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GENEXPRESSION

(A) Biochemische Grundlagen

Bakterien besitzen die Fähigkeit, auf Veränderungen ihrer Umgebung sehr flexibel zu reagie-

ren. Besonders ausgeprägt ist dabei die Anpassung von Enzymaktivitäten kataboler Stoff-

wechselwege an die jeweils zur Verfügung stehenden Substrate. So nutzt das Enterobakte-

rium Escherichia coli Glucose als bevorzugte Kohlenstoffquelle. In Abwesenheit von Glucose

können aber auch andere Zucker verwertet werden, unter anderem -Galactoside wie z. B.

das Disaccharid Lactose. Die Proteine, die für die Aufnahme und Spaltung der Lactose in

Galactose und Glucose erforderlich sind, nämlich die Lactosepermease und die -Galactosi-

dase, werden nur gebildet, wenn -Galactoside als Substrat im Nährmedium vorhanden sind.

Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose jedoch werden diese Proteine, die zur Verwertung

von -Galactosiden erforderlich sind, nur noch in einem sehr geringen Umfang gebildet, selbst

wenn ein geeignetes Substrat vorhanden ist. Die Regulation von Enzymaktivitäten durch An-

und Abschalten der Proteinsynthese, die sich auf der Ebene der Transkriptionskontrolle

abspielt, wird als Induktion bzw. Repression bezeichnet. Eine Substanz, die die Synthese von

bestimmten Proteinen induziert, nennt man Induktor.

Durch Analyse der DNA-Sequenzen und der Funktionsweise der für das -Galactosidase-

system codierenden Genabschnitte war es möglich, die Mechanismen, die dieser Regulation

zugrunde liegen, sehr detailliert zu beschreiben.

Wird in einer Kultur von E. coli die Bildung der -Galactosidase durch Zugabe eines geeigneten

Induktors induziert, so beobachtet man gleichzeitig nicht nur eine vermehrte Synthese von

Lactosepermease, einem Transportprotein, das die Aufnahme der Lactose und anderer -

Galactoside in das Zellinnere überhaupt erst ermöglicht, sondern auch den Aktivitätsanstieg

eines Enzyms, das als Transacetylase bezeichnet wird. Dieses Protein katalysiert die

Übertragung der Acetylgruppe von AcetylCoA auf -Galactoside, die durch -Galactosidase

nicht hydrolysiert werden können und sich daher in der Zelle anhäufen würden (z. B. -Thio-

galactoside). Da die acetylierte Verbindung von den Bakterien wieder ausgeschieden wird,

verhindert die Transacetylase eine Schädigung der Zelle durch Akkumulation nicht spaltbarer

-Galactoside. Die genetische Information für diese drei Proteine liegt auf einem zusammen-

hängenden DNA-Abschnitt. Die Expression dieser drei Strukturgene, deren Transkription eine

einzige, polycistronische mRNA ergibt, wird durch ein gemeinsames genetisches Kon-

trollelement reguliert. Dieses besteht aus dem Promotor und dem Operator und bildet

zusammen mit den drei Strukturgenen eine Funktionseinheit, die als lac-Operon bezeichnet

wird (Abb. 1a und b).

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Abb. 1 Regulation des lac-Operons in E. coli

a) reprimiertes lac-Operon

b) aktives lac-Operon

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Das lac-Operon besteht aus dem Promotor (Plac), den beiden Operatorsequenzen O1 und O2

und den Strukturgenen für -Galactosidase (lac Z), Lactosepermease (lac Y) und Transace-

tylase (lac A). Der Funktionszustand des Operons wird durch den Repressor bestimmt, ein

regulatorisches Protein, dessen Strukturgen als Regulatorgen (lac I) bezeichnet wird. Der

Repressor liegt in seiner aktiven Form als Tetramer vor und bindet mit hoher Affinität an die

beiden DNA-Sequenzen des Operators. Dadurch wird der Teil des lac Z-Gens, der unmittelbar

stromabwärts vom Promotor, der Bindungsstelle der RNA-Polymerase liegt, blockiert. Das

Operon ist reprimiert, d. h. es findet keine Synthese der entsprechenden mRNA statt.

Die durch den Repressor verursachte Hemmung der Transkription lässt sich durch einen ge-

eigneten Induktor aufheben. Induktoren des lac-Operons sind allosterische Effektoren, die

durch Bindung an den Repressor diesen von einer aktiven in eine inaktive Konformation

überführen. Da der Repressor in der inaktiven Form nur eine sehr niedrige Affinität zum Ope-

rator aufweist, wird die Blockierung des lac Z-Gens aufgehoben. Die an die DNA der Pro-

motorregion gebundene RNA-Polymerase kann nun das gesamte Operon transkribieren

(Abb. 1b). Die Information der drei Strukturgene lac Z, lac Y und lac A wird dabei auf ein ein-

ziges mRNA-Molekül übertragen. Diese polycistronische mRNA dient nun bei der Translation

als Matrize, wobei die entsprechenden Proteine gleichzeitig an einem einzigen mRNA-Molekül

gebildet werden.

Biologisch bedeutsame Induktoren des lac-Operons in E. coli sind in der Natur vorkommende

-Galactoside wie -Galactoglycerin, welches aus dem Abbau von Galactolipiden stammt, und

Allolactose (Abb. 3). Letztere wird in geringem Umfang aus der von den Bakterienzellen

aufgenommenen Lactose gebildet. Diese Reaktion wird ebenfalls durch die -Galactosidase

katalysiert, die daher, zusammen mit der Lactosepermease, mit einer niedrigen Basalaktivität

vorhanden sein muss. Für biochemische Untersuchungen der Induktion des lac-Operons

eignen sich besonders gut synthetische Analoga von -Galactosiden wie z.B. Isopropyl--

thiogalactosid (Abb. 3), weil diese Verbindungen zwar ausgeprägte Induktoreigenschaften

besitzen, aber von der -Galactosidase selbst nicht abgebaut werden.

Der bereits zuvor erwähnte Einfluss von Glucose auf die Induzierbarkeit der ß-Galactosidase

lässt allerdings einen komplexeren als den hier beschriebenen Regulationsmechanismus

vermuten. Tatsächlich wird die negative Kontrolle des lac-Operons, die durch den Repressor

ausgeübt wird, ergänzt durch eine positive Kontrolle der Transkription, bei der die Signalsub-

stanz 3',5'-cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) eine Schlüsselrolle spielt. Die intra-

zelluläre cAMP-Konzentration ihrerseits ist abhängig von der im Nährmedium vorhandenen

Glucose: Bei Glucosemangel ist der cAMP-Spiegel in der Zelle hoch und sinkt nach Gluco-

sezugabe wieder sehr rasch ab. Ein hoher cAMP-Gehalt der Zelle stimuliert die Initiation der

Transkription, ein Effekt, der durch ein weiteres regulatorisches Protein, das cAMP-Rezeptor-

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Protein (CRP), vermittelt wird. Dieses Protein wird häufig auch als CAP (catabolite gene

activator protein) bezeichnet. Wachsen E. coli-Zellen auf Glucose, ist der cAMP-Spiegel

niedrig, und CRP liegt in einer inaktiven Form vor. Ist die Glucose im Medium jedoch aufge-

braucht, steigt die Konzentration an cAMP, und es bildet sich ein aktiver CRP: cAMP-Komplex.

Dieser bindet sowohl an eine spezifische DNA-Sequenz in der Nähe des Promotors als auch

an die RNA-Polymerase und erhöht dadurch deren Bindungskonstante für den lac-Promotor,

was zu einer erheblichen Steigerung der Transkriptionsrate des lac-Operons führt (Abb. 1b).

Der molekulare Mechanismus der Regulation des cAMP-Spiegels in der Bakterienzelle un-

terscheidet sich grundsätzlich von demjenigen in eukaryotischen Zellen. Während die Aktivität

der Adenylatcyclase in Eukaryonten hormonell gesteuert wird, ist die Kontrolle ihrer Aktivität

bei dem Prokaryonten E. coli eng an den mit einer Phosphorylierung verbundenen Transport

von Glucose durch die Zellmembran gekoppelt. Dieser Transport erfolgt über das komplexe

Phosphotransferasesystem, dessen Komponente Enzym III bei der Regulation des

Kohlenhydratstoffwechsels eine Schlüsselfunktion besitzt.

Katalysiert durch das Phosphotransferasesystem entsteht aus Enzym III (EIIIglc) in mehreren

Reaktionsschritten die phosphorylierte Form von Enzym III (EIIIglc~P), wobei eine Phospho-

rylgruppe von Phosphoenolpyruvat in einer mehrstufigen Reaktionskaskade auf EIIIglc über-

tragen wird. Beim Glucosetransport durch die Zellmembran überträgt EIIIglc~P die Phospho-

rylgruppe auf den Zucker. Bei dieser Reaktion wird aus EIIIglc~P wieder EIIIglc zurückgebildet,

welches dann in einem weiteren Reaktionszyklus unter Verbrauch von Phosphoenolpyruvat

rephosphoryliert wird. Diese Interkonversion der beiden unterschiedlichen Formen von Enzym

III geht einher mit einer Konzentrationsänderung von phosphorylierter und nicht

phosphorylierter Form, die ihrerseits vom Umfang des Glucosetransportes abhängig ist. In

Abwesenheit von Glucose im Kulturmedium liegt Enzym III weitgehend als EIIIglc~P vor,

wohingegen bei der Aufnahme von Glucose aus dem Nährmedium die dephosphorylierte Form

EIIIglc überwiegt. Beide Formen von Enzym III besitzen, wie in Abb. 2 skizziert,

unterschiedliche regulatorische Eigenschaften.

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Abb. 2 Einfluss von Glucose auf die Aktivität von Adenylatcyclase und Lactosepermease

E. coli-Zellen, die auf glucosefreiem Kulturmedium wachsen, zeigen einen hohen cAMP-

Spiegel, weil die Adenylatcyclase durch EIIIglc~P, der unter Glucosemangel vorherrschenden

Form von Enzym III, aktiviert wird. Bei gleichzeitiger Anwesenheit eines geeigneten Induktors

der -Galactosidase liegen somit Bedingungen vor, die eine maximale Transkription des lac-

Operons ermöglichen (Abb. 1b). Die Zugabe von Glucose zur Kultur verursacht einen drasti-

schen Abfall der Konzentration von EIIIglc~P, und folglich sinkt auch der Spiegel von cAMP.

Dieser inhibitorische Glucoseeffekt, der schließlich über eine Inaktivierung des cAMP-Re-

zeptor-Proteins zur Herabsetzung der Transkriptionsrate des lac-Operons führt, wird als Ka-

tabolitrepression bezeichnet. Katabolitrepression wird nicht nur bei den Enzymen, die durch

das lac-Operon codiert werden, sondern auch bei einer Reihe von Enzymen aus anderen

katabolen Stoffwechselwegen in Bakterien beobachtet.

Von diesem Mechanismus jedoch muss die Katabolithemmung unterschieden werden. Dabei

handelt es sich um eine Hemmung der Lactosepermease durch das dephosphorylierte Enzym

EIIIglc, welches in Gegenwart von Glucose überwiegt. Dieser Effekt verhindert die Aufnahme

von Lactose durch das Bakterium; somit gelangt kein Induktor in die Zelle, und das lac-Operon

wird lediglich entsprechend seiner Basalaktivität exprimiert. Beide Regulationswege ergänzen

sich gegenseitig und stellen sicher, dass Glucose als bevorzugtes Substrat genutzt wird.

Die Katabolithemmung verhindert die Aufnahme des Induktors, wenn die Bakterien bei Zugabe

des Induktors bereits Glucose als Kohlenstoffquelle verwerten. Unter diesen Bedingungen wird

das lac-Operon nicht induziert, da in der Zelle kein Induktor zur Verfügung steht. Im

umgekehrten Fall, wenn zu einer bereits induzierten Kultur Glucose zugegeben wird, wie es

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bei dem hier durchzuführenden Versuch geschieht, bewirkt die Katabolitrepression ein Ab-

sinken des cAMP-Spiegels, was seinerseits zu einer schnell eintretenden Herabsetzung der

Expressionsrate des lac-Operons führt.

Das Beispiel des lac-Operons von E. coli zeigt, dass Bakterien zu einer optimalen Anpassung

an ihre Umgebung befähigt sind. Durch ein Zusammenspiel von drei verschiedenen

Regulationsmechanismen, nämlich Induktion, Katabolitrepression und Katabolithemmung,

wird die Bildung der Enzyme, die zur Verwertung von Lactose und anderen -Galactosiden

erforderlich sind, sehr genau dem jeweiligen Bedarf der Zelle angepasst.

Abb. 3 Substrate und Substratanaloga der ß-Galactosidase

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1. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Wachsende Kulturen von E. coli zeigen nur eine geringe Aktivität der -Galactosidase. Durch

Zugabe des Induktors Isopropyl--thiogalactosid (IPTG) wird die Synthese von -Galactosidase

induziert, die Aktivität des Enzyms nimmt in Abhängigkeit von der Zeit zu (Versuchsreihe A). Bei

Zugabe von Glucose zur bereits induzierten Kultur steigt die -Galactosidase-Aktivität nicht weiter

an (Versuchsreihe B).

Die Bestimmung der Enzymaktivität von -Galactosidase erfolgt durch Hydrolyse des syn-

thetischen Substrates o-Nitrophenyl--galactosid (0NPG) zu Galactose und o-Nitrophenol. Die

Konzentration an o-Nitrophenol, das im alkalischen Bereich gelb gefärbt ist, wird pho-

tometrisch bestimmt ( = 400 nm). Der Proteingehalt der jeweiligen Proben wird durch

Trübungsmessung der Kultur ermittelt. Aus der Konzentration von o-Nitrophenol und aus dem

Proteingehalt wird die spezifische Aktivität der -Galactosidase berechnet.

2. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

1. Induktion und Probenentnahme

Vorbereitung der Reaktionsgefäße (Eppis):

a) 28 Reaktionsgefäße (Eppis) werden auf dem Deckel folgendermaßen

beschriftet:

7 Eppis mit A0 T; A5 T; A10 T; A15 T; A20 T; A25 T; A30 T (Proben aus

Ansatz A zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten)

7 Eppis mit A0; A5; A10; A15; A20; A25; A30 (Proben aus Ansatz A zum

Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten)

7 Eppis mit B0 T; B5 T; B10 T; B15 T; B20 T; B25 T; B30 T (Proben aus

Ansatz B zum Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten)

7 Eppis mit B0; B5; B10; B15; B20; B25; B30 (Proben aus Ansatz B zum

Zeitpunkt t = 0 bis t = 30 Minuten)

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b) Eppis mit Toluol behandeln:

In die mit „T“ beschrifteten Eppis wird jeweils1 Tropfen Toluol (steht unterm

Abzug, Schutzbrille, Handschuhe) pipettiert

c) Vorbereitung der Bakterienkultur:

Jede Gruppe hat an seinem Platz zwei Erlenmeyerkolben (Ansatz A und B) mit je

40 ml einer Kultur von E. coli, Stamm H 3000.

Die am Platz befindlichen weißen Plastikschüsseln werden nun zur Hälfte mit

Wasser, aus der Vorratswanne aufgefüllt (Ablagebank an der Spüle!!).

Die Kolben mit den enthaltenen Bakterien werden nun in die Schüsseln gesetzt

und bei 37°C temperiert und zur Belüftung mit einem Magnetrührer (250rpm)

gerührt.

Nach einer Vorinkubationszeit von 5 min wird in beiden Kolben die Bildung von -

Galactosidase durch Zugabe von je 1 ml 5 mM IPTG-Lösung (I) induziert (t = 0).

Sofort nach Zugabe des Induktors und weiterhin im Abstand von jeweils 5

Minuten werden aus beiden Kolben Proben von 1 ml entnommen und in die

vorbereiteten Eppigefäße (AO T und AO, B0 T und B0, A5 T etc.) pipettiert. Die

Gefäße werden verschlossen und 10 sec lang kräftig geschüttelt.

15 min nach der Induktion mit IPTG vor der Entnahme der Probe zum

Zeitpunkt t = 15 min wird der Kolben B zusätzlich mit 1 ml 20 mM

Glucoselösung (G) versetzt, um den Einfluss von Glucose auf die Expression

des Lac Z Gens zu untersuchen

Bis zur letzten Probenentnahme zum Zeitpunkt t = 30 min bleiben die Toluolproben

im Eppiständer.

Die Trübungsmessung der anderen Proben A0-A30 und B0-B30 kann direkt am

Photometer durchgeführt werden.

Die Messung erfolgt gegen eine mit Wasser gefüllte Leerwertküvette.

Photometrische Bestimmung-

Die Extinktionen werden bei der Wellenlänge = 400 nm gegen den Leerwert, gemessen und

in die Tabelle 1 eingetragen.

57

Der Versuchsablauf ist im folgenden Zeitplan nochmals zusammengefasst:

Reagenzzugabe

Probenentnahme

ß-Galaktosidase-

Aktivität

Toluolprobe

Probenentnahme

Proteinbestimmung/

Zelldichte

Eis

Zeit

(min)

Kolben A Kolben B Kolben A

jeweils

1ml

Kolben B

jeweils 1ml

Kolben A

jeweils 1ml

Kolben B

jeweils 1ml

0 1ml IPTG 1ml IPTG A0 T B0 T A0 B0

5 A5 T B5 T A5 B5

10 A10 T B10 T A10 B10

15 1ml

Glucoselösung

A15 T B15 T A15 B15

20 A20 T B20 T A20 B20

25 A25 T B25 T A25 B25

30 A30 T B30 T A30 B30

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2. Bestimmung des Proteingehalts der Bakteriensuspension

Die Proteinkonzentration der Bakteriensuspension wird über die Zelldichte ermittelt. Dazu wird

die Trübung von 1ml der Proben entnommen und bei der Wellenlänge = 400 nm im

Photometer gegen eine mit Wasser gefüllte Leerwertküvette gemessen.

Bei diesem Versuch wird ein Bakterienstamm verwendet, für den gilt:

E400 = Proteinkonzentration

Die Extinktionen werden bei der Wellenlänge = 400 nm gegen den Leerwert, gemessen

und in die Tabelle 1 (auf Seite 62) eingetragen.

3. -Galactosidasetest (Toluolproben)

Die Reaktionsgefäße mit den Proben A0T bis A30T und B0T bis B30T werden

nochmals kräftig geschüttelt.

Zum Zellaufschluss werden die Proben für 40 min bei 37°C inkubiert.

Anschließend wird in dem so gewonnenen Lysat die -Galactosidase-Aktivität

bestimmt. Dazu werden zunächst folgende Ansätze vorbereitet:

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Pipettierplan:

In der Zwischenzeit können die Ansätze in Eppis - bis auf das „inkubierte Lysat“ (40 min

Inkubation) - vorbereitet werden.

Achtung: Eppis vor der Entnahme des entsprechenden Aliquots kräftig schütteln!

Reihe A

Ansatz Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

Probe A0 T A5 T A10 T A15 T A20 T A25 T A30 T L

Enzympuffer (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

LB-Medium (ml) - - - - 0,3 0,3 0,4 0,5

inkubiertes und frisch

geschütteltes Lysat

(ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,1 -

L = Leerwert

Reihe B

Ansatz Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

Probe B0 T B5 T B10 T B15 T B20 T B25 T B30 T L

Enzympuffer (ml) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

LB-Medium (ml) - - - - 0,3 0,3 0,3 0,5

inkubiertes und frisch

geschütteltes Lysat

(ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,2 -

L = Leerwert

60

Die Ansätze werden dann 5 min bei 37°C mit dem Lysat im Wasserbad inkubiert.

Dasselbe macht man mit den Leerwertproben

Proben aus dem Wasserbad nehmen und die Enzymreaktion durch Zugabe von

0,1 ml oNPG-Lösung (O) starten. Dazu in Eppis A t=0und B t=0 oNPG Lösung

geben, schütteln, dann in A t=5 und B t=5 oNPG-Lösung geben, schütteln usw.

Die Proben wieder für 10 min ins Wasserbad stellen.

Proben aus dem Wasserbad entnehmen, Enzymreaktion durch Zugabe von

1,0 ml 1 M Na2CO3-Lösung: auch hier die Zugabe nach dem gleichen Prinzip wie

oben stoppen

Die Proben werden für 5 min bei 14000rpm zentrifugiert und vorsichtig

herausgenommen.

Photometrische Bestimmung-

Die Extinktionen werden bei der Wellenlänge = 400 nm gegen den Leerwert, gemessen

und in die Tabelle 2 (auf Seite 62) eingetragen.

61

AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Berechnen Sie die spezifische Aktivität der -Galactosidase in den Proben von Reihe A und B.

Stellen Sie die gefundenen Werte in Abhängigkeit von der Zeit nach Induktorzugabe graphisch

dar.

Rechenbeispiel:

In einen Testansatz mit dem Gesamtvolumen VT = 2 ml wurden 0,2 ml Lysat (= VL) eingesetzt.

Nach einer Inkubationszeit t = 10 min wurde bei der Wellenlänge = 400 nm und mit einer

Schichtdicke d = 1 cm die Extinktionsdifferenz E400 = 0,375 gemessen. Die

Proteinkonzentration des Lysates betrug 0,9 mg/ml. Für p-Nitrophenolat gilt:

𝜀 24,9 ∙ 10 1 ∙ 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑐𝑚

Nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz lässt sich die Konzentration von p-Nitrophenolat im

Testansatz bestimmen:

𝑐∆𝐸

𝜀 ∙ 𝑑

𝑐0,375

24,9 ∙ 10𝑚𝑜𝑙

115 ∙ 10 𝑚𝑜𝑙 ∙ 1

15 ∙ 10 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑚𝑙

Nach Berücksichtigung von Verdünnungsfaktor und Inkubationsdauer erhält man die Aktivität

der -Galactosidase im Lysat:

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡𝑐 ∙ 𝑉𝑡 ∙ 𝑉

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡15 ∙ 10 ∙ 2

600 ∙ 0,2𝑚𝑜𝑙

𝑚𝑙 ∙ 𝑠0,25 ∙ 10 𝑚𝑜𝑙 ∙ 𝑠 ∙ 𝑚𝑙

62

Die spezifische Aktivität ist dann

𝑆𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡

𝑚𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛

𝑆𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡0,25 ∙ 10

0,9𝑚𝑜𝑙

𝑠 ∙ 𝑚𝑔

0,28 𝑛𝑘𝑎𝑡𝑎𝑙 ∙ 𝑚𝑔

Die Zusammenfassung der vorhergehenden Rechenschritte ergibt folgende Gleichung:

𝑆𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 ∆𝐸 ∙ 10 ∙ 𝑉

𝜀 ∙ 𝑑 ∙ 𝑡 ∙ 𝑉 ∙ 𝑚𝑔 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑘𝑎𝑡𝑎𝑙 ∙ 𝑚𝑔

Vereinfachte Berechnung siehe Anhang

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MEßERGEBNISSE UND AUSWERTUNG

Tabelle 1: Messwerte für Proteinbestimmung

Reihe A

Probe A0 A5 A10 A15 A20 A25 A30

Proteinkonzentration

mg Protein/ml

Reihe B

Probe B0 B5 B10 B15 B20 B25 B30

Proteinkonzentration

mg Protein/ml

Tabelle 2: Messwerte des -Galactosidasetests (Toluolproben)

Reihe A

Probe A0T A5T A10T A15T A20T A25T A30T

E400

Reihe B Probe B0T B5T B10T B15T B20T B25T B30T

E400

Tabelle 3: Berechnung der spezifischen Aktivität

Reihe A

Probe A0 A5 A10 A15 A20 A25 A30

Aktivität IU/ml*mg

Reihe B

Probe B0 B5 B10 B15 B20 B25 B30

Aktivität IU/ml*mg

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𝑠𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑡∆𝐸∗10 ∗𝑉𝑇

𝜀∗𝑑∗𝑡∗𝑉𝐿∗𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑘𝑜𝑛𝑧.𝑘𝑎𝑡𝑎𝑙/𝑚𝑙

Berechnung mit Hilfe von Konstanten:

spez. Aktivität [nkatal/mg] =

𝑏𝑒𝑖 𝑉𝐿 0,5 ∆𝐸

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑘𝑜𝑛𝑧.∗ 0,27

𝑏𝑒𝑖 𝑉𝐿 0,2 ∆𝐸

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑘𝑜𝑛𝑧.∗ 0,67

𝑏𝑒𝑖 𝑉𝐿 0,1 ∆𝐸

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑘𝑜𝑛𝑧.∗ 1,34

E = E Aktivität

Proteinkonz. [mg/ml] = E Trübungsmessung

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SCHLUSSFOLGERUNGEN