06/02 Projektkennblatt

der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

Az

13267 Referat

32 Fördersumme

510.274 EUR Antragstitel

Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaseroberflächen zur Herstellung innovativer Textilien

Stichworte

Biokatalyse, Textilveredlung, Polyethylenterephthalat, Oberflächenbehandlung

Laufzeit Projektbeginn Projektende Projektphase(n)

36 Monate

01.07.2012

30.06.2015

Bewilligungsempfänger

Universität Leipzig Tel 0341-97 36781

Institut für Biochemie

Lehrstuhl Mikrobiologie & Bioverfahrenstechnik Projektleitung

Johannisallee 23

Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann

04103 Leipzig Bearbeiter

Kooperationspartner

evocatal GmbH, Monheim

Saxion University of Applied Sciences, NL-Enschede ifu Hamburg GmbH

Zielsetzung und Anlaß des Vorhabens

Das Ziel des Projekts war die Entwicklung neuer und hochaktiver Biokatalysatoren für umweltfreundliche innovative Oberflächenbehandlungsprozesse von Polyester-Fasern und -Folien aus Polyethylentereph-thalat (PET). Hierfür sollten Polyesterhydrolasen zur Funktionalisierung der Oberflächen von PET Mate-rialien entwickelt werden. Hierdurch sollten konventionelle chemisch/thermische Veredlungsprozesse, die sich durch einen hohen Energie- und Wasserbedarf auszeichnen, durch ein umweltfreundliches und energiesparendes biokatalytisches Verfahren ersetzt werden. Die mit den entwickelten Enzymen behan-delten PET Textilien und Folien sollten anschliessend für eine Verarbeitung mittels eines Metallisie-rungsverfahrens und innovativer Tintenstrahl-Drucktechnologie evaluiert werden mit dem Ziel der Ent-wicklung funktionaler Materialien mit umweltverträglichen Methoden.

Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden 1. Entwicklung von Hochdurchsatzmethoden zur Bestimmung enzymatischer PET Hydrolyseaktivität 2. Etablierung eines Hochexpressionssystems für die Polyesterydrolase TfCut2 aus Thermobifida fusca 3. Entwicklung von Verfahren zur rekombinanten Herstellung der Polyesterydrolasen in größeren Men-gen für Anwendungsversuche 4. Generierung von Enzymvarianten von TfCut2 mittels Modellierung und rationalem Proteindesign 5. Charakterisierung der biokatalytischen Eigenschaften der Polyesterhydrolasen mit verschiedenen PET Materialien mittels Gravimetrie, HPLC, Spektroskopie und Massenspektrometrie. 6. Evaluierung der biokatalytischen Oberflächenmodifikation von PET Fasern und Folien mittels Elektro-nenmikroskopie, Kontaktwinkelbestimmungen und Infrarotspektroskopie. 6. Vergleichende Ökoeffizienzanalyse des konventionellen chemischen und des biokatalytischen Verfah-rens zum Glätten von PET Faseroberflächen und zur Oberflächenmodifikation von PET Filmen.

Deutsche Bundesstiftung Umwelt £ An der Bornau 2 £ 49090 Osnabrück £ Tel 0541/9633-0 £ Fax 0541/9633-190 £ http://www.dbu.de

Ergebnisse und Diskussion Zwei Hochdurchsatz-Screeningmethoden zur Bestimmung von Polyesterhydrolaseaktivitäten mittels Turbidimetrie und Fluoreszenzspektroskopie konnten bereitgestellt werden (Meilenstein 1). Zur rekombi-nanten Produktion von Polyesterhydrolasen wurde auf der Basis des Gram-positiven Wirts Bacillus subti-lis ein Hochexpressionssystem für TfCut2 aus Thermobifida fusca entwickelt (Meilenstein 2). Mittels mo-lekularer Modellierung und rationalem Proteindesign konnten Enzymvarianten mit 50% gesteigerter Po-lyesterhydrolaseaktivität und 20% erhöhter Thermostabilität im Vergleich zum Wildtypenzym TfCut2 er-zeugt werden (Meilensteine 3 und 4). Mit Hilfe des Bacillus Sekretionssystems wurden Hochzelldich-tefermentationen zur Herstellung rekombinanter PET Hydrolasen etabliert (Meilensteine 5 und 6). Die Charakterisierung der hydrolytischen Aktivität von TfCut2 und deren Varianten mit kristallinen PET Fa-sern und amorphen PET Filmen zeigte, dass PET Fasern schwieriger enzymatisch zu hydrolysieren wa-ren als PET Folien, deren Abbaubarkeit von der kalten Kristallisationstemperatur der Folien abhing. Der enzymatische Abbau des PET Polymers erfolgte nach einem Endomechanismus, wobei auch kürzere Oligomere hydrolysiert wurden (Meilenstein 7). Die Evaluierung der im Projekt hergestellten Enzyme in einem technischen Verfahren zur Generierung geeigneter Oberflächen für die Herstellung innovativer funktionaler PET Materialien zeigte, dass die Polyesterasen TfCut2 und evo142 in der Lage waren, in ei-nem Ersatz des chemischen Verfahrens die Oberfläche von PET Fasern unter milden Reaktionsbedin-gungen zu glätten, um eine nachfolgende Funktionalisierung durch Aufbringung einer Aluminiumschicht zur Herstellung von Sonnen- und Blendschutz-Textilien zu ermöglichen. In einem weiteren Anwen-dungsbeispiel wurde gezeigt, dass auch PET Folien durch die Behandlung mit den entwickelten Enzy-men Eigenschaften verliehen werden können, die eine nachfolgende Funktionalisierung der Oberfläche mittels Tintenstrahl-Drucktechnologie ermöglicht für Anwendungen z.B. in der Elektronikindustrie (Mei-lensteine 8 und 9). Die vergleichende Ökoeffizienzanalyse der beiden Prozesse mit einem chemischen Verfahren zeigte Energie- und Wassereinsparungen sowie eine verbesserte Reinigungsleistung und kür-zere Behandlungszeiten bei Nutzung des biokatalytischen Verfahrens zur Glätttung von PET Textilien. Die Oberflächenbehandlung der PET Filme zeigte ebenfalls einen geringeren Energiebedarf im Vergleich zum chemischen Verfahren, jedoch wurde durch den Einsatz eines weiteren Tensids in einem zusätzli-chen Waschgang die Umweltwirkung wesentlich verschlechtert. Obschon hauptsächlich aufgrund der hohen Enzymkosten im Projekt die untersuchten biokatalytischen Verfahren als weniger ökoeffizient als die chemischen anzusehen waren, zeigten die Szenario-Analysen, daß die enzymatischen Verfahren die ökoeffizientere Variante darstellen, wenn die Kosten für die Enzymherstellung und die zur Behandlung benötigten Enzymmengen reduziert werden können (Meilenstein 10). Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation Die Ergebnisse des Projekts wurden zum Teil bereits in Fachzeitschriften und bei Kongressen veröffent-licht, weitere Publikationen und eine Präsentation zum Einsatz vom Biokatalysatoren beim Recycling von Plastikabfällen bei der Woche der Umwelt 2016 in Berlin ist in Vorbereitung. Fazit

• Zwei Hochdurchsatz-Screeningmethoden für Polyesterydrolaseaktivität wurden entwickelt • Ein Hochleistungsexpressionssystem für die Polyesterhydrolasen wurde etabliert • Die Produktion der rekombinanten Enzyme konnte mit hoher Ausbeute in Hochzelldichtefermenta-

tionen erzielt werden • Enzymvarianten mit 50% erhöhter Polyesterhydrolaseaktivität und 20% verbesserter Thermostabi-

lität wurden generiert • Die katalytischen Eigenschaften der entwickelten Enzyme wurden mit verschiedenen PET Materia-

lien charakterisiert • Die Anwendung der entwickelten Biokatalysatoren zeigte ihre Einsatzmöglichkeit bei der Modifizie-

rung der Oberflächen von PET Textilfasern und PET Folien zur Herstellung neuer funktionaler Ma-terialien.

• Die Modellierung und ökoeffiziente Bewertung der biokatalytischen Oberflächenbehandlungen im Vergleich zu den chemisch/thermischen Prozessen ergab ein hohes Einsparungspotential an Energie, Wasser und Behandlungszeit bei den biokatalytischen Verfahren. Die enzymatischen Verfahren stellen auch die ökoeffizientere Variante dar, wenn die Kosten für die Enzymherstellung und die im Prozess benötigten Enzymmengen bei Einsatz in einem industriellen Maßstab reduziert werden können.

Deutsche Bundesstiftung Umwelt £ An der Bornau 2 £ 49090 Osnabrück £ Tel 0541/9633-0 £ Fax 0541/9633-190 £ http://www.dbu.de

         

 

 

 

Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaser-

Oberflächen zur Herstellung innovativer Textilien

AZ 13267

Prof. Dr. Wolfgang Zimmermann, Lehrstuhl für Mikrobiologie &

Bioverfahrenstechnik, Institut für Biochemie, Universität Leipzig

Dr. Christian Leggewie, evocatal GmbH Monheim

Dr. Pramod Agrawal & Ajinkya Powar,  Saxion University of Applied Sciences,

NL-Enschede

Tobias Brinkmann & Mieke Klein, ifu Hamburg GmbH

Projektbeginn 01.07.2012

Laufzeit 36 Monate

Leipzig

2015

         

 

 

 

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung

Anlass und Zielsetzung des Projekts

Ergebnisse und Diskussion

• Universität Leipzig • evocatal GmbH • Saxion University of Applied Sciences • Ifu Hamburg GmbH

Öffentlichkeitsarbeit

Fazit

Anhang

• Publikationen • Kooperationsvertrag

         

 

 

 

Zusammenfassung

Im Projekt „Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaseroberflächen zur

Herstellung innovativer Textilien“ entwickelte ein multidisziplinäres

internationales Team neuartige Biokatalysatoren zum Einsatz in innovativen

Funktionalisierungsprozessen der Oberflächen von Materialien für Druck-

oder Beschichtungsprozesse von Textilien oder Filmen aus

Polyethylenterephthalat (PET). Hierfür wurden bisher chemisch-thermische

Verfahren eingesetzt, die jedoch einen hohen Wasser- und Energieverbrauch

bedingen und damit zu erheblichen Umweltbelastungen führen. Durch den

Einsatz eines alternativen biokatalytischen Verfahrens unter Verwendung

von leistungsstarken mikrobiellen Polyesterhydrolasen sollte im Projekt

gezeigt werden, dass PET Materialien auf umweltschonende Weise

modifiziert und ihre Oberflächeneigenschaften verbessert werden können.

Die Bereitstellung effizienter und stabile Enzyme in ausreichenden Mengen

stellte aufgrund der Rekalzitranz synthetischer Polyester und der benötigten

relativ hohen Reaktionstemperaturen ein wichtiges Projektziel dar. Die

Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung einer

enzymatischen Polyesterhydrolyseaktivität war daher eine Vorbedingung,

um in nachfolgenden Screeningverfahren gentechnisch erzeugten

Enzymvarianten mit verbesserten Eigenschaften auswählen und evaluieren

zu können. Zwei Verfahren zur turbidimetrischen und

fluoreszenzspektroskopischen Bestimmung einer biokatalytischen

Polyesterydrolyse konnten dafür bereitgestellt werden.

Auf der Grundlage der Proteinkristallstruktur der Polyesterhydrolase TfCut2

und eines verwandten Enzyms wurden Dockingexperimente mit PET

Modellsubstraten durchgeführt. Identifizierte unterschiedliche Aminosäuren

in der Umgebung der Substratbindetasche wurden dann mittels rationalem

Proteindesign ausgetauscht. Die Variante G62A sowie die auf deren

Grundlage erzeugten Doppel- und Dreifachmutanten zeigten eine mehr als

         

 

 

 

50%ige Erhöhung der Polyesterhydrolyseaktivität im Vergleich zum

Wildtypenzym TfCut2. Die erzeugte Variante I213S wies eine um mehr als

20%ige Erhöhung der Thermostabilität im Vergleich zu TfCut2 auf.

Ein Hochleistungsexpressionssystem für TfCut2 konnte dann erfolgreich auf

der Basis eines Bacillus-Sekretionssystems entwickelt werden. Dieses

System wurde anschliessend für Hochzelldichtefermentationrn eingesetzt,

wobei Ausbeuten von ca. 0,6 g/L erzielt werden konnten. Bei der Suche

nach weiteren Polyesterydrolasen konnten die Esterasen evo142 und abCut

identifiziert werden, die mit hoher Aktivität PET-Oberflächenoligomere bzw.

PET Nanopartikel hydrolysierten.

Die Charakterisierung der hydrolytischen Aktivität von TfCut2 und deren

Varianten mit kristallinen PET Fasern und amorphen PET Filmen zeigte,

dass PET Fasern schwieriger enzymatisch zu hydrolysieren waren als PET

Folien, deren Abbaubarkeit mit ihrer kalten Kristallisationstemperatur

korrelierte. Der enzymatische Abbau des PET Polymers erfolgte nach einem

Endomechanismus, wobei auch kürzere Oligomere hydrolysiert wurden.

Die Evaluierung der im Projekt hergestellten Enzyme in einem technischen

Verfahren zur Generierung geeigneter Oberflächen für die Herstellung

innovativer funktionalisierter PET Textilien zeigte, dass die entwickelten

Polyesterasen TfCut2 und evo142 in der Lage waren, in einem Ersatz des

chemischen Verfahrens die Oberfläche von PET Textilien unter milden

Reaktionsbedingungen zu glätten, um eine nachfolgende Funktionalisierung

durch Aufbringung einer Aluminiumschicht zu ermöglichen. Diese

Technologie wird zur Herstellung von Sonnen- und Blendschutz-Textilien

für einem weltweiten Markt benutzt. In einem weiteren Anwendungsbeispiel

konnte gezeigt werden, dass auch PET Folien durch die Behandlung mit den

entwickelten Polyesterhydrolasen Eigenschaften verliehen werden können,

die eine nachfolgende Funktionalisierung der Oberfläche mittels

Tintenstrahl-Drucktechnologie ermöglicht für Anwendungen z.B. in der

         

 

 

 

Elektronikindustrie. Hierbei konnten nach der Enzymbehandlung durch

Aufbringen von Nanosilberpartikeln elektrisch leitfähige Schichten mit

verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu chemischen Verfahren auf der

Oberfläche der Folien generiert werden.

Die vergleichende Ökoeffizienzanalyse der beiden Prozesse mit einem

chemischen Verfahren ergab eine Einsparung von Energie (50%) und

Wasser (30%) sowie eine verbesserte Reinigungsleistung (10%) und kürzere

Behandlungszeiten (98%) bei Nutzung des biokatalytischen Verfahrens zur

Glätttung von PET Textilien. Bei der Oberflächenbehandlung der PET Filme

zeigte sich ein um 40% gesenkter Energiebedarf im Vergleich zum

chemischen Verfahren. Durch den Einsatz eines weiteren Tensids in einem

zusätzlichen Waschgang wurde die Leistung des biokatalytischen

Verfahrens verbessert, jedoch die Umweltwirkung verschlechtert. Es wurden

jedoch deutliche Optimierungspotentiale durch die Reduktion des Wasser-

und Tensidverbrauchs bei einer Weiterentwicklung des Prozesses in einem

größeren Maßstab festgestellt. Obschon hauptsächlich aufgrund der hohen

Enzymkosten im Projekt die untersuchten biokatalytischen Verfahren als

weniger ökoeffizient als die konventionellen chemisch/thermischen Prozesse

anzusehen waren, zeigten die Szenario-Analysen, daß die enzymatischen

Verfahren die ökoeffizientere Variante darstellen, wenn die Kosten für die

Enzymherstellung und die benötigten Enzymmengen für die

Oberflächenbehandlungen bei Einsatz in einem industriellen Maßstab

reduziert werden können.

Das Projekt profitierte von der erfolgreichen Zusammenarbeit der

Projektpartner, die sich in ihren Expertisen zur Enzymtechnologie, Protein-

Engineering, Scale-up und Textiltechnologie/Functional Smart Materials

ergänzen konnten. Ein Teil der Ergebnisse wurde bereits in Fachzeitschriften

veröffentlicht, weitere Publikationen sind in Vorbereitung.

         

 

 

 

Anlass und Zielsetzung des Projekts

Mehr als die Hälfte der weltweit produzierten Textilfasern sind synthetische

Fasern, wobei Chemiefasern aus PET am häufigsten für die Textilherstellung

eingesetzt werden. Aufgrund der günstigen Herstellungskosten und

vielfältigen Einsatzmöglichkeiten besitzen PET Fasern einen wichtigen

Marktanteil bei Textilfasern. Um synthetischen Textilien die gewünschten

Funktionen zu verleihen, kommen bei der Textilausrüstung verschiedene

Veredlungsverfahren zum Einsatz z.B. die Modifizierung der Oberfläche

zum Färben und Bedrucken der Textilien. Die hierfür derzeit gebräuchlichen

chemisch-thermischen Verfahren bedingen jedoch einen hohen Wasser-,

Energie- und Chemikalienverbrauch und führen damit zu erheblichen

Umweltbelastungen. Darüber hinaus verursachen die aggressiven

Behandlungsbedingungen beträchtliche Einbussen an der Faserqualität. Ein

substantieller Durchbruch bei der Entwicklung neuer umweltschonender

Textilveredlungsverfahren ist von chemischen Prozessen nicht zu erwarten.

Die industrielle Biotechnologie bietet durch die Einführung innovativer

Produktionsprozesse unter Einsatz von Biokatalysatoren das Potential, neue

und wirtschaftlich interessante Textilprodukte mit umweltfreundlichen

Verfahren herzustellen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass PET

Materialien mit hydrolytischen Enzymen (Polyesterhydrolasen) modifiziert

werden können. Hierdurch konnten die Oberflächeneigenschaften verbessert

und störende Oberflächenoligomere entfernt werden. Für die weitere

Entwicklung eines industriell einsetzbaren biokatalytischen

Oberflächenbehandlungsprozesses werden jedoch effizientere und stabile

PET Hydrolasen in ausreichenden Mengen benötigt. Weiterhin muss der

biokatalytische Prozess besser verstanden werden, um ihn kontrollierbar in

einem industriellen Behandlungsverfahren einsetzen zu können.

         

 

 

 

Der Gegenstand des Projekts war daher die Entwicklung neuer und

hochaktiver Biokatalysatoren für einen innovativen

Oberflächenbehandlungsprozess von Polyester-Fasern und -Folien. Die

bereits durch Vorarbeiten verfügbare Polyesterydrolase TfCut2 sollte hierbei

für einen industriellen Einsatz bei der Funktionalisierung von PET

Materialien weiterentwickelt und neue Varianten identifiziert werden.

Hierdurch sollten herkömmliche chemische Veredlungsprozesse, die sich

durch hohen Chemikalienbedarf und Abwasserbelastung auszeichnen, durch

ein umweltfreundliches, energiesparendes und faserschonendes

biokatalytisches Verfahren ersetzt werden. Die Eigenschaften der

oberflächenmodifizierten PET Materialien sollten anschliessend für eine

Verarbeitung mittels eines Metallisierungsverfahren und innovativer

Tintenstrahl-Drucktechnologie evaluiert werden mit dem Ziel der

Entwicklung funktionaler Materialien mit umweltverträglichen Methoden.

Das Projekt beinhaltete in einem Verbund interdisziplinärer Partner aus

Universität, angewandter Forschung und KMU die Entwicklung und

Charakterisierung von PET Hydrolasen, der Enzymproduktion und ihre

Maßstabsvergrößerung bis zur Evaluierung einer Anwendung des

Bioprozesses zur Herstellung von innovativen Materialien mit den folgenden

Zielen: a) Bereitstellung einer Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung von

Polyesterydrolaseaktivitäten und die Entwicklung eines

Hochleistungsexpressionssystems (Arbeitspaket 1, Universität

Leipzig/evocatal GmbH); b) Entwicklung der Polyesterhydrolase TfCut2

mittels rationalem Proteindesign zur Gewinnung von Enzymen mit

geeigneter Stabilität und hoher Wirksamkeit für einen industriellen Einsatz

(Arbeitspaket 2, Universität Leipzig); c) Scale-up der Herstellung des

rekombinanten Enzyms und der Produktionsbedingungen für einen

industriellen Maßstab (Arbeitspaket 3, evocatal GmbH); d) Charakterisierung

der enzymatischen Hydrolyse verschiedener PET Materialien und ihrer

         

 

 

 

Oberflächeneigenschaften nach enzymatischer Modifizierung (Arbeitspaket

4, Universität Leipzig/Saxion University); e) Evaluierung der Enzyme in

zwei technischen Verfahren zur Generierung geeigneter Oberflächen für die

Herstellung innovativer funktionalisierter PET Materialien (Arbeitspaket 5,

Saxion University) und f) Bewertung der ökologischen und ökonomischen

Folgewirkungen der beiden Anwendungen zum Glätten von PET

Textilfasern und zur Oberflächenmodifikation von PET Filmen mittels einer

vergleichenden Ökoeffizienzanalyse (Arbeitspaket 6, ifu Hamburg GmbH).

Ergebnisse und Diskussion

Siehe Einzelberichte der Projektpartner

Öffentlichkeitsarbeit

Die Ergebnisse des Projekts wurden zum Teil bereits in Fachzeitschriften

und bei Tagungen veröffentlicht, weitere Publikationen und eine

Präsentation zum Einsatz vom Biokatalysatoren beim Recycling von Plastik

bei der Woche der Umwelt 2016 in Berlin ist in Vorbereitung.

Wei R, Oeser T, Barth M, Weigl N, Lübs A, Schulz-Siegmund M, Hacker M,

Zimmermann W. 2014. Turbidimetric analysis of the enzymatic

hydrolysis of polyethylene terephthalate nanoparticles Journal of

Molecular Catalysis B: Enzymatic 103:72-78.

Wei R, Oeser T, Then J, Kühn N, Barth M, Zimmermann W. 2014.

Functional characterization and structural modeling of synthetic

polyester-degrading hydrolases from Thermomonospora curvata. AMB

Express 4:44.

         

 

 

 

Wei R, Oeser T, Schmidt J, Meier R, Barth M, Then J, Zimmermann W.

2015. Tailoring the substrate binding pocket of a bacterial polyester

hydrolase for enhanced polyethylene terephthalate degradation,

manuscript in preparation.

Agrawal P, Brinks G, Wei R, Leggewie C, Zimmermann W. 2015.

Biocatalytic modification of PET films for inkjet printing with nano silver

particles to impart conductivity, manuscript in preparation.

Fazit Die Leistungsfähigkeit der zur biokatalytischen Modifikation von

Polyesteroberflächen bearbeiteten Polyesterasen konnte durch Modellierung

und rationalem Proteindesign deutlich gesteigert werden. Die Entwicklung

eines Bacillus-Expressionssystems erlaubte eine signifikante Steigerung der

Proteinausbeute in Hochzelldichtefermentationen zur Bereitstellung

ausreichender Biokatalysatormengen für die Anwendungsversuche. Die

Erprobung der im Projekt entwickelten und charakterisierten

Biokatalysatoren zeigte dabei ihre Einsatzmöglichkeit bei der Modifizierung

der Oberflächen von PET Textilfasern und PET Folien zur Herstellung neuer

funktionaler Materialien. Die vergleichende Ökoeffizienzanalyse der

Anwendungen ergab ein hohes Einsparungspotential an Energie,

Prozesswasser und Behandlungszeiten bei den biokatalytischen Verfahrenen.

Die enzymatischen Verfahren stellen auch die ökoeffizientere Variante dar,

wenn die Kosten für die Enzymherstellung und die im Prozess benötigten

Enzymmengen bei Einsatz in einem industriellen Maßstab reduziert werden

können.

     

 

  1  

Universität Leipzig

Schlussbericht

„Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaser-Oberflächen zur

Herstellung innovativer Textilien“

Arbeitspaket 1 – Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Bestimmung von

PET-Hydrolaseaktivitäten

1.1 Turbidimetrischer Enzymtest mit Polyester Nanopartikeln

Es wurde eine Methode erarbeitet, um den Abbau der Polyester Polycaprolacton (PCL)

oder Polyethylenterephthalat (PET) durch die Messung der Änderung der Transmission

bzw. der Streuung des Lichts in einer Nanopartikelsuspension bei einer enzymatischen

Hydrolyse quantitativ zu bestimmen und anhand eines heterogenen kinetischen Modells zu

charakterisieren. Die Ergebnisse konnten bereits publiziert werden (Wei et al. 2014a). Die

enzymatische Hydrolyse der Polyester wurde in einer Küvette bestimmt, die Polyester

Nanopartikel immobilisiert in einem Agarosegel enthielten. Der Abbau der Partikel wurde

turbidimetrisch verfolgt. Die Trübungsabnahme der Polyester Nanopartikelsuspension bei

der enzymatischen Hydrolyse kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden:

(1)

wobei τ die Trübung bei 600 nm ist, τ0 die Trübung beim Zeitpunkt t0, t die Reaktionszeit,

kτ die relative Hydrolyseratekonstante, KA die Adsorptionsgleichgewichtskonstante und [E]

die Enzymkonzentration Auf der Basis eines Langmuir-Adsorptionsmodells wurde die Rate

der Quadratwurzel der relativen Trübungsabnahme bei 600 nm (auf der linke Seite der

( ) [ ][ ]EKEKk

t A

Aτ

+=−1d

d 0ττ

     

 

  2  

Gleichung) mit den kinetischen Konstanten der Reaktion (auf der rechten Seite der

Gleichung) korreliert.

Abb. 1 Enzymatische Hydrolyse von PET Nanopartikel aus (A) recycelten PET Granulat mit hoher Kristallinität, (B) PET Folien mit geringer Kristallinität und (C) PET Fasern mit mittlerer Kristallinität. Der Zeitverlauf der Trübungsabnahme bei 600 nm einer PET Nanopartikelsuspension bei 60°C und pH 8,5 katalysiert von TfCut2 ist links dargestellt mit Enzymkonzentrationen von 0-50 µg/mL: 50 µg/mL (-◇-), 30 µg/mL (�□�), 20 µg/mL(-△-), 10 µg/mL (-×), 5 µg/mL (-*-), 3 µg/mL (-○-) und 0 µg/mL (-). Die kinetische Analyse nach Gleichung (1) ist rechts dargestellt und zeigt die experimentalen Daten (□) und die Ausgleichkurven.

Nanopartikel wurden aus PET Proben unterschiedlichen Kristallisationsgrades mit einer

Präzipitationsmethode hergestellt. Die Bestimmung mittels dynamischer Lichtstreuung

     

 

  3  

ergab einen durchschnittlichen Durchmesser der Partikel zwischen 100 und 160 nm.

Aufgrund ihrer großen Oberfläche wurden die PET Nanopartikel wesentlich leichter

enzymatisch abgebaut als PET Folien oder Fasern. Damit eignen sie sich gut als Polyester

Modellsubstrat für die untersuchten PET Hydrolasen. Der enzymatische Abbau der

Nanopartikeln wurde als ein Erosionsprozess auf der Oberfläche des Polyesters interpretiert

und mathematisch mit der Trübungsabnahme einer Nanopartikelsuspension bei 600 nm

korreliert (Abb. 1). Mit Gleichung (1) konnten die kinetischen Parameter des heterogenen

Katalyseprozesses berechnet werden. Ein Vergleich der kinetischen Konstanten der

enzymatischen Hydrolyse von Nanopartikeln aus PET Materialien mit verschiedenem

Kristallisationsgrad zeigte, dass die enzymatische Abbaubarkeit vom Anteil an amorphen

Polyester abhängt, der zugänglich für einen enzymatischen Abbau ist. Die Effizienz der

enzymatischen Hydrolyse kann hierbei durch den Adsorptionskoeffizienten determiniert

werden, der die Affinität des Enzyms zur Substratoberfläche beschreibt.

Die enzymatische Hydrolyse der schneller als PET abbaubaren PCL Nanopartikel konnte

auch ohne deren Immobilisierung in Agarose durchgeführt werden. Damit konnte der

turbidimetrische Enzymtest auf ein 96-Well Plattenformat übertragen werden und ist für ein

Hochdurchsatz-Screening geeignet.

1.2 Fluoreszenzspektroskopischer Enzymtest

Ein Fluoreszenzspektroskopischer Test zum Nachweis enzymatisch freigesetztem

Terephthalat (TPA) aus PET wurde zum Einsatz im 96-Well Format weiterentwickelt und

erlaubt ebenfalls den direkten Nachweis der Aktivität der untersuchten PET Hydrolasen

(Wei et al. 2012). Dabei wird TPA in Gegenwart von freien Hydroxylradikalen in das

fluoreszierende 2-Hydroxylterephthalat (HOTP) überführt. Während der initialen

Reaktionsphase der enzymatischen Hydrolyse wurde eine annähernd lineare Zunahme des

aus PET freigesetzten TPA in den Reaktionsüberständen beobachtet (Abb. 2B).

     

 

  4  

Abb. 2 (A) Kalibrierungskurve von HOTP mit TPA Konzentrationen zwischen 0,01 und 0,075 mM in 0,1 M Phosphatpuffer (schwarze Quadrate) und in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (graue Diamanten). (B) Die TPA Konzentration im Überstand von Reaktionsansätzen einer TfCut2-katalysierten Hydrolyse von PET Folien wurde fluoreszenzspektrometrisch (schwarz Quadrate) und mit HPLC (grau ausgefüllte Kreise) bestimmt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung aus zwei unabhängigen Bestimmungen dar.

Die gefundenen Werte korrelierten gut mit den parallel dazu mittels HPLC gemessenen

TPA Konzentrationen (R2=0,99; Abb. 2A). Die Erzeugung freier Hydroxylradikale erfolgte

durch eine Eisen-Autoxidation mit Fe2+ und EDTA. Dieses Verfahren kann mit kleinen

     

 

  5  

Probenmengen in kurzer Arbeitszeit (10 min Inkubationszeit gegenüber dem

zeitaufwändigen HPLC Verfahren) durchgeführt werden und ist nicht störanfällig

gegenüber Restprotein in der Lösung. Die Methode zeigte sich als ebenfalls geeignet für

ein Hochdurchsatz-Screening von PET Hydrolasen in einem Fluoreszenz-

Mikroplattenlesegerät.

Fazit

Zwei Hochdurchsatz-Screeningmethoden zur Bestimmung von PET Hydrolaseaktivitäten

wurden bereitgestellt. Der Meilenstein 1 wurde damit erreicht.

Arbeitspaket 2 – Entwicklung der Polyesterhydrolase TfCut2 mittels evolutiver

Methoden und rationalem Proteindesign zur Gewinnung von Varianten mit erhöhter

Stabilität und hydrolytischer Aktivität

Ortsgerichtete Mutagenese an der Substratbindetasche von TfCut2

Neben der Kristallstruktur von TfCut2 wurde kürzlich die Struktur einer weiteren

hochhomologen Polyesterhydrolase (LC-Cutinase) publiziert, die aus einem Kompost-

Metagenom gewonnen worden war (Sulaiman et al. 2012, 2014, PDB ID: 4EB0). Mit

diesem Enzym konnten höhere Hydrolyseraten von PET als mit TfCut2 bei 70°C erzielt

worden. Auf der Grundlage der beiden Kristallstrukturen wurden Dockingexperimente an

der Bindetasche der Enzyme mit einem PET Modellsubstrat (2PET) durchgeführt.

Aminosäurereste, die an der Substratbindung beteiligt sind, wurden durch Ausrichten der

Proteinstrukturen von LCC und TfCut2 mit angedocktem 2PET identifiziert (Abb. 3). Ein

Vergleich der Sequenzen von TfCut2 und LCC offenbarte eine Reihe von unterschiedlichen

Aminosäureresten in der Substratbindetasche. G62, T63, I178 und I213 von TfCut2 wurden

mit den entsprechenden Aminosäuren in LCC ausgetauscht. Aufgrund der deutlich

erhöhten hydrolytischen Aktivität von G62A im Vergleich zum Wildtypenzym wurden

Doppel- und Dreifach-Mutanten auf der Basis diese Variante konstruiert (Abb. 4).

     

 

  6  

Abb. 3. Vergleich der Struktur der Polyesterhydrolase TfCut2 (PDB ID: 4CG1, grau, blaue und rote Linien) im Komplex mit angedocktem Modellsubstrat 2PET (blau/rot) und der Struktur der LCC (PDB ID: 4EB0, weiß, orange Linien). Die Aminosäurereste der Substratbindetasche sind als Linien dargestellt. Ausgewählte Mutationsstellen sind als Stäbchen gezeigt.

Da kürzlich gezeigt werden konnte, dass Ca2+-Ionen die Stabilität von Polyesthydrolasen

erhöhen (Sulaiman et al. 2014; Then et al. 2015), wurde die Hydrolyse bei 65°C in

Gegenwart von 10 mM Ca2+ durchgeführt. Dadurch war es möglich, einen Abbau der PET

Folien über 50 h bei 65°C zu verfolgen. Abb.4 zeigt die Gewichtsverluste von amorphen

PET Folien nach 50 h enzymatischen Abbau bei 65°C mit TfCut2 und Varianten. Unter den

Einzelmutanten zeigte G62A die beste Abbauleistung mit einen Gewichtsverlust der PET

Folien von 42,6%. Die entspricht einer 2,7-fachen Steigerung im Vergleich zum

Wildtypenzym TfCut2. Im Gegensatz dazu zeigten die anderen Einzelmutanten nur

moderate Gewichtsverluste zwischen 15% und 16%. Mehrfachmutanten, die als

Kombination der Einzelmutationen auf der Grundlage von G62A erzeugt wurden, ergaben

keine signifikant bessere oder geringere Abbauleistungen als G62A. Dabei zeigte die

Doppelmutante G62A/I213S den höchsten Gewichtsverlust der PET-Folie mit 42,9%,

gefolgt von der Doppelmutante G62A/I178V und Dreifach-Mutante G62A/I178V/I213S,

     

 

  7  

die jeweils einen Gewichtsverlust von 42,3% und 41,7% verursachten. Obwohl die

Variante T63D eine höhere Hydrolyserate als das Wildtypenzym zeigte, führte diese

Mutation bei den G62A-basierten Varianten zu einer Verringerung der Abbauleistung.

Abb. 4. Gewichtsverluste von amorphem PET Folien (3×0,5 cm2, ca. 45 mg) nach einer Reaktionszeit von 50 h bei 65°C mit TfCut2 und Varianten. Gewichtsverluste sind in mg (linke Achse) und in Prozent (rechte Achse) angegeben. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Die Thermostabilität von TfCut2 und dessen Varianten unter den Reaktionsbedingungen

der PET Abbauversuche wurde mit einem turbidimetrischen Assay mit Polycaprolacton

Nanopartikel als Polyestermodellsubstrat untersucht (Wei et al. 2014b). Wie in Abb. 5A

dargestellt, zeigten alle Enzymvarianten einen Aktivitätsverlust von mehr als 50% nach

einer Reaktionszeit von 50 h bei 65°C in Gegenwart von 10 mM Ca2+. Die höchste

Thermostabilität zeigte die Variante I213S mit einer Restaktivität von 47,6 ± 9,1%. Die

Restaktivitäten der anderen Enzymvarianten und des Wildtypenzyms waren im Bereich

zwischen 32,3% und 41,5%. Ohne Ca2+ Ionen verloren alle Varianten mehr als 50% ihrer

Aktivität innerhalb von 1 h Reaktionszeit bei 65°C. Unter dieser Bedingung zeigte jedoch

I213S eine signifikant höhere Stabilität im Vergleich zum Wildtypenzym TfCut2 (Abb.

5B).

     

 

  8  

Abb. 5 (A) Restaktivität von TfCut2 und Varianten nach einer Reaktionszeit von 50 h bei 65°C in Gegenwart von 10 mM Ca2+. (B) Restaktivität von TfCut2 und I213S nach einer Reaktionszeit von 1 h bei verschiedenen Temperaturen ohne Ca2+. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Die weiteren Untersuchungen konzentrierten sich auf die vielversprechende Enzymvariante

G62A. Die enzymatische Hydrolyse von PET Folien mit TfCut2 und G62A wurde unter

Verwendung eines kinetischen Modells für heterogene Katalyseprozesse analysiert (Herzog

et al. 2006; Ronkvist et al. 2009; Scandola et al. 1998; Wei et al. 2014a). Die

Anfangsreaktionsgeschwindigkeit V0 wurde als die Summe aller Abbauprodukte einer

enzymatischen Hydrolyse bei 60°C ohne den Zusatz von Ca2+ Ionen definiert, um einen

Einfluss der Metallionen auf die kinetischen Eigenschaften auszuschließen. Die kinetischen

Parameter sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. G62A zeigte eine 4-fach höhere

Hydrolysegeschwindigkeitskonstante (kh) und eine 1,5-fach niedrigere Substrat

Adsorptionsgleichgewichtskonstante (KA) als das Wildtypenzym. Die Kinetik der

Produkthemmung wurde nach einem kinetischen Modell von Barth et al. (2015a) ermittelt.

Für das Hydrolyseprodukt MHET wurde mit G62A eine 5,5-fach niedrigere

Bindungskonstante im Vergleich zum Wildtypenzym erhalten (Tabelle 1).

     

 

  9  

Tabelle 1 Kinetische Parameter der Hydrolyse von PET Folien durch TfCut2 und G62A und deren

Hemmung durch MHET

Hydrolysekinetik Hemmungskinetik

kh (µmol/h/cm2) KA (ml/µg) βMHET (l/mmol) Reference

WT TfCut2 0.094±0.009 0.338±0.029 0.738 ± 0.014 (Barth et al.

2015b)

G62A 0.370±0.011 0.224±0.021 0.134 ± 0.003

(Wei et al. 2015,

Manuskript in

Vorbereitung)

Die Veränderung der freien Energie der Aminosäurereste der Substratbindetasche wurden mittels

ROSETTA (Alexander et al., 2014) berechnet, um strukturelle Auswirkungen der einzelnen

Mutationen auf den Enzym-Modellsubstratkomplex zu analysieren (Abb. 6). Dies ermöglichte es

auch, die Beiträge jedes Aminosäurerestes an der Gesamt-ΔG0 abzuschätzen. Die höchsten Werte

wurde beim Liganden 2PET selbst gefunden, da er mit mehreren Aminosäuren wechselwirkte. Y60,

W155 und I178 zeigten besonders starke Wechselwirkungen in der Enzymstruktur.

Abb. 6 Vergleich der ΔΔG0 –Werte (ROSETTA Energy Unit, REU) von 2PET und verschiedenen

Aminosäureresten in der Substratbindetasche von TfCut2 (dunkelgrau), G62A (hellgrau).

     

 

  10  

Ein Stickstoffatom an Position G59 von TfCut2 zeigte eine starke Wechselwirkung mit einem

Carbonylsauerstoffatom des Modellsubstrats. Diese Wechselwirkung wurde in der G62A Variante

aufgrund einer sterischen Hinderung durch die Seitenkette von A62 blockiert. Stattdessen konnte

eine schwächere Wechselwirkung zu S66 und partiell zu N212 gebildet werden. Die daraus

resultierende geringere Produkthemmung kann als Ursache für die detektierte erhöhte Aktivität der

Variante G62A vermutet werden.

Fazit

Alle G62A-basierten Mutanten zeigten eine um mehr als 50% erhöhte PET

Hydrolyseaktivität im Vergleich zu TfCut2. Die Variante I213S wies eine um mehr als 20%

erhöhte Thermostabilität im Vergleich zu TfCut2 auf. Die Meilensteine 3 „Erzeugung von

TfCut2 Varianten mittels evolutiver Methoden und rationalem Proteindesign“ und 4

„Bereitstellung von Enzym-Varianten mit 20-50% erhöhter PET Hydrolyseaktivität und

Stabilität“ wurden damit erreicht.

Arbeitspaket 4 – Charakterisierung der PET Hydrolaseaktivität von TfCut2 mit

verschiedenen PET Materialien und Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus

Charakterisierung der PET hydrolytischen Aktivität von TfCut2 und deren Mutanten mit

semikristallinen PET Fasern

Auf der Grundlage der Ergebnisse der Abbauversuche mit amorphen PET Folien wurde

ebenfalls die Hydrolyse von semikristallinen PET Fasern mit TfCut2 und drei der

Varianten durchgeführt (Abb. 7). Aufgrund der hohen Kristallinität und der entsprechenden

niedrigen Bioabbaubarkeit der PET Fasern (Wei et al. 2014a) wurde der Abbau durch eine

Bestimmung der Hydrolyseprodukte in den Reaktionsüberständen verfolgt. Die

Abbauprodukte nach 50 h Reaktion bei 65°C bestanden fast ausschließlich aus

Terephthalsäure (TPA). Monohydroxyethylenterephthalat (MHET) wurde nur mit einem

Anteil von weniger als 5,1% detektiert. Die höchste Menge an freigesetzten

Hydrolyseprodukten wurde mit G62A erhalten, was einer 2,8-fachen Steigerung im

     

 

  11  

Vergleich zum Wildtypenzym entspricht. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit PET Folien

wurde mit den Doppelmutanten G62A/I178V und G62A/I213S deutlich weniger

Abbauprodukte als mit G62A nachgewiesen.

Abb. 7. Enzymatische Abbauprodukte freigesetzt aus PET Fasern nach einer Reaktionszeit von 50 h bei 65°C mit TfCut2 und Varianten. TPA (dunkelgrau) und MHET (hellgrau) wurden mittels HPLC quantifiziert. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus Dreifachbestimmungen.

Charakterisierung der Bioabbaubarkeit von verschiedenen amorphen PET Folien

Zur Untersuchung des Einflusses von Tm (Schmelzpunkt), Tg (Glasübergangstemperatur)

und Tc (kalte Kristallisationstemperatur) auf die Bioabbaubarkeit von amorphen PET Folien

wurden die Folientypen APET-GF-1, APET-GF-2 und APET-GF-3 für 24 h bei

Temperaturen bis zu 72,5 °C hydrolysiert. Als Enzyme wurden 100 µG WT TfCut2 und als

Vergleichsenzym Novozymes NS-29061, eine Cutinase aus Humicola insolens, eingesetzt.

Aufgrund der begrenzten Thermostabilität von TfCut2 nahm der Gewichtsverlust bei

Reaktionstemperaturen von über 65°C ab während er mit NS-29061 bis zu 72,5°C anstieg

(Abb. 8). Die Folien unterschieden sich in ihrer Hydrolysierbarkeit, die bei APET-GF-1

höher war als bei APET-GF-3, welches wiederum leichter abbaubar war als APET-GF-2.

Eine Analyse der PET Folientypen mittels dynamischer Differenzkalorimetrie ergab, dass

diese sich in ihrem Tm, Tg und Tc unterschieden, wobei die Folie mit der höchsten Tc auch

am leichtesten enzymatisch abbaubar war.

     

 

  12  

Abb. 8. Gewichtverluste der PET Folientypen APET-GF-1, APET-GF-2 und APET-GF-3 nach einem enzymatischen Abbau über 24 h mit TfCut2 (links) bzw. NS-29061 (rechts) bei Temperaturen zwischen 55°C und 72,5°C. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus Doppelbestimmungen.

Bei einem mengenmäßigen Vergleich der Hydrolyseprodukte der drei Folientypen, die

nach Reaktion mit TfCut2 und der Variante G62A erhalten wurden, bestätigte sich

ebenfalls die hohe Abbaubarkeit der Folie APET-GF1, vor allem mit G62A (Abb. 9).

Abb. 9. Enzymatische Abbauprodukte freigesetzt aus den PET Folientypen APET-GF-1, APET-GF-2 und APET-GF-3 nach einer Reaktionszeit von 24 h bei 60°C mit TfCut2 und G62A.

     

 

  13  

Reaktionsmechanismus der enzymatischen PET Hydrolyse

Zur Aufklärung des enzymatischen Reaktionsmechanismus wurde die Größenverteilung

von PET Oligomeren (Φ Mw~3,5 kDa) mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie

analysiert. Abb. 10 zeigt das Massenspektrum der PET Oligomere vor und nach der

Reaktion mit TfCut2 über 15 h bei 60°C. Während das Ausgangsmaterials einen mittleren

m/z Wert von 3003 aufwies, zeigten die mit TfCut2 hydrolysierten PET Oligomere eine

Verschiebung zu kleineren Molekularmassen mit einem mittleren m/z Wert von 2300. Ein

erhöhter Anteil im Molekularmassenbereich von m/z 1000-2000 sowie das Verschwinden

von Peaks mit einem m/z Wert größer als m/z 5000 wiesen darauf hin, daß größere PET

Oligomere durch TfCut2 mittels eines Endomechanismus in kleinere Moleküle zerlegt

wurden. Dies deutet darauf hin, dass durch TfCut2 bevorzugt Esterbindungen in der Mitte

der Polymerketten hydrolysiert werden. Die Abnahme der Peaks im

Molekularmassenbereich mit einem m/z Wert von weniger als 1000 deutet darauf hin, daß

auch die kurzkettigen PET Oligomere durch TfCut2 hydrolysiert wurden.

Abb. 10. MALDI-TOF Massenspektren von PET Oligomeren vor (links) und nach (rechts) einer Hydrolyse über 15 h bei 60°C mit TfCut2. Regressionsdaten basierend auf einer Gausschen Verteilung mit dem m/z Mittelwert sind als gestrichelte Kurven dargestellt. Die vertikal grau gestrichelte Linie zeigt den durchschnittlichen m/z Wert von 3003 des Ausgangsmaterials.

     

 

  14  

Fazit

Die Charakterisierung der hydrolytischen Aktivität von TfCut2 und deren Mutanten

erfolgte mit kristallinen PET Fasern und amorphen PET Filmen. PET Fasern waren

schwieriger enzymatisch zu hydrolysieren als PET Folien, deren Abbaubarkeit von der

kalten Kristallisationstemperatur der Folien abhing. Der Abbau von PET Polymerketten

durch TfCut2 erfolgte nach einem Endomechanismus wobei auch kürzere Oligomere

hydrolysiert werden. Der Meilenstein 7 wurde damit erreicht.

Literaturzitate Alexander NS, Preininger AM, Kaya AI, Stein RA, Hamm HE, Meiler J. 2014. Energetic analysis

of the rhodopsin-G-protein complex links the alpha 5 helix to GDP release. Nature Structural & Molecular Biology 21(1):56-63.

Barth M, Oeser T, Wei R, Then J, Schmidt J, Zimmermann W. 2015a. Effect of hydrolysis products on the enzymatic degradation of polyethylene terephthalate nanoparticles by a polyester hydrolase from Thermobifida fusca. Biochemical Engineering Journal 93:222-228.

Barth M, Wei R, Oeser T, Then J, Schmidt J, Wohlgemuth F, Zimmermann W. 2015b. Enzymatic Hydrolysis of polyethylene terephthalate films in an ultrafiltration membrane reactor. Journal of Membrane Science.

Herzog K, Müller RJ, Deckwer WD. 2006. Mechanism and kinetics of the enzymatic hydrolysis of polyester nanoparticles by lipases. Polymer Degradation and Stability 91(10):2486-2498.

Ronkvist ÃsM, Xie W, Lu W, Gross RA. 2009. Cutinase-catalyzed hydrolysis of poly(ethylene terephthalate). Macromolecules 42(14):5128-5138.

Scandola M, Focarete ML, Frisoni G. 1998. Simple Kinetic Model for the Heterogeneous Enzymatic Hydrolysis of Natural Poly(3-hydroxybutyrate). Macromolecules 31(12):3846-3851.

Sulaiman S, Yamato S, Kanaya E, Kim JJ, Koga Y, Takano K, Kanaya S. 2012. Isolation of a novel cutinase homolog with polyethylene terephthalate-degrading activity from leaf-branch compost by using a metagenomic approach. Appl Environ Microbiol 78(5):1556-1562.

Sulaiman S, You DJ, Kanaya E, Koga Y, Kanaya S. 2014. Crystal structure and thermodynamic and kinetic stability of metagenome-derived LC-cutinase. Biochemistry 53(11):1858-69.

Then J, Wei R, Oeser T, Barth M, Belisário-Ferrari MR, Schmidt J, Zimmermann W. 2015. Ca2+ and Mg2+ binding site engineering increases the degradation of polyethylene terephthalate films by polyester hydrolases from Thermobifida fusca. Biotechnology Journal 10(4):592-598.

Wei R, Oeser T, Billig S, Zimmermann W. 2012. A high-throughput assay for enzymatic polyester hydrolysis activity by fluorimetric detection. Biotechnol J 7:1517-1521.

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Wei R, Oeser T, Then J, Kühn N, Barth M, Zimmermann W. 2014b. Functional characterization and structural modeling of synthetic polyester-degrading hydrolases from Thermomonospora curvata. AMB Express 4:44.

1

evocatal: DBU-Gesamtbericht „Biokatalytische Modifikation von

Polyesterfaser-oberflächen zur Herstellung innovativer Textilien“

AZ: 13267

Im Rahmen des DBU-Projekts „Biokatalytische Modifikation von

Polyesterfaseroberflächen zur Herstellung innovativer Textilien“ entwickelte evocatal

sowohl ein Expressionssystem auf der Basis des Gram-positiven Bakteriums

B. subtilis zur rekombinanten Produktion der Cutinase TfCut2 aus Thermobifida

fusca als auch neue Enzyme zum Abbau cyclischer Trimere.

Zur Entwicklung der Expressionssystems wurde zunächst untersucht, ob das Enzym

TfCut2 in B. subtilis heterolog exprimiert und in das Kulturmedium sekretiert werden

kann. Hierzu wurde die Cutinase N-terminal mit einer Auswahl an 15 Signalpeptiden

(spA bis spQ) fusioniert, welche sowohl aus B. subtilis als auch aus den Bacillus-

Arten B. licheniformis und B. amyloliquefaciens stammen und bereits erfolgreich zur

Sekretion von Zielproteinen in B. subtilis führten. Für dieses Signalpeptid-Screening

wurde das Cutinase-Gen in 2 verschiedene evocatal Expressionsvektoren kloniert,

welche sich durch die Promotoren unterscheiden

Nach Verifizierung der Bacillus Transformanten wurden 28 Stämme mit

unterschiedlichen Promotoren für Expressionsstudien in einem Labormaßstab von 50

ml kultiviert und die Kulturüberstände mittels SDS-PAGE und Messung der

lipolytischen Aktivität analysiert. Dabei konnte bereits im Kulturüberstand dieser

Anzucht eine deutliche Zielproteinbande im SDS-PA-Gel nachgewiesen und eine

starke Aktivität mit dem Substrat para-Nitrophenyloctanoat (bis zu 2,55 U/ml)

nachgewiesen werden.

Da sowohl die beste Volumenaktivität als auch die am stärksten sichtbare

Zielproteinbande im SDS-PA-Gel in Verbindung mit dem Signalpeptid L zu

beobachten war, wurde mit diesem Konstrukt weitergearbeitet.

Ein Ansatz die Proteinausbeute zu steigern, stellt eine gerichtete

Stammmodifizierung dar, durch welche eine Verbesserung der Expressionseffizienz,

Sekretion und Umgang des Produktionsstamms in Hochzelldichtefermentationen

erzielt werden sollte. Dazu wurde im Rahmen eines anderen Projekts zum einen ein

Gen (spo-Gen) deletiert, welches essentiell für die Sporulation von B. subtilis ist.

Zum anderen wurde das Gen (hpr-Gen) eines negativen Regulatorproteins mutiert,

2

welches die Expressionsrate des Zielgens durch Bindung an den verwendeten

Phasen-induzierten Promotor während des exponentiellen Zellwachstums reguliert.

Weiterhin lag eine markerfreie Doppelmutante vor, welche Modifizierungen in spo

und hpr aufweist. Es stellte sich jedoch heraus, dass die mutierten Stämme keine

bessere Zielproteinausbeute lieferten. Dies wurde sowohl mit einer SDS-PAGE als

auch über die Volumenaktivität gegenüber para-Nitrophenyloctanoat gezeigt.

Um zu überprüfen, ob sich die Ergebnisse auch auf einen größeren

Volumenmaßstab (7,5L Fermenter, Arbeitsvolumen verringert auf 2,8L) übertragen

lassen, wurde die Sporulationsmutante mit dem ausgewählten spL-TfCut2-

Expressionsvektor in einer Hochzelldichtefermentation für 48 h kultiviert und die

Kulturüberstände durch SDS-PAGE (siehe Abb. 1) und Aktivitätsmessungen (pNPC-

Test) untersucht. Die extrazelluläre Proteinkonzentration an TfCut2 lag demnach

nach 48 h Fermentation bei ca. 0,6 g/L und die lipolytische Aktivität bei 162 U/ml.

Nach der Fermentation wurden 2 L Kulturüberstand von der Zellmasse getrennt und

wurden auch den Partnern für weitere Analysen zur Verfügung gestellt.

Des Weiteren wurden Expressionsstudien mit 2 unabhängigen Klonen der

Doppelmutante durchgeführt. Dazu wurden diese ebenfalls mit dem ausgewählten

Expressionskonstrukt transformiert und im 50 ml Labormaßstab kultiviert. Die

Kulturüberstände wurden anschließend mittels SDS-PAGE (siehe Abb. 2) und

Aktivitätsmessungen (siehe Abb. 3) analysiert. Durch die SDS-Gelanalyse konnte in

Abb. 1: SDS-Gelanalyse von Fermentationsproben zur Detektion von TfCut2. Fermentiert wurde die sporulationsdefiziente Mutante mit dem spL-TfCut2-Expressionsvektor. Die Probenbezeichnung 8h, 24h, 30h und 48h gibt die Kultivierungsdauer der untersuchten Probe an. M: Protein Marker, Broad (New England Biolabs). Zur Abschätzung von Proteinmengen wurde zusätzlich ein BSA-Standard aufgetragen. In der 8h-Spur wurde präzipitiertes Gesamtprotein aus 100 µl Kulturüberstand aufgetragen. In den anderen Probespuren wurde jeweils Gesamtprotein aus 5 µl Kulturüberstand eingesetzt.

3

den Kulturüberständen der Doppelmutanten eine deutliche Überexpressionsbande

von TfCut2 (28 kDa) detektiert werden. Die Intensität der jeweiligen Bande war dabei

etwas stärker als die in der Spur des Ausgangsstamms, obwohl das Zellwachstum

des Ausgangsstamms höher war (Vergleich OD600 nm-Werte, Abb. 2).

Die Messung der lipolytischen Aktivität (siehe Abb. 3) zeigte ebenfalls bei der

Doppelmutante gute Umsätze der extrazellulären Cutinase.

Abb. 3: Lipolytische Aktivität in Kulturüberständen von B. subtilis Doppelmutanten. Die lipolytische Aktivität der Kulturüberstände wurde nach 24 h Kultivierung der Zellen photometrisch bei einer Wellenlänge von 410 nm durch die Hydrolyse von p-Nitrophenyloctanoat gemessen. Jede Messung wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt. Als Kontrolle wurde der Kulturüberstand von B. subtilis mit Leervektor analysiert.

Abb. 2: SDS-Gelanalyse zur Detektion von TfCut2 in Kulturüberständen von B. subtilis Doppelmutanten. Proben: 70 µl präzipitierter Kulturüberstand nach 24 h Kultivierungsdauer der angegebenen B. subtilis Transformanten mit dem spL-TfCut2-Expressionskonstrukt. Als Kontrolle wurde der Kulturüberstand von B. subtilis mit Leervektor analysiert. Zur Abschätzung von Proteinmengen wurde zusätzlich ein BSA-Standard aufgetragen. M: 7 µl Protein Marker, Broad (New England Biolabs). Die molekulare Masse von TfCut2 beträgt 28 kDa.

4

Des Weiteren haben wir uns im Rahmen dieses Projektes mit dem Abbau von

cylischen PET-Trimeren durch eine Reihe weiterer Enzyme beschäftigt. Solche

Trimere treten insbesondere in der weiteren Behandlung von PET-Textilien auf und

sind eine weitere Grund für „raue“ Oberflächen, die sich beispielsweise sehr schlecht

bedrucken lassen. Eine Entfernung dieser stark an der Faser haftenden Trimere

würde Folgeanwendungen, wie das Bedrucken erst ermöglichen.

Hierzu wurden zunächst drei weitere Enzyme ausgewählt. Das erste dieser Enzyme

ist die bereits aus der Literatur bekannte Thermobifida fusca cutinase (TfCa), mit der

bereits ein Umsatz von cyclischen PET Trimeren gezeigt werden konnte. Das

nächste Enzym ist eine von uns im Rahmen des FuPol-Prokejtes für Waschmittel-

anwendungen entwickelte PET-Esterase, 142, die bereits sehr starke Aktivitäten

gegenüber polymerem PET zeigt. Und das letzte getestete Enzym ist eine neu

entwickelte Cutinase (abCut) aus einem pilzlichen Organismus, welche zu PET-

Esterasen homologe Bereiche aufweist und daher ein guter Kandidat für die

folgenden Versuche war.

Zunächst haben wir uns mit der Expression der entsprechenden Gene in E. coli

(zytoplasmatisch) beschäftigt und konnten schnell feststellen, dass bis auf die bereits

entwickelte 142 die beiden übrigen Enzyme nicht (im Falle von TfCa) oder nur

unlösliche (im Falle von abCut) synthetisiert wurden (siehe Abb. 4).

Abb. 4: SDS-Gelanalyse zur Synthesekontrolle der drei Zielenzyme. Nach Kultivierung der E. coli Zellen über 24 h und Aufschluss des Zellpellet wurde die lösliche (RE) als auch die unlösliche Pelletfraktion (P) aufgetragen. Das Zielprotein, soweit vorhanden, ist jeweils mit einem Pfeil markiert Die Leervektorkontrolle (LV) zum Abgleich mit den stammeigenen Proteinen ist ebenfalls aufgetragen.

5

Die Identität der Proteinbanden im SDS-Polyacrylamidgel wurde mittels Western Blot

Analyse (StrepII-tag Detektion, Ergebnisse nicht gezeigt) zusätzlich verifiziert. Um

die Synthese der beiden bisher nicht löslich produzierten Enzyme zu verbessern,

wurden diese in Fusion mit dem Maltosebindeprotein synthetisiert (siehe Abb. 5).

Abb. 5: SDS-Gelanalyse zur Synthesekontrolle der Maltosebindeprotein-Fusionsproteine. Nach Kultivierung der E. coli Zellen über 24 h und Aufschluss des Zellpellet wurde die lösliche (RE) als auch die unlösliche Pelletfraktion (P) aufgetragen. Das Zielprotein (65,9 kDa für MBP-rabCut und 97,2 kDa für MBP-rTfCa) ist jeweils mit einem Pfeil markiert. Die Leervektorkontrolle (LV) zum Abgleich mit den stammeigenen Proteinen ist ebenfalls aufgetragen.

In Fusion mit dem Maltosebindeprotein ist sowohl die abCut als auch die TfCa gut in

E. coli zu synthetisieren. Zwar befindet sich noch ein großer Teil der Fusionsproteine

in der Pelletfraktion, der in der löslichen Fraktion enthaltene Anteil reicht jedoch für

weitere Analysen und für eine Anreicherung (s. Anreicherungstabelle, Tabelle 1, Abb.

6) vollkommen aus.

Tabelle 1: Anreicherungstabelle der angereicherten Enzyme. Die spezifischen Aktivitäten beziehen sich auf den Umsatz von para-Nitrophenylactanoat.

MBP-rabCut MBP-rTfCa 142

Rohextrakt c [mg/ml] 8 8,8 11,4

spez. Aktivität [U/mg] 0,18 ± 0,007 2,22 ± 0,166 12,64 ± 0,742

gereinigtes Protein

c [mg/ml] 0,52 0,56 0,82 spez. Aktivität [U/mg] 35,75 ± 1,09 181,31 ± 18,97 649,95 ± 44,99

Anreicherungsfaktor (spez. Aktivität) 298 119 34 Ausbeute [%] (Gesamtaktivität) 148,5 26,0 74,0

6

Abb. 6: SDS-Gelanalyse zum Nachweis der angereicherten Proteine. Das Protein 142 (24 kDa) wurde über seinen strepII-Tag mithilfe einer Streptactinmatrix aufgereinigt, während MBP-rabCut (65,9 kDa) und MBP-rTfCa (97,2 kDa) an einer Amylosematrix über deren MBP-Fusion angereichert wurden. Hier wurde insbesondere bei MBP-rTfCa noch das physiologisch in E. coli vorkommende MBP co-aufgereinigt. Das Enzym 142 liegt teilweise noch als Dimer vor.

Neben der Bestimmung der optimalen Temperatur und des pH-Wertes bezogen auf

die para-Nitrophenyloctanoat-Aktivität wurde eine Reihe von weiteren Substraten

positiv getestet, von denen wir im Folgenden nur die PET-Derivate behandeln

werden. Zunächst wurde die hydrolytische Aktivität gegenüber PET-Polymeren in

Form von PET-Nonopartikeln auf Platten-Assays getestet (siehe Abb. 7).

Abb. 7: PET-Nanopartikel-Platte nach 22,5 h Inkubation mit Rohextrakt aus den Enzym produzierenden Stämmen. Eine deutliche Hydrolyse ist bei dem abCut-Enzym und dem bereits als PET-hydrolysiered bekannten Enzym, der 142, zu beobachten.

Die Hydrolyse von polymerem PET wurde weiterhin mittels HPLC-Analyse der

entstandenen Abbauprodukte (Terephthalsäure, BHET) verifiziert.

7

Der nächste Schritt bestand in der Testung von cyclischen PET-Trimeren, die

zunächst aus einer Probe eines PET-Faser-verarbeitenden Betriebes aufgereinigt

und via HPLC-Analytik analysiert wurden. Hierzu wurde weiterhin eine

Standardgerade mit cyclischen PET-Trimeren erstellt, um deren potentielle Abnahme

nach Hydrolyse quantifizieren zu können (siehe Abb. 8).

y = 4E+07x + 6197,2

R² = 0,99930

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Sig

na

lflä

che

[cp

s]

c(CTR) [mM]

Abb. 8: Standardgerade zur Quantifizierung der cyclischen PET-Trimere.

Bei der Inkubation der cyclischen PET-Trimere mit den drei Enzymen konnte nur bei

der abCut kein Umsatz beobachtet werden, bei den beiden anderen Enzymen, der

TfCa und der 142 konnte ein guter Umsatz des Substrates (siehe Abb. 9) bei

gleichzeitiger Produktzunahme (Abbauprodukte, nicht gezeigt) beobachtet werden.

Abb. 9: Zeitabhängiger Abbau von cyclischen PET-Trimeren durch TfCa und 142. Dabei ist zu

beachten, dass von der TfCa ungefähr die 10-fache Enzymmenge gegenüber der 142 eingesetzt

wurde.

8

Fazit:

Es konnte wie geplant ein Hochleistungsexpressionssystem für die Cutinase TfCut2

auf der Basis eines Bacillus-Sekretionssystems entwickelt werden, welches alle

Vorteile einer extracytoplasmatischen Produktion aufweist. Hierdurch wurde der

Meilenstein 2 fristgerecht erreicht. Unter Nutzung dieses neuen Expressionssystems

wurde eine Hochzelldichtefermentation durchgeführt (fristgerechte Erfüllung

Meilenstein 5). Die Ausbeute von ca. 0,6 g/L ist für eine nicht weiter optimierte

Fermentation sehr hoch und vielversprechend für eine weitere Skalierung im

industriellen Maßstab.

Die zu entwickelnden PET-hydrolysierenden Enzyme sollen in diesem Projekt

genutzt werden, um Textiloberflächen zu glätten. Diese Oberflächen weisen oft

aufgrund der vorhergehenden Behandlung cyclische PET-Oligomere an deren

Oberfläche auf und lassen diese dadurch unter anderem „rau“ erscheinen. Diese

Beschaffenheit ist jedoch auch für die nachfolgende Verarbeitung der Textilien,

beispielsweise dem Bedrucken, kontraproduktiv. Eine Entfernung der cyclischen

PET-Oligomere ist daher von der Textilindustrie stark erwünscht.

Um dieses Ziel zu erreichen wurden drei weitere Enzyme isoliert (TfCa, 142 und

abCut), von denen das Enzym 142 im FuPol-Projekt für die Anwendung im

Waschmittel entwickelt worden ist und die abCut im Rahmen dieses Projektes

entwickelt wurde. Die TfCa ist ein literaturbekanntes Enzym, welches cyclische PET-

Trimere abbaut. Sowohl das Enzym 142 als auch abCut zeigten gute Aktivitäten in

der Hydrolyse von polymeren PET (PET Nanopartikel). Eine Hydrolyse von

cyclischen PET-Trimeren konnte jedoch nur für 142 und TfCa beobachtet werden.

Allerdings müssen diese Ergebnisse noch über eine weitere Methode, beispielsweise

einer MS-Analytik, verifiziert werden. Es ist nicht ausgeschlossen, dass Reste von

polymeren Substraten umgesetzt und nicht die cyclischen PET-Trimere als Substrat

hydrolysiert werden. Wenn diese Ergebnisse bestätigt werden, wäre die 142 ein

interessantes Enzym zur Hydrolyse von cyclischen PET-Trimeren, da dieses bereits

sehr viel bessere Leistungen als das literaturbekannte Enzym, die TfCa, zeigt.

1

ChemBioTec  Project  

Final  Report    

Bio-­‐catalytic  modification  of  polyester  fiber  surfaces  for  manufacturing  innovative  textiles  

 WP  4:  Characterization  the  surface  properties  of  enzymatically  treated  PET  materials  

&  WP  5:  Evaluation  of  surface  treatment  with  TfCut2  and  variants  production  of  functional  PET  materials.  

 

 

 

Written  by  –    

Mr.  Ajinkya  Powar  &  dr.  Pramod  Agrawal    

2

Contents  Executive  Summary                   03  

1. Introduction                                               06  2. Materials  and  Methods                 08  

2.1:  Materials                       08  2.2:  Methods                       08                          

             3. Part  I:  Results  and  Discussion  -­‐  Controlled  wettability  of  PET  films  with  enzymes   11  

3.1 Benchmark  NaOH  treatment               11  3.2 Enzymatic  treatment  of  PET  film                 12  3.3 Presence  of  protein  on  enzyme  treated  samples           14  3.4 The  performance  of  four  enzymes  (TfCut2,  NS  29061,  Evo  hydrolase    

and  Texazym  PES)  followed  by  SDS  wash  on  PET  film           16  3.5 SEM-­‐  Element  (EDS)  analysis  /  Characterisation  of  Enzyme  treated    

samples                       17  3.6 SEM  Characterization  of  enzyme  treated  PET  films         18  3.7 Conclusions  Part  I                   20  

 4. Part  II:  Results  and  Discussion  -­‐  Inkjet  printing  of  nano-­‐silver  ink  on  (modified)  PET  film  to  

impart  conductivity                   21  4.1 Selecting  print  pattern  and  benchmark  nano-­‐silver  printing  on  paper,  

PET  textile  and  PET  film                   21  4.2 Sintering  optimization  of  nano  silver  ink  on  PET  surface         22  4.3 Sintering  optimisation  at  lower  temperature  on  PET  film         25  4.4 Effect  of  NaOH  treated  PET  (controlled  wettability)  samples  on  conductivity  27    4.5 Effect  of  NS29061  and  Evo  hydrolase  treated  PET  (controlled  wettability)  

samples  on  conductivity                   27  4.6 Conclusions  part  II                   30  

 5. Overall  Conclusions                                             31  

 6. References                           31

 Appendix  –  Data  Sheets                 32  i) Specifications  of  the  PET  film  under  study ii) Nano  silver  ink  specifications  and  printing  guidelines iii) Print  pattern  and  print  setting  of  functional  ink  with  Dimatix  printer iv) Enzymes  under  study                  

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Executive  Summary    The  objective  of  the  ChemBioTec  project  with  a  multidisciplinary  research  consortium  is  to  develop  biocatalysts  for  a  novel  biocatalytic  functionalization  process   in  polyester  fiber  finishing.   In  contrast  to   the   conventional   finishing   methods   consuming   large   amounts   of   chemicals   and   energy,  biocatalysts   will   be   employed   to  modify   PET   fibers   using   environmentally   friendly   and   sustainable  process  conditions.  The  project  is  thereby  applying  novel  concepts  of  industrial  biotechnology  in  the  textile   industry   and   related  markets.   Saxion-­‐University   of   Applied   Sciences,   is   one   of   the   research  partner  in  this  consortia  plying  vital  role  in  WP4  and  WP5.  Following  sub  tasks  are  defined  for  Saxion  within  the  project:  • WP  4:  Task  M7  (month  19-­‐24):  Characterization  PET  hydrolase  activity  with  PET  materials.  • WP  4:  Task  M8  (month  31-­‐36):  Characterization  the  surface  properties  of  enzymatically  treated  

PET  materials.  • WP5:   Task   M9   (month   31-­‐36):   Evaluation   of   surface   treatment   of   PET   materials   with   the  

polyester  hydrolase  TfCut2  and  variants  for  the  production  of  functional  products.  Preparation  of  metallised   PET   fabrics   and   conductivity   printing   on   PET   films   by   means   of   inkjet   printing  technology  was  investigated.  

 We  have  submitted  two  reports  at   the  end  of  18th  month  and  the  30th    month,   respectively.   In   the  18th   month   report,   the   benchmarking   of   industrial   washing   of   loomstate   polyester   fabrics   was  reported   to   analyse   the   eco-­‐efficiency   of   the   process.   It   is   known   that   conventional   discontinuous  washing   processes   have   several   disadvantages   in   terms   of   washing   efficiency   of   the   fabric,   water  consumption,   temperature   during   washing   etc.   At   the   same   time,   the   fabric   prepared   after  conventional   washing   has   several   issues   such   as   PET   oligomer   accumulation   on   the   fibre   surface  owing   to   heat   treatment,   improper   removal   of   polyester   size,   stiffness   etc.   that   needs   to   be  addressed  as  well.  The  data  related  to  the  industrial  washing  process  have  been  transferred  to  IFU-­‐Hamburg  GmBH  for  an  eco-­‐efficiency  analysis.  Characterisation  in  terms  of  SEM  imaging  of  loomstate  and   industrially   washed   polyester   has   been   carried   out   to   visualise   the   fibre   surface   in   terms   of  oligomer  formation.    The   30th   month   report   dealt   with   the   aim   to   bring   the   enzymatic   PET   treatment   process   to   an  industrial   level.   For   the   exploitation   of   the   results,   we   have   considered   a   business   case   for   the  company  Verosol  BV,  The  Netherlands.  The  report  discusses  some  of  the  relevant  results  related  to  task  M8  –Characterization  the  surface  properties  of  enzymatically   treated  PET  materials   (WP4)  and  M9   -­‐   Evaluation   of   surface   treatment   of   PET   materials   with   the   polyester   hydrolase   TfCut2   and  variants  for  the  production  of  metallised  PET  fabrics  by  Verosol  BV  (WP5).  Although  M8  and  M9  were  targeted  for  the  months  31-­‐36,  Saxion  had  already  started  activities  in  that  direction  and  some  of  the  results  have  been  reported  in  the  30th  month  report.  The  aim  was  to  remove  the  polyester  size  from  the  loomstate  polyester  fabric.  This  scouring  step  is  essential  to  remove  impurities  from  the  polyester  surface  including  the  polyester  size.  A  detailed  evaluation  of  the  industrial  polyester  scouring  process  has   been   carried   out.   Two   different   enzymes,   TfCut2   (produced  within   the   project)   and  NS   29061  (Novozymes)   were   evaluated   for   bio-­‐scouring   of   polyester   fabrics.   The   bio-­‐scouring   of   polyester  

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process   has   been   optimised   in   terms   of   pH,   temperature,   effect   of   mechanical   shear,   enzyme  concentration,  effect  of  prewashing  with  water  etc.  The  enzymatic  bio-­‐scouring  of  polyester  showed  clear   advantages   over   existing   industrially   scoured   polyester   fabric.   A   smooth   and   clean   polyester  surface  which  is  free  from  the  impurities  and  surface  oligomers  enabling  high  tech  applications  could  be  achieved.  The  business  case  discussed  in  the  30th    month  report  was  related  to  the  size  removal  from  polyester   textile   surface  enabling   the  high   tech  application  of   aluminium  metallisation  of   the  polyester   surface.   The   enzymatic   size   removal   was   more   efficient   and   faster   compared   with   the  conventional  process  and  hence  creating  value  for  the  industry.    The   final   report   addresses   the   tasks   specified   in   WP4   (Task   8)   and   WP5   (Task   9).   In   WP   5,   the  treatment  of  PET  films  with  TfCut2  and  variants  was  evaluated  for  the  application  of   inkjet  printing  technology.   An   increased   hydrophilicity   and   wettability   of   the   film   surfaces   is   required   for   this  application.  PET  film  was  used  since  printing  conductive  tracks  on  textiles  is  not  possible  due  to  inter-­‐yarn   and   intra-­‐yarn   pores   in   textiles.   The   printing   of   conductive   tracks   on   PET   films   is   a   novel  application  with  a  high  market  potential.  The  film  were  treated  with  polyester  hydrolases  followed  by  a  functionalization  step  applying  inkjet  printing.  Alkaline  hydrolysis   is  the  most  widely  used  method  for  surface  modification  of  polyester  substrates.  This  treatment  is  harsh,  not  eco-­‐friendly  and  causes  irreversible  damage  to  the  polyester  substrate.  Hence  this  research  was  aimed  towards  replacing  this  process  with   an  enzyme   treatment  enabling   the  manufactures  of   a   functionalized  product  without  impairing   its   mechanical   properties   or   damaging   the   polyester   substrate.   The   research   has   been  divided   in   two   parts,   Part   I   –   achievement   of   controlled   wettability   of   PET   films   with   polyester  hydrolases   and   Part   II   -­‐   inkjet   printing   of   nano-­‐silver   ink   on   the   modified   PET   films   to   impart  conductivity.    The  surface  smoothness  (roughness)  of  the  polyester  film  plays  an  important  role  in  the  quality  and  performance   of   conductive   printing.   A   controlled   wettability   of   the   PET   film   is   desired   for   proper  wetting  and  spreading  of  the  ink.  The  proper  adhesion  of  the  silver   ink  on  the  PET  film  impacts  the  thickness  of  the  printed  layer  and  thus  the  electrical  performance.    A  modification   of   PET   film   surfaces  with   four   polyester   hydrolases   (TfCut2,  NS   29061,   evo142   and  Texazym   PES)   and   a   benchmark   treatment   with   NaOH   was   performed.   A   SDS   washing   step   was  implemented   for   the   removal   of   protein   after   the   enzymatic   treatments.   The   resistance   (Ω)   and  conductivity   values   obtained   with   enzymatically   modified   and   benchmark   treated   PET   films   were  compared.   PET   samples   treated   with   NS29061   and   evo142   were   subjected   to   conductive   printing  using  a  Dimatix  printer.  Optimal  sintering  (100°C  for  156  min)  showed  conductivity  for  all  the  enzyme  treated  samples.  It  has  been  established  that  the  mild  treatment  with  enzymes  positively  influenced  the  surface  wettability  resulting  in  a  smoother  surface  and  conductivity  of  the  nano  silver  ink  tracks.  Unlike  NaOH,   the   enzyme   treatments   did   not   negatively   influence   the   PET   surface  microstructure.  We   have   proven   the   added   value   of   an   enzymatic   pre-­‐treatment   of   the   PET   film   surface   over  conventional   chemical   treatment   for   the   conductive   printing   with   nano   silver   inks   using   inkjet  printing  technology.  In   conclusion,   two   different   applications   for   a   biocatalytic   process   using   polyester   hydrolases   to  modify  PET  surfaces  have  been  successfully  demonstrated  by  Saxion  in  the  project.    

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1.  Introduction  Saxion  –  University  of  Applied  Sciences  (SAX)  is  one  the  project  partner  within  ChemBioTec  consortia.  The   project   is   undertaken   at   the   Chair   for   Functional   Smart  Materials   at   the   Research   Centre   for  Design  and  Technology,  Enschede  the  Netherlands.  The  project  is  aiming  at  the  development  of  PET-­‐hydrolases   for   an   innovative   biocatalytic   process   in   polyester   textile   finishing   to   increase   the  hydrophilicity   of   PET   fibers.   The   project   relies   on   an   integrated   and   multidisciplinary   approach  encompassing   the   key   steps   of   the   creation   of   a   value   chain   for   the   whole   bioprocess   from  biocatalyst   characterization,   enzyme     engineering,   scale-­‐up   of   enzyme   production   to   industrial  application   with   the   following   objectives:   WP1)   the   use   of   natural   biodiversity   to   identify   novel  bacterial  PET-­‐hydrolases  with  enhanced  efficiency;  WP2)  genetic  engineering  of   the  PET-­‐hydrolases  using   rational   design   and   evolutionary   methods   to   obtain   biocatalysts   with   high   efficiency   and  stability;   WP3)   engineering   and   scale-­‐up   of   the   recombinant   production   of   PET-­‐hydrolases   for  industrial  application;  WP4)  thorough  characterization  of  the  biofinishing  process;  WP5)  application  of   the   enzymes   in   the   design   of   novel   biofinishing   processes   to   increase   the   hydrophilicity   of   PET  fibres  suitable  for  the  industrial  production  of  functional  textiles.  This  report  addresses  tasks  related  to  WP4  and  WP5.      The  PET  substrate  is  hydrophobic  in  nature.  The  origin  of  hydrophobicity  of  polyester  is  lack  of  polar  groups  i.e.  (  -­‐  OH,  -­‐  COOH,  -­‐  NH2    )etc.  On  its  polymer  backbone.  It  has  low  moisture  regain.  It  has  also  problems  related  to  static  charge  generation.  It  attracts  dust,  dirt  and  oils  easily.  Also  pilling  tendency  is   a   problem.   PET   surface   is   not   a   good   medium   for   adhering   and   PET   is   non   polar   in   character  because   of   benzene   ring   prominence   and   the   presence   of   –CH2-­‐CH2-­‐   groups.  Moreover,   polyester  could   be   highly   crystalline   in   nature,   tightly   packed   highly   ordered  molecules   and  with   absence   of  polar  functional  groups,  capable  of  forming  hydrogen  bond  with  other  molecules.  So  these  properties  restrict  PET  in  many  value  added  applications.      

The   traditional   method   employed   to   make   the   polyester   hydrophilic   is   alkaline   treatment   .   The  phenomenon  that  occurs  is  etching  of  the  surface  and  introducing  polar  groups  onto  the  surface.  But  this  method   can   cause   various   problems   like   surface   pitting   as  well   as  weight   loss.   So  mechanical  properties   are   affected   and   environmental   concerns   are   associated.   Hence   enzymatic   treatment  could  be  a  good  alternative.  Because  of  their  size  enzyme  act  on  to  the  surface  without  affecting  the  properties  of  PET  materials,  probably  retaining  smooth  surface.  Enzyme  treatments  could  be  carried  out   in  moderate   conditions   at   less   concentrations   and   ambient   temperature   and   shorter   reaction  time.   So   our   aim   is   characterization   of   surface   of   enzymatically   pretreated   textiles   and   imparting  functionality  by  digital  printing  technology.  So  based  on  properties  required  for  conductive  printing  the   substrate   must   have   good   smoothness,   high   surface   energy   (i.e.   good   wettability)   for   the  functional   nano-­‐silver   ink.   For  high  adhesion  performance   it   is   crucial   to  have  good  wetting  of   the  print  pattern  on  to  the  PET  substrate.    

The   central   research   question   is   Can   enzymatic   treatment   of   PET   film   be   useful   for   imparting  functionality  by  digital  printing  technology?  The  Sub-­‐questions  that  help  to  set  the  milestones  of  the  laboratory  study  are    

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• Enzymatic   pre-­‐treatment   of   polyester   film   with   the   help   of   enzymes   (TfCut   2,   Novozymes   NS  29061,   Evo  hydrolase   and   Texazym  PES   enzyme)   and   comparing   it  with   the   alkaline   treatment  (NaOH)  in  terms  of  surface  PET  film  modification.  

• Characterization  of  surface  properties  of  enzymatically/NaOH  treated  polyester  film.    

• Functionalistion  of  PET  film  with  inkjet  printing  of  nanosilver  inks  to  create  conductive  surfaces.  And  evaluate  the  effect  of  controlled  wettability  by  enzyme  treatment  on  conductive  printing.  

A  schematic  research  approach  is  given  in  Figure  1  and  Figure  2  below.  

 Figure  1:  PART  A-­‐  Enzymatic  treatment  and  benchmark  treatment  of  PET  film  to  achieve  controlled  wettability.  

     Figure  2:  PART  B:  Printing  conductive  patterns  on  treated  films  by  inkjet  technology  

Blank  PET  film  

Benchmark  NaOH  treatment  (1.5  M,  650  C)  Different  treatment  time  from  15  to  240  

mins  

Treatment  with  TfCut  2,  NS  29061,Evo  hydrolase,  Texazym  PES  at  pH  8.0  for  1  hr  at  400  C  Concentrations  from  10  to  150  

units/incubation.  

Achieving  Controlled  Wettability  

TEC-­‐IJ-­‐010  silver  ink    (Viscosity  –  9  –  15  cps,  Surface  tension  -­‐  30-­‐32  dynes/cm)  

Selection  of  print  pattern  Study  and  optimisation  of  jettability  of  ink  

Printing  using  Dimatix  DMP  2831  digital  printer  on  paper,  blank  PET  film,  Kapton  film,  enzyme  treated  and  benchmark  treated  samples  

Characterization  using  Contact  angle  measurement,  SEM  analysis,  FTIR  analysis.  

Evaluation  of  the  effect  of  change  in  hydrophilicity  on  the  conductivity  by  using  multimeter  and  studying  the  patterns  by  digital  microscope  

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2. Materials  and  Methods  

2.1  Materials  PET  film:  Low  crystalline  PET  film  with  Product  no:  029-­‐198-­‐54  and  250  µm  thickness  purchased  from          Goodfellow  GmbH  Germany  (Refer  Appendix  I).  This  is  similar  substrate  used  by  University  of  Leipzig  to  study  the  hydrolysis  by  enzymes.          Silver   Ink:  Commercially   available   silver   ink   TEC-­‐IJ-­‐010   (Metallo-­‐Organic   Complex)from   INKTEC   Ltd  (Refer   Appendix   II).   It   is   nano-­‐silver   ink   formulation,   which   is   capable   to   deposit   using   inkjet  technology.        Enzymes:  All  the  enzymes  used  for  the  experiments  are  cutinases.  TfCut2  and  Evo  hydrolase  are  the  enzymes   produced   and   supplied   by   the   partners   within   ChemBioTec   project   and   NS   29061   and  Texazym  PES  are  commercially  available  enzyme.  Refer  Appendix   IV   for  all   relevant  data  about   the  enzymes.  General  information  about  enzymes  are  given  in  table  1.    Table  1:  Details  of  TfCut  2,  NS  29061,Evo-­‐  Hydrolase,  Texazym  PES  enzymes.  Enzyme  name   TfCut2   NS  29061   Evo-­‐  Hydrolase   Texazym  PES  

Classification   EC  3.1.1.74   EC  3.1.1.3   EC  3.1.1.3   ?  

Bio-­‐chemical  name  

thermobifida  fusca  

fusarium  solani?   ?   ?  

Source   Bacterial   Fungal   Bacterial  (thermostable)  

?  

Special  affinity  towards  

Water  soluble  and  amorphous  polyester  

Water   soluble   and  insoluble  polyester  

?   ?  

Unit  Activity  (U/ml)  

42,7   1600,1   10  U/mg  lyophilisate   90  U/ml  

Stage  of  development  

Research  stage   Commercially  available  

Research  stage   Commercially  available  

Supplier   UniversityLeipzig/    Evocatal  GmBH  

Novozymes   Evocatal  GmBH   inoTex  CZ  

 Other   Chemicals:   Hydrochloric   Acid   37   %   solution   from   Acros   Organics,   Sodium   Hydroxide   ACS  reagent,   ≥97.0%,   pellets   from   Sigma   Aldrich,   Tris(hydroxymethyl)aminomethane   from   99   %   purity  from  Acros  organics  and  Sodium  dodecyl  sulfate  (SDS)  Electrophoresis-­‐Grade  from  Fischer  Scientific.    2.2.  Methods  2.2.1  General  experimental  setup:  The  enzymatic   treatment  and  benchmark  treatment  with  NaOH  were   carried   out   in   a  water   bath  with   beakers   placed.   A   4*4   cm  PET   film  was   selected   for   all   the  experiments  with  approximately  0.5  gm  weight  of  each   film.  Material   to  Liquid   ratio   (MLR)  of  1:40  was  selected.  

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 2.2.2  Benchmark  NaOH  treatment:  The  PET  film  was  treated  with  1.5  M  NaOH  at  65°C  for  15,  30,  45,  60,  75,  90,  120,  240  minutes  at  MLR  1:40  to  access  the  change  in  wettability.  After  the  treatment  the  PET  film  was  washed  with  demi  water  for  10  minutes  to  remove  the  residual  alkali  and  then  dried  in  oven   at   40°   for   10   minutes.   The   treatment   was   carried   out   at   milder   conditions   to   avoid   the  distortion  of  the  film.    2.2.3   General   enzymatic   treatment:   The   enzyme   incubation-­‐experiments   were   carried   out   in   the  beaker  placed  in  water  bath.  Maximum  of  eight  beakers  with  a  volume  of  each  250  ml  can  be  placed  inside.   The   selected   MLR   was   1:40.   The   PET   film   was   treated   either   with   TfCut2,   NS   29061,   Evo  hydrolase  and  Texazym  PES  enzymes  at  identical  processing  conditions  such  as  pH  8.0  for  1  hour  at  40°C  using  0.1  M  tris-­‐HCl  buffer  solution.  The  concentrations  used  were  10,  20,  30,  40,  80,  120,  150  Units/Incubation   for   each   enzyme.   After   the   treatment,   the   PET   film  were  washed  with   10  %   SDS  solution  at  20°c  with  MLR  1:40   for  5  minutes,   followed  by  rinsing  with  demi  water   two  times   for  5  minutes,  and   then  dried  at  40°c   for  10  minutes.  The  Concentration  was  varied  and   the   time,   temp  and  pH  was  kept  constant  to  study  the  effect  of  hydrophilicity.    2.2.4  Ink  Formulation  for  Digital  Printing:  Commercially  available  silver  ink  TEC-­‐IJ-­‐010  has  been  used  from  Clarient.  Before  the  print  process  starts  the  ink  needs  to  be  filled  into  the  cartridge  and  stay  at  room   temperature   for   approximately   two  hours.   This   helps   to   lower   the   viscosity   to   the   indicated  viscosity   level   of   10   (+/-­‐2)   cps.   Fujifilm   recommends   the   usage   of   0.2   µm   filters   to   remove   large  particles   form   ink.   Silver   ink   is   much   easier   to   handle.   The   print   guideline   is   given   in   appendix   II  regarding,  how  to  refill   the  cartridges.   InkTec  also  delivers  a  cleaning  solution   liquid.  This   liquid  has  been  used  to  cleaned  the  cartridge  before  refilling  for  removing  dust  and  impurities.  This  process  is  described  in  part  two  of  the  print  guideline  of  silver  ink  in  appendix  II.  When  the  cartridges  are  filled  with   ink   and   the   jetting   module   is   connected   to   the   plastic   container,   the   print   process   can   be  started.   Before   the   actual   print   process   can   be   started   all   the   necessary   print   settings   have   to  determine  by  trial  and  error  by  changing  several  parameters  such  as  voltage,  frequency,  waveforms  etc.  Please  see  Appendix  III  for  optimal  jetting  parameters    2.2.5  Characterization  Techniques:  Contact  angle  measurement:  G10  contact  angle  measuring   instrument   from  Krüss  GmBH  Germany  (Figure   3).   This   device   is   located   at   the   Saxion   University   of   Applied   Science   in   Enschede.  Hydrophilicity   is   an   important   parameter   for   this   research.   The   higher   the   advancing   angle   is,   the  more  hydrophobic   is   the  substrate.  To   find  the  advancing  contact  angle   the  syringe  must  be   in   the  liquid  drop  during  the  measurement.  When  the  needle  of  the  syringe  is  in  the  drop,  the  drop  is  filled  slowly  with  H2O,  which  has  a  surface  tension  of  72.75.  After  a  while  the  drop  expands  on  one  side.  When   this   is   happening   a   picture   is   taken  with   the   attached   camera.  With   the   right   software,   the  angle   of   the   expanding   drop   can   be   determined.   This   angle   of   the   expanding   drop   is   called   the  advancing  contact  angle  (ɵ).  The  contact  angle  measurements  of  enzyme  treated,  benchmark  treated  and  blank  Pet  film  was  carried  out  in  duplicate.      

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Figure  3:  Contact  angle  measurement  device  Krüss  G10    FTIR   analysis:   FTIR   offers   quantitative   and   qualitative   analysis   for   organic   and   inorganic   samples.  Fourier  Transform  Infrared  Spectroscopy  (FTIR)  identifies  chemical  bonds  in  a  molecule  by  producing  an  infrared  absorption  spectrum.  The  spectra  produce  a  profile  of  the  sample,  a  distinctive  molecular  fingerprint   that  can  be  used  to  screen  and  scan  samples   for  many  different  components.  FTIR   is  an  effective   analytical   instrument   for  detecting   functional   groups   and   characterizing   covalent  bonding  information.  Film   samples   were   used   for   analysis   before   and   after   SDS   washing   to   detect   the  presence   of   the   proteins   on   the   SDS   unwashed   enzyme   treated   samples.   The   FTIR   spectra   of   the  untreated  and  the  enzyme  treated  SDS  washed  and  unwashed  samples  were  recorded  in  the  3750  –  500cm-­‐1region  on  a  broker  tensor  27  FTIR  instrument  with  16  scans  in  each  case.    SEM  analysis  and  EDS  analysis:  A  SEM  scans  linearly  the  surface  topography  of  a  substrate  by  means  of   electrons.   As   a   result,   the   SEM   transduces   highly   detailed   images   of   the   substrate   surface.   This  technique  is  therefore  suitable  in  order  to  analyse  the  fibre  surface  with  regard  to  any  modification  occurred.  The  type  SEM  used  for  this  project  is:  InTouchScope  JSM  6010LA  of  the  company  JEOL  USA  (Figure  4).  The  SEM  is  located  at  the  Saxion  University  of  Applied  Science.                                                                                                                      Figure  4:  SEM  JOEL  6010LA    Digital  Microscope:  Digital  microscope  from  Dino-­‐Lie  Pro,  Model  AM  413  T  was  used  having  optical  zoom  upto  x  200  was  used  to  study  the  images  of  the  printed  samples.  Here  we  have  measured  the  dimensions  of  the  printed  paper,  blank,  enzyme  treated  samples.  Also  we  have  observed  the  digital  images  of  all  the  samples  i.e.  printed  paper,  blank  and  enzyme  treated  samples  at  zoom  x  50  to  see  the  good  printed  patterns  and  also  the  bad  patterns  with  cracks.  

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3. Part  I:  Results  and  discussion  -­‐  Controlled  wettability  of  PET  films  with  enzymes    

 Our  aim   is   to  make  conductive  patterns  onto   the  enzymatically  modified  polyester   (PET)   film  using  digital   printing   technology   enabling   various   applications   in   the   field   of   printed   electronics.   An  industrial/traditional  way  of  making  the  polyester  hydrophilic  with  the  aid  of  NaOH  is  harsh,  energy  consuming,   un-­‐uniform   and   non-­‐eco-­‐friendly.   Hence   this   research   was   aimed   towards   A)   the  modification   of   polyester   (PET)   film   by   enzymatic   treatment   and   then   B)   accessing   the   printing   of  conductive   patterns   with   aid   of   nano-­‐silver   ink   onto   modified   PET   film   to   evaluate   if   controlled  wettability  and  PET  surface  microstructure  plays  any  role.    Surface  Characterization  of  the  Polyester  film   was   carried   out   by   treatment   with   four   different   enzymes   and   benchmarking   with   NaOH  treatment.   In   parallel   inkjet   printing   of   nano-­‐silver   based   conductive   pattern   onto   the   surface  modified  polyester  film  were  carried  out.  Microscopic  images  were  made  to  study  morphology  of  the  printed   patterns.   Resistance   values   (Ω)   were  measured   as   a   function   of   conductivity   of   the   nano-­‐silver  based  print  patterns.    3.1  Benchmark  NaOH  treatment:    It  is  important  to  benchmark  the  effect  of  conventional  way  of  treating  PET  film  with  NaOH.  In  order  to   benchmark   with   NaOH   treatment,   the   concentration   of   NaOH   (1.5M)   and   the   treatment  temperature  (65⁰C)  were  kept  constant,  while  the  varying  the  treatment  time  (from  0  till  240  mins).  The  NaOH  treatment  was  carried  out  at  lower  concentration  and  temperature  conditions  to  avoid  the  structural  damage  to  the  PET  film.  The  experimental  protocol  is  given  in  Experimental  section  of  this  report.  The  results  of  NaOH  benchmarking  treatment  are  shown  in  figure  5.      

 Figure  5:  Advancing  contact  angle  (ʘ)  achieved  after  1.5  M  NaOH  treatment  at  65⁰C  for  different  

time  interval.    

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As  seen  from  Figure  5,  the  benchmark  contact  angle  value  for  blank  (untreated  PET  film  sample)  is  ʘ  =73.2  which  is  relatively  hydrophobic.  The  contact  angle  values  decreased  from  ʘ  =73.2  to  ʘ=48.1  by  increasing   the  NaOH   treatment   time.  After   90  mins   treatment   time,   no   significant   decrease   in   the  contact   angle   of   the   treated   PET   samples   were   obtained.   The   reason   can   be   attributed   to   the  complete   hydrolyzed   ester   bonds   of   the   PET   film.   There   is   direct   relationship   between   increased  wettability   (decrease   in   contact   angle)   as   a   result   of   increased  NaOH   treatment   time.   Therefore   it  could  be  mentioned  that  the  maximum  hydrophilicity  achieved  by  NaOH  treatment   is  equivalent  to  ʘ=48.1,   this   value   could  be   considered  as  benchmark/reference   value  and  would  be   interesting   to  compare  the  performance  of  enzymes  under  study.      An   Element   analysis   has   been   carried   out   with   EDS   for   90min   NaOH   treated   PET   sample.   Table   2  shows   EDS   analysis,   suggests   that   only   carbon,   oxygen   and   gold   are   present.   EDS   is   a   qualitative  analysis,  the  presence  of  C  and  O  shows  probably  the  broken  ester  bonds.  The  presence  of  gold  (Au)  is  a  result  of  thin  gold  coating  applied  on  PET  film  before  EDS  treatment.          

 Table  2:  Elemental  analysis  (EDS)  of  1.5M  NaOH  treated  PET  film  (90  mins)  

Chemical  formula   Mass      %  C   79.29  0   19.51  Au  (Gold)   1.08  Total   100  %  

 Scanning   electron  microscopic   (SEM)   images   at   1000x  magnification   of   various   NaOH   treated   PET  samples  were  made  to  visualise  any  structural  changes  on  the  surface.  The  blank  PET  film  (no  NaOH  treatment)  shows  smooth  surface  (Figure  6a).  As  the  NaOH  treatment  time  increases  the  PET  surface  becomes   rougher   (Figure   6b,   6c,   6d   &   6e).   Even   though   an   achieved   surface   hydrophilicity   after  90min  NaOH  treatment  sample  is  same,  the  microstructure  of  PET  film  became  more  rougher  owing  to  increase  treatment  time.  This  might  have  negative  influence  of  surface  conductivity,  which  will  be  evaluated  and  reported  later  part  of  this  report.        3.2  Enzymatic  treatment  of  PET  film:    Enzymatic  treatment  of  the  PET  film  were  carried  with  TfCut  2,  NS  29061,  Evo  hydrolase  enzyme  with  concentration  ranging  from  10  to  150  Units/   incubation  using  0.1  M  Tris-­‐  HCl  buffer  at  pH  8.0  for  1  hour  at  40°C.  The  general  experimental  set  up  for  enzymatic  treatment  has  already  described  in  the  materials  and  methods  section.  The  evaluation  of  the  surface  hydrophilicity  of  treated  PET  films  were  expressed   in   terms   of   advancing   contact   angle   (ʘ).   The   results   are   shown   Figure   7.   An   irregular  pattern   in   terms  of   surface  hydrophilicity   (contact  angle)  after  enzyme   treatment  have  emerge.  As  seen   previously  with  NaOH,   it  was   expected   that   increased   enzyme   concentration  would   result   to  proportional   increase   in   hydrophilicity.   However   as   seen   from   figure   7,   the   concentration   of   the  enzyme  increased  the  hydrophilicity  values  did  not  increase.  This  could  be  attributed  to  the  presence  of  enzyme  proteins  on  the  PET  film  after  the  treatment.   It   is  possible  that  proteins  did  not  remove  completely  from  the  PET  surface  with  applied  water  rinsing  steps.        

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                                                                                                                 (a)                                                                                                                                              (b)    

                                                                                                                                                                                                                                                         (c)                                                                  

                                                                                                                                           (d)                                                                                                          (e)  Figure  6:  a)  PET  blank  film,  b)  1.5  M  NaOH  treatment  of  PET  films  for  15  min,  c)  for  90  min,  d)  for  

120  min  and  e)  for  240  min.    

   

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 Figure  7:  Advancing  Contact  Angle  (ʘ)  achieved  after  TfCut  2,  NS  29061  and  Evo  hydrolase  enzyme  

(Units/Incubation)  treatment  of  PET  film.    3.3 Presence  of  proteins  on  enzyme  treated  samples:    As   described   in   earlier   section,   an   un-­‐uniform   advancing   contact   angle   (ʘ)   results   after   enzyme  treated  were   attributed   to   presence   of   protein   on   the   PET   sample.   Therefore   it  was   important   to  establish  the  presence  proteins  on  PET  samples.  An  additional  standard  washing  procedure  with  10%  wt  SDS  (Sodium  dodecyl  sulphate)  –  an  anionic  surfactant  solution  in  demi  water  was  carried  out  with  MLR   of   1:40   for   5  minutes   at   20°C,   followed   by   consecutive   rinsing   treatments   of   5  mins   for   two  times.   The   protein   removal   procedure   was   suggested   by   our   project   partner   Evocatal   GmBH,  Germany.     To   confirm   the   removal  of  proteins   from  PET   film,   FTIR  analysis  of   a)  blank  PET   sample  (Figure   8),   b)   Enzyme   treated   sample   (Figure   9)   and   c)   Enzyme   treated   and   SDS   washed   sample  (Figure  10)  were  carried  out.    

 Figure  8:  FTIR  analysis  of  blank  PET  film  (no  treatment)  

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 Figure  9:  FTIR  analysis  of  Evo  Hydrolase  treated  (150  U/incubation)  PET  film  (only  water  washed  

samples)  

 Figure  10:  FTIR  analysis  of  Evo  Hydrolase  (150U/incubation)  treated  PET  film  (SDS  washed  samples)  

 The  FTIR  analysis  of  blank  PET  film  is  presented  in  Figure  8.  It  is  clear  that  the  peak  at  1713  cm-­‐1  is  a  characteristic  peak  for  esters  (C=O  stretch).  Peaks  at  1016  cm-­‐1,  1091cm-­‐1,  1239cm-­‐1,  are  belongs  to  esters  (C-­‐O  stretch).  Thus  FTIR  analysis  of  the  blank  PET  film  confirms  the  presence  of  ester  bonds.  It  is   important   to  mention   that   the  FTIR  analysis  of  blank  PET   sample   is   a  benchmark  analysis.  Other  

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two   FTIR   analysis   images   of   enzyme   treated   (Figure   9)   and   SDS   washed   (Figure   10)   are  subtracted/missing   from   the  blank  FTIR   treatment  of  PET   film.  Therefore  only  additional  peaks  are  visible.      FTIR  analysis  in  case  of  the  Evo  hydrolase  treated  sample  (Figure  9),  shows  that  the  peak  at  3362  cm-­‐1  is  attributed  to  the  presence  of  primary  amines  (N-­‐H  stretch).  Peaks  at  of  1544  &  1645  cm-­‐1  were  allocated  to  secondary  amines  and  amide  group  (N-­‐H  bend)  presence.  Hence  the  presence  of  protein  onto   the   enzyme   treated   sample   is   confirmed.   After   SDS   washing   procedure   protein   removal   is  expected  from  the  enzyme  treated  sample.  FTIR  analysis  of  SDS  washed  film  (Figure  10),  shows  that  peak   at   2158   cm-­‐1   allocated   to   presence   of   alkynes   and   peaks   at   3362   cm-­‐1   attributed   to   the  presence   of   primary   amines   (N-­‐H   stretch)   is   missing.   Hence   FTIR   results   indicate   the   removal   of  protein.    3.4  The  performance  of  four  enzymes  (TfCut2,  NS  29061,  Evo  hydrolase  and  Texazym  PES)  followed  by  SDS  wash  on  PET  film  As  described  earlier,  treatment  of  PET  film  was  carried  out  with  TfCut  2,  NS  29061,  Evo  hydrolase  and  Texazym   PES   enzyme   at   pH   8.0   for   1   hour   at   400C.   This   treatment   was   carried   out   at   different  concentrations   from  10   to  150  Units/incubation.  Advancing  contact  angle   (ʘ)   after  SDS  wash  were  evaluated.  In  previous  section  it  has  been  observed  that  that  all  the  enzyme  treated  samples  without  SDS  wash   resulting  an  uneven   trend  of   the  advancing   contact   angle.   The  advancing   contact   angles  after   SDS   wash   can   be   considered   the   real   effect   of   enzyme   treatment   since   there   is   no   surface  proteins  are  presence  on  PET  film.  The  advancing  contact  angle  for  the  buffer  treatment,  followed  by  SDS  washed  PET  sample  shows  the  advancing  contact  angle  of  ʘ=73.0,  which  is  almost  equivalent  to  blank  PET  film.    

 Table  3:  Effect  of  four  different  enzyme  treatment  at  varied  concentration  (10U-­‐150U/incubation)  on  

PET  film  followed  by  SDS  wash.      Enzyme  Concentration  

(U/incubation)  TfCut  2  Advancing  contact  angle  (ʘ)  

NS  29061  Advancing  

contact  angle(ʘ)  

Evo  hydrolase          Advancing  contact  angle  (ʘ)  

Texazym  PES  Advancing  contact  angle(ʘ)  

Blank  PET  (untreated)   73.2   73.2   73.2   73.2  PET  film    

(Buffer  treatment  followed  by  SDS  wash)  

73.0   73.0   73.0   73.0  

10   64.15   60.7   64.3   68.7  20   62.51   55.9   54.6   65.1  30   62.5   54.3   53.6   62.8  40   60.1   51.2   53.2   62.2  80   58.8   51.1   51.9   58.4  120   58.4   50.2   51.9   58.9  150   56.3   49.0   51.4   58.0  

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All  the  results  in  terms  of  advancing  contact  angle  (ʘ)  are  presented  in  table  3.4.  It  is  clear  that  there  is   systematic   trend.   The   contact   angle   is   decreasing   as   a   result   of   increased   concentration   of  enzymes.      The  overall  comparative  performance  of  all  four  enzymes  on  PET  film  have  been  given  in  figure  3.8.  As  mentioned  earlier,   it   is   important  to  note  that  probably  all  the  enzymes  used  under  study  might  have   different   optimal   pH,   temp   conditions.   Therefore   this   comparison   is   only   valid   under   the  enzymatic  treatment  conditions  mentioned  earlier.    

 Figure  11:  Overall  enzyme  performance  on  PET  film  under  identical  treatment  conditions.  

 It   is   clear   from   figure   11/table   3   that,   overall,   Evo   hydrolase   (from  Evocatal  GmBH)   and  NS   29061  (Novozymes)  enzymes  showing  the  best  results  in  terms  of  hydrophilicity  as  compared  to  TfCut  2  and  Texazym  PES  enzyme.   Enzymatic   treatment  was   carried  out   for  1hr   at   40⁰C   compared   to  1.5hrs   at  65⁰C   in   case   of   benchmark   treatment.   The   results   are   almost   comparable   with   benchmark   NaOH  treatment   (Θ=48.4).    As  describe   in   the  materials   and  method   section  all   four   enzymes  belongs   to  hydrolase,   however   the   source,  mode  of   action  and   substrate   reactivity   are  different.  We  have  no  specific   information   about   both   commercial   enzymes   (NS   29061   and   Texazyme   PES)   hence  commenting  on  its  reactivity  towards  PET  substrate  would  be  difficult.      It  is  important  to  mention  that  we  have  tried  to  compare  the  performance  of  all  these  four  enzyme  on  same  substrate  (PET  film)  under  similar  processing  conditions.  The  enzyme  activities  are  defined  and   provided   by   the   supplier.   They   might   have   used   different   assay   conditions   and   different  substrates  for  the  assay.     It   is  also  possible  that  the  enzyme  optimal  performance  may  be  different  than  what  we   have   undertaken   in   this   study.   Therefore   the   results   valid   only   for   selected   process  parameters  and  conditions  under  study.        

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3.5  SEM-­‐  Element  (EDS)  analysis  /  Characterisation  of  Enzyme  treated  samples  Elemental   analysis   of   all   the   enzyme   treated   PET   samples   were   carried   out.   The   selected   enzyme  treated   sample   selected   at   two   points,   1)   when   the   further   improvement   in   hydrophilicity   is   not  visible   and   2)   the  maximum   concentration   of   enzymes   used   (150U/incubation).   All   the   results   are  presented   in   table   4.   As   expected   only   C   and   O   elements   are   visible.   There   are   not   substantial  variations   in   the   ratio   between   C   and   O.   Some   gold   (Au)   is   visible   which   is   a   result   of   sample  preparation.    

 Table  4:  Elemental  analysis  (EDS)  of  all  enzyme  treated  samples  (TfCut  2,  NS  29061,  Evo  hydrolase  

and  Texazym  PES)  at  different  concentrations.  Enzymes   Concentration  

(U/incubation)  C  (%)   O  (%)   Au  (%)   Total  (%)  

TfCut  2   80   77.8   21.02   1.18   100  TfCut  2   150   76.89   22.11   1.19   100  NS  29061   40   77.78   21.05   1.17   100  NS  29061   150   77.54   21.25   1.21   100  

Evo  Hydrolase   80   77.95   20.78   1.27   100  Evo  Hydrolase   150   78.4   20.47   1.12   100  Texazym  PES   80   78.26   20.86   0.88   100  Texazym  PES   150   78.25   20.82   0.93   100  

 3.6  SEM  Characterization  of  enzyme  treated  PET  films  SEM   images   at   1000x   magnification   (Figure   3.9   a,   b,   c,   d,   e,   f,   g   and   h)   shows   the   different  degradation   pattern   on   the   PET   film   surface   as   a   result   enzyme   treatment.   It   is   evident   that   each  enzyme   treatment   (either   different   enzyme  or   different   concentration)   has   some   influence   on   the  surface  properties  of  the  PET  film  as  visible  in  Figure  12.  Some  samples  looks  more  smoother  (Figure  12a,b,c,f,g,h)  compared  with  others  (Figure  12  d,e).  However  no  direct  conclusions  could  be  drawn.        

                                                                                                                     (a)                                                                                                                    (b)                                                                                                                    

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                                                                                                                                                         (c)                                                                                                                              (d)    

                                                                                                                                                 (e)                                                                                                                              (f)    

                                                                                                                   (g)                                                                                                                                    (h)  Figure  12:  SEM  microphotographs  (at  1000x)  of  enzyme  treated  PET  samples,  a)  TfCut  2  treated  PET  film  (80  U/Incu),  b)  TfCut  2  treated  PET  film  (150  U/Incu),  c)  NS  29061  treated  PET  film  (40  

U/Incu),  d)  NS  29061  treated  PET  film  (150  U/Incu),  e)  Evo  hydrolase  treated  PET  film  (80  U/Incu),  f)  Evo  hydrolase  treated  PET  film  (150  U/Incu),  g)  Texazym  PES  treated  PET  film  (80  U/Incu)    h)  

Texazym  PES  treated  PET  film  (150  U/Incu)    

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 3.7  Conclusions  (Part  I)  Controlled   wettability   of   PET   film   have   been   achieved   (from   Θ=73.2   to   49.0)   by   both   traditional  chemical  treatment  (1.5M  NaOH,  at  65°C)  and  with  enzyme  treatments.  Four  different  enzymes  were  explored  with  variable  concentrations  (10U-­‐150U/incubation)  at  fix  time  (1hrs),  temperature  (40°C),  and  pH   (8.0)   to  modify   the   PET   film   surface.  Overall,   Evo  hydrolase   (from  Evocatal  GmBH)   and  NS  29061   (Novozymes)   showing   the   best   results   in   terms   of   hydrophilicity   and   almost   equivalent   to  benchmark   NaOH   treatment.   The   obtained   hydrophilicity   could   be   achieved   at   much   milder  conditions  and  shorter  time  without  any  chemicals.  The  part  I  has  been  achieved.  We  could  able  to  treat   PET   films   (with  NaOH  or   enzyme)   to   achieve   controlled  wettability   from  Θ=73.2   to  49.0.   The  best  performing  enzymes  (Evo  hydrolase  and  NS29061)  have  been  considered  for  further  study  (Part  II),   wherein   we   will   investigate   the   influence   of   increased   wettability   of   conductivity   on   digitally  printed  nano-­‐silver  pattern  PET  film.    

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4. Results  and  discussion  -­‐  Inkjet  printing  of  nano-­‐silver  ink  on  (modified)  PET  film  to  impart  conductivity  (Part  II)  

 4.1  Selecting  print  pattern  and  benchmark  nano-­‐silver  printing  on  paper,  PET   textile  and  PET  film    In  order   to  study  the   influence  of   line   thickness  on  the  conductivity,   three   lines  of  different  widths  were  selected  (Table  5).  The  dimensions  of  the  selected  print  pattern  are  as  follows:    

 Table  5:  Dimensions  of  the  selected  print  pattern    

Line   Width  of  box  (mm)   Line  Width    (mm)   Length  (mm)  1st  line   2*3   0.110   20  2nd  line   2*3   0.230   20  3rd  line   2*3   0.590   20  

 To  visualize  the  selected  print  pattern,  inkjet  printing  of  nano-­‐conductive  inks  using  Dimatix  printed  has  been  carried  out  on  paper  substrate.     It   is  visible   from  Figure  13a,  13b,  13c  and  13d  that  clear  image  with  conductive  ink  were  obtained  on  to  the  paper.  The  image  is  clear  and  without  spreading  of   the   ink   at   any   location.   It   was   decided   to   print   the   conductive   ink   pattern   on   Polyester   fabric  (Figure  13e).  However,  because  of  the  porous  fabric  structure  and  intra-­‐  and  inter-­‐yarn  pores,  the  ink  was  spreaded  and  hence  no  uniform  coating  observed  on  the  fabric.  Hence  semi-­‐crystalline  PET  film  was  chosen  as  a  model  substrate  for  further  experiments.      

                                                                                                           (a)                                                                                                                          (b)  

 

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                                                                                                                         (c)                                                                                                                            (d)                                                                                                                                  

                                                                                                                                                                                                                                 (e)  

 Figure  13:  (a)  Entire  print  pattern  on  paper  (b)  1st  printed  line  on  paper  (c)  2nd  printed  line  on  paper  

(d)  3rd  printed  line  on  paper  (e)  Entire  print  pattern  on  polyester  fabric    4.2  Sintering  optimization  of  nano  silver  ink  on  PET  surface  4.2.1  Sintering  of  nanosilver   ink  on  PET   film:  According   to   the  specifications  of   the  nano  silver   ink  supplier   the   recommended   sintering   conditions   are   130°C   for   10   minutes.   However,   PET   film   is  usually   less  stable  at  high  temperature  owing  to  lower  glass  transition  temperature  (Tg).  Therefore,  sintering  have  been  carried  out  at  various  temperatures  from,  90°C    100°C,  110°C,  120°C,  130°C  and  140°C   for   10   mins.   All   the   digital   images   of   various   treatments   are   given   in   Figure   3.11.   At   80°C  (Figure14),  the  nano-­‐silver  ink  does  not  even  get  dried.  The  ink  easily  get  removed  by  simple  rubbing.  At  90°C  (Figure  14b)  and  100°C  (Figure  14c),  the  ink  is  not  sintered  yet  and  hence  no  any  resistance  were  found.    

 

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                                                                                                                               (a)                                                                                                                (b)  

                                                                                                                                 (c)                                                                                                            (d)    

                                                                                                                                     (e)                                                                                                (f)          

                                                                                                                                                                                                                                       (g)    Figure  14:  Sintering  of  inkjet  printed  nano-­‐silver  ink  on  blank  PET  film  at  (a)  80°C,    (b)  90°C,  (c)  100°C,  

(d)  110°C,    (e)  120°C,  (f)  130°C,  and  (g)  140°C  for  10  mins  respectively.                                                                                                                                              

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Above  100°C  (Figure  14c,  d,  e,  f,  g)  cracks  are  formed  on  to  the  printed  film.  The  cracks  are  formed  due   to   the   difference   in   the   coefficient   of   expansion   of   the   PET   film   and   the   nano   silver.   The  coefficient  of  expansion  is  more  in  case  of  PET  film  so  the  cracks  are  formed.  Because  of  cracks  the  resistance  is  so  high  that  it  cannot  be  measured.  No  conductivity  was  obtained.    No  resistance  (Ω)  could  be  measured  across  the  line  1,  2  and  3.  Above  120°C  (figure  14e,f  and  14g),  the  film  turns  milky  white  (sign  of  converting  amorphous  PET  into  crystalline).  Several  other  options  including  one  side  heating,   two  side  heating  with  and  without   tape   (to  avoid  shrinkage)  have  been  explored.  The  negative  results  could  be  attributed  to  low  glass  transition  temperature  (Tg  =  78-­‐80°C)  and   the  amorphous  nature  of   the  PET   film.  The   surface   cracks  on   the   conductive   tracks   could  also  because   of   immediate   cooling   of   printed   samples   which   is   a   result   of   difference   in   coefficient   of  expansion   of   PET   film   and   the   silver.   Because   of   the   cracks   the   resistance  was   high   enough   to   be  measured.  The  recommended  sintering  temperature  suggested  by  the  supplier  is  130⁰C  for  10  mins.      4.2.2   Printing   and   sintering   of   nano-­‐silver   ink   on   Kapton   50   H   polyimide   film:   To   avoid   any  possibility  if  the  nano  silver  ink  is  functional  or  not,  it  was  decided  to  print  on  temperature  resistance  polyimide   film   from  DuPont.   Selected   three   line  printed  pattern  was   inkjet  printed  on  Kapton  50H  polyimide   film.   Curing   was   carried   out   at   recommended   temperature   of   130°C   for   10   mins.   The  printed   tracks   on   polyimide   film   are   shown   in   Figure   15a   and   digital   photograph   of   single   line   is  shown  in  Figure  15b.  The  measured  resistance  (Ω)  values  are  given  in  table  6.        

                                                                                         (a)                                                                                                      (b)  Figure  15:  (a)  Entire  printing  pattern  on  Kapton  50H  polyimide  film,  (b)  line  1  printing  on  polyimide  

film.    

 All   three   printed   lines   are   conductive.   As   expected,   the   measured   resistance   (Ω)   are   in   following  order  (High  to  low)  Line  1  (110  µm)  >  Line  2  (230  µm)  >  Line  3  (590  µm)  (Table  6).  The  positive  results  could   be   attributed   to   the   uniform   drying   of   the   polyimide   film.   Nano-­‐silver   ink   is   functional   and  130°C  for  10min  is  proven  to  be  an  optimal  sintering  temperature.  No  cracks  are  formed  because  the  coefficient  of  expansion  of  Kapton  film  is  less  as  compared  to  the  polyester  film.  

   

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Table  6:  Resistance  values  of  all  lines  for  Kapton  50H  polyimide  film                                                              4.3  Sintering  optimisation  at  lower  temperature  on  PET  film  It  has  been  established  that  the  nano-­‐silver  ink  is  functional.  It  has  been  also  established  that  the  PET  film   is   less   thermostable   and   cannot   handle   high   sintering   temperature   of   130°C   for   10   min.  Therefore  it  was  necessary  to  lower  the  sintering  temperature  to  at  least  100°C.      Arrhenius'   equation   gives   the   dependence   of   the   rate   constant   (k)   of   a   chemical   reaction   on   the  absolute  temperature  T  (in  kelvins),             k  =  A  e-­‐Ea/RT               [eq  1]    Where  A  is  the  pre-­‐exponential  factor  (or  simply  the  prefactor),  Ea  is  the  activation  energy,  and  R  is  the   universal   gas   constant.   According   to   the   Arrhenius   equation,   there   is   a   relationship   between  sintering   temperature   and   time.   For   each   10   degree   lower   temperature   the   time   increase   by   2.5  times.    Considering  the  starting  value  of  130°C  for  10min,  we  have  calculate  the  time  increase  of  2.5  times  for  each  lower  10°C.  The  results  are  presented  in  table  8.        Table  8:  Sintering  temperature  (from  130°C  till  90°C)  and  expected  time  required  for  the  sintering.  

Temperature   Time   Time     mins   Hrs  

130°C   10    120°C   25    110°C   63   1  hrs  and  3  mins  100°C   156   2  hrs  and  36  mins  90°C   391   6  hrs  and  31  mins  

                                             It  was   decided   to   lower   the   sintering   temperature   to   100°C.   Because   smooth   and  uniform   cooling  gives  more  time  for  stress  relaxation  for  the  PET  film  and  hence  there  are  chances  of  no  cracks.  The  experiments  has  been  conducted   in  Mathis  and  oven  at  100°C  for  156min.  With  steady  heating  for  1hrs  and  slow  cooling  for  1  hrs.  Inkjet  printing  has  been  carried  out  with  20um  ds  (1270  dpi)  single,  double   and   triple   pass   on   blank   PET   films.   Two   identical   sets   of   sintering   conditions  were   applied  using  Mathis  and  at  Oven.  The  conditions  are  selected  time  and  temperature  are  100⁰C  for  156  min  (Table  8).  The  preheating   from  room  temperature  to  100⁰C  (30  mins).  Followed  by  actual  curing  at  100⁰C  for  156  min  (2  hrs  36  mins).  At  the  end,  cooling  was  performed  for  1hr   from  100⁰C  to  room  temperature.  At  the  end  resistance  (Ω)  values  have  been  measured  using  voltmeter.  The  results  are  presented  in  table  7.        .  

Line  No.   Line  1  (110  µm)   Line  2  (230  µm)  

Line  3  (590  µm)  

Resistance   86.8  Ω   42.9  Ω   17.9  Ω  

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Table  7:  Blank  PET  printed  samples  followed  by  Mathis  lab  dryer  or  oven  and  their  resistance  values  (Ω).      

Drying  Conditions  

Printing  conditions   Line  1  (thickness  110  

µm)  

Line  2  (thickness  230  

µm)  

Line  3  (thickness  590  

µm)  In  Mathis  lab  

dryer  Single  pass    (1270  DPI)   -­‐-­‐   595  Ω   -­‐-­‐  Double  pass  (1270  DPI)   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  Triple  pass  (1270  DPI)   313  Ω   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

In  Oven   Single  pass    (1270  DPI)   -­‐-­‐   116  Ω   419  Ω  Double  pass  (1270  DPI)   -­‐-­‐   -­‐-­‐   26.31  KΩ  Triple  pass  (1270  DPI)   -­‐-­‐   377.2  Ω   57  Ω  

 It   is  clear   from  table  7  that   the  results  are  better   for  oven  dried  sample  compared  with  Mathis   lab  dryer.  More  oven  dried  samples  are  showing  resistance,  hence  conductivity.  High  resistance  such  as  595  Ω  and  313Ω  was  found  in  case  of  the  samples  with   line  2  and  line  1  with  single  pass  and  triple  pass   respectively   in   case   of   Mathis   dried   samples.   The   results   can   be   attributed   to   the   uneven  printing  on  to  the  blank  PET  film.  Under  any  selected  conditions,  not  all  three  lines  show  resistance.  For   oven   drying,   the   best   performance   for   triple   pass   with   line   2   and   line   3   showing   resistance.  Uneven   resistance  was   obtained   in   case   of   the   third   line  with   single,   double   and   triple   passes   the  reason   could   be   attributed   to   the   uneven   printing   on   the   blank   PET   film,   because   of   its   surface  hydrophobicity  (Θ=73.2)      Figure  16,  shows  the  digital  images  of  printed  tracks  of  random  sample  of  oven  dried  PET  samples  at  100⁰C  (Table  7).  The  images  shows  no  cracks  on  the  conductive  track.  The  images  also  show  no  milky  surface  of  the  PET  substrate  and  no  conversion  of  amorphous  to  crystalline.    The  samples  showed  no  shrinkage  of  the  PET  films.  The  reason  can  be  attributed  to  the  low  temperature  sintering  causing  no  distortion  of  the  film  and  also  uniform  drying  there  are  no  any  cracks.      

                                                                             (a)                                                                                                                (b)          (c)  

Figure  16:  (a)  (b)  (c)  good  printed  nano-­‐silver  tracks  with  no  cracks      

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Based   on   the   observations   triple   pass   (1270  DPI)   and   oven   drying   (100⁰   C   for   156  mins)   has   been  selected  as  a  benchmark  sintering  treatment  for  all  NaOH  and  best  performing  enzyme  (NS29061  and  Evo  hydrolase)  treated  samples.    4.4  Effect  of  NaOH  treated  PET  (controlled  wettability)  samples  on  conductivity    In  chapter  3,  it  has  been  demonstrated  that  controlled  wettability  can  be  achieved  on  PET  film  using  NaOH  treatment  for  different  time  interval.  The  aim  of  this  set  of  experiment  to  study  the  effect  of  change  in  surface  hydrophilicity  on  conductivity  of   inkjet  printed  nano-­‐silver  ink  on  to  PET  film.  The  optimal   printing   and   sintering   conditions   are   already   described   earlier.     The   results   are   tabulated  below  (Table  9).          

Table  9:  NaOH  treatment  time    on  PET  films,  achieved  contact  angle  (Θ)  and  obtained  resistance  values  (Ω)    

1.5M  NaOH  treatment  time  

Contact  angle  (Θ)   Line  1:  110  µm  (Ω)  

Line  2:  230  µm  (Ω)  

Line  3:  590  µm  (Ω)  

0   73.2   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

15   66.7   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

30   61.4   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

45   58.4   -­‐-­‐   -­‐-­‐   286  

60   54.3   -­‐-­‐   58   48  

75   49.5   -­‐-­‐   832   256  

90   48.4   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

120   48.3   -­‐-­‐   -­‐-­‐   43  

240   48.1   124   -­‐-­‐   243  

It   seems   that   there   is   relationship   between   the   resistance   (Ω)   and   the   surface   hydrophilicity.   No  resistance   (Ω),   and   no   conductivity   has   been   observed   for   0,   15  &   30  min   NaOH   treated   samples.  More   samples   from   Line   3   (590   um   width)   sample   shows   resistance   (Ω),   hence   conductivity  compared  with  Line  2  and  Line  1.  It   is  simply  because  the  lines  are  thick  and  there  are  more  routes  for  current  to  flow.  Very  high  resistance  values  were  observed  which  were  difficult  to  be  measured.  The   conductivity   pattern   and   the   intensity   of   the   resistance   (Ω)   is   un-­‐uniform.   It   seems   that   apart  from   hydrophilicity,   the   surface  micro-­‐structure   (holes   on   the   PET   surface)   also   playing   important  role  and  negatively  affecting  the  conductivity.      4.5  Effect  of  NS29061  and  Evo  hydrolase   treated  PET   (controlled  wettability)   samples  on  conductivity    NaOH  treated  PET  samples  showed  un-­‐uniform  conductivity  (Table  9).    It  has  been  attributed  to  the  harsh   and   uneven   chemical   treatment   negatively   influencing   surface   microstructure.   It   has   been  

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anticipated  that  mild  treatment  conditions  of  both  the  enzymes  NS29061  and  Evo  hydrolase  will  only  influence  the  hydrophilicity  and  would  not  negatively  influence  the  surface  microstructure.              4.5.1  Effect  of  NS29061  enzyme  on   conductivity  of  digitally  printed  nano-­‐silver  pattern:   Table  10  shows  the  results  of  NS29061  treatment  on  PET  surface  in  terms  of  contact  angle  (Θ)  and  resistance.        Table  10:  NS  29061  enzyme  concentration,  Contact  angle  and  resistance  values  NS  29061  (Units)   Contact  angle  (Θ)   Line  1:  110  µm  

(Ω)  Line  2:  230  µm  

(Ω)  Line  3:  590  µm  

(Ω)  

0   73.2   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

10   60.7   156   49   28  

20   55.9   301   137   61  

30   54.3   94   120   38  

40   51.2   103   35   12  

80   51.1   102   179   20  

120   50.2   118   71   31  

150   49   74   47   53  

Average   (Ω)  range   (74-­‐301)   (47-­‐179)   (12-­‐61)  

 All  the  enzyme  treated  samples  (from  10U  till  150U)  shows  resistance  (Ω)  for  Line  1,  Line  2  and  Line  3.  Blank  PET  printed  sample  show  high  resistance  which  is  difficult  to  be  measured.  As  expected  Line  1   shows   higher   resistance   (74-­‐301  Ω),   followed   by   Line   2   (47-­‐179  Ω)   and   last   Line   3   (12-­‐61  Ω).   In  general   enzyme   treatment   are   specific   and   mild,   expected   to   create   minimal   damage   to   the   PET  surface,  resulting  smooth  surface  and  hence  allowing  current  to  flow  across  the  printed  line.      

 4.5.2  Effect  of  Evo  hydrolase  enzyme  on  conductivity  of  digitally  printed  nano-­‐silver  pattern:  Table  11   shows   the   results  of  Evo  hydrolase   treatment  on  PET   surface   in   terms  of   contact  angle   (Θ)  and  resistance.   Similar   to   NS29061,   all   Evo-­‐hydrolase   treated   sample   showed   resistance   (Ω),   hence  conductivity  across  the  printed  line  1,  2,  and  3  for  all  the  enzyme  treated  samples.    In  general  Line  1  showing  stable  resistance  (Ω)  with  lesser  fluctuations  (105-­‐207  Ω),  followed  by  Line  2  (32-­‐345  Ω)  and  last  Line  3  (18-­‐320  Ω).  As  expected,  the  lowest  resistance  achieved  by  line  1  is  105  (Ω)  which  higher  than   32   (Ω)   of   line   2   and   18   (Ω)   for   line   3.   In   general   enzyme   treatment   are   specific   and   mild,  expected  to  create  minimal  damage  to  the  PET  surface,  resulting  overall  better  conductivity  values.  The  uneven  results  can  be  attributed  to  the  contamination  of  the  probe  of  the  multimeter.    

   

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Table  11:  Evo  hydrolase  enzyme  concentration,  Contact  angle  and  resistance  values  Evo  hydrolase  

(Units)  Contact  angle  (Θ)   Line  1:  110  µm  

(Ω)  Line  2:  230  µm  

(Ω)  Line  3:  590  µm  

(Ω)  

0   73.2   -­‐-­‐   -­‐-­‐   -­‐-­‐  

10   64.3   105   245   47  

20   54.6   127   106   165  

30   53.6   122   97   18  

40   53.2   164   57   185  

80   51.9   123   112   67  

120   51.9   112   163   18  

150   51.4   207   32   320  

Average   (Ω)  range   (105-­‐207)   (32-­‐245)   (18-­‐320)  

 4.5.3   Digital   images   of   NS   29061   and   Evo   Hydrolase   printed   samples:   To   visualize   the   surface  structure  of  conductive  tracks  digital  photographs  were  made  from  randomly  selected  NS29061  and  Evo-­‐hydrolase  treated  PET  samples  for  line  1,  line  2  and  line  3.  The  photographs  are  shown  in  figure  3.14.      

                                                                                                                   (a)                                                                                                                                      (b)  

                                                               (c)                                                                                                                                            (d)  

29

 

                                                                                                         (e)                                                                                                                                          (f)    Figure  17:  (a)(b)(c)  Inkjet  printed  conductive  tracks  on  NS  29061  treated  PET  film  a)  line  1,  b)  Line  2,  

c)  Line  3  and      Inkjet  printed  conductive  tracks  on  Evo  hydrolase  d)  line  1,  e)  line  2  and  f)  line  3.      All  the  NS29061  and  Evo  hydrolase  treated  samples  shows  good  resistance  and  the  intact  conductive  tracks   (without   cracks)   showing   conductivity   which   is   a   result   of   improved   wettability   and  smooth/un-­‐interrupted  PET  surface.    4.6  Part  II  -­‐  Conclusions  Three  line  print  pattern  have  been  digitally  created.  Conductive  ink  has  been  printed  on  paper,  PET  film  (blank),  Polyester  fabric,  Polyimide  film,  Enzyme  treated  PET  film  samples.  Evaluation  has  been  made   in   terms  of  advancing  contact  angle  measurements   (Θ),  microscopic   images  and  conductivity  measurements   (Ω).   It   is   clear   that   benchmark   NaOH   treatment   showing   smooth   increase   in  hydrophilicity   (Θ  =  73.2  to  Θ  =  48.4).  However  the  conductivity  pattern  observed  were  un-­‐uniform.  This   could   be   attributed   to   the   non-­‐specific   degradation   (formation   of   holes   and   pits)   on   the   PET  surface  by  NaOH  treatment.          Controlled  wettability   have  been  achieved  by  using   four  different   enzymes   (TfCut   2,  NS29061,   Evo  hydrolase  and  Texazyme  PES)  with  the  variable  parameters  e.g.  concentration,  time  and  type  of  the  enzyme   treatment.   The   comparison   have   been  made   between   the   performance   all   four   enzymes  towards  change  in  wettability  of  PET  surface.  Both  NS29061  from  Novozymes  and  Evo  hydrolase  from  Evocatal  GmBH  showed  very  good  wettability  (Θ  =  49.0  and  Θ  =  51.4  respectively)  results  are  almost  similar  to  NaOH  benchmark  treatment  (Θ  =  48.4).    Selected  enzymes   (NS29061  and  Evo-­‐hydrolase)   treated  PET  samples  were  subjected   to  conductive  printing  using  Dimatix  printer.  Optimal  sintering  (100°C  for  156  min)  showed  conductivity  for  all  the  enzyme   treated   samples.   It   has   been   established   that   mild   treatment   with   enzymes   could   only  positively  influence  the  surface  wettability  resulting  smoother  surface  and  conductivity  of  nano-­‐silver  tracks.   Unlike   NaOH   treatment,   enzyme   treatment   do   not   negatively   influence   the   surface  microstructure.  We  have  proven  the  added  value  of  enzymatic  pre-­‐treatment/washing  of  PET  surface  over   traditional   NaOH   treatment   for   conductive   printing   functional   nano-­‐silver   inks   using   inkjet  printing.    

   

30

5. Overall  Conclusions  Within  ChemBioTec  project,  Saxion  has  important  role  in  the  area  of  enzyme  application  on  polyester  surface   in   order   to   establish   that   enzymatic   washing   process   of   polyester   could   lead   to   more  environmental   friendly   process   compared  with   convention  washing   processes   used   in   the   industry  today.  At  Saxion  we  have  taken  two  different  cases  wherein  the  potential  of  hydrolytic  enzymes  on  PET  surfaces    have  successfully  demonstrated  both  at  lab-­‐scale  and  at  industrial  level  meeting  all  the  stated   tasks  within   the  boundary  of  ChemBioTec  project.   The  business   case   for  enzymatic  washing  with   enzymes   for   size   removal   from  polyester   fabric   for   aluminium  metallisation  has   been   already  submitted  during  month  30  report.      This   last   36th   month   report   aim   at   investigating   the   effect   of   enzymatic   treatments   and   related  parameters   towards   polyester   film  modification   as   an   important   step   towards   achieving   polyester  film   for   high   tech   applications   such   as   conductive   printing   using   inkjet   technology.   Controlled  wettability  of  PET  film  have  been  achieved  (from  Θ=73.2  to  49.0)  by  both  Chemical  treatment  (NaOH)  and  with  enzyme  treatments.  Four  different  enzymes  were  explored  (with  variable  concentrations)  at  fix  time,  temp,  and  pH  to  modify  the  PET  film  surface.  The  benchmark  treatments  (NaOH)  have  been  carried   out  with   1.5M   at   65⁰C   for   varied   time   interval   to   achieve   the   controlled  wettability   (from  Θ=73.2  to  48.4).  Overall,  Evo  hydrolase   (from  Evocatal  GmBH)  and  NS  29061  (Novozymes)  showing  the  best  results  in  terms  of  hydrophilicity.  Hence  these  two  enzyme  treated  PET  samples  have  been  explored  to  visualise  the  effect  of   improved  wettability   in  terms  of  conductivity  (Ω).  This  controlled  wettability  could  potentially  can  be  used  as  a  tool  to  improve  the  surface  wetting  of  nano-­‐silver  inks  for  creating  conductive  tracks  using  Inkjet  printing.      Application  Printing  conductive  track  on  PET  film:  Print  pattern,  conductive  ink  selection,  wave  form  optimisation   and   jettability   have   been   tested   with   Dimatix   DMP   2931   printer.   Conductive   ink   has  been   printed   on   paper,   PET   film   (blank),   Polyester   fabric,   Polyimide   film,   Enzyme   treated   PET   film  samples.   Evaluation   have   been   made   in   terms   of   advancing   contact   angle   measurements   (Θ),  microscopic   images   and   conductivity   measurements.   It   is   clear   the   benchmark   NaOH   treatment  showing  smooth  increment  in  hydrophilicity  (Θ  =  73.2  to  Θ  =  48.1).  However  the  conductivity  pattern  observed  was  un-­‐uniform.   This   could   be   attributed   to   the  non-­‐specific   degradation  PET   surface  by  NaOH   treatment.     Selected   enzymes   (NS29061   and   Evo-­‐hydrolase)   treated   PET   samples   were  subjected  to  conductive  printing  using  Dimatix  printer  shows  complete  conductivity.  We  have  proven  the  added  value  of  enzymatic  pre-­‐treatment/washing  of  PET  surface  over  traditional  NaOH  treatment  for  conductive  printing  functional  nano-­‐silver  inks  using  inkjet  printing.      

References  • Agrawal,  P.  (Feb  2014)  Bio-­‐catalytic  modification  of  polyester  fiber  surfaces  for  anufacturing  

innovative  textiles,  ChemBiotech  Project,18th  Month  Status  Report.    

• Agrawal,  P.  (Nov  2014)  Bio-­‐catalytic  modification  of  polyester  fiber  surfaces  for  anufacturing  

innovative  textiles,  ChemBiotech  Project,18th  Month  Status  Report.    

• Zimmerman,  W.,  project  proposal,  ChemBiotech,  2012  

ifu Hamburg (Tobias Brinkmann, Mieke Klein)

ÖKOEFFIZIENZ-ANALYSE

Endbericht

Tobias Brinkmann & Mieke Klein ifu Hamburg Gmbh t.brinkmann@ifu.com

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Inhalt

1 Hintergrund und Ziele ................................................................................................. - 3 -

2 Vorhabensbeschreibung ............................................................................................. - 3 -

3 Methodik der Ökoeffizienz-Anaylse ............................................................................ - 4 -

3.1 Verwendete Ökobilanzsoftware ........................................................................... - 4 -

3.2 Datengrundlage ................................................................................................... - 4 -

3.3 Ökologische Bewertung ...................................................................................... - 4 -

3.4 Ökonomische Bewertung .................................................................................... - 4 -

3.5 Ergebnisdarstellung ............................................................................................. - 5 -

3.5.1 Der ökologische Fußabdruck ........................................................................ - 5 -

3.5.2 Das Ökoeffizienz-Portfolio ............................................................................ - 6 -

4 Fallbeispiel 1: ............................................................................................................. - 6 -

4.1 Prozessbeschreibung .......................................................................................... - 6 -

4.2 Systemgrenzen ................................................................................................... - 7 -

4.3 Funktionelle Einheit ............................................................................................. - 9 -

4.4 Aufbau der Ökobilanz- Modelle ........................................................................... - 9 -

4.4.1 Klassisches Reinigungsverfahren ................................................................. - 9 -

4.4.2 Biotechnologisches Reinigungsverfahren ................................................... - 11 -

4.5 Ergebnisse ........................................................................................................ - 12 -

4.5.1 Umweltbewertung ...................................................................................... - 12 -

4.5.2 Ökoeffizienz-Portfolio ................................................................................. - 14 -

4.5.3 Szenario-Analyse ....................................................................................... - 14 -

5 Fallbeispiel 2: ........................................................................................................... - 16 -

5.1 Prozessbeschreibung ........................................................................................ - 16 -

5.2 Systemgrenzen ................................................................................................. - 16 -

5.3 Funktionelle Einheit ........................................................................................... - 17 -

5.4 Aufbau der Ökobilanz-Modelle .......................................................................... - 17 -

5.4.1 Alkalische Vorbehandlung .......................................................................... - 17 -

5.4.2 Enzymatische Vorbehandlung .................................................................... - 18 -

5.5 Ergebnisse ........................................................................................................ - 19 -

5.5.1 Umweltbewertung ...................................................................................... - 19 -

5.5.2 Ökoeffizienz-Portfolio ................................................................................. - 21 -

5.5.3 Szenario-Analyse ....................................................................................... - 21 -

5.6 Zusammenfassung und Diskussion ................................................................... - 24 -

6 Literaturverzeichnis .................................................................................................. - 24 -

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1 Hintergrund und Ziele Die Textilveredelung gehört innerhalb der Textilindustrie zu den Bereichen, die hohe Umweltbelastungen verursachen, insbesondere durch Chemikalieneinsatz sowie Wasch- und Trocknungsprozesse (vgl. Carbon Footprint Report BenningerGroup, 2010). In diesem von der Deutschen Bundesumweltstiftung geförderten Projekt zur Entwicklung innovativer biotechnologischer Verfahren zur Modifikation von PET-Oberflächen soll daher die vergleichende Ökoeffizienzanalyse eingesetzt werden, um projektbegleitend Fallbeispiele zu zur Prozessoptimierung zu bewerten. Der Einsatz von Ökoeffizienz-Analysen in frühen Phasen des Verfahrensdesigns ist sinnvoll, denn die meisten Entscheidungen, die in diesen frühen Phasen getroffen werden, haben einen großen Einfluss auf die spätere ökonomische und ökologische Performance des entwickelten Prozesses. Ökoeffizienz-Analysen helfen, in diesen frühen Phasen die Entscheidungsprozesse durch Prozessanalysen zu unterstützen. Denn das Prozesswissen ist zu Beginn der Prozessentwicklung gering, während die Kosten für spätere, notwendige Prozessmodifikationen hoch sind (vgl.Abbildung 1).

2 Vorhabensbeschreibung Gegenstand dieses Chembiotec-Projektes war die Entwicklung neuer Biokatalysatoren für innovative Textilveredlungsprozesse zur Herstellung geeigneter PET-Materialien für die Herstellung hochwertiger funktioneller Textilien. Hierdurch sollen herkömmliche chemische Textilveredlungsprozesse, die sich durch hohen Chemikalienbedarf und Abwasserbelastung auszeichnen, durch umweltfreundliche, energiesparende und materialschonende biokatalytische Verfahren ersetzt werden. Für dieses Projekt betrachtet die Ökoeffizienz-Analyse 2 Fallbeispiele:

1. Entschlichten und Glätten von PET-Fasern: Es soll ein enzymbasiertes Verfahren entwickelt werden, welches PET-Fasern im Veredelungsprozess von Schlichtemitteln und anderen Verunreinigungen reinigt und zusätzlich die Oberflächenstruktur glättet.

2. Oberflächenmodifikation von PET-Filmen: Die Oberflächenbehandlung von PET-Filmen soll eine spätere Bedruckbarkeit mittels innovativer Tintenstrahl-Textildrucktechnologie mit dem Ziel der Herstellung leitender, funktioneller Textilien ermöglichen.

Abbildung 1: Die Relation zwischen Entwicklungsfreiheit, Fixierung von Kosten und Umweltschäden sowie Wissen in der Prozessentwicklung ( Quelle: Heinzle, und Hungerbühler 1997)

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3 Methodik der Ökoeffizienz-Anaylse Die Ökoeffizienz-Analyse soll Verfahren identifizieren, die sowohl aus Kosten- als auch aus Umweltsicht besser abschneiden als vergleichbare Alternativen. Dabei gehen Kosten- als auch Umweltaspekte gleichermaßen mit 50% in das Endergebnis ein.

3.1 Verwendete Ö kobilanzsoftware Die für diese Ökoeffizienz-Analyse verwendete Software ist Umberto NXT Universal in der Version 7.1

3.2 Datengrundlage Die Daten zur Herstellung der Enzyme stammen vom Entwickler evocatal GmbH. Die Verfahrensbeschreibungen zu den konventionellen als auch zu den biotechnologischen Prozessen stammen von der Projektgruppe um Dr. Agrawal, Functional Smart Materials - Knowledge Centre Design and Technology von der Hogeschool Saxion aus den Niederlanden sowie von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Zimmermann, Institut für Biochemie, Universität Leipzig. Die verwendeten Ökobilanzdaten stammen aus den Datenbanken ecoinvent 2.2 und 3.1.

3.3 Ö kologische Bewertung Es existiert eine Vielzahl an ökologischen Bewertungsmethoden. Am bedeutendsten ist die Ökobilanz nach den ISO-Normen 14040 und 14044. Diese stellt einen Rahmen zur Umweltbewertung bereit, fördert aber auch einen Methodenpluralismus: Nicht eine Methode allein kann allen ökologischen Fragestellungen gerecht werden, sondern nur mehrere! In der Prozessentwicklung erschweren unter anderem Datenunsicherheiten und Datenlücken den Einsatz von Ökobilanzierungsmethoden. Sicherlich ist hier zudem der Kosten- und Zeitdruck der Entwicklungsprojekte als weiteres Hemmnis nennen. Für vergleichende, für die Öffentlichkeit bestimmte Ökobilanzen ist außerdem ein unabhängiger externer Gutachter zwingend erforderlich, um die Forderungen der oben genannten Normen zu erfüllen. Aus diesem Grund wird hier keine Ökobilanz nach ISO 14040 & 14044 durchgeführt. Allerdings wird in Anlehnung an diese Norm die ReCiPe Methode (Hintergründe hierzu http://www.lcia-recipe.net/) eingesetzt, um die in den Systemgrenzen festgelegten Prozesse miteinander vergleichen und ökologische Stellschrauben identifizieren zu können. Dabei erlaubt die ReCiPe Methode sowohl eine wirkungs- wie auch eine schadensbasierte Wirkungsabschätzung. Dies bedeutet, dass die potentiellen Umweltwirkungen auf Wirkungskategorie-Ebene („Midpoint“-Methode) dargestellt werden können, als auch, dass die Umweltwirkungen aggregiert als eine Kennzahl („Endpoint“.Methode) bereitgestellt werden können. Die Endpoind-Methode ist notwendig, damit später die Umweltbewertung als eine Kennzahl in dem Ökoeffizienz-Portfolio dargestellt werden kann.

3.4 Ö konomische Bewertung Für die ökonomische Bewertung wird aus Sicht des Anwenders das jeweilige Verfahren betrachtet und nur die Unterschiede zwischen den einzelnen Verfahren gegenübergestellt. Daher beschränkt sich diese Analyse nur auf Material- und Energiekosten.

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3.5 Ergebnisdarstellung

3.5.1 Der o kologische Fußabdruck

Die in der Midpoint-Methode ermittelten Werte der einzelnen Wirkungskategorien aller Alternativen werden hier ungewichtet als Balkengraphik dargestellt. Folgende Wirkungskategorien werden von der ReCiPe-Methode berechnet:

Abbildung 2: Die ReCiPe-Wirkungskategorien

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3.5.2 Das Ö koeffizienz-Portfolio Die ökonomische Dimension wird gemeinsam mit der ökologischen in einer sogenannten Ökoeffizienzmatrix dargestellt (siehe Abbildung 3). Hierzu wird eine Bewertungsmethode benötigt, die die Ergebnisse der ökologischen Bewertung aggregiert darstellt. Der Abstand einer Alternative zur Ökoeffizienz-Diagonalen ist ein Maß für die Ökoeffizienz.

4 Fallbeispiel 1:

4.1 Prozessbeschreibung Der klassische Prozess der Entschlichtung ist in Abbildung 4 dargestellt. Der konventionelle Prozess kann in drei Schritte aufgeteilt werden:

1. Prozessschritt A: Das PET–Rohgewebe wird mit einer 2%igen NH-Tensidlösung imprägniert. Danach wirkt es für 48 Stunden auf einer „Docking Station“ ein.

2. Prozessschritt B: In einem dreistufigen Waschverfahren werden Schlichtemittel und andere Verunreinigungen vom PET-Rohgewebe entfernt. Die Wasserbecken haben eine Temperatur von 90°C, 60°C und 20°C.

3. Prozessschritt C: Das gewaschene Gewebe wird durch zunächst bei 100°C getrocknet und bei 200°C stabilisiert.

Abbildung 3: Das Ökoeffizienz-Portfolio

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Abbildung 4: Übersicht des klassisch chemischen Prozesses (Agrawal 2014)

Der Einsatz einer Enzymlösung anstelle des Tensids führt zu folgenden Prozess-veränderungen im biotechnologischen Verfahren:

1. Prozessschritt A: Das PET-Rohgewebe wird mit einer TfCut2-Lösung bei 40°C behandelt. Die Einwirkzeit beträgt 1 Stunde. Der pH-Wert wird auf 8 eingestellt.

2. Prozessschritt B: In einem zweistufigen Waschverfahren werden Schlichtemittel und andere Verunreinigungen vom PET-Rohgewebe entfernt. Die Waschbecken haben eine Temperatur von 20°C.

3. Prozessschritt C: Das gewaschene Gewebe wird durch zunächst bei 100°C getrocknet und bei 200°C stabilisiert.

4.2 Systemgrenzen Die Ökobilanzmethodik verfolgt generell einen ganzheitlichen Ansatz über die Lebenswegabschnitte Gewinnung und Bereitstellung der Rohstoffe, Hilf- und Betriebsstoffe, Produktion, Transporte, Nutzenphase, Recyclings- und Entsorgungsphase. In dieser projektbegleitenden Ökoeffizienz-Analyse wird aufgrund des vergleichenden Ansatzes auf Vollständigkeit verzichtet und nur die wesentlichen Unterschiede beider Verfahrensalternativen untersucht. Die Abbildungen 5 und 6 verdeutlichen die betrachteten Prozesse. Dabei sind Energie- und Massenströme als Sankey-Diagramm dargestellt. Sankey-Diagramme visualisieren Massen- und Energieströme. Grundsätzlich sind dabei innerhalb einer Einheit alle Flüsse relativ zu einander dargestellt. Vereinfacht gesagt: Je größer ein Fluss ist, desto mehr Material oder Energie fließt.

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Abbildung 5: Übersicht über den biotechnologischen Prozess

Abbildung 6: Übersicht über den konventionellen Prozess

Die betrachteten Prozesse sind:

Bereitstellung Dampf Bereitstellung Strom (optionale Komponente im Modell) Bereitstellung Wasser Produktion Tensid Produktion der Enzyme PET-Textil-Behandlung Abwasserbehandlung

Zur Berechnung der Ökobilanz müssen die Prozesse zur Herstellung des Tensids und der Enzymlösung nachmodelliert werden. Außerdem der Prozess zur PET-Textil-Behandlung selbst. Der wesentliche Unterschied beim Vergleich beider Modelle liegt in der Wahl der Inkubationslösung: bei der chemischen Alternative wird die Herstellung des Tensids betrachtet, während beim biotechnologischen Verfahren die Enzymproduktion betrachtet wird. Die Einflüsse dieser Verfahrenswahl auf den Dampf- und Wasserbedarf wird im nachfolgenden Kapitel dieses Abschlussberichts erläutert.

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4.3 Funktionelle Einheit Das Ziel der Ökoeffizienzanalyse wird mit der Wahl der funktionellen Einheit festgelegt. Die funktionelle Einheit ist eine quantifizierbare Größe eines Produktesystems, welche als Referenzeinheit einer Lebenszyklusanalyse dient. In diesem Fall ist es die Herstellung von 1.000 kg gereinigtem PET-Stoff.

4.4 Aufbau der Ö kobilanz- Modelle Die Modellierungen der Stoff- und Energieströme wird in den nachfolgenden Kapiteln dargelegt. Für die Kostenkalkulation wurden folgende Preise angenommen:

Dampf: 0,02€/MJ Enzymlösung: 154€/kg NH-Tensid: 2€/kg Natriumhydroxid: 0,1€/kg Leitungswasser: 0,002€/kg Entkalktes Wasser: 0,004€/kg Deionisiertes Wasser: 0,004 €/kg

Die Preise stammen - bis auf die Angabe zum NH-Tensid - aus der Sabento-Datenbank, die versucht sich auf Industriepreise zu beziehen. Der Preis für das NH-Tensid ist eine Industrie-Information. 4.4.1 Klassisches Reinigungsverfahren

Die Angaben aus Kapitel 4.1 konnten in ein Umberto-Prozess-Modell übertragen werden. Folgende Abbildung 7 zeigt den klassischen Reinigungsprozess. Dabei wird zu Beginn des Verfahrens der PET-Stoff mit einer 2%igen NH-Tensid-Lösung durchtränkt. Es wird angenommen, dass mit dem Stoff 21 Gewichtsprozent Tensid-Lösung diesen Prozessschritt verlassen. Die Gesamtmenge an Tensid-Lösung zum Durchtränken wird nicht kalkuliert, sondern nur der Verbrauch. Es folgt eine 24 - 48 stündige Einwirkzeit. Danach werden Schlichtemittel und andere Verunreinigungen bei Temperaturstufen von 90°, 60° und 20°C aus dem PET-Gewebe ausgespült. Hierbei handelt es sich um eine Gegenstromspülanlage, d.h. das Wasser aus dem letzten Schritt bei 20°C mit den wenigsten Verunreinigungen wird im mittleren Schritt auf 60°C erwärmt bevor es im „ersten“ Spülschritt bei 90° die schwerste Schmutzfracht mit sich zur Kläranlage führt. Der Wasserbedarf liegt bei 5 Litern pro kg Stoff.

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Abbildung 7: Sankey-Darstellung des konventionellen Reinigungsprozesses

Der Ökoeffizienz-Vergleich fokussiert nur die Unterschiede beider Verfahren. Deshalb wurde auf die Berücksichtigung von Strombedarfen verzichtet, da wesentliche Änderungen nur beim Dampfbedarf gesehen werden. Auch wurde der Trocknungs- und Stabilisierungsschritt energetisch nicht berücksichtigt, da diese Prozesse gleich bleiben. Das Modell ist prinzipiell aber so aufgebaut, dass Strombedarfe berücksichtigt werden können. In der ecoinvent-Datenbank finden sich Ökobilanzdatensätze für die „Bereitstellung von Dampf“, “Bereitstellung von Strom“, “Bereitstellung von Wasser“ sowie für die Abwasserbehandlung, um eine ökologische Bewertung vornehmen zu können.

Nicht vorhanden ist in der ecoinvent-Datenbank ein Datensatz für die Herstellung des NH-Tensids. Die Produktion wurde daher in einem weiteren Modell nachgebaut. Das NH-Tensid besteht zu 95% aus Fettalkoholethoxylaten, 2,5% Fettalkohol und weiteren 2,5% Kondensationsprodukten. Aufgrund des geringen Anteils an Tensid-Einsatz (4,2 kg) im Vergleich zur eingesetzten Gesamtmasse (2% Masseanteil von der Tensid-Lösung) wird hier nur die Herstellung von 100% Fettalkoholethoxylat vorgenommen. Fettalkoholethoxylate entstehen durch eine Vernetzung von gesättigten C12-14 Fettalkoholen (hier Palmöl) mit 7-11 mol Ethylenoxiden. Aufgrund fehlender Informationen zum Prozessablauf, wurde an dieser Stelle auf die Modellierung von Zusatzchemikalien als auch von Energie verzichtet. Alternativ wurde in diesem Modell die Möglichkeit geschaffen, mit einem Durchschnittsdatensatz für organische Substanzen zu rechnen. Dieser Datensatz schneidet allerdings günstiger ab als das modellierte Tensid aus Fettalkoholethoxylat, weswegen dieser nicht weiter berücksichtigt wird. Abbildung 8: Modell- Tensidherstellung

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4.4.2 Biotechnologisches Reinigungsverfahren Die Abbildung 9 zeigt den Aufbau des enzymatischen Modells als Sankeydiagramm.

Abbildung 9: Sankey-Darstellung des enzymatischen Prozesses.

Gegenüber dem konventionellen Reinigungsverfahren gibt es hier bedingt durch den Enzym-Einsatz 3 wesentliche Prozessänderungen:

Das Durchtränken des PET-Stoffs mit der Enzymlösung wird bei einer Temperatur von 40°C anstelle von Raumtemperatur durchgeführt. Es werden 5 Liter Enzymlösung pro kg PET-Stoff benötigt, die erhitzt werden muss. Der Verbrauch an Enzymlösung entspricht jedoch wie bei der chemischen Alternative der Wasseraufnahme des Gewebes von 21%.

Die Einwirkzeit kann hier von 24-48h auf 1 Stunde reduziert werden. Es werden nur noch 2 Spülvorgänge benötigt, die auf 20°C temperiert werden.

4.4.2.1 Enzymherstellung

Die Fermentation wurde ursprünglich in einem 5 L Labfors Fermenter durchgeführt, wird im Folgenden aber auf den industriellen Prozess in einem 100 L Fermenter skaliert. Nach Innokulation mit der 2 L Vorkultur verläuft die Fermentation insgesamt über 48 Stunden, bei moderaten Rührraten (500-800 rpm) und bei 37°C. Während des gesamten Prozesses wird der pH-Wert gemessen und mit NH3-Lösung auf 7 gehalten. Insgesamt werden in diesem Prozess 18 L Glucoselösung, 2,8 L NH3-Lösung und 360 ml Entschäumer verbraucht. Am Ende der Fermentation wird der Fermenterinhalt dem DSP zugeführt, der Fermenter mit 60 L Wasser gefüllt und mittels Dampferzeuger autoklaviert. Während der gesamten Fermentation (48 h) wurden pro Minute 110 L Luft eingetragen. Im DSP wird die Zellmasse von dem Überstand getrennt, da es sich um ein sekretorisches System handelt, wo sich das Zielprotein im Überstand befindet. Dafür wird Westfalia Separator für die ca. 81 L Fermentationsbrühe genutzt. Inklusive der Vorlauf- und Reinigungsphase benötigt dieser dafür ca. 8 h. Der Zellüberstand wird im Anschluss daraufhin sterilfiltriert und bei -20°C für die weitere Verwendung eingefroren. Die folgende Abbildung 10 zeigt das Modell für die Fermentation. Sichtbare Ströme sind vor allem der Kühlwasserbedarf, Luft sowie Strombedarf für die Versorgung des Fermenters. Aufgrund sehr geringer Massenanteile wurden einige Bestandteile des Mediums nicht berücksichtigt.

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Abbildung 10: Sankeydarstellung des Fermentationsprozesses.

4.5 Ergebnisse

4.5.1 Umweltbewertung

Abbildung 11 zeigt die absoluten Werte der Wirkungsanalyse. Es ist erkennbar, dass der chemische Prozess in jeder Kategorie höhere Werte als der biotechnologische Prozess aufweist.

Abbildung 11: ReCiPe-Wirkungsanalyse

0

50

100

150

200

250

ReCiPe - Impactassessment

Chemical Process

Enzyme Process

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Die höheren Werte in den Wirkungskategorien Klimawandel, fossiler Rohstoffverbrauch, menschliche Toxizität sowie ionisierende Strahlung werden hauptsächlich durch den Datensatz für die Dampfproduktion verursacht. Dies zeigt auch die Darstellung der ReCiPe-Total Punkte in den nachfolgenden Abbildungen. In beiden Verfahren werden jeweils über 90% der Umweltbewertungszahl durch die Dampfproduktion verursacht. Es zeigt sich, dass das enzymatische Verfahren mit in Summe 10,3 Punkten um ca 50% umweltfreundlicher ist als der konventionelle chemische Prozess.

Abbildung 12: Übersicht ReCiPe Total – Punkte beim chemischen Verfahren

Abbildung 13: Übersicht ReCiPe Total - Punkte beim biotechnologischen Verfahren

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4.5.2 Ö koeffizienz-Portfolio Das Ökoeffizienzportfolio in Abbildung 14 stellt neben den normierten Umwelt-belastungen auch die Kosten dar. Es zeigt, dass das enzymatische Ver-fahren zwar umwelt-freundlicher ist, aber auch wesentlich teurer ist. Aus Umweltsicht ist das enzymatische Verfahren fast um den Faktor 2 besser, jedoch um den Faktor 7 teurer. Im biotechnologischen Ver-fahren entstehen Kosten in Höhe von ca. 350€ im Vergleich zu ca. 50€ im chemischen Verfahren. Daher ist in diesem Portfolio das chemische Verfahren als ökoeffizienter zu bezeichnen. Es ist zu berücksichtigen, dass der angenommene Preis für ein Kilogramm Enzymlösung auf Durchschnittskosten für einen 150 L Fermenter inklusive des gesamten DSP-Aufreinigungsverfahren stützt. Die verwendete Enzymlösung wurde in diesem Forschungsprozess jedoch nicht aufkonzentriert, weswegen davon ausgegangen werden kann, dass der angenommene Preis für dieses Verfahren vergleichsweise hoch ist. Der enzymatische Prozess befindet sich zudem noch im Entwicklungsstadium und wird daher nicht im industriellen Großmaßstab durchgeführt, wodurch weitere Kosteneinsparpotentiale entstehen würden. Diese Unsicherheit in der Festsetzung eines Preises für die Enzymlösung soll durch 2 Szenarien weiter analysiert werden, 4.5.3 Szenario-Analyse

Es kann davon ausgegangen werden, dass die Kosten für die Produktion der Enzymlösung im industriellen Großmaßstab gesenkt werden können. Für dieses Szenario werden daher 2 Szenarien berechnet:

Szenario 1: Die Kosten für die Enzymherstellung können um den Faktor 2 von 154€/kg auf 75€/kg gesenkt werden.

Szenario 2: Die Kosten für die Enzymherstellung können um den Faktor 5 von 154€/kg auf 30€/kg gesenkt werden.

Abbildung 14: Das Ökoeffizienzportfolio für Fallbeispiel 1

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Abbildung 15: Szenariovergleich - Ökoeffizienzportfolio

Es zeigt sich in Abbildung 15, dass eine Halbierung des Preises in Szenario 1 die Ökoeffizienz des biotechnologischen Verfahrens verbessert, jedoch noch nicht dieselbe Ökoeffizienz erreicht, wie die chemische Alternative. Eine Reduzierung um den Faktor 5 für die Kosten der Enzymherstellung platziert diese Alternative direkt als ökoeffizienteste Alternative im Portfolio. Die Szenarioanalyse verdeutlicht, dass das biotechnologische Verfahren die ökoeffizientere Variante werden kann, wenn die Kosten für die Enzymherstellung um etwas mehr als den Faktor 2 gesenkt werden können. Zusammenfassend können folgende Schlussfolgerungen getätigt werden:

Die hohen Temperaturen im Spülvorgang von 90/70/20°C konnten von 40°C/20°C/20°C reduziert werden. Damit spart das enzymatische Verfahren rund 50% an benötigter Wärmemenge ein.

Zudem kann dadurch der Wasserbedarf an Spülwasser um 30% reduziert werden. Das enzymatische Verfahren verbessert die Reinigungsleistung um 10%. Die Inkubationszeit konnte um 98% auf nur 1 Stunde reduziert werden (chemisches

Verfahren 48h)

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5 Fallbeispiel 2: Im 2. Fallbeispiel wird mit einem konventionellen und einem neuen, biotechnologischen Verfahren die hydrophobe Struktur von PET-Fasern dahingehend modifiziert, dass hydrophilere Eigenschaften geschaffen werden. Die so behandelten PET-Materialien können dadurch für die Herstellung von funktionaler Kleidung verwendet werden. In diesem Fallbeispiel sollen im Anschluss an die Behandlung der PET-Filmoberflächen diese mit metallischen, leitfähigen Tinten mittels Ink-Jet-Print-Sytem bedruckt werden. Die Ökoeffizienzanalyse vergleicht dabei das enzymatische Verfahren zur Vorbehandlung der PET-Filme mit einem konventionellen Verfahren.

5.1 Prozessbeschreibung Eine traditionelle Methode zur Schaffung von hydrophilen Eigenschaften ist eine alkalische Behandlung. Damit wird die PET-Oberfläche angegriffen und polare Gruppen installiert sowie die Benetzbarkeit der Oberfläche erhöht. Dieses Verfahren kann zu verschiedenen Nachteilen führen, wie zum Beispiel Grübchenbildung oder Gewichtsverlust, welche die mechanischen Eigenschaften des Materials verändern können. Leider konnte dies in diesem Projekt für die Ökoeffizienz-Analyse nicht quantifiziert werden. Während die konventionelle Behandlung des PET-Films mit einer 1,5 molaren Natronlauge bei 65 °C in 1,5h durchgeführt wird, kann dies bei der enzymatischen Behandlung unter milderen Bedingungen von 40°C in 1h stattfinden. Folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die Bedingungen beider Verfahren:

Alkalisches Verfahren Enzymatisches Verfahren Inkubation 1,5 molare Natronlauge Enzymlösung

(Evo-Hydrolase, 80 Units) Prozesstemperatur 65°C 40°C Prozessdauer 1,5 h 1 h Waschvorgänge 1 Waschvorgänge mit

entionisiertem Wasser

1 Waschvorgang mit SDS-Lösung, 1 Waschvorgang mit entionisiertem Wasser

Verhältnis Film zu Flüssigkeit

1 g / 40 ml 1g / 40 ml

5.2 Systemgrenzen In diesem Fallbeispiel werden nur die beiden Verfahren zur PET-Film-Oberflächenmodifikation betrachtet. Die anschließenden Trocknungs- und Inkjet-Printing -Verfahren sind nicht Teil dieser Analyse, da diese in diesem Vergleich identisch sind. Wie im 1. Fallbeispiel sollen hier nur die Unterschiede beider Verfahren herausgearbeitet werden. Abbildung 16 und 17 zeigen die beiden Verfahren in der Übersicht als Sankeydiagramm. Die betrachteten Prozesse sind.

Bereitstellung Dampf Bereitstellung Wasser Produktion Tensid

Natriumlaurylsulfat (SDS)

Produktion der Enzyme PET-Film Behandlung Abwasserbehandlung

- 17 -

Für die Produktion des Tensids SDS wurde kein eigener Datensatz in der ecoinvent Datenbank gefunden. Es wurde daher der Datensatz Fettalkoholsulfat als anionisches Tensid ausgewählt, da SDS zu der Gruppe der Fettalkoholsulfate gehört. In diesem DBU-Projekt wurden verschiedene Enzyme untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass Evo-Hydrolase von der Evocatal GmbH sehr effektiv ist, die PET-Oberfläche hinsichtlich einer guten Benetzbarkeit zu modifizieren. Aus zeitlichen Gründen konnte die Produktion von Evo-Hydrolase in diesem Projekt nicht in Umberto NXT modelliert werden. Deswegen wurde auf das Modell zur Herstellung von TfCut2 zurückgegriffen. Beide Enzymherstellungsverfahren finden am selben Produktionsort statt und sind laut Aussage der evocatal GmbH vergleichbar. Die PET-Film Behandlung erfolgt nach den unter 5.1 gemachten Angaben.

5.3 Funktionelle Einheit Die funktionelle Einheit ist die Herstellung von 1000 kg oberflächenmodifizierter PET-Filmen.

5.4 Aufbau der Ö kobilanz-Modelle Die Modellierungen der Stoff- und Energieströme beider Alternativen wird in den nachfolgenden Kapiteln behandelt. Im Vergleich zu dem ersten Fallbeispiel werden beide Verfahren im Labormaßstab durchgeführt. Dies führt zu recht hohen Massenströmen in diesem Beispiel. Die Vorbehandlung besteht nur aus einem Prozessschritt. Deswegen ist die Darstellung des Prozesses zur PET-Film Behandlung wesentlich einfacher als die aus dem ersten Fallbeispiel (PET-Textil – Reinigung). Für die Kostenkalkulation wurden folgende Preise angenommen:

Dampf: 0,02€/MJ Enzymlösung: 154€/kg SDS-Tensid: 2€/kg Natriumhydroxid: 0,1€/kg Leitungswasser: 0,002€/kg Entkalktes Wasser: 0,004€/kg Deionisiertes Wasser: 0,004€/kg

Die angenommenen Preise wurden der Sabento-Datenbank entnommen. Der Preis für das SDS Tensid orientiert sich an der Angabe zum NH-Tensid aus dem 1. Fallbeispiel (Bulkabnahme). 5.4.1 Alkalische Vorbehandlung

Die unter Kapitel 5.1 aufgeführten Angaben konnten in ein Umberto-Modell übertragen werden. Demnach benötigt der konventionelle Schritt zur Behandlung von 1000 kg PET-Film 1,5 molare Natronlauge ungefähr 4.800 kg Natriumhydroxid und 80.000 Liter deionisiertes Wasser. Die hohe Wassermenge ergibt sich aus dem Inkubationsprozess und dem

- 18 -

anschließenden Waschprozess. In beiden Prozessen werden Feststoff- Flüssigverhältnisse von 1g zu 40ml angegeben. Dazu werden ca. 9.500 MJ an Dampf benötigt, um die Wassertemperatur von 8°C auf 65°C zu erhöhen. Abbildung 16 zeigt den konventionellen Prozess als Sankey-Diagramm.

Abbildung 16: Übersicht Modellaufbau des chemischen Verfahrens

5.4.2 Enzymatische Vorbehandlung

Wie unter Kapitel 5.1 beschrieben, wird gegenüber dem alkalischen Verfahren ein zweiter Waschprozess mit dem Tensid SDS benötigt. Dementsprechend hoch ist der Wasserbedarf beim enzymatischen Verfahren mit 118.000 Litern. Die 10%ige Tensid-Lösung führt mit dem Feststoff-Flüssigkeitsverhältnis von 1 g: 40 ml zu insgesamt 4.000 kg SDS-Bedarf. Die benötigte Dampfmenge um von die Wassertemperatur von 8°C auf 40°C zu erhitzen, beträgt knapp 5.400 MJ.

Abbildung 17: Übersicht Modellaufbau des enzymatischen Verfahrens

- 19 -

5.5 Ergebnisse

5.5.1 Umweltbewertung

Die Abbildung 18 zeigt die Ergebnisse der Wirkungsabschätzung. Der enzymatische Prozess schneidert in fast allen Wirkungskategorien schlechter ab, als der chemische Prozess. Wie auch Abbildung 20 zeigt, wird dieses Ergebnis dominiert von der SDS-Produktion. Der höhere Wert für die benötigte landwirtschaftliche Fläche wird beim enzymatischen Prozess vor allem für die Bewirtschaftung der Palmen zur Palmölgewinnung (SDS Produktion) verursacht. Der SDS-Datensatz hat zudem einen großen Einfluss auf die höheren Werte in den Wirkungskategorien Treibhauspotential, fossiler Rohstoffverbrauch, Humantoxizität sowie Wasserverbrauch. Der etwas höhere Wert bei der ionisierenden Strahlung geht hauptsächlich auf die benötigte Stromproduktion für die Enzymproduktion zurück.

Abbildung 18: Die ReCiPe – Wirkungsanalyse für das 2. Fallbeispiel

Die Verteilung der Umweltbewertungspunkte im chemischen Prozess zeigt Abbildung 19. Es wird deutlich, dass über 85% der Umweltbewertungszahl durch die Produktion von Natronlauge verursacht wird.

- 20 -

Abbildung 19: ReCiPe Umweltbewertungspunkte des chemischen Verfahrens

Die Abbildung 20 zeigt die Verteilung der Umweltbewertungspunkte auf den enzymatischen Prozess. Es wird deutlich, dass durch die SDS-Tensid Herstellung mehr als 83% der gesamten Umweltbewertungspunkte verursacht werden. Die Enzymproduktion ist hier nur mit ca 13% an der gesamten Umweltpunktzahl beteiligt.

Abbildung 20: ReCiPe Umweltbewertungspunkte des enzymatischen Verfahrens

Im direkten Vergleich wird deutlich, dass der chemische Prozess mit 979 Punkten fast 2,5-mal so „gut“ abschneidet, wie das enzymatische Verfahren mit 2.591 Punkten.

- 21 -

5.5.2 Ö koeffizienz-Portfolio Das Ökoeffizienz-Portfolio in Abbildung 21 zeigt sehr deutlich, dass der chemische Prozess ökoeffizienter ist, als der enzymatische. Mit einer Umweltbewertungs-zahl von 979 Punkten schneidet der chemische Prozess knapp 2,5-mal so „gut“ ab, wie der enzymatische Prozess mit 2.591 Punkten. Beim enzymatischen Ver-fahren belaufen sich die Kosten auf ca. 318.000 €, während für das chemische Verfahren nur gerade 1.000€ für die Behandlung von 1.000 kg PET-Film anfallen. Hauptverursacher ist mit 308.000 € die Enzymlösung. Damit ist auch aus Kostensicht der chemische Prozess wesentlich günstiger. Allerdings befindet sich der enzymatische Prozess noch im Entwicklungsstadium. Es ist davon auszugehen, dass durch weitere Prozessentwicklungen das enzymatische Verfahren optimiert werden kann. Deswegen sollen im folgenden Kapitel noch 2 Szenarien betrachtet werden. 5.5.3 Szenario-Analyse

Es wurden für die Ergebnisdiskussion noch 2 Szenarien aufgestellt.

Enzym Szenario SDS: Die Tensidlösung kann im Zuge der Prozessentwicklung von einer 10%igen zu einer 2%igen Lösung optimiert werden

Enzym Szenario SDS + Faktor 5: Das Szenario SDS wird erweitert. Zusätzlich werden die Kosten für die Enzymherstellung um den Faktor 5 von 154€/kg auf 30 €/kg gesenkt. Da die Enzyme zurzeit in einem relativ kleinen Fermenter produziert werden, kann davon ausgegangen werden, dass Kosten für die Enzymproduktion noch wesentlich gesenkt werden können.

Abbildung 21: Ökoeffizienz-Portfolio für das 2. Fallbeispiel

- 22 -

Abbildung 22: Szenario-Analyse für das 2. Fallbeispiel

Die Szenario-Analyse zeigt, dass beide Annahmen die Performance des biotechnologischen Prozesses wesentlich verbessern können. In Abbildung 23 ist zu erkennen, dass allein durch die Reduzierung der SDS Konzentration von 10% auf 2% die Umweltbewertungszahl von 2591 auf 860 Punkte gesenkt werden konnte. Eine Realisierbarkeit vorausgesetzt, wäre das enzymatische Verfahren aus ökologischer Sicht nun nur noch knapp 7 Prozent schlechter. Jede weitere Optimierung bezüglich Enzym- bzw. SDS Verbrauch würde den enzymatischen Prozess zusätzlich verbessern. Dabei ist zu berücksichtigen, dass der Datensatz zur Enzymherstellung mit einer Unsicherheit behaftet ist. Für die Enzymherstellung von Evo-Hydrolase wurde mit dem Datensatz von TfCut2 gerechnet. Auch wenn die Umweltbewertung durch den Bedarf an SDS Lösung unter den getroffenen Annahmen dominiert wird, sollte dieser Datensatz im Hinblick auf eine höhere Datenqualität näher analysiert werden.

- 23 -

Abbildung 23: Die ReCiPe-Bewertungspunkte für das Szenario SDS + Faktor 5

Zusammenfassend können folgende Schlussfolgerungen für das 2. Fallbeispiel getätigt werden:

Das chemische Verfahren bleibt in dieser Analyse im Vergleich zu 3 biotechnologischen Szenarien die ökoeffizientere Variante.

Wichtig: Das chemische Verfahren kann die Mikrostruktur der PET-Oberfläche beschädigen. Diese qualitative Beeinträchtigung der PET-Oberfläche konnte in diesem Projekt nicht quantifiziert werden. Deswegen kann von einer weiteren Verbesserung der Ökoeffizienz ausgegangen werden. Das Ökoeffizienz-Portfolio stellt nur eine Momentaufnahme des bisherigen Erkenntnisgewinns in diesem Projekt dar (Labormaßstab).

Eine wichtige Stellschraube zur Optimierung des biotechnologischen Prozesses ist die benötigte Menge an SDS im Waschprozess. Der enzymatische Prozess kann seine Ökoeffizienz aus Umweltsicht im Wesentlichen durch eine Optimierung der SDS-Konzentration im zusätzlichen Waschprozess von 10% auf 2% stark verbessern (Szenario SDS). Dadurch würde auch die Unsicherheit bezüglich des angenommenen Preises sinken.

Der Preis für die Enzymlösung ist sehr hoch. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die Kosten für die Produktion der Enzymlösung im industriellen Großmaßstab gesenkt werden können (Szenario SDS + Faktor 5). Durch eine Umsetzung des Verfahrens in einen großtechnischen Prozesses können zudem die Umweltbelastungen weiter reduziert werden.

Durch die milderen Temperaturen bei der Vorbehandlung der PET-Filme im biotechnologischen Verfahren kann in diesem Prozess zur Vorbehandlung von PET-Filmen knapp 40% Energie in Form von Dampf eingespart werden.

Der Wasserbedarf ist im biotechnologischen Verfahren aufgrund der zusätzlichen

- 24 -

Spülung um 50% höher. Es ist zu prüfen, inwieweit 2 Spülvorgänge hier notwendig sind bzw. inwieweit hier der Wasserbedarf reduziert bzw. wiederverwertet werden kann.

5.6 Zusammenfassung und Diskussion Bei der Durchführung von Ökoeffizienz-Analysen in Prozessentwicklungs-Projekten muss mit Datenlücken und Unsicherheiten umgegangen werden. In diesem Bericht wurden zwei Ökoeffizienz-Analysen durchgeführt. In beiden Analysen gab es Schwierigkeiten bei der Datenerhebung und einige Annahmen mussten getroffen werden. Dennoch lieferte die Ökoeffizienz-Analyse gute Ergebnisse, da in beiden Analysen Stellschrauben mit großen Einflüssen auf das Endergebnis gefunden werden konnten. Die Ökoeffizienz-Analyse soll Entscheidungsprozesse bei der Prozessentwicklung mit Umwelt- und Kosteninformationen unterstützen, sie soll dabei nicht absolut genaue Umweltkennzahlen liefern. Dies ist in beiden Fallbeispielbewertungen gelungen. Zunächst hat in beiden Fallbeispielen das chemische Verfahren ökoeffizienter abgeschnitten. Jedoch konnte gezeigt werden, dass durch bestimmte Annahmen in den Szenario-Analysen die Ökoeffizienz der biotechnologischen Verfahren wesentlich verbessert werden konnte. Stellschrauben sind aus ökonomischer Sicht insbesondere die Kosten für die Enzymproduktion, aus ökologischer Sicht kann in beiden Fällen die Einsatzmenge an Enzymen einen wesentlichen Beitrag zur Verbesserung der Ökoeffizienz liefern. Im 2. Fallbeispiel wurde durch den Einsatz eines weiteren Tensids in einem zusätzlichen Waschgang zwar die Leistung des biotechnischen Verfahrens stark verbessert, jedoch die Umweltwirkung wesentlich verschlechtert. Aufgrund der Durchführung des 2. Fallbeispiels im Labormaßstab sind hier jedoch noch hohe Optimierungspotentiale zu erwarten.

6 Literaturverzeichnis BenningerGroup (2010): Carbon Footprint Report Switzerland. verfügbar unter:

http://www.benningergroup.com/de/textilveredlung/carbon-footprint/ (zuletzt abgerufen am 22.01.2014) Bruijn, H.; Duin, R.; Huijbregts, M.; Guinee, J.; Gorree, M.; Heijungs, R. (2004): Handbook on Life Cycle Assessment:

Operational Guide to the ISO Standards. Kluwer Academic Publishers, Dodrecht, Netherlands. Goedkoop, M.;Spriensma, R. (2001): The Eco-indicator 99: A damage oriented method for Life Cycle Impact Assessment.

Methodology Report. Leiden, Netherlands. Heinzle, E.; Hungerbühler, K. (1997).Chimia 5, 176 International Organization for Standardization (2006): Environmental management - Life cycle assessment - Principles and

framework (ISO 14040). Beuth Verlag. Berlin, Germany. International Organization for Standardization (2006): Environmental management - Life cycle assessment - Requirements and

guidelines (ISO 14044). Beuth Verlag, Berlin, Germany. Agrawal, P. (2014) Chembiotech Project, 18th Month Status Report Bio-catalytic modification of polyester fibre surfaces for

manufacturing of innovative textiles. Enschede/TheNetherlands

Wei et al. AMB Express 2014, 4:44http://www.amb-express.com/content/4/1/44

RESEARCH ARTICLE Open Access

Functional characterization and structuralmodeling of synthetic polyester-degradinghydrolases from Thermomonospora curvataRen Wei, Thorsten Oeser, Johannes Then, Nancy Kühn, Markus Barth, Juliane Schmidt and Wolfgang Zimmermann*

Abstract

Thermomonospora curvata is a thermophilic actinomycete phylogenetically related to Thermobifida fusca thatproduces extracellular hydrolases capable of degrading synthetic polyesters. Analysis of the genome of T. curvataDSM43183 revealed two genes coding for putative polyester hydrolases Tcur1278 and Tcur0390 sharing 61%sequence identity with the T. fusca enzymes. Mature proteins of Tcur1278 and Tcur0390 were cloned and expressedin Escherichia coli TOP10. Tcur1278 and Tcur0390 exhibited an optimal reaction temperature against p-nitrophenylbutyrate at 60°C and 55°C, respectively. The optimal pH for both enzymes was determined at pH 8.5. Tcur1278retained more than 80% and Tcur0390 less than 10% of their initial activity following incubation for 60 min at 55°C.Tcur0390 showed a higher hydrolytic activity against poly(ε-caprolactone) and polyethylene terephthalate (PET)nanoparticles compared to Tcur1278 at reaction temperatures up to 50°C. At 55°C and 60°C, hydrolytic activity againstPET nanoparticles was only detected with Tcur1278. In silico modeling of the polyester hydrolases and docking with amodel substrate composed of two repeating units of PET revealed the typical fold of α/β serine hydrolases with anexposed catalytic triad. Molecular dynamics simulations confirmed the superior thermal stability of Tcur1278 consideredas the main reason for its higher hydrolytic activity on PET.

Keywords: Polyester hydrolase; Synthetic polyester; Polyethylene terephthalate (PET); Thermomonospora curvata

IntroductionThe widespread use of synthetic polyesters such as poly-ethylene terephthalate (PET) in industry and daily life hasresulted in serious environmental pollution over the lastdecades. However, the recycling of PET by chemicalmethods performed under extreme temperature and pHconditions is an energy-consuming process (Paszun andSpychaj 1997). Recently, alternative processes using bioca-talysis have been proposed for recycling and surface func-tionalization of PET (Müller et al. 2005; Zimmermann andBillig 2011). Microbial enzymes capable of degradingPET have been previously described from various fun-gal (Egmond and de Vlieg 2000; Alisch et al. 2004;Alisch-Mark et al. 2006; Nimchua et al. 2007; Ronkvistet al. 2009) and bacterial (Müller et al. 2005; Eberl et al.2009; Herrero Acero et al. 2011; Ribitsch et al. 2012a;

* Correspondence: wolfgang.zimmermann@uni-leipzig.deDepartment of Microbiology and Bioprocess Technology, Institute ofBiochemistry, University of Leipzig, Johannisallee 21-23, D-04103 Leipzig,Germany

© 2014 Wei et al.; licensee Springer. This is anAttribution License (http://creativecommons.orin any medium, provided the original work is p

Ribitsch et al. 2012b; Sulaiman et al. 2012; Kitadokoroet al. 2012; Chen et al. 2010; Oeser et al. 2010) sources.Enzymes with high PET-hydrolyzing activity are mostlyextracellular proteins secreted by thermophilic microor-ganisms such as Thermomyces insolens (Ronkvist et al.2009) and several Thermobifida species (Müller et al.2005; Eberl et al. 2009; Herrero Acero et al. 2011; Ribitschet al. 2012a; Ribitsch et al. 2012b; Kitadokoro et al. 2012;Chen et al. 2010; Oeser et al. 2010). The biodegradabilityof PET by these enzymes has been shown to stronglydepend on the flexibility of polymer chains that is directlyinfluenced by the hydrolysis reaction temperatures(Ronkvist et al. 2009; Wei et al. 2013).Thermomonospora curvata DSM 43183, a facultative

aerobic thermophilic actinomycete, has been isolatedfrom composts containing plant materials (Henssen 1957;Henssen and Schnepf 1967; Chertkov et al. 2011). The op-timal growth temperature of T. curvata is 50°C (Henssenand Schnepf 1967) at a wide range of pH from 7.5 to 11(Chertkov et al. 2011). Weak growth of T. curvata has

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Wei et al. AMB Express 2014, 4:44 Page 2 of 10http://www.amb-express.com/content/4/1/44

been also observed at higher temperatures up to 65°C(Henssen and Schnepf 1967). The phylogenetic analysisof T. curvata revealed a distant relationship to otherthermophilic actinomycetes isolated from a similarhabitat including Thermobifida fusca and Thermobifidaalba, as indicated by a lower level of 16S rRNA se-quence similarity between 89% and 90% (Henssen 1957;Zhang et al. 1998; Chertkov et al. 2011). Several ofthese bacteria have been shown to express extracellularenzymes with polyester-hydrolyzing activity (Kleeberget al. 1998; Alisch et al. 2004; Herrero Acero et al. 2011;Thumarat et al. 2012; Ribitsch et al. 2012b).In this study, we report the identification of two genes

coding for the polyester hydrolases Tcur1278 andTcur0390 by genome mining of T. curvata DSM43183(Chertkov et al. 2011), the characterization of their cata-lytic properties and thermal stability, as well as the mod-eling and analysis of their three-dimensional structures.

Materials and methodsCloning, expression and purification of Tcur1278 andTcur0390The genes encoding Tcur1278 and Tcur0390 without theGram-positive secretion signal peptides were selectedfrom the annotated genome sequences of T. curvataDSM43183 (Chertkov et al. 2011). Synthetic gene con-structs with adapted codon usage to E. coli (GeneartGmbH, Regensburg, Germany) for Tcur1278 [EMBL:HG939554] and Tcur0390 [EMBL: HG939555] were ap-plied for direct cloning into the pBAD TOPO expressionvector (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, USA).The recombinant expression of T. curvata hydrolaseswas carried out in One Shot E. coli TOP10 (Invitrogen)at room temperature for 14 h in lysogeny broth (LB)containing 0.2% (m/v) of L-arabinose as inducer as de-scribed previously (Oeser et al. 2010). Bacterial cellswere harvested by centrifugation and resuspended in alysis buffer containing 50 mM phosphate (pH 8) and300 mM NaCl. After sonication, the soluble cell extractswere subjected to immobilized metal ion affinity chro-matography (IMAC) using Ni-NTA columns (Qiagen,Hilden, Germany). The protein elutions containing the re-combinant hydrolases were separated by SDS PAGE andanalyzed by esterase activity-staining with 1-naphthylacetate and Fast Red dye (Sztajer et al. 1992) as well as bystaining with Coomassie Brilliant Blue.

Determination of esterase activityEsterase activity was determined with p-nitrophenyl butyr-ate (pNPB) as a substrate in a microplate format (BioTekPowerWave XS, BioTek Instruments Inc., Winooski, USA)(Billig et al. 2010). To avoid the adsorption of proteins tothe plastic vials, the dilution was carried out in the pres-ence of 15% poly(ethylene glycol) (PEG6000, Sigma-Aldrich

Co., St. Louis, USA) in Davies buffer (Davies 1959) be-tween pH 6.5 and 9.5 or in 100 mM Tris-HCl. One unit ofesterase activity was defined as the amount of enzyme re-quired to hydrolyze 1 μmol pNPB per min (Alisch et al.2004). To investigate their thermal stability, 250 μg/mL ofenzymes were incubated in 100 mM Tris buffer (pH 8.5) at50°C, 55°C and 60°C for up to 1 h. Residual esterase activ-ity against pNPB was determined at 25°C in triplicate. TheMichaelis-Menten kinetic constants for the hydrolysis ofpNPB by Tcur1278 and Tcur0390 were determined at 25°Cand pH 8.5.

Enzymatic hydrolysis of polyester nanoparticlesThe enzymatic hydrolysis of polyesters was analyzed bymonitoring the change of turbidity of a polyester nano-particle suspension at 600 nm (Wei et al. 2013). Poly(ε-caprolactone) (PCL) and PET nanoparticles were pre-pared by a precipitation and solvent evaporation tech-nique from amorphous PCL (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, USA) and low-crystallinity PET film (GoodfellowGmbH, Bad Nauheim, Germany) dissolved in acetoneand 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, respectively. Theenzymatic hydrolysis of PCL was performed in a micro-plate format (BioTek PowerWave XS) at 49°C with0.22 mg/mL of PCL nanoparticles in each well, whereasthe enzymatic hydrolysis of PET was performed at 50°Cto 60°C in cuvettes containing 0.25 mg/mL of PET nano-particles immobilized in 0.9% agarose gel. The change ofturbidity was monitored over an incubation period of15 min at 1 min intervals for PCL hydrolysis, whereas PEThydrolysis was determined for 60 min at 5 min intervals.The initial degradation rates were defined as the squareroots of turbidity decrease during the initial linear phase ofthe hydrolysis, and plotted as a function of enzyme con-centration using a kinetic model (Eq. 1) modified fromWei et al. (2013)

dffiffiffi

τpð Þdt

¼ kτKA E½ �1þ KA E½ � ð1Þ

where τ is the turbidity of a nanoparticle suspension, t,the reaction time, kτ, the hydrolysis rate constant basedon the turbidity change, KA, the adsorption equilibriumconstant, and [E], the enzyme concentration.

Homology modeling and molecular dockingHomology modeling of T. curvata polyester hydrolaseswas carried out using the Phyre2 web server (Kelley andSternberg 2009) based on the crystal structure of T. albaAHK 119 (Est119, PDB ID: 3VIS) (Kitadokoro et al. 2012).The sequence identity of T. curvata polyester hydrolaseswith the corresponding template structure is summarizedin Table 1 and Additional file 1: Figure S1.

Table 1 Sequence identity (in percent, upper right part)and the root-mean-square deviation (RMSD) of Cα atoms(in Å, lower left part) of T. curvata polyester hydrolasesin comparison with the crystal structure of homologousT. alba Est119 (PDB ID: 3VIS)

Identity (%)

RMSD (Å) Tcur1278 Tcur0390 T. alba Est119

Tcur1278 82.2 61.7

Tcur0390 0.11 61.7

T. alba Est119 0.85 0.83

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The molecular docking program GOLD version 5.1(Cambridge Crystallographic Data Centre, Cambridge,UK) (Jones et al. 1997) was used to study the substrate-binding pocket of T. curvata polyester hydrolases. Thepolyester model substrate 2PET composed of 2 repeatingunits of PET (bis 2-hydroxyethyl terephthalate, BHET)was constructed with the software MOE (ChemicalComputing Group, Montreal, Canada). The central esterbond of 2PET was constrained in the oxyanion holecomposed of the main chain NH groups of amino acidresidues F62 and M131 with the correct orientation toform a tetrahedral intermediate based on the catalyticmechanism of ester hydrolases (Jaeger et al. 1999). Theother atoms of 2PET were allowed to be flexible for aconformation to be docked to the rigid protein struc-tural model by a genetic algorithm (Jones et al. 1997).Based on the default scoring function of GOLD, the top-ranked productive docking conformations in accordancewith the catalytic mechanism of ester hydrolases (Jaegeret al. 1999) were selected for the illustrations generatedby the MOE software.

Molecular dynamics simulationsThe molecular dynamics (MD) simulations were carriedout using GROMACS 4.6 (Groningen University, TheNetherlands) (Hess et al. 2008) in the Amber99SB forcefield (Hornak et al. 2006) in explicit solvent. Proteinstructural models of both T. curvata polyester hydrolaseswere centered in a cube with a distance of ≥1.0 nm fromeach edge as the starting structures. The steepest descentmethod was applied to perform energy minimization untila maximum force (Fmax) of less than 1000 kJ/mol/nm wasreached. The system was equilibrated for 100 ps by aposition-restrained simulation at the desired temperaturesin the isothermal-isobaric (NPT) ensemble. The isotropicpressure coupling using the Berendsen algorithm was ap-plied with a reference pressure of 1.0 bar (Berendsen et al.1984). For each protein structure, three independent simu-lations were performed under equilibration conditions for50 ns in 2 fs steps at 298 K (25°C) and 353 K (80°C), re-spectively. To analyze the thermal stability of the polyesterhydrolases, the time course of the root-mean-square

deviation (RMSD) of backbone structures and the root-mean-square fluctuation (RMSF) of Cα atoms of eachamino acid residue over the complete 50 ns simulationwere calculated using GROMACS 4.6 (Hess et al. 2008).

ResultsCloning, expression and purification of Tcur1278 andTcur0390Synthetic genes encoding Tcur1278 and Tcur0390 wereamplified in the pBAD-TOPO expression vector (Invi-trogen) for recombinant expression in One Shot E. coliTOP10 (Invitrogen). Following an expression period of14 h at 25°C and the subsequent IMAC purification,2.5 mg of Tcur1278 and 2.9 mg of Tcur0390 were ob-tained from a 500 mL culture with a specific activity of 3.0U/mg and 17.9 U/mg against pNPB, respectively. By SDSPAGE analysis, both T. curvata hydrolases were obtainedas single bands with esterase activity against 1-naphthylacetate, corresponding to an apparent molecular mass ofapproximately 35 kDa (Additional file 1: Figure S2).

Effect of pH and temperature on the hydrolytic activity ofTcur1278 and Tcur0390The effect of pH on the hydrolytic activity of Tcur1278and Tcur0390 was investigated against pNPB in a pHrange from 6.5 to 9.5 (Figure 1A). Both enzymes dis-played an optimal pH at pH 8.5 and still retained morethan 60% of their maximum activity at pH 9.5.The effect of temperature on the hydrolytic activity of

both enzymes was assayed against pNPB in a temperaturerange from 30°C to 70°C (Figure 1B). Tcur1278 andTcur0390 showed an optimal temperature at 60°C and 55°C,respectively.

Thermal stability of Tcur1278 and Tcur0390The stability of Tcur1278 and Tcur0390 at 50°C, 55°Cand 60°C was investigated at pH 8.5 over a period of60 min by monitoring the residual activities againstpNPB (Figure 2A-B). Tcur1278 showed a higher thermalstability compared to Tcur0390 retaining more than 80%of its initial activity following incubation for 60 min at50°C and 55°C. At 60°C, approximately 65% loss of its ini-tial activity was detected following incubation for 10 min.In contrast, Tcur0390 showed a residual activity of only40% following incubation for 60 min at 50°C and of 15%following incubation for 10 min at 55°C and 60°C.

Kinetic analysis of the hydrolysis of pNPB by Tcur1278and Tcur0390Based on the Michaelis-Menten kinetic model, Tcur0390revealed an almost 6-fold higher kcat and no significantlylower Km than Tcur1278 for pNPB hydrolysis indicatinga higher hydrolytic activity of Tcur0390 against the sol-uble pNPB compared to Tcur1278 (Table 2).

60

80

100

120

acti

vity

(%

)

A

0

20

40

0 10 20 30 40 50 60 70

Res

idu

al

Time (min)

100

120B

80

100

ty (

%)

60

80

acti

vit

40si

du

al

20Res

0

0 10 20 30 40 50 60 700 10 20 30 40 50 60 70

Time (min)

Figure 2 Thermal stability performance of Tcur1278 and Tcur0390.The residual hydrolytic activity was determined with (A) Tcur1278 and(B) Tcur0390 against pNPB over a period of 1 h at 50°C (solid line),55°C (broken line) and 60°C (dotted line). Error bars indicate thestandard deviation of three determinations.

Table 2 Kinetic parameters for pNPB hydrolysis byTcur1278 and Tcur0390 at 25°C and pH 8.5

Tcur1278 Tcur0390

Km (μM) 88.8 ± 12.8 83.1 ± 11.1

kcat (1/s) 2.3 ± 0.1 12.4 ± 0.4

100

120A

80y (%

)

60acti

vit

40ativ

ea

20

Rel

06 6 5 7 7 5 8 8 5 9 9 5 106 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10

pH

100

120B

80

100

y (%

)

60

80

acti

vit

40ativ

e

20

Rel

025 30 35 40 45 50 55 60 65 70 7525 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Temperature (°C)

Figure 1 Effects of pH and temperature on the hydrolytic activityof Tcur1278 and Tcur0390. Activities of Tcur1278 and Tcur0390 againstpNPB at different (A) pH and (B) reaction temperature conditions areshown as broken and solid lines, respectively. Error bars indicate thestandard deviation of three determinations.

Wei et al. AMB Express 2014, 4:44 Page 4 of 10http://www.amb-express.com/content/4/1/44

Kinetic analysis of the hydrolysis of PCL nanoparticles byTcur1278 and Tcur0390A PCL nanoparticle suspension with a concentration of0.22 mg/mL was completely hydrolyzed following incuba-tion for 15 min at 49°C with 20 μg/mL of Tcur0390 or30 μg/mL of Tcur1278 (data not shown). The kinetic ana-lysis of the hydrolysis of PCL nanoparticles was thereforeperformed at enzyme concentrations up to 20 μg/mL and30 μg/mL for Tcur0390 and Tcur1278, respectively. The hy-drolysis rates of PCL nanoparticles calculated from thesquare roots of turbidity decrease are shown as a functionof enzyme concentration (Figure 3A-B). By fitting the ex-perimental data to Eq. (1), the kinetic constants for the PCLnanoparticle hydrolysis by the two enzymes were deter-mined (Table 3). Compared to Tcur1278, Tcur0390 showeda 2.3-fold higher adsorption equilibrium constant (KA) andno significantly higher hydrolysis rate constant (kτ).

Kinetic analysis of the hydrolysis of PET nanoparticles byTcur1278 and Tcur0390The enzymatic hydrolysis of PET nanoparticles by Tcur1278and Tcur0390 was investigated at pH 8.5 and temperaturesof 50°C, 55°C and 60°C (Figure 3C-F). Due to the lower

thermal stability of Tcur0390 (Figure 2B), a hydrolyticactivity at 55°C and 60°C was not detected. At 50°C, amaximum hydrolysis rate (d

ffiffiffi

τpð Þ=dt ) of 3.3 × 10-3 min-1

and 5.9 × 10-3 min-1 was determined with 80 μg/mL ofTcur1278 and 20 μg/mL of Tcur0390, respectively. With50 μg/mL of Tcur1278, the hydrolysis rate was increased1.8-fold at 55°C and 2.6-fold at 60°C. Higher enzymeconcentrations exceeding the amount required for themaximum reaction rate resulted in lower hydrolysis rates.This effect has also been observed in the hydrolysis ofPET nanoparticles by TfCut2, a polyester hydrolase fromT. fusca, and has been attributed to the adsorption ofcatalytically inactive enzyme in excess to the monolayercoverage of the PET surface (Wei et al. 2013).Table 3 summarizes the kinetic constants for the

enzymatic PET nanoparticle hydrolysis by fitting the

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

dt

(1/m

in)

A

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0 5 10 15 20 25 30 35

-d(

1/2 )

/

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

0.08

0.09B

0 06

0.07

min

)

0.05

0.06

dt

(1/

0.03

0.04

d(

1/2 )

/

0 01

0.02

-

0

0.01

0 5 10 15 20 250 5 10 15 20 25

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

0.0035

0.004C

0.003

min

)

0.002

0.0025

dt

(1/

0.0015

d(

1/2 )

/

0.0005

0.001-

0

0 20 40 60 80 100 1200 20 40 60 80 100 120

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

0.007

0.008D

0.006

min

)

0.004

0.005d

t (1

/m

0.003

d(

1/2 )

/

0.001

0.002-

0

0 20 40 60 800 20 40 60 80

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

0 01

0.012E

0 008

0.01

min

)

0.006

0.008

dt

(1/

0.004

d(

1/2 )

/

0.002

-

0

0 20 40 60 800 20 40 60 80

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

0.007

0.008F

0.006

min

)

0.004

0.005

dt

(1/m

0.003

d(

1/2 )

/

0.001

0.002-

0

0 10 20 30 40 50 600 10 20 30 40 50 60

[E], Enzyme concentration (µg/mL)

Figure 3 Decomposition of polyester nanoparticles by T. curvata hydrolases. PCL hydrolysis by (A) Tcur1278 and (B) Tcur0390 at 49°C; PEThydrolysis by Tcur1278 at (C) 50°C, (D) 55°C and (E) 60°C, and by Tcur0390 at (F) 50°C. The initial rates of the square roots of turbidity decrease areplotted as a function of enzyme concentration (squares and diamonds). Error bars represent the standard deviation of duplicate determinations. Fitteddata (solid lines) according to Eq. (1) are also shown.

Wei et al. AMB Express 2014, 4:44 Page 5 of 10http://www.amb-express.com/content/4/1/44

experimental data to Eq. (1). Compared to Tcur1278, a1.7-fold higher kτ and a 3.9-fold higher KA were obtainedwith Tcur0390 at 50°C. With Tcur1278, the highest valuesof both kinetic constants were determined at 60°C.

In silico modeling of Tcur1278 and Tcur0390Structural models of Tcur1278 and Tcur0390 were gen-erated on the basis of the crystal structure of Est119from T. alba AHK119 (PDB ID: 3VIS) (Kitadokoro et al.

2012). Homology models of T. curvata polyester hydro-lases revealed a typical α/β hydrolase fold (Ollis et al.1992; Carr and Ollis 2009) with low RMSD values of Cα

atomic coordinates of less than 1 Å in comparison withthe template crystal structure (Table 1).Similar to TfCut2 from T. fusca KW3 (Wei 2011;

Herrero Acero et al. 2011), the catalytic triad of T. cur-vata polyester hydrolases formed by S130, D176 andH208 was found to be exposed to the solvent

Table 3 Kinetic parameters for polyester nanoparticle hydrolysis by Tcur1278 and Tcur0390 at 49°C to 60°C and pH 8.5

Polyester nanoparticles PCL PET

Temperature (°C) 49 50 55 60

Tcur1278KA (mL/mg) 41.1 ± 4.5 44.4 ± 8.6 24.3 ± 5.3 46.9 ± 12.1

kτ (10-3/min) 122.2 ± 11.9 4.1 ± 0.5 11.0 ± 1.2 11.8 ± 1.2

Tcur0390KA (mL/mg) 96.0 ± 9.8 172.7 ± 30.7 n. d. n. d.

kτ (10-3/min) 108.3 ± 5.7 7.0 ± 0.8 n. d. n. d.

n. d. = not detectable.

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(Figure 4A-B). By docking of the 2PET model sub-strate, the substrate-binding pocket could be identifiedas a large groove on the surface of Tcur1278 andTcur0390 (Figure 4C-F). The negative charge buried inthis major groove was contributed by the deprotonatedS130 (Figure 4C-D). As shown in Figure 4C-F, Tcur1278and Tcur0390 displayed similar surface properties in thevicinity of the active site with extended hydrophobic re-gions around the substrate-binding groove.

Molecular dynamics simulations of Tcur1278 and Tcur0390The overall Cα RMSD values for T. curvata polyester hy-drolases obtained by MD simulations at 298 K and 353 Kare shown as a function of simulation time (Figure 5A-B).In all simulations, the RMSD values for both proteins sta-bilized rapidly within 0.02 ns. At 298 K, the RMSD forTcur1278 showed values below 0.1 nm, slightly lower thanthe corresponding values for Tcur0390. At 353 K, theRMSD values for Tcur0390 fluctuated more strongly com-pared to Tcur1278. This effect was most pronounced after15 ns simulation time. The RMSD values for Tcur0390were almost doubled at 353 K compared to those obtainedat 298 K. In contrast, Tcur1278 exhibited only a slight in-crease in backbone structure deviations at 353 K furtherconfirming its superior thermal stability properties.The corresponding RMSF plots revealed the flexibility

profiles for the complete protein sequence (Figure 5C-D).Both the enzymes displayed a flexible N-terminus with thehighest deviation of Cα atoms contributed mainly by ashort helical part of the molecule (12-17) embedded inloop structures (2-11, 18-23). The high RMSF observed inthis part of the protein also affected the neighboring beta-sheet structure (24-30) and furthermore the whole en-zyme. Compared to Tcur1278, Tcur0390 showed generallya larger difference in the flexibility profiles obtained by theMD simulations performed at temperatures from 298 K to353 K. A significant increase of the RMSF values at highertemperatures was observed in the neighborhood of D176(172-180) with both enzymes. This resulted also in ahigher flexibility of H208 at 353 K due to its interactionwith D176 according to the catalytic mechanism of esterhydrolases (Jaeger et al. 1999). As a consequence, the dis-tance between the catalytic H208 and S130 (H-S) in-creased from 0.3 nm to 0.5 nm after 34 ns and 28 ns of

the MD simulation at 353 K with Tcur1278 and Tcur0390,respectively (Figure 5E-F). Compared to the RMSD plotshown in Figure 5A that suggested a relatively stable back-bone structure of Tcur1278 during the complete 50 nssimulation at 353 K, the permanent change of the H-S dis-tance occurred at an earlier stage prior to the denaturationof its other temperature-labile parts.

DiscussionBacterial polyester hydrolases have been previously de-scribed mainly from thermophilic Thermobifida species(Kleeberg et al. 1998; Alisch et al. 2004; Herrero Aceroet al. 2011; Thumarat et al. 2012; Ribitsch et al. 2012b;Oeser et al. 2010). T. curvata is a phylogenetically re-lated actinomycete that has been isolated from a similarhabitat (Henssen 1957; Zhang et al. 1998; Chertkov et al.2011). By genome mining of T. curvata DSM 43183(Chertkov et al. 2011), we identified two genes encodingthe proteins Tcur1278 and Tcur0390 with sequencessimilar to TfCut2 from T. fusca KW3 (Wei 2011; Her-rero Acero et al. 2011). As shown in the protein se-quence alignment (Simossis and Heringa 2005),Tcur1278 and Tcur0390 share a sequence identity ofabout 82% and both enzymes show a sequence identityof about 61% with TfCut2 (Additional file 1: Figure S1).Codon-optimized genes of Tcur1278 and Tcur0390

were synthesized for cloning and recombinant expres-sion in E. coli. When the pET-20b(+) vector (Novagen)was used for the recombinant expression of thecomplete proteins of Tcur1278 and Tcur0390 in E. coliBL21(DE3), no active proteins could be detected sug-gesting an interference of the original Gram-positive sig-nal peptides with the recombinant system. With thepBAD expression vector and E. coli TOP10 (Invitrogen)for shorter mature proteins, both T. curvata polyesterhydrolases could be expressed as active enzymes fusedwith a C-terminal His-tag and purified by affinity chro-matography (Additional file 1: Figure S2).Similar to homologous polyester hydrolases from T. fusca

(Chen et al. 2008; Wei 2011; Herrero Acero et al. 2011),Tcur1278 and Tcur0390 showed their highest activityagainst pNPB between pH 8 and pH 9 in a temperaturerange from 50°C to 60°C (Figure 1). Compared toTcur1278, Tcur0390 revealed a significantly higher

Figure 4 Structural modeling of Tcur1278 and Tcur0390 polyester hydrolases. Homology modeling was performed with the Phyre2 webserver (Kelley and Sternberg 2009). The catalytic triad of (A) Tcur1278 and (B) Tcur0390 is formed by S130, D176 and H208. The 2PET modelsubstrate was docked using GOLD 5.1 with its central ester bond constrained between 2.7 and 3.1 Å in the oxyanion hole formed by the mainchain NH groups of F62 and M131 (broken yellow lines). The hydrogen bonds stabilizing the tetrahedral intermediate formed during the catalyticreaction are shown as broken lines in blue. The backbone structures are shown as gray cartoons. The electrostatic surface properties of Tcur1278(C) and Tcur0390 (D) are shown with negatively charged residues in red, positively charged residues in blue and neutral residues in white/gray,respectively. The lipophilic surface properties of Tcur1278 (E) and Tcur0390 (F) are shown with hydrophilic residues in pink and hydrophobicresidues in bright green, respectively. The docked 2PET model substrate is shown in cyan.

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hydrolytic activity against both soluble (pNPB) and in-soluble substrates (polyester nanoparticles) at reactiontemperatures up to 50°C (Figure 3, Tables 2 and 3).This higher hydrolytic activity could be attributed tothe stronger substrate affinity of Tcur0390 (Table 3).Molecular docking experiments with the model sub-strate 2PET to the structural models of T. curvata poly-ester hydrolases confirmed the presence of extendedhydrophobic regions in close vicinity to the catalytictriad (Figure 4E-F). The hydrophobic character of theregions near the substrate-binding groove may facilitatethe binding of hydrophobic polymeric substrates. Com-pared to Tcur1278, the hydrophobic properties were

more pronounced in Tcur0390 and may account for itsobserved higher substrate affinity (Figure 4E-F). Thisresult is confirming earlier observations that morehydrophobic and less charged amino acid residues clus-tered in the neighborhood of the substrate-bindinggroove of Thc_Cut1 compared to Thc_Cut2 and a con-comitantly higher hydrolytic activity of the former iso-enzyme from T. cellulosilytica (Herrero Acero et al.2011; Herrero Acero et al. 2013).The optimal temperatures for pNPB hydrolysis by

Tcur1278 and Tcur0390 were 60°C and 55°C, respectively(Figure 1B). However, both enzymes showed poor thermalstability at their optimal temperature, as indicated by an

0.25A

0.2

)

0.15

(n

m

0.1

RM

SD

0.05

0

0 10 20 30 40 50

Time (ns)

)D

)D

0.25B

0.2

0.15

(n

m

0.1

RM

S

0.05

0

0 10 20 30 40 50

Time (ns)

0.7

0.8C

0.6

0 4

0.5

0.3

0.4

RM

S (

nm

)

S130 D176 H208

0 1

0.2

0

0.1

0 50 100 150 200 250

Residue number

0.7

0.8D

0.6

0 4

0.5

0.3

0.4R

MS

(n

m)

H208D176S130

0 1

0.2

0

0.1

0 50 100 150 200 250

Residue number

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

ance

(n

m)

E

0

0.1

0.2

0.3

0 10 20 30 40 50

H-S

Dis

t

Time (ns)

0.7

0.8F

0.6

(nm

)

0.4

0.5

ance

(

0.3

S D

ist

0.1

0.2H-S

0

0 10 20 30 40 50

Time (ns)

Figure 5 Molecular dynamics simulation of (A, C, E) Tcur1278 and (B, D, F) Tcur0390 polyester hydrolases. (A, B) Time courses of backboneRMSD changes during a simulation for 50 ns at 298 K (blue) and 353 K (red). (C, D) RMSF of Cα atoms per amino acid residue during a simulation for50 ns at 298 K (blue) and 353 K (red). The purple spirals and arrows at the top of the RMSF graphs indicate α-helices and β-sheets, respectively. Thecatalytic triad residues are shown as solid spheres. (E, F) The distance of the catalytic H208 and S130 (H-S) during a simulation for 50 ns at 298 K (blue)and 353 K (red). For a clearer view, single simulation data from three simulations are shown.

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irreversible loss of more than 65% of their initial activitiesfollowing incubation for 10 min (Figure 2A-B). Tcur1278maintained its maximum activity against PET nanoparti-cles for approximately 15 min at 60°C (data not shown).This suggests that the thermal stability of Tcur1278 wasimproved in the presence of the insoluble polymeric sub-strate. In contrast, a significant improvement of the ther-mal stability was not detected with Tcur0390 in thepresence of PET nanoparticles. The backbone RMSD

plots obtained by MD simulations also indicated a morerigid structure of Tcur1278 thus verifying its superior ther-mal stability compared to Tcur0390 (Figure 5A-B). TheRMSF profiles that describe the deviation of Cα atoms ofsingle amino acid residues from the averaged position overthe simulation period showed highly flexible regions clus-tered in the neighborhood of the catalytic residues H208and D176 (Figure 5C-D). These regions may enable someinduced fit motions necessary for the catalytic reaction at

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the active site. A comparison of the backbone RMSD plots(Figure 5A) and the H-S distance of Tcur1278 (Figure 5E)over the complete MD simulation period indicated thatthe exposed flexible catalytic triad was also prone to localunfolding prior to the denaturation of the overall struc-ture. By contrast, the permanent increase of the H-S dis-tance in Tcur0390 was accompanied by the unfolding ofthe overall structure and occurred at an earlier stage ofMD simulations compared to Tcur1278 (Figure 5B, F).A reaction temperature close to the glass transition

temperature of PET at approximately 75°C (Alves et al.2002) is required for an optimal performance of the en-zymatic hydrolysis due to the restricted mobility of poly-mer chains at temperatures below (Marten et al. 2003,2005; Herzog et al. 2006; Ronkvist et al. 2009; Wei et al.2013). The thermal stability of Tcur1278 needs thereforebe further improved for an efficient degradation of PET.Protein engineering in regions near the catalytic triad aswell as at the flexible N-terminus could be a useful ap-proach for further optimizations to overcome the limitedthermal stability of these polyester hydrolases.In summary, the polyester hydrolases Tcur1278 and

Tcur0390 from T. curvata have been shown to exhibitcatalytic and structural features similar to enzymes fromT. fusca and T. cellulosilytica. The comparison of thecatalytic characteristics of Tcur1278 and Tcur0390 re-vealed a correlation between their hydrolytic activity andtheir surface properties in the vicinity of the catalytictriad. However, a comparison of the thermal stability ofthe two enzymes provided evidence that their ability tohydrolyze PET is predominately limited by their stabilityat higher reaction temperatures.

Additional file

Additional file 1: Figure S1. Alignment of the mature proteinsequences of Tcur1278, Tcur0390, TfCut2 and Est119 polyester hydrolases.The regions of similarity of individual amino acid residues are indicatedwith colors from blue, unconserved to red, conserved. The multiplesequence alignment was performed with the PRALINE web server(Simossis and Heringa 2005). Figure S2. SDS PAGE analysis of Tcur0390(lanes 1-2) and Tcur1278 (lanes 3-4). 10 μg of crude cell lysate (1, 3) andeluate obtained after IMAC purification (2, 4) were loaded in each lane;protein size markers (M). The gel was first stained with Fast Red dye foresterase activity against 1-naphthyl acetate (purple bands) followed bystaining with Coomassie Brilliant Blue (blue bands).

Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contributionsRW and NK carried out the recombinant cloning of genes coding for thepolyester hydrolases. MB and JS participated in the expression and purificationof the recombinant enzymes. TO and RW carried out the biochemicalcharacterization of the polyester hydrolases. JT performed the moleculardynamics simulations. RW and TO analyzed the experimental and simulationdata and prepared the manuscript. WZ conceived the study and contributed tomanuscript writing. All authors read and approved the final manuscript.

AcknowledgementsDr. René Meier, Institute of Biochemistry, University of Leipzig is acknowledgedfor his assistance in the MD simulations. This work was supported by theDeutsche Bundesstiftung Umwelt (AZ 13267; AZ 2012/202).

Received: 20 April 2014 Accepted: 27 April 2014

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doi:10.1186/s13568-014-0044-9Cite this article as: Wei et al.: Functional characterization and structuralmodeling of synthetic polyester-degrading hydrolases from Thermomo-nospora curvata. AMB Express 2014 4:44.

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Kooperationsverei n baru ng

Präambel

Mit dieser Vereinbarung wird die Kooperation der Partner bei dem von der DeutschenBundesstiftung Umwelt (DBU) geförderten Verbundprojekt:

,,FS-Biotechnologie: ChemBioTec: Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaser-oberflächen zur Herstellung innovativer Textilien"

geregelt. Die erfolgreiche Durchführung dieses Verbundprojektes bedarf einervertrauensvol len Zusammenarbeit und eines fairen Umgangs der Partner und desAuftragnehmers mit den Projektergebnissen. In diesem Geiste schl ießen sie dienachfolgende Verei n ba ru ng :

1. Universität Leipzig, Ritterstraße 26,04109 Leipzig vertreten durch die Rektorin, diesedurch den Kanzler, Herrn Dr. Frank Nolden. Ausführende Stelle Institut für Biochemie, HerrProf, Dr. Wolfgang Zimmermann

2. evocatal GmbH, Merowingerplatz 1a,40225 Düsseldorf

3, Saxion - University of Applied Sciences, M.H. Tromplaan 28,7513 AB, Enschede,Niederlande, vertreten durch den Vorsitzender des Board of Directors der Saxion, Herrn Dr.J.W. Boomkamp. Ausführende Stelle Kenniscentrum Design en Technologie, Herr G.J. (Ger)Brinks

und der Auftragnehmer:

4. ifu lnstitut für Umweltinformatik Hamburg GmbH, Max-Brauer-Allee 50, 22765 Hamburg

im Folgenden einzeln oder gemeinsam Partner genannt

schließen folgende Vereinbarung :

Kooperationsvereinbarung Verbuntlprojekt: ,,FS-Biotcchnologie: ChcmBioTec: Biokatalyische Modifikation von Polycsterfaserobcrflächcn zur Hcrslellung

$ 1 Definit ionen

(1) ,,Verbundprojekt" ist das von allen Partnern gemeinsam durchgeführte Projekt,,Biokatalytische Modifikation von Polyesterfaser-oberflächen zur Herstellung innovativerTexti I i e n" i n sgesa mt, ei nsch I ießl ich de r Tei I proje kte.

(2) ,,Teilprojekt" ist der Teil des Verbundprojektes, der nach der zusammenfassendenVorhabenbeschreibung einem einzelnen Partner zuzuordnen ist.

(3) Projektleitung ist der Partner, der das Verbundprojekt koordiniert.

(4) FuE sind Forschung und Entwicklung bzw. Forschungs- und Entwicklungsleistungen.

(5) Sicherung ist jede Form des Schutzes von FuE-Ergebnissen durch gewerblicheSchutzrechte und Urheberrecht.

(6) Venruertung ist jede Form der Nutzung der FuE-Ergebnisse des Verbundprojektes undder diesbezüglichen Rechte . Zur Verwertung gehören insbesondere FUE- Anschlusspro-jekte, jede Form der wirtschaftlichen Venvertung (2.8. Produktion, Lizenzvergabe,Veröffentl ichungen).

$ 2 Gegenstand dieser Vereinbarung

(1) Mit dieser Vereinbarung werden die Rechtsbeziehungen zwischen den Partnern beidiesem Verbundprojekt geregelt. Die Vereinbarung trifft auch Regelungen zur rechtl i-chen Zuordnung der Projektergebnisse, zur Sicherung sowie zur Venruertung der FUE-Ergebnisse.

(2) Folgende Anlagen sind Bestandteil dieser Vereinbarung: zusammenfassende Vorhaben-beschreibung zum Verbundprojekt mit Zeit-, Arbeits- und Venrvertungsplänen sowiezuwend u ngsrechtl iche -Verpfl ichtu ngen gegenü ber der DBU.

$ 3 Projektleitung

(1) Die Projektleitung (vgl. S 1 Abs. 3) erfolgt durch die Universität Leipzig

(2) Die Projektleitung hat insbesondere folgende Aufgaben:

fachl iche Koordination und Kontrol le der Zusammenarbeit der Partner,

Herstel lung eines einheit l ichen Informationsstandes der Partner (u. a. Austausch vonZwischen- und Schlussberichten, mindestens einmal jährl ich Vorbereitung undDurchführung Diskussionsveranstaltungen zum aktuel len Projektstand und seinerweiteren Entwicklung),

Anforderung von Berichten zu den Teilprojekten und Erstellung von Berichten zumVerbundprojekt für die DBU,

(3) Die Projektleitung handelt bei der Erfül lung ihrer zuwendungsrechtl ichen Verpfl ichtungeneigenverantwort l ich, im übrigen im Einvernehmen mit den anderen Partnern.

(4) Die Partner sind verpflichtet, die Projektleitung aktiv bei ihren Aufgaben zu unterstützen.Insbesondere sind von der Projektleitung zwecks Erfüllung ihrer Aufgaben angeforderteUnterlagen termingerecht vozulegen und Termine, zu denen die Projektleitung einlädt,wahrzunehmen. Darüber hinaus ist die Projektleitung unverzüglich über Tatsachen zuinformieren, die Einfluss auf die erfolgreiche Durchführung des Verbundprojektes habenkönnen (2.8. wesentl iche Abweichungen im Projektverlauf, drohende lnsolvenz einesPartners).

$ 4 Verantwortlichkeiten für die Teilprojekte

(1) Jeder Partner ist für sein Teilprojekt selbst verantwortl ich.

(2) Jeder Partner verpflichtet sich, sein Projekt entsprechend den Festlegungen zu seinemTeilprojekt und zum Verbundprojekt durchzuführen.

(3) Jeder Partner stellt die Finanzierung seines Teilprojektes entsprechend demprojektspezifischen Fi na nzieru n gsbeda rf s icher.

$ 5 Rechtseinräumung für Zwecke der Durchführung des Verbundprojektes und seinerTeilprojekte

(1) Die Partner räumen sich gegenseitig für Zwecke der Durchführung desVerbundprojektes und seiner Teilprojekte folgende Rechte ein: einfache Nutzungsrechte(Lizenzen) an Know-how, an urheberrechtl ich geschützten Werken, an Erfindungen undan erteilten Schutzrechten. Dies betrifft nur solche Rechte, die bei Beginn desVerbundprojektes vorhanden sind oder im Rahmen des Verbundprojektes entstehen.Eine Rechtseinräumung erfolgt nicht, soweit dadurch Dritten vor Unterzeichnung dieserVereinbarung gewährte Rechte verletzt würden.

(2\ Die Rechtseinräumung gem. $ 5 Abs. 1 gilt auch zugunsten des/der Unterauftragnehmereines Partners, soweit der Unterauftrag im Rahmen seines Teilprojektes vergeben wirdund die Rechtseinräumung für die Durchführung des Unterauftrags erforderl ich ist.

$ 6 Ergebnisse des Verbundprojektes und seiner Teilprojekte

Die Regelungen des $ 5 sowie die zuwendungsrechtl ichen Verpfl ichtungen, die ErgebnisseForschung und Lehre in Deutschland unentgeltl ich zur Verfügung zu stellen, bleiben vonnachfolgenden Regelungen unberührt:

(1) Der einzelne Partner ist berechtigt, die im Rahmen seines Teilprojektes entstandenenErgebnisse uneingeschränkt zu nutzen. Dies gilt auch für Erfindungen, wenn sie imRahmen seines Teilprojektes entstanden sind und die Mitarbeiter des Partners dieerfinderische Leistung erbracht haben. Der uneingeschränkt nutzungsberechtigtePartner leitet unvezüglich die schutzrechtl iche Sicherung und Venryertung ein.

(2) Arbeitsergebnisse, die von mehreren Vertragspartnern gemeinschaftlich erarbeitetwurden, stehen diesen gemeinsamzu. Sofern es sich dabei um schutzrechtsfähigeErfindungen handelt, werden sich die betroffenen Partner rechtzeitig vor einerAnmeldung zum Schutzrecht darüber verständigen, wer von den Beteil igten alsMiterfinder anzusehen ist.

(3) Sind Mitarbeiter mehrerer Partner an einer Erfindung beteil igt (Gemeinschaftserfindung),stimmen sich die beteil igten Partner über die Modalitäten der unverzüglichvorzunehmenden schutzrechtlichen Sicherung und Venruertung ab (Anmelder, Kosten,Aufteilung des wirtschaftl ichen Gewinns, u. s. w.). Gemeinschaftserfindungen kannjeder Miterfinder uneingeschränkt nutzen.

$ 7 Dokumentationspfl icht

Die Partner sind verpfl ichtet, ihre Beiträge zu FuE-Ergebnissen angemessen zudokumentieren.

$ 8 Erstverhandlungsrecht der Partner

Die Partner sind verpfl ichtet, aus dem Verbundprojekt hervorgehende Erf indungen zunächstden übrigen Partnernn zur Nutzung anzubieten.

$ 9 Vergütungspfl icht

(1) Räumt ein Partner einem anderen Partner Rechte an Know How, urheberrechtl ichgeschützten Werken, Erfindungen und erteilten Schutzrechten ein, ist hierfür einemarktübliche Vergütung zu zahlen Bei der Bemessung der Vergütung sollen dieRechtsinhaber Beiträge des anderen Partners angemessen berücksichtigen, die alsnotwendige, aber nicht hinreichende Voraussetzung für eine Erf indung zu werten sind.

(2) Die Vergütungspfl icht gemäß Absatz 1 besteht nicht,

wenn ein Miterf inder eine Gemeinschaftserf indung nutzt, an der er betei l igt ist,

wenn in den Zuwendungsbescheiden etwas anderes geregelt ist

(3) Partner, die Unternehmen der gewerbl ichen Wirtschaft sind, können untereinanderbilateral folgende abweichende Vereinbarung treffen:

Die Vergütungsansprüche für die gegenseit ige Rechtseinräumung sind beigleichgewichtigen Beiträgen vol lständig und bei ungleichgewichtigen Beiträgentei lweise abgegolten. Bei ungleichgewichtigen Beiträgen ist für den nichtabgegoltenen Tei l ein marktübl icher Ausgleich zu vereinbaren.

$ 10 Vertraul ichkeit

(1) Die Partner werden al le als geheimhaltungsbedürft ig erklärten oder als solcheerkennbaren lnformationen technischer oder geschäft l icher Art eines anderenPartners während und nach Beendigung des Verbundprojektes vertraulich behandelnund nicht ohne schriftl iche Zustimmung des betroffenen Partners Dritten zurVerfügung stel len. Diese Verpfl ichtung entfäl l t , wenn die Informationen derÖffentl ichkeit bekannt oder al lgemein zugänglich sind.

(2) Unter Einhaltung dieser Geheimhaltungspfl icht sind die Partn er zur Veröffentl ichungvon Ergebnissen ihres Teilprojektes berechtigt und nach Abschluss des Vorhabensim Sinne der Zuwendungsbestimmungen verpflichtet. Veröffentlichungen über dasVerbundprojekt oder das Teilprojekt anderer Partner bedürfen der vorhergehendenZustimmung der beteil igten Partner.

Die Berichtspfl ichten aufgrund der Zuwendungsbestimmungen gegenüber der DBUwerden von den vorstehenden Bestimmungen nicht berührt.Geheimhaltungsbedürft ige lnformationen sind in diesen Berichten besonders zukennzeichnen.

$ 11 Gewährleistung und Haftung

(1) Jeder Partner ist nur bei vorsätzlicher oder grob fahrlässiger Verletzung seinerPfl ichten aus dieser Vereinbarung verpfl ichtet, anderen Pafinern den ihnen aus derPflichtverletzung entstehenden Schaden zu ersetzen.

(2) Bei Ansprüchen Dritter haftet jeder Vertragspartner für die Tatbestände, die ihm oderseinem Teilprojekt zuzuordnen sind. lm Falle einer lnanspruchnahme eines anderenPartners aus dem Gesichtspunkt der gesamtschuldnerischen Haftung, kann dieserverlangen, von der Haftung freigestellt zu werden.

$ 12 Kündigung

(1) Eine Kündigung dieser Vereinbarung durch einen Partner, die der Schriftform bedarf,kann mit einer Frist von 6 Monaten bei Vorlage von trift igen Gründen erfolgen. lmFalle der Kündigung entscheiden die übrigen Partnern einvernehmlich über dasweitere Vorgehen (vorzeitige Beendigung des Verbundprojektes, Aufnahme einesneuen Partners an Stelle des ausscheidenden Partnerss. Übernahme derArbeitspakete durch a_ndere Partner).

(2) lm Falle des Ausscheidens eines Partnerss aus dem Verbundprojekt beschränkensich seine Rechte auf die FuE-Ergebnisse seines Teilprojektes, DieRechtseinräumung gegenüber den anderen Partnern gemäß $ 5 dieser Vereinbarungbesteht bis zum Abschluss des Verbundprojektes fort, soweit dies nicht unzumutbarist. Die Pflichten der anderen Partnern aus dieser Kooperationsvereinbarunggegenüber dem ausscheidenden Partner enden mit Wirksamwerden der Kündigung.lhre bis zu diesem Zeitpunkt entstandenen Rechte werden durch die Kündigung nichtberührt. Der ausscheidende Partner ist nicht berechtigt, Informationen undErgebnisse aus anderen Teilprojekten oder dem Verbundprojekt zu nutzen oderDritten zugänglich zu machen.

$ 13 Zuwendungsrechtl iche Verpfl ichtungen und Unwirksamkeit

(1) Zuwendungsrechtl iche Verpfl ichtungen der einzelnen Partner gegenüber der DBUwerden durch den Inhalt dieser Vereinbarung nicht berührt.

(2) Soweit einzelne Bestimmungen dieser Vereinbarung im Widerspruch zu höherrangigemRecht, insbesondere EU-Wettbewerbsrecht oder zuwendungsrechtlichen Bestimmungender DBU bzw. zuwendungsrechtl ichen Verpfl ichtungen eines Partnerss stehen, sind sie

(3)

Koopcrationsvereinbamng Verbundproickl: ..FS-tsiotcchnologie: C-'henrBioTec: Biokatalyischc Modifikation von Polyesterlascroberflächen zur Herstcllung

unwirksam.

(3) Soweit einzelne Regelungen dieser Vereinbarung unwirksam sind, wird die Wirksamkeitder übrigen Regelungen nicht berührt. Die Partner sind verpfl ichtet, unwirksameRegelungen durch wirksame Regelungen zu ersetzen, die Sinn und Zweck dieserVereinbarung angemessen Rechnung tragen. Eine entsprechende Verpfl ichtungbesteht ebenfalls im Falle einer Regelungslücke.

S 14 Schriftform

Anderungen und Ergänzungen dieser Vereinbarung bedürfen der Schriftform.

S 1 5 Schiedsgerichtsverfahren

(1) Diese Vereinbarung und sämtliche Verpfl ichtungen, die sich daraus ergeben, unterl iegenin ihrer Gesamtheit dem Recht der Bundesrepublik Deutschland.

(2) Alle Streit igkeiten im Zusammenhang mit dieser Vereinbarung oder ihrer Gültigkeitwerden nach den Regeln der Deutschen lnstitution für Schiedsgerichtbarkeit e.V. (DlS) voneinem Schiedsgericht unter Ausschluß des ordentl ichen Rechtsweges endgültigentschieden. Ort des schiedsrichterl ichen Verfahrens ist Leipzig. Die Sprache desschiedsrichterl ichen Verfahrens ist deutsch. Für Maßnahmen des vorläufigenRechtsschutzes bleiben die Zuständigkeiten der ordentl ichen Gerichte unberührt.

$ 16 lnkrafttreten

Diese Vereinbarung tritt mit Laufzeitbeginn des Vorhabens am 01 .07 .2012 in Kraft und endet5 Jahre danach am 30.06.2017.

Kooperationsvereinberog Verburdprcjekr: .FS-Biaechnctogie: CbcrnBioTcc: Bio&*lyrird* Modiftrrisr vsr rofeserfrrer$cndnr an llersdluag ia

Universität Leipzig

1 I iAN. 2013

Dr. Frank Nolden(Kanzler der Universität Leipzig)

UNIVERSITÄT LEiPZIGKsnzler

Ritferslr.,ü'3e ?604; C9 Leipzig

Koopcrgtiql$vcrEinbc^ng v.rüDdFqF*t J$Bicseo&*ic cbsnBi,oTcc: Bi*nelytirdc MsEfirdin vo Pobrc*crhsoüqtE(,hso m llcr*hg imvaivcr Textilicn'

evocatal GmbH

(Forschungsleiter)

Koopcüimsr|c Eißhr4| VerüüQd*t -f$S|d..b.|o3ic ChcrnBioTe ndrjlrrb*e farffrfa-o rln hly*k!äa0e arr tkg.tl4 mvrirtr Tcrrilirü-

Saxion - university of Applied Sciences, Enschede, Niederlande

Enschede, den

J4 'o ,r, J-, 5

Kon;rrationsvereinharng Vcörar{n{ekt -FS-Biorct'hrologie: (-hemBioTcc: $iolrtalytisc}r Modifkalioo von Polyesrerfasr:rohcrf*ic

ifu Institut für Umweltinformatik Hamburg GmbH

Hamburg, den/7?

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