Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Universität WürzburgMichael Kempf, Peter Schreier

Institut für Pharmazeutische Biologie, TU BraunschweigAnnika Reinhard, Till Beuerle

Pyrrolizidin-Alkaloide (PA) in Honig und Pollen

Senecionin

Senecionin-N-Oxid

N

HO

O

O

OH

HO

N

HO

O

O

OH

HO

O

Motivation� Datenlage zu Gehalten von PA in Honigen

(einschließlich Imkereierzeugnissen und Pollenprodukten) lückenhaft (SKLM 2002)

� Ziel des Projekts:

Entwicklung einer Methode zur selektiven und sensitiven Analytik (0.1ppm) von PA in Honig und Pollen

Erarbeitung einer verlässlichen Datengrundlage über das Vorkommen von PA in diesen Produkten

GC oven

backflushvent

GC ov en

backflushvent

600°Creduction reac tor

GC oven

backflushvent

He

water separator

pyrolysis reacto r, 1250 °C p yrolysis reactor, 1 440 °C

CO

magic mix

pyrolys is mode for the

determ ination of O/O1816

H2

pyrolysis mode for the

determination ofH/H21

oxidat ion reactor, 960 °C

o xidation mode for t he

d etermination of C /C, N/N13 1215 14

Grenzwerte für Phytopharmaka1:� innere Anwendung: 1µg/Tag (<6Wochen/Jahr); 0.1µg/Tag (>6Wochen/Jahr)� äußere Anwendung: 100µg/Tag (<6Wochen/Jahr); 10µg/Tag (>6Wochen/Jahr)� Schwangere und Stillende:

� innere Anwendung: keine Benutzung� externe Anwendung: nach Rücksprache mit dem Arzt

1) für PA mit 1,2-ungesättigtem Necingerüst sowie deren N-Oxide

Pyrrolizidin-Alkaloide – Struktur I

Senecionin

Necin-Base

Necin-Säure

7(R)

N

HHO OH

9

Heliotrin

7(S)

� typische sekundäre (toxische) Pflanzeninhaltsstoffe� ca. 380+ Strukturen aus 600 Pflanzen bekannt

Retronecin

Akute Toxizität / GenotoxizitätAkute 1,2-Doppelbindung + Makrocyclische Ester > Diester >Toxizität: Heliotridin-Monoester > Retronecin-Monoester

Nektarpflanzen / Verbreitung / Strukturen

Senecio spp.

Eupatorium spp.

Echium spp.

Borago off.

Symphytum off.

Heliotropium spp.

[Crotalaria spp.]

Asteraceae

Boraginaceae

Fabaceae

N

HO

O

O

OH

HO

N

HO

OHO

OH

HO

Nektarpflanzen / Verbreitung / Strukturen

Analytische Methode I

N

HO

O

O

OH

HO

N

HO

O

O

OH

HO

O

N

HO

O

O

O

N

OO

O

O

OH

HO

FestphasenextraktionKonzentrierung an SCX

LiAlH4-Reduktion� PA-Ester in Retronecin/Heliotridin

Derivatisierung mit MSTFA� GC-MS Analytik

Di-TMS-

Heliotridin

Di-TMS-

Retronecin

Zink-Reduktion� N-Oxide in tertiäre PA

Zugabe des internen StandardsHeliotrin (2µg/20g)

Analytische Methode II

17,0 17,5 18,0 18,5 19,0 19,5 20,0 20,5Time (min)

40

50

60

70

80

90

100

30

40

50

60

70

80

90

10018,42

20,55

17,61

18,43

19,22

20,55

17,61

di-TMS-heliotridineRI= 1632

di-TMS-retronecineRI= 1600

A

B

di-TMS-retronecineRI= 1600

di-TMS-heliotridineRI= 1632

di-TMS-retronecineRI= 1600

A

B

di-TMS-retronecineRI= 1600

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

Honig-Probe # 21A

Honig-Probe # 21B

+ interner Standard(Heliotrin ���� di-TMS-Heliotridin)

LOQ: 10ng/g (0.01ppm)

N

HOSi O

Si

� bei allen untersuchten Honig- und Pollenproben (n=216/n=55) wurden nie natürlich vorkommende Heliotridin-PA gefunden

� alle Proben waren mit dieser Methode quantifizierbar

PA in Honig: Wissensstand

� Deinzer et al., 1977, Science: GC-MS,

Senecio jacobaea (n=4) 0.3-3.9 µg/g

� Culvenor et al., 1981, J.Agric.Food.Chem.: GC-MS Echium plantagineum (n=5) 0.27-0.95 µg/g

� Crews et al., 1997, Food Add. Cont.: LC-MS, Senecio jacobaea (n=23) 0.002-1.48 µg/g

� Beales et al., 2004, J.Agric.Food.Chem.: LC-MS, Echium plantagineum, H. europaeum, H. amplexicaule

(n=68, LOD:1ng/g) 0.03-2.2 µg/g

� Betteridge et al., 2005, J.Agric.Food.Chem.: LC-MS,

Echium vulgare (n=9, LOD: 1ng/g) 0.017-2.85 µg/g

� NL, Nahrungsmittel- und Warenamt: 2007, LC-MS,

Senecio jacobaea (n=171, 28%, ∅: 0.007 µg/g, LOD: 1 ng/g) 0.001-0.365 µg/g

PA in Honig: Ergebnisse I

PA Gehalte Honig (n=3) *

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

21 32 34 35 36 39 41 43 50 93 119 145 153 155 161 176 179 188 212

Honigprobe

PA

Geh

alt

[µg

/g]

*) PA-Gehalt berechnet als Heliotridin/Retronecin-Äquivalente

� non-target Analyse von 216 Honigen (19 PA-positiv; 9%)� Bereich*: 0.02µg/g – 0.12µg/g, ∅ 0.06µg/g

PA in Honig: Ergebnisse IIRegionale Verteilung der untersuchten Proben

Regionale Verteilung der PA-positiven Proben

94

60

34

22 6

Europa nicht zugeordnet Zentral-/Südamerika Australien/Neuseeland USA/Canada

123

31

nicht zugeordnet Zentral-/Südamerika Australien/Neuseeland USA/Canada

2005

Boppré et al., J.Agric.Food.Chem.:

• Echium vulgare (Boraginaceae)

• nativer Pollen

• LC-MS, 8-14mg/g

2008

Boppré et al., J.Agric.Food.Chem.:

• Pollenhöschen, LC-MS, u.a.:• Echium vulgare (Boraginaceae): 350µg/g

• Echium plantagineum (Boraginaceae): 6-28µg/g

• Eupatorium cannabinum (Asteraceae): 120µg/g

• Senecio jacobaea (Asteraceae): 100µg/g

• Senecio ovatus (Asteraceae): 70µg/g

PA in Pollen: Wissensstand

PA in Pollenprodukten: Ergebnisse I

PA Gehalte Pollenprodukte (n=4) *

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

20,00

2 3 8 9 12 13 19 24 28 33 34 37 38 40 45 50 52

Pollenprobe

PA

Geh

alt

[µg

/g]

*) PA-Gehalt berechnet als Heliotridin/Retronecin-Äquivalente

� non-target Analyse von 55 Pollenprodukten (17 PA-positiv; 31%)� Bereich*: 1.08µg/g – 16.35µg/g, ∅ 5.17µg/g

PA in Pollenprodukten: Ergebnisse II

3316

4 1 1

Europa nicht zugeordnet USA/Mexiko Neuseeland Asien

9

8

Europa (Spanien/5, Rumänien/2, Italien/1, Frankreich/1) nicht zugeordnet

Regionale Verteilung der untersuchten Proben

Regionale Verteilung der PA-positiven Proben

PA in Honig / Pollen: Diskussion I

• Bundesanzeiger, 1992, June 17, 4805

Phytopharmaka: 1,2 ungesättigte PA max. 1µg/Tag bzw. 0.1µg/Tag und Nulltoleranz für Schwangere und Stillende

• Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Positionspapier des BfR vom 12. März 2007

Bei der Bewertung der Verunreinigungen von Lebensmitteln durch Pflanzenteile oder Pflanzenbestandteile die toxikologisch relevante Stoffe enthalten …wird unterschieden, ob einerseits akut-toxische oder andere nicht-genotoxischeEffekte (z.B. THC, Morphin) oder andererseits genotoxische

Effekte (z.B. Pyrrolizidinalkaloide) des pflanzlichen Wirkprinzips im Vordergrund der Risikobewertung stehen.Im ersten Fall wird das Konzept des „margin of safety“angewandt, im zweiten das der „Nulltoleranz“.

Deutschland

Australien /

Neuseeland

Niederlande

USA

Europa

PA in Honig / Pollen: Diskussion I

Deutschland

Australien /

Neuseeland

Niederlande

USA

Europa

• Lebenslange tägliche Einnahme

Virtually Safe Dose von 0.43 ng/kg/ Körpergewicht pro Tag (Riddellin)

• Maximal Tolerable Risk

3µg/Person/Tag

• TDI (nicht-karzinogene Effekte)

6.5µg/Tag

• Kräuterbeschluss

die Menge toxischer PA in Kräuterpräparaten< 1 µg/kg oder Liter.

PA in Honig / Pollen: Diskussion I

Deutschland

Australien /

Neuseeland

Niederlande

USA

Europa

• Amtsblatt der Europ. Union 27.06.2008

Genehmigung für raffiniertes Echium Öl

PA nicht nachweisbar (Nachweisgrenze 4µg/kg)

Berechnet auf eine Tagesdosis für dieses Lebensmittel ���� ca. 0.05 µg PA/Tag

PA in Honig / Pollen: Diskussion I

Deutschland

Australien /

Neuseeland

Niederlande

USA

Europa

• FDA Empfehlung von 2001

…the clear evidence of an association between oral exposure to pyrrolizidine alkaloids and serious adverse health effects and the lack of any valid scientific data that would enable the agency to determine whether there is an exposure, if any, that would present no harm to consumers, indicates that this substance should not be used as an ingredient in dietary supplements…

…the manufacturer bears the primary responsibility for ensuring that its dietary supplement products are safe…

PA in Honig / Pollen: Diskussion I

Deutschland

Australien /

Neuseeland

Niederlande

USA

Europa

• Food Standards Australia New Zealand

provisorischer “safe level of intake” (tolerable daily intake): 1µg/kg Körpergewicht/Tag

20

Zusammenfassung / Fazit

� 19 von 216 (9%) Honigen, sowie 17 von 55 (31%) Pollen-produkten erwiesen sich als PA-positiv

� Honig: ∅∅∅∅ 0.06µg/g

� Pollen: ∅∅∅∅ 5.17µg/g

� Berechnete Tagesdosis mit einer Verzehrmenge von 20g (Honig) bzw. 10g (Pollen):

Alle Proben (Ausnahme ein Honig) liegen über dem Grenzwert für Phytopharmaka von 1µg/Tag.

� alle PA-positiven Proben enthielten z. T. erhebliche Anteile von Pollen PA-produzierender Pflanzen (meist Echium spp.).

� bei hoch belasteten Honigen besteht die Gefahr der down-stream Kontamination in der Nahrungsmittelindustrie

Vielen Dank für’sZuhören

Bieneninstitut CelleDr. Werner von der Ohe