RNA-Regulationsmechanismen: RNA Interferenz

Vorlesung System-Biophysik 19. Dez. 2008

LiteraturMartens: BIOspektrum 4/02 8. JahrgangM. Kuhlmann: Biol. Unserer Zeit Nr.3 (2004), S. 142.

Genregulation durchTranskriptionsfaktoren(Jacob&Monod)

RNA Interferenz(Fire&Mello)

RNA Moleküle können interferieren, d.h.insbesondere kann doppelsträngige RNAden Abbau von RNA und damit dieposttranskriptionelle Stillegung (Silencing)eines Gens bewirken.

Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2006

Andrew Z. Fireand Craig C. Mello

for their discovery of"RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

Auch RNA kann komplementäre Strukturen bilden

Doppelstrang(dsRNA)

}

The simplest of all viral life cycles.The hypothetical virus shownconsists of a small double-strandedDNA molecule that codes for only asingle viral capsid protein. No knownvirus is this simple.

The life cycle of the Semliki forest virus.The virus parasitizes the host cell for most of its biosyntheses.

Beispiele für virale Genome

RNAtobacco mosaic virus parvovirus

DNAT4 bacteriophage

SV40

fX174 bacteriophages

The enzyme reverse transcriptase first makes a DNA copy of the viral RNA molecule andthen a second DNA strand, generating a double-stranded DNA copy of the RNA genome.The integration of this DNA double helix into the host chromosome, catalyzed by theviral integrase, is required for the synthesis of new viral RNA molecules by the host-cellRNA polymerase.

The life cycle of a retrovirus.

Die offenen Fragen im klassischen Modellder Genregulation (bis 1998)

1. Das Problem mit der Petunie - „cosuppression“

2. Antisense DNA

Die blaue Farbe der Petunie wird durch dasEnzym Chalkonsynthase erzeugt

Läßt sich die blaue Farbe durch Zugabe von zusätzlichenChalkonsynthase-Genen verstärken?

Überraschung:Die Zugabe eines zusätzlichen Gens für Chalkon-Synthase führt zur Unterdrückung der Farbe - EinPhänomen das man „Cosuppression“ nennt.

Die Antisense Strategie

Durch Zugabe kleiner Antisense DNA Stückewerden spezifische mRNA Moleküle für dieTranslation gesperrt

Das Experiment von Fire und Mello

RNA carrying the code for a muscle protein is injected into the worm C.elegans. Single-stranded RNA has no effect. But when double-stranded RNAis injected, the worm starts twitching in a similar way to worms carrying adefective gene for the muscle protein.

RNA silencing

1. DICER: analog einerRNase III

2. siRNA(small interfering RNA)

3. RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER)

doppelsträngige RNA wird von Dicer (ein Homolog der dsRNA-spezifischen RNase III) in siRNAs zerlegt, siRNAs werden von RISCgebunden und entwunden, der Antisense-Strang spezifiziert RISC(RNA Induced Silencing complex mit ssRNase-Aktivität) zurDegradation der Ziel-mRNA.

Standardmodell für RNAi:

RISC: RNAi-induzierter silencing complex (mit unbekannter Untereinheit : SLICER)

Alternativer RNAi Mechanismus

Entwundene siRNAs dienen der RNAabhängigen RNA-Polymerase RdRPals Primer, sodass mit der mRNA alsMatrize ein neuer Doppelstranggebildet wird. Weil dieser Doppelstrangwieder als Substrat für Dicer dienenkann, ist die mRNA Degradation durchRISC theoretisch nicht erforderlich.

Verbindung zwischen Antisense RNA und RNAi

Natürliche Funktionen des Gene Silencings

Zelluläre Funktionen von RNAi

Post-transkriptionale Genregulation durch endogeneAntisense-RNAs

Abbau aberranter RNAs und RNA-Bruchstücke

Abwehr von Retroviren (z.B. Aids, TMV etc.)

Retro-Virus indiziertes Gene Silencing

Gene „knock down“

Die siRNA werden in isolierte Zelleneingebracht (transfiziert) und die mRNA desZielgens wird abgebaut. Die resultierendeVerringerung der Genprodukte (knock down)ermöglicht es, Hinweise auf diephysiologische Bedeutung des betreffendenGenes zu erhalten.

Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494-8.

genomic DNA

mRNA

proteins

RISC

siRNA

Beispiel : siRNA zur Bekämpfung von HIV

Ansatzpunkte für siRNA bei HIV: Angriff auf virale RNA: Hier kann gleichdie RNA nach dem Eindringen in die Zelle angegriffen werden, noch bevordie Reverse Transkriptase die virale RNA in cDNA umwandeln kann.

siRNA Therapieansatz gegen Krebs

Einsatzmöglichkeiten von siRNA bei Krebserkrankungen ist z.B. die Unterdrückung desmutierten p53-Proteins. Wildtyp-p53 funktioniert als Tumorsuppressor, indemes die Zelledazu zwingt, in Apoptose oder einen Zellzyklus-arrest überzugehen. Eine sporadischentstandene Mutation in einem Allel des p53-Gen wirkt dominant und kann so den Eintritt indie Apoptose oder den Zellzyklusarrest verhindern. siRNA-vermittelte Inhibition desmutierten p53-Allels könnte daher die Krebsentstehung verhindern.

Zusammenfassung

RNAi ...

* Kann Verdau von mRNA triggern* Benötigt „Dicer“, „RISC“ und RdRP* Ist in der Lage spezifische mRNA (damit Gene) auszuschalten* Ist Teil eines “alten” molekularen Immunsystems zur RNA Kontrolle* Ist auf zwei Arten für die Gentechnik von hoher Bedeutung a) Therapeutisch b) Research Bereich