Regulation der Genexpression: regulierbare Promotoren ... · Regulation der Genexpression:...
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Regulation der Genexpression: regulierbare Promotoren,
Proteine und siRNA
Serap Klein, AG Grez
Biochemie Praktikum
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten
Chromatin
Transkription
RNA-Processing
RNA-Stabilität und -Transport
TranslationProtein-Reifung/Modifikation
Cytoplasma
ZellkernIntrons Exons
Gen
AAAAA
AAAAA
AAAAA
Cap
mRNA
Protein
DNA
Transkription
RNAi
Protein-Tuning
Regulation auf Ebene der Transkription
Beispiele:1. Metallothionein-Promoter
2. Tetracyclin-regulierbare Systeme
3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme
und viele mehr….
1. Metallothionein-Promoter
-260 -150 -140 -70 -60 -50 -20 0
GRE MRE MRE MRE MREGC TATA
MRE: Metal responsive elements
Promoter des Metallothionein1 Gens der Maus• wird durch Schwermetalle aktiviert (zu Beginn wurde dafür Cadmium benutzt) •Genprodukt dient der detoxifikation
•Spätere, modifizierte Varianten des Promoters erlauben die Aktivierung mit Zink
Nachteile:System ist sehr “leaky”Metalle sind oft entweder toxisch oder beinflussen massiv die Physiologie (Zink)Meist längere Zeiten bis der Promotor wieder inaktiv wird (besonders in vivo)
2. Tetracyclin regulierbare SystemeTn10 Transposon aus E. coli codiert für Tetracyclinresistenz
TREPromoter TRE
Tet-Repressor
-Tetracyclin
TREPromoter TRE
+Tetracyclin
Tet-Operator
PCMV Tet-Repressor
+ Dox
tetO Reporter-Gen
Tet-Repressor System
PCMV Tet-Repressor
-Dox
tetO Reporter-Gen
Dox: Doxycyclin – ein Tetracyclin-Analogon
- Dox +Dox
- Dox +Dox
Weiterentwicklungen : Der Tet-Repressor ist mit einem Transregulator fusioniert
Promoter TetR VP16
Tet-Off
Tetracyclin-Bindestelle
DNA-Bindedomäne
Transaktivator-Domäne
tTATetracyclin regulierbarer Transaktivator
Tet-Off/On Systeme
Tet-Off Tet-On
Tet-Off: ist Tet da, keine TK Tet-On: ist Tet da, dann TK
Tet-Off/On Systeme
Vor- und Nachteile von Tet-Regulierbaren Systemen:
• Relativ hohes Maß an Aktivierung
• Einfach und vielseitig, funktioniert in fast allen Zellen und auch in vivo (Mausmodellen)
• Mit Doxycyclin gute Verfügbarkeit im gesamten Organismus (alle Zellen werden erreicht).
• Systeme sind zu “leaky”, um toxische Proteine zu exprimieren.
3. Steroidrezeptor abgeleitete Systeme
Estradiol
Zelle
Zielgen
NNAGGTCANNNTGACCTNNEstrogen response element
Estradiol-rezeptor
Prinzipieller Aufbau:
DNA-Bindung
Ecdysonrezeptor
Liganden-Bindung
GAL4- DNA-Bindedomäne(aus Hefe)
Dimerisierung
Rezeptor Aktivator
Transaktivator
Retinsäurerezeptor (RXR) Dimerisierungsdomäne
VP16 Transaktivator-Domäne aus HSV
RheoSwitch-System (New England Biolabs)
Vor- und Nachteile :
•Sehr hohes Maß an Aktivierung (10.000X)
•Sehr geringe basale Aktivität
•Der Ligand besitzt gute Eigenschaften in Bezug auf Nebenwirkungen, Stabilität und “Biodistribution – und availability”
Regulation auf RNA-Ebene:RNA-Interferenz (RNAi)
• natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen
• wichtige Rolle in der Genregulation und Abwehr von Viren
• hemmt die Expression einzelner Gene
• post-transkriptionell oder translationell
• führt zur Spaltung oder zur Translationsblockade einer Ziel-mRNA
• reduziert somit die Produktion spezifischer Proteine
• RNA als Ziel erkennendes Molekül
miRNA
siRNA
shRNA
Dicer: Rnase III Ribonuclease,• Spezifität für dsRNA,• Schnitt alle ~ 22 Nukleotide• 5‘-Phosphat , 3‘-Überhang
RISC: RNA induced silencing complex• 250K Precursor Complex• 100K aktiver Komplex nach Bindung von ATP und „unwinding“ von dsRNA zu ssRNA
RNA interference
Dicer
RISC
miRNA
• micro RNA
• kleine ssRNA (17-23Nt): biologisch aktive Form
• ca.1-3% der Gene im Genom höherer Eukaryonten kodieren für
spezielle miRNAs ⇨ endogene RNAs
• spielen bei der Steuerung einer Vielzahl von zellulären Prozessen
eine entscheidende Rolle
• wirken hauptsächlich über RNAi, als negative Regulatoren der
Genexpression auf Translationsebene
n Transkription der miRNA-Gene durch RNA Pol II im Kern:
pri-miRNA (primary miRNA):
§ Prozessieren der pri-miRNA durch Drosha (RNase III) im Kern:pre-miRNA (precursor miRNA):
§ Transport über den Exportin 5 Rezeptor ins Cytoplasma§ Schneiden der pre-miRNA durch Dicer (RNase III):
ds miRNA:§ Einbau des „anti-sense“-Stranges in den RISC Komplex:
§ Erkennen und Binden der komplementären mRNA:
a) vollst. Basenpaarung: Abbau der mRNA
b) unvollst. Basenpaarung: Hemmung der Translation
miRNA
miRNA
miRNAs haben generell keine perfekte Komplementarität zum Target,daher bildet sich ein Loop aus typisches Merkmal von miRNAs
siRNA
• small interfering RNA• kurze dsRNA (19-28 Nt) mit Einzelstrangüberhängen• Entstehung:
a) herausgeschnitten aus langer dsRNA (z.B durch viralen Befall)
durch das Enzym Dicer
b) synthetisch ⇨ Transfektion von Zellen• wirken über RNAi und führen somit zu einer verminderten Expression
spezifischer Proteine (knockdown)
Auswahlparameter für „target sequence“
• 19-23nt unique sequence (max. 15bp matches zu anderen Genen)• Bereich der CDS• Sequenzen sollen nicht im Bereich von 100bp des TK-Starts bzw.
der TK-Termination sein• Base an +1 Position soll ein Purin sein (für POL III Effizienz)• Die Helix-Struktur soll im 5‘-Bereich des „top-strands“ stabiler sein
als in seinem 3`-Bereich• Für bessere Effizienz des Silencing sollten die beiden Bases
unmittelbar upstream der Target-Sequence AA sein• GC-Gehalt zwischen 30% und 70%, möglichst weniger als 50%
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siRNA
siRNA
Vorteile der Transfektion mit siRNA:Ø schnell und unkompliziertØ gute TransfektionseffizienzØ kaum toxisch
Nachteile der Transfektion mit siRNA:Ø Synthese der RNA: teuerØ nur knockdown, kein knockout → geringe Proteinmengen reichen z.T. aus, um die normale Proteinfunktion zu erhalten Ø transiente Transfektion → Proteinmenge steigt wieder mit fortlaufender Zellteilung
shRNA:
• kurzes RNA Transkript (< 23 Nt), das sich zu einer Stammschleife falten kann
§ Einbringen in die Zelle mittels eines Plasmid-Vektors
kontinuierliche Expression der shRNA
§ führt über den Mechanismus der RNA-Interferenz zum knockdown spezifischer Proteine
kontinuierliche Repression der Translation spezifischer Proteine
Dicer
stabile Transfektion
short hairpin RNA
Vektorbasierte RNAi
Nebenwirkungen
Endogene miRNAs als Regulatoren
Regulierbare Proteine
Regulierbare Proteine
Beispiel: ProteoTuner von Clontech
Ebenen der Genregulation in Eukaryoten
Transkription
RNA-Stabilität
TranslationProteinmodifikation
Cytoplasma
ZellkernIntrons Exons
Gen
AAAAA
AAAAA
AAAAA
Cap
mRNA
Protein
DNA
Transkription
Protein-Tuning
Tet-Off/OnSteroid-Rezeptor-Systeme
RNAi
siRNA –Video
Ende