Protein Expression Purification Tag- · PDF fileC2H5 C2H5 + R-C2H5N CH3 ... DE-52 (Whatman)...

Protein Expression

Purification

Tag-nology

Expression, homolog oder heterolog?

• Heterologe Expression in anderem Host

• Kompartment

• Codon usage

• Posttranslationale Modifikationen

• Kofaktoren

• Chaperone

Non-leaky Expression

• Ein Expressionsytem soll möglichst “dicht”- non-leaky sein.

• Grund: Proteine, die exprimiert werden sollen, können toxisch sein.

• Das kann zur Folge haben, dass sich der Expressionshost gar nicht transformieren lässt, da die transformierten Zellen sofort sterben.

• Stirbt der Expressionshost nicht, kann aber das Zeilprotein, das durch leaky Expression produziert wird, eine negative Selektion gut exprimierender Zellen bewirken. Erklärung: Gut exprimierende Zellen produzieren viel Zielprotein, aber weniger eigene Proteine, d.h. wachsen schlechter. Die gut exprimierendensind nach einigen Verdopplungsrunden fast nicht mehr vorhanden. Man selektioniert also auf schlecht exprimierende Zellen.

• Das pET System von Studier für Expression in E.coli ist extrem “dicht” aufgrund verschiedener Vorkehrungen.

lacPromoter

GenT7 PolymeraselaclacRepressorRepressor

genomische DNA

LacI laclacOperatorOperator

Gen Gen zurzurExpressionExpression

laclacOperatorOperator

laclacRepressorRepressor

T7 T7 Promoter

Promoter

T7 Polymerase

Zielprotein



T7 T7 Promoter

Promoter



T7 T7 Promoter

Promoter laclacOperatorOperator


T7 T7 Promoter

Promoter

E.coli BL21 (DE3)- pET Expressionssystem

High copy plasmid

T7 T7 PolymerasePolymerase




Lac Lac PromoterPromoter

Keine Expression ohne Induktion

• da lac-Repressor Protein auf Operatorregion sitzt und Bindung der E.coli Polymeraseverhindert, d.h es wird keine T7 Polymerasesynthetisiert.

• Ohne T7 Polymerase keine Expression des Zielproteins.

• Als zusätzliche Sicherung sitzt auch beim T7 Promoter noch eine lac Operatorregion. Sollten T7 Polymerase dennoch in geringen Mengen synthetisiert worden sein, kann das Gen trotzdem nicht abgelsen werden.

• Zusätzliche Kopien des Lac Repressors sind Plamid kodiert. So wird genügend lac Repressorsynthetisiert.




T7 T7 PromoterPromoter

E.c

oliG

enom

Pla

smid

E.coli Polymerase





Zusätzliche Sicherung

• Eine weitere Absicherung gegen T7 Polymerase, die in geringen Mengen synthetisiert wurde, ist die Co-Expression von Lysozym, welches auch als Inhibitor der T7 Polymerase wirkt. Die T7-Polymerase wird abgefangen, bevor die Expression des Zielgensstattfindet. • Das Lysozym wird auf einem zweiten Vektor kodiert.

LysozymLysozym

E.c

oliG

enom

E.coli Polymerase




T7 T7 PromoterPromoterP

lasm

id



laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV



Expression erst nach Induktion

• da lac-Repressor von Operator (Genom) abfällt

• E.coli Polymerase liest Gen für T7 Polymeraseab.

• lac Repressor von Operator (Plasmid) fällt ab.

• T7 Polymerase liest Gen für Zielprotein ab.



T7 T7 PromoterPromoter

E.c

oliG

enom

Pla

smid

Gal

acto

se

/ IP

TG

Gal

acto

se

/ IP

TG

laclac RepressorRepressorINAKTIVINAKTIV

Zielprotein

Kompartment• Cytosol => Cytosol (E.coli, Hefe, Insektenzellen)

• Membran => Spezieller E.coli Stämme

„Walker strains“ C41, C43

• Extrazellulär

=> Expression in Hefe, Sekretion ins Medium

⇒ Signalpeptid & Sekretion ins Periplama von E.coli

⇒ Expression im Cytosol in E.coli Stämmen mit defizienter Thioredoxin- und Glutathionreduktase

Codon usage

• Verschiedene Codon Präferenz

• Verschiedene tRNA levels in Organismen

• Bei seltenen Codons => Translationsstop

Rare Codons

BL21(DE3)Rosetta

BL21(DE3)pLys

BL21(DE3) Nicht induziert

Rare Codons- Expression in Rosetta

Protein purification

First Enrichment / Purification step is a successful expression

General aim:3 STEP Purification

1.Step capture

2. Step purify

3. Step polish

Each step should be a different type of separation, has different capacitiesand different performance. E.g. capacity decreases from step1 to 3, performance increases step 1-3.

Under normal conditions you lose at each purification step ca 20%,

General rules

Until you don’t know better

-Use protease inhibitors

-Work fast (prepare buffers, SDS –PAGE, Blots etc)

-Keep cold protein (slower denaturation and less proteolysis)

-Do NOT freeze in between; if necessary shock freeze with glycerol.

-Start with high amounts of protein

-Make small scale tests prior large scale preparations

Column self made / or ready-to-use

Depends on material

Kind of separation

Prize of material

Knowledge / experience of experimentator

Principles of Protein Separation

Ion exchange (IEX, cation / anion exchange)

Hydrophobic interaction (HIC)

Reversed phase (RP)

Size exclusion (SEC, gelfiltration)

Affinity (IMAC, MBP, GST)

Ion exchangeSuited as capture, purification, or polishing stepTwo types: Anion exchange and Cation exchange

+

++++++++

Anion exchange:•Matrix has positive charge•Protein is negative charged•Protein stick to matrix; elution with a anion, e.g. ClCl--, SO, SO44

22--, PO, PO4433--

•the more neg. charges the better binding

+

pH dependence of IEX separation

Three proteins : blue acidic pI, green neutral pI, red basic pI

Different materials Anion exchangeDEAE Di Ethyl Amino Ethyl; weak and mild anion exchanger, Separation is satisfying

R-C2H5NH

C2H5

C2H5

+

R-C2H5N

CH3

CH3

+CH3

Q, TMAE Quaternary Nitrogen, Tri Methyl Amino Ethyl Strong an.ex., not so mild, for some proteins to hard, good to excellent separation

Different media /columns

DE-52 (Whatman) DEAE on Cellulose matrix

DEAE (Amersham; on sepharose matrix)

Q-sepharose –[fast flow]

[Re -] Source Q30

[Re -] Source Q15

MonoQ

MiniQ

Separation prize

Comparison

1.800 SFr

635-1000 SFr

250 SFr

150 SFr

Cation exchange Carboxymethyl, CM, weak, mild, etc

Sulfonicacid S, strong, harsh

R-C-O-CH3

O

R-SO3-

Hydroxyapatite (neither anion nor cation exchange)CaPO4 matrix, proteins can bind as cations but also as anionsElution with PO4

3- or Cl-

General aspects IEX

Very Fast flow (e.g. Source30, 1 cm diameter up to 20 ml/min)

High chemical stability

High mechanical stability

High capacity

High perfomance

Easy upscaling

Hydrophobic interaction

Suited as capture step or purification step

Different HIC media

Strong influence of matrix on separationinfluence not predictable!

General aspects HIC

Fast flow

High chemical stability

mechanical stability

High capacity

Good - high perfomance

Easy upscaling

Size exclusion

Different typeshave different pore size => different media according to size of proteins

Pitfalls in SECWrong material, not suited for proteins to separate

Cloggy sample, closes pores of material

Top of column is not even => smear, bad separation

Application of to large volume

Large dilution of sample

Long duration

General aspects SEC

slow flow (required for good separation)

chemical stability in some cases not that high

low mechanical stability ! Overpressure can ruin the column

Medium - low capacity

High perfomance

Upscaling not so easy. You have to buy columns for best perfomance.

Tags

• His6-tag (1 kDa)

• GST-tag (26 kDa)

• MalE-tag (40 kDa)

• CBP-tag (4 kDa)

• Strep-tag (1 kDa)

His-tagImmobilized Metal ion Adsorption Chromatography (IMAC)

Prinzip• Protein mit N- oder C-terminaler Fusion an 6 His bis 10

His Reste

• His-Reste koordinieren immobilisiertes Metal-Ion auf Säulenmatrix

• Elution mit Imidazol

• Metallionen: Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+

• Matrix: GE-Healthcare, Quiagen, BioRad, TALON

His-tag

Säulenmatrix

His-tag

Vorteile

• Sehr gute Bindung

• Kleiner Tag

• Detergenzien stören nicht

• Benötigte Technik gering

His-tag

Nachteile

• Unspezifische Bindung

His-tag (1 kDa)

Nachteile

• EDTA kann nicht benutzt werden

• EDTA komplexiert Metalionen der Säulenmatrix

His-tag (1 kDa)

Nachteile

• DTT kann nicht benutzt werden

• DTT komplexiert Metalionen der Säulenmatrix

His-tag

Nachteile• Ni2+ als Verunreinigung in Proteinpräperation• Oxidation von Met und Cys durch Ni2+

GST-tag (26 kDa)Glutathion-S-transferase

Prinzip• Protein mit N- oder C-terminaler Fusion von GST

• GST bindet an glutathion an Säulenmatrix

• Elution mit Glutathion

• Verschiedene Anbieter

GST-Tag

Matrix

GST-tag

Vorteile

• Protein Tag

• Spezifische Bindung

• Batch- wie Säulenverfahren möglich

GST-tag

Nachteile

• Sehr großer tag

• Bindung sehr, sehr langsam

• Elution mit Glutathion -> kann Disulfidereduzieren

• GST dimerisiert => artifizielles Dimer

MalE / MBP-tag (40 kDa)maltose binding protein

Prinzip• Protein meist mit N-terminaler Fusion von MalE

• MalE bindet an Amylose an Säulenmatrix

• Elution mit Maltose

• Verschiedene Anbieter (NEB, GE-Healthcare, etc)

MBP-tag

Vorteile

• Protein Tag

• Spezifische Bindung

• Batch- wie Säulenverfahren möglich

MBP-tag

Nachteile

• Sehr großer tag

• Bindung langsam

• Keine denaturierende Isolation möglich

• Viele Proteine bleiben in Lösung mit tag, aber präzipitieren, wenn der tag abgespalten wird.

CBP-tag (4 kDa)Calmodulin binding peptide

Prinzip• Protein mit Fusion von Peptid der Myosin Light Chain

Kinase (MLCK)

• Peptid bindet an Calmodulin an Säulenmatrix

• Bindung in Gegenwart von Ca2+

• Elution mit EDTA

CBP-tag

Matrix

CBP-tag

Vorteile• Protein Tag

• Bindung schnell

• Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden

CBP-tag

Nachteile• Säulenmatrix ist Calmodulin

• Bindung schnell

• Tag muss nicht unbedingt abgespalten werden

Strep-tag (4 kDa)Streptavidin von Streptomyces avidinii,

Prinzip

• Protein mit Fusion von Peptid Asn-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-

• Bindung an Strepavidin

• Elution mit Biotin / Desthiobiotin

Strep-tag

Matrix• Minimal Strepavidin

Strep-tag

Vorteile• Protein / Peptid tag• Sehr spezifische Bindung• Kleiner Tag

Strep-tag

Nachteile

• Detergenzien nur bedingt möglich

• Saurer pH nicht möglich

• Protein auf Säulenmatrix (Cleaning of columnetc)

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