Praktikum Biochemie II - biochem.uni-frankfurt.de · 26.11.09 Tönjes: Genome, endogene Retroviren...

Praktikum

Biochemie II

WS 2009/2010

3-wöchiges Praktikum im Hauptstudium der Biochemie

Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-Str. 51-59

D-63225 Langen Tel.: 06103-77-0

Wichtig: Alle Teilnehmer bitte am Montag, den 16.11.2009 um 9:00 Uhr an der Pforte des Paul-Ehrlich-Institutes melden

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Praktikumsleitung: Prof. Dr. Christian J. Buchholz Tel.: 06103-774011 Email: [email protected] Prof. Dr. Ralf Tönjes Tel.: 06103-774010 Email: [email protected] Beteiligte Arbeitsgruppen Abt. Medizinische Biotechnologie (Leiter Prof. Dr. Cichutek): Fachgebiet 6/5 „Virale Gentransferarzneimnittel“ (Prof. Dr. Buchholz) Fachgebiet 6/2 „Nicht-virale Gentransferarzneimittel“ (Prof. Dr. Schweizer) Fachgebiet 6/3 „Tissue Engineering, Zelltherapeutika“ (Dr. Flory) Fachgebiet 6/4 „Xenogene Zelltherapeutika“ (Prof. Dr. Tönjes) Sachgebiet 6/01 „Rekombinante Masernviren und Impfstoffe“ (Dr. Mühlebach) Abt. Immunologie Fachgebiet 3/3 „Morphologie“ (Dr. Boller) Abt. Virologie Sachgebiet 2/01 „Forschung beim Abteilungsleiter“, (Dr. Schwantes/Dr. Suezer) Forschung beim Präsidenten (Prof. Dr. Löwer) Pr2 Retroelemente (Prof. Dr. Schumann) Nachwuchsgruppen NG1 Experimentelle Allergiemodelle (Dr. Toda) NG2 Neue Vakzinierungsstrategien und frühe Immunantworten (Dr. Waibler) NG3 Zelluläre Aspekte von Pathogen-Wirt Interaktionen (Dr. Weßler)

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Themenblöcke des Praktikums:

• Exp. 1: Immunologische Nachweismethoden I Gr. 1-3: Labor Toda Gr. 4-6: Labor Weßler

• Exp. 2: Immunologische Nachweismethoden II

Gr. 1-3: Labor Schweizer Gr. 4-6: Labor Waibler

• Exp. 3: Virusquantifizierung/siRNA

Gr. 1-3: Labor Toenjes Gr. 4-6: Labor Schwantes/Suezer

• Exp. 4: Genexpression in Säugerzellen

Gr. 1-3: Labor Flory Gr. 4-6: Labor Schumann

• Exp. 5: Viraler Gentransfer

Gr. 1-3: Labor Buchholz Gr. 4-6: Labor Mühlebach

• Exp. 6: Mikroskopische Verfahren

Gr. 1-6: Labor Boller

• Tierhausbesichtigung und Seminar Tierversuche Dr. Plesker, Dr. Cußler

Protokolle: Jede Gruppe (also A1, B1, usw.) fertigt zu jedem Experiment ein Protokoll an. Das Protokoll wird bis spätestens 15.12.09 an den jeweiligen Versuchsbetreuer per eMail geschickt. Das Protokoll wird einmal korrigiert (üblicherweise auf Papier). Das Protokoll wird entsprechend den Korrekturen überarbeitet. Danach muss eine akzeptable Endversion vorliegen, die dann abgezeichnet wird.

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Übersicht zum Zeitplan

1. Woche 16.11.-19.11.

2. Woche 23.11.-26.11.

3. Woche 30.11.-3.12.

Mo Gr. 1/4: Exp. 3 Gr. 2/5: Exp. 2 Gr. 3/6: Exp. 5

Gr. 1/4: Exp. 2 Gr. 2/5: Exp. 5 Gr. 3/6: Exp. 3


Di Gr. 1/4: Exp. 1 Gr. 2/5: Exp. 4 Gr. 3/6: Exp. 5



Mi Gr. 1/4: Exp. 3 Gr. 2/5: Exp. 2 Gr. 3/6: Exp. 5



Do Gr. 1/4: Exp. 1 Gr. 2/5: Exp. 4 + Tierversuche Gr. 3/6: Exp. 6

Gr. 1/4: Exp. 4 + Tierversuche Gr. 2/5: Exp. 5 Gr. 3/6: Exp. 1

Gr. 1/4: Exp. 5 Gr. 2/5: Exp. 1 Gr. 3/6: Exp. 4 + Tierversuche

Fr Riedberg Tag Riedberg Tag Riedberg Tag

Gruppeneinteilung: A1/B1=PEI 1, A2/B2=PEI 2, … A6/B6=PEI 6

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Theoretischer Teil BCII Praktikum (jeweils 9.00-10.00 im Hörsaal, wenn nicht anders angegeben) 16.11.09 Vorbesprechung/Einweisung 17.11.09 Schweizer: Retroviren und retrovirale Vektoren (gr. Konferenzraum) 18.11.09 Buchholz/Mühlebach: Oberflächenengineering von viralen Vektoren für Anwendungen in der Molekularen Medizin 19.11.09 Weßler: Mechanismen der Signaltransduktion in der Krebsentstehung: Untersuchung von Funktion und Bedeutung von Proteinkinasen (gr. Konferenzraum) 23.11.09 Waibler: FACS-Analyse von Immunzellen im Blut

24.11.09 Toda: Molecular mechanisms of allergic diseases: understanding of signal transduction in inflammatory cells 25.11.09 Boller: Mikroskopie und Elektronenmikroskopie: Ein Überblick über Methoden und Möglichkeiten 26.11.09 Tönjes: Genome, endogene Retroviren und Suppression der viralen Genexpression durch siRNA (gr. Konferenzraum; 8.30-9.30) 30.11.09 Schwantes/Suezer: Virustitration und Pockenvirus-Biologie 01.12.09 Flory: Intrazelluläre Signaltransduktionswege bei der Virus-Wirtszellinteraktion (Außenstelle) 02.12.09 keine Veranstaltung, Praktikumsbeginn mit jeweiligen Betreuern absprechen 03.12.09 Abschlußbesprechung (16.00-17.00)

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Montag 16.11.2009

Dienstag 17.11.2009

Mittwoch 18.11.2009

Donnerstag 19.11.2009

Freitag 21.11.2007

9.00 9.00 9.00 9.00 Riedberg 9.00-10.30 - Vorbesprechung - Einweisung

GenTG

9.00-10.00 - Einführung I

9.00-10.00 - Einführung II

9.00-10.00 - Einführung III

Gr. 1: Lightcycler (Exp. 3) Gr. 4: Primäre Fibroblasten (Exp. 3) Gr. 2/5: Zellen markieren (Exp. 2) Gr. 3/6: Transduktion (Exp. 5)

Gr. 1/4: Gele laden (Exp. 1) Gr. 2/5: Zellen transfizieren (Exp. 4) Gr. 3/6: Auswertung/DNA-Präp (Exp. 5)

Gr. 4: Virustitration (Exp. 3) Gr. 1: RT-Test (Exp. 3) Gr. 2/5: FACS (Exp. 2) Gr. 3/6: PCR/Auswertung (Exp. 5)

Gr. 1/4: Blots entwickeln (Exp. 1) Gr. 2/5: VM: Auswertung (Exp. 4) NM: Tierhausbesichti-gung und Seminar Tierversuche Gr. 3/6: EM/Fluoreszenz (Exp 6)

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Montag 23.11.2009

Dienstag 24.11.2009

Mittwoch 25.11.2009


Freitag 27.11.2009

9.00 9.00 9.00 9.00 Riedberg 9.00-10.00 - Einführung IV

9.00-10.00 - Einführung V

9.00-10.00 - Einführung VI

9.00-10.00 - Einführung VII

Gr. 1/4: Zellen markieren (Exp. 2) Gr. 2/5: Transduktion (Exp. 5) Gr. 3: Lightcycler (Exp. 3) Gr. 6: Primäre Fibroblasten (Exp. 3)

Gr. 1/4: Zellen transfizieren (Exp. 4) Gr. 2: EM (Exp. 6) Gr. 5: Fluoreszenz (Exp 6) Gr. 3/6: Gele laden (Exp. 1)

Gr. 1/4: FACS (Exp. 2) Gr. 2/5: Auswertung/DNA-Präp (Exp. 5) Gr. 3: RT-Test (Exp. 3) Gr. 6: Virustitration (Exp. 3)

Gr. 1/4: VM: Auswertung (Exp. 4) NM: Tierhausbesichti-gung und Seminar Tierversuche Gr. 2/5: PCR (Exp. 5) Gr. 3/6: Blots entwickeln (Exp. 1)

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Montag

30.11.2009 Dienstag 1.12.2009

Mittwoch 2.12.2009


Freitag 4.12.2007

9.00 9.00 9.00 9.00 Riedberg 9.00-10.00 - Einführung VIII

9.00-10.00 - Einführung IX

9.00-10.00 - Einführung X

16.00 - Abschluss-

besprechung

Gr. 1/4: Transduktion (Exp. 5) Gr. 2: Lightcycler (Exp. 3) Gr. 5: Primäre Fibroblasten (Exp. 3) Gr. 3/6: Zellen markieren (Exp. 2)

Gr. 1: Fluoreszenz (Exp. 6) Gr. 4: EM (Exp 6) Gr. 2/5: Gele laden (Exp. 1) Gr. 3/6: Zellen transfizieren (Exp. 4)

Gr. 1/4: Auswertung/DNA-Präp (Exp. 5) Gr. 2: RT-Test (Exp. 3) Gr. 5: Virustitration (Exp. 3) Gr. 3/6: FACS (Exp. 2)

Gr. 1/4: PCR (Exp. 5) Gr. 2/5: Blots entwickeln (Exp. 1) Gr. 3/6: VM: Auswertung (Exp. 4) NM: Tierhausbesichti-gung und Seminar Tierversuche

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Experiment 1: Immunologische Nachweismethoden I

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment an Mastzellen in der AG Toda

durch, die Gruppen 4-6 an Heliobacter pylori in der AG Wessler.

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Verlaufsplan: Tag 1:

• Zelllyse und Vorbereitung der Proteinextrakte

• Proteinbestimmung nach Bradford

• 1. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese

• 1. Western Blotting: Proteintransfer auf PVDF Membranen, Blocken der

Membran

Tag 2:

• 1. Western Blotting: Entwicklung mittels HRPO

• 2. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese

• 2. Coomassie Färbung

• Auswertung

Versuchshintergrund: H. pylori: Das Genexpressionsmuster einer Zelle wird permanent durch ein breites

Spektrum extrazellulärer Stimuli moduliert. Um auf Pathogene, wie z.B. Helicobacter

pylori, Wachstumsfaktoren, Mitogene, Hitze-Schock oder UV-Licht schnell reagieren

zu können, müssen die Zellen über Mechanismen verfügen, die es ermöglichen,

durch gezielte Genexpression auf den extrazellulären Stimulus spezifisch zu

reagieren. Einen besonders schnellen Weg der Signaltransduktion bieten reversible

Proteinphosphorylierungen, die direkt die Aktivität distinkter Transkriptionsfaktoren

kontrollieren. Eukaryotische Zellen verfügen über verschiedene evolutionär

konservierte Signalwege, die ein weites Spektrum an Proteinkinasen umfassen. Eine

besonders gut untersuchte Gruppe von Proteinkinase Kaskaden stellt die mitogen-

activated protein kinase (MAPK) Familie dar. Die MAPK Signalwege sind sequentiell

angeordnete Kinase-Kaskaden, in der jede Kinase als Substrat einer übergeordneten

Kinase aktiviert wird. Bis heute sind mehrere distinkte Subfamilien der MAPK

Kaskaden in Vertebraten bekannt, die ihrer Endpunkte entsprechend in (1) ERKs

(extracellular signal-regulated kinases), (2) JNKs (Jun N-terminal kinases)/SAPKs

(stress-activated protein kinases) und (3) p38 Kinasen unterteilt werden. Ein

gemeinsames Merkmal der MAPKs ist die regulierte Translokation vom Zytoplasma

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in den Nukleus, wo sie ihre spezifischen Substrate phosphorylieren, die das

Konsensus-Motiv Ser/Thr-Pro enthalten. In allen Fällen erfordert die maximale

Stimulierung der MAPKs (ERKs, JNKs, p38) die Phosphorylierung eines Threonins

und eines Tyrosins, die durch eine einzige Aminosäure voneinander getrennt sind.

Die Kinasen, die diese Aufgabe erfüllen, sind dual-spezifische MAPK Kinasen

(MAPKKs), die ihrerseits durch Serin/Threonin-spezifische MAPKK Kinasen

(MAPKKKs) reguliert werden (siehe Abb.). Die individuellen MAP Kinasen können im

allgemeinen unabhängig voneinander extrazelluläre Signale übertragen. Die

Diversität der regulatorischen Domänen der Proteinkinasen gibt der MAPK Familie

die Flexibilität, auf ein breites Spektrum extrazellulärer Stimuli zu reagieren.

H. pylori löst Deregulierungen in den infizierten Wirtszellen aus, die an der

Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, chronische Gastritiden,

Magenkrebs oder MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) Lymphome beteiligt

sind. Aufgrund seines Karzinogen Potentials wurde H. pylori 1994 von der WHO als

ein Klasse I Karzinogen eingestuft. Im Rahmen dieses Praktikums soll die

Aktivierung der ERK1/2 Kinasen nach einer Infektion gastraler Epithelzellen mit H.

pylori nachgewiesen werden, denen eine übergeordnete Rolle in der Proliferation

zugeordnet werden. Dazu sollen gastrale Epithelzellen (AGS Zellen) mit H. pylori

infiziert werden und die katalytische Aktivierung von ERK1/2 wird mit einem

spezifischen Antikörper mittels Western-Blot Analysen detektiert, wenn Threonin 202

und Tyrosin 204 von ERK1/2 phosphoryliert wurden.

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Mastzellen: Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei IgE-assoziierten allergischen

Erkrankungen. Die Zellen exprimieren einen hochaffinen Rezeptor für IgE (FcεRI) auf

der Zelloberfläche. Bindet ein Allergen an IgE-Antikörper welche an FcεRI gebunden

sind, kommt es zu einer Quervernetzung der FcεRI. Das hat die Degranulierung und

Aktivierung der Mastzelle zur Folge. Die Degranulierung führt zur Freisetzung von

bioaktiven Mediatoren wie Histamine, welche die frühe Phase der Reaktion

auslösen. Solche Reaktionen können Hautausschlag oder ein anaphylaktischer

Schock sein. Des Weiteren induziert die FcεRI-Quervernetzung durch Allergene die

Produktion von Cytokinen und Chemokinen. Durch Mastzellen produzierte Cytokine

und Chemokine triggern die Aktivierung und Infiltration entzündungsfördernder

Zellen, z.B. Eosinophile. Diese induzieren Enzündungsreaktionen, die verzögerte

Phase. Sowohl die frühe als auch die verzögerte Phase sind am auftreten und am

aufrechterhalten einer allergischen Reaktion beteiligt.

Die Quervernetzung von FcεRI triggert Signalkaskaden, welche die Aktivierung

verschiedener Kinasen, Phosphatasen und GTPasen zur Folge haben. Für die

Cytokin- und Chemokin- Produktion in Mastzellen spielt der Map-Kinase-Signalweg

eine wichtige Rolle. In diesem Signalweg werden zunächst Serin/Threonin–Kinasen

(Raf; MEKK) aktiviert, diese phosphorylieren und aktivieren weitere Kinasen (MEK,

JNKK). Das führt schließlich zur Phosphorylierung und Aktivierung der Map-Kinasen

ERK 1, ERK 2, JNK1 und p38. Die Map-Kinasen aktivieren Transkriptionsfaktoren

wie z.B. Ap-1 und NFκB, welche die Transkription und Produktion von Cytokinen und

Chemokinen fördern.

Die rat basophilic leukemia (RBL-2H3) Zellinie wird als Model für Mastzellen

verwendet da RBL-2H3 Zellen eine große Menge an FcεRI expressionieren. In dem

Versuch, der im Rahmen des Praktikums durchgeführt werden soll, wird die

Phosphorylierung der ERK1/2 in RBL-2H3 Zellen nach der Aktivierung durch FcεRI

Quervernetzung durch IgE/antigen gemessen.

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Versuchsdurchführung: Tag 1: Zelllyse und Vorbereitung der Proteinextrakte:

Gruppe H. pylori: Vorbereitete Zellen werden für 30 min mit Helicobacter pylori

infiziert. Dabei wird eine MOI 1:100 („multiplicity of infection“) eingesetzt. Die

Bakterien werden mit einem sterilen Wattenstäbchen (angefeuchtet mit PBS) von der

Platte genommen und in ca. 5 ml PBS resuspendiert. Bei einer Wellenlänge von 600

nm wird die optische Dichte der Bakterien gemessen und die Bakterienmenge an

einer vorbereiteten Eichkurve abgelesen. Das einzusetzende Volumen der

Bakteriensuspension wird errechnet, in die Zellkulturschalen pipettiert und vorsichtig

verteilt. Der Infektionsansatz wird für 30 min im Inkubator inkubiert (Probe 2). Als

Negativkontrolle wird PBS (Probe 1) und als Positivkontrolle wird eine

Zellkulturschale mit 100 nM Phorbolester PMA für 30 min stimuliert (Probe 3).

In einem Parallelversuch werden Zellen für 4 h mit H. pylori infiziert und alle 60 min

fotografiert.

Gruppe Mastzellen: RBL-2H3 werden mit 10 ng/ml anti-DNP IgE in MEM-Medium

mit 5 % FBS über Nacht sensibilisiert. Am nächsten Tag werden die Zellen mit MEM

mit 0,5 % BSA (MEM/BSA) dreimal gewaschen. Die Zellen werden mit 10 ng/ml

DNP-HSA in MEM/BSA (5 ml) für 5 min bei 37°C stimuliert. Als Negativ-Kontrolle

werden die Zellen nur mit MEM/BSA und als Positiv-Kontrolle mit PMA unter den

gleichen Bedingungen inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 5 ml kalten

PBS gestoppt und die Zellen mit 5 ml kalten PBS gewaschen. Durch Zugabe von 300

µl Lyse-Puffer werden die Zellen lysiert. Die Lysate werden in ein 1,5 ml

Reaktionsgefäß gegeben und 30 min auf Eis stehen gelassen. Darauf folgend wird

bei 12000 rpm für 10 min bei 4°C zentrifugiert und der Überstand in ein neues

Reaktionsgefäß überführt. Die Protein-Konzentration wird mittels BCA-assay

bestimmt.

Lysis-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 0.5 % NP-40 0.5 % Na-Deoxycholat frisch dazu geben: 1 x Protease-Inhibitoren-Mix 1 mM Na-Vanadat

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1 mM Natrium-Molybdat 20 mM NaF 10 mM NaPP 20 mM ß-Glycerophosphat

Proteinbestimmung nach Bradford:

Die Bestimmung der Proteinkonzentration soll anhand eines Bradford-assays

durchgeführt werden. Durch die Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue an

Proteine kann im Vergleich zu Standardproteinmengen (Rinderserumalbumin, BSA)

die Menge an Protein in unbekannten Proben bestimmt werden. Zur Ermittlung der

Eichkurve wurden unterschiedliche Mengen an BSA (1, 2, 4, 8 und 16 µg) zu der

Bradford-Lösung gegeben und die Absorption bei 595 nm gemessen. Die Werte

wurden in einer Eichkurve aufgetragen, aus der die Proteinmengen unbekannter

Proben abgelesen wurden.

Die Berechnung der Proteinkonzentration der Proben erfolgt computergestützt.

Proteinbestimmung mit BCA nach PIERCE:

Zunächst wird die BCA Stammlösung 50:1 (Reagenz A:B) angesetzt und die BSA

Standardlösung je 1:2 von 2000 µg/ml bis 8 µg/ml mit Lysispuffer verdünnt.

Anschließend werden 10 µl Standard oder 10 µl Probe in die Wells pipettiert und

mit 200µl BCA-Lösung 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Absorption wird bei 562

nm gemessen und mit Hilfe des Programms Soft Max Pro die Proteinkonzentration

berechnet.

Proben aufbereiten: Für den Gellauf werden von den Proben 30 µg in ein neues Eppi

pipettiert und mit SDS Probenpuffer (4 fach konzentriert) 5 min bei 95° C im

Heizblock aufgekocht. Für die Coomassie-Färbung (siehe Tag 2) wird ein zweiter

Ansatz pipettiert, ebenfalls im Heizblock aufgekocht und dann bei -80°C eingefroren.

1. SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese:

Glasplatten gründlich mit A. Bidest. waschen, abtrocknen und zusammenbauen,

Trenngellösung für ein 12 %iges Gel:

30 % Acrylamid, 0,8 % Bisacrylamid 4 ml 1M Tris/HCl pH 8.8 3.76 ml

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20% SDS 50 µl A. Bidest 2.08 ml TEMED 10 μl Ammoniumpersulfatlösung 10 %ig 100 μl

Trenngellösung vorsichtig zwischen die Glasplatten füllen, bei denen die

Trenngelhöhe vorher markiert wurde. Mit Wasser oder isopropanol überschichten, so

dass eine gerade Trenngelfront entsteht. Nach dem Auspolymerisieren ca. 30 min

vorsichtig das Wasser abgießen und mittels Filter trocknen. Jetzt kann das

Sammelgel bis zur oberen Kante eingefüllt und der Kamm eingesetzt werden.

Sammelgellösung für ein 4 %iges Gel:

30 % Acrylamid, 0,8 % Bisacrylamid 0,4 ml 1 M Tris/HCl pH 6.8 0.38 ml 20% SDS 15 µl A. Bidest 2.15 ml TEMED 3 µl Ammoniumpersulfatlösung 10 %ig 30 µl

Weitere Lösungen:

10 x Laufpuffer für 1 l, pH 8.3 30.2 g Tris-Base 144 g Glycin 10 g SDS (Natriumlaurylsulfat) auf 1L mit H20 Der Laufpuffer ist 10 x konzentriert und muss mit A.Bidest 1:10 verdünnt werden.

4 x SDS-Probenpuffer: 125 m M Tris/HCl pH 6.8 6 % SDS 20 % Glycerin 10 % b-Mercaptoethanol 0,02% Bromphenolblau ad 20 ml A. Bidest

Mittels einer Hamilton-Spritze vorher kurz die Gelslots mit Elektrophoresepuffer

spülen. Danach die Proben und Proteinstandards (5 µl) in die Geltaschen laden. Die

Kammern anschließen und die Proben 10 min bei 100 V einlaufen lassen.

Anschließend bei 160 V laufen lassen (ca. 1.5 h) bis die Bromphenolblaufront aus

dem Gel herausgelaufen ist.

1. Western-Blot:

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Pro Minigel werden 2 Filterpapiere (Dicke: 3mm) und die PVDF-Membran zurecht

geschnitten. Die Membran wird für ein paar Sekunden in Methanol getaucht bis sie

vollständig durchgefeuchtet ist, dann wird sie kurz in Transferpuffer geschwenkt.

Kathode

Filter (3-4x)

Polyacrylamidgel

Membran

Filter (3-4x)

Anode

Zusammenbau des Blots auf der Semi-dry transfer-Apparatur:

Filterpapier, getränkt in Transferpuffer; darüber die PVDF-Membran; beides

luftblasenfrei an die Anode andrücken; darüber das Gel (Größenmarker links);

luftblasenfrei arbeiten; darüber Filterpaper, getränkt in Transferpuffer; wieder

Luftblasen entfernen. Die Kathode auflegen; der Transfer erfolgt bei 15 V für 45 min.

Nach dem Transfer wird die Membran 1 h in Rotiblock (Gruppe H. pylori) bzw. 5%

Milk in TBST (Gruppe Mastzellen) blockiert. Der Primärantikörper wird in TBS-T

(Gruppe H. pylori) verdünnt und mit der PVDF-Membran über Nacht bei 4°C

inkubiert. H. pylori-Gruppe: Zu Detektion des phosphorylierten ERK1/2 wird der

Primärantikörper (1:2000 Verdünnung anti-phospho-ERK1/2) in 4 ml Rotiblock

(+10 µM Na-Vanadat) (Gruppe H. pylori) bzw. in 1% BSA in TBST (Gruppe

Mastzellen) gegeben und zusammen mit der PVDF Membran eingeschweißt. Der

Primärantikörper wird über Nacht bei 4°C mit der Membran unter leichtem

Schwenken inkubiert.

1x Transfer-Puffer: Tris-buffered saline (TBS):

Tris-Base 24 mM 20 mM Tris-HCl, pH 7.4

Glycine 192 mM 8 g NaCl

20 % Methanol ad 1 L A. Bidest

ad 1 L A. Bidest. Für TBS-T: Zusatz von 0.1% Tween-20

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Tag 2: Western-Blotting Entwicklung:

Die über Nacht in primärem Antikörper inkubierten Membranen werden 3 X 5 min in

TBS-T gewaschen und dann für 1 h bei RT in sekundärem Antikörper geschwenkt

(Gruppe H. pylori: anti-Rabbit horseradish-peroxydase-conjugated, 1:10000 in TBS-

T; Gruppe Mastzellen: anti-Rabbit horseradish-peroxydase-conjugated, 1:1000 in

TBS-T). Die Membranen werden dann wie oben 3 X gewaschen und nachfolgend 1

min mit dem Chemiluminiszenz-Substrat inkubiert (dazu Reagenz 1 und 2 zu

gleichen teilen mischen). Danach werden die Membranen in Folien eingeschweißt,

Röntgenfilm in der Dunkelkammer aufgelegt und belichtet (verschiedene

Zeitintervalle, je nach Intensität der Banden).

Coomassie-Färbung:

Anhand einer zweiten SDS-PAGE wird zur Kontrolle der Proteinmenge auf dem Gel

eine Coomassie-Färbung durchgeführt. Coomassie Brilliant Blue färbt unspezifisch

alle Proteine, so dass nach einem Entfärbeschritt die Proteine je nach ihrer Größe

und Menge in unterschiedlich stark gefärbten Banden auf dem Gel erscheinen.

Färbelösung:

0,25 g Coomassie Brilliant Blue

90 ml Methanol:H2O (5:4) plus 10 ml Eisessig

Entfärbelösung:

90 ml Methanol:H2O (5:4) plus 10 ml Eisessig

Die Gele werden für 2 h in der Färbelösung gefärbt und dann für 2 h entfärbt.

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Experiment 2: Immunologische Nachweismethoden II

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment an humanen Zellen (PBMC) in der AG

Schweizer durch (A), die Gruppen 4-6 an murinen Zellen in der AG Waibler (B).

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Inhalt des Praktikums In diesem Versuch sollen periphere humane Blutlymphozyten (PBMCs= peripheral blood

mononuclear cells) oder Immunzellen der Maus isoliert und auf charakteristische

Oberflächenmarker mittels FACS-Analyse untersucht werden. Grundsätzlich spielen

Lymphozyten eine bedeutende Rolle für den Ablauf von Immunreaktionen. Normalerweise

sind sie für die erworbene (adaptive) Immunität verantwortlich und dienen der Abwehr z.B.

von Mikroorganismen oder entarteter Zellen im Körper. Die Phänotypisierung erfolgt mittels

Bestimmung populationsspezifischer Zelloberflächenproteine (Clusters of Differentiation

oder CD-Marker). Diese lassen sich durch spezifische Antikörper identifizieren und

durchflußzytometrisch analysieren. Durchflußzytometrische Analysen werden zunehmend

bei zahlreichen immunologischen Fragestellungen auch zu diagnostischen Zwecken

durchgeführt, z.B bei der Immunphänotypisierung und Therapieüberwachung bei HIV-

Patienten.

Im Rahmen des Versuchs mit humanen PBMCs werden die Anteile an B-Lymphozyten

(CD19+), T-Lymphozyten (CD3+) und Monozyten (CD14+) bestimmt. Die beiden

Hauptklassen der T-Lymphozyten (d.h. aller CD3+) lassen sich durch den Nachweis der

Oberflächenmoleküle CD8 (für Zytotoxische T-Zellen) und CD4 (für T-Helferzellen)

voneinander unterscheiden.

Bei den Maus-Experimenten werden Immunzellen aus dem Blut, der Milz und dem

Thymus untersucht. Dafür werden unterschiedliche Mauslinien eingesetzt, bei denen (i) die

vier J-Elemente der variablen Region der schweren Kette von Immunglobulinen deletiert

sind (JHT), (ii) das Recombination Activating Gene 1 inaktiviert ist (RAG1-/-), oder (iii) bei

denen es sich um ganz normale wildtyp Mäuse handelt (WT). Im Rahmen des Versuchs

soll bestimmt werden, in welchen Organen sich B-Lymphozyten (CD19+), T-Lymphozyten

(CD3ε+) oder antigenpräsentierende Zellen (CD11c+) befinden, und welchen Einfluss die

Deletion der J Elemente oder die von RAG1 auf die Entwicklung der verschiedenen

Immunzelltypen hat.

Prinzip der Durchflusszytometrie Das FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) stellt eine schnelle Methode zur

Untersuchung von Oberflächenproteinen dar. Hierbei können Oberflächenproteine auf

Zellen detektiert und quantifiziert, und damit Subpopulationen in Zellgemischen untersucht

werden.

Hierfür werden Zellen mit Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern gefärbt

und nach Lichtstreuung und Fluoreszenzintensität analysiert. Die Lichtstreuung in 180°

Vorwärtsrichtung (Forward Scatter) gilt als Maß für die Größe der Zellen (kleine dichte

Zellen streuen weniger Licht), die in 90º (Side Scatter) als Maß für die die Granularität.

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Die an die Antikörper gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B.

Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE) werden bei der gleichen

Wellenlänge (480 nm) von einem Argon-Laser zur Emission von Lichtimpulsen angeregt.

Der Emissionsbereich von FITC (Grünfluoreszenz) liegt zwischen 500 und 570 nm, der von

PE (Rotfluoreszenz) reicht von 570-600 nm.

Abb. 1: Schematische Abbildung des optischen Systems eines FACS-Geräts. Die Zellprobe

(sample) wandert in einer Küvette an einem Argonlaser (488 nm) vorbei. Hierbei wird das Licht zum

einen durch die Zellen gemäß ihrer Größe und Granularität gestreut, zum anderen wird das

Fluorochrom des entsprechend markierten Antikörpers angeregt und emittiert das Licht in einer für

das Fluorochrom typischen Wellenlänge. So genannte Photodetektoren registrieren das emittierte

Licht und setzen dieses in digitale Signale um, die dann mit Hilfe einer entsprechenden Software

dargestellt und analysiert werden können.

Da die Emissionsmaxima von Fluoreszenz 1 (FITC-530 nm) und Fluoreszenz 2 (PE-585

nm) oder Fluoreszenz 3 (z.B. PJ-615 nm) in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen

liegen, die von entsprechenden Photodetektoren registriert werden, lassen sich mehrere

Farbstoffe gleichzeitig messen (Mehrfarben-Immunfluoreszenz). Auf Grund der teilweise

überlappenden Emissionsbereiche müssen die Detektoren für die Fluoreszenzen 1 und 2,

so wie 2 und 3 gegeneinander kompensiert werden. Ein elektronisches System, der

Photomultiplier, erhält die Lichtimpulse von der optischen Einheit und übermittelt sie zur

Datenauswertung an den Computer.

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Abb. 2: Beispiel für eine Auftrennung von Blutzellen nach Größe (FSC) und Granularität (SSC)

in einer Dot-Blot-Analyse. Jeder Punkt (Dot) repräsentiert eine Zelle oder Zellfragment, deren

Signal vom entsprechenden Photomultiplier an den PC übermittelt und im Dot-Blot entsprechend

ihrer Größe und Granularität dargestellt wird.

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A) Versuchsablauf humane PBMCs (AG Schweizer)

Teil I PBMC-Präparation und Kultivierung

Teil II FACS-Färbung und -Messung

FACS-Auswertung und Besprechung der Ergebnisse

Teil I

Isolierung von PBMCs aus humanem Vollblut Die PBMCs werden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Hypaque) aus dem

Vollblut eines gesunden Spenders isoliert. Hierbei sammeln sich die Lymphozyten und

Monozyten (PBMC), entsprechend ihrer spezifischen Dichte, in der Interphase zwischen

Überstand (Plasma/Thrombozyten) und Ficoll-Histopaque an. Das Zellsediment bilden

Erythrozyten und Granulozyten, die eine höhere Dichte besitzen (siehe Abb.).

Durchführung

• 15 ml Ficoll (Histopaque von Sigma 1077) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen vorgelegen

• 20 ml Vollblut je Falcon vorsichtig über das Ficollkissen schichten.

VORSICHT!: Ist das Vollblut einmal mit Ficoll-Lösung vermischt, ist es unbrauchbar.

• die Proben 30 min bei 2.000 rpm und bei Raumtemperatur zentrifugieren, ohne Bremse!

• die PBMCs bilden einen milchig-trüben Ring zwischen der oberen Plasmaphase und der

unteren Ficollphase

→ Interphasenring vorsichtig mit einer 2 ml Pipette abziehen und in ein neues 50 ml

Falcon-Röhrchen pipettieren in dem 10 PBS vorgelegt wurden

• um das restliche Ficoll zu entfernen werden die PBMCs mit PBS gewaschen. Falcons

mit 37°C warmem PBS auffüllen!

• Zentrifugation bei 1.200 rpm, 10 min, RT (mit Bremse)

Ficoll Ficoll

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• um die Erythrozyten vollständig aus der Lymphozytenfraktion zu entfernen, werden

diese mit Ammoniumchloridlösung lysiert.

→ Überstand verwerfen, PBMCs in 10 ml 0.86%iger Ammoniumchloridlsg.

resuspendieren und 10 min bei 37°C im Wasserbad inkubieren

• um das Ammoniumchlorids zu entfernen, wird das Falcon mit warmen PBS aufgefüllt

und die PBMCs erneut bei 1.200 rpm / 10 min abzentrifugiert

• Überstand verwerfen und die PBMCs nochmals mit 45 ml PBS resuspendieren und 10

min, bei 1.200 rpm zentrifugieren

• Zellpellet in 20 ml RPMI-Medium aufnehmen, Zellzahl bestimmen (s.u.)

Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität Zur Bestimmung der Zellzahl und der Vitalität der Zellen werden die PBMCs im Verhältnis

1:1 mit Trypanblau gefärbt. Trypanblau wird aufgrund der Membrandurchlässigkeit nur von

den toten Zellen aufgenommen. Die Zellen werden in eine Neubauer Zählkammer überführt

und gezählt. Die Zellkonzentration ergibt sich aus der Multiplikation von Zellzahl,

Verdünnungsfaktor und Kammerfaktor (104).

Beispiel:

Die Neubauerkammer hat in der Mitte ein Kreuz aus engen Linien. Die 4 Eckfelder

(Gruppenquadrate) sind in je 16 Einzelquadrate unterteilt. Zellen in mindestens 2 (bei

besonders wenig Zellen 4) Eckfeldern zählen.

→ Berechnung

150 Zellen wurden in 2 Eckfeldern gezählt

15 µl Zellsuspension wurde mit 15 µl Trypanblau verdünnt » Faktor 2

der Kammerfaktor (um vom Einschlussvolumen auf 1 ml umzurechnen) beträgt 10.000

150 : 2 x 2 x 10.000 = 1.5x106 Zellen/ ml

Insgesamt sind von der Zellsuspension 40 ml vorhanden:

1.5 x 106 Zellen x 40 ml = 6x107 Zellen insgesamt

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Kultivierung der PBMCs

• Zellen in einer Dichte von 1x106/ml in RPMI Medium (plus 10% FCS, 2 mM Glutamin,

Antibiotikacocktail, 200 U/IL-2 und 0.22g PHA) aufnehmen

• 2 ml der PBMC-Zellsuspension je 6-well aussäen

Teil II

FACS-Färbung und Analyse der PBMCs

• Zellen in 15 ml Falcon überführen, wichtig durch resuspendieren auch die adhärenten

Zellen ablösen

• Medium bei 1.200 rpm, 10 min und RT abzentrifugieren

• Zellpellet in 5-10 ml PBS aufnehmen

• Zellzahl mit Hilfe Neubauer-Zählkammer bestimmen

→ 15 µl Zellsuspension mit 15 µl Trypanblau mischen

• 5x105 Zellen pro Ansatz in FACS-Röhrchen überführen (insgesamt 10 Ansätze) und die

Röhrchen mit FACS-Waschpuffer auffüllen

• bei 1.500 rpm, 5 min und 4°C abzentrifugieren und Überstand verwerfen

• das Zellpellet in je 200 µl Waschpuffer aufnehmen und die folgenden

fluoreszenzmarkierten Antikörper zu pipettieren

1. Isotypkontrolle

2. CD19-PE

3. CD3-FITC

4. CD4-Cy5

5. CD8-PE

6. CD14-PE

7. CD3-FITC/CD19-PE

8. CD3-FITC/CD4-Cy5/CD8-PE

• die Proben 20 min bei 4°C (im Kühlschrank) inkubieren

• zum Waschen der Zellen, die FACS-Röhrchen auffüllen und 5 min, bei 1.500 rpm, 4°C

zentrifugieren

• Überstand dekantieren und Zellen erneut in 500µl Fixierlösung (1% PFA)

resuspendieren

• FACS-Messung (FACS Galaxy, Software: FloMax):

1. Dot-Plot: FSC/SSC (Zellpopulation festlegen)

2. Geräteeinstellung (Kompensation) mit Hilfe der Einzelfärbungen

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3. Dot-Plot: CD3/CD19

4. Dot-Blot: CD4/CD8 im Gate der CD3+ Zellen

5. Dot Blot CD14

6. Histogramm CD3 und CD19

Aufgaben Vervollständige die prozentualen Angaben der Lymphozyten-Populationen in folgendem

Schaubild:

1. Wieviel Prozent der Leukozyten sind T-Zellen, B-Zellen und Monozyten?

2. Wieviel Prozent der T-Zellen sind Zytotoxische T-Zellen bzw. T-Helferzellen?

3a. Beurteile die prozentuale Verteilung der gemessenen Lymphozytenpopulationen des

Spenders.

3b. Wie ist das Verhältnis von CD4+ zu CD8+ und welches Verhältnis ist liegt bei einem

gesunden Donor vor?

3c. Wie verändert sich dieses Verhältnis im Verlauf einer HIV-Infektion?

4. Wo würde man in einem FSC/SSC Dot Blot die Granulozten finden?

5. Fülle folgende Tabelle aus:

CD-

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Lymphozyt Marker Funktion

T-Helfer Zelle

Zytotoxische T

Zelle

B-Lypmphozyt

Monozyt

Makrophage

Granulozyten

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B) Versuchsablauf murine Zellen (AG Waibler)

Teil I Präparation von Blutzellen, Milzzellen und Thymuszellen aus WT, JHT und

RAG1-/- Mäusen

FACS-Färbung

Teil II FACS-Messung

FACS-Auswertung und Besprechung der Ergebnisse

Teil I

Präparation von Blutzellen, Milzzellen und Thymuszellen aus WT, JHT und RAG1-/-

Mäusen Für dieses Experiment werden je eine WT, JHT und RAG1-/- Maus eingesetzt. Für die

Blutentnahme werden die Tiere kurz betäubt. Nach dem Töten der Tiere werden die

Immunorgane entnommen.

Blut

• Die Maus wird durch Inhalations-Narkose mit Isofluran betäubt (erfolgt durch Betreuer)

• Das Blut wird retrobulbär abgenommen (erfolgt durch Betreuer)

• Das Blut wird in heparinisierte Microcontainer gegeben

• 15 µl heparinisiertes Blut wird für einen Färbeansatz eingesetzt

Milz

• Maus wird durch cervicale Dislokation getötet (erfolgt durch Betreuer)

• Maus wird auf die rechte Seite gelegt (Kopf zeigt nach links)

• Mit einer stabilen Schere wird eine Öffnung ins Fell geschnitten

• Die Öffnung wird weiter aufgerissen

• Die Milz wird mit einer chirurgischen Schere und Lidpinzetten entnommen

• Die Milz wird in eine Petri-Schale gelegt, ca. 5 ml PBS werden zugegeben und die Milz

wird mit Pipettenspitzen ausgeklopft

• Die Milzzellen werden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 10 ml Stab-Pipette

resuspendiert, Proben werden mit PBS auf 10 ml aufgefüllt

• Zentrifugation (5 min, 1200 rpm), Überstand verwerfen

• Zellpellet in 5 ml RBC-Lysis-Puffer resuspendieren und ca. 1 min bei RT inkubieren

• Zugabe von 5 ml PBS


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• Zellpellet in ca. 10 ml PBS resuspendieren und durch ein 70 µm Filicon filtrieren

• Zellzahlbestimmung (siehe unten)

Thymus

• Nach Entnahme der Milz wird die Maus auf den Rücken gelegt und der Brustkorb

entlang des Sternums mit einer stabilen Schere geöffnet

• Rippenbögen aufziehen

• Thymus entnehmen (Vorsicht: nicht ins Herz schneiden)

• Der Thymus wird in eine Petri-Schale gelegt, ca. 5 ml PBS werden zugegeben und das

Organ wird wie die Milz ausgeklopft

• Thymuszellen werden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 10 ml Stab-Pipette

resuspendiert, Proben werden mit PBS auf 10 ml aufgefüllt

• Zellsuspension durch ein 70 µm Filicon filtrieren

• Zellzahlbestimmung (siehe unten)

Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität Zur Bestimmung der Zellzahl und der Vitalität der Zellen werden diese seriell mit Trypanblau

verdünnt und gefärbt (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Trypanblau wird aufgrund der veränderten

Membrandurchlässigkeit toter Zellen nur von diesen aufgenommen, lebende Zellen bleiben

farblos. Eine geeignete Verdünnung wird in eine Neubauer Zählkammer überführt und die

lebenden (ungefärbte) Zellen ausgezählt. Die Zellkonzentration ergibt sich aus der

Multiplikation von Zellzahl (Mittelwert aus allen vier Quadranten), Verdünnungsfaktor und

Kammerfaktor (104).

Schematische Darstellung einer Neubauer Zählkammer mit vier

Quadranten à 16 Kleinquadraten.

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FACS-Färbung und Analyse der Proben In diesem Experiment werden die zuvor präparierten Blut-, Milz- und Thymuszellen aus WT,

JHT und RAG1-/- Mäusen mittel spezifischer, Fluorochrom-gekoppelter Antikörper angefärbt.

Blut

• Pro Färbeansatz 15 µl heparinisiertes Blut in FACS-Röhrchen überführen

• Zugabe der Antikörper nach dem Schema der Färbeansätze (siehe unten), vortexen

• Inkubation der Proben für 15 min bei 4°C (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)

• Zugabe von 1 ml Blut-Lyse-Puffer (nicht RBC-Lysis-Puffer)

• Inkubation der Proben für 20-30 min bei RT (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)


• Zugabe von 1 ml FACS-Puffer

• Zentrifugation (5 min, 1200 rpm), Überstand verwerfen und Zellpellet im verbleibenden

Restvolumen resuspendieren (vortexen)

Milz und Thymus

• 2x105 bis 1x106 Zellen in 50 µl FACS-Puffer pro Färbeansatz in FACS-Röhrchen

überführen (Zellen ggf. vorher auf gewünschte Zellzahl einstellen)

• Zugabe der Antikörper nach dem Schema der Färbeansätze (siehe unten), vortexen

• Inkubation der Proben für 15 min bei 4°C (Proben sollen dunkel aufbewahrt werden)

• Zugabe von ca. 1 ml FACS-Puffer


• Zellpellet in 100 µl FACS-Puffer und 100µl 1%iger Paraformaldehyd-Lösung

resuspendieren (vortexen)

Schema der Färbeansätze

1. ungefärbt

2. 1 µl anti-CD3ε PE

3. 1 µl anti-CD19 FITC

4. 1 µl anti-CD11c APC

5. 1 µl anti-CD3ε PE + 1 µl anti-CD19 FITC + 1 µl anti-CD11c APC

WT Blut: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

WT Milz: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

WT Thymus: Färbeansätze 1. – 5. durchführen

JHT Blut: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

JHT Milz: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

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JHT Thymus: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Blut: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Milz: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

RAG1-/- Thymus: Färbeansätze 1. und 5. durchführen

Die gefärbten Zellen können bis zur Messung am Durchflusszytometer bei 4°C gelagert

werden.

Teil II

FACS-Messung und Auswertung der Daten Die FACS-Messung der in Teil I isolierten und gefärbten Zellen erfolgt am

Durchflusszytometer LSR II der Firma BD. Die gewonnenen Daten werden mit der BD

FACSDiva ™ Software analysiert. Zur Besprechung der Ergebnisse beantworten Sie bitte

folgende Fragen:

1. Welche Zelltypen können Sie mit Hilfe der verwendeten Antikörper detektieren?

2. Wie sieht die prozentuale Verteilung von T-Zellen, B-Zellen und antigenpräsentierenden

Zellen in Blut, Milz und Thymus aus?

3. Welche absoluten Anzahlen von T- und B-Zellen finden sich in der Milz und im Blut von

Mäusen?

4. Welchen Einfluss hat die Deletion der J Elemente auf die Entwicklung von Immunzellen

in den verschiedenen Organen?

5. Welchen Einfluss hat die Deletion von RAG1 auf die Entwicklung von Immunzellen in

den verschiedenen Organen?

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Experiment 3: Virusquantifizierung/siRNA

Wichtig

Experiment 3 wird an zwei verschiedenen Viren durchgeführt. Die

Gruppen sind wie folgt eingeteilt:

Gruppen 1-3: Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen

Zellen durch siRNA (AG Toenjes)

Seite 32-43

Gruppen 4-6: Quantifizierung von Vacciniaviren (AG Schwantes/Suezer)

Seite 44-54

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Experiment 3: Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen Zellen durch siRNAs AG Toenjes Ziele des Versuchs: 1. Ermittlung der absoluten Viruslast in infizierten Zell-Linien. 2. Nachweis der spezifischen Reduktion der Virusbelastung durch porzine

endogene Retroviren (PERV) in Zellkultur-Überständen mittels PERV-spezifischer siRNAs.

Theorie: Hemmung der Genexpression durch siRNA 1990 wurde das Posttranscriptional Gene Silencing (PTGS) in Petunien (Solanaceae) gefunden, nachdem Forschergruppen um Mol und Jorgensen versuchten, die Blütenfärbung von Petunien durch das Einbringen eines zusätzlichen Pigmentgens zu verstärken und dabei das genaue Gegenteil erreichten. Es konnte gezeigt werden, dass die Gene nicht nur auf der Ebene der Transkription abgeschaltet wurden, sondern ebenso die zugehörige mRNA schnell abgebaut wurde. Etwas später wurden ähnliche Erkenntnisse bei Pilzen (Neurospora; „Quelling“), Würmern, Fliegen und Mäusen gewonnen (1, 2). Die Technik der RNA Interferenz (RNAi) wurde 1998 durch A. Fire und C. Mello in Caenorhabditis elegans nachgewiesen (1, 2, 3). Doppelsträngige RNA (dsRNA) führte zu einem effizienten und spezifischen Gene-Knockdown. Wird eine doppelsträngige (ds) RNA mit homologer Sequenz zu einer zelleigenen mRNA in eine Zielzelle eingebracht, startet der Vorgang des PTGS, indem Dicer, eine ATP-abhängige Ribonuklease, die dsRNA in viele kleine Stücke schneidet. Es entstehen sogenannte small interfering RNAs (siRNAs). Diese siRNAs wandern zu einem Enzymkomplex, dem sog. RNA-induced-silencing-complex (RISC). Anhand der siRNA wird das komplementäre Stück der zelleigenen mRNA gefunden, zerschnitten und somit die Proteinsynthese des entsprechenden Gens unterbunden (Abb. 1). In höheren Eukaryoten führt lange, dsRNA (mehr als 30 Basenpaare) zu unspezifischen Auswirkungen bzw. zur Apoptose, da diese die enzymatische Zerstörung aller mRNAs und den Stop der Proteinsynthese bewirkt. Erst die Arbeit von S. Elbashir unter der Leitung von T. Tuschl konnte 2001 dieses Problem umgehen, indem kurze dsRNAs von 21 nt Länge verwendet wurden, die am 3’-Ende jeweils 2-3 Nukleotide überstehen. Solche kurzen siRNA-Moleküle können synthetisch hergestellt und in die Zielzellen eingebracht werden. Man steigt dadurch in den Prozess des PGTS zwar erst später ein, erzielt jedoch den gleichen Effekt (1, 2, 4; Abb. 2). Weiterführende Informationen zu siRNA und MicroRNA siehe http://opengenomics.org/CSB2005_RNAiTutorial/3-CSB2005-B&WSlides.pdf

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Die Lage der synthetischen siRNAs innerhalb der Genomstruktur von PERV, die im Versuch verwendet werden, ist in Abb. 3 dargestellt. Die Nukleotidangaben beziehen sich auf eine Referenzsequenz (PERV-B(33)ATG; Acc.No. AJ133816) und bezeichnen die Positionen, die von den siRNAs erkannt werden. Abb. 1:

Modell der molekularen Schritte des Posttranskriptional Gene Silencing (PTGS) http://www.laborjournal.de/rubric/archiv/stichwort/w_02_07.html (2) Abb. 2:

RNA Interferenz (RNAi) mit siRNA http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10075 (5)

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Abb. 3

Genomstruktur von PERVPosition der synthetischen siRNA‘s

Nukleotidangaben bezogen auf PERV-B(33)ATG (Czauderna et al. 2000)

3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag



3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag



3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag


3’-LTR

poly A site

env5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gag pol

SA 3’-LTR

poly A site

env

3’-LTR

poly A site

3’-LTR

poly A site

envenv5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

5’-LTR

cap site

PBS (Gly4)

SD

gaggag pol

SA

polpol

SA

1154 2728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag

11541154 27282728

gag I1245-1266

si 71414-1435

gag IV2086-2107

gag III1949-1970

gag

Zum Versuch: PERV-infizierte humane Zellen (293/PERV-B(33)) werden 48 Std. vor Beginn des Versuches mit PERV-spezifischen siRNAs in verschiedenen Kombinationen und einer nicht PERV-spezifischen siRNA, sowie MOCK (nur Transfektionsreagenz, keine siRNA im Ansatz) transfiziert. Als Negativkontrolle dienen nicht-transfizierte Zellen. Aus den Überständen der transfizierten Zellen wird virale RNA von PERV mittels des High Pure Viral RNA Kit (Roche) isoliert. Daraufhin wird mittels quantitativer One-Step RT-PCR (LightCycler, Roche) die Anzahl der Virionen pro µl Zellkultur-Überstand bestimmt. Aliquots der Überstände werden bei –80°C eingefroren und dienen als Template für einen reversen Transkriptase (RT)-Test (C-type-RT Activity Assay, Cavidi Tech). Es soll gezeigt werden, dass es durch den Einsatz spezifischer siRNA's möglich ist, die Anzahl der Virionen im Zellkultur-Überstand zu verringern und, dass unspezifische siRNAs keinen Einfluss auf die Virusexpression haben.

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Durchführung: ACHTUNG: Die Transfektion wird nicht von den Praktikanten durchgeführt, die folgende Beschreibung dient nur zum besseren Verständnis des Versuches! Pro Reaktionskammer (well) werden am Vortag der Transfektion 2x105 293/PERV-B(33)-Zellen ausgesät. Ansätze (je 1 µg siRNA/well): siRNA 7 (Eurogentec), siRNA I, III u. IV (Dharmacon) bei 2-er-Kombi je 2,5 µl siRNA/Ansatz bei 3-er-Kombi je 1,7 µl siRNA/Ansatz

Transfektion: • die zu transfizierenden siRNAs zu 0,1 ml Opti-MEM I (Invitrogen) in

Polystyrolröhrchen geben (A) • Mastermix aus 0,9 ml Opti-MEM I und 90 µl Transfektionsreagenz

Lipofectamine ansetzen und vortexen (B) • je Probe 0,1 ml B zu A geben, vortexen • 15–30 min bei RT inkubieren, damit sich die siRNA-Lipidkomplexe bilden

können • in der Zwischenzeit Zellen 1x mit 2 ml Opti-MEM I pro well waschen • je 0,8 ml Opti-MEM I zu A/B’s geben (= Transfektionsmix) • je 1 ml Transfektionsmix pro well • bei 37°C im Brutschrank 4-5 Std. inkubieren • Transfektionsmix absaugen • je well 2 ml Medium (DMEM + 10% FKS + Streptomycin/Penicillin + L-

Glutamin) zugeben nach 72 Std.: Überstände (Supernatant, SN) zellfrei filtrieren, Isolierung

der viralen RNA aus 200 µl SN, SN für RT-Test aliquotieren (je 1x 100 µl)

72 3

4 5

98

106

1

si7si7 + +

si I III +

si7 + MOCK Neg. control siRNA

unt .Zellen

I II IV X X

72 3

4 5

98

106

1

si7si7 + +

si I III +

si7 + MOCK

unt .Zellen

I II IV X X

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Filtration der Überstände und Aliquotierung: • 2x 10 Eppi’s analog den 6-well-plates beschriften (also: si7+I+IV,

siI+III+IV, … ODER von 1-10) [1x 10 Eppi’s für Isolierung viraler RNA, 1x 10 Eppi’s für RT-Test]

• 10 5-ml-Röhrchen beschriften und in Ständer einsetzen (= Auffanggefäße für filtrierte SN’s)

• je ca. 2 ml SN pro well mittels 2-ml-Spritze aufnehmen • durch 0.45 µm Sartorius-Filter in vorbereitete 5-ml-Röhrchen filtrieren • je 1x 100 µl zellfrei filtrierten SN in vorbereitete Eppi’s geben (für RT-

Test), bei -80°C (Gruppe A) bzw. auf Eis (Gruppe B) lagern

Isolierung viraler RNA (High Pure Viral RNA Kit, Roche): 1) Arbeitslösung herstellen: 5 ml Bindepuffer (grüner Deckel) ergänzt mit

50 µl poly(A) carrier-RNA 2) pro Eppi je 400 µl Arbeitslösung vorlegen, je 200 µl zellfrei filtrierten SN

zugeben und gut mischen (vortexen) 3) Inkubation bei Raumtemperatur (RT) für 10 min 4) High Pure Filter-Tubes in Auffanggefäße setzen und Proben in das

obere Reservoir pipettieren 5) 15 sec bei 10.000 rpm in Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugieren 6) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen, alte Auffanggefäße

verwerfen 7) je 500 µl Inhibitor Removal Puffer (Gefäß 3a, schwarzer Deckel) in die

oberen Reservoirs pipettieren (geht am besten mit einer Eppendorf Multipette und 12,5 ml-Combitip)

8) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren 9) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen, alte Auffanggefäße

verwerfen. Es folgen zwei Waschschritte. 10) Für den ersten Waschschritt 500 µl Waschpuffer (blauer Deckel) in die

oberen Reservoirs pipettieren (Eppendorf Multipette, 5 ml-Combitip) 11) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren 12) Filter-Tubes in neue Auffanggefäße setzen. Für den zweiten

Waschschritt je 400 µl Waschpuffer zugeben. 13) 1 min bei 8.000 rpm zentrifugieren, anschliessend 10 sec bei 13.200

rpm zentrifugieren (um Reste des Waschpuffers zu entfernen) 14) Auffanggefäße verwerfen und Filter-Tubes in sterile, Nuclease-freie 1,5

ml-Eppis einsetzen 15) Je 50 µl Elutionspuffer (Gefäß 4, farbloser Deckel) in die oberen

Reservoirs pipettieren (Eppendorf Multipette, 2,5 ml-Combitip) 16) 1 min bei 10.000 rpm zentrifugieren 17) Filter-Tubes verwerfen, Eppis mit vRNA verschließen und auf Eis stellen

(Gruppe A) bzw. bei –80°C lagern (Gruppe B). Die Proben dienen als Template für die One-Step RT-PCR mittels LightCycler.

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Quantitative One-Step RT-PCR (LightCycler, Roche): Die PCRs werden mittels des QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kits (Qiagen, Cat.No.: 204243) durchgeführt. Die PERV RT-PCR dient zur Bestimmung der Virionenzahl im Überstand PERV-infizierter Zellen. 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix, RNase-freies Wasser und Primer (F und R, je 10 µM) auftauen (im PCR-Raum), Template-RNAs (vRNA) und externen homologen Standard auf Eis auftauen (im Labor). Der PCR-MasterMix wird im PCR-Raum pipettiert, die Verdünnung des Standards und die Templatezugabe findet im Labor statt. Externen homologen Standard verdünnen (auf Eis; Wasser in Eppis vorlegen): Externer homologer Standard (= 326 bp T7-in-vitro transkribierte RNA): F/R (NdeI) [126 ng/µl] Berechnung der Kopienzahl: 6x1023 [Kopien/µl] x Konz. [g/µl] / MW [g/mol] MW (RNA) = Basepairs x 340 daltons/bp MW = 326 bp x 340 daltons/bp MW = 1,108x105 daltons Für die Konzentration von 126 ng/µl gilt also:

6x1023 x 1,26x10-7 / 1,108x105 = 6,82x1011 copies/µl Verdünnungsreihe: 1:6,8 (1 µl RNA + 5,8 µl H2O) = 1x1011 copies/µl, dann seriell 1:10 verdünnen von 1010 bis 103

Als Standard einsetzen:103 - 109 copies/µl Proben als Doppelbestimmung einsetzen! MasterMix ansetzen (PCR-Raum!): pro Probe: 5,8 µl RNase-freies Wasser 10 µl 2x QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master Mix 1 µl Primer F (0,5 µM Endkonz.) 1 µl Primer R (0,5 µM Endkonz.) 0,2 µl QuantiTect RT Mix 18 µl Gesamtvolumen gesamt (n+2 = 30): 174 µl RNase-freies Wasser 300 µl 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 30 µl Primer F 30 µl Primer R 6 µl QuantiTect RT Mix

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540 µl vortexen 18 µl pro Kapillare + je 2 µl Standard und Template-RNA (erst im Labor zugeben!) Probenreihenfolge: 1: Wasser 15: Probe 4 2: Standard 2 x 103 16: Repl. von Probe 4 3: Standard 2 x 104 17: Probe 5 4: Standard 2 x 105 18: Repl. von Probe 5 5: Standard 2 x 106 19: Probe 6 6: Standard 2 x 107 20: Repl. von Probe 6 7: Standard 2 x 108 21: Probe 7 8: Standard 2 x 109 22: Repl. von Probe 7 9: Probe 1 23: Probe 8 10: Repl. von Probe 1 24: Repl. von Probe 8 11: Probe 2 25: Probe 9 12: Repl. von Probe 2 26: Repl. von Probe 9 13: Probe 3 27: Probe 10 14: Repl. von Probe 3 28: Repl. von Probe 10 Kapillaren mit Deckel verschließen und mit Proben zum LightCycler gehen. Probenkarussell mit Kapillaren beladen und in Zentrifuge kurz zentrifugieren. Probenkarussell in LightCycler platzieren. PCR: RT-Reaktion 50°C 20 min Denaturierung 95°C 15 min Amplifikation (40 cycles) 94°C 15 sec 58°C 15 sec 72°C 16 sec slope 2°C/s, single

measurement Schmelzkurve 95°C 10 sec 65°C 10 sec 97°C 0 slope 0,1°C/s, cont.

measurement Cooling 40°C 30 sec (wenn nicht anders angegeben: slope 20°C/s) Nach Beendigung des PCR-Laufs werden die Proben entsorgt und es erfolgt entweder direkt die Auswertung der Daten oder aber am zweiten Tag (je nach Gruppeneinteilung). RT-Test (C-Type-RT Activity Assay, Protokoll B, Cavidi-Tech)

Bestimmung der Enzymaktivität der reversen Transkriptase im Überstand PERV-infizierter Zellen (d.h. in den Viruspartikeln, die sich im Überstand befinden).

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Sample Dilution Buffer (Flasche B) Reconstitution Buffer (Flasche C2) bei 37°C im Wasserbad auftauen Benötigte Anzahl poly(A)-beschichteter Streifen (siehe Tab.1), Sample Dilution Buffer (2x Flasche B2, weißer Deckel), RT Reaction components (Flasche C1, grüner Deckel, 1 Flasche pro 96-well-plate) und MMuLV-Standard (Flasche D, gelber Deckel, Lot-Nr. 05133) aus –20°C nehmen. Für Gruppe A: Proben aus -80°C nehmen und auf Eis auftauen. Reaktionsmix herstellen: • pro Platte 12 ml Reconstitution Buffer (C2) zu einer Flasche C1 geben,

gut mischen und in 50 ml Falcon geben • 6 ml Wasser zugeben • Sample Dilution Buffer (B) herstellen (je 5 ml aus B1 pro Flasche B2, gut

mischen und Inhalt beider B2‘s wieder in B1 geben, mischen) • 6 ml Sample Dilution Buffer (B) in Falcon geben, mischen Poly(A)-Platten vorbereiten: • entsprechende Anzahl 8-er-Streifen in 96-well-plate-Rahmen spannen

(Tab. 1) • pro well 200 µl Reaktionsmix mit elektronischer Mehrkanalpipette

zugeben • Platten mit selbstklebender Folie schließen • Präinkubation der Platten für 20-60 min bei 33°C •

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Tab. 1: Probenauftragung RT-Test

1

2

3

4

A 1

767 mU/ml

B 2

341 mU/ml

C 3

151 mU/ml

D 4

67,3 mU/ml

E 5

29,9 mU/ml

F 6

13,3 mU/ml

G 7

5,91 mU/ml

H 8

2,63 mU/ml

MMuLV-Standard verdünnen (gilt für Lot-Nr. MUL 05133 !): • 420 µl Sample Dilution Buffer (B) zu MMuLV-Lyophilisat geben, gut

mischen • 8 Eppi’s vorbereiten, je 250 µl Sample Dilution Buffer (B) vorlegen • 200 µl resuspendierten MMuLV Standard ins erste Eppi geben, vortexen • Pipettenspitze wechseln, 200 µl aus dem ersten ins zweite Eppi geben,

vortexen • Pipettenspitze wechseln, 200 µl aus dem zweiten Eppi ins dritte geben,

vortexen, usw. bis Eppi Nr. 8 RT-Reaktion starten: • Poly(A)-Platten aus 33°C-Inkubator nehmen • Standard (je 10 µl/well) in die erste Reihe pipettieren (von oben nach

unten abnehmend, entsprechend Tab. 1) • Proben zugeben (als Duplikate, Pipettierschema ist selbst zu entwerfen

und in Tab. 1 einzutragen), je 10 µl/well • Platten mit selbstklebender Folie verschließen

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• Platten für 2-3 Std. bei 33°C inkubieren Platten waschen: • Waschpuffer (2.5 ml Waschpufferkonzentrat, 75 ml 10% Triton X-100 ad

1 l H2O) • Platte im ELISA-Washer 3x mit 200 µl Waschpuffer pro well waschen

(Programm RT, last strip = 4) • Platte umgedreht auf Celltorks aufklopfen • Platte kann jetzt entweder eingefroren (-20°C, Gruppe B) oder der

Versuch fortgesetzt werden (Gruppe A) Inkubation mit Product Tracer: • 12 ml 1% Triton X-100 zu einer Flasche Product Tracer (O) geben,

vortexen • benötigt ca. 10-20 min, bis sich das Lyophilisat gelöst hat, zwischendurch

vortexen • je 100 µl Product Tracer pro well zugeben • Inkubation bei 33°C für 90 min Inkubation mit AP-Substrat: • Flasche mit AP Substrat Puffer bei 37°C im Wasserbad auftauen • AP-Substrat Tablette (P1) zu AP Substrat Puffer (Flasche mit Alufolie

umwickeln) geben, vortexen (braucht ca. 10 min zum Lösen) • Platte im ELISA-Washer 3x mit 200 µl Waschpuffer pro well waschen

(Programm s.o.) • Platte umgedreht auf Celltorks aufklopfen • je 125 µl AP-Substrat pro well, Platten mit Kunststoffdeckel schließen, im

Dunkeln 15-30 min inkubieren • Platten im ELISA-Reader messen (A405)

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Auswertung: a) Berechnung der Anzahl der PERV Virionen in den Proben und

Darstellung im Balkendiagramm (Mittelwerte bilden und Standardabweichung [Fehlerbalken] eintragen)

Anhand der PERV-Standardreihe der RT-PCR ermittelt die LightCycler-Software die RNA-Kopien in 2 µl Probe. Viruspartikel enthalten einen doppelten Satz virale Nukleinsäure (2x vRNA), daher muss dieser Wert durch 4 geteilt werden, um die RNA-Kopienzahl pro µl Probe zu erhalten.

RNA-Kopienzahl (in 2 µl) / 4 = Anzahl der Viruspartikel pro µl Probe

b) Berechnung bzw. grafische Auswertung (Balkendiagramm aus

Mittelwerten der Proben, Standardabweichung eintragen) des RT-Tests

c) Vergleich der erhaltenen Daten von RT-PCR und RT-Test Frage: Kann durch spezifische siRNA eine Reduktion der Virusbelastung in PERV-infizierten humanen Zellen qualitativ und quantitativ erreicht werden? Literatur:

1) http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=RNA-Interferenz&printable=yes

2) Hien K. RNA-Interferenz (RNAi). Laborjournal-Ausgabe 07/2002 aus http://www.laborjournal.de/rubric/archiv/stichwort/w_02_07.html

3) Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC: “Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans.” Nature 391, 806-811, (1998).

4) Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T: “Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture.“ Nature 411, 494-498 (2001).

5) http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=10075 6) http://opengenomics.org/CSB2005_RNAiTutorial/3-CSB2005-

B&WSlides.pdf 7) Laborjournal 11/2008, S. 60-63

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Experiment 3 (Tönjes) Tag 1

ca. 10:15h

Tag 2 ca. 10:15h

ca. 12:00h

ca. 13:00h

ca. 15:00h

•Filtration Zellüberstand •Aliquots pipettieren •RNA präparieren

ca. 17:00h

ca. 12:00h

ca. 13:00h

ca. 15:00h

ca. 17:00h

Gruppe A

•Pause

•LightCycler

Gruppe A

•RT Test (komplett) •LightCycler Auswertung

•Vorbereitung

Gruppe B

•Pause

Gruppe B

•Vorbereitung RT-Test

•Inkubation RT-Test

•Waschen RT-Test

•LightCycler Auswertung

•LightCycler

•Pause

•Waschen RT-Test

•Inkubation mit AP- Substrat •Messung bei 405 nm

•Vorbereitung quantitative RT-PCR

•Inkubation Product Tracer RT-Test

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Quantifizierung von Vacciniaviren AG Schwantes/Suezer

Allgemeine Einleitung In diesem Versuch soll die Herstellung einer Virus-Impfpräparation und deren Quantifizierung behandelt werden. Dazu werden einzelne Arbeitsschritte durchgeführt, welche die Herstellung und Anzucht von primären Zellen für die Amplifikation von Viren, die Aufreinigung von Viruspartikeln und die Quantifizierung einer fertigen aufgereinigten Virus-Stammlösung (Virus-Stock) beinhalten. Pockenviren gehören zu den behüllten Viren und besitzen ein doppelsträngiges DNA-Genom. Im Gegensatz zu anderen Viren mit einem DNA-Genom replizieren sie ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zelle. Sie durchlaufen während des Replikationszyklusses verschiedene Reifungsstadien, die in die Bildung verschiedener Formen infektiöser Partikel münden. Diese infektiösen Virionen werden von den unreifen Viren (engl.: immature virion, IV) abgegrenzt und in folgende Klassen eingeteilt: intrazelluläre reife Viren (engl.: intracellular mature virion, IMV), intrazelluläre behüllte Viren (engl.: intracellular enveloped virion, IEV) und extrazelluläre bzw. zellassoziierte behüllte Viren (engl.: extracellular/cell-associated enveloped virion, EEV/CEV). Die extrazellulären behüllten Virionen knospen von infizierten Zellen und sorgen vorrangig für die Verbreitung des Virus innerhalb eines infizierten Wirtsorganismus. Die intrazellulären infektiösen Viren werden zusammen mit infizierten Zellen bzw. Zellresten freigesetzt und dienen vermutlich der Übertragung auf neue Wirte.

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Abbildung 1 Schema des Replikationszyklus von Orthopockenviren. e) frühe, i) intermediäre und l) späte Genexpression, f) virale Fabriken, MV = reifes Viruspartikel, IV = intrazelluläre unreife Viruspartikel (immature virions), IMV = intrazelluläre reife Viruspartikel (intracellular mature virions), IEV = intrazelluläre behüllte Viruspartikel (intracellular enveloped virions), CEV = zellassoziierte behüllte Viruspartikel (cell-associated enveloped virions), EEV = extrazelluläre behüllte Viruspartikel (extracellular enveloped virions). Unter den Pockenviren wurden die Vacciniaviren (VACV) ehemals als Impfstoffe gegen die Pockenerkrankung beim Menschen erfolgreich eingesetzt, was die Ausrottung dieser Erkrankung zur Folge hatte. Heutzutage sind Pocken-Virusimpfstoffe, vor allem als Vektorimpfstoffe, wieder gefragt. Hierbei dient das Pockenvirus lediglich als Träger für Antigene, um damit gegen andere Krankheitserreger oder Erkrankungen eine Immunantwort zu induzieren. Aufgrund der früher gelegentlich beobachteten und teilweise erheblichen Nebenwirkungen der replikationskompetenten Vacciniaviren wurden attenuierte Pockenviren entwickelt, welche ein hohes Sicherheitsprofil aufweisen und die auch bei Menschen mit. Immunsuppression oder bei Schwangeren ohne Risiko verabreicht werden können. Ein solcher wichtiger Impfstoffkandidat ist das in diesem Praktikum verwendete modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). Im Gegensatz zu VACV ist MVA nicht mehr in der Lage, sich produktiv zu vermehren. Es infiziert noch Zellen und exprimiert alle Gene, besitzt aber einen Block in der Virionen-Morphogenese. Daher bildet es auch in Zellkultur, anders als seine replikationskompetenten Verwandten, keine lytischen Plaques aus, sondern infiziert nur einzelne Zellen. Auch der sonst typische zytopathische Effekt ist nicht vorhanden. Eine Ausnahme bilden dabei primäre Hühnerembryofibroblasten (engl. chicken embryo fibroblast cells, CEF) oder Baby-Hamster-Nierenzellen (engl. baby hamster kidney cells, BHK), auf denen MVA noch replizieren kann und welche auch zur Anzucht von MVA genutzt werden.

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Überblick über den Ablauf der einzelnen Experimente: Tag 1: Experiment 1: Präparation primärer Hühnerembryofibroblasten Experiment 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels Sucrose-

Gradienten- Zentrifugation

→ Vorbereitung des Gradienten Experiment 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung

→ Vorbereitung und Titration der Virus-Stammlösungen auf verschiedenen Zellen

Tag 2: Experiment 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels Sucrose-Gradienten-

Zentrifugation

→ Beladen und Lauf des Gradienten mit der Virus-Stammlösung; Ernte des gereinigten Virusmaterials

Experiment 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung

→ Fixieren und Färben der Titrationen, Auszählen, Bestimmung des Virustiters

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Versuch 1: Präparation primärer Hühnerembryofibroblasten

Einleitung: Zur Virusanzucht werden sogenannte permissive Zellen benötigt, das sind solche Zellen, die ein produktives Wachstum des jeweiligen Virus erlauben. Dabei erfolgt die Anzucht des MVA auf CEF- bzw. BHK-Zellen und die eines replikationskompetenten Pockenvirus, hier verwenden wir das Mäusepockenvirus (Ectromelievirus, ECTV), auf BS-C-1-Zellen (epitheliale Nierenzellen der grünen Meerkatze). Die Zellen werden mit einer niedrigen MOI (engl. multiplicity of infection, Menge an infektiösen Virionen pro Zelle) infiziert, und 3-4 Tage nach der Vermehrung des Virus können diese geerntet werden. Innerhalb der Zellen befinden sich die meisten infektiösen Virionen, aber auch extrazellulär sind Viren enthalten. Daher werden sowohl der Zellkulturüberstand als auch die Zellen geerntet. Durch wiederholte Einfrieren-Auftauen-Schritte und die Behandlung durch Ultraschall werden die Zellen zerstört und die intrazellulären Viruspartikel freigesetzt und vereinzelt. Durch anschliessende Zentrifugationsschritte werden die Virionen angereichert und gereinigt. CEF-Zellen werden aus den Embryonen von 10 - 11 Tage lang bebrüteten Hühnereiern hergestellt. Da die Embryonen zur Virusanzucht verwendet werden sollten die Eier aus speziell überwachten Haltungen, d.h. aus sogenannten spezifisch-pathogen freien (spf-)Hühnern stammen (z.B. Lohmann Tierzucht GmbH). Zur Präparation der Zellen werden zunächst die Embryonen aus dem Ei entnommen, durch Entfernung des Kopfes getötet und das differenzierte Gewebe (Herz, Leber, Niere) von dem undifferenzierten Fibroblasten-Gewebe (Körper) getrennt. Das Fibroblastengewebe wird anschliessend durch die Methode der fraktionierten Trypsinierung in einzelne Zellen aus dem Zellverband gelöst. Diese noch undifferenzierten Zellen können einige Tage in Kultur gehalten werden, während der sie ein normales Zellwachstum zeigen. Während dieser primären Phase sind sie effektive Produzenten von neuen Viruspartikeln, insbesondere von MVA. Nach einigen Zellteilungen differenzieren die Zellen aus. Dabei verlieren sie die Fähigkeit zur Teilung und sind, vermutlich aufgrund veränderter Genexpressionsmuster innerhalb der Zelle, für eine Anzucht von MVA nicht mehr geeignet. Material:

o PBS, Trypsin o Kulturmedium mit 10 % FCS (fötales Kälberserum) (v/v), 1x NEA (nicht-essentielle

Aminosäuren), 2mM L-Glutamin, Penicillin (60 µg/ml) and Streptomycin (100 µg/ml).

o Kühl-Zentrifuge, Gasbrenner, Feuerzeug o 2-4 Pinzetten, 2 Scheren, steril o Bechergläser 200 ml, 300 ml, 500ml oder 1 l, steril o Bechergläser (400ml), die mit 2 Lagen Gaze bespannt wurden, steril o Erlenmeyerkolben, 300-500 ml, steril o große Petrischalen, steril o Magnetrührer und Magnetrührerstäbchen („Rührfische“), steril o Falcon-Röhrchen (50 ml) o Zellkulturflaschen (T175)

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o 200 ml Spritzen Versuchsablauf:

Vorbereitung: o ca. 20 Eier 10 Tage vor Präparation in einen Brutschrank (37,8°C, 53 % Luftfeuchte)

legen Durchführung (Tag 1): o Eier mittels einer Schier-Lampe auf lebende Embryonen überprüfen o Eier mit Ethanol abspülen o Schale am stumpfen Pol mit Schere aufschlagen und Schalenteile mit steriler

Pinzette entfernen o Eihaut mit neuer steriler Pinzette „wegklappen“ o Embryo mit Pinzette aus dem Ei entnehmen, in einer große, mit PBS gefüllte

Petrischale geben und sofort „köpfen“ (Tierschutz! Kopf wird verworfen) o alle weiteren Eiern so prozessieren o Embryonen in eine frische, mit PBS gefüllte Petrischale überführen und Eingeweide

entfernen o gesäuberte Teile (Rumpf mit Beinen und Flügeln) in eine Petrischale mit frischem

PBS überführen, schwenken, Schritt wiederholen o Embryonenteile zur Zerkleinerung durch eine 20 ml-Spritze direkt in einen 300-

500ml-Erlenmeyerkolben mit sterilen Magnetrührerstäbchen drücken o Zugabe von ca. 2,5 ml Trypsin (37°C) pro Ei o Zugabe von PBS (ad ca. 6,25 ml pro Ei) o Suspension 20-25 min auf dem Magnetrührer bei RT rühren

nach der Inkubation erhält man flüssigen Überstand ( ) und Restgewebe ( )

zu : o flüssigen Überstand in ein mit steriler Gaze bespanntes Becherglas geben und so

filtrieren (Gazebespannung dazu ein bisschen ins Becherglas zur Vertiefung eindrücken)

o Filtrat in 2 x 50 ml-Falcon-Röhrchen überführen (jeweils gleiche Mengen zum Austarieren der Zentrifuge!)

o Filtrat zentrifugieren, 1.500 rpm, 4°C, 7 min, es entsteht ein lockeres Zellpellet o Überstand vorsichtig in steriles Becherglas abgießen (Pellet schwimmt leicht ab!) und

verwerfen o Waschschritt: Pellets in ca. 15 ml PBS aufnehmen, gut durch Schütteln mit der Hand

mischen (nicht vortexen!!!), beide Zelllösungen vereinen o Zelllösung zentrifugieren, 1.500 rpm, 4°C, 7 min o Waschschritt mit PBS wiederholen o Überstand verwerfen, Pellet in ca. 10 ml CEF-Medium aufnehmen, durch Schütteln

mit der Hand mischen, auf Eis stellen

zu : o Restgewebe im Erlenmeyerkolben (Volumen: ca. 40 ml) o Zugabe von vorgewärmtem Trypsin (37°C, ad ca. 80 ml, ca. 2 ml Trypsin pro Ei) zum

Restgewebe o Zugabe von PBS (ad ca. 125 ml, ca. 6.25ml Gesamtvolumen inkl. Trypsin pro Ei) o Suspension 20 min bei RT rühren

nach der Inkubation: flüssiger Überstand ( , wieder wie bei verfahren) und Restgewebe ( )

zu : o Restgewebe im Erlenmeyerkolben (Volumen: ca. 30 ml)

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o Zugabe von vorgewärmtem Trypsin (37°C, ad ca. 60 ml, ca. 2ml Trypsin pro Ei) zum Restgewebe

o Zugabe von PBS (ad ca. 100 ml, ca. 5ml Gesamtvolumen inkl. Trypsin pro Ei) o Suspension 15 min bei RT rühren

nach der Inkubation: flüssiger Überstand ( , wieder wie bei verfahren) und Restgewebe (verwerfen)

o die 3 Ansätze CEF-Zellen poolen o Zellen nochmals über frische Gaze filtrieren o Zugabe von CEF-Medium (37°C, ca. 2ml entsprechen einem Ei) o Zellen in Zellkulturflaschen (T175) einsäen (ca. ½-1 Ei/Embryo pro T175), bei 37°C,

5 % CO2, 90 % Luftfeuchte bis zur Konfluenz der Zellen inkubieren (24 bis 48 Stunden)

aus Hühnerembryonen präpariertes Zellmaterial

Trypsin- behandlung

Filtration durch Gaze

Zellsuspension + Gewebereste

Zentrifugation, Zellpellet 1

Trypsin- behandlung

Schema für die CEF-Präparation:




Trypsin- behandlung




verwerfen

Zellen vereinen, Aussäen

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Versuch 2: Herstellung eines gereinigten Virus-Stocks mittels

Sucrose-Gradienten-Zentrifugation Einleitung: Die Virusaufreinigung erfolgt durch mehrere Zentrifugationsschritte. In einer ersten Zentrifugation werden alle größere Bestandteile (Virionen des Zellkulturüberstandes, Zell-assoziierte Virionen, Zellreste) pelletiert. Dieses Pellet wird nun mit Ultraschall behandelt, um zell-assoziierte Virionen (CEV) freizusetzen. Um die Virionen aufzureinigen, wird das Pellet über ein Sucrosekissen definierter Dichte (36% Sucrose (V/V)) pelletiert. Dabei passieren die Virionen das Kissen, dagegen bleiben größere zelluläre Bestandteile auf oder in dem Kissen liegen/stecken. Das Viruspellet wird weiter aufgereinigt, indem eine Gradientenzentrifugation angeschlossen wird. Der Gradient besteht aus Sucrose zunehmender Dichte (20% bis 50 oder 60% Sucrose). Hier reichern sich die Virionen in einer bestimmten Dichte an und bilden eine Bande aus. Diese Bande wird geerntet und anschliessend werden die Virionen gewaschen, um die Sucrose aus der Viruslösung zu entfernen. Material:

o 50 % (V/V) Sucrose-Lösung in 10mM TrisCl pH 9,0, steril o 20 % (V/V) Sucrose-Lösung in 10mM TrisCl pH 9,0 , steril o UZ-Röhrchen für rote (kleine) Buckets (Beckman Nr. 337986 Polyallomer), Rotor

SW32Ti o 10 mM TrisHCl pH 9,0 o Ultraschallgerät, Pipetten, Ultrazentrifuge Beckman, Kryo-Röhrchen (1-2ml)

Versuchsablauf:

Herstellung des Gradienten (Tag 1): o 50 % und 20 % Sucrose-Lösung zu gleichen Teilen (7 + 7ml) im UZ-Röhrchen

vorsichtig und langsam übereinander schichten, unten die 50%ige, oben die 20%ige Sucrose-lösung

o zu 4°C stellen (12-48h) Gradient bildet sich über Nacht aus (Gradient immer mit äußerster Vorsicht

transportieren und behandeln) Beladung und Lauf des Gradienten (Tag 2): o Virus-Suspension (Sucrose-Kissen gereinigt) 3x1 min beschallen (100 %),

zwischendurch gut vortexen o Sucrose-Gradienten mit Virus-Suspension überschichten (max. 1 ml pro Röhrchen,

bzw. Flüssigkeitsspiegel sollte minimal 0,5 cm vom oberen Rand des Röhrchen enfernt sein, sonst kollabieren die Röhrchen ) ACHTUNG: Verwirbelungen vermeiden!!!

o UZ-Röhrchen in Buckets einsetzen und gegeneinander austarieren o zentrifugieren, Rotor SW32Ti, rote Buckets, 13.300 rpm, 4°C, 50 min, kein Bremsen

(„no brake“) nach der Zentrifugation sind eine Bande ( , aufgereinigtes Virus) und ein Pellet

( , Reste von Virus an Zellwand gebunden & Zelltrümmer) zu erkennen

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zu : o Sucrose über der Bande abpipettieren o Bande vorsichtig mit der Pipette entnehmen und in 50ml Falcon überführen o Zugabe von ca. 20ml 10 mM Tris pH 9,0 zum Waschen o zentrifugieren, Rotor SW32Ti, rote Buckets, 14.000 rpm, 4°C, 60 min, maximales

Bremsen nach der Zentrifugation ist ein Pellet zu erkennen

o Überstand vorsichtig abkippen o Pellet in ca. 500µl 10 mM Tris pH 9,0 resuspendieren, bei -80°C lagern

zu : o Nach Entnahme der Bande restliche Sucrose abkippen o Röhrchen umgekehrt auf ein mit Alkohol getränktes Papier stellen o Pellet in ca. 500µl 10 mM Tris pH 9,0 resuspendieren, bei -80°C lagern

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Versuch 3: Bestimmung des Virus-Titers einer Virus-Präparation mittels

Immunostain und Kristallviolettfärbung Einleitung: Die Quantifizierung von Pockenviren wird im Zellkultursystem durchgeführt, wobei mit dieser Methode die infektiösen Partikel (IMV, IEV, EEV und CEV) bestimmt werden. Dabei können normalerweise bei ausreichender Verdünnung der Viruslösung Löcher im Zellrasen beobachtet werden, die jeweils auf die Infektion mit einem einzelnen Virus zurückzuführen sind. Daher bestimmt die Anzahl dieser Löcher (engl. plaques) die Menge an infektiösen Viren und werden entsprechend als sogenannten Plaque-formende Einheiten pro Milliliter (engl. plaque forming units/ml bzw. pfu/ml,) angegeben. Würde man die Quantifizierung mittels des Nachweises der viralen DNA-Genome durchführen, würde man auch Viruspartikel nachweisen, welche zwar ein Genom enthalten, aber nicht-infektiös wären. Diese nicht-infektiösen Viren liegen in höherer Anzahl als die infektiösen Viren vor und bezeichnet den Faktor des Verhältnisses beider Formen als den "Particle-to-Pfu-Ratio". Dieses Verhältnis liegt bei den Pockenviren bei ca. 100:1. Von einer Virussuspension mit unbekannter Menge an (infektiösen) Virionen wird eine Verdünnungsreihe in 10er Schritten angelegt und in einem definierten Volumen (1ml) auf Zellen in einer 6 Loch-Platte gegeben. Zur Verifizierung des Ergebnisses wird stets ein Doppelansatz durchgeführt. Ausgehend von einer -1 Verdünnung, das heißt, einer 10fachen Verdünnung der Virussuspension, bis zu einer -9 Verdünnung, werden die Verdünnungsstufen in jeweils ein Loch einer 6 Loch-Platte im Doppelansatz transferiert. Verdünnungsschema der Viruslösung und Ausbringen in 6-Loch-Platten

Nach 2 Tagen, in denen die Viren sich vermehrt haben, können bereits makroskopisch Löcher im Zellrasen beobachtet werden, die durch die lytische Aktivität und den zytopathischen Effekt der Virusinfektion hervorgerufen wurden. Dabei bilden die Viren in Abhängigkeit vom genutzten Zelltyp unterschiedlich große Plaques aus. MVA bildet dabei auf CEF größere Plaques aus als auf BHK und das ECTV bildet auf BS-C-1 nur kleine, im Mikroskop sichtbare, Plaques aus. Um die Plaques als Herd einer Virusinfektion zu verifizieren, können Färbemethoden die Analyse unterstützen. Insbesondere bei MVA-

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

-4 -5 -6

-6-5-4

-1 -2 -3

-3 -2 -1

je 1ml

Virus

serielle Verdünnungen

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Infektionen wird auf eine immun-histochemisch vermittelte Färbung mit VACV-spezifischen Antikörpern zurückgegriffen. Der VACV-spezifische Antikörper wird durch einen Zweit- Antikörper detektiert, der gegen die leichte und schwere Kette des ersten Antikörpers gerichtet ist. Der Zweit-Antikörper ist mit der Meerrettichperoxidase (Engl. horse raddish peroxidase, HRP) gekoppelt, welche das Substrat TMB (3,3´,5,5´Tetramethylbenzidine) in Anwesenheit von H2O2 oxidiert, wobei das Substrat in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Dadurch erscheinen infizierte Zellen dunkelblau. Dagegen werden Plaques von Zellen, die mit replikationskompetenten Viren infiziert wurden, indirekt durch Färbung und gleichzeitiger Fixation der noch intakten Zellen mit Kristallviolett sichtbar gemacht. Hierbei erscheinen die Plaques als weiße Punkte oder Löcher vor violett-blauem Hintergrund. Der Virustiter berechnet sich dabei folgendermaßen: Es wird das Loch, in dem sich mindestens 20-30 Plaques auszählen lassen gewählt und die Anzahl der Plaques gezählt. Dann wird diese Zahl mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert und man erhält einen Titer von Plaque-bildenden Einheiten pro ml. Titer = Anzahl Plaques * Verdünnung des ausgezählten Loch´s Die Plaques werden in beiden Doppel-Ansätzen ausgezählt und gemittelt, woraus der endgültige Titer errechnet wird. Vorarbeit:

• CEF-Herstellung, Virus-Amplifikation • Type 19 Ultrazentrifugation • Surcose-Kissen (36% V/V Sucrose in 10mM TrisCl pH 9,0)

Material:

o gereinigter Virus-Stock, dessen Titer bestimmt werden soll o 6-well-Platten mit sekundären CEF Zellen oder BHK-Zellen sowie BS-C-1 Zellen o Kulturmedium mit 2 % FCS (CEF EMEM, BHK RPMI, BS-C-1 DMEM) o Aceton-Methanol Gemisch (1:1) o Kristallviolettlösung (0,1 % Kristallviolett, 20 % Ethanol in H2O) o PBS mit 3 % FCS o rabbit-anti-Vacciniavirus-Antikörper (von Acris) o goat-anti-rabbit-HRP-Antikörper (von JacksonResearch) o PBS o TrueBlue (von Medac) o Ultraschallgerät, Falcon-Röhrchen, Pipetten, Rockerplattform

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Versuchsablauf:

Vorbereitung am Vortag: o Zellen in 6-well-Platten aussäen, so dass sie bis zum nächsten Tag etwa 80 %

Konfluenz erreichen

Durchführung (Tag 1): o Virus-Suspension 3 x 1 min mit Ultraschall (100 %) behandeln, zwischendurch

vortexen o Virus-Verdünnungen ansetzen, zwischendurch gut vortexen:

20 µl Virus + 180 µl Medium 10-1 100 µl Virus-Verdünnung 10-1 + 900 µl Medium 10-2 500 µl Virus-Verdünnung 10-2 + 4.500 µl Medium 10-3 500 µl Virus-Verdünnung 10-3 + 4.500 µl Medium 10-4

usw. bis 10-9

o Medium von Zellen abnehmen o Virus-Verdünnungen auf Zellen ausbringen, je 1 ml/well im Doppelansatz o Zellen bei 37°C, 5 % CO2, 90 % Luftfeuchte 2 h inkubieren o Virus-Verdünnungen abnehmen o 2 ml Kulturmedium/well zufügen o Zellen bei 37°C, 5 % CO2, 90 % Luftfeuchte 48 h inkubieren Durchführung (Tag 2): CEF oder BHK Immunostain: o Medium abnehmen (infektiös! In den Flüssigabfallbehälter und dann autoklavieren) o Zellen mit 1-2 ml/well Aceton-Methanol (1:1) fixieren, 5 min einwirken lassen,

abnehmen (gesonderter Abfall!) und Methanolfilm komplett verdunsten lassen o 2 ml PBS/3 % FCS pro well zufügen, 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren o Lösung abnehmen o 1. Antikörper zugeben: 500µl/well, Verdünnung 1:4000 in PBS/3 % FCS o Platte mindestens 1 Std. bei RT auf Rockerplattform inkubieren o Antikörper-Lösung abnehmen o Platte dreimal mit PBS waschen (Volumen ca. 2ml) o 2. Antikörper zugeben: 500µl/well, Verdünnung 1:4000 in PBS/3 % FCS o Platten 45 min bis max. 1 Std bei RT auf Rockerplattform inkubieren o Antikörper-Lösung abnehmen o Platte dreimal mit PBS waschen o Substrat zugeben (500µl/well), auf Rockerplattform färben o nach 10 Minuten Färbe-Lösung abnehmen, mit Aqua dest. 5 Minuten waschen o Aqua dest abnehmen und Platten trocknen lassen

BS-C-1 Kristallviolettfärbung: o Medium abnehmen (infektiös! In den Flüssigabfallbehälter und dann autoklavieren) o 2 ml/well Kristallviolettlösung pro Vertiefung zugeben 5 min inkubieren (= Fixation und

Färbung) o Kristallviolett-Lösung abnehmen (gesonderter Abfall!) o Platte umdrehen auf Zelltork und komplett trocknen lassen

CEF/BHK & BS-C-1: o Titer auszählen (mindestens 30-100 Plaques)

Beispiel: 30 Plaques bei einer Verdünnung von 10-8 Titer 3 x 109

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Experiment 4:

Transaktivierung der HIV-LTR durch das virale Tat Protein

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment in der AG Flory durch, die

Gruppen 4-6 in der AG Schumann/Löwer.

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Ziele des Versuchs: 1.) Ermittlung der Transfektionseffizienz in der humanen T-Zelllinie A3.01 durch

Transfektion eines GFP-Expressionsplasmids. 2.) Nachweis der LTR-Transaktivierung durch das virale Tat-Protein mittels

Reporter-Assay. Theorie: Transaktivierung der HIV-LTR durch Tat: Im HIV-Genom befindet sich vor den viralen Genen der sogenannte LTR-Bereich („long terminal repeats“). Dieser Bereich enthält eine TATA-Box und zahlreiche Bindestellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren und stellt damit einen Promotor/Enhancer für die viralen Gene dar. Am LTR-Promotor erfolgt eine effiziente Initiation der Transkription, die Elongation des Transkriptionskomplexes ist allerdings ohne das Tat-Protein („transactivating protein“) stark eingeschränkt. Das Tat-Protein des HI Virus ist ein kleines regulatorisches Protein, dessen Funktion u. a. darin besteht, die Expression der viralen Gene zu kontrollieren. Tat bindet über eine spezifische Interaktion an ein regulatorisches Element der entstehenden mRNA. Dieses Element wird TAR („transactivation-responsive region“) genannt und bildet eine Haarnadelstruktur aus, an die Tat bindet. Über eine assoziierte Protein-Kinase vermittelt Tat die Hyperphosphorylierung der RNA Polymerase II im Elongationskomplex, was zu einer erhöhten Prozessivität des Enzyms führt. Zum Versuch: Zunächst wird die Transfektionseffizienz bestimmt, indem ein EGFP-Expressions-plasmid („enhanced green fluorescent protein“, pEGFP-N1) transfiziert wird. Die erfolgreich transfizierten Zellen exprimieren das fluoreszierende Protein und können so im Fluoreszenzmikroskop identifiziert werden. Durch Auszählen des Anteils der grün leuchtenden Zellen kann die Transfektionseffizienz ermittelt werden. Zur Untersuchung der LTR-Aktivierung durch das Tat-Protein verwenden wir ein Reportergensystem. Es wird ein Reporterplasmid verwendet, in dem der virale Promotor LTR (inklusive TAR-Region) vor ein Firefly-Luciferasegen geschaltet ist (pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc). Tat wird über das Expressionsplasmid pBS- kRSPA-TATNL4-3 in die Zellen eingebracht. Wird am Promotor die Transkription initiiert, kommt es zur Expression des Luciferasegens. Durch Messung der Luciferaseaktivität kann dann eine Aussage über die Stärke der Aktivierung des Promotors getroffen werden. Das Enzym Luciferase bietet sich als Reportergen an, weil seine Aktivität relativ leicht gemessen werden kann. Bei der Umsetzung des Substrats Luciferin wird Fluoreszenzlicht emittiert und kann im Luminometer nachgewiesen werden. In Anwesenheit von ATP, Mg2+ und O2 katalysiert die Luciferase die Oxidation des Luciferins über das Intermediat Luciferyl-AMP zu Oxyluciferin nach folgender Reaktion:

Luciferin + ATP → Lucifery-AMP + PP Lucifery-AMP + O2 → Oxyluciferin + Licht

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Die Plasmide werden durch transiente Transfektion in die Zellen eingebracht. Hierzu verwenden wir das Transfektionsreagenz DMRIE-C, welches ein Lipid enthält, das mit DNA interagieren kann. Es bilden sich Lipid-DNA-Komlexe, die von den Zellen aufgenommen werden können. Zusätzlich wird in alle Ansätze ein Expressionsplasmid für Renilla-Luciferase (phRG-TK) transfiziert. Im Unterschied zur Firefly-Luciferase, die durch den indizierbaren LTR-Promotor reguliert wird, wird die Renilla-Luciferase konstitutiv exprimiert und dient daher als interne Kontrolle. Alle gemessenen Firefly-Luciferaseaktivitäten werden auf den entsprechenden Renilla-Luciferasewert normalisiert. Dadurch können Pipettierfehler und Unterschiede in der Transfektionseffizienz ausgeglichen werden. Da beide Enzyme unterschiedliche Substrate umsetzen, kann zwischen beiden Luciferaseaktivitäten unterschieden werden. Durchführung: Alle Versuchsansätze werden in drei identischen Ansätzen durchgeführt. Transfektion: - je Ansatz DNA und 0,5 ml Opti-Mem in Polystyrolröhrchen vortexen (dreifache

Menge für Triplikate) - Mastermix (für alle Ansätze): je Ansatz 0,5 ml Opti-Mem und 3,5 µl DMRIE-C - je 0,5 ml Mastermix in ein 6well geben und im gesamten well verteilen - je 0,5 ml DNA-Lösung dazu geben, kurz schütteln - 30 min. bei RT inkubieren, DNA-Lipidkomlexe bilden sich

- A3.01 T-Zellen abzentrifugieren (1200 rpm, 7 min. RT) - in 10 ml RPMI ohne alles resuspendieren - Zellen zählen, mit RPMI auf eine Konzentration von 1x106/ml bringen

- je well 0,5 ml Zellen zugeben (entspricht 5x105 Zellen) - bei 37°C im Brutschrank 4-5h inkubieren - je well 1,5 ml Vollmedium (RPMI+10%FCS+Penicillin+Streptomycin+L-Glutamin)

zugeben Folgende Plasmide werden transfiziert: 1-3) 1 µg pEGFP-N1 (keine Lyse, mikroskopische Auswertung) 4-6) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 0,5 µg pBS-kRSPA + 100 ng phRG-TK 7-9) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 0,4 µg pBS-kRSPA + 0,1 µg pBS- kRSPA-TATNL4-3 + 100 ng phRG-TK 10-12) 0,5 µg pGL3-basic-NL4-3-LTR-luc + 0,5 µg pBS-kRSPA-TATNL4-3 + 100 ng phRG-TK

Lyse:

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- Zellen in 15 ml-Falcons abzentrifugieren (1300 rpm, 7 min.) - Zellen 1x in PBS waschen - Pellets in je 100 µl Lysispuffer (PLB, Promega) resuspendieren, in Eppis überführen - vortexen - 30 min. auf Eis inkubieren - mit 13000 rpm abzentrifugieren (10 min., 4°C) - für Luciferase –Assay je 20 µl in 96well-Platte geben Messung der Luciferaseaktivität: die Substratzugabe erfolgt durch das Luminometer: - Zugabe von je 50 µl Luciferase Assay Reagenz (Substrat für Firefly-Luciferase) - nach 2 sec. beginnend wird über 10 sec. die Fluoreszenz gemessen - Zugabe von 50 µl Stop&Glow (unterdrückt die Firefly-Fluoreszenz und enthält das

Substrat für die Renilla-Luciferase) - nach 2 sec. beginnend wird über 10 sec. die Fluoreszenz gemessen Auswertung: Transfektionseffizienz: - Bestimmung der Transfektionseffizienz durch Auszählen des Prozentsatzes

der EGFP-exprimierenden Zellen Einfluss von Tat auf die LTR-Aktivität: - Normalisierung der Meßwerte auf Renilla-Luciferaseaktivität, Berechnung der

Mittelwerte der Dreifachbestimmungen. - Erstellen von Säulendiagrammen (Mittelwerte der Dreifachbestimmungen sollen

mit Standardabweichung dargestellt werden), um welchen Faktor erhöht die Tat-Expression die LTR-Aktivität?

Literatur:

Funktion des Tat Proteins:

http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/COMPENDIUM/2000/partI/Karn.pdf

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Experiment 5:

Gentransfer mit retroviralen Vektoren

Wichtig

Die Gruppen 1-3 führen das Experiment in der AG Buchholz durch, die

Gruppen 4-6 in der AG Mühlebach.

Verlaufsplan: Tag 1 (Montag): - Transduktion der Zielzellen

- Isolierung viraler RNA

Tag 2 (Mittwoch): - EGFP

- lacZ-Färbung

- Isolierung zellulärer DNA

Tag 3 (Donnerstag): - reverse Transkription viraler RNA

- PCR an RNA , cDNA und genomischer DNA

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Versuchshintergrund und -ablauf:

Retrovirale Vektoren, die zur genetischen Veränderung von bestimmten Zielzellen

verwendet werden sollen, können durch verschiedene Methoden hergestellt werden:

zum einen gibt es stabil transfizierte Verpackungszellen, welche alle

Komponenten des Vektors (Transfervektor, Gag/Pol, Env) konstitutiv bilden.

Andererseits können die für diese Vektorbestandteile kodierenden Plasmide transient

(nicht stabil, „vorübergehend“) in geeignete Zelllinien ko-transfiziert (d.h. mit einer

speziellen Technik in die einzelnen Zellen eingebracht) und so „transient

transfizierte Verpackungszellen“ generiert werden (Abb. 1). Hierfür sind 293T-

Zellen (humane embryonale Nierenmarkszellen) aufgrund der hohen erreichbaren

Transfektionseffizienzen besonders geeignet.

Für diesen Versuch wurden in Vorbereitung ausgehend von 293T-Zellen

verschiedene transient transfizierte Vepackungszellen zur Produktion von Murinen

Leukämie Virus (MLV)-abgeleiteten Vektoren hergestellt und die entsprechenden

Vektoren präpariert. Die dabei erzeugten Vektormengen und die Eigenschaften der

Vektorpartikeln werden innerhalb des Praktikums untersucht.

Die zu erzeugenden Vektoren bestehen alle aus MLV-Kapsidpartikeln (Gag/Pol),

unterscheiden sich aber durch die verwendeten Transfervektoren, die

unterschiedliche Reportergene (lacZ/β-Gal bzw. gfp/GFP) beinhalten, und die

Hüllproteine, welche das Wirtszellspektrum (Tropismus) der Vektorpartikel durch die

Bindung an spezifische zelluläre Rezeptoren bestimmen (Abb. 2). Folgende

Hüllproteine (Env) sollen hier verwendet werden:

1. Env des ecotropen MLV: Ecotropes MLV (vollständiges Virus, nicht der Vektor!)

repliziert nur in Nagerzellen und nutzt den zellulären Rezeptor MCAT-1 zum

Anbinden und den Eintritt in die Wirtszelle.

2. Env des amphotropen MLV: Amphotropes MLV repliziert in Nagerzellen sowie

auch in humanen Zellen und nutzt den Rezeptor RAM-1 (receptor for amphotropic

MLV 1).

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3. Env des GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus): Das Hüllprotein des GaLV bindet

an den Rezeptor Glvr-1 (GaLV receptor 1), der (wie RAM-1) in fast allen

humanen Zelltypen, jedoch nicht in murinen Zellen gebildet wird. Allerdings

scheint Glvr-1 in einigen für die Gentherapie besonders interessanten

Zellpopulationen (z. B. hämatopoetischen Stammzellen) stärker exprimiert zu

werden als RAM-1. Daher wird GaLV Env zur Pseudotypisierung (Verwendung

eines heterologen Env, d.h. Verwendung eines Hüllproteins eines anderen Virus

auf der Vektoroberfläche) von retroviralen MLV-abgeleiteten Vektorpartikeln

verwendet. Somit verändert man den Vektortropismus und kann in bestimmten

Zielzellen die Gentransfereffizienz erhöhen.

Zunächst wurden durch Lipofektion (= Transfektionsmethode) 293T Zellen mit den

für die Vektorkomponenten kodierenden Plasmiden (Transfervektor,

Verpackungskonstrukt, Hüllproteinkonstrukt) transfiziert. Zwei Tage nach

Transfektion konnten die vektorhaltigen Zellkulturüberstände dieser

Verpackungszellen (viral packaging cells; VPC) „geerntet“ werden. Diese werden

Ihnen im Praktikum zur Verfügung gestellt. Der eigentliche Praktikumsversuch

beginnt dann mit der Transduktion verschiedener Zielzellen, d.h. die Zielzellen

werden mit vektorhaltigem Überstand inkubiert, um die Zielzellen durch Einschleusen

des Transfervektors ins Genom genetisch zu verändern. Zwei Tage nach erfolgter

Transduktion werden die Zielzellen auf die Anwesenheit der transferierten

Reportergene (auf Transfervektor) hin untersucht. Die Menge der generierten

Vektorpartikel und deren Tropismus lassen sich so nachweisen. Im Rahmen dieses

Versuches sollen auch die RNA Genome aus den Vektorpartikeln isoliert, in cDNA

umgeschrieben werden und dann mit PCR detektiert werden.

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Abb. 1: Herstellung und Analyse von retroviralen Vektoren durch Triple-

Transfektion

Dreifach-Transfektion in 293T Zellen

Vektorhaltige Überstände werden ingeeigneten Zielzellen titriert.

293T-Transfektanden (Verpackungszellen)exprimieren gag, pol, env und einen Ψ-positivenTransfervektor.

Nachweis des Reportergens (Fluoreszenz,bzw. X-Gal-Test)

Mikroskopische Auswertung

Verpackungskonstrukt

Transfervektor LTR LTRψ

Reportergen

gag/polLTR LTRψΔ

Hüllproteinkonstrukt envLTR LTRψΔ

gag/pol

Nachweis der Expression der Reporterproteine (X-Gal bzw. Fluroeszenz) und eines Reportergens (PCR) in den Zielzellen

DNA-Isolierung

PCR auf Markergensequenzen Mikroskopische Auswertung (Reporterproteine)

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Vor dem Praktikum vorbereitet und durchgeführt:

Herstellung von MLV abgeleiteten Vektoren

Lipofektion:

• 24 h vor Versuchsbeginn werden in 35 mm Kulturschalen 6 x 105 Zellen

ausgesät

• je 1µg DNA pro Konstrukt (Transfervektor, Verpackungskonstrukt,

Hüllproteinkonstrukt), also insgesamt 3 µg werden in Eppis vorgelegt

(siehe Pipettierschema nächste Seite).

• 4 µl Lipofektamin PLUS werden in 100 µl DMEM- angesetzt (Eppi) und für

15 min bei RT mit den DNA-Lösungen inkubiert.

• je 10 µl Lipofectamin in 100 µl DMEM- werden zugegeben - weitere 15 min

bei RT

• nach der Inkubation wird mit DMEM- auf 1 ml aufgefüllt.

• die Transfektionslösungen werden auf die Zellen gegeben (Medien zuvor

entfernen).

• Inkubation für 2 bis 5 h bei 37° C

• Mediumwechsel (komplettes Kulturmedium)

• Inkubation über Nacht

• Mediumwechsel (je 2 ml komplettes Kulturmedium)

• zwei Tage nach Transfektionsbeginn können die Überstände geerntet und

zur Vektorpräparation sowie nachfolgend zur Transduktion der Zielzellen

eingesetzt werden.

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A

nsat

z

Verpackungs-

konstrukt

(MLVgag/pol)

Hüllprotein-

konstrukt

(GaLV env,

MLVeco env,

MLVampho env)

Transfervektor

(MLV LTRs

und

Verpackungssignal

Ψ)

1 pHIT60

pALF-GaLVwt

pMg-β-Gal-ΔLNGFR

2 pHIT60

pALF-GaLVwt

pMg-EGFP-ΔNGFR

3 pHIT60

pHIT123

pMg-β-Gal-ΔLNGFR

4 pHIT60

pHIT123

pMg-EGFP-ΔNGFR

5 pHIT60

pHIT456

pMg-β-Gal-ΔLNGFR

6 pHIT60 pHIT456 pMg-EGFP-ΔNGFR

Tab.: Kombinationen der Vektorkomponenten kodierenden Plasmid-DNAs (je 1 µg)

zur Transfektion von 293T Zellen.

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Transfervektoren

Verpackungskonstrukt

Hüllprotein(Env)-Konstrukte

pMg -ß- Gal-Δ LNGFR:

LTR LTRψ

Δ LNGFR

SD SA

lacZ

ATG ATG

SD SA

pMg -EGFP-Δ LNGFR:

LTR LTR ψ

Δ LNGFR egfp

ATG ATG

Fig .2

pHIT60: LTR LTR ψ

ATG Δ

pHIT123: env (ecotrop. MLV)LTR LTR ψ

ATG Δ

pHIT456: env (amphotrop. MLV)LTR LTR ψ

ATG Δ

pALF - GaLVwt : ATG

env (GaLV )LTR LTR Δ ψ

MLV gag/pol

Die Transfervektoren (pMg-β-Gal-∆LNGFR, pMg-EGFP--∆LNGFR) besitzen die von MLV abgeleiteten flankierenden LTRs (long terminal repeats), das Verpackungssingnal "Ψ", welches die Verpackung der Transkripte in MLV-Kapsidpartikel gewährleistet, sowie einen Splicedonor (SD) bzw. –akzeptor (SA). Als Reportergenprodukte dienen die trunkierte Variante des "low affinity nerve growth factor receptor" (∆LNGFR) sowie β-Gal bzw. EGFP. Das Verpackungskonstrukt pHIT60 beinhaltet die Strukturgene gag und pol des MLV, deren Genprodukte in der Lage sind, leere, nicht umhüllte Kapsidpartikel des MLV zu bilden. Die Hüllproteinkonstrukte kodieren für die Hüllproteine des eco- oder amphotrophen MLV bzw. des GaLV. Alle Strukturgene werden von modifizierten LTRs getrieben.

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Versuchsdurchführung:

Alle Arbeiten werden steril und unter der Werkbank durchgeführt

Tag 1 (Montag):

Experiment Transduktion von Zielzellen:

Zielzellen: NIH 3T3, HT1080, und D17 (canine [„Hunde“] Osteosarkomzellen)

Je 1,5 x 105 Zellen wurden in Sechs-Loch-Platten am Tag zuvor ausgesät und werden zur Verfügung gestellt:

• Es werden jeweils 3 Zellkulturplatten benötigt: a) für GFP-Detektion b) für LacZ Detektion, c) für die Isolierung von zellulärer DNA (s. Schema S. 76).

• Vektorhaltige Überstände (SN) wurden vor Beginn des Praktikums generiert und stehen nun für Transduktionsversuche zur Verfügung. 550 µl einer 1:10 Verdünnung herstellen (nach Absprache mit Versuchsbetreuern).

• Zielzellen mit PBS waschen

• je 500 µl der unverdünnten und 1:10 verdünnten vektorhaltigen filtrierten Überstande zu den Zielzellen geben (siehe Schema S. 76; beschriften!).

• 2h nach Transduktion Zellen mit frischen Medien versorgen.

• Weiterhin stehe DNAse-vorbehandelte Vektorüberstände für die Isolierung viraler RNA zur Verfügung.

Tag 1 (Montag):

Experiment Isolierung von Nukleinsäuren und PCR Detektion:

Isolierung viraler RNAs Um die viralen RNAs aus den Vektor-Partikeln zu isolieren, wird der vektorhaltige Überstand direkt eingesetzt und mittels des QIAamp Viral RNA Kit aufgereinigt. QIAamp viral RNA Mini Kit The sample is first lysed under highly denaturing conditions to inactivate RNases and to ensure isolation of intact viral RNA. Buffering conditions are then adjusted to provide optimum binding of the RNA to the QIAamp membrane, and the sample is loaded onto the the QIAamp spin column. After contaminants are washed away,

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high-quality RNA is eluted in a special RNase-free buffer, ready for direct use or safe storage. Preparation of virus RNA (according to Qiagen)

Use RNase-free material only after the lysis with buffer AVL

• filtrate supernatant through 45µm filter • Pipet 560µl of prepared Buffer AVL (containing carrier RNA) into a 1.5ml tube • Add 140µl virus-containing supernatant, mix by votexing for 15 sec. • Incubate at RT for 10 min. • Briefly centrifuge tube to remove drops from inside the lid • Add 560µl EtOH (96-100%), mix by vortexing, briefly spin down • apply 630µl of sample to provided column (in a 2-ml collection tube) • centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the QIAamp column in a

clean collection tube • apply residual sample to column • centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the QIAamp column in a

clean collection tube • add 500µl buffer AW1, centrifuge 1 min (8000rpm) and discard filtrate, place the

QIAamp column in a clean collection tube • add 500µl buffer AW2, centrifuge 3 min (13000rpm) and discard filtrate, place the

QIAamp column in a clean collection tube. • repeat centrifugation to get rid of residual filtrate, place the QIAamp column in a

clean 1.5-ml microcentrifuge tube • add 60µl buffer AVE, incubate 1 min at RT • centrifuge 1 min (13000rpm) • Take off 20 µl for DNase digest (see page 69), store on ice • store rest of eluate at –80°C

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DNAse digestion of RNA

20 µl + 67.5 µl H2O

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69

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71

Tag 2 (Mittwoch)

Experiment Transduktion von Zielzellen:

• 48h nach Transduktionsbeginn können die Zielzellen mittels

Fluoreszenzmikroskopie (eGFP) bzw. nach Fixierung mittels X-Gal-Test

(β-Gal) auf den erfolgten Gentransfer hin untersucht werden.

X-gal-Färbung von Monolayer-Kulturen Fixierlösung: - PBS (ohne Ca und Mg) - 2 % Formaldehyd - 0,2% Glutaraldehyd Stammlösungen: - 5- Bromo-4-Chloro-3-Indolyl ß-D-Galactopyranoside (x-Gal) in DMSO (40mg/ml) - Kaliumhexacyanoferrat III (1M) (Kaliumferricyanid = rotes Blutlaugensalz) - Kaliumhexacyanoferrat II (0,5M) (Kaliumferrocyanid = gelbes Blutlaugensalz) - MgCl2 (1M) Reaktionsmix: - PBS (ohne Ca + Mg) 20ml - X-Gal (40mg/ml) 500µl (=1mg/ml) - R-Ferricyanid (1M) 100µl (=5mM) - R-Ferrocyanid (0,5M) 200µl (=5mM) - MgCl2 (1M) 40µl (=2mM) Ablauf: - Medium von Zellen entfernen - (Zellen 1x PBS waschen) - Fixierlösung auf Zellen geben (6well: +1-2ml), 10Min./RT - 1x (-3x) vorsichtig mit PBS waschen - X-Gal-Lösung (s.o. Reaktionsmix, frisch angesetzt) auf Zellen geben (6well: +1-

2ml) - 37°C stellen (Färbung ist nach einigen Stunden erkennbar – kann aber auch über

Nacht stehen)

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Tag 2 (Mittwoch)

Auswertung des Experiments Transduktion von Zielzellen (eGFP + lacZ):

Die transduzierten Zellen werden unter dem Axiovert (Mikroskop) untersucht und

die Zahl der transduzierten Zellkolonien pro betrachteter Fläche bestimmt.

Hochgerechnet auf die gesamte Fläche der Kulturschale kann die Zahl der

infektiösen Vektorpartikel pro Volumeneinheit Überstand bestimmt werden

(t.u./ml; t.u. = transducing units).

Diese Titer können graphisch dargestellt werden.

Vergleiche die Titer der verschiedenen Vektorpartikel in den

unterschiedlichen Zielzellen;

- Gibt es Unterschiede zwischen den verschiedenen Reportergenen in der

Hinsicht, welche Zellen bei welchen Vektoren positiv werden? Warum?

- Bei den NIH3T3 und HT1080-Zellen handelt es sich um eine humane und eine

murine Zellinie. Welche ist was? (Hinweis: Der Tropismus der verwendeten

Hüllproteine sollte eine Aussage erlauben!)

- Welche Rezeptoren sind auf der caninen Zellinie D17 vorhanden?

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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Tag 2 (Mittwoch)


Isolierung zellulärer DNAs

Die Gesamt DNA der Vektor-transduzierten Zellen soll isoliert werden und

die Anwesenheit der Vektorsequenzen mit PCR nachgewiesen werden. Wir

nutzen zur Isolierung der DNA das QIAGEN DNeasy Tissue Kit.

DNeasy Tissue procedure:

The kit uses advanced silica-gel-membrane technology for rapid and efficient

purification of total cellular DNA. The buffer system is optimized to allow

direct lysis followed by selective binding of DNA to the to the DNeasy

membrane. DNeasy purified DNA typically has an A260/A280 ratio between

1.7 and 1.9, and is up to 50 kb in size. The DNeasy procedure also efficiently

recovers DNA fragments as small as 100 bp.

Before lysis of cells, these have to be detached from monolayer culture and

washed :

• Wash cells 1x with 1 ml PBS/well

• Detach cells by adding 500 µl Trypsin-EDTA + PBS and incubation for

5 min at RT

• Transfer cells into Eppendorff Tube

• Spin down (5 min 2000 rpm)

• Wash cells with 1 ml PBS

• Spin down (5 min 2000 rpm

Purification of total DNA from cultured animal cells:

• Spin down cells (maximum 5x106) 5 min 2000 rpm

• Resupend pellet in 200µl PBS

• Add 20µl proteinase K and 200µl buffer AL (do not add proteinase k

directly to buffer AL), mix by votexing

• Incubate 70°C 10 min

• Add 200 µl EtOH, mix by vortexing

BCII am PEI, 16.11.2009-03.12.2009

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• Transfer mixture to DNeasy mini spin column (placed in a 2 ml

collection tube)

• spin 1 min at 8000 rpm

• Replace the collection tube, add 500µl buffer AW1


• Replace the collection tube, add 500µl buffer AW2


• place the column in clean 1.5 ml centrifuge tube

• add 200 µl buffer AE on the membrane

• incubate 1 min

• spin 1 min at 8000 rpm to elute DNA

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Tag 3 (Donnerstag)


→ Herstellung von cDNA der viralen RNA

• heat one incubator to 80°C and one to 37°C

• prepare RT-reaction-Mastermix for all samples: for one sample (Σ=13µl): 5x Buffer 4µl dNTP (20mM) 1µl RNase OUT 0,5µl Reverse Transkriptase 0,5µl (for control: 0,5µl H2O) DTT 2µl H20 5µl

• preparation of the RNA samples: mix 4µl RNA + 1µl (10pmol) Primer + 2µl H2O (control: one sample without template) • incubate these 7µl samples 1min at 80°C, then put them directly on ice

• add 13µl reaction-mix to each sample, incubate 1h at 37°C

→ Detektion von GFP und lacZ Sequenzen mittels PCR an RNA, cDNA und DNA

• prepare PCR-reaction-mix for all samples (additional: one plasmid control to check the PCR and to check for DNA content in the RNA: Instead of cDNA use 0,5µl RNA as Template in the PCR): for one sample (Σ=50µl): sample (cDNA or DNA or RNA or H20) in 10µl 10x Buffer 5µl dNTP (10mM) 1µl Primer 1 (10pmol/µl) 1µl Primer 2 (10pmol/µl) 1µl Taq-Polymerase 0,5µl H20 31,5µl

• program: 1. 4min 95°C 2. 40sec 95°C 3. 40sec 58°C (Temp depends on the Primer) 4. 1min 72°C (Time depends on expected product length: 1 min / kb) 5. 10min 72°C 6. hold at 4°C

30 repeats from step 2 to 4

• Analyse samples on agarose gels.

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D17

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6

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Experiment 6:

Mikroskopische Methoden

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Mikroskopische Methoden sind für biochemische Fragestellungen dort unverzichtbar, wo zelluläre Bausteine, regulatorische Moleküle oder Stoffwechselprodukte nicht isoliert, sondern im räumlichen Zusammenhang in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden sollen. Im Praktikum sollen virale Proteine mittels Immunfluoreszenz-Mikrokopie in Zellkulturen lokalisiert werden. Dazu werden verschiedene monoklonale Antikörper und Antiseren gegen das humane endogene Retrovirus HERV-K als Sonde zum Nachweis der HERV-K Strukturproteine verwendet. Colokalisation verschiedener Antikörper bedeutet, dass die entsprechenden Antigene in die gleichen biologischen Strukturen, also Viruspartikel, eingebaut werden. Die Größe von Viruspartikeln liegt jenseits der Auflösungsgrenze des Lichtmikroskopes. Eine direkte Virusdarstellung ist daher nur im Elektronenmikroskop möglich. Im Praktikum werden mittels Negativkontrast verschiedene Virustypen präpariert. Die morphologischen Unterschiede sind ein sicheres und schnelles Mittel zur Diagnose vieler Viren. Wir werden die Unterschiede von Retroviren, Influenzaviren und anderen im EM sichtbar machen.

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Immunfluoreszenz Immunfluoreszenz ist eine lichtmikroskopische Methode zum Nachweis und zur Lokalisation von Antigenen. Ihr Vorteil gegenüber anderen immunologischen Verfahren ist die hohe Sensitivität, wenn ein Antigen nur in geringen Mengen vorhanden jedoch lokal konzentriert ist, sowie die Information über die räumliche Verteilung eines Proteins. Durch Doppel- und Mehrfachmarkierungen lassen sich mehrere Antigene gleichzeitig und in ihrer Lagebeziehung zueinander beobachten. Hauptnachteil der Fluoreszenzmikroskopie ist der gerätetechnische Aufwand. Material:

• PBS

• 2% frisch hergestellter Formaldehyd in PBS

• 0,5% Triton X-100 in PBS

• 0,5% BSA in PBS

• PBS zu Waschen

• 1. antigenspezifischer Antikörper

• 2. fluoreszenzmarkierter Antikörper

• Moviol

Vorbereiten:

• adhärent wachsende Zellen auf Deckgläschen oder Objektträger aussäen,

oder

• Suspensionszellen auf Deckgläschen bzw. Objektträger fixieren oder,

• Gewebeschnitte herstellen

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Durchführung:

• Zellen fixieren: 2% Formaldehyd in PBS (ohne Ca/Mg), 10 min, RT

• waschen mit PBS 3 x 3 min.

• für intrazelluläre Antigene: Zellen permeabilisieren mit 0,5% Triton in PBS, 5 min RT

• waschen mit PBS 3 x 3min.

• blockieren unspezifischer Bindungen mit 1% BSA 5 min.

• 1 x waschen mit PBS

• 1. AK in entsprechender Verdünnung (Seren 1:100 bis 1:3000) in PBS aufbringen

• 20 min. inkubieren bei 37 °C


• 2. AK in entsprechender Verdünng. in PBS aufbringen

• 15 Min. bei Raumtemperatur inkubieren


• evtl. Gegenfärbung mit Evans Blue, Propidium Iodid oder DAPI 5 Min. bei Raumtemperatur


• eindecken in Moviol

• Auswertung und Dokumentation am Fluoreszenzmikroskop

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KB/PEI Negativkontrastierung Negativkontrastierung ist die schnellste und einfachste Präparationsmethode für die Elektronenmikroskopie. Sie lässt sich in wenigen Minuten durchführen und ist geeignet zur Darstellung großer Moleküle, von Zellbestandteile und Viren. Nachteilig ist die hohe Konzentration an Molekülen bzw. Teilchen, die zur Beobachtung nötig ist. Beim Negativkontrast werden die Strukturen in ein "Pfütze“ eines elektronendichten Kontrastierungsmittels eingebracht. Da biologisches Material in der Regel elektronendurchlässig ist erscheinen die Strukturen hell vor dem dunklen Untergrund des Kontrastierungsmittels.

Material:

• befilmte und kohlebedampfte Trägernetzchen

• Pasteurpipetten, kleine Bechergläser (50 – 100 ml)

• Filterpapier

• Pinzetten

• Parafilm, Schere, Stoppuhr

• Eppendorfpipetten und Spitzen (10 – 50 µl)

• Aqua-dest.

• 2 %-ige Uranylacetatlösung in Aqua-dest

Vorbereiten:

• Beglimmen der Trägernetzchen (Hydrophilisierung) in Beglimmungsanlage

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Durchführung:

• 10 µl Virussuspension auf einem Stück Parafilm vorlegen

• mittels Pinzette Grid mit befilmter Seite auf den Tropfen legen

• Viruspartikel 2 Minuten adhärieren lassen

• währenddessen 2 Tropfen Aqua-dest. und 10 µl der Uranylacetatlösung

auf den Parafilm vorlegen

• nach der Adhäsionszeit nacheinander sehr kurz in den Aqua-dest. -

Tropfen waschen

• überschüssige Flüssigkeit an einem Filterpapier abfließen lassen

(Vorsicht! nicht trocken saugen)

• den Tropfen Uranylacetat mit dem in der Pinzette gehaltenem Grid

aufnehmen

• nach 10 Sekunden an einem Filterpapierstreifen das Kontrastmittel

vollständig abfließenlassen (Flüssigkeitsfilm darf nicht abreißen, d.h. der

Kontakt zum Filterpapier muss solange gehalten werden, bis die

Flüssigkeit vollständig abgezogen ist !)

• Präparat in einer kleinen Petrischale, welche mit Filterpapier ausgelegt ist

staubfrei lagern

• Auswertung und Dokumentation im Transmissionselektronenmikroskop

Anmerkungen: Sollte es sich um eine Suspension handeln, in der nur sehr wenig Material zu erwarten ist, dann empfiehlt es sich auf Waschschritte weitgehend zu verzichten.

Gegebenenfalls kann die Adhäsionszeit von 2 Minuten erhöht werden.

Praktikum Biochemie II - biochem.uni-frankfurt.de · 26.11.09 Tönjes: Genome, endogene Retroviren...

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