Planung von Experimenten zur Sicherheitsforschung bei Gehölzen

W. E. Weber

Institut für Pflanzenzüchtung und Pflanzenschutz

Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Dahnsdorf, 5. Juni 2003

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze2. Projektübergreifende Aspekte3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei

Pappel und Apfel4. Vertikaler Genfluss bei Rosen5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei

Pappeln6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

Struktur des Forschungsverbundes

Spezifische Umweltwirkungen transgener Gehölze

Rhizosphäre

Rhizosphäre

P4, P5: Pappel

Rebarthropoden

Rebarthropoden

P6: Rebe

Verantwortliche, am Vorsorgeprinzip orientierte Nutzung gentechnisch veränderter Gehölze

VertikalerGentransfer

Sterilitätskonzepte

P1: EspeP2: Apfel

AuskreuzungP3: Rose

• P1 Espen und P2 Apfel– Männliche und weibliche Sterilität bzw. Parthenokarpie

sollen vertikalen Gentransfer unterdrücken.

• P3 Rosen– Quantitative Erfassung des vertikalen Gentransfers

• P4 Pappeln– Bodensanierung durch transgene Pappeln

• P5 Pappeln– Einfluss von Transgenen auf die Rhizoflora im Labor

und Freiland

• P6 Wein– Direkter und indirekter Effekt von Chitinasen und

anderen Enzymen auf Rebarthropoden bei Wein

Gehölze, Übersicht über die Projekte

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze2. Projektübergreifende Aspekte3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei

Pappel und Apfel4. Vertikaler Genfluss bei Rosen5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei

Pappeln6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

Gehölze sind durch folgende Besonderheiten gekennzeichnet:

• mehr- bis vieljährig

• große Pflanzen

• langsame Jugendentwicklung bis zur Blüte

• genetisch vergleichsweise wenig untersucht

• Der Versuchsansteller ist für viele Jahre standortmäßig festgelegt.

• Es gibt zahlreiche Wechselbeziehungen zur übrigen Flora und Fauna.

• Nur eine vergleichsweise kleine Zahl an Pflanzen kann genauer untersucht werden.

• Ein einmal gewählter Versuchsplan ist kaum noch zu ändern.

• Partielle Entnahme von Bäumen führt zu Lücken im Versuchsplan mit allen Konsequenzen.

Generelle Aspekte mit transgenen Gehölzen

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze2. Projektübergreifende Aspekte3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei

Espen und Apfel4. Vertikaler Genfluss bei Rosen5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei

Pappeln6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

• Vermeidung von Auskreuzungen bei transgenen Espen– männliche Sterilität => Pollenflug aus der Anlage– weibliche Sterilität => Samenbildung in der Anlage– Zur Vermeidung eines vertikalen Transfers wird

beides gebraucht.

• Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung– Prozentsatz falscher Blüten

Quantitative Ausprägung würde im Ernstfall aber kritisch zu bewerten sein.

P1 Espe - Ziele

P1 Espe

• Projektplan– 7 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens

vermittelt) und Kontrolle– Jeweils zwei Varianten: ohne und mit rolC-Gen

Das rolC-Gen verursacht eine gut erkennbare Wuchsveränderung.

– Jeweils 2 Varianten: ohne und mit Konstrukt für Frühblühen

– Je Variante 10 transgene Bäume geplant

rolC- Gen

(A)geringer Wuchs (B) hellgrüne Blattfarbe

Eigenschaften rolC-transgener Aspen (links, mitte)im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen (rechts).

• Versuchsumfang– (7 +1) * 2 * 2 = 32 Varianten = 320 Bäume

• Kontrolle der transgenen Espen mit PCR– Einbau nur eines Konstruktes wichtig, da

mehrere Konstrukte sich gegenseitig beeinflussen könnten

– Ermittlung des Insertionsortes• Anzucht der Bäume bis zur Blüte • Beobachtung über mehrere Perioden

P1 Espe

Promotor/Zielgen-Kombination

Zielgewebe der Expression

Verfügbarkeit

PTA29-Barnase Tapetum Dr. Debener

PTA 29-Vst1 Tapetum Dr. Debener

ClGPDHC- Barnase Pollen Dr. Debener

ClGPDHC-Vst1 Pollen Dr. Debener

PTA29-argE Tapetum Prof. I. Broer

Stigma-spez. Promotor-Barnase

Stigma Dr. Debener

DefH9-iaaM Stigma Prof. A. Spena

Konstrukte

• Versuchsfragen: – Zeigen die Konstrukte die gewünschte Wirkung?– Ist die Wirkung ausreichend?

• Vergleiche:– Jeweils mit gegen ohne Konstrukt, sowohl mit als

auch ohne rolC-Gen (Einfach- gegen Doppeltransformation)

– Verschiedene Konstrukte miteinander

P1 Espe

• Es ist unbekannt, wann und wie intensiv die Espen blühen, es besteht aber die Hoffnung, dass dies in 1-3 Jahren realisierbar ist.

• Es ist unbekannt, ob die Konstrukte zu ausreichender männlicher oder weiblicher Sterilität führen.

• Es darf zur Erreichung des Zieles nur ein kleiner Teil falscher Blüten gebildet werden. Wer setzt fest , welcher Anteil tolerierbar ist (etwa 5%) ?

P1 Espe – Offene Fragen

P1 Espe - Sicherheitsaspekte

• Wenn die Espen blühen und der Mechanismus nicht mit Sicherheit erfolgt, könnte eine Ausbreitung stattfinden.

• Dem kann im Projekt dadurch vorgebeugt werden, dass die blühenden Bäume ins Gewächshaus gebracht werden.

• Nach Ablauf des Versuches wird die Fläche vollständig gerodet.

• Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen– Alle Konstrukte werden mit derselben Kontrolle

verglichen.

– Zusätzlich interessiert der Vergleich der Kontrollen untereinander.

• Stichprobenumfang – kein Problem, da viele Blüten vorhanden

• Zeitabhängigkeit– Effekt unbekannt

– Blüte auch in Folgejahren, aber im Projektzeitraum wohl nicht mehr verfügbar

P1 Espe – biometrische Aspekte (1)

Quantitative Erfassung der Wirkung• Idealfall: 100 %, jeder Abweicher

widerlegt die Hypothese• Realfall: vorgegebene Frequenz an

Abweichern– Ist die Frequenz genotypabhängig?– Welche Verteilung liegt vor

(binomial, Poisson, geklumpt) ?– Wie ist die Frequenz zu bewerten?

P1 Espe – biometrische Aspekte (2)

• Übertragung von Resistenzen über Transformation

– Feuerbrand– Apfelschorf– Apfelmehltau

• Verhinderung der Auskreuzung transgener Bäume– männliche Sterilität => kein Pollenflug aus der Anlage– Parthenokarpie => samenlose Früchte

• Bei nur partieller Unterdrückung: quantitative Erfassung– Prozentsatz falscher Blüten

P2 Apfel - Ziele

Projektplan• 6 Konstrukte (Agrobacterium tumefaciens

vermittelt) und Kontrolle• Transformation transgener und nicht

transgener Linien der Sorte ‚Pinova‘ in vitro

• Kontrolle der Transformation– PCR, Southern Blot, ELISA, ...

• Veredlung auf M9 mit ‚Hibernal‘ als Zwischenveredlung

P2 Apfel

P2 Apfel - Konstrukte

Promotor/Zielgen-Kombination

Zielgewebe der Expression

Zielstellung

PTA29-Barnase Tapetum Pollensterilität

PTA29-Vst1 Tapetum Pollensterilität

CIGPDHC-Barnase Pollen Pollensterilität

CIGPDHC-Vst1 Pollen Pollensterilität

DefH9-iaaM Stigma Parthenokarpie

Nin88-Nin88-antisense Pollen Pollensterilität

• Vergleich der Konstrukte mit Kontrollen– Alle Konstrukte werden mit derselben

Kontrolle verglichen.– Zusätzlich interessiert der Vergleich der

Kontrollen untereinander.– Vergleich transgen gegen nicht transgen

• Andere Aspekte ähnlich wie bei den Espen (P1)

P2 Apfel – biometrische Aspekte

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze2. Projektübergreifende Aspekte3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei

Pappel und Apfel4. Vertikaler Genfluss bei Rosen5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei

Pappeln6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

P3 Rosen - Teilprojekt 1

• Auskreuzungsrate bestimmter Rosentypen– Floribundarosen (‚Heckenzauber‘)– Teehybriden (‚Pariser Charme‘)

• Erfassung der Polleneintragsrate über selbstinkompatible Fängerpflanzen (diploider Genotyp) in Abhängigkeit von– Abstand: 0, 20 und 200 m– Richtungen: 2-3– Standorte: Ahrensburg, Groß Lüsewitz

• Überprüfung der Auskreuzungsrate– an Samen– mittels molekularer Marker

P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Versuchsplan)

PCHeck

F

F F

F

FF

20 200

F

F20

200

Versuchskern:5 Pariser Charm5 Heckenzauber

Mantel: 20 Fängerpflanzenin 20 bzw. 200 m Entfernung:

je 5 Fängerpflanzen

Merkmale:Zahl der Früchte zu Zahl der BlütenJe Fängerblock max. 20 Samen

• Früchte pro BlüteHeckenzauber und Pariser Charme als Kontrollen für die selbstinkompatiblen Fängerpflanzen– Vergleich von Anteilen; 2 Orte

• Samenkeimrate bei Fängerpflanzen – mehrdimensionale Kontingenztafel– Orte, Abstände, Richtungen

• Herkunft von Samen bei Fängerpflanzen– mehrdimensionale Kontingenztafel

– Orte, Abstände, Richtungen sowie Genotypen(Heckenzauber‚ Pariser Charme, andere Quellen)

P3 Rosen - Teilprojekt 1 (Auswertung)

P3 Rosen - Teilprojekt 2

• Auskreuzungsrate aus Kulturrosen in Wildrosen– Quelle: 2 Rosenzuchtbetriebe– Empfänger: natürlich vorkommende Wildrosen in der

Umgebung

• Versuchsplan– Anzahl Wildrosen unbekannt, daher kein Plan möglich– max. 100 Samen pro gefundener Pflanze– max. 1000 Samen

• Auswertung– Anteil Samen auf Wildrosen aus Auskreuzung– Identifizierung über molekulare Marker

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze

2. Projektübergreifende Aspekte

3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei Pappel und Apfel

4. Vertikaler Genfluss bei Rosen

5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei Pappeln

6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

P4 und P5 Pappeln: Ziele

Projektplan• Freisetzung transgener Pappeln mit dem Ziel

der Schwermetallaufnahme zur Entgiftung verseuchter Böden. Hintergrund ist die Überexpression cytosolischer -Glutamylcystein-Synthetase (cyt-ECS) transgener Pappeln.

• Stabilität des Transgens über mehrere Perioden

• Erfassung des horizontalen Gentransfers über Mykorrhizen

• Versuchsumfang– 2 Standorte (Mansfelder Land, Ekatarinenburg)– 3 Belastungsgrade mit Kupfer– transgene Pappeln und Kontrollen randomisiert in

50*50 m² Parzellen

• Beobachtungszeitraum– 3 Jahre (geplant), jedes Jahr werden einige Bäume zur

Untersuchung gerodet und ergeben Lücken.

• Vergleiche– zwischen Kontrollbäumen und transgenen Bäumen– zwischen Kupferbelastungen – für jeden Standort getrennt

P4 Pappeln

P4 Pappeln - Versuchsplan

geringe Kupferbelastung

mittlere Kupferbelastung

hohe Kupferbelastung

Mansfelder Land Ekatarinenburg

( )

keine Fläche gefunden

P4 Pappeln – Versuchsplan (Detail)

17 25 19 15 11 10

13 8 18 21 35 24

26 1 36 14 3 31

12 6 7 30 2 29

33 28 34 32 9 27

20 16 23 22 5 4

Ausschnitt; schwarz = Kontrolle, rot = transgen

Insgesamt 144 = 72+72 Bäume + 2 Reihen Kontrolle als Mantel

• Zu Beginn des Versuches– Bodenproben an verschiedenen Stellen

• Während der Vegetation– 3 Probenahmetermine im Abstand von 2 Monaten– Messung der Konzentration an Thiolen

(Glutathion und Phytochelatine) in den Blättern (HPLC)

– Messung der Expression des gshl Gens (Northern Blot)

P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (1)

• Am Ende der Vegetation jedes Jahr– Rodung von 10 Kontroll- und 10 transgenen

Bäumen je Parzelle– Chemische Analyse der Biomasse (in Blätter und

Holzteile getrennt) auf 10 Schwermetalle– Bodenproben an den Entnahmestellen– Sammeln der Blätter nach Laubfall (vermeidet

Wiedereintrag)• Am Ende des Versuches

– Rodung der Flächen– Verbrennung und Ascheanalyse auf Schwermetalle

– Bodenproben an verschiedenen Stellen

P4 Pappeln – Analyse des Entgiftungsprozesses (2)

P5 Pappeln und Mykorrhizen

Schwerpunkte sind:• Untersuchung des Einflusses der verstärkten

Schwefelaufnahme durch transgene Pappeln auf die Zusammensetzung der für Pappeln wichtigen Mykorrhizen

• Beeinflussung der Schwefelaufnahme transgener Pappeln durch Mykorrhiza

• Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer (Übertragung von Transgenen von der Pappel auf Mykorrhizen). Hierzu dient der Versuch zur Bodenentgiftung (P4).

• Mykorrhizisierungsgrad an Stichproben (20 +30+30 Bäume)

• Anzucht der gefundenen Mykorrhizen und deren Bestimmung der Arten

• Verschiedene Entnahmezeitpunkte, um Umwelteinflüsse zu erfassen

• Da horizontaler Gentransfer ausgesprochen selten erwartet wird, ist eine biometrische Analyse kaum möglich.

P4 und P5 Pappeln –Mykorrhiza

Gliederung

1. Struktur des Forschungsverbundes Gehölze2. Projektübergreifende Aspekte3. Unterbindung des vertikalen Genflusses bei

Pappel und Apfel4. Vertikaler Genfluss bei Rosen5. Entgiftung und horizontaler Genfluss bei

Pappeln6. Toxizität gegenüber Arthropoden bei Wein

• A: Laborversuche zum Einfluss von Enzymen und Insektenpathogenen auf Larven von Lobesia botrana (Traubenwickler, Schädling) und Typhlodromus pyri (Raubmilbe, Nützling)

• B: Gewächshausversuche mit transgenen Reben, die diese Enzyme enthalten

• C: Freisetzungsversuche mit transgenen Reben

P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen

• Enzyme– CHI (Chitinase)– GLU (1,3 Glucanase)– RIP (Ribosom-inhibierendes Protein)

• Insektenpathogene– Bacillus thuringiensis– Entomopathogene Pilze

• Erfasste Wirkungen– Direkte Toxizität der Enzyme– Synergistische und antagonistische Wirkungen der

Enzyme über die Insektenpathogene

P6 Wein – Auswirkung transgener Reben auf Arthropoden als Nichtzielorganismen

• Toxizität über Probitanalyse– LD50 sowie LD20 und LD80– Schwellenwerte über Vorversuche

• Mikroskopische Untersuchungen– Beschaffenheit der Matrix des Mitteldarmes wird

an 10 Larven je Stufe analysiert• Sequentielle Vorgehensweise

– Das Ergebnis der Laborversuche bestimmt das Vorgehen im Gewächshaus, dieses wiederum die Strategie bei den Freilandversuchen

P6 Wein – Biometrische Aspekte

Zusammenfassung

1. Der Verbund ist vergleichsweise heterogen.2. Die Dauerhaftigkeit der Gehölze verträgt sich

schlecht mit der zeitlich befristeten Projektdauer.3. Die Möglichkeiten der biometrischen

Versuchsplanung sind bei Freilandversuchen und z. T. auch im Gewächshaus stark eingeschränkt.

4. Einige Ereignisse werden nur selten erwartet, der für sichere Aussagen notwendige große Stichprobenumfang ist aber technisch meistes nicht machbar.

5. Im Vordergrund steht der Erkenntnisgewinn, nicht die Sicherheit.