stammen von fünf Probanden.

-6,5 -5,5 -4,5 -3,5

0

20

40

60

80

100

IC50 = 105,2 µmol/l

log [Paracetamol] (mol/l)

CO

X-1

Hem

mu

ng

(%

)

-6,5 -5,5 -4,5 -3,5

0

20

40

60

80

100

IC50 = 26,3 µmol/l

log [Paracetamol] (mol/l)

CO

X-2

Hem

mu

ng

(%

)

Ergebnisse 71

6.2.5 In-vitro-Wirkung von Paracetamol auf die COX-2-Aktivität von

humanem rekombinanten Enzym und Blutmonozyten

Durch weitere Experimente wurde untersucht, ob die beobachtete COX-2-Hemmung (sieh

Abschnitt 6.2.3) die Folge einer kompetetiven Hemmung und / oder einer verringerten

Expression ist. Zunächst wurden deshalb die COX-2-Aktivitäten von humaner rekombinanter

COX-2 (siehe Methoden 5.3.2.6.2) sowie von LPS-stimulierten humanen Monozyten nach einer

Kurzzeitinkubation mit Paracetamol (siehe Methoden 5.3.2.6.3) bestimmt. Wie in Abbildung 13

zu erkennen ist, führte Paracetamol in therapeutischen Konzentrationen (100 µmol/l) zu einer

wesentlichen Hemmung der COX-2 bei sowohl rekombinanten Enzymen als auch in humanen

Monozyten. Die in Abbildung 13 dargestellte ex-vivo-Hemmung der COX-2 in humanem Vollblut

(Tabelle 9) wurde zur besseren visuellen Vergleichbarkeit ebenfalls dargestellt.

Abbildung 13: Wirkung von Paracetamol (100 µmol/l) auf die Aktivität humaner rekombinanter COX-2 sowie die COX-2-Aktivität in LPS-stimulierten humanen Monozyten. Die gezeigte Hemmung der COX-2-Aktivität im Vollblut stellt die im Abschnitt 6.2.3 beschriebene ex-vivo-Hemmung der COX-2 dar. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM (n= 3 bis 6 Experimente) in Prozent der Kontrolle (Inkubation ohne Paracetamol) aufgetragen.

6.2.6 In-vitro-Wirkung von Paracetamol auf die COX-2-Expression

Im Weiteren wurde die Frage untersucht ob die COX-2-Hemmung durch Paracetamol zusätzlich

durch eine verringerte Expression der COX-2 vermittelt wird. Dafür wurde die COX-2-

Expression in humanen mononukleären Zellen mit und ohne LPS-Stimulation nach einer 24-

stündigen Inkubation mit Paracetamol, analysiert (siehe Abschnitt 5.3.2.6.4). Die Expression der

Ergebnisse 72

COX-2 wurde dann mittels Immunoblotanalyse visualisiert und ausgewertet. Es konnte gezeigt

werden, dass sowohl in LPS-stimulierten Zellen als auch in nicht LPS-stimulierten Zellen sich

die COX-2-Expression nicht durch Paracetamol änderte (Abbildung 14). Somit kann

geschlussfolgert werden, dass Paracetamol nur einen Effekt auf die COX-2-Aktivität hat.

Abbildung 14: Repräsentativer Immunoblot zum Einfluss von Paracetamol auf die Expression von COX-2 in humanen mononukleären Zellen. Die Immunoblotanalyse zeigt, dass die COX-2-Expression durch Paracetamol nicht beeinflusst wird. Als interner Standard wurde β-Aktin nach dem „Stripping“ nachgewiesen. Über den Blots sind die densitometrischen bestimmten Expressionsdaten der COX-2 in Prozent der Kontrolle gezeigt (n=4 Immunoblots). Innerhalb der nicht LPS-stimulierten Zellen bzw. der LPS-stimulierten Zellen zeigte sich keine Änderung der COX-2-Expression durch Paracetamol. Die LPS-Stimulation der Zellen führte zu einer Zunahme der COX-2-Expression um durchschnittlich 160 %.

Ergebnisse 73

6.3 Entwicklung und Validierung einer HPLC-UV Methode zur

Bestimmung der Konzentrationen von Lumiracoxib in

menschlichem Plasma

6.3.1 Methodenentwicklung

Zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Lumiracoxib war es notwendig, eine Methode

zu entwickeln. Die zu entwickelnde Methode müsste für laborübliche Analysengeräte

zugeschnitten sein. Deswegen wurde die Analyse mittels HPLC und UV-Detektion durchgeführt.

Nach der Spektroskopie hat es sich zwei Maximume ergeben. Deswegen wurde Messung von

Lumiracoxib bei Wellenlänge: 210, 212, 270, 280 nm durchgetestet. Dabei wurden bei niedrigen

Wellenlängen zweimal größere Peakflächen von Lumiracoxib, als bei höheren Wellenlängen

gemessen. Jedoch wurden mehrere Störpeaks mitgemessen. Deshalb wurde es für

Wellenlänge 270 nm entschieden. Die Lumiracoxib-Plasmakonzentrationen wurden mithilfe

einer Internen-Standard-Methode bestimmt. Als interner Standard wurde Nifluminsäure und

Diclofenac untersucht. Es wurde für Nifluminsäure entschieden, weil Diclofenac unmittelbar vor

dem Lumiracoxibpeak rausgegangen ist, wodurch schlechtere Auflösung erzielt wurde.

Als mobile Phase für die Trennung von Analyten wurde Gemisch aus 0,05% Trichloressigsäure

und Acetonitril im verschiedenen Verhältnisse überprüft. Bei Mischungsverhältnis von 0,05%

Trichloressigsäure und Acetonitril 35:65 (v/v) war die Trennung von Lumiracoxib und Internen

Standard optimal, ohne dass Interferenzen mit den übrigen Plasmabestandteilen auftraten.

Es hat sich angeboten, ein zweiphasiges Lösungsmittelgemisch bestehend aus einem polaren,

und einem weniger polaren, leicht verdampfbaren Lösungsmittel zu verwenden. Nach diesen

Vorüberlegungen wurden zweiphasige Lösungsmittelsysteme, so wie Pentan:Chloroform und

Hexan:Diethylether auf ihre Eignung als Extraktionsmittel untersucht. Ein Gemisch aus Hexan

und Diethylether stellte sich als das effektivste Extraktionsmittel heraus. Dabei wurden größere

Peakflächen bei der Verhältnis 70:30 (v/v) von Hexan:Diethylether gemessen.

Die Methode ermöglichte die Bestimmung von Lumiracoxib im Konzentrationsbereich von 10 –

10 000 ng/ml.

6.3.1.1 Standardlösungen

4,5 mg Lumiracoxib wurden in 4,5 ml Methanol gelöst so dass eine Standardlösung von 1

mg/ml Lumiracoxib erhalten wurde. Diese Lösung wurde weiter 1:10 mit 50%-igem (v/v)

wässrigen MeOH verdünnt, so dass die eine Standardlösung von 100 µg/ml erhalten wurde.

Ergebnisse 74

Die Standardlösung des internen Standards Nifluminsäure mit einer Konzentration von 10 µg/ml

wurde durch Lösen von 1 mg Nifluminsäure in 100 ml MeOH erhalten. Alle Standardlösungen

wurden bei -20°C aufbewahrt.

6.3.1.2 Probenaufarbeitung und Messung

Zu 1000 µl Plasma wurden 100 µl interner Standard (Nifluminsäure 10 µg/ml Methanol), 500 µl

1M HCl sowie 4 ml Extraktionsmittel (Hexan:Diethylether 70:30) gegeben. Die Proben wurden

10 Minuten über Kopf geschüttelt und anschließend in einer Kühlzentrifuge (Eppendorf 5810R)

bei 4000 r.p.m. für eine Dauer von 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Organische Phase wurde

abgehoben und unter Stickstoff evaporiert.

Als mobile Phase für die HPLC-Analyse diente ein Gemisch aus 0,05% Trichloressigsäure und

Acetonitril im Verhältnis 35:65 (v/v). Die Fließgeschwindigkeit lag bei 1,0 ml/min. Temperatur

des Säulenofens wurde auf 28°C gestellt. Das Fließmittel wurde vor der Verwendung in

Ultraschalbad gestellt, um gelöste Gase zu beseitigen, die die HPLC-Analytik stören könnten.

Vor Beginn der Messungen wurde die HPLC-Apparatur mindestens eine halbe Stunde lang mit

der mobilen Phase äquilibriert. Die Leitungen des automatischen Probengebers und des

Injektionssystems wurden vor und nach jeder Messung mit entgastem 50%-igem wässrigen

Acetonitril gespült. Die Detektion erfolgte mithilfe eines Ultraviolettdetektors bei einer

Wellenlänge von 270 nm. Die Retentionszeit für Nifluminsäure (IS) lag bei 10,4 Minuten und für

Lumiracoxib bei 16,9 Minuten. Bei jeder Messung während der Lumiracoxibanalytik wurde

Qualitätskontrollproben (10, 50, 100, 500, 1000, 5000 und 10 000 ng/ml) mitgemessen. Die

Schwankungen des Peakhöhenverhältnisses von Lumiracoxib zu Nifluminsäure in den

Kontrollproben, berechnet als Variationskoeffizient, lagen im Lauf der Bestimmungen bei

weniger als 15%, bei Lumiracoxibkonzentration von 10 ng/ml bei weniger als 20%. Das HPLC-

System lief unter Verwendung der Software Borwin (Jasco-Borwin Version 1.50).

Ergebnisse 75

6.3.2 Validierung

In dieser Arbeit wurde die Validierung auf der Basis der von Shah (2000) zusammengefassten

Richtlinien der Konferenz „Analytical methods validation: Bioavailability, bioequivalence and

pharmacokinetic studies“ (Shah et al., 2000) durchgeführt.

6.3.2.1 Spezifität, Linearität und Bestimmungsgrenze

Spezifität (auch Selektivität) wurde nachgewiesen, indem man Leerplasmaproben von sechs

verschiedenen Probanden untersucht hat und keine Störpeaks an der Stelle der Analytes

festgestellt hat.

Linearität der Kalibriergerade für Lumiracoxib ist in Messbereich von 10 ng/ml bis 10000 ng/ml

vorhanden. Diesen Bereich wurde in 3 kleinere Messbereiche aufgeteilt: kleinen 10-100 ng/ml,

mittleren 100-1000 ng/ml und großen 1000-10 000 ng/ml und für jedes Bereich separat validiert.

Die Linearität der Messung wurde durch die Analyse von jeden Messbereich bestehend aus

jeweils fünf Konzentrationen ermittelt. Die Korrelationskoeffiziente waren größer als 0,997. Die

Bestimmungsgrenze lag bei 10 ng/ml.

Ergebnisse 76

6.3.2.2 Repräsentative Chromatogramme

Mit der entwickelten analytischen Methode wurde optimale Trennung von Analyten erreicht.

In Abbildung 15 sind typische Chromatogramme für die Analyse von Leerplasma, einer

Vergleichsprobe mit zugesetztem Lumiracoxib und Nifluminsäure und einer Patientenprobe

dargestellt.

Abbildung 15: Chromatogramme einer Leerplasmaprobe (A), einer Vergleichsprobe mit einer Lumiracoxibkonzentration von 1000 ng/ml (B) and einer Plasmaprobe vom Proband, der einmalig Lumiracoxib 200 mg eingenommen hat (C). Die Blutprobe wurde 15 min nach Medikamenteinnahme entnommen. Die Plasmakonzentration an Lumiracoxib betrug 608,8 ng/ml.

A

B

C

5

5

5

10

10

10 15

15

15 20

20

20

Lumiracoxib

Lumiracoxib

Nifluminsäure

Nifluminsäure

[min]

[min]

[min]

Ergebnisse 77

6.3.2.3 Intra-day und - Inter-day-Präzision

Akzeptable und zuverlässige Präzision und Richtigkeit der Methode wurden in intra-day und

inter-day Validierung mit untere Bestimmungsgrenze von 10 ng/ml gezeigt (nachgewiesen). Zur

Bestimmung der Intra-day-Präzision und -Richtigkeit des Messverfahrens wurden jeweils fünf

Proben bei sieben verschiedenen Lumiracoxibkonzentrationen über den gesamten Messbereich

analysiert. Die Ergebnisse von intra-day-Präzision und Richtigkeit sind in Tabelle 10 präsentiert.

Inter-day Präzision und Richtigkeit wurde an drei verschiedenen Tage bewertet und in Tabelle

11 zusammengefasst.

Tabelle 10: Intra-day-Präzision and Richtigkeit für kleine, mittlere und höhere Konzentrationen von Lumiracoxib.

Intra-day Soll / Konzentration

(ng/ml)

Gemessene Konzentration (ng/ml)

CV (%)

Richtigkeit

(%)

10

9,54 ± 0,71

7,5

4,6

50

52,68 ± 1,04

2,0

5,4

100

110,10 ± 2,26

2,1

10,4

100

100,44 ± 1,77

1,8

0,5

500

513,35 ± 7,41

1,4

2,7

1000

1002,27 ± 22,70

2,3

0,2

1000

919,63 ± 23,73

2,6

-8,0

5000

5069,70 ± 64,48

1,3

1,4

10000

10220,88 ± 246,50

2,4

2,2

CV = Variationskoeffizient. Die Werte sind als Mittelwerte ±±±± SD (n = 5) eingegeben.

Ergebnisse 78

Tabelle 11: Inter-day-Präzision and Richtigkeit für kleine, mittlere und höhere Konzentrationen von Lumiracoxib.

Inter-day Soll / Konzentration

(ng/ml)

Gemessene Konzentration

(ng/ml)

CV (%)

Richtigkeit

(%)

10

9,80 ± 0,59

6,1

-2,0

50

49,04 ± 4,07

8,3

-1,9

100

103,28 ± 7,65

7,4

3,3

100

105,00 ± 8,27

7,9

5,0

500

498,19 ± 31,34

6,3

-0,4

1000

969,51 ± 43,48

4,5

-3,0

1000

925,12 ± 66,16

7,2

-7,5

5000

4942,37 ± 255,92

5,2

-1,2

10000

10140,34 ± 497,99

4,9

1,4

CV = Variationskoeffizient. Die Werte sind als Mittelwerte ±±±± SD (3 Tage, n = 5 je.) eingegeben.

6.3.2.4 Wiederfindung

Wiederfindung (Recovery) von Lumiracoxib wurde bei vier Konzentrationen bestimmt und ist in

Tabelle 12 aufgeführt. Durchschnittliche Widerfindungsrate lag zwischen 82-93%.

Tabelle 12: Wiederfindung von Lumiracoxib in Plasma

Konzentration

(ng/ml)

Wiederfindung

(%)

10 93,2 ± 8,8

100 87,0 ± 4,5

1000 82,4 ± 4,5

10000 85,8 ± 2,5

Die Werte sind als Mittelwerte ±±±± SD (n = 5 für jede Gruppe) eingegeben.

Ergebnisse 79

6.3.2.5 Stabilität

Die Untersuchung der Stabilität wurde über einen fünfwöchigen Zeitraum bei -70°C

durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 präsentiert. Der Gehalt der Lumiracoxib nimmt

weniger als 10%, außer LOQ von 10 ng/ml (15%) ab.

Tabelle 13: Stabilität von Lumiracoxib nach Gefrierzeit von fünf Wochen bei – 70°C.

Soll / Konzentration

(ng/ml)

Ist / Konzentration

(ng/ml)

SD (%)

10

11,5 ± 0,63

14,6

50

47,85 ± 0,84

4,3

100

91,14 ± 0,65

8,9

100

94,94 ± 0,65

5,1

500

465,70 ± 11,53

6,9

1000

1025,33 ± 9,89

2,5

1000

953,39 ± 10,12

4,7

5000

5254,76 ± 94,86

5,1

10000

10164,50 ± 341,56

2,7

Die Werte sind als Mittelwerte ±±±± SD (n = 5 für jede Gruppe) eingegeben.

Ergebnisse 80

6.4 Klinisch-pharmakologische Untersuchungen zur

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Lumiracoxib

6.4.1 Pharmakokinetik von Lumiracoxib nach oraler Gabe

Die Fläche unter den Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Lumiracoxib nach der oralen Gabe

von 50 mg, 100 mg oder 200 mg sowie die weitere pharmakokinetische Parameter sind in der

Abbildung 16 bzw. Tabelle 14 präsentiert.

Tabelle 14: Pharmakokinetische Parameter von Lumiracoxib nach der oralen Einnahme von 50 mg, 100 mg oder 200 mg Lumiracoxib.

50 mg 100 mg 200 mg

tmax (h) 2,38 ± 0,9 2,25 ± 0,4 1,50 ± 0,5

Cmax (µmol/l) 4,09 ± 0,9 9,04 ± 1,8 18,39 ± 4,5

Cmax / ex-vivo COX-2 IC50

Quotient 29,2 64,6 131,4

AUCt (µmol*h/l) 13,99 ± 3,7 29,11 ± 7,6 63,72 ± 12,1

t1/2 (h) 2,67 ± 0,6 2,37 ± 0,5 4,15 ± 0,2

Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von vier Probanden, die Lumiracoxib in verschiedenen Dosierungen eingenommen hatten, angegeben.

Das Zeitintervall für die maximalen Plasmakonzentrationen von Lumiracoxib lag zwischen 1,5

bis 2,4 Stunden Tabelle 14. Dabei zeigte die Höchstdosis von 200 mg Lumiracoxib die kürzeste

tmax. von 1,5 Stunden. Die tmax stieg mit den geringeren Dosierungen von 100 mg und 50 mg auf

2,25 bzw. 2,38 Stunden an. Für die Cmax zeigte sich ein linearer Zusammenhang zur Dosis. Die

Verdopplung der Dosierung von 50 mg auf 100 mg führte ebenfalls zu einer Verdopplung der

Cmax von 4,09 ± 0,9 µmol/l auf 9,04 ± 1,8 µmol/l. Die weitere Verdopplung der Dosis auf 200 mg

Lumiracoxib hatte dann auch einen entsprechenden Effekt auf die Cmax, die sich auf 18,39 ±

4,5 µmol/l erhöhte. Ein vergleichbarer Effekt war ebenfalls für die AUCs zu beobachten. Diese

nahmen bei den Dosierungen von 50 mg, 100 mg und 200 mg Lumiracoxib von 13,99 ±

3,7 µmol*h/l auf 29,11 ± 7,6 µmol*h/l bzw. 63,72 ± 12,1 µmol*h/l zu.

Die maximalen Plasmakonzentrationen von Lumiracoxib lagen 29-fach (50 mg), 65-fach

(100 mg) und 131-fach (200 mg) über dem ex-vivo bestimmten IC50-Wert für die COX-2-

Ergebnisse 81

0 4 8 12 16 20 24

0

5

10

15

20

25

100 mg200 mg

50 mg

Zeit (h)

[Lu

mir

aco

xib

](µ

mo

l/l)

Hemmung (Abbildung 18). Weiterhin waren die durchschnittlichen Plasmakonzentrationen von

Lumiracoxib 8 Stunden (50 mg) oder 12 Stunden (100 mg und 200 mg) nach der

Dosiseinnahme höher als der ex-vivo bestimmte IC50-Wert für die COX-2-Hemmung.

Abbildung 16: Plasmakonzentrationen von Lumiracoxib nach der oralen Verabreichung von 50 mg, 100 mg oder 200 mg. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM von vier Probanden, die Lumiracoxib in verschiedenen Dosierungen erhielten, angegeben. 24 Stunden nach der Dosisverabreichung von 200 mg Lumiracoxib bei allen Probanden noch quantifizierbar. Jedoch war 24 Stunden nach der Gabe von 100 mg oder 50 mg Lumiracoxib die Substanz nur bei zwei bzw. einem Probanden im Plasma quantifizierbar.

Ergebnisse 82

0 4 8 12 16 20 24

0

20

40

60

80

100

120

140

100 mg200 mg

50 mg

Zeit (h)

CO

X-2

-Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

80% Hemmung

6.4.2 Ex-vivo-Hemmung der COX-2-Aktivität nach oraler Gabe von

Lumiracoxib

Die ex-vivo Hemmung der COX-2-Aktivität nach oraler Verabreichung von 50 mg, 100 mg oder

200 mg Lumiracoxib ist in Abbildung 17 gezeigt. Die durchschnittlichen pharmakodynamischen

Parameter sind in Tabelle 15 präsentiert. Lumiracoxib führte im Zeitraum von 1 bis 1,5 Stunden

zur kompletten Hemmung der COX-2-Aktivität bei allen untersuchten Dosisierungen (Tabelle

15).

Abbildung 17: Ex-vivo-Hemmung der COX-2-Aktivität nach einmaliger oraler Verabreichung von 50 mg, 100 mg oder 200 mg Lumiracoxib bis 24 Stunden nach der Einnahme. Alle Daten sind als Mittelwerte ± SEM von vier Probanden, die Lumiracoxib in verschiedenen Dosierungen erhielten, angegeben. Die eingefügte horizontale Linie stellt die 80%-ige COX-2-Hemmung dar. Die Zeiträume die zur maximalen COX-2-Hemmung notwendig waren lagen für alle

untersuchten Dosierungen im gleichen Bereich für die entsprechenden tmax von Lumiracoxib

(Tabelle 14, Tabelle 15). Die maximale COX-2-Hemmung war in dieser Zeitspanne bei allen

Dosierungen identisch ( ∼99,9 %). Jedoch konnten dosisabhängig bereits nach 5 Stunden

Unterschiede in der Hemmung der COX-2 nachgewiesen werden, die bei der Dosis von 50 mg

bei 90%, bei der Dosis von 100 mg bei 94% und für die 200 mg Dosis bei 97% lag (Tabelle 15).

Diese Tendenz verstärkte sich mit zunehmender Zeit.

Die durchschnittlichen Werte der Fläche innerhalb der Effekt-Zeitkurve (AWEC) unterschieden

sich zwischen den drei Gruppen innerhalb aller analysierten Zeiträume (5, 8, 12 oder 24

Stunden nach Medikation) nicht signifikant (Tabelle 15).

Ergebnisse 83

Tabelle 15: Ex-vivo bestimmte pharmakodynamische Parameter von Lumiracoxib nach der oralen Einnahme von 50 mg, 100 mg oder 200 mg Lumiracoxib.

50 mg 100 mg 200 mg

Zeit zur maximalen COX-2-Hemmung (h) 1,50 ± 0,53 1,06 ± 0,66 1,06 ± 0,66

Maximale Hemmung (%) 99,93 ± 0,07 99,7 ± 0,19 99,98 ± 0,02


0.25-5 hours (%) 89,5 ± 5,13 94,18 ± 2,52 96,89 ± 2,22


0.25-8 hours (%) 83,34 ± 5,7 91,37 ± 2,52 95,99 ± 2,03


0.25-12 hours (%) 76,94 ± 6,69 85,21 ± 2,42 91,89 ± 3,27


0.25-24 hours (%) 70,18 ± 7,22 76,81 ± 2,17 83,95 ± 4,79

AWEC0-5 hours (% · h) 453,87 ± 14,15 465,29 ± 8,02 478,53 ± 5,19

AWEC0-8 hours (% · h) 668,33 ± 35,87 717,06 ± 24,48 760,72 ± 10,16

AWEC0-12 hours (% · h) 850,48 ± 92,06 968,21 ± 56,85 1078,37 ± 44,27

AWEC0-24 hours (% · h) 1218,73 ± 260,37 1365,86 ± 163,84 1652,27 ± 221,86

AWEC: Effekt-Zeitkurve. Alle Daten sind als Mittelwerte ± SEM von vier Probanden, die Lumiracoxib in verschiedenen Dosierungen erhielten, angegeben.

In jeder Dosisgruppe kehrte die durchschnittliche COX-2-Aktivität 24 Stunden nach

Dosisverabreichung auf den Basiswert zurück, wobei eine relativ hohe Variabilität in der COX-2

zu diesem Zeitpunkt (Abbildung 17) beobachtet wurde.

Ergebnisse 84

-6,5 -6,0 -5,5 -5,0 -4,5 -4,0

0

20

40

60

80

100

IC50 = 0,14 µmol/l

log [Lumiracoxib] (mol/l)

CO

X-2

Hem

mu

ng

(%

)

6.4.3 Korrelation zwischen den Lumiracoxibplasmakonzentrationen und

der ex-vivo COX-2-Hemmung

Der berechnete ex-vivo IC50-Wert von 0,14 µmol/l (Abbildung 18) ist vergleichbar mit dem in-

vitro IC50-Wert von Lumiracoxib für die COX-2 (0,13 µmol/l), der bereits veröffentlicht wurde

(Capone et al., 2007).

Abbildung 18: Korrelation zwischen der ex-vivo COX-2-Hemmung und den Lumiracoxibplasmakonzentrationen. Für die Berechnung der ex-vivo IC50-Werte wurden die Lumiracoxibplasmakonzentrationen und die entsprechenden COX-2-Hemmungen nach der einmaliger oraler Verabreichung von 50 mg, 100 mg und 200 mg Lumiracoxib aufgetragen. Die Werte wurden von jeweils vier Probanden pro Dosis erhalten.

Ergebnisse 85

6.5 Klinisch-pharmakologische Untersuchungen zur

Pharmakokinetik und Pharmakodynamik von Naproxen

Die medizinischen Daten aus Untersuchungen mit Naproxen wurden in der Doktorarbeit von Dr.

med. Dominika Besz dargestellt (Besz, 2008).

6.5.1 Pharmakokinetik von Naproxen und ex-vivo-Hemmung der COX-1-

und COX-2-Aktivität nach einmaliger oraler Gabe von 220 mg

Naproxen Natrium bei gesunden Probanden

Die Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Naproxen nach der einmaligen oralen Einnahme von

220 mg Naproxen Natrium (A) sowie die entsprechenden COX-1- bzw. COX-2-Hemmungen (B

und C) sind in Abbildung 19 dargestellt.

A

B

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

20

40

60

80

100

120

140

95% Hemmung

Zeit nach der Dosiseinnahme (h)

CO

X-1

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

50

100

150

200

250

300


[Na

pro

xe

n]

(µM

)

Ergebnisse 86

C

Abbildung 19: Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Naproxen (A) und die entsprechenden COX-1- bzw. COX-2-Hemmungen (B bzw. C) nach einmaliger oraler Gabe von 220 mg Naproxen Natrium. Die Proben für die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Naproxen und für die Bestimmung der COX-Hemmung wurden vor der ersten Tabletteneinnahme sowie 1, 3 und 12 Stunden danach gewonnen. Die untere eingefügte horizontale Linie in Abbildung B stellt die COX-1-Hemmung von 95%dar. Es sind die Mittelwerte ± SEM von vier Probanden aufgetragen. Nach einmaliger Gabe von 220 mg Naproxen Natrium war die maximale Hemmung der COX-1

und COX-2 94,1% ± 1% bzw. 78,8% ± 5,5%. Die Zeiten bis zur maximalen Hemmung der COX-

1 und COX-2 entsprachen der tmax und lagen bei 1 Stunde nach Naproxengabe.

6.5.2 Pharmakokinetik von Naproxen und ex-vivo-Hemmung der COX-1

und COX-2-Aktivität nach oraler Gabe von 220 mg Naproxen Natrium

im Steady-state

Die folgenden Ergebnisse zur Pharmakokinetik von Naproxen (A) und zur Hemmung von COX-

1 bzw. COX-2 (B und C) wurden im Steady-state gewonnen und sind in Abbildung 20

präsentiert. Dabei nahmen die Probanden zweimal täglich 220 mg Naproxen Natrium für sieben

Tage ein. Das detailierte Protokoll ist in Abschnitt 5.3.4.5 beschrieben.

Nach der Beendigung der Medikamenteinnahme änderten sich die Aktivitäten der COX-1 und

COX-2 innerhalb von 36 Stunden auf 28 % bzw. 39 % der Ausgangswerte vor

Tabletteneinnahme (Zeitpunkt 0, Tag 1, Abbildung 20 B, C). Zu diesem Zeitpunkt waren die

Naproxenplasmakonzentrationen noch quantifizierbar und betrugen durchschnittlich 73,2 µM

(Abbildung 20 A).

Im Steady-state, das am dritten Tag der Tabletteneinnahme erreicht wurde, waren die

maximalen Hemmungen für die COX-1 bzw. COX-2 93,1 ± 1,3 % und 84,5 ± 3,1 %. Die

maximalen Hemmungen der COX-1 und COX-2 in dieser Studie wurden 4,5 ± 0,5 Tage bzw.

6,8 ± 1,3 Tage nach der ersten Dosisverabreichung beobachtet.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0

20

40

60

80

100

120

140


CO

X-2

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

Ergebnisse 87

1 2 3 4 5

0

50

100

150

200

250

300

8 9

Naproxeneinnahme Recovery(Tag 8 - 9)(Tag 1 - 7)

[Nap

roxe

n]

(µM

)

A

B

C

Abbildung 20: Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Naproxen (A) und die entsprechenden COX-1- bzw. COX-2-Hemmungen (B und C) im Steady-State nach oraler Gabe von Naproxen Natrium zweimal pro Tag für sieben Tage. Die Blutproben für die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Naproxen und COX-Hemmungen wurden vor der ersten Tabletteeinnahme und zu bestimmten Zeitpunkten am 1. Tag (Abbildung 19) sowie an den Tagen 2, 3, 4, 5 und 8 zwölf Stunden nach der vorherigen Abenddosis (sieh Protokoll Tabelle 3) gewonnen. Die Untersuchungen in der Recovery-Phase erfolgten bis 36 Stunden nach der letzten Tabletteeinnahme. Es sind die Mittelwerte ± SEM von vier Probanden aufgetragen. Die eingefügte horizontale Linie (B) stellt die 95%-ige COX-1-Hemmung dar.

1 2 3 4 5

0

20

40

60

80

100

120

140

8 9


95% Hemmung

CO

X-1

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

1 2 3 4 5

0

20

40

60

80

100

120

140

8 9


CO

X-2

Akt

ivit

ät(%

vo

n B

asis

lin

ie)

Ergebnisse 88

6.5.3 Korrelation zwischen den Naproxenplasmakonzentrationen und ex-

vivo-Hemmungen der COX-Isoformen

Der Zusammenhang zwischen den Plasmakonzentrationen von Naproxen und der ex-vivo-

Hemmung von COX-1 und COX-2 wurde mittels grafischer Analyse untersucht (Abbildung 21).

Dafür wurden die Ergebnisse aus der Steady-state-Untersuchung und der Einmalgabe von

Naproxen kombiniert. Dadurch war es möglich, die ex-vivo IC50-Werte für die Hemmung der

beiden COX-Isoformen nach Naproxeneinnahme zu bestimmen. Für die COX-1 wurde ein IC50-

Wert von 35,5 µmol/l, für die COX-2 ein IC50-Wert von 64,6 µmol/l errechnet.

A

B

Abbildung 21: Korrelationen zwischen der ex-vivo-Hemmung von COX-1- (A) und COX-2-Aktivität (B) und den Plasmakonzentrationen von Naproxen. Für die Bestimmung der ex-vivo IC50-Werte wurden die Plasmakonzentrationen von Naproxen und die entsprechenden COX-Hemmungen nach einmaliger oraler Gabe von Naproxen Natrium und im Steady-state verwendet. Die Daten wurden von vier Probanden erhalten.

-5,0 -4,5 -4,0 -3,5 -3,0

0

20

40

60

80

100

IC50 = 35,5 µmol/l

log [Naproxen] (mol/l)

CO

X-1

-Hem

mu

ng

(%

)

-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0

0

20

40

60

80

100

IC50 = 64.62 µmol/l

log [Naproxen] (mol/l)

CO

X-2

Hem

mu

ng

(%

)

Ergebnisse 89

Der sigmoidale Verlauf ist im Falle der COX-1 deutlicher ausgeprägt, da bei den maximalen

Plasmakonzentrationen nach einmaliger therapeutischer Dosierung von 220 mg Naproxen

Natrium eine 100 %ige Hemmung erreicht wurde (Abbildung 21). Weiterhin war auffällig, dass

für die COX-2 der sigmoidale Kurvenverlauf weniger deutlich ausgeprägt war als für die COX-1.

Dies ist auf die hohe Variabilität für die COX-Inhibition über den gesamten Bereich der

Plasmakonzentrationen zurückzuführen (Abbildung 21).

Diskussion 90

7 Diskussion

7.1 Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Metamizol

Der Wirkungsmechanismus von Metamizol konnte lange nicht aufgeklärt werden. Zuerst wurde

das Medikament mit einer vorwiegenden Hemmung der PGE-Synthese im Gehirngewebe in

Zusammenhang gebracht (Dembinska-Kiec, 1976). Jedoch widersprach eine spätere Studie

einer zellspezifischen Modulation, da eine vergleichbare hemmende Wirkung von dem

Hauptmetabolit von Metmizol (4-MAA) auf die Prostanoid-Freisetzung in Astrozyten und

Makrophagen gezeigt werden konnte (Lanz et al., 1986). Darüberhinaus wurde vor kurzem

behauptet, dass Metamizol eine Variante des COX-1-Genes, die sogenannte COX-3, selektiv

hemmt (Chandrasekharan et al., 2002). Diese Splicevariante ist durch den Verbleib des Intron-1

charakterisiert. Jedoch wurde in dieser Studie die COX-3 von Hunden und COX-1 bzw. COX-2

von Mäusen mit jeweils unterschiedlichen Aktivitäten verglichen. Metamizol zeigte dabei nur

eine schwache COX-3-Hemmung (IC50 = 52 µmol/l). Ein weiteres Problem ist die Tatsache,

dass die Induktion und die Aufrechterhaltung der Hyperalgesie eher durch Prostaglandine, die

durch die zentrale COX-2 gebildet wurden, als durch die COX-1 assozierten PGs vermittelt wird.

Zusätzlich dazu wurde kürzlich die Existenz einer humanen COX-3 in Frage gestellt, da die

Retention des Intron-1 beim Menschen zur Verschiebung des Leserahmens (frame-shift), zum

frühzeitigem Translationsstop und unvollständigem COX-3 Protein führte (Patrono, 2001; Hinz

et al., 2006).

Qin et al. gelang es, die geringe Expression von drei Splicevarianten der COX-1 im humanen

Gewebe nachzuweisen (Qin et al., 2005). Jedoch konnte kein Unterschied hinsichtlich der

Hemmung durch Metamizol zwischen der Wildtypvariante der COX-1 und einer Variante mit

Intron-1 festgestellt werden. Aufgrund der erwähnten Gründe mussten die Versuche, die

pharmakologische Wirkung von nichtsauren Analgetika mit der Hemmung der zentralen COX-3

zu erklären, verworfen werden. Obwohl weitere ausgezeichnete Arbeiten veröffentlicht wurden,

die die zentralen Wirkmechanismen des antinozizeptiven Effekts von Metamizol unterstützen

(Carlsson et al., 1986; Gelgor et al., 1992; Neugebauer et al., 1994; Shimada et al., 1994),

wurde eine periphere Wirkung in vergangenen Jahren weitgehend vernachlässigt.

Die vorliegende Arbeit ist die erste, die ex-vivo beim Menschen die Selektivität von Metamizol

zu den peripheren COX-Enzymen sowie die Bedeutung der entsprechenden

Metamizolmetabolite untersuchte. Hier wurde gezeigt, dass der Hauptmetabolit von Metamizol,

Methylaminoantipyrin (4-MAA), in-vitro und ex-vivo im Blut von Probanden zu einer deutlichen

Hemmung von COX-1 und COX-2 führt. In-vitro hemmte 4-MAA die COX-1 und COX-2

praktisch in gleichem Maße. Nach oraler Gabe von Metamizol waren die maximalen

Plasmakonzentrationen von 4-MAA bis zu 23,2- und 12,7-fach höher (1000 mg Dosis) als die

Diskussion 91

jeweiligen in-vitro bestimmten IC50-Werte für COX-1 bzw. COX-2. Aufgrund eines schnellen

Anflutens von 4-MAA innerhalb von 15 Minuten nach Tabletteneinnahme kam es bei beiden

Dosierungen (500 md und 1000 mg) zu einer unmittelbaren Hemmung der zwei Isoformen. Die

Plasmakonzentrationen von 4-MAA blieben nach Verabreichung für 8 Stunden (500 mg Dosis)

bzw. 12 Stunden (1000 mg Dosis) über den für jedes Isoenzym entsprechenden in-vitro

bestimmten IC50-Werten. Die ex-vivo Hemmung der COX-Enzyme korrelierte mit der

Plasmakonzentration von 4-MAA, wobei die ex-vivo-bestimmten IC50-Werte 2,5-fach für COX-1

und 5,3-fach für COX-2 niedriger als die jeweiligen in-vitro Werte waren. Im Einklang mit bereits

veröffentlichten Daten über andere COX-2-Inhibitoren (Hinz et al., 2006) wurde eine

beträchtliche Variabilität zwischen Probanden bezüglich der Plasmakonzentrationen von 4-MAA

und der ex-vivo-Inhibition von COX-2 beobachtet. Diese Variabilität könnte auch für den oben

erwähnten, obgleich sehr kleinen Unterschied zwischen den in-vitro und ex-vivo bestimmten

IC50-Werten mitverantwortlich sein.

Entsprechend wurden signifikante Unterschiede zwischen den Parametern der COX-Hemmung

(maximale und mittlere Hemmung, AWEC-Werte) für beide Metamizol-Dosen für COX-1

ermittelt. Im Gegensatz dazu, zeigten sich keine Unterschiede für die COX-2. Die Gründe dafür

sind unklar, aber genetische und interindividuelle Variabilitäten in der COX-2 oder in der

Pharmakokinetik sind möglicherweise dafür verantwortlich. (Patrono, 2001).

Im Gegensatz zu 4-MAA waren die maximalen Plasmakonzentrationen vom anderen

Metamizolmetabolit 4-Aminoantipyrin (4-AA) nach der 1000 mg Metamizol Dosis 2,8- und 5,7-

fach unter den in-vitro IC50-Werten für COX-1 bzw. COX-2. So erscheint ein signifikanter Beitrag

von 4-AA nach einmaliger Einnahme von Metamizol zur Hemmung beider Enzyme

unwahrscheinlich.

Aufgrund der schnellen Hydrolyse von Metamizol erreichte 4-MAA in kurzer Zeit die maximale

Plasmakonzentration. Dieses pharmakokinetische Profil steht im Einklang mit dem klinisch

erforderlichen schnellen Wirkungseintritt und einer viermaligen täglichen Einnahme. Bei

Verdoppelung der Dosis kann man eine mehr als zweifache Zunahme in den AUC-Werten

beider Metaboliten feststellen. Dies unterstützt die Hypothese einer nicht linearen

Pharmakokinetik von Metamizol (Levy et al., 1995). Die Zunahme nach Dosisverdoppelung war

deutlicher bei 4-MAA. Im Vergleich zu diesem Metabolit erreicht 4-AA die maximale

Plasmakonzentration später und wird auch mit mittleren terminalen Halbwertzeiten von 6,3

Stunden (500 mg Dosis) bzw. 5,7 Stunden (1000 mg Dosis) langsamer und variabler eliminiert.

Agranulozytose wird als schwerwiegende Nebenwirkung in Zusammenhang mit Metamizol

gebracht. Obwohl hier ein statistisch signifikanter Zusammenhang zu bestehen scheint, ist das

Auftreten von Agranulozytose äußerst selten (1 Fall pro Millionen Behandlungsperioden)

(Anonymous, 1986; Kaufman DW, 1991; Ibanez et al., 2005). Diese Tatsache verhinderte

Diskussion 92

ausführliche klinische Untersuchungen mit diesem Medikament. Aus diesem Grund gibt es auch

keine klinischen Studien zur Wirkung von Metamizol bei chronischen Schmerzen (Hackenthal,

1997). Dementsprechend sind tierische Studien, die auf eine im Vergleich zu NSAR geringere

entzündungshemmende Wirkung von Metamizol hinwiesen (Brune and Alpermann, 1983;

Tatsuo et al., 1994), nicht auf Menschen angewandt worden.

In vorliegende Untersuchungen rief Metamizol eine beträchtliche Hemmung der COX-2-Aktivität

hervor, die eindeutig über der COX-2-Hemmung anderer nicht saurer Wirkstoffe wie z.B.

Celecoxib und Rofecoxib nach einmaliger Dosierung von klinisch empfohlenen Dosen von

200 mg bzw. 25 mg lag (Hinz et al., 2006). Obwohl noch nicht nachgewiesen, weisen die

gegenwärtigen Daten daraufhin, dass die empfohlene 4-mal tägliche Gabe von 500 mg oder

1000 mg Metamizol (Levy et al., 1995) mit konstanten 70-90%-igen Hemmung von COX-2

assoziiert wird.

Hinsichtlich der nicht selektiven Hemmung der COX-Enzyme sind vorliegende Daten in

Einklang mit den Ergebnissen von Campos et al. (Campos et al., 1999), die gereinigte Enzyme

für ihre Untersuchungen benutzten. Dabei wurden jedoch verhältnismäßig hohe IC50-Werte (426

µmol/l für COX-1 und COX-2) beobachtet. Einer der Gründe für diese Tatsache liegt

möglicherweise in der kurzzeitigen (10 Minuten) Verwendung des inaktiven Prodrug Metamizol

in einem enzymatischen Assay. In der gleichen Veröffentlichung wurden weiterhin IC50-Werte

für die COX-1-Hemmung in Endothelialzellen der Rinderaorta und frischen menschlichen

Blutplättchen beschrieben, die weit über den notwendigen pharmakologischen Konzentrationen

lagen. Die Autoren schlossen daraus, dass Metamizol eine selektive COX-2-Hemmung in-vivo

hervorrufen könnte (Campos et al., 1999). In der Tat könnte diese Hypothese das reduzierte

Risiko für gastrointestinale Blutungen von Metamizol im Vergleich zu ASS und anderen NSAR

erklären (Laporte and Carne, 1987; Laporte et al., 1991). Trotz alledem konnten wir im Vollblut,

das eher die in-vivo Situation repräsentiert, eine signifikante Hemmung der COX-1-vermittelten

TXB2-Synthese beobachten. Bisherige Daten weisen darauf hin, dass im Serum nur eine

Hemmung der TXB2-Synthese von über 95% die Thrombozytenfunktion maßgeblich beeinflusst

(Reilly and FitzGerald, 1987). In vorliegenden Untersuchungen lag die Hemmung der COX-1-

vermittelten TXB2-Bildung in der 500 mg Gruppe unter 95%. Eine Inhibition der TXB2-Synthese

über 95% konnte jedoch in der 1000 mg Gruppe im Zeitraum zwischen 0,75 und 3 Stunden

nach Metamizoleinmahme beobachtet werden. Im Vergleich zu einer Einmaldosis von 100 mg

Aspirin, die zu einer Reduktion des thrombozytären TXB2 von über 95% für 24 Stunden führt

(Patrignani et al., 1982), hat Metamizol nur einen sehr kurzzeitigen thrombozytenhemmenden

Effekt. Andererseits war das Ausmaß der COX-1-Hemmung durch Metamizol stärker als bei

einer 75 mg Retardform von Diclofenac (Hinz et al., 2003). Aufgrund der geringen

gastrointestinalen Nebenwirkungen von Metamizol in epidemiologischen Studien und dem

widersprüchlichen Einfluss auf COX-1, wird vermutet, dass physikochemische Faktoren (z.B.

Diskussion 93

die nicht vorhandenen Säureeigenschaften) für die bessere gastrointestinale Verträglichkeit im

Vergleich zu den NSAR verantwortlich sind. Tatsächlich sind zwei Mechanismen hauptsächlich

für den ulcerativen Effekt von NSAR verantwortlich. Dabei handelt es sich zum einen um die

lokale Reizung der Mukosaschleimhaut und zum anderen um die Hemmung der

Prostaglandinsynthese. Die lokale Reizung der Schleimhaut ist dabei nur auf die NSAR

beschränkt, da diese sich aufgrund ihres sauren Charakters im sauren Milieu („Ionenfalle“)

akkumulieren (Brune et al., 1980). Weitere Studien weisen darauf hin, dass nicht nur die

alleinige Inhibition der Prostaglandinsynthese für die gastrointestinalen Komplikationen

verantwortlich ist (Frolich et al., 1986). So konnte gezeigt werden, dass eine dreimal tägliche

Gabe von 1000 mg Metamizol für 3 Tage trotz einer substantiellen Verringerung der PGE2-

Konzentrationen im Magensaft nicht zu schweren gastrointestinalen Beeinträchtigungen führte.

Zusammengefasst weißt die schnelle und deutliche Hemmung von COX-2 durch therapeutische

Dosierungen von Metamizol in menschlichen Blutmonozyten daraufhin, dass ein signifikanter

Anteil der analgetischen Wirkung von Metamizol wahrscheinlich durch periphere Mechanismen

vermittelt wird. Metamizol in Dosierung von 1000 mg ruft eine COX-2-Hemmung über 80 %, d.h.

noch höhere Dosierung (z.B. 2,5 mg) kann nur noch wenig zum Effekt beitragen, dagegen aber

die COX-1 vermittelten unerwünschten Effekte potenzieren.

Im Hinblick auf zu NSAR vergleichbare COX-1-Hemmung wird vermutet, dass eher

physikochemische Faktoren (z.B. die nicht vorhandenen Säureeigenschaften) für die bessere

gastrointestinale Verträglichkeit im Vergleich zu den sauren NSAR verantwortlich sind.

Aufgrund der ausgeprägten analgetischen Wirkung von Metamizol, seiner guten

gastrointestinalen Verträglichkeit und der freiverkäuflichen Anwendung in vielen Ländern

(insbesondere Lateinamerika, Asien, Ost- und Mitteleuropa) sind weitere klinische Studien zur

Aufklärung der peripheren analgetischen und antientzündlichen Mechanismen sinnvoll.

Diskussion 94

7.2 Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Paracetamol

Die Wirkungsweise von Paracetamol gehört auch wie Metamizol noch immer zu den

pharmakologischen Rätseln in der Schmerz-Forschung. Während das Arzneimittel zuerst mit

einer vorwiegenden Unterdrückung der PG-Synthese im Hirngewebe (Flower and Vane, 1972)

in Verbindung gebracht wurde, stellten nachfolgende Studien eine zellspezifische Modulation in

Frage (Lanz et al., 1986; Swierkosz et al., 2002; Warner et al., 2004). Einer der Gründe für

diese kontroversen Ergebnisse könnte an der Tatsache liegen, dass Paracetamol keine

messbaren Inhibitionen der PG-Bildung in aufgeschlossenen Zell-Präparationen, aber eine

profunde Unterdrückung in intakten Zellen auslöst (Graham and Scott, 2005). Trotz dieser

Ergebnisse wird Paracetamol als ein schwacher Inhibitor von peripheren COX-1 und COX-2

Enzymen angesehen. Auf der anderen Seite tauchen erste Anzeichen auf, die andeuten, dass

Paracetamol viele Eigenschaften mit selektiven COX-2 Inhibitoren teilt, da es keine toxischen

Effekte auf den Gastrointestinaltrakt auslöst (Garcia Rodriguez and Hernandez-Diaz, 2001),

keine Thrombozytenfunktion hemmt (Mielke, 1981; Catella-Lawson et al., 2001) und kaum

bronchiale Verengungen bei Aspirin-sensitiven Asthmatikern provoziert (Jenkins et al., 2004).

Basierend auf diesen klinischen Beobachtungen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Hypothese

einer selektiven COX-2- Inhibition durch Paracetamol untersucht, wobei menschliche Vollblut-

Proben benutzt wurden (Patrignani et al., 1994). Dadurch war es möglich den aussagekräftigen

Selektivitäts-Index zu bestimmen, mit dem die COX-Inhibition in einem physiologischen Milieu

gemessen wird und dadurch intakte zelluläre Interaktionen, die für den

Arachidonsäuremetabolismus essentiell sind, sowie die Arzneistoffbindung an Plasmaproteine,

berücksichtigt wird.

Die vorliegende Studie demonstriert, dass Paracetamol eine vierfach höhere Selektivität für die

Inhibition von COX-2 in-vitro und ex-vivo zeigt. Die Verabreichung einer Standarddosis des

Arzneistoffes bewirkte eine beinahe komplette Inhibition von COX-2 in menschlichen

Probanden, wohingegen nur eine moderate Inhibition von COX-1 beobachtet wurde. In

vorliegenden Studie war die Inhibition der COX-2-Aktivität durch Paracetamol sogar höher als

das entsprechend bei Einzeldosierung von Celecoxib und Rofecoxib bei klinisch empfohlenen

Dosierungen von 200 mg und 25 mg (Hinz et al., 2006). Im Gegensatz zu den letzteren

Verbindungen wurde keine substanzielle Variabiliät zwischen den Patienten bezüglich der

Plasmakonzentration von Paracetamol und dem entsprechendem Grad der ex-vivo COX-2

Inhibition beobachtet. Obwohl es noch nicht untersucht ist, wird es durch die bestehenden

Daten offensichtlich, dass die empfohlene viermalige Dosierung von 1000 mg Paracetamol am

Tag mit einer permanenten 60-80%-igen Inhibition von COX-2 verbunden sein könnte. Frühere

Daten (Catella-Lawson et al., 2001), die eine viel langsamere und unselektivere ex-vivo

Diskussion 95

Inhibition von COX-2 durch Paracetamol andeuteten, entstanden wahrscheinlich aufgrund der

Auswertung innerhalb eines begrenzten Zeitrahmens.

In Anbetracht des ähnlichen Verhaltens von Paracetamol und Coxiben auf die COX-2

vermittelten PGE2-Konzentration im menschlichen Vollblut, deuten vorliegende Daten an, dass

Paracetamol eine periphere COX-2 während einer Entzündung, ähnlich wie Rofecoxib und

Celecoxib, beeinflusst. Obwohl eine solche Annahme gerechtfertigt erscheint, wurde von

Paracetamol angenommen, keine entzündungshemmende Aktivität zu besitzen. In der Tat

basiert dieser Befund auf eine frühere Arbeit, die zeigt, dass Paracetamol keine Entzündungen,

die mit Gelenkrheumatismus assoziiert sind, hemmt (Boardman and Hart, 1967; Ring et al.,

1974). Dieses könnte durch die hohe extrazelluläre Konzentration der Arachidonsäure und

Peroxid im entzündeten Gewebe erklärt werden; beides schwächt den Effekt von Paracetamol

auf die PG-Synthese (Ouellet and Percival, 2001; Boutaud et al., 2002; Graham and Scott,

2005). Auf der anderen Seite mindert Paracetamol die Gewebe-Anschwellung nach einer

Kiefer-Operation bei Menschen, mit einer Wirksamkeit, sehr ähnlich der von Ibuprofen

(Skjelbred and Lokken, 1979; Bjornsson et al., 2003). Eine periphere entzündungshemmende

Wirkung wird ferner gestützt durch Ergebnisse, die Paracetamol als ein Inhibitor von

Nozizeption und Ödemen im “rat carrageenan footpad model” zeigen (Ferreira et al., 1978;

Honore et al., 1995), einem inflammatorischen Zustand, der sehr abhängig von COX-2-

vermittelten PGs ist (Smith et al., 1998).

Vorliegende Ergebnisse zeigen ferner, dass die COX-2-Blockade durch Paracetamol in

menschlichen Gefäßen, Beachtung auslösen sollte. Tatsächlich ist eine permanente Blockade

von COX-2-abhängigen PGs, einschließlich Prostacyclin und PGE2 die zurzeit plausibelste

Erklärung für die kardiovaskuläre Gefährdung, die von selektiven und nicht selektiven COX-2

Inhibitoren ausgeht (Cannon et al., 2006; Hinz et al., 2006). In diesem Zusammenhang wurde

ein anhaltender Anstieg des Blutdruckes nach langfristiger Anwendung als Hauptursache für die

kardiovaskulären Nebenwirkungen vorgeschlagen.

Bezüglich der Auswirkungen von Paracetamol auf den Blutdruck, fand eine große

Gruppenstudie heraus, dass die geregelte Anwendung von Paracetamol im Vergleich zur

Nichtanwendung durch ein signifikant höheres Risiko für die Entwicklung von Hypertonie

begleitet wurde (Forman et al., 2005). Bemerkenswerterweise war das relative Risiko von

Paracetamol ähnlich wie das der NSAR. In Übereinstimmung mit dieser Erkenntnis, zeigte sich

in einer großen, prospektiven, kürzlich veröffentlichten Studie, dass die Anwendung von

Paracetamol bei mehr als 15 Tabletten pro Woche nahezu das gleiche Risiko für

kardiovaskuläre Ereignisse, wie bei traditionellen NSAR mit sich bringt (Chan et al., 2006).

In der vorliegenden Arbeit reduzierte Paracetamol die COX-2-Proteinmenge in menschlichen

Monozyten weder in der Abwesenheit noch in der Anwesenheit von LPS. Dies schließt einen

Diskussion 96

signifikanten Beitrag zu einer verminderten COX-2-Expression durch eine verringerte PGE2-

Konzentraton in menschlichem Blut aus. Ferner wurde die Hemmung der COX-2 Aktivität durch

Paracetamol in Kurzzeit-Experimenten, in denen sowohl menschliche rekombinante COX-2

Enzyme als auch menschliche Monozyten als Matrix von COX-2 eingesetzt wurden, bestätigt.

Wie früher schon diskutiert wurde, hängt die Fähigkeit von Paracetamol als COX-2-Inhibitor

stark vom oxidierenden / antioxidierenden Status des umgebenden Systemes ab (Ouellet and

Percival, 2001; Graham and Scott, 2005). Daher kann die Anwesenheit von verschiedenen

enzymatischen und nichtenzymatischen antioxidierenden Komponenten im menschlichen

Plasma (Halliwell and Gutteridge, 1990) erklären, warum Paracetamol die ausgeprägteste

COX-2-Inhibition im menschlichen Vollblut im Vergleich mit den beiden anderen

experimentellen Systemen auslöst.

Die nur moderate Inhibition von COX-1 durch Paracetamol bei Probanden spiegelt sich durch

dessen schwache antithrombozytenaggregatorische Aktivität und der guten gastrointestinalen

Verträglichkeit wieder. Tatsächlich deuten frühere Daten an, dass nur eine Steigung über 95%

der Inhibition des TXB2 im Serum signifikant die Thrombozytenfunktion beeinflusst (Reilly and

FitzGerald, 1987). In Übereinstimmung mit unseren Daten hemmt Paracetamol bei einzelnen

oralen Dosierungen von 1000 mg (Mielke, 1981) oder von bis zu 1950 mg (Catella-Lawson et

al., 2001) nicht die Thrombozytenfunktion. Klinische Studien, die von einer Inhibition der

Thrombozytenfunktion durch Paracetamol berichten, benutzten hohe parenterale Dosierungen

des Arzneimittels (Niemi et al., 2000; Munsterhjelm et al., 2005). Dieselbe Abhängigkeit von der

Dosierung gilt auch für die gastrointestinale Verträglichkeit von Paracetamol. Demnach führen

höhere Dosierungen von Paracetamol, im Vergleich mit geringeren Dosierungen, zu höheren

Raten von gastrointestinalen Nebenwirkungen (z.B. Dyspepsie), wahrscheinlich aufgrund der

ausgeprägteren COX-1-Inhibition. Im Gegensatz zu mehreren, kurzzeitigen, randomisierten

Studien, deuten Ergebnisse von epidemiologischen Studien an, dass Paracetamol, bei

täglichen Dosierungen von >2 oder >2,6 g, das Risiko von stärkeren gastrointestinalen

Nebenwirkungen, einschließlich gastrointestinaler Blutungen oder Perforation, erhöht (Mielke,

1981; Rahme et al., 2002). Allerdings kann aufgrund dieser Daten nicht geschlussfolgert

werden, dass Paracetamol zu erhöhten gastrointestinalen Nebenwirkungen führt, da oftmals

Patienten mit einem gastrointestinalem Risiko bzw. Komplikationen mit Paracetamol behandelt

werden (Abramson, 2002). Demnach wird Paracetamol immer noch als frei von größerer

gastrointestinaler Toxizität angesehen (Bannwarth, 2004; Graham et al., 2005). Dennoch sollten

großangelegte, randomisierte, gastrointestinale Ausgangsstudien an Patienten durchgeführt

werden, die langfristig Paracetamol einehmen.

Mit Bezug auf die gastrointestinale Sicherheit von Paracetamol, erscheint eine andere Tatsache

bemerkenswert. Neben seiner signifikant geringeren Auswirkung auf COX-1 im Vergleich zu

den sauren NSAR, können physikochemische Faktoren, so wie das Fehlen der Säurefunktion

Diskussion 97

für die günstige Magenverträglichkeit sowohl von Paracetamol, als auch von Metamizol

verantwortlich sein. Folglich, abgesehen von der Fähigkeit, die PG-Synthese zu unterdrücken,

wird die ulzerogene Wirkung von NSAR im Magen von einem topisch reizenden Effekt auf das

Epithel, aufgrund des Phänomens „ ion traping“, d.h. aufgrund der Akkumulation von saueren

NSAR in gastrischen Epithelzellen begleitet (McCormack and Brune, 1987; Somasundaram et

al., 1997; Wallace, 1997). In diesem Zusammenhang wurde behauptet, dass die sauren NSAR

Schleimhautverletzungen produzieren, indem oxidative mitochondrielle Phosphorylierungen in

Epithelzellen ausgelöst werden, die eine verminderte zelluläre ATP-Produktion zur Folge haben,

sowie zelluläre Toxizität und eine gesteigerte mukosale Permeabilität (Somasundaram et al.,

1997). Ein COX-unabhängiger Mechanismus für die gastrointestinale Toxizität von NSAR wird

desweiteren gestützt durch Befunde in COX-1 Knock-out Mäusen, die noch gastrale Reaktionen

als Antwort auf die orale Verabreichung von Indomethacin entwickelten (Langenbach et al.,

1995).

Letztendlich begründet die Frage der nachgewiesenen selektiven ex-vivo COX-2-Inhibition in

Erwachsenen einen generellen Ablauf, der zu ermitteln bleibt. Im Falle des Geschlechtes

jedenfalls ist die früher nachgewiesene 22-prozentige Clearance (Ausscheidung) von

Paracetamol bei Männern im Vergleich zu Frauen (Miners et al., 1983) nicht als klinisch wichtig

betrachtet worden.

In Bezug auf Kinder ist die zu erzielende Plasmakonzentration von Paracetamol für die

Antipyrese 10-20 µg/ml (z.B., 66-133 µmol/l) (Rumack, 1978) was im Bereich der

Paracetamolkonzentrationen, die zu einer starken COX-2 Inhibition in menschlichem Vollblut

von Erwachsenen führen, liegt. Obwohl die ideale Plasmakonzentration für die Analgesie

unbestimmt bleibt, wird angenommen, dass sie innerhalb desselben Bereiches liegt (Mantzke

and Brambrink, 2002). Auf der anderen Seite empfehlen aktuelle Produkte eine rektale

Paracetamoldosis von 10-15 mg/kg für Kinder, die maximale Plasmakonzentrationen erbringt,

die geringer sind als die zitierte pharmakologische Konzentration, weshalb die Frage

aufgeworfen wird, ob diese Dosis für eine effektive post-operative Schmerztherapie geeignet ist

(Mantzke and Brambrink, 2002). In diesem Zusammenhang hat eine frühere Studie gezeigt,

dass in Kindern eine anfängliche rektale Paracetamoldosis von 40 mg/kg gefolgt von einer 20

mg/kg Dosis alle sechs Stunden benötigt wird, um geeignete antipyretische

Plamakonzentrationen zu erreichen (Birmingham et al., 2001). Hinsichtlich älterer Patienten

zeigen frühere Daten keine altersbezogenen Veränderungen in der Rate und im Ausmaß der

Resorption sowie Plasmakonzentrationen von Paracetamol (Triggs and Nation, 1975).

Diskussion 98

7.3 Entwicklung und Validierung einer analytischen Methode zur

Bestimmung von Lumiracoxib in Plasma von menschlichen

Probanden

Eine einfache, sensitive analytische Methode zur Bestimmung von Lumiracoxib in Plasma

mittels Flüssig-flüssig-Extraktion und HPLC-UV-Detektion wurde entwickelt und validiert.

Die Spezifität der Methode wurde dadurch nachgewiesen, dass in sechs untersuchten Leer-

plasmen keine Störpeaks an der Stelle der Analyten festgestellt wurden. Eine

Zusammensetzung der mobilen Phase aus Acetonitril:0.05 % Trichloressigsäure 35:65 (v/v)

erlaubt eine effektive Trennung der Analyten von einander und die Trennung des internen

Standardes vom Störpeak vor ihm.

Der Messbereich von 10 ng/ml bis 10000 ng/ml wurde in drei kleinere Messbereiche aufgeteilt.

Die Kalibrationsgerade jedes Bereiches bestand aus fünf Kalibrationspunkten. Die Linearität der

Kalibrationsgerade wurde in jedem Messbereich nachgewiesen und die

Lumiracoxibkonzentration von 10 ng/ml wurde als LOQ festgelegt.

Die Untersuchung der Präzision und Richtigkeit wurde für sieben verschiedene Konzentrationen

mit jeweils fünf Proben (Messungen) an einem Tag durchgeführt. Bei allen Konzentrationen

wurden eine niedrige Standardabweichung und ein Variationskoeffizient bis zu maximal 7,5 %

ermittelt, woraus sich eine sehr geringe Streuung der Analysenergebnisse und damit eine hohe

Präzision der Methode ergab. Auch die Bestimmung der Inter-day-Präzision ergab mit

Variationskoeffizienten von 4,5 % bzw. 8,3 % gute Ergebnisse, wodurch die Gleichmäßigkeit

und Qualität von Aufarbeitung und Messung auch an unterschiedlichen Tagen bestätigt wurde.

Diese analytische Methode wurde für die Bestimmung von Lumiracoxib in Plasma bei gesunden

Probanden in der nachstehenden Studie verwendet. Alle gemessenen Konzentrationen lagen

im Messbereich dieser Methode.

Diskussion 99

7.4 Untersuchungen zur COX-2-Hemmung durch Lumiracoxib in

verschiedenen Dosierungen

Die vorliegende Arbeit demonstrierte, dass die orale Gabe von 50 mg Lumiracoxib bei

gesunden Probanden die COX-2 in Blutmonozyten in einem vergleichbaren Ausmaß wie

100 mg oder 200 mg Lumiracoxib hemmt. Die maximale Plasmakonzentrationen von

Lumiracoxib waren 29- (50 mg), 65- (100 mg) und 131-fach (200 mg) über der Konzentration

(IC50), die die Hälfte der maximalen COX-2-Hemmung ex-vivo bewirkt. Das spiegelt eine

schnelle und vollständige Hemmung dieses Enzymes durch jede Dosis wider.

Die maximalen Plasmakonzentrationen des Medikamentes wurden innerhalb eines Zeitraums

von 1,5 bis zu 2,4 Stunden nach der Verabreichung beobachtet, was mit dem schnellen

Einsetzen der Schmerzlinderung durch das Medikament übereinstimmt (Bannwarth and

Berenbaum, 2007). Im Einklang mit der kurzen Plasmahalbwertzeit von Lumiracoxib kehrten die

durchschnittlichen COX-2-Aktivitätswerte nach 24 Stunden auf das Niveau vor der

Tabletteneinnahme zurück. Trotz seiner schnellen Elimination scheinen klinische Studien nur

die einmalige tägliche Dosierung von Lumiracoxib zu empfehlen (Bannwarth and Berenbaum,

2007). Ein möglicher Grund für diese offenbare Diskrepanz kann die Tatsache sein, dass der

saure Arzneistoff in das entzündete Gewebe abgesondert wird und dadurch die Hemmung der

Prostaglandinsynthese an den entzündeten Stellen über das ganze Dosisintervall gewährleistet.

Dementsprechend hatten die Patienten mit rheumatischer Arthritis, die mit Lumiracoxib 400 mg

einmal täglich für 7 Tage behandelt wurden, ca. 3-fach höhere Steady-state-Konzentrationen

von Lumiracoxib in der Synovialflüssigkeit als im Plasma (Scott et al., 2004). Um diesen Befund

zu verallgemeinern, sind jedoch mehr Daten, insbesondere von Patienten, die einmal täglich mit

niedrigeren Dosen von Lumiracoxib behandelt wurden, notwendig.

Es wird angenommen, dass die Hemmung der COX-2 ex-vivo ein Marker der antientzündlichen

und schmerzlindernden Wirkung von COX-Inhibitoren darstellt. Blutproben passen in diesem

Zusammenhang gut, da die Messungen in einem physiologischen Milieu durchgeführt werden,

wodurch die variable Bindung des Medikamentes zu Plasmaproteinen berücksichtigt wird. Die

Tatsache, dass Lumiracoxib in den Dosen von 50 mg, 100 mg und 200 mg eine ähnliche COX-

2 hemmende Wirkung in diesem System hervorruft, wirft die Frage auf, ob die Dosierungen

kleiner als 100 mg für die Schmerztherapie genügend sind. In der Tat zeigte eine klinische

Studie, dass Patienten mit Osteoarthritis, die randomisiert Lumiracoxib (50, 100 oder 200 mg

zweimal täglich oder 400 mg einmal täglich) oder Diclofenac (75 mg zweimal täglich) erhielten,

eine vergleichbare Schmerzlinderung hatten (Schnitzer et al., 2004a).

Im Hinblick auf die offensichtlich dosisabhängige Lebertoxizität von Lumiracoxib (Schnitzer et

al., 2004b), könnten niedrigere Dosen eventuell Leberschäden vermeiden, wodurch die Vorteile

Diskussion 100

dieses Arzneistoffes wieder genutzt werden könnten. Laut einer jüngsten Behauptung des

Herstellers (Novartis, 2007) wurde Lumiracoxib in der Dosis von 100 mg mit nur neun starken

hepatischen Ereignissen weltweit in Verbindung gebracht, die alle nach einer Behandlung von

länger als einem Monat aufgetreten sind. Das entspricht einer Rate von 5,2 Ereignissen pro

100 000 Patientenjahren, die innerhalb der erwarteten Rate für NSAR liegt (Rubenstein and

Laine, 2004).

Außerdem deutet ein neuer Hinweis (Li et al., 2008) darauf hin, dass sich die Lebertoxizität

durch Lumiracoxib einen gemeinsamen Mechanismus mit dem strukturell ähnlichen Diclofenac

teilt, indem beide Substanzen eine CYP2C9-vermittelte Biotransformation zu chemisch

reaktiven Metaboliten (elektrophile Chinon Imine Arten) erfahren. Tatsächlich geht der

Gebrauch von Diclofenac mit einer ähnlichen Lebertoxizität einher, aber im Hinblick auf seine

therapeutischen Vorteile wird diese Gefahr als akzeptabel betrachtet.

Insgesamt untersucht die vorliegende Studie die Notwendigkeit, Lumiracoxib in den Dosen über

100 mg zu verabreichen, und ob die Dosen bis zu 100 mg für die COX-2-Hemmung und

Schmerzlinderung ausreichen können. Im Hinblick auf eine anhaltende praktisch 100%-ige

Hemmung der COX-2 bei den untersuchten Dosierungen (50 mg, 100 mg, 200 mg) erscheinen

die hohen Dosen von 200 und 400 mg sinnlos. In Anbetracht der eindrucksvollen

gastrointestinalen Verträglichkeit von Lumiracoxib (Schnitzer et al., 2004b) könnte

vorgeschlagen werden, die niedrigeren Dosierungen von Lumiracoxib für die Schmerztherapie

noch einmal zu überlegen. Es könnte durchaus sein, dass Lumiracoxib ein verbessertes

Analogon (z.B. weniger gastrointestinale Toxizität, kein Einfluss auf Blutkoagulation) des

weltweit bevorzugten nichtselektiven NSAR Diclofenac ist.

Diskussion 101

7.5 Untersuchung zur thrombozytenhemmende und potenziell

kardioprotektive Wirkung von Naproxen

Der Einfluss von Naproxen auf das kardiovaskuläre System konnte bisher nur schwer

interpretiert werden. Einerseits weisen neue Daten der vorzeitig abgebrochenen Alzheimer`s

Disease Antiinflammatory Prevention (ADAPT)-Studie mit Celecoxib, Naproxen und Placebo bei

Patienten mit Alzheimer auf ein erhöhtes kardiovaskuläres und cerebrovaskuläres Risiko von

Naproxen hin (ADAPT Reserach Group, 2006). Jedoch sind diese Daten keineswegs endgültig,

da diese Studie nicht geplant wurde um Unterschiede im kardiovaskulären und

cerebrovaskulären Risiko von COX-Inhibitoren nachzuweisen und da die Ergebnisse

retrospektiv zusammengefasst wurden. Außerdem stehen diese Ergebnisse im Gegensatz zu

einer Meta-Analyse von 138 veröffentlichten und unveröffentlichten, randomisierten

Untersuchungen (Kearney et al., 2006) die zeigten, dass das Auftreten von ernsten vaskulären

Ereignissen zwischen einem COX-2-Hemmer und jedem NSAR außer Naproxen ähnlich ist,

und dass das Risiko von Naproxen mit Placebo vergleichbar ist. Die Ereignisrate von

vaskulären Nebenwirkungen war in den untersuchten Studien im Vergleich zum Placebo 0,92

für Naproxen, 1,51 für Ibuprofen und 1,63 für Diclofenac. Auf der anderen Seite konnte

nachgewiesen werden, dass die andauernde und regelmäßige Einnahme von Naproxen

(500 mg zweimal täglich) die COX-1-Aktivität in Thrombozyten und die dadurch vermittelte

Plättchenaggregation während des gesamten Dosierungsintervals in einigen, aber nicht in allen

Probanden beeinflussen konnte (Capone et al., 2004). Auf Grund der publizierten Studien

besteht Konsens, dass die 95 %-ige Hemmung der TXB2-Synthese im Serum die

Thrombozytenfunktion klinisch relevant beeinflusst (Reilly and FitzGerald, 1987). Deshalb

könnte eine ausgeprägte und lang andauernde Hemmung der COX-1 durch Naproxen ein

möglicher Mechanismus für die potentiell kardioprotektive Wirkung sein.

Die vorliegende Studie untersuchte, ob auch OTC Dosierungen von freiverkäuflichem Naproxen

Natrium (220 mg zweimal täglich) eine ausreichende COX-1-Hemmung nach einer einzelnen

Dosisverabreichung und im Steady-State erzeugen können. Es konnte festgestellt werden, dass

die Hemmung der COX-1-vermittelten TXB2-Synthese nach einer einzelnen Naproxendosis

mehr als 95 % in zwei von vier Probanden zum Zeitpunkt der maximalen Plasmakonzentration

(tmax) war. Jedoch war im Vergleich zur Einmalgabe von 100 mg Aspirin®, die eine anhaltende

Hemmung des Thrombozyten-TXB2 für 24 h (Reilly and FitzGerald, 1987) verursacht, die

Wirkung von 220 mg Naproxen Natrium auf TXB2 nur kurzzeitig. Weiterhin wurde festgestellt,

dass bei einem von vier Probanden die COX-1 im Steady-State über 95 % innerhalb des

gesamten Dosierungsintervalls gehemmt wurde. Auf der Grundlage dieser Daten ist es

vorstellbar, dass die dauernde Behandlung mit Naproxen Natrium in Dosen von 220 mg für die

Kardioprotektion in allen Patienten nicht ausreichend ist.

Diskussion 102

Die Analyse der COX-2-Aktivität in Probanden, die mit Naproxen behandelt wurden, zeigte

maximale Hemmungen von 79 % (einzelne Dosis) und von 80 % (Steady-state). Im Hinblick auf

vorherige Daten, die eine direkte Korrelation in-vitro COX-2 IC80-Werte zu analgetischen

Plasmakonzentrationen der verschiedenen COX-2-Hemmer (Huntjens et al., 2005) zeigte,

könnte man diese Hemmung als ausreichend für die effiziente Schmerzlinderung in OTC

Dosierungen betrachten. Tatsächlich lag die gemessene COX-2-Hemmung durch niedrige

Dosierungen von Naproxen nicht unter der COX-2-Hemmung, die durch analgetische

Standarddosierungen von selektiven COX-2-Hemmer erreicht wird. Entsprechend rief Celecoxib

(200 mg zweimal täglich) und Rofecoxib (25 mg einmal täglich) eine 81%- oder 72%-ige COX-

2-Hemmung im Steady-state hervor (Hinz et al., 2006). Beachtenswerterweise wurde in dieser

Arbeit eine wesentliche Variabilität zwischen Probanden bezüglich der Plasmakonzentrationen

von Naproxen und dem entsprechenden Grad der COX-2-Hemmung beobachtet. Diese

Beobachtung stimmt mit vorherigen Daten überein, die mit den selektiven COX-2-Hemmern

(Hinz et al., 2006) erreicht wurden. Der Grund für dieses Verhalten ist unklar. Aber mehrere

Faktoren, einschließlich genetischer Variabilitäten im Zielprotein, in arzneimittel-

metabolisierenden Enzymen oder die Variabilität in der Pharmakokinetik zwischen den

Probanden scheinen mögliche Gründe zu sein (Patrono, 2001).

In einer Veröffentlichung wurde berichtet, dass die in-vitro IC50-Werte von Naproxen in

menschlichen Vollblut innerhalb der pharmakologischen Konzentrationsreihe des NSAR, d. h.

bei ca. 16 µM für COX-1 und bei 28 µM für COX-2 lagen (Patrignani et al., 1997). In

Übereinstimmung mit diesen Daten zeigt die vorliegende Analyse der Korrelation von

Naproxenplasmakonzentrationen mit der ex-vivo Hemmungen von COX-1 und COX-2 eine

bevorzugte Blockade der COX-1. Die berechneten ex-vivo IC50-Werte waren 35,5 µM für COX-1

bzw. 64,6 µM für den COX-2. Diese Daten erklären auch die langsame Wiederherstellung

(Recovery) von beiden Enzymen nach Naproxeneinnahme. Dementsprechend waren die

durchschnittliche Naproxenplasmakonzentrationen, die 36 Stunden nach der Beendigung der

Naproxeneinnahme gemessen wurden, noch über oder leicht unter den ex-vivo IC50-Werten für

die COX-1 bzw. COX-2. Deswegen wurden die COX-1 und COX-2-Aktivitäten nur zu 28% bzw.

39% im Bezug auf die jewelige Aktivität vor Naproxeneinahme an diesem Zeitpunkt

wiederhergestellt.

Zusammengefasst wird die verlängerte Behandlung von gesunden Probanden mit Naproxen

Natrium mit OTC Dosen mit einer größeren als 90%-igen Hemmung der COX-1 und einer

ausreichenden bis zu 80%-igen Hemmung der COX-2 begleitet. Naproxen-Natrium kann

funktionell relevante antiaggregatorische Wirkung auf Grund einer fast ganzen und anhaltenden

Hemmung des COX-1 in einer beschränkten Zahl von Patienten hervorrufen, aber das muss in

weiteren Analysen bestätigt werden.

Schlussfolgerungen 103

8 Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden:

• Metamizol führt zu einer wesentlichen dosisabhängigen Hemmung der beiden COX-

Enzymen in-vitro und ex-vivo im Blut von Probanden durch seinen Metabolit 4-MAA. Die

schnelle und deutliche Hemmung von COX-2 in menschlichen Blutmonozyten

unterstützt die Annahme, dass ein signifikanter Anteil der analgetischen Wirkung von

Metamizol wahrscheinlich durch periphere Mechanismen vermittelt wird. Dabei wurde

keine COX-1/COX-2-Selektivität festgestellt. Es wird vermutet, dass physikochemische

Faktoren (z.B. die nicht vorhandenen Säureeigenschaften) für die bessere

gastrointestinale Verträglichkeit im Vergleich zu den sauren NSAR verantwortlich sind.

Auf Grund der guten Gewebepenetration von Metamizol lässt sich vermuten, dass auch

im ZNS eine analgetisch ausreichende COX-2-Hemmung geschieht. Der nachhaltige

Effekt von 1000 mg Metamizol lässt höhere Einzeldosen sinnlos erscheinen.

• Nach einmaliger Einnahme von 1000 mg Paracetamol betrug die Hemmung von COX-2

in-vitro und ex-vivo mehr als 80%, in etwa vergleichbar mit NSAR und COX-2 Inhibitoren.

Andererseits, fehlte eine relevante COX-1-Blockade (mind. 95%), die für die

Unterdrückung der Thrombozytenfunktion notwendig ist. In-vitro und ex-vivo zeigte

Paracetamol eine ca. 4-fach höhere Selektivität für COX-2. Auf Basis der

nachgewiesenen COX-2-Hemmung sollte Paracetamol einer kritischen Analyse

hinsichtlich seines kardiovaskulären Risikopotentials unterzogen werden.

• Lumiracoxib ruft in der Dosierung von 50 mg eine vollständige und anhaltende COX-2-

Hemmung hervor. Es erscheint sinnvoll eine Anwendung von Lumiracoxib in den Dosen

bis zu 100 mg für Schmerztherapie zu überlegen.

• Die Gabe von 220 mg Naproxen Natrium zweimal täglich ruft eine starke Hemmung von

beiden Enzymen hervor. Obwohl eine antikoagulatorische und damit potenziell

kardioprotektive Hemmung der COX-1 bei einzelnen Probanden bereits mit OTC

(rezeptfreie) Dosierung beobachtet wurde, dürfte eine zuverlässige kardioprotektive

Wirkung erst bei Dosen um 1g / Tag erreicht werden.

Fazit: Auf Grund der vorgelegten Untersuchungen erscheint eine kritische Analyse der

„üblichen“ Dosierungen von Cyclooxygenasehemmern geboten.

Literaturverzeichnis 104

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Lebenslauf 116

9 Lebenslauf

Name Olga Cheremina

Geburtsdatum 28. Februar 1970

Geburtsort Kysyl / Russland

Staatsangehörigkeit Russisch

e-mail [email protected]

Familienstand verheiratet, 1 Kind (10 Jahre alt)

Beruflicher Werdegang

09/1977 – 07/1987 Allgemeinbildende Schule in Kysyl / Russland

Abschluss: Hochschulzugangsberechtigung

09/1987 – 06/1992 Polytechnische Universität, Tomsk

Studium: Chemische Technologie der biologisch

aktiven Verbindungen

Abschluss: Diplom-Ingenieur-Chemietechnologe

09/1992 – 02/1996 Chemiebetrieb „Synthesekautschuk“, Toljatti

Schichtchemikerin in analytischem Labor

03/1996 – 07/1998 Medizinische Fachschule, Omsk

Umzug und Ausbildung zur Krankenschwester

Abschluss: Diplom-Krankenschwester

08/1998 – 12/1999 Familienzeit

01/2000 – 06/2000 Regionale Pharmaziegesellschaft „Pharmamarket“ GmbH Moskau

Außendienstmitarbeiterin in Omsk

26.07.2000 Einreise in die Bundesrepublik Deutschland

08/2000 – 05/2001 Familienzeit

06/2001 – 06/2003 Sprach- und Integrationskurse in Bundesrepublik Deutschland

Lebenslauf 117

07/2003 – 12/2003 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und

Toxikologie, Arbeitsgruppe Arzneistoffanalytik

Praktikum als Stipendiatin der Otto Benecke Stiftung




Wissenschaftliche Hilfskraft




Wissenschaftliche Angestellte und Promotionsstudium unter

Betreuung von Prof. Dr. med. Dr. h.c. K. Brune und Prof. Dr. rer.

nat. B. Hinz

Veröffentlichungen 118

10 Veröffentlichungen

Aus dieser Dissertation sind die folgenden Publikationen hervorgegangen: Originalarbeiten

Dezember 2005 Cheremina O., Bachmakov J., Neubert A., Brune K., Fromm M.F., Hinz

B., (2005). Simultaneous determination of oxycodone und its major

metabolite, noroxycodone in human plasma by high-performance

liquid chromatography. Biomed Chromatogr., 19:777-82

Oktober 2006 Cheremina O., Brune K., Hinz B., (2006). A validated high-performance

liquid chromatographic assay for determination of lumiracoxib in

human plasma. Biomed Chromatogr., 20:1033-7

August 2007 Hinz B., Cheremina O., Bachmakov J., Renner B., Zolk O., Fromm M. F.,

Brune K. (2007). Dipyrone elicits substantial inhibition of peripheral

cyclooxygenases: new insights into the pharmacology of an old

analgesic. FASEB J., 21:2343-51

Februar 2008 Hinz B., Cheremina O., Brune K. (2008). Acetaminophen (Paracetamol)

is a selective cyclooxygenase-2 inhibitor in man. FASEB J., 22: 383-

90.

Sertürner-Preis 2007

April 2008 Hinz B, Cheremina O, Besz D, Slotnick S, Brune K. (2008). Impact of

naproxen sodium at over-the-counter doses on cyclooxygenase

isoforms in human volunteers. Int J Clin Pharmacol., 46: 180-6

Februar 2009 Hinz B, Renner B, Cheremina O, Besz D, Zolk O, Brune K. (2009).

Lumiracoxib inhibits cyclo-oxygenase 2 completely at the 50 mg

dose: is liver toxicity avoidable by adequate dosing? Ann Rheum

Dis., 68: 289-91

Veröffentlichungen 119

Posterpräsentationen

März 2007 Cheremina O., Bachmakov J., Brune K., Hinz B. Metamizol elicits

substantial inhibition of peripheral cyclooxygenases in human

volunteers.

(48. Frühjahrstagung der Deutsche Gesellschaft für Experimentelle und

Klinische Pharmakologie und Toxikologie in Mainz).

Oktober 2007 Cheremina O., Brune K., Hinz B. Acetaminophen (Paracetamol) is a

selective Cyclooxygenase-2 inhibitor in man.

(8. Jahreskongress der Deutsche pharmazeutischen Gesellschaft in

Erlangen).

Oktober 2007 Cheremina O., Bachmakov J., Brune K., Hinz B. Metamizol elicits

substantial inhibition of peripheral cyclooxygenases in human

volunteers.

(8. Jahreskongress der Deutsche pharmazeutischen Gesellschaft in

Erlangen).

März 2008 Cheremina O., Besz D, Renner B., Brune K., Hinz B. The 50-mg dose of

lumiracoxib is sufficient to elicit complete cyclooxygenase-2

inhibition in man.



März 2008 Cheremina O., Brune K., Hinz B. Acetaminophen (Paracetamol) is a

selective Cyclooxygenase-2 inhibitor in man.



Danksagung 120

Danksagung

Sehr herzlich bedanken möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. Dr. Kay Brune, dass er mir die

Durchführung dieser Arbeit am Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und

Toxikologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg ermöglicht hat. Mit großer

Bewunderung habe ich Herrn Professor Brune gesehen, wie er sich selbstlos für die

Wissenschaft als Proband einsetzt. Ich schätze mich sehr glücklich, dass ich mit ihm diese

Versuche durchführen konnte. Ich möchte an dieser Stelle nochmals meinen besonderen Dank

zum Ausdruck bringen.

Mein großer Dank geht auch an Herrn Professor Dr. Burkhard Hinz für die Übertragung der

interessanten Themen, für seine Unterstützung und sein stetes Interesse am Fortgang der

Arbeit. Seine wissenschaftliche und methodische Fragestellungen, sowie die konstruktive Kritik

trugen entscheidend zur Realisierung meines Promotionsvorhabens bei.

Herrn Professor Dr. Reinhard Troschütz möchte ich danken, dass er meine Arbeit seitens der

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität betreute, sowie Herrn

Professor Geoffrey Lee, dass er sich als Vorsitzender bei Promotionsprüfung zur Verfügung

gestellt hat.

Ich bedanke mich sehr bei Ulrike Weinzierl für die Durchführung der ELISA Messungen und die

Westernblot-Analyse.

Auch gilt mein großer Dank den Ärzten unseres Institutes, die sich als Probanden für

Selbstversuche zur Verfügung gestellt haben. Besonderes möchte ich mich bei dem Dr. Bertold

Renner bedanken.

Mein besonderer Dank geht an Dr. Hartmut Gläser, weil er immer für Fragen und Diskussionen

zur Verfügung stand und da ich immer auf seine geduldige Unterstützung zählen konnte.

Auch gilt mein großer Dank Martin Gillich und Daniel Auge für die technische Unterstützung in

Fragen der Arzneistoffanalytik.

Bei dieser Gelegenheit möchte ich nicht versäumen, meinen Dank an allen Kollegen des

Lehrstuhls für Klinische Pharmakologie und Klinische Toxikologie für die sehr angenehme

Arbeitsatmosphäre und für das nette Beisammsein im Sozialraum auszurichten.

Pharmakokinetische und pharmakodynamische Untersuchungen ... · Pharmakodynamik von Naproxen...

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