Physikalische Chemie - Grundmodul...Joh Ins 0 I / [a.u.] Abbild @647n scheide 1.2 Z Trotz z stark s...

Physikalische Chemie

- Grundmodul -

Konfokale Einzelmolekülmikroskopie

Version: November 2011 Verfasser: PD Dr. Gerald Hinze


Johannes Gutenberg - Universität Seite 2 Grundmodul Physikalische Chemie Institut für Physikalische Chemie

Zusammenfassung In diesem Versuch wird das optische Auflösungsvermögen eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops bestimmt. Anhand zeitabhängiger Fluoreszenzintensitäts-messungen an einzelnen Molekülen wird deren Triplettkinetik berechnet. Grundlagen: Optik, Detektoren, Fluoreszenz, Jablonski Diagramm, Korrelations-funktionen Lernziele • konfokale Fluoreszenzmikroskopie • Einzelmolekülspektroskopie • optische Auflösungsvermögen • zeitabhängige Messungen • Korrelationsfunktionen



0 Inhalt 0 Inhalt .................................................................................................................... 3

1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu konventionellen Ensemblemessungen ................................................................................................. 5

1.1 Homogene und inhomogene Linienform ...................................................... 5

1.2 Zeitabhängige Fluoreszenz .......................................................................... 6

2 Experimentelle Voraussetzungen für Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen Molekülen ................................................................................................................... 7

2.1 Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen ................................................. 7

2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen ............................... 8

3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie ................................................................... 10

3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie .................................................... 10

3.1.1 Auflösungsvermögen .............................................................................. 10

3.1.2 Vergrößerung .......................................................................................... 12

3.1.3 Fluoreszenzmikrokopie ........................................................................... 13

3.1.4 Konfokale Mikroskopie ............................................................................ 14

3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes (Praktikum) ............ 16

3.2.1 Anregungsstrahlengang .......................................................................... 16

3.2.2 Scanner .................................................................................................. 18

3.2.3 Detektionsstrahlengang .......................................................................... 18

4 Bedienungsanleitung.......................................................................................... 19

4.1 Wichtig ! ..................................................................................................... 19

4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen ............................................. 20

4.3 Mikroskopsteuerung ................................................................................... 22

4.3.1 Hardware ................................................................................................ 22

4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops ........................................................ 23

4.4 Einzelnen Operationen ............................................................................... 24

4.4.1 Probenwechsel ....................................................................................... 24

4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds .......................................................... 26

4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren .................................................... 27

4.5 Datenauswertung ....................................................................................... 28

4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder ................................................................ 28

4.5.2 Analyse der Zeitspuren ........................................................................... 29

5 Aufgabenstellung ............................................................................................... 32



5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen .................................... 32

5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI) ...................................................... 33

6 Fragen zur Vorbereitung .................................................................................... 37

7 Literatur: ............................................................................................................. 38

8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches ............................................................ 39

9 Tabellen für die Messwerte ................................................................................ 40



1 Die Fluoreszenz einzelner Moleküle – Vergleich zu konventionellen Ensemblemessungen

Bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie wird eine hinreichend große Anzahl (ein Ensemble) von Molekülen auf ihr Fluoreszenzverhalten hin untersucht. Die gemessene Fluoreszenz entsteht durch Überlagerung der Beiträge einzelner Moleküle in dem Probenvolumen. Wenn alle Moleküle zeitlich und spektral genau gleiches Verhalten zeigen, wird die Messung an einem einzelnen Molekül genau die gleichen Ergebnisse liefern wie Ensemblemessungen, allerdings mit einem deutlich ungünstigerem Signal-zu-Rausch Verhältnis.

In den meisten Systemen unterscheiden sich jedoch die Fluoreszenzeigenschaften der Moleküle untereinander. Dabei sind Unterschiede sowohl in den spektralen Eigenschaften wie auch im zeitlichen Verhalten möglich. Nimmt beispielsweise die Fluoreszenz einer Farbstofflösung mit zunehmender Bestrahlungsdauer ab, kann nicht ohne weiteres entschieden werden, ob nun jedes einzelne Farbstoffmolekül weniger abstrahlt oder aber ob ein zunehmender Anteil der Moleküle überhaupt nicht mehr fluoresziert – oder ob beide Effekte gleichzeitig auftreten.

Viele spektroskopische Eigenschaften von Farbstoffmolekülen können erst durch die Untersuchung einzelner Moleküle bestimmt werden. Im folgenden werden Beispiele für die beiden wichtigen Aspekte – spektrale Eigenschaften und zeitliches Verhalten – skizziert.

1.1 Homogene und inhomogene Linienform

Die Farbstoffmoleküle liegen typischerweise in einer Lösung oder eingebettet in eine feste Matrix vor. Je nach Art der Umgebungsmoleküle und deren räumlicher Anordnung um einen Farbstoff werden dessen spektrale Eigenschaften beeinflusst.

Als Beispiel werden die Emissionsspektren des Farbstoffs Terrylendiimid gezeigt. Es sind deutliche Unterschiede in den Spektren zu sehen. Je nach lokaler Umgebung werden die Maxima der Spektra verschoben. In einer Ensemblemessungen würde man nur ein Gesamtspektrum erhalten, die lokale Information wäre nicht zugänglich.

JohIns

0

I / [a

.u.]

Abbild@647nscheide

1.2 Z

Trotz zstark sein ÜbVerschwieder oder Tdetektie

Abbild

In eineIntensit

hannes Gutestitut für Phys

650

dung 1 : Enm), eingeen sich die

Zeitabhän

zeitlich konchwanken

bergang ewinden desichtbar wranslation erten Inten

ung 2 : Be

em Ensemtätsfluktuat

Ko

enberg - Univsikalische Ch

700

N

O

O

N

O

O

λ / nm

Emissionspebettet in e Spektren

ngige Flu

nstanter A. Hierfür k

eines Farber Emissiowird. Ander

der beobansität führe

eispiel eine

mble-Expetionen einz

nfokale Ein

versität hemie

750

m

pektren voneinen PMder einzel

uoreszen

Anregung kkann es sebstoffs in on, die nare Möglichachteten F

en können.

er Zeitspur

riment wirzelner Mol

nzelmolekü

Seite 6

800

N

O

O

N

O

O

n einzelnenMMA-Film. lnen Molek

nz

kann die ehr untersc

einen Trach dem Ühkeiten sindFarbstoffm

r: zeitabhän

rd eine meküle sind

ülmikrosko

n TerrylendJe nach

küle.

Intensität chiedliche iplettzusta

Übergang d dynamisoleküle, d

ngige Fluo

mittlere Fludort nicht

opie

GrundmPhysikalisch

diimid Molokaler U

des emittiGründe gend zu einin den Gr

sche Vorgäie auch zu

oreszenz ei

uoreszenz sichtbar.

modul he Chemie

olekülen (aUmgebung

erten Licheben. Häufnem kurzzrundzustanänge wie Rur Fluktuat

ines Molek

gemesse

ngeregt g unter-

hts sehr fig führt zeitigen nd aber Rotation tion der

küls

en, d.h.



2 Experimentelle Voraussetzungen für Fluoreszenzuntersuchungen an einzelnen Molekülen

Einzelmolekülmikroskopie ist mittlerweile in vielen wissenschaftlichen Bereichen etabliert. In diesem Abschnitt werden die Voraussetzungen diskutiert, die für die Detektion einzelner Farbstoffmoleküle notwendig sind. Neben einem speziellen experimentellen Aufbau müssen auch die zu untersuchende Farbstoffe bestimmte Bedingungen erfüllen.

2.1 Anzahl der Moleküle im Detektionsvolumen

Bei konventionellen Fluorometern wird das erfasste Volumen in einer Küvette durch den Anregungs- und den Emissionsstrahlengang bestimmt (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3 : Strahlengang in einer Fluoreszenzküvette

Nur die Photonen aus einem Teilvolumen in der Mitte der Küvette gelangen auf den Detektor. Die Größe dieses Teilvolumens ist von der genauen Geometrie der Strahlengänge abhängig. Eine Abschätzung der Anzahl von fluoreszierenden Molekülen kann mit typischen Werten durchgeführt werden:

Detektionsvolumen : Kugel mit Radius mm1r =

39.3Det m102.4r

34V −=π= (1)

Konzentration einer Farbstofflösung : 314Farbstoff mmol1.0Lmol10c −−− ==



Mit 123.A mol10022.6N −= lässt sich die Anzahl der Farbstoffmoleküle FarbstoffN in dem

Volumen DetV berechnen:

14.Det

.Farbstoff

.AFarbstoff 105.2VcNN ≈= (2)

2.2 Fluoreszenzmessung an einzelnen Farbstoffmolekülen

Um die Fluoreszenzeigenschaften einzelner Moleküle untersuchen zu können, werden oft extrem stark verdünnte Proben untersucht. Die Konzentration der zu untersuchenden Spezies wird so gewählt, dass sich immer nur maximal ein Molekül im Fokus des Mikroskopobjektivs befindet. Außer bei Messungen in der Gasphase befinden sich die Fluorophore in einer festen oder flüssigen Matrix. Als feste Matrix können amorphe (z.B. Polymere) oder Kristalle verwendet werden.

Abbildung 4: Bei genügend gro0em Abstand können zueinander können einzelne Fluorophore getrennt betrachtet werden

Oft zeigt die Matrix auch eine schwache Fluoreszenz, die durch Verunreinigungen verursacht wird. Daneben treten Streueffekte (Rayleigh- und Ramanstreuung) an den Molekülen der Matrix auf. Reflexionen an den Phasengrenzflächen sind eine weitere Ursache für ungewünschte Effekte. Daher ist es vorteilhaft, möglichst kleine Anregungs- und Detektionsvolumina zu verwenden. Je kleiner das beleuchtete Volumen ist, in dem sich der Fluorophor befindet, desto signifikanter kann das Fluoreszenzsignal auf dem Lichtuntergrund detektiert werden. Ausschlaggebend ist dabei nicht die Höhe des Untergrundes selbst, sondern die zeitliche Änderung (Fluktuation) des Untergrundes (Signal/Rausch-Verhältnis). Je kleiner das Detektionsvolumen ist, desto geringer wird auch das Hintergrundrauschen bei einer Messungen sein

Neben einer sehr empfindlichen Photonendetektion müssen auch die Fluorophore bestimmten Anforderungen genügen, damit signifikante Messergebnisse resultieren können:

(A) Der Absoptionsquerschnitt Bσ eines Moleküls B muss bei der verwendeten Anregungswellenlänge exλ möglichst groß sein, damit der fluoreszenzfähige Zustand von dem Molekül effizient besetzt werden kann. Im Zusammenhang mit Einzel-



moleküluntersuchungen ist es zweckmäßig, anstelle der molaren Größe Bε den Absoptionsquerschnitt Bσ zu verwenden, der sich auf ein einzelnes Molekül bezieht :

A

BB N

10ln ε⋅=σ (3)

AN ist die Avogadrische Konstante und Bε der molare dekadische Extinkions-koeffizient. Daraus folgt, dass Bσ die Dimension einer Fläche hat.

(B) Die Fluoreszenzquantenausbeute des Moleküls sollte groß sein, damit aus fast jedem Absorptionsprozess eine Emission resultiert.

(C) Die Besetzungswahrscheinlichkeit für langlebige Molekülzustände sollte klein sein. In diesem Zusammenhang spielen bei Farbstoffmolekülen die langlebigen Triplettzustände eine Rolle. Die Moleküle sollten also ein kleine Intersystemcrossing-Rate besitzen.



3 Konfokale Fluoreszenzmikroskopie Diese experimentelle Methode hat sich in den letzten Jahren als Standardmethode für Fluoreszenzmesungen an einzelnen Moleküle etabliert. Die Beschreibung des experimentellen Aufbaus ist in zwei Teile untergliedert.

In den folgenden Abschnitten wird schrittweise das Prinzip der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie beschrieben (3.1.) , danach folgt der im Praktikum verwendete Aufbau (3.2.).

3.1 Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie

3.1.1 Auflösungsvermögen Um tatsächlich nur einzelne Moleküle optisch anzuregen, muss das Anregungslicht sehr stark fokussiert werden. Allerdings sind der Fokussierung von Licht, z.B. mit einem Mikroskopobjektiv, durch das Beugungslimit Grenzen gesetzt. Der laterale Durchmesser (senkrecht zur Ausbreitungsrichtung) der erreichbaren Strahltaille w(Stelle im Strahlengang mit dem geringsten Durchmesser) ist abhängig von der Wellenlänge λ des Lichtes, von dem Brechungsindex n des Mediums (in dem sich das Licht ausbreitet) und vom Öffnungswinkel α2 des Lichtkegels.

Die radiale Ortsabhängigkeit der Intensitätsverteilung ( )xI in der Taille, beschrieben durch die Koordinate x, ist näherungsweise gaußförmig,

( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−∝ 2

2

wxexpxI . (4)

Der Öffnungswinkel hängt mit der Strahltaille über die Beziehung

wsinnNA

πλ

=α= (5)

zusammen. Dabei bezeichnet NA die numerische Apertur. Hohe numerische Aperturen werden mit extrem kurzbrennweitigen Objektiven erreicht, deren

JohIns

ÖffnungBrennw

Abbild

Ein seWellenStrahltaAbmes

012.0 −könnenAbbildubezeichkönnen

Die Ha

Für diIntensit


gswinkel weite und d

dung 5 : G

ehr guteslänge vonaille von

ssungen. nm15.0 .

n sie nicht ungsgrenzehnet. Je kn aufgelöst

lbwertsbre

HWBlateral

e Anregutäten ben

Ko


α2 sehr dem Frontl

Gaußsche S

Immersion 600=λ

nm136w =Zur Eri

Befinden mehr von

e wird dkürzer diet werden.

eite der Inte

αλ

=sinn53.0

ung von nötigt. Ist

nfokale Ein

versität hemie

groß ist. insendurch

Strahltaille

onsölobjeknm0 ergibm . Dies nnerung: sich also

neinander gdaher auce verwend

ensitätsver

.

FarbstoffeP die L

nzelmolekü

Seite 11

Prinzipiehmesser d

und latera

ktiv besitzbt sich da

ist sehr typische mehrere

getrennt wch als Auete Welle

rteilung HW

n in eineLeistung (

ülmikrosko

ll ist der es verwen

ale Intensit

zt z.B. earaus eingroß im

C-C BMoleküle

werden. Dieuflösungsvnlänge ist

WB wird b

em Mikro(Energie p

opie

GrundmPhysikalisch

Öffnungsndeten Obj

tätsverteilu

ine NA =ne Breite

Vergleich Bindungslä

innerhalbese wellen

vermögen t, desto fe

berechnet d

skop werpro Zeit),

modul he Chemie

swinjkel vektives ab

ung

4.1 . Beder Gauzu mole

ängen bb der Stranlängenabh

des Mikreinere Str

durch

rden sehr die mit

von der hängig.

ei einer ußschen ekularen etragen ahltaille, hängige roskops rukturen

(6)

kleine einem

JohIns

LeistunAnregu

berechgemess

von I =

3.1.2 V Ein typAbbildubestehein der Bdes OTubuslVerbindentschewerdenauswirk

Abbild


ngsmeter ungsintens

(=

laHWBI

nen. Mit esen, ergib

7 W107.1 ⋅

Vergrößer

pischer Stung gezeigen schon Brenneben

Objekts iminse liegdungsachseidenden Vn kann, ohkt.

dung 6 : S

Ko


in dem Sität I (Ene

)ateral 177.1P

einem typbt sich (An

2mW − !

rung

trahlengangt, schemaMikroskopne des Mik Unendlict der In

se der bVorteil, da

hne dass e

Schematisc

nfokale Ein

versität hemie

Strahlungsgrgie pro Ze

) π⋅2

ische Wernnahme: N

ng eines atisch dargobjektive akroskopobjchen liegtnfinity-Bere

beiden Linss der Abs

es sich auf

cher Aufba

nzelmolekü

Seite 12

gang gemeit und Fläc

rt von z.B4.1NA = , λ

modernen gestellt besaus mehrejektives m. Zwischeeich, in nsen sichstand zwisf die Abbil

u eines op

ülmikrosko

messen wche) mittel

B. W2P μ=nm600=λ

Mikroskostehend a

eren Linsenit der Bren

en dem Mdem di

h ausbreitschen diesldungsschä

ptischen Mi

opie

GrundmPhysikalisch

ird, lässt ls der Bezi

W , direkt vm ) eine An

ops wird ius zwei Ln). Das Obnnweite f1, Mikroskopoe Strahleten. Dies en beiden ärfe oder d

ikroskops

modul he Chemie

sich daraehung

vor dem Onregungsin

in der folinsen (tatsbjekt befind

so dass dobjektiv uen parall

hat denLinsen ve

die Vergrö

aus die

(7)

Objektiv ntensität

genden sächlich det sich das Bild nd der lel zur n ganz erändert ößerung

JohIns

Werdenoder Sbeeintrparalle

Die TuBrenneVerhältaufged

Als möAbstanObjekt

3.1.3 Die FReflektwird, msehr eirealisie

AbbildWeitfel


n in den IStrahlteile rächtigt, all) wären.

ubuslinse ebene der tnis der bruckte Ver

öglicher Dd f2 positioim Abstan

Fluoresze

Fluoreszentionsmethomittels optiinfacher A

ert werden.

dung 7 : scdbeleuchtu

Ko


nfinity-Bereingefügt,

ls wenn d

mit der BTubuslins

beiden Brrgrößerung

Detektor kaoniert wer

nd f1 vom M

enzmikros

nzmikroskooden den Vschen Filt

Aufbau daf

chematiscung

nfokale Ein

versität hemie

reich weite so wird

die Strahle

Brennweitese. Die Vrennweiteng macht als

ann z.B. rden. MannMikroskopo

skopie

opie bieteVorteil, dasern sehr e

für kann m

her Strahle

nzelmolekü

Seite 13

ere optischdie Abbil

enbündel i

e f2 erzeuVergrößerun f2/f1 gegso nur in K

der CCD-n erhält daobjektiv bef

et gegens Anreguneffektiv vo

mit einem

engang ein

ülmikrosko

he Elemenldungsquan diesem

ugt ein reung diesegeben. DieKombinatio

-Chip eineann ein scfindet.

über reingslicht, mi

om Fluoresfarbteilend

nes Fluores

opie

GrundmPhysikalisch

nte wie Fillität dadurBereich k

eales Zwies Systeme auf Mikn mit einer

er Videokacharfes Bil

nen Tranit dem die szenzlicht den (dichro

szenzmikro

modul he Chemie

ter, Polarirch weit wkonvergen

schenbild ms ist durkroskopobjr Tubuslins

amera ged, wenn s

nsmissionsProbe belabzutrenn

oitischen)

oskops mi

satoren weniger

nt (nicht

in der rch das jektiven se Sinn.

nau im sich das

s- und leuchtet

nen. Ein Spiegel

t

JohIns

Das küunsereweites licht kafokussiWellen

3.1.4

Mit demaxiale Adas late

AndersPunkt scheinlintensitZeitein

Abbild

ZusätzZwischin der Opassiergeblock


ürzerwelligm BeispieFeld bele

ann den faert. Von länge) wird

Konfokale

m konfokaAuflösungserale Auflö

s als bei din der P

ichkeit in tät hoch geheit) zu erm

ung 8 : An

lich wird enbildeben

Objektebenren könnekt.

Ko


e Anregunl wurde es

euchtet wirarbteilendeder Prob

d von dem

e Mikrosko

len Prinzipsverhalten

ösungsverm

dem AufbaProbe fokdem klein

enug, um möglichen

nregungsst

in demne eingefüne, wird deen. Objekt

nfokale Ein

versität hemie

ngslicht wis außerdemrd (Weitfelen Spiegele rückges farbteilend

opie

p kann im n wesentlicmögen (in

u in Abbildkussiert. Dnen Bereiceine detek.

trahlengan

m Detektügt. Befindeessen Abbie an and

nzelmolekü

Seite 14

ird an demm derart fodmikrosko passierenstreutes Aden Spieg

Vergleich ch verbessder Objekt

dung 7 wiDamit konch der Strktierbare A

ng in einem

ionsstrahleet sich ein ildung die eren Posi

ülmikrosko

m farbteileokussiert,

opie). Das n und wirdAnregungslel abgetre

zur konvesert werdetebene).

rd hier danzentriert rahltaille: nAnzahl von

m Fluoresze

engang eObjekt (MLochblenditionen we

opie

GrundmPhysikalisch

enden Spiedas in derlängerwel

d in der Zwlicht (keinnnt.

entionellenn, zudem

as Anregunsich die

nur hier isAbsorptio

enz-Mikros

eine Locholekül) gen

de in der Zwerden von

modul he Chemie

egel reflekr Objekteblige Fluorewischenbil

ne Änderu

n Mikroskoerhöht sic

ngslicht auAnregung

st die Anreonsprozess

skop

hblende nau in demwischenbil der Loch

ktiert. In ene ein eszenz-debene

ung der

opie das ch auch

uf einen gswahr-egungs-sen (pro

in der m Fokus debene hblende

JohIns

AbbildZwisch

Die KoMikrosk

Unter ( aλ=λ

MeistenauseinaAbsorpnumeri

Bisher Um einHilfe ei

Die kospektroProbe könnenNeben einzelnAbsorpProzes


dung 9 : Oenbildeben

ombinationkop zu wes

der Anna)emab λ= , e

HWB lateral =

ns liegen ander, so

ption und sche Aper

wurde genn zwei- odenes Piezos

onfokale oskopischeweiter als

n einzelne der Intens

ner Moleküptionsspektsse etc. .

Ko


Ortsabhängne. Der An

n beider Psentlich ge

ahme, dasergibt sich

NA4.0 λ

= un

aber Ano dass ei

die Emisrtur des ve

nau ein Puer drei-dimscanners v

Fluoreszenen Untersu

das obenMoleküle usität könneüle bestimmtren, Pola

nfokale Ein

versität hemie

gige Lichtunregungsst

Prinzipien esteigertem

ss Anregufolgendes

nd HWB ax

regungs-gentlich e

ssion vorgrwendeten

unkt der Prmensionalesvor dem O

nzmikroskouchung ei angegebeunterschieen prinzipiemt werdenarisationse

nzelmolekü

Seite 15

nterdrückutrahlengan

führt im m lateralen

ungs- und (optimales

NA45,0

xialλ

=

und Emiseine gesogenommenn Mikroskop

robe angers Bild der bjektiv bew

opie hat nzelner Mene Auflösden werdeell alle mö wie Fluor

eigenschaft

ülmikrosko

ung durch eng wurde h

Vergleich Auflösung

Emissions) Auflösun

λ

ssionswelleonderte Ben werden pobjektives

regt und deProbe zu

wegt, d.h. a

sich als Moleküle esungsvermen: man erglichen sp

reszenzlebten, Triple

opie

GrundmPhysikalisch

eine Lochbier weggel

zu einemgsvermöge

nswellenlänngsvermög

enlänge metrachtung

müsste. s (siehe Ab

essen Emierhalten, wabgeraster

Schlüsserwiesen. S

mögen vonehält einzel

pektroskopbensdauernettkinetik,

modul he Chemie

blende in dlassen.

m herkömen.

ngen gleicgen :

mehr als g jeweils

NA ist hbbildung 4

ssion beobwird die Prrt.

eltechnologSind sie ieinander ene Leuchtoischen Parn, Emissio

photoche

der

mlichen

ch sind

(8)

10 nm für die

hier die 4).

bachtet. robe mit

gie zur n einer

entfernt, objekte. rameter ns- und

emische



3.2 Experimenteller Aufbau des Fluoreszenzmikroskopes (Praktikum)

Nach dem in den vorhergehenden Abschnitten der prinzipielle Aufbau eines konfokalen Fluorezenzmikroskops gezeigt wurde, wird hier der aktuelle, im Praktikum verwendete Aufbau beschrieben.

3.2.1 Anregungsstrahlengang

Zur Zeit (Stand Oktober 2011) wird für Anregung ein Diodenlaser mit einer mittleren Wellenlänge von 638nm verwendet

Generell werden die Lichtquellen in eine Glasfaser eingekoppelt. Zusätzlich sind noch folgende optische Elemente in dem Anregungsstrahlengang eingebaut:

- kontinuierlichen Abschwächer: hier wird die Anregungsintensität eingestellt

- Laserlinienfilter: unerwünschte Laserlinien werden abgeblockt. Nur die gewünschten Laserlinien können den Filter passieren (=Bandpassfilter)

- Polarisationsfilter (optional): die Anregung erfolgt mit linear polarisiertem Licht

- Shutter / Verschluss : die Probe wird nur während einer Messung angeregt

Über eine Linse wird das Anregungslicht in eine Glasfaser eingekoppelt. Prinzipiell ist die Faser nicht notwendig, sie bietet aber deutliche Vorteile:

- die Anregungslichtquellen können ausgetauscht werden, ohne dass der Anregungsstrahlengang im Mikroskop verändert werden muss

- die Anregungslaser können räumlich vom Mikroskop getrennt werden

- bei geeigneten Fasern erhält man an der Austrittsöffnung eine ideale punktförmige Lichtquelle

Über einen teildurchlässigen Spiegel wird das Anregungslicht in das Objektiv gelenkt. Die punktförmige Anregungslichtquelle wird also in der Objektebene wieder als Punkt abgebildet.



LF : Laserlinienfilter (nur die gewünschten Wellenlängen werden durchgelassen)

A : optischer Abschwächer (Einstellen der Anregungsleistung)

P : Polarisator

SH : Shutter (Verschluss)

L : Linsen

GF : Glasfaser

DS : teildurchlässiger Spiegel (ca. 10% des Anregungslicht werden umgelenkt,

90% des emittierten können passieren)

S : Spiegel

LP : Langpassfilter (ab einer bestimmten Wellenlänge kann längerwelliges Licht

den Filter passieren)

PS : polarisationsabhängiger Strahlteiler

D1 : hochempfindlicher Detektor (APD, avalanche photo diode)

D2 : “ “ “ “

Abbildung 10: Experimenteller Aufbau des konfokalen Fluoreszenzmikroskops im Praktikum



3.2.2 Scanner

Durch das konfokale Prinzip bedingt, wird immer nur ein Punkt der Probe in der Objektebene beleuchtet bzw. auch detektiert. Um eine Abbildung der Probe zu erhalten, muss die Probe vor dem Objektiv abgerastert werden. Dazu befindet sich die Probe auf einem Verschiebetisch, der über Piezoaktuatoren in alle drei Raumrichtungen verschoben werden kann. Der im Praktikum verwendet Scanner hat eine Auflösung von ca. 20-50 nm. Die Steuerung erfolgt über einen Computer, der auch die detektierten Intensitäten registriert und auswertet.

3.2.3 Detektionsstrahlengang

Von der Probe emittierte Photonen werden über das Objektiv wieder eingesammelt und können zu ~93% den teildurchlässigen Spiegel passieren. Nach einem Spiegel wird mit einem hochwertigen Langpassfilter das längerwellige Fluoreszenzlicht von dem unveränderten Streulicht getrennt. Ein polarisationsabhängiger Strahlteilerwürfel lenkt die Photonen polarisationsabhängig auf den Detektor D1 oder D2. Anstelle der in Abbildung 8 gezeigten Lochblende wird die räumlich begrenzte, photoempfindliche Detektionsfläche der Photodioden verwendet. Dadurch können einige optische Elemente vermieden werden, die immer einen bestimmten Verlust an Photonen durch Reflexion bedeuten würden. Die Detektoren sind empfindlich genug, um einzelne Photonen detektieren zu können. Ein Computer zählt die ankommenden Photonen. Aus dem Intensitätsverhältnis von D1 zu D2 kann die Polarisation der emittierten Photonen ermittelt werden.



4 Bedienungsanleitung In den folgenden Abschnitten wird die Bedienung des im Praktikum eingesetzten Mikroskops und der Auswertungssoftware beschrieben.

(Stand 28.Mai 2010)

4.1 Wichtig !

Einige der im Mikroskop verwendeten Komponenten sind sehr teuer und können durch Bedienungsfehler zerstört werden. Hier sind die beiden ‚gefährdetsten’ Komponenten beschrieben :

Als Detektoren werden Avalanche Photodioden (APD) verwendet, die durch einen zu hohen Photonenstrom zerstört werden können. Findet keine Messung statt, müssen sie daher immer ‚ausgeschaltet’ sein.

Abbildung 11: Handsteuerung für das Mikroskop mit Funktionsleuchten

Der Probenwechsel muss äußerst vorsichtig durchgeführt werden, da ansonsten das Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Niemals die Linsen des Objektivs berühren!



Abbildung 12: Probenhalter des invertierten Mikroskops: Die Probe wird von unten betrachtet

4.2 Übersicht der Komponenten und Funktionen

Die Ansteuerung und Datenerfassung des konfokalen Mikroskops wird vollständig mit einem zentralen Computer durchgeführt. Er erfüllt dabei drei verschiedene Aufgaben:

a) Monitor für die angeschlossene CCD-Kamera (Justage des Objektiv-Focus)

b) Vollständige Steuerung (LABVIEW-Routinen) des Mikroskops (Kontrolle des Piezoscanners, Datenerfassung)

c) Datenauswertung mit Hilfe von MATLAB-Routinen

Mikroskopobjektiv



Abbildung 13: Schematischer Aufbau der Mikroskopsteuerung und Datenerfassung

Abbildung 14 : konfokales Laserscanningmikroskop

teildurchlässigerSpiegel

Objektiv

Probe

LPL

L

D2(APD)

D1(APD)

S

klappbarer Spiegel

CCDKamera

XY-Piezoscanner. . . . ..

Shutter



4.3 Mikroskopsteuerung

4.3.1 Hardware

Die folgenden Komponenten können gesteuert werden:

- XY Piezoscanner (erfolgt vom Hauptcomputer)

- APD ‚Gate’ : aktivieren/deativieren der hochempfindlichen Detektoren (erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung)

- SHUTTER : öffnen / schließen des Shutters im Anregungsstrahlengang (erfolgt vom Hauptcomputer bzw. auch per Handsteuerung)

- MIRROR : Spiegel für die Justage des Fokus in den Strahlengang drehen (erfolgt per Handsteuerung)

Abbildung 15 : Handsteuerung des Mikroskops

Während einer Messung übernimmt der Hauptcomputer die Kontrolle der einzelnen Komponenten.



4.3.2 Softwaresteuerung des Mikroskops

Eine Messung wird vollständig über eine Software gesteuert (Labview-Routinen). Über eine Maske können die verschiedenen Parameter für z.B. Scanbereich, Scangeschwindigkeit etc. eingestellt werden. Anschließend können die gemessenen Daten (Bilder oder Zeitspuren) auf der Festplatte gespeichert werden. Details der Eingabemöglichkeiten werden in den folgenden Abschnitten beschrieben.

Abbildung 16 : Eingabemaske der Steuerungssoftware



4.4 Einzelne Operationen

4.4.1 Probenwechsel

Ein Probenwechsel muss mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden, da ansonsten das Mikroskopobjektiv beschädigt werden könnte. Zuerst muss der Deckel des Probenraumes entfernt werden, er wird einfach abgehoben. Wichtig ist hierbei, dass keine Messung läuft und dass die Detektoren (APD) ausgeschaltet sind. Ansonsten könnten sie durch den Lichteinfall zerstört werden.

Abbildung 17 : Probenraum (Deckel wurde entfernt)

Die Probe besteht aus einem Objektdeckgläschen, auf das die eigentliche Probe als dünner Film aufgebracht wurde. Das Gläschen liegt auf einem runden silberfarbenen Metallring und wird durch eine magnetische Folie festgehalten.

Nachdem eine neue Probe eingebaut wurde, muss das Objektiv neu fokussiert werden. Dazu gibt es zwei Möglichkeiten:

- über den Drehknopf ‚manuelle Fokuseinstellung’ wird das Objektiv hoch- oder runterbewegt (siehe Abbildung 16).

- Der Piezoscanner kann auch in Z-Richtung bewegt werden. Dies erfolgt über einen Controller, der in der Abbildung 17 gezeigt wird

Magnetische Folie

Metallring

Manuelle Fokuseinstellung



Abbildung 18 : Controller für die Z-Achse des Piezoscanners (Fokuseinstellung desObjektivs)

Die Einstellung des Fokus wird über die Reflexion an der Glas-Luft-Grenzfläche des Probengläschen durchgeführt. Dazu muss der motorisierte Spiegel in den Strahlengang eingedreht werden. Dies wird durch die Handsteuerung (Abbildung 3) durchgeführt. Auf Tastendruck (‚ON’) dreht der Spiegel und gleichzeitig wird der Shutter des Anregungsstrahls geöffnet. Nun fällt das an der Grenzfläche reflektierte Licht auf eine CCD-Kamera (siehe Abbildung 1), die an den Hauptcomputer angeschlossen ist. Mit der Software ’CCD-Kamera’ wird das von der Kamera aufgenommene Bild auf dem Monitor angezeigt.

Nun wird der Fokus so eingestellt, dass sich ein möglichst kleiner und heller Punkt ergibt. Der Brennpunkt des Objektivs liegt nun genau bei der Glas/Luft-Grenzfläche. Nun den Spiegel über die Handsteuerung wieder aus den Strahlengang entfernen (‚OFF’).

Zusammenfassung:

(1) Prüfen, dass keine Messung läuft (APD ausgeschaltet!)

(2) Deckel des Probenraum öffnen

(3) Magnetische Folie entfernen

(4) Objektdeckgläschen vorsichtig mit Pinzette austauschen

(5) Mit Folie befestigen

(6) Deckel des Probenraums einsetzen

(7) Spiegel für die Fokussierung eindrehen

(8) CCD-Software aktivieren

(9) Fokussieren

(10) Spiegel wieder rausdrehen.



4.4.2 Aufnahme eines Fluoreszenzbilds

Für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes müssen einige Parameter in der Bildschirmmaske der Softwaresteuerung eingestellt werden.

Abbildung 19 : Bedienelemente für die Aufnahme eines Fluoreszenzbildes

Beschreibung der wichtigsten Parameter:

range [μm] : Größe der zu scannenden Fläche (10 X, 10 Y bedeutet 10x10μm) Der Mittelpunkt der Fläche ist 0/0, d.h. bei 10 μm wird von -5...+5μm gescannt. # of pixels : Anzahl der pixels (128 X, 128 Y bedeutet 128x128Pixel=16384Pixel) offset [mm] : Der Mittelpunkt der zu scannenden Fläche. Maximal können 80x80μm gescannt werden. time/pixel [ms] : Zeitdauer für ein Pixel. Beispiel 128x128 Pixel, 3ms pro Pixel -> die Messung dauert 128x128x3=49 Sekunden. direction : sollte immer auf ‚uni’ gestellt sein. Es wird immer nur in einer Richtung gescannt.



Sind die Parameter eingestellt, kann der start Knopf betätigt werden. APD und Shutter werden automatisch aktiviert und nach einer Messung wieder ausgeschaltet.

Justage der Laserleistung

Übliche Laserleistungen für die Detektion einzelner Farbstoffmoleküle liegen im Bereich von 1-2 μW, direkt vor dem Objektiv gemessen. Da dies zur Zeit nicht möglich ist, muss die Leistung indirekt eingestellt werden. Typische Emissionszählraten sind ~ 100-200 counts pro 5ms. Bei höheren Zählraten muss die Anregungsleistung mit dem Abschwächer (siehe Abbildung 2) verringert werden. Die Zählrate kann während einer Messung in der oberen rechten Abbildung abgelesen werden.

Daten speichern

Ist ein Bild vollständig gescannt, müssen die Daten für die weitere Bearbeitung gespeichert werden. Dazu muss die save Taste gedrückt werden.

4.4.3 Aufnahme von Fluoreszenzzeitspuren

Nachdem ein Fluoreszenzbild aufgenommen wurde, können einzelne Moleküle näher untersucht werden. Dazu muss der Cursor aktiviert sein und auf ein

Molekül positioniert werden. Über einen Tastendruck [goto cursor] fährt nun der Piezoscanner tatsächlich an die Position, d.h. das gewählte Molekül befindet sich

im Focus des Mikroskopobjektivs.

Eine Zeitspur der Fluoreszenz kann einfach aufgenommen werden. Dazu muss im vornherein die Zeitauflösung (time bin) eingestellt werden. [time bin = 1ms] bedeutet, das jede Millisekunde ein neuer Zählvorgang gestartet wird. Die Zählergebnisse werden fortlaufend in einem File gespeichert. Für eine höhere Zeitauflösung

muss der Fastcount-Modus verwendet werden. Hier ist eine Zeitauflösung bis zu 10μs möglich. WICHTIG: Über den Kanalwähler wird bestimmt, welche APD gespeichert wird!



Beendet wird die Aufnahme einer Zeitspur durch nochmaliges Drücken des entsprechenden Schalters. Während im Fastcount-Modus die Daten ‚on the fly’, also

schon während einer Messung gespeichert werden, müssen im langsameren Modus die Daten manuell gespeichert werden.

Bei funktionierendem Betrieb sollten Laser und APD-Detektoren automatisch aktiviert und auch wieder deaktiviert werden.

4.5 Datenauswertung

Die gemessenen Daten – Fluoreszenzbilder und Zeitspuren – werden mit speziellen Software-Routinen (MATLAB) ausgewertet.

4.5.1 Analyse der Fluoreszenzbilder

Das Programm IMAGE1 muss aufgerufen werden.

Abbildung 20 : Oberfläche der Bildauswertungssoftware IMAGE1

Mit Hilfe der Maus wird eine gemessene Bild-Datei ausgewählt. Nach dem Einladen werden die Daten der beiden verwendeten Detektoren APD1 und APD2 gleichzeitig angezeigt. Als Achsenbeschriftung werden die Pixel angezeigt, dies muss bei der Auswertung beachtet werden. Durch einfaches ‚Anklicken’ eines hellen Spots in D1



oder D2 springt das Fadenkreuz auf diese Position. Durch Drücken der [FIT] Taste wird ein zweidimensionaler Gauss-Fit des markierten Spots (Molekül) durchgeführt. Standardmäßig wird dabei eine Fläche von 30x30 Pixeln angefittet. Diese Größe kann aber mit den beiden Tasten [zoom +] und [zoom -] verändert werden.

Die Fit-Ergebnisse erscheinen im unteren linken Fenster. Es werden beide Kanäle unabhängig (hintereinander) angefittet mit:

( ) ( )

2

20

2

20

2yy

2xx

eeamp)y,x(I σ

−−

σ

−−

⋅⋅= (9)

Als Ergebnis werden angegeben x0/y0, σ und amp für beide Kanäle.

4.5.2 Analyse der Zeitspuren

Das Programm TRACE1 muss aufgerufen werden.

Abbildung 21 : Oberfläche der Auswertungssoftware TRACE1. Damit können zeitabhängige Signale statistisch ausgewertet werden.



Die Daten einer Zeitspur werden durch einfaches Anklicken in dem Directory-Fenster ausgewählt und geladen. Im Praktikum werden typischerweise zwei Detektoren verwendet, zwischen diesen beiden Kanälen kann über die Taste [ch x] umgeschaltet werden.

Wenn nicht die gesamte Zeitspur für die weitergehende Auswertung (Autokorrelation) verwendet werden soll, muss ein Bereich gewählt werden. Dazu muss der Cursor auf den Anfangs- bzw. Endpunkt gesetzt werden und jeweils eine der Tasten [set start] bzw. [set end] gedrückt werden.

Der Cursor wird durch einfaches Anklicken der gewünschten Position in der Zeitspur gesetzt. Der angezeigte Ausschnitt der Zeitspur kann ausgewählt werden. Dabei bedeuten :

nach links zoomen stauchen nach rechts Eine Autokorrelation des ausgewählten Abschnittes wird durch Drücken der Taste [correlate] gestartet. Je nach Länge der Zeitspur kann dieser Vorgang einige Sekunden dauern.

Eine Zeitspur lässt sich durch Wertepaare it , ic darstellen, n,,1i K= . Die Breite eines Punktes, die wir bei unserer Messung durch [timebin] eingestellt hatten, ist

i1i ttt −=Δ + , die Anzahl der gezählten Photonen eines Zeitpunktes beträgt ic .

Allgemein wird bei einer Korrelation untersucht, in wieweit verschiedene Ereignisse von einander abhängen. Dies können vollkommen unterschiedliche Dinge sein und daher werden Korrelationen in sehr vielen Bereichen wie z.B. in der Medizin, Wirtschaft etc. verwendet.

In den Naturwissenschaften basieren einige wichtige Messprinzipien auf dem Aufstellen von Korrelationen. Ein Beispiel dafür ist die hier verwendete Autokorrelation der gemessenen Intensitätsfluktuationen. Da die Intensitäts-fluktuationen als Funktion der Zeit untersucht werden, handelt es sich um eine Zeitkorrelationsfunktion.

Bei einer Autokorrelation wird eine Größe mit sich selbst korreliert. Mit K wird ganz

allgemein der Mittelwert einer Funktion bezeichnet

( ) )'t(ctcFc = (10)

Da unsere Messwerte diskret vorliegen, wird die Korrelationsfunktion mit dem Software-Programm wie folgt berechnet:



( ) ( ) ( ) 2n

1ii

n

1i

n

1jji

jjiic

c

cctctctF

⎟⎠⎞⎜

⎝⎛∑

∑∑==Δ

=

= = (11)

Die normierte Intensitätskorrelationsfunktion ( )tFc Δ wird der Einfachheit halber nun

im folgenden als Funktion der Zeit geschrieben, ( )tFc . Das Ergebnis wird in dem oberen rechten Fenster angezeigt.

In einem weiteren Schritt kann an die berechnete Korrelationsfunktion entweder eine Exponentialfunktion

( ) ktc eBAtF −⋅+= (12)

oder eine gestreckte Exponentialfunktion

( ) ( )bktc eBAtF −⋅+= (13)

angepasst (gefittet) werden. Über die Tasten [fit start + -] bzw. [fit end + -] kann der Bereich der Korrelationsfunktion bestimmt werden, an den die analytische Funktion angefittet werden soll.

Das Ergebnis des Fits wird in dem Fenster unten rechts angezeigt. Mit der Taste [save data] können die Korrelationsergebnisse (Korrelationsfunktion, Fitkurve und Fitergebnisse) gespeichert werden. Es wird ein ASCII-File mit dem Namen *_fiterg.dat erzeugt.



5 Aufgabenstellung Für die Durchführung der Aufgaben ist es notwendig, die vorhergehenden Kapitel gelesen zu haben. Für die aktuellen Versuche wird als Anregungslichtquelle ein roter Diodenlaser ( )nm635=λ verwendet. Die Aufgaben teilen sich in zwei unter-schiedliche Bereiche. Beachten Sie sämtliche Fragen und diskutieren Sie diese.

5.1 Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögen

Das laterale Auflösungsverhalten des Mikroskops lässt sich am einfachsten mit einer Probe bestimmen, die stark fluoresziert und Strukturen aufweist, die kleiner sind als die mögliche Auflösung des Mikroskops. Wir verwenden in dem Versuch Polymerkugeln, die mit Farbstoffen markiert sind (Tetraspeck - Molecular Probes). Die Kugeln befinden sich auf einem Deckgläschen ohne weitere Matrix und haben einen Durchmesser von 100nm.

(a) Setzen Sie eine Probe mit Tetraspeck-Kugeln in das Mikroskop ein. Hier ist äußerste Sorgfalt geboten, um das Mikroskopobjektiv nicht zu beschädigen.

(b) Fokussieren Sie das Objektiv (siehe Bedienungsanleitung).

(c) Scannen Sie die Probe so, dass Sie insgesamt mindestens 10 Polymerkugeln vollständig erfasst haben. Beginnen Sie dafür zuerst mit sehr niedriger Anregungsleistung und erhöhen Sie diese sukzessive, bis eine maximale Zählrate von 200 cts/5ms gemessen wird. Die Daten der gescannten Bilder sollen abgespeichert werden und mit der beschriebenen Software (IMAGE1) ausgewertet werden.

Folgende Größen sollen bestimmt werden:

- maximale Intensität APD1 und APD2 (woher kann der Unterschied herrühren?)

- Breite der Spots : Als Ergebnis soll die mittlere FWHM für beide Kanäle und die Standardabweichung angegeben werden (Full Width at Half Maximum)

Wie groß ist nun das optische Auflösungsvermögen des Mikroskops?

Welche Rolle spielt die Größe der untersuchten Teilchen bei der Berechnung der Auflösung?



5.2 Untersuchung von Terrylendiimid (TDI)

Dieser Farbstoff zeichnet sich u.a. durch seine sehr hohe Photostabilität aus. Absorptions- und Emissionsspektren sind in der folgenden Abbildung gezeigt. In dem Praktikumsversuch wird er mit einem Diodenlaser (nominell 635nm) angeregt. Die Fluoreszenz wird über einen Bandpass von der Anregungswellenlänge getrennt. Das emittierte Licht wird polarisationsaufgelöst mit zwei Detektoren aufgezeichnet (siehe Bedienungsanleitung) .

(a) Setzen sie ein Probengläschen mit TDI in PMMA in das Mikroskop ein.

(b) Fokussieren sie das Objektiv.

(c) Stellen Sie die Laserleistung auf einen Wert ein, der vom Assistenten während des Versuchs genannt wird. Die Leistung muss höher als bei der Untersuchung der Polymerkugeln sein. Warum?

(d) Scannen Sie ein Bild, wählen Sie dazu einen geeigneten Ausschnitt. Als günstige Zeit pro Pixel (bin time) können 5ms gewählt werden. Warum ist das Signal-zu-Rausch-Verhältnis hier deutlich ungünstiger als bei den farbstoffmarkierten Polymerkugeln?

(e) Werten Sie 2 Moleküle analog zu den Kugeln aus (Teil 1). Warum gibt es hier deutlich größere Unterschiede in den detektierten Intensitäten zwischen den beiden Detektoren APD1 und APD2? Was ist der Unterschied zwischen APD1 und APD2?

(f) Nehmen Sie für 10 Moleküle eine Zeitspur mit einer Zeitauflösung von s10μ auf. Die notwendige Anregungsintensität und die Länge der Zeitspuren werden vom Assistenten angegeben. Bestimmen Sie mit Hilfe der Software TRACE1 die Triplettlebensdauern der TDI-Moleküle (Mittelwert, Standardabweichung).

500 600 700 8000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

N

O

O

N

O

O

N

O

O

N

O

O

TDI in Toluol Absorption Emission

(λex = 600 nm)

A b

zw. Ψ

em /

willk

. Ein

heite

n

λ / nm

Abbildung 22 : Absorptions- und Emissionsspektren von Terrylendiimid (TDI)



Theoretische Grundlagen :

In der folgenden Abbildung ist das Drei-Niveau-System des TDI mit den wichtigsten Übergängen gezeigt. Nach einer Anregung vom Grundzustand 0S in den ersten

angeregten Singulettzustand 1S kann mit einer kleinen Wahrscheinlichkeit auch der Triplettzustand 1T populiert werden. Während die Lebensdauer des 1S Zustandes

nur etwas s105.3 9−⋅ beträgt, ist der Triplettzustand mit einer Lebensdauer von s1010050 6−⋅− wesentlich stabiler.

Abbildung 23 : Das Drei-Niveau-System

Für die weiteren Betrachtungen ist es notwendig, die zeitliche Entwicklung der Besetzungswahrscheinlichkeiten des angeregten Zustandes 2ρ zu kennen. Folgendes Gleichungssystem beschreibt die zeitliche Entwicklung

3312211121 kkkdtd

ρ+ρ+ρ−=ρ (14)

2232211122 kkkdtd

ρ−ρ−ρ+=ρ (15)

3312233 kkdtd

ρ−ρ+=ρ (16)

mit 1321 =ρ+ρ+ρ .



Nach Lösen des Gleichungssystems (gekoppelte Differentialgleichungen) erhält man ( )[ ]1eCeC1 mm2 +++−∝ρ βτ−ατ− (17) mit 2112 kk +≈α (18)

2112

231231 kk

kkk+

+≈β (19)

( )211231

2312

kkkkkC+

≈ (20)

Wie aus den Gleichungen zu erkennen ist, liefern die Zerfallskonstante β und der molekulare Kontrast C Informationen über die Intersystem-Crossing Rate 31k und damit über die Triplett-Lebensdauer.

Man nennt den Zustand, in dem ein Molekül in der Lage ist zu fluoreszieren, einen ‚An’-Zustand. Im ‚Aus’-Zustand befindet sich das Molekül im Triplett-Zustand und kann nicht fluoreszieren. Der Wechsel zwischen ‚An’ und ‚Aus’-Zuständen ist in den Zeitspuren als Wechsel zwischen Helligkeits- und Dunkelperioden zu sehen. Die Photonen werden nicht kontinuierlich, sondern meist in Bündeln, ’bunches’ emittiert. Der Einfachheit halber werden die Übergangsraten in diese Zustände mit onk und

offk bezeichnet. Die Rate, mit der der Triplettzustand verlassen wird, ist 31on kk = .

Der ‚Aus’-Zustand wird aus dem Grundzustand 0S über den ersten angeregten

Zustand 1S erreicht, 231221

12off k

kkkk+

= , wobei angenommen wurde, dass die

Anregungsrate wesentlich kleiner ist als die Fluoreszenzrate, 2112 kk << .

Damit lässt sich Gleichung (19) schreiben als : offon kk +=β (21)

und

on

off

kkC ≈ (22)



Hierbei wurde angenommen, dass die Intensitäten im ‚An’-Zustand wesentlich größer sind als im ‚Aus’-Zustand, offon II >> . Mit der Annahme, dass die Zeitauflösung einer Messung deutlich kleiner (geringer1) als die Fluoreszenzlebensdauern ist, erhält man aus der Autokorrelation einer Zeitspur

( ) ( ) βτ−+=τ eC1g 2 (23)

(Es handelt sich um eine Korrelationsfunktion 2. Ordnung)

1 Fluoreszenzlebensdauern liegen bei einigen ns, die Zeitauflösung der Messung beträgt einige μs



6 Fragen zur Vorbereitung

• Wodurch wird das räumliche Auflösungsvermögen eines Mikroskops bestimmt?

• Wie vergleicht sich ein konfokales Mikroskop mit einem (‚herkömmlichen‘) Weitfeldmikroskop?

• Was sind die Voraussetzungen, um einzelne Moleküle untersuchen zu können?

• Warum könnten Einzelmoleküluntersuchungen interessant sein? • Welche Parameter können prinzipiell an einzelnen Farbstoffen untersucht

werden? • Welche Detektoren sind für die optische Einzelmolekülmikroskopie geeignet? • Welche Informationen erhält man aus Korrelationsfunktionen? • Welche Art von Korrelationsfunktion wird in dem vorliegenden Versuch

bestimmt?



7 Literatur:

Die folgende Liste wurde übernommen von

http://www.olympusfluoview.com/books/index.html, Stand September 2011

- Handbook of Biological Confocal Microscopy - James B. Pawley (editor), Publisher: Springer; 2nd edition (March 31, 1995) , ISBN: 0306448262

- Confocal Microscopy for Biologists - Alan R. Hibbs, Springer; 1 edition (August 4, 2004), ISBN: 0306484684

- Cell Biological Applications of Confocal Microscopy - Brian Matsumoto (editor), Academic Press; 2 edition (December 24, 2002) , ISBN: 0125804458

- Confocal Microscopy: Methods and Protocols - Stephen W. Paddock (editor), Humana Press; 1st edition (January 15, 1999) , ISBN: 0896035263

- Confocal Laser Scanning Microscopy - Colin J. R. Sheppard and David M. Shotton, Springer; 1 edition (January 1997) , ISBN: 0387915141

- Confocal and Two-Photon Microscopy: Foundations, Applications, and Advances - Alberto Diaspro (editor) � Wiley-Liss; 1 edition (November 22, 2001) , ISBN: 0471409200

- Confocal Microscopy (Methods in Enzymology - Volume 307) - P. Michael Conn (editor), Academic Press; 1 edition (September 7, 1999) , ISBN: 0121822087

- Principles of Three-Dimensional Imaging in Confocal Microscopes - Min Gu, Wspc (July 29, 1996) , ISBN: 9810225504

- Three-Dimensional Confocal Microscopy: Volume Investigation of Biological Systems - John K. Stevens, Linda R. Mills, and Judy E. Trogadis (editors), Academic Press; 1 edition (September 15, 1994) , ISBN: 0126683301

- Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems - Timothy R. Corle and Gordon S. Kino, Academic Press; 1 edition (September 12, 1996) , ISBN: 0124087507

- Confocal Microscopy - Tony Wilson (editor), Academic Press (November 11, 1990) , ISBN: 0127572708

- Selected Papers on Confocal Microscopy - Barry R. Masters and Brian J. Thompson (editors), SPIE Press (November 15, 1996) , ISBN: 0819423726



8 Gefährdungsbeurteilung des Versuches Laserstrahlung kann potentiell schädlich für die Augen sein. Es sind die entsprechenden Sicherheitsbestimmungen einzuhalten.



9 Tabellen für die Messwerte

(A) räumliches Auflösungsvermögen

# amp1

cts/5ms σ1

Pixel amp2

cts/5ms σ2

Pixel 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

(B) Intensitätsfluktuationen, Autokorrelationfunktion

# A B k β 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1

10 1 1 1 1 1

Physikalische Chemie - Grundmodul...Joh Ins 0 I / [a.u.] Abbild @647n scheide 1.2 Z Trotz z stark s...

Documents

Transcript of Physikalische Chemie - Grundmodul...Joh Ins 0 I / [a.u.] Abbild @647n scheide 1.2 Z Trotz z stark s...