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Entomologie heute 17 (2005)

Entomologie heute 17 (2005): 39-45

Röntgenmikroanalytische Untersuchung des Chorionsder Gespenstschrecke Pharnacia westwoodi

(Phasmatodea)

X-Ray Microanalysis of the Egg Chorion of the Stick Insect Pharnaciawestwoodi (Phasmatodea)

HARTMUT GREVEN, MICHAEL MIELEWCZIK & HILDEGARD HAMMER

Zusammenfassung: Elektronenstrahlmikroanalysen (ESMA) belegen das Vorhandensein vonCalcium im gesamten (Exo-)Chorion der Eier der Gespenstschrecke Pharnacia westwoodi. Punktana-lysen an Bruchflächen zeigen, dass Calcium relativ gleichmäßig in den drei lichtmikroskopisch undrasterelektronenmikroskopisch zu identifizierenden Schichten verteilt ist. Das gilt auch für dieMikropylarplatte; hier war zudem Schwefel nachzuweisen. Im Operculum war wenig oder keinCalcium vorhanden. Auch die leeren Eihüllen von P. westwoodi enthalten Calcium.

Schlüsselwörter: Phasmatodea, Chorion, Stabilisierung des Chorions, Calciumsalze

Summary: X-ray analysis (ESMA) of the (exo)chorion of the eggs of the stick insect Pharnaciawestwoodi showed the presence of calcium. Spot analyses of fracture planes revealed a ratherhomogeneous distribution in the three layers identified in histological sections and by scanningelectron microscopy. This was true also for the micropylar plate; some sulphur was also shown tobe present here. The operculum contained calcium in very small amounts, if any. Even afterhatching, calcium was present in the chorion.

Keywords: Phasmatodea, chorion, stabilization of the chorion, calcium salts

1. Einleitung

Die Eihülle (Chorion) von Insekten bestehtaus Polysacchariden und einer Reihe mehroder weniger taxonspezifischer Proteine undist vielfach mechanisch äußerst widerstands-fähig. Dies wird unter anderem durch Sklero-tisierung, bei einigen Taxa aber auch durchdie Einlagerung mineralischer Bestandteileerreicht (Übersicht z.B. bei HINTON 1981;MARGARITIS 1985).Verschiedene Mineralsalze, unter anderemvon Calcium, finden sich auch im Exochori-on von Gespenstschrecken (Phasmatodea);sie können hier bis 38 % des Trockengewich-tes ausmachen. Bisher sind verschiedene Mi-neralsalze und Elemente entweder histoche-misch � dies erlaubt zum Teil auch die Loka-

lisation von Elementen in bestimmten Schich-ten des Chorions (s. MOSCONA 1950a,b) �,meistens aber qualitativ und vereinzelt quan-titativ unter Verwendung ganzer Eier, unteranderem mit Hilfe der Atomabsorptions-spektroskopie, bei einer Reihe von Arten nach-gewiesen worden (RAMSAY 1955; CARLBERG etal. 1982). Dem Calcium kommt offenbar einebesondere Rolle zu, da es unter anderem beimanchen Arten von den Embyronen wäh-rend der Entwicklung genutzt wird (PANTEL

1919, zitiert nach HINTON 1981; MOSCONA

1948); es scheint bevorzugt in den innerenSchichten des Chorions vorzukommen(MOSCONA 1950a,b).Im Folgenden berichten wir über den Nach-weis von Calcium im Chorion der Eier derGespenstschrecke Pharnacia westwoodi, das bei

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dieser Art offenbar in allen Chorionschichtenvorhanden ist.

2. Material und Methoden

Zur Verfügung standen frisch abgelegte Eierund leere Eihüllen von Pharnacia westwoodi ausder Zucht des Aquazoos und Löbbecke-Museums in Düsseldorf.Kleine Stücke des Chorions wurden in 2,5 %Glutaraldehyd in 0,1 mol/l Cacodylatpufferfixiert, in 1 % Osmiumtetroxid im gleichenPuffer nachfixiert und in Spurr eingebettet.Semidünnschnitte (etwa 1 µm dick) wurdenmit Toluidinblau-Borax gefärbt.Für die konventionelle Rasterelektronen-mikroskopie wurden die Objekte (ganzeEier oder Bruchstücke) mit Kohlenstoff-Klebeplättchen auf Probenteller aus Alu-minium befestigt, mit Gold besputtert undin den Rasterelektronenmikroskopen JeolJSM 5500 (Institut für Physikalische Che-mie) und Leo 1430 VP, Zeiss (FB Biologie)untersucht.Für die Analysen wurden die Eier oderBruchstücke davon ebenfalls auf Probentel-ler aus Aluminium geklebt und ohne Gold-beschichtung im Rasterelektronenmikro-skop Philips XL 30 ESEM mit einemEDAX-X-Ray-Detektor (Institut für Physi-kalische Chemie und Elektrochemie) bei ei-ner Primärelektronenenergie von 20 kV ana-lysiert und mit der Software EDAX-Gene-sis 4.0 ausgewertet.Untersucht wurden an ganzen frisch abge-legten Eiern und leeren Eihüllen die äuße-re Oberfläche des unspezialisierten Exocho-rions � im Folgenden Chorion genannt �,aus den spezialisierten Bereichen Opercu-lum und Mikropylarplatte (von innen) so-wie Bruchflächen von Chorion (ohne En-dochorion), Operculum und Mikropylar-platte.Bei der Elektronenstrahlmikroanalyse(ESMA) wird der Elektronenstrahl auf fest-gelegte Punkte (jedoch ohne zu rastern) ein-gestellt (Punktanalyse) auf die Probe ge-

schossen. Dabei werden unter anderem dieAtome der Probe ionisiert, das heißt Elek-tronen aus inneren Schalen herausgeschla-gen. Die angeregten Atome und Ionen fal-len in den Grundzustand zurück und emit-tieren dabei ein Röntgenquant mit einer fürdas Element charakteristischen Energie.Durch einen Detektor werden Energie und

Abb. 1: Struktur der Eihülle von Pharnacia west-woodi: a: Gesamtansicht mit Mikropylarplatte(REM); b: Operculum mit Capitulum (links)(REM); c: unentkalkter Semidünnschnitt desChorions mit drei Schichten (1, 2, 3).Fig. 1: Structure of the egg capsule of Pharnaciawestwoodi: a: total aspect with micropylar plate(SEM); b: operculum plus capitulum (left)(SEM); c: uncalcified semi-thin section of thechorion with three layers (1, 2, 3).

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Anzahl dieser Röntgenquanten gemessenund als Röntgenspektrum dargestellt. Diesich bei den verschiedenen Energien erge-benden �peaks� können bestimmten Ele-menten zugeordnet werden. Die Höhe der�peaks� kann allerdings kaum als Maß fürdie Konzentration des nachzuweisendenElements gelten. Für eine erste Annäherunghaben wir daher das Verhältnis von Anzahl

der Signale (�counts�) der Calciumlinien zuden unter denselben Bedingungen (�countsper life seconds�) erhaltenen �counts� fürStickstoff und/oder Sauerstoff bestimmt.Unter der Voraussetzung, dass beide Ele-mente mehr oder weniger gleichmäßig ver-teilt sind, sind so relative Aussagen mög-lich. Eine Aussage über die chemischen Ver-bindungen, in denen sich die nachgewiese-

Abb. 2: Röntgenmikroanalyse der äußeren Oberfläche des Operculums einer leeren Eihülle (a-c) undBruchfläche des Chorions (d-f) mit drei Schichten (1, 2, 3): a,d: Messpunkte; b,e: Sammelspektrumder 10 Messpunkte; c,f: Relation von Calcium zu Stickstoff. Weitere Erklärungen siehe Text.Fig. 2: X-ray microanalysis of the outer surface of the operculum of an empty egg capsule (a-c) andthe fractured chorion (d-f) showing three layers (1, 2, 3): a,d: measuring spots; b,e: ESMA spectrumof the 10 measuring spots; c,f: relation of calcium to nitrogen. For further explanations see text.

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nen Elemente befinden, ist nicht möglich.Zudem kommen Informationen über dieelementare Zusammensetzung aus einer Tie-fe von maximal 1 µm (GOLDSTEIN et al.1981).

3. Ergebnisse

Das Ei von Pharnacia westwoodi ist sphärisch,etwa 5 mm lang und besitzt eine dreilappigeMikropylarplatte (Abb. 1a). Das Operculum

Abb. 3: Röntgemikronanalyse der Mikropylarplatte einer leeren Eihülle, innere Fläche (a-c) undBruchfläche (d-f): a,d: Messpunkte; b,e: Sammelspektrum der Messpunkte, man beachte dasVorkommen von Schwefel; c: Relation von Schwefel zu Stickstoff; f: Relation von Calcium zuSauerstoff. Weitere Erklärungen siehe Text.Fig. 3: X-ray microanalysis of the micropylar plate of an empty egg capsule, inner surface (a-c) andfractured plate (d-f): a,d: measuring spots; b,e: ESMA spectrum of the measuring spots, note thepresence of sulphur; c: relation of sulphur to nitrogen; f: relation of calcium to oxygen. For furtherexplanations see text.

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trägt ein gestieltes Capitulum; der Opercular-winkel tendiert gegen Null (Abb. 1b). DasChorion ist etwa 60 µm dick. Im lichtmikro-skopischen (Abb. 1c) und rasterelektronen-mikroskopischen Bild (Abb. 2d) sind dreiSchichten zu unterscheiden, die alle sehr kom-pakt wirken.Die Analyse der äußeren Flächen des Eis(Operculum s. Abb. 2a-c; Chorion, Mikropy-larregion, nicht abgebildet) zeigt in allen Fäl-len Calcium an. Im Operculum scheint we-nig Calcium vorhanden zu sein. Die Abwei-chung in Messpunkt 2 ist aufgrund der Ska-lierung geringer als Abbildung 2c vermutenlässt und ist durch die Schattenwirkung derProbe zu erklären (Abb. 2b,c). Punktanalysenüber die Bruchfläche des unspezialisiertenChorions von innen nach außen belegen,dass Calcium in allen Schichten vorkommt,sehr wahrscheinlich aber in schwankenderKonzentration. Diese ist offenbar unabhän-gig von der Schichtung (Abb. 2d-f). Calciumlässt sich in leeren Eihüllen und frisch abge-legten Eiern nachweisen. Deutliche Unter-schiede in der Konzentration, insbesondereder inneren Schichten, waren nicht auszuma-chen (ohne Abbildung). In der Mikropylar-platte konnte Calcium lediglich im äußerenBereich der Bruchstelle nachgewiesen werden,nicht aber weiter innen (weder durch diePunktanalyse der Bruchfläche noch durch dieAnalyse der Innenseite) (Abb. 3d-f). Abbil-dung 3f zeigt die relative Verteilung von Cal-cium in der Mikropylarplatte in der Relationzu Sauerstoff. Auch die Relation von Calci-um zu Stickstoff (nicht abgebildet) ist ähn-lich. Auffällig ist die relativ gleichmäßige Ver-teilung von Schwefel in der Mikropylarplatte(Abb. 3c), sowohl an den Bruchflächen (Abb.3e) als auch auf der Innenfläche (Abb. 3b).

4. Diskussion

Unsere Daten belegen zunächst das Vorkom-men von Calcium(-Salzen) in unspezialisier-ten und zum Teil in spezialisierten Bereichendes Chorions von Pharnacia westwoodi. Neben

Calcium haben wir noch Kohlenstoff, Stick-stoff, Sauerstoff und Schwefel (in der Mikro-pylarplatte) detektiert. Vor allem die speziali-sierten Regionen sind von taxonomisch-sys-tematischer Bedeutung (u.a. MAZZINI et al.1993; CLARK SELLIK 1997; LIPINSKI et al. 1999;ZOMPRO 2004).Calcium wird mit der Nahrung aufgenom-men. Daher dürfte der Calciumgehalt desChorions in Abhängigkeit vom gebotenenFutter schwanken. RAMSAY (1955) ist der Mei-nung, das von den Erwachsenen aufgenom-mene Calcium würde über die Faeces und dieEier �entsorgt� (s.u.).Das Chorion der Eier von Ph. westwoodi unddas anderer Phasmidenarten, deren Eihüllenmineralisiert sind, ist schwer zu schneiden (s.auch LIPINSKI et al. 1999). MOSCONA (1950a,b)hat in dem außerordentlich komplexen Cho-rion der Eier von Bacillus libanicus histolo-gisch nach verschiedenen Farbreaktionen achtSchichten (einschließlich des Endochorions)identifiziert; in der vierten Schicht wurde Cal-ciumoxalat, in der sechsten Calciumcarbonatnachgewiesen. Die Anzahl der Schichten desChorions sowie deren Aufbau könnenallerdings von Art zu Art außerordentlichunterschiedlich sein (HINTON 1981; s. auchLIPINSKI et al. 1999). Bei Ph. westwoodi habenwir im Rasterelektronenmikroskop und inSemidünnschnitten nur drei Schichten imExochorion identifizieren können. In diesenist Calcium offenbar mehr oder wenigergleichmäßig vorhanden. Bemerkenswert sinddas Fehlen von Calcium in den inneren Schich-ten sowie das Vorkommen von Schwefel inder gesamten Mikropylarplatte. Dies deutetauf beträchtliche regionale Unterschiede hin(vgl. dazu MOSCONA 1950a,b).Calcium ist auch in leeren Eihüllen nach demSchlupf der Nymphen nachzuweisen. Da dievon uns angewendete Methode eine exakteQuantifizierung nicht erlaubt (s.o.), könnenwir noch nichts darüber aussagen, ob und inwelchem Maße die Embryonen von Ph. west-woodi während ihrer Entwicklung dem Chori-on Calcium entziehen. Dies ist aber zumin-

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dest indirekt für einige Phasmiden-Arten be-legt. PANTEL (1919, zitiert nach HINTON 1981)fand Calcium in den Malpighischen Gefäßenfrisch geschlüpfter Donusa prolixa, nicht jedochin den Embryonen. Das Exochorion besitzthier zudem eine �kristalline� Lage von Calci-um, die beim Schlupf der Jungen weitgehendreduziert ist. Das Chorion von Bacillus libani-cus gibt im Laufe der Entwicklung etwa 19 %seines Mineralgehaltes � ca. 38 % des Trocken-gewichtes bestehen aus Calcium, Magnesium,Aluminium, Kalium, Schwefel, Stickstoff undOxalat � offenbar an den Embryo ab. Dabeiwird eine innere Lage des Exochorions, dieCalciumcarbonat enthält, dünner. Eine andereLage, die Calciumoxalat enthält, dient offen-bar lediglich der Stabilisierung und wird nichtvon den Embryonen genutzt. Aus Eiern vonAdulten, die nur calciumfreies Futter zur Ver-fügung hatten, schlüpften nur wenige Junge,die nicht überlebten (MOSCONA 1948, 1950a,b).Dies spricht zumindest bei diesen Arten ge-gen eine bloße Entsorgung des Calciums überdie Eihüllen (s.o.).Inwieweit sich die unterschiedlichen Men-gen von Mineralsalzen auch mit anderen Pa-rametern der Phasmiden-Biologie korrelie-ren lassen, zum Beispiel mit der Wahl desEiablageplatzes (versteckt in Hohlräumenvon Pflanzenteilen oder angeklebt) und kli-matischen Bedingungen (so wenn die Eierin Regionen mit periodischer Vegetations-ruhe längere Perioden überdauern müssen)(BEIER 1968), ist unseres Wissens nicht be-kannt.

Danksagung

Herr D. SCHULTEN, Aquazoo und Löbbecke-Museum der Stadt Düsseldorf, überließ unsfreundlicherweise die Eier, Herr Prof. Dr. SEI-DEL, Institut für Physikalische Chemie undElektrochemie II der Universität Düsseldorf,ermöglichte die Röntgenanalytik, Herr M.BRENNER, Zoologie II der Universität Düs-seldorf, half bei der Herstellung einiger REM-Fotos.

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Prof. Dr. Hartmut GrevenMichael MielewczikInstitut für Zoomorphologie und ZellbiologieProf. Dr. Hildegard HammerInstitut für Angewandte PhysikHeinrich-Heine-Universität DüsseldorfUniversitätsstr. 1D-40225 DüsseldorfE-Mail: grevenh@uni-duesseldof.de