SƠ LƢỢC PHÂN LOẠI THỤ THỂ THEO CẤU TRÚC VÀ VỊ TRÍ HOẠT

ĐỘNG

6.1 Nhóm thụ thể của Neurotransmitters: (neurotransmitters receptors-NR)

Về mặt tổng quát, nhóm thụ thể này là những heterotetramer hoặc heteropentamer và mỗi tiểu

đơn vị được mã hóa trên một hoặc nhiều gene khác nhau trên cùng hay khác nhiễm sắc thể. Tất

cả các NR đều là protein bậc IV và chịu rất nhiều nguy cơ đột biến gene cũng như sai lệch trong

quá trình biểu hiện gene.

Synapses là nơi mà neuron giải phóng neurotransmitter, tác động đến hậu synapse của tế bào

đích (có thể là một neuron, cơ hay các tế bào tuyến). Trong phần này chúng ta sẽ tập trung vào

một số vấn đề quan trọng liên quan đến sự truyền tín hiệu (impulse transmission):

- Neurotransmitter được tạo ra ở đầu tận sợi trục như thế nào.

- Cái gì tạo ra điện thế hoạt động tại đầu tận sợi trục (axon termini) tại presynapse để kích

thích tiết neurotransmitter.

- Bằng cách nào việc gắn neurotransmitter vào thụ thể tương ứng tại postsynapse dẫn đến

thay đổi điện thế màng.

- Neurotransmitter được loại bỏ như thế nào sau khi nó kích thích tế bào postsynapse.

Thụ thể neurotransmitter được chia làm hai loại chính: Ligand-gated ion channels – có khả năng

mở ra ngay lập tức khi neurotransmitter bám vào và thụ thể G protein-coupled. Neurotransmitter

bám vào thụ thể G protein-coupled làm mở hay đóng các kênh ion riêng lẽ bởi quá trình kéo dài

từ vài giây đến vài phút. Những thụ thể neurotransmitter loại “chậm” này đã được đề cập chi tiết

khi thảo luận về cấu trúc lẫn chức năng của thụ thể G protein-coupled. Ở phần này, chúng ta sẽ

cùng nhau làm rõ hơn cấu trúc và hoạt động của nhóm thụ thể nicotinic acetylcholine – nhóm

được tìm thấy rất nhiều ở các synapse thần kinh-cơ. Đây là kênh ion đầu tiên được phát hiện,

phân dòng, là cơ sở các hệ luận của các kênh ion neurotransmitter khác.

Cấu trúc của thụ thể acetylcholine hƣớng ion

Thụ thể acetylcholine ở tế bào cơ bám xương là một protein pentamer với các tiểu đơn vị cấu tạo

lần lượt là α2βγδ. Tiểu đơn vị α, β, γ có tính tương đồng trong trình tự cấu tạo, bình thường

khoảng 35-40%. Thụ thể hoàn chỉnh là một cấu trúc 5 vòng xoắn, lòng ion là một cấu trúc hiện

hữu trong lòng thụ thể tương thích với 5 tiểu đơn vị.

Kênh này mở ra khi acetylcholine nối kết tại vùng nằm trên mặt ngoài tế bào tại vị trí của αγ và

αδ. Khi sự nối kết xảy ra, kênh sẽ mở trong một vài micro giây. Các nghiên cứu định lượng tính

thấm với các cation cho thấy lòng kênh khá hẹp, đường kính khoảng 0.65 đến 0.80 nm, đủ để

cho ion Na+ và K+ đi ngang qua khi chúng ở trong phức thể với phân tử nước. Do vậy, thụ thể

acetylcholine có khả năng vận chuyển cation được hydrated hóa, không giống các kênh Na+ và

K+ thông thường khác (chỉ vận chuyển được ion đơn thuần).

Hình 6.1: Minh họa cấu trúc thụ thể acetylcholine

Mặc dù cấu trúc trung tâm kênh vẫn chưa được làm sáng tỏ ở mức độ phân tử, có nhiều bằng

chứng cho thấy rằng nó được cấu tạo bởi 5 xoắn α M2 xuyên màng tương đồng nối kết với từng

đơn vị dưới của kênh. Xoắn M2 được cấu tạo ởi phần lớn các amino acid không phân cực hay kị

nước, nhưng luôn có phần mang điện tích âm của aspartate hay glutamate ở mỗi đầu tận, gần bề

mặt màng; ngoài ra còn có một vài serine hay threonine ở gần trung tâm. Các đột biến xảy ra đối

với thụ thể acetylcholine thay đổi vùng điện tích âm bởi điện tích dương (của lysine) đã được xác

định.

Khi thụ thể nối kết với acetylcholine, nhất thiết phải thúc đẩy sự biến đổi lập thể của thụ thể và

dẫn đến việc nới rộng lòng kênh.

Hình 6.2: Minh họa sự đóng/mở lòng kênh.

Neurotransmitter đƣợc tải vào túi synapse (synaptic vesicles) bởi H+-linked antiport

proteins

Có rất nhiều các phân tử nhỏ hoạt động như là một neurotransmitter tại các synapse khác nhau,

ngoại lệ là acetylcholine, một loại neurotransmitter có bản chất là một dẫn xuất của amino acid.

Các nucleotide, như ATP chẳng hạn và những nucleoside tương ứng (không gắn gốc phosphate)

cũng đóng vai trò là neurotransmitter. Mỗi neuron có khả năng sản xuất chỉ một loại

neurotransmitter mà thôi.

Tất cả các neurotransmitter cổ điển (classic neurotransmitter) đều được tổng hợp trong tế bào

chất và được vận chuyển ra các túi synapse bám màng tại đầu tận của sợi trục và được dự trữ ở

đó. Những túi synapse này có đường kính khoảng 40-50 nm, và có tính acid, được tổng hợp bởi

sự hoạt động của nhóm V bơm H+ (V-class proton pump) tại màng tế bào của túi.

Ví dụ, acetylcholine được tổng hợp từ acetyl coenzyme A (chất trung gian trong quá trình thoái

hóa glucose và acid béo) và choline với sự xúc tác của choline acetyltransferase:

Hình 6.3: Phản ứng tạo thành acetylcholine

Túi synapse thu giữ acetylcholine từ bào tương thông qua quá trình vận chuyển ngược với

radient nồng độ bằng cách sử dụng H+/acetylcholine antiporter tại màng tế bào. Có điều lạ là

gene mã hóa cho cái antiporter này có vị trí tại vùng intron đầu tiên của gene mã hóa cho choline

acetyltransferase, cách sắp đặt này là nguyên nhân bảo tồn được cơ chế điều hòa tương tác rất

chặt chẽ biểu hiện của cả hai protein này. Ngoài ra còn có những protein H+/neurotransmitter

antiport khác được sử dụng để đưa các loại neurotransmitter khác vào trong túi synapse.

Dòng Ca2+

nhập bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+

(Voltage-gated Ca2+

channels) kích

thích tiết neurotransmitter

Neurotransmitter được giải phóng qua quá trình xuất bào. Quá trình này có sự hỗ trợ của các tải

nội bào chế tiết và các protein xuyên màng. Có 2 điều làm cho sự xuất bào ở synapse khác với

những tế bào chế tiết khác:

- Sự tiết liên quan chặt chẽ đến hoạt động điện thế màng tại đầu tận của sợi trục.

- Túi synapse được tái cấu trúc tại khu vực hoạt động của nó, ngoại trừ acetylcholine.

Sự khử cực của màng tế bào không thể tự gây ra sự hòa màng của các túi synapse. Để có sự hòa

màng xảy ra, một hoạt động điện nhất thiết phải được biến đổi thành một tín hiệu hóa học – sự

gia tăng nồng độ Ca2+

trong tế bào chất. Kênh cổng điện thế Ca2+

sẽ mở ra để dòng Ca2+

nhập

bào khi sự khử cực xảy ra. Dòng Ca2+

nhập bào này làm gia tăng nồng độ Ca2+

trong tế bào chất

của các túi synapse kế cận từ

Có một thí nghiệm đã chứng tỏ được tầm quan trọng của kênh cổng điện thế Ca2+

trong quá trình

giải phóng neurotransmitter. Bằng cách khóa kênh này bằng tetrodotoxin (thuốc ức chế kênh

cổng điện thế Na+) để ngăn chặn sự thay đổi điện thế hoạt động của tế bào, người ta thấy rằng

không có sự chế tiết neurotransmitter. Nếu màng tế bào của sợi trục sau đó được khử cực bằng

cách sử dụng 100mM KCl, neurotransmitter lại tiếp tục được giải phóng bởi vì dòng Ca2+

lại vào

được tế bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+

, tương tự như quá trình khử cực bằng kênh cổng

điện thế Na+.

Luồng tín hiệu tại synapse thƣờng kết thúc bởi sự thoái giáng hoặc tái hấp thu

neurotransmitter

Hình 6.4: Minh họa quá trình tiết neurotransmitter, sự tái tạo synapse vesicle và sự tái hấp thu

neurotransmitter.

Sự co cơ và sự mở kênh acetylcholine-Gated cation

Hình 6.5: Trình tự hoạt hóa sự co cơ.Điện thế nơi tận tại presynapse của neuron vận động làm

mở kênh cổng điện thế Ca2+

(b1) và kích thích giải phóng acetylcholine, hoạt hóa sự mở thụ thể

acetylcholine tại màng tế bào cơ (b2). Kết quả của quá trình trên là sự nhập bào của Na+, rồi khử

điện thế màng gây hiện tượng mở kênh cổng điện thế Na+, Na

+ tiếp tục nhập bào gây ra một điện

thế hoạt động (b3). Khi Sự khử cực truyền tế ống T, nó tạo ra kích thích mở kênh cổng điện thế

Ca2+

trên màng tế bào. Ca2+

của sarcoplasmic reticulum sẽ đi vào tế bào chất (b4). Chính Ca2+

này sẽ kích thích quá trình co cơ (có thể tìm hiểu cơ chế cụ thể ở các tài liệu khác). (Theo

Guyton’s medical physiology)

Hình 6.6: Các tiểu đơn vị và polymere của thụ thể neurotransmitter

Hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse - Chức năng của thụ thể

Hình 6.7: Minh họa hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse (Theo Guyton’s

Medical physiology)

Màng neuron hậu synapse chứa rất nhiều protein thụ thể. Các thụ thể này được cấu tạo bởi 2

thành phần chính: (1) protein bám màng, hướng ra màng đến khe synapse – đây là nơi tiếp nhận

chất dẫn truyền thần kinh từ đầu tận của thần kinh tiền synapse, (2) các ion được truyền từ màng

vào bên trong của thần kinh hậu synapse bởi các thể mang ion. Các thể mang ion này tồn tại ở 2

dạng (1) kênh ion- cho phép 1 số ion chuyên biệt qua màng, (2) chất kích hoạt chất thông tin thứ

hai – phân tử này hướng về phía bào tương và kích hoạt một hoặc nhiều chất bên trong neuron

hậu synapse chứ không đơn thuần là một kênh ion.

Các kênh ion ở màng thần kinh hậu synapse có 2 loại (1) kênh cation (chủ yếu là Na+ đôi khi

cũng cho K+ và Ca

2+ đi qua), (2) kênh anion (kênh này chủ yếu cho Cl

- và 1 số ít các anion khác

đi qua). Kênh Na+ mang điện tích âm. Chính điện tích âm này giúp kênh vận chuyển được ion

Na+ khi đường kính của kênh lớn hơn đường kính của ion Na

+. Anion Cl

- và các anion khác

không qua được kênh này mà đi qua các kênh dành riêng cho chúng (có đường kính đủ lớn).

Nguyên nhân chủ yếu làm cho Na+, K

+, Ca

2+ không qua được các kênh dành cho anion là vì thể

hydrate hóa của các ion này có kích thước quá lớn.

Các chất dẫn truyền trung gian có nhiệm vụ mở kênh cation được gọi là chất dẫn truyền kích

hoạt, ngược lại các chất làm nhiệm vụ mở kênh anion được gọi là chất dẫn truyền ức chế. Các

kênh ion được mở ngay lập tức khi các chất dẫn truyền trung gian kích hoạt chúng (chưa đến 1

ms) và khi các chất dẫn truyền trung gian không còn nữa các kênh này sẽ được đóng lại với tốc

độ tương tự. Vậy, sự điều khiên của các neuron hậu synapse được nhanh chóng là nhờ sự đóng-

mở các kênh ion.

Hệ thống chất thông tin thứ 2 ở neuron hậu synapse

Một vài chức năng của hệ thần kinh như sự ghi nhớ cần có những thay đổi trong neuron từ vài

giây đến hằng tháng kể từ khi chất dẫn truyền thần kinh không còn nữa.. Kênh ion đóng trong

vòng vài ms sau khi chất dẫn truyền biến mất nên nó không có khả năng gây ra những thay đổi

neuron hậu synapse kéo dài. Thay vào đó, các kích thích hoặc hạn chế các thay đổi neuron hậu

synapse bằng cách kích thích hệ thống chất thông tin thứ 2 ở trong chính những neuron hậu

synapse đó. Và chất thông tin thứ 2 sẽ giúp kéo dài sự thay đổi.

Hệ thống chất thông tin thứ 2 có nhiều loại. Loại phổ biến nhất là G-Proteins. G-protein bám vào

phần thụ thể hướng vào bên trong tế bào. G-protein gồm 3 phần phần α - phần kích hoạt và phần

β, phần γ bám vào phần α và bên trong màng tế bào kế cận của protein thụ thể. Khi có kích thích

thần kinh, phần α tách khỏi phần β và γ để găn vào bào tương.

Trong bào tương, tùy vào từng loại neuron mà phần α thực hiện 1 hay nhiều nhiệm vụ khác nhau.

Hình thể hiện 4 thay đổi có thể xảy ra. Đó là các dạng:

1. Mở 1 vài kênh ion thông qua màng tế bào hậu synapse. Ở bên góc trái của hình: kênh K+ được

mở nhờ G-protein, nhờ G- protein kênh này được mở ra rất lâu so với cơ chế không dùng hệ

thống chất thông tin thứ 2.

2. Kích hoạt cAMP hay cGMP ở trong tế bào thần kinh. cAMP, cGMP có khả năng kích hoạt

những hệ thống chuyển hóa chuyên biệt trong neuron nên chúng có thể gây ra sự thay đồi lâu dài

trong cấu trúc tế bào, và chúng cũng nhạy cảm với các kích thích của neuron.

3. Sự kích hoạt các enzyme nội bào. G-protein có thể kích hoạt một hoặc nhiều enzyme nội bào.

Các enzyme này sẽ thực hiện một vài chức năng hóa học nhất định trong tế bào.

4. Kích hoạt sự phiên mã. Đây là một trong những tác dụng quan trọng nhất của hệ thống thông

tin thứ 2 vì sự phiên mã có thể tạo ra những protein mới trong neuron, các protein này sẽ thay đổi

bộ máy chuyển hóa hay cấu trúc của tế bào. Thật vậy , sự thay đổi cấu trúc được gây ra bởi

neuron xảy ra ở qui trình ghi nhớ dài hạn

Rõ ràng là sự kích hoạt hệ thống thông tin thứ 2 trong neuron bởi G-protein hay các loại khác, rất

quan trọng trong việc đáp ứng lâu dài ở những con đường dẫn truyền thần kinh khác nhau.

Sự kích hoạt hoặc kìm hãm thụ thể trong màng neuron hậu synapse

Vài thụ thể hậu synapse khi được kích hoạt có thể kích thích hay ức chế các neuron hậu synapse.

Sự kích thích hay ức chế này rất quan trọng trong chức năng của hệ thần kinh. Các thụ thể khác

nhau sẽ sử dụng những cơ chế màng và phân tử khác nhâu để kích hoạt và ức chế.

Sự kích hoạt

1. Sự mở của kênh Na+

cho phép 1 lượng lớn điện tích dương chảy vào bên trong tế bào hậu

synapse. Sự tăng về nồng độ các điện tích dương làm cho điện thế dương nội màng tăng đến

mức ngưỡng kích thích để tạo ra kích thích.

2. Giảm lượng ion vận chuyển qua kênh chloride và postassium. Nó làm giảm sự khuếch tán Cl-

vào bên trong neuron hậu synapse hay giảm sự khuếch tán của K+ ra ngoài. Nó làm cho màng

nội bào dương hơn mức bình thường, đó là sự kích thích.

3. Sự thay đổi đa dạng trong chuyển hóa nội bào của neuron hậu synapse kích hoạt hoạt động tế

bào. (sự tăng lên các thụ thể màng kích hoạt hay giảm xuống các thụ thể màng ức chế)

Sự ức chế

1. Sự mở các kênh Cl- trên màng neuron hậu synapse giúp cho Cl

- khuếch tán nhanh chóng từ

ngoài vào bên trong neuron hậu synapse, làm tăng điện tích âm bên trong màng, đó là sự ức chế.

2. Sự thoát K+

khỏi neuron giúp các ion dương được khuếch tán ra ngoài làm tăng điện thế âm

bên trong neuron.

3. Sự kích hoạt các enzym thụ thể làm kiềm chế các chức năng chuyển hóa tế bào, tăng thụ thể

synapse ức chế hoặc giảm thụ thể synapse kích hoạt.

6.2 Nhóm thụ thể kết hợp với Protein G: (G protein-coupled receptor)

Sự phát hiện ra G protein

G- protein được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin Rodbell năm 1971 về sự kích hoạt

cAMP bởi glucagon. Nhờ thí nghiệm này Martin Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP

là rất quan trọng trong phản ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide, sau

này đổi tên là N-protein, hoạt động như bộ chuyển đổi trung gian giữa discriminator (receptor)

and amplifier (effector; i.e., adenylate cyclase). Sau đó, ông thấy rằng adenylatecyclase đã

được kích hoạt mạnh mẽ và không thể đảo ngược bởi một analog GTP,5'-

guanylylimidophosphate, hoặc[GPP (NH)-p]’. Vì GPP (NH)-p có khả năng chống thủy phân

nên Rodbell cho rằng GTP là"chất thủy phân tại vùng tác hoạt", có nghĩa là, bộ chuyển đổi

giống như GTPase. Điều này sau đó đã được thể hiện rõ hơn bởi Cassell và Selinger vào năm

1976. Sự có mặt của protein bám GTP riêng lẽ, khác biệt với các enzyme adenylate cyclase,

được xác định bởi Alfred Gilman và đồng nghiệp người đã tái thiết lại GPP (NH)-p-, 1 chất kích

thích hoạt động adenylate cyclase trong màng từ dòng đột biến tế bào ung thư hạch (cyc-) - có

adenylate cyclase nhưng thiếu G-protein bằng cách bổ sung thêm yếu tố 40kDa GTP bám riêng

biệt. Năm 1980, Howlett và Gilman cho rằng sự kích hoạt lâu dài của G-protein kích hoạt

cyclase làm giảm lượng phân tử protein, nhấn mạnh rằng G-protein được tạo thành bởi những

tiểu đơn vị có thể li giải được. Cấu trúc tam thể (3 thành phần) của G-protein được phát hiện bởi

Stryer và cộng sự. Họ đã chứng tỏ được rằng sự kích hoạt Gt bởi Gpp(NH)-p và ánh sáng dẫn

đến sự phân ly của phức hợp trimeric αβγ, tạo nên Gpp(NH)-p bám αt và βγ (αt có vai trò kích

hoạt sự khử phosphoryl hóa). Năm 1985, α-transducin được tạo thành bởi 4 nhóm với các trưởng

nhóm là Numa, Boume, Khorana, và Simon; Năm 1986, cấu trúc của tiểu đơn vị α được xác định

đầy đủ bởi nhóm của Gilman. Rodbell và Gilman được trao giải Nobel vào năm 1994.

Cấu trúc của G-protein

G-protein được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45 kDa, tiểu đơn vị β có KLPT

~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa . Có khoảng 20 gen mã hóa nhiều loại tiểu đơn vị α,

6 gen đối với tiểu đơn vị β và 12 gen cho tiểu đơn vị γ. Ở trạng thái trimer hóa, G-protein bám

vào mặt trong của màng tế bào thông qua đuôi kị nước của tiểu đơn vị α và γ (myristoyl và

palmitoyl trên α, farnesyl hoặc geranylgeranyl trên γ). Tiểu đơn vị β và γ được nối lại với nhau

bởi liên kết giữ lõi với lõi để tạo nên βγ-dimer; tiểu đơn vị β của βγ-dimer này sẽ bám vào tiểu

đơn vị α bằng theo kiểu bổ sung ở vùng liên kết peptide trên 2 protein và sự tương tác với đuôi kị

nước. Khi G-protein được kích hoạt, liên kết giữa tiểu đơn vị α và β bị đứt, trimer bị phân ly

thành tiều đơn vị monomeric α và tiểu đơn vị dimeri βγ. Tiểu đơn vị α và βγ đều bám vào màng

tế bào nhưng cũng dễ dàng tách khỏi màng khi cần.

Hình 6.8: Mô tả cấu trúc G-protein (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.

Foreman_ T. Johansen)

Tiểu đơn vị α có 2 vùng chức năng quan trọng khác ngoài vùng để nối kết với tiểu đơn vị β.

Một là, tiểu đơn vị α tác động với thụ thể ở vị trí 5 amino acid cuối của đầu C tận. Hai là nó

mang vùng gắn kết với guanine nucleotide binding pocketđể thực hiện chức năng GTPase của G-

protein. Mặc khác, cả 2 tiểu đơn vị α và βγ đều có thể tác động đến bề mặt tác động của G-

protein.

Sự xáo trộn của chu trình G-Protein

Chu trình của G-protein có thể bị xáo trộn bởi những con đường sau:

1. Sự đảo của chu trình dựa vào sự thủy phân của γ-phosphate của GTP. Điều này xảy ra khi một

dẫn xuất của GTP nối kết vào thụ thể nhưng không có khả năng thủy phân hay thủy phân chậm

nối kết với tiểu đơn vị. Ví dụ,

5′-guanylylimidophosphate (Gpp(NH)-p) hay guanosine 5′-O-(3-thiotriphosphate)

(GTPγS),hay thêm vào AlF4, tạo các triphosphate giả (pseudo phosphate) trên GDP trong Gα-

GDP. Trong những điều kiện này, sự hoạt hóa các chất tác hiệu trở thành không thuận nghịch.

Thụ thể được kích hoạt sẽ xúc tác chu trình G-protein, về bản chất cũng giống như khi có ligand

kết nối nhưng chậm hơn từ 100 đến 1000 lần. Khi thiếu sự kích hoạt thụ thể bởi ligand, chu trinh

cơ bản chậm sẽ xảy ra. Nguyên nhân có thể là vì phần nhỏ của thụ thể hiện diện trong thể hoạt

động ngay cả khi thiếu ligand. Kết quả là, sự thay đổi Gpp(NH)-p hay GTPγS bởi GTP hay sự có

mặt của AlF4 đóng vai trò tạo ra các đáp ứng tác hiệu (effector response) trong khi thiếu ligand

thụ thể. Tuy vậy, sự kích hoạt vẫn chậm hơn khi có sự hiện diện của ligand.

Hình 6.9: Minh họa một số cấu trúc (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.

Foreman_ T. Johansen)

2. Chu trình có thể chậm lại khi thêm vào những GDP dư thừa hay, guanosine

5′-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS) – một dẫn xuất ổn định hơn. Không giống GTPγS, GDPβS

có liên kết thuận nghịch nên nó chỉ cạnh tranh với GTP. Do vậy nó sẽ chỉ hoạt động ở nồng độ

cao hơn tiêu chuẩn từ 10 lần trở lên.

3.Khi có sự hiện diện của NAD+, tiểu đơn vị α của G-protein có thể bị ADP-ribosylated bởi 2

loại

Protein vi khuẩn. Độc tố của vi khuẩn Ho gà (whooping-cough) (PTx) ADP-ribosylates cysteine

ở đầu C tận của G-protein của nhóm Gi và Go ngăn cản sự bắt gặp của G-protein thụ thể và

năng chặn sự hoạt hóa GPCR. . N-ethyl-maleimide (NEM) cũng alkyl hóa cysteins theo cùng cơ

chế.

Độc tố dịch tả (CTx) ADP-ribosylates arginine trong G-proteins của lớp Gs (adenylate cyclase-

stimulating) ở gần vị trí GTPase. Nó làm ngăn cản chức năng của GTPase xúc tác và gây ra sự

hoạt hóa Gs/adenylate cyclase lâu dài. Tranducin và gustducin (tín hiệu nhìn và nếm) đều được

ADP-ribosylated bởi cả 2 loại độc tố trên. Phản ứng này có thể được dùng để phân lập các G-

protein có thể bị ADP-ribosylated.

Sự điều hòa tín hiệu G-protein

RGS Protein

RGS protein thuộc họ các protein liên kết lỏng lẻo giống nhau ở vị trí RGS 130 amino acid cho

phép chúng bám vào tiều đơn vị α của G-protein. Khi RGS protein bám vào, nó điều hòa tín hiệu

G-protein theo 2 cách. Cách thứ nhất (quan trọng nhất), nó có vai trò như GAPs (protein kích

hoạt GTPase), tăng cường sự thủy phân GTP bằng cách hoạt hóa G-protein, sau đó chúng kích

hoạt GαGTP hay Gβγ tăng cường sự khôi phục của các phần tử tác hiệu (effector). RGS protein

không ảnh hưởng đến tỉ lệ GDP-GTP và tỉ lệ G-protein được kích hoạt bởi thụ thể. Cách thứ 2.

RGS protein làm giảm khả năng bám của GαGTP vào các phần tử tác hiệu, ngăn chặn phản ứng.

Ta có thể thấy tiểu đơn vị α được kích hoạt bở GTPγS không thủy phân được. Ví dụ, RGS

protein, RGS4, ngăn cản sự đáp ứng của PLC-β1đối với GTPγS kích hoạt Gq.

Có rất nhiều loại RGS protein vì vậy cũng có rất nhiều độ chọn lọc cho từng tiểu đơn vị α và

cũng có nhiều tác động lên từng hệ thống tác động khác. Những thuộc tính này thường được

đánh giá trong hệ thống biểu hiện khôi phục. Hiện nay vai trò của RGS protein riêng biệt trong tế

bào vẫn chưa được rõ.

Một trong những điều thú vị của vấn đề này đó là sự liên kết giữa RGS protein và tiểu đơn vị α

có thể bị phá vỡ bởi điểm đột biến trên tiểu đơn vị α mà không ảnh hưởng đến chức năng của

Gα. Sự kết hợp đột biến này với đột biến khác giúp loại bỏ tính nhạy cảm của PTx (hình 7.10).

RGS protein nội sinh có vai trò trong việc ức chế dòng Ca2+

trong thần kinh giao cảm bởi Go

được kích hoạt bởi noradrenaline. Ví dụ: sự thay thế Goα bằng Goα đột biến giúp giảm sự nhạy

cảm của noradreanaline đi 10 lần và làm chậm quá trình khởi động và khôi phục sự ức chế. Tuy

nhiên, vấn đề này liên quan đến khả năng hoàn nguyên của hệ gene.

Hình 6.10: Minh họa một số vai trò của RGS protein

Protein hoạt hóa GTPase hoạt động nhƣ một phân tử tác hiệu

Enzyme có vai trò như GAP - tăng cường sự thủy phân GTP, điều khiển sự bất hoạt nhanh của

các ezyme được hoạt hóa bởi G-protein. Ví dụ, Gαq-GTP thuần có hoạt tính GTPase rất yếu (tiêu

tốn 10-60s) nhưng hoạt tính này sẽ tăng lên 50 lần khi có mục tiêu tác hiệu của nó, như PLC-β1

chẳng hạn, điều nay làm cho chu kì bán hủy hoạt tính sinh học của nó chỉ kéo dài trong 1s. Như

thế, sự thêm vào phosphodiesterase rút ngắn chu kì bán hủy của GTP-bound α-transducin từ 20s

xuống còn 5s. Tác dụng tăng cường của phosphodiesterase kết hợp với tác động visual RGS

được đề cập ở trên. Các tác hiệu của kênh ion có vai trò như GAP khi thiếu RGS protein vẫn

chưa rõ cơ chế.

6.3 Nhóm thụ thể Tyrosine Kinase: (Tyrosine kinase receptors)

Distinct mechanisms of small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies for targeting receptor

tyrosine kinases in cancer cells. a | Epidermal growth factor receptor (EGFR) and receptor tyrosine kinase

(RTK)-dependent growth signalling in cancer cells. The extracellular region of EGFR consists of four

domains, the ligand-binding domains (L1 and L2) and the cysteine-rich domains (CR1 and CR2), and the

C-terminal domain of EGFR contains six tyrosine residues (Y; only two are depicted here for simplicity).

Following the activation of EGFR by ligand binding or ligand-independent dimerization, the Ras–Raf–

MEK–MAPK pathway is activated through the growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2)–SOS

complex. EGFR-mediated signalling also activates the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–AKT

pathway, which contributes to anti-apoptotic effects of EGFR activation. Additionally, signal transducer

and activator of transcription (Stat) proteins (STAT1, STAT3 and STAT5) are also activated. The

coordinated effects of these EGFR downstream signalling pathways lead to the induction of cellular

responses including proliferation, differentiation, cell motility, adhesion and angiogenesis. The

deregulation of EGFR-mediated signalling in some cancer cells leads to aberrant proliferation, invasion,

metastasis and neovascularization.[9] b | Small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as

gefitinib function as ATP analogues and inhibit EGFR signalling by competing with ATP binding within

the catalytic kinase domain of RTKs. As a result, the activation of various downstream signalling

pathways is blocked. Each TKI has a different selectivity for RTKs, and some are dual- or multi-selective,

which might provide a therapeutic advantage. c | By contrast, therapeutic monoclonal antibodies (mAbs)

bind to the ectodomain of the RTK with high specificity (for example, cetuximab binds to the L2 domain

of EGFR, and thereby inhibits its downstream signalling by triggering receptor internalization and

hindering ligand–receptor interaction. Unlike small-molecule inhibitors, mAbs also activate Fcγ-receptor-

dependent phagocytosis or cytolysis by immune-effector cells such as neutrophils, macrophages and

natural killer cells by inducing complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular

cytotoxicity (ADCC).[107] MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEK, mitogen-activated protein

kinase kinase.

Khám phá thụ thể Tyrosine kinase

Khoảng hơn 30 năm trước, các thụ thể của hormone polypeptide như là insulin và GH đã được

phát hiện như là vùng nối kết kích hoạt hoạt động của màng tế bào, tế bào hoặc các protein

xuyên màng bằng cách sử dụng protein đánh dấu phóng xạ. Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu của

những thụ thể này vẫn còn là điều bí mật trong suốt 10 năm sau đó cho đến khi hoạt tính của

PTK được khám phá. RTK đầu tiên được khám phá cả về cấu tạo và chức năng là thụ thể EGF

(epidermal growth factor). Stanley Cohen và đồng sự đã tách ly được thụ thể EGF và chứng

minh nó là một glycoprotein trong màng tế bào và có trọng lượng là 170kDa, ngoài ra người ta

còn thấy nó có một vùng nối kết đặc biệt. Cấu trúc hoàn chỉnh của thụ thể EFG được phát hiện

nhờ vào phương pháp phân dòng cDNA (cDNA cloning) và trình tự mRNA, PTK được cố định

ở trong bào tương tại thụ thể chuỗi polypeptide (receptor polypeptide chain). Ligand nối kết làm

nhị hợp hóa thụ thể EGF và nhanh chóng kích hoạt PTK tự phosphoryl hóa một vài phân tử

tyrosine tại đầu C của thụ thể. Các phosphotyrosine là vùng nối kết cho vùng Src homology 2

(SH2) hoặc vùng gắn kết phosphotyrosine (phosphotyrosine-binding domain, PTB) của một vài

phân tử protein tín hiệu.

Sau đó, RTKs được phát hiện có 20 dòng nhỏ khác nhau và tất cả đã được phân lập. Những cấu

trúc này hằng định trong vùng xúc tác của PTK nhưng chúng biến động rất lớn trong khu vực

ngoại bào cũng như là tại juxtamembrane và vị trí tại đầu C trong bào tương. Sự phân loại các

dòng nhỏ (subfamilies) dựa vào các trình tự tương đồng chính yếu (primary-sequence homology)

và sự tương khớp trong cấu trúc bậc 2. Vùng giàu cysteine, vùng immunoglobulin-like (Ig-like),

vùng giàu leucine, vùng giàu cadherin-like, vùng fibronectin type III, vùng EGF-like, và vùng

kringle-like chỉ rõ đặc điểm của khu vực ngoại bào của RTKs.

Hình 6.11: Minh họa 20 họ của siêu họ RTK. (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed

- J. Foreman_ T. Johansen)

Nhìn chung, tyrosine kinase là họ thụ thể được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: Ngoại bào và nội

bào, chúng nối kết với nhau bằng một chuỗi polypeptide xuyên màng. Thành phần ngoại bào là

nơi gắn kết với ligand (khu vực gắn ligand, ligand biding domain-LBD). Thành phần nội bào có

những amino acid tyrosine, là vị trí phosphoryl hóa dưới sự xúc tác của tyrosine kinase. Chuỗi

polypeptide xuyên màng là một vòng α có cấu trúc bậc II, cấu trúc mỏng manh của vòng xoắn α

làm thành phần ngoại bào dễ bị lệch trục khi màng bào tương trở nên giảm linh động do sự tích

hợp của protein, cholesterol tự do hay acid béo no lên màng bào tương nên LBD không thể gắn

được với ligand. Tình trạng này được xem là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng

kháng insulin trong hội chứng chuyển hóa cũng như tình trạng miễn dịch kém trong hội chứng

này, vì thụ thể insulin và cytokines thuộc họ RTK.

Hình 6.12: Cấu trúc SH2

Các học thuyết về sự kích hoạt thụ thể Tyrosine Kinase

Các nghiên cứu trên chức năng của thụ thể EGF đã xác lập được 2 hệ luận trong sự hoạt hóa

RTK và sự truyền tín hiệu.

Trước hết, RTKs được kích hoạt bởi sự nhị hợp hóa phát sinh bởi sự liên kết với ligand. Ngoại

trừ họ thụ thể insulin, tất cả các thụ thể RTK khác (EGF, thụ thể platelet-derived growth factor

(PDGF)) đều có cấu trúc monomer trên màng tế bào. Khi ligand nối kết với thụ thể đã khiến nó

trải qua quá trình dimer hóa và quá trình tự phosphoryl hóa xảy ra trên vùng C (nội tế bào chất)

của nó. Thụ thể insulin là một thụ thể dimer disulfide, 2 chuỗi polypeptide được gọi là α2β2

heterotetramer. Insulin nối kết với tiểu đơn vị α ngoài màng tế bào dẫn đến quá trình sắp xếp lại

(rearrangement) trong cấu trúc của thụ thể (quaternary heterotetrameric) và kích hoạt PTK, tăng

cường quá trình tự phosphoryl hóa của vùng nội bào. Thể hoạt hóa của thụ thể insulin và các thụ

thể monomer PTK khác đều ở trạng thái dimer, và cơ chế hoạt hóa các thụ thể này rất tương

đồng với nhau.

Hình 6.13: Minh họa sự dimer hóa của RTK (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed

- J. Foreman_ T. Johansen)

Thứ hai, thụ thể tự phosphoryl hóa tạo ra vùng phosphotyrosine (phosphotyrosine sites) tại vị trí

trong màng bào tương của thụ thể, tạo ra một vùng neo (docking site) để nối kết với vùng SH2

và PTB. Hơn nữa, để cho thấy vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa hoạt động của PTK, sự

tự phosphoryl hóa tyrosine của RTK là một quá trình thiết yếu để tái cấu trúc và kích hoạt các

phân tử protein tín hiệu. Hầu hết các vùng tự phosphoryl hóa tyrosine đều nằm ở vùng không xúc

tác (noncatalytic regions) của vùng nội bào phân tử thụ thể. Những vùng này gồm đuôi C (C-

terminal tail) (như với thụ thể EGF) hoặc vùng nối phosphate (kinase insert region) (như đối với

thụ thể PDGF). Sự tương tác giữa vùng SH2 và các motif phosphotyrosine tạo ra cơ chế hiệp

đồng và tái cấu trúc của phức hợp tín hiệu (signaling complex) bằng cách kích hoạt RTK. Do

vậy, tất cả RTK cần phải được biết đến không chỉ dưới vai trò thụ thể (PTK activity) mà còn phải

xem như là nền tảng của sự nhận diện và tái cấu trúc (bổ sung) các thành phần đặc biệt của phân

tử protein tín hiệu.

Hình 6.14: Thụ thể của Growth hormone (GH). Các cấu trúc monomer GH kết hợp với phần

khác để tạo thành cấu trúc dimer khi có GH nối kết. Quá trình này được xúc tác bởi JAK2 kinase

trans-phosphorylate JAK2 và thụ thể GH, yếu tố phiên mã STAT được phosphoryl bởi

JAK2.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J. Foreman_ T. Johansen)

Hình 6.15: Các dạng RTK tiêu biểu và cấu trúc bất hoạt/hoạt động

Chi tiết sự hoạt hóa dimer hóa tysosine

Trong gần 20 năm trở lại đây, những quá trình tín hiệu đã được hiểu rõ dựa vào sự hiểu biết về

nền tảng phân tử của quá trình dimer hóa RTKs. Nền tảng này được các nghiên cứu hóa sinh học

về việc nối kết ligand và hoạt hóa RTK chứng minh là đúng. Tuy nhiên, các phân tử nền tảng

chính xác cho sự hình thành này vẫn chưa được biết đầy đủ. Các hiểu biết về ligand trong phức

hợp của nó với vùng kết nối thụ thể đã cho thấy cơ chế tự nhiên của sự dimer hóa này. Một vài

cấu trúc lập thể của thụ thể trong phức hợp của nó với ligand tương ứng đã được chứng minh,

bao gồm cả cytokin cũng như các thụ thể của yếu tố tăng trưởng (growth factor). Những ligand

khác nhau dẫn đến các cơ chế tác động khác nhau nhưng đều có điểm chung là kích thích vùng

dimer hóa của RTK.

Cấu trúc lập thể của những monomer ligand như GH và EPO trong phức hợp với các thụ thể đặc

hiệu cho thấy những hormone này tạo nối kết với thụ thể theo tỉ lệ 1:2. Sự dimer hóa thụ thể

được làm ổn định hóa hơn nữa bởi sự tương tác giữa các thụ thể kế cận.

Một vài yếu tố tăng trưởng là cấu trúc dimer thuần (homodimers), như vascular endothelial

growth factor (VEGF) và PDGF chứng minh cho việc dimer hóa của thụ thể. Thụ thể VEGF

chứa 7 vùng Ig-like trong cấu trúc xuyên màng của nó, trong đó chỉ có vùng 2 và 3 là có nối kết

với ligand. Cấu trúc lập thể của VEGF trong phức hợp với Ig-like 2 của thụ thể Flt-1 VEGF là

bằng chứng trực tiếp xác nhận sự dimer hóa của thụ thể. Cấu trúc này cho thấy một phân tử thụ

thể bám vào phần còn lại bởi 2 vùng nối liền giữa các VEGF protomer tạo thành phức hợp có 2

thành phần đối xứng (twofold symmetric), ngoài ra chứa thêm 2 VEGF protomer của vùng Ig-

like 2.

Fibroblast growth factor (FGF) là một monomer ligand, nó hoạt hóa thụ thể FGF với sự bổ trợ

của phân tử phụ - heparin sulfate proteoglycan. Cấu trúc lập thể của FGF trong phức hợp với

ligand tại vùng nối kết (bao gồm cả vùng 2 và 3 của Ig-like) cho tỉ lệ 2:2 (FGF:FGF) phức hợp

thụ thể, nghĩa là FGF tương tác bền với vùng 2 và 3 của Ig-like mà các nối kết này nằm trong

cùng 1 thụ thể. Cấu trúc dimer được giữ ổn định bởi một vùng liên kết thứ cấp có sự tương tác

giữa FGF và D2 của thụ thể thứ cấp trong phức hợp cũng như là sự tương tác giữa 2 thụ thể.

Ngược lại với liên kết disulfide của VEGF dimer, 2 phân tử FGF trong liên hệ 2:2 (FGF:FGF)

không có sự liên hệ với nhau. 2 thụ thể FGF không hoàn toàn cố định thành thụ thể FGF dimer

hóa trên bề mặt tế bào. Heparin hay heparan sulfate proteoglycan là thành phần ổn định hóa cấu

trúc dimer này. Heparin bám vào vùng eo có điện tích dương được tạo bởi Lys và Arg kéo dài

xuyên qua vùng D2 (D2 domain) của cả 2 thụ thể trong cấu trúc dimer và nối tiếp biên phân tử

FGF.

Hình 6.16: Cấu trúc FGF receptor.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.

Foreman_ T. Johansen)

Chi tiết quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine

Quá trình hoạt hóa RTKs được hoàn thành nhờ quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine – kết quả

của quá trình dimer hóa ligand. Hai quá trình này dẫn đến kết quả là tăng cường hoạt động xúc

tác của PTK và tạo nên vị trí gắn trong miền nội bào, thúc đẩy sự dẫn truyền tín hiệu đến các

protein. Một cách tổng quát mà nói, quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine trong quai kích hoạt

(activation loop) tại vùng PTK đưa đến việc kích thích hoạt động của kinase, và tự phosphoryl

hóa tyrosine trên juxtamembrane, cài kinase (kinase insert) và vùng carboxyl tạo ra vị trí neo giữ

nhận ra phosphotyrosine trong các trường hợp đặc biệt. 2 module nối kết phosphotyrosine hoàn

chỉnh (2 well-established phosphotyrosine-binding modules) hiện diện trong protein tín hiệu là

vùng SH2 và PTB.

Mọi RTKs chứa khoảng 1 đến 3 phân tử tyrosine trong quai hoạt hóa kinase (kinase activation

loop), trong subdomain VII và VIII của lõi xúc tác protein kiase (protein kinase catalytic core).

Sự phosphoryl hóa các phân tử tyrosine này được chứng minh là cần thiết cho việc kích hoạt khả

năng xúc tác và các chức năng sinh học của một lượng lớn RTKs, kể cả thụ thể insulin, FGF và

VEGF, PDGF, Met (hepatocyte growth factor) và TrkA (NGF). Ngoại lệ quan trọng là thụ thể

EGF, quá trình tự phosphoryl hóa của tyrosine trong quai kích hoạt không liên quan đến quá

trình truyền tin. Sự thay đổi tyrosine thành phenylalanine không làm thay đổi hoạt động của

RTK hoặc dòng thác tín hiệu.

Về nguyên tắc, sự tự phosphoryl hóa RTK có thể xảy ra ở mặt cis (trong lòng thụ thể monomer)

hoặc trans (giữa hai thụ thể ở trạng thái dimer). Trong trường hợp thứ nhất, ligand bám vào có

thể gây ra sự biến đổi cấu trúc thụ thể và làm quá trình cis-autophosphoryl hóa của tyrosine cố

định trong hoặc ngoài vùng PTK. Trong trường hợp thứ hai, không nhất thiết phải xảy ra sự thay

đổi cấu trúc dimer. Một hiệu ứng đơn giản gần (simple proximity effect) có thể tạo điều kiện

thuật lợi cho quá trình trans-autophosphoryl hóa tyrosine ở vùng nội bào tương bởi một RTK thứ

hai.

Cấu trúc lập thể của trạng thái không phosphoryl hóa thụ thể insulin cung cấp chi tiết cơ chế

phân tử trạng thái bất hoạt của RTKs (tình trạng hoạt động kém) trước khi sự tự phosphoryl hóa

xảy ra. Trong cấu trúc thụ thể insulin, 1 trong 3 tyrosine ở trong quai hoạt hóa, Tyr1162, liên kết

với vùng hoạt động và có vẻ như trong vị trí tự phosphoryl hóa dạng cis. Tuy nhiên, Asp1150

của PTK-conserved, trình tự Asp-Phe-Gly ở vị trí khởi đầu quai hoạt hóa không phải ở vị trí

chính xác để phối hợp với MgATP và gây trở ngại cho việc gắn ATP. Điều này phụ hợp với dữ

liệu hóa sinh về việc phosphoryl của Tyr1162 (và Tyr1158, Tyr1163) cho rằng nó xảy ra theo

dạng trans (bởi một phân tử thụ thể insulin thứ 2). Hơn nữa, sự thay thế Tyr1162 bằng

phenylalanine dẫn đến việc tăng hoạt động kinase hóa cơ bản một cách chắc chắn, phù hợp với

vai trò ức chế của Tyr1162.

Hình 6.17: Cấu trúc giải phẫu vùng hoạt hóa của protein kinase. Biểu đồ trình bày thông tin

chính của vùng prototypicalkinase catalytic dựa trên cấu trúc của IRK. Vùng N được biểu diễn

màu xanh, vùng C được biểu diễn màu tím và quai hoạt hóa màu vàng. Cơ chất peptide neo vào

quai hoạt hóa và một phân tử ATP màu đen. Xoắn C chứa các thành phần xúc tác, xoắn G – nơi

neo giữ protein cơ chất có dạng phiến mỏng.

Cấu trúc lập thể vùng tris-phosphorylated PTK của thụ thể insulin tiết lộ vai trò của quai hoạt

hóa phosphoryl hóa trong sự kích thích hoạt động xúc tác. Sự tự phosphoryl hóa thụ thể insulin

mang lại sự xác định rõ vai trò của quai hoạt hóa (activation loop). Cụ thể, sự thay đổi cấu trúc

của quai hoạt hóa tris-phosphorylated insulin RTK được ổn định bởi sự tương tác với

phosphotyrosine (cụ thể là phosphorylated Tyr1162, có liên kết hydrogen với phân tử arginine

đầu tiên của quai hoạt hóa (Arg1155) và gốc amide với một nữa sau của quai). Do đó, thụ thể

insulin có bản chất ức chế dạng cis, khi có sự gắn kết của Tyr1162 tại vùng hoạt hóa sẽ cạnh

tranh với protein cơ chất nhưng không tự phosphoryl hóa dạng cis được bởi vì sự ràng buộc

không gian ngăn chặn sự nối kết của MgATP. Thụ thể insulin có bản chất hoạt hóa dạng trans

nhờ phân tử thụ thể thứ 2 có khả năng phosphoryl hóa Tyr1162. Các yếu tố nhiệt độ (B-factors)

cho thấy vị trí phosphoryl hóa của quai hoạt hóa insulin RTK rất di động, có lẽ là vì có sự cân

bằng giữa những sự biến đổi đa chiều với các phân tử hiện diện trong dung dịch. Tập hợp các

nhóm loại này (trạng thái bất hoạt của thụ thể insulin) gây trở ngại sự liên kết với cơ chất

(protein và ATP). Ngược lại, những sự biến đổi cấu hình khác (thụ thể insulin RTK hoạt hóa) sẽ

làm cho việc nối kết với cơ chất và quá trình phosphoryl hóa dễ dàng hơn.

Hình 6.18: Protein kinase trong điều hòa thông qua tương tác vùng N. Trong rất nhiều protein

kinase, quá trình điều hòa hoạt động của protein kinase xảy ra ở một vùng nối kết xoắn C với

vùng điều hòa như GRK2 và họ Scr, …

Chất ức chế RTK (Receptor Tyrosine Kinase)

RTK là thành phần giới hạn của con đường tín hiệu, nó điều khiển sự tăng trưởng và phát triển

của tế bào. Khi có bất kì sự kích thích nào bất thường vào RTK do đột biến hay do sự quá biểu

hiện (overexpression) thì điều đó chứng tỏ có ung thư. Do vậy, sự ức chế có lựa chọn RTKs là

một điều cần thiết.

Mặc dù có rất nhiều tác nhân tham gia vào quá trị ức chế RTKs đã được khám phá, tuy nhiên cho

đến nay cơ chế ức chế vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Có 2 nghiên cứu đã báo cáo xác định

được cấu trúc lập thể của chất ức chế RTK trong phức hợp với Tyrosine kinase domain của thụ

thể FGF 1 - một nhóm của chất ức chế RTKs có nền tảng là nhân oxindole (indolinones). Tác

chất của nhóm này ngăn chặn khả năng liên kết với gốc PO43-

của thụ thể FGF 1 (FGFR1) và có

tính đặc hiệu cao đối với nhiều nhóm RTKs khác nhau. Cấu trúc của phức hợp này cho thấy rằng

đầu oxindole chiếm giữ vị trí bám của ATP, và đầu còn lại bám vào vị trí bản lề của RTKs. Sự

ức chế của thụ thể FGF 1 sẽ càng đặc hiệu hơn nếu có sự thay đổi cấu trúc lập thể trong nối kết

nucleotide (nucleotide-binding loop). Một nhóm ức chế RTKs khác liên quan đến sự tổng hợp

pyrio-2,3-D-pyrimidine, nhóm này ức chế chọn lọc hoạt động PTKs nhờ thụ thể FGF và VEGF.

Cấu trúc phức hợp protein kinase inhibitors và vùng gắn gốc PO43-

trong thụ thể FGF 1 cho thấy

khả năng nới rộng sự tương tác bề mặt với những nhóm giống pyrimidine và nhóm kị nước ATP-

binding của thụ thể FGF 1. Những tác nhân ức chế này rất hứa hẹn trong việc chữa bệnh ung thư

và các rối loạn tăng trưởng khác trong tương lai.

Hình 6.19: Structural details of part of the fibroblast-growth-factor signalling pathway.

a | The structural details for part of the fibroblast growth factor (FGF) pathway. b | The same pathway

shown schematically. In part a, the structures of three protein complexes are shown (FGF1–FGF-receptor-

1 (FGFR1) (blue–red), son-of-sevenless-1 (SOS1)–Ras (blue–red) and Ras–Raf1 (red–green)). The

structures that are involved in domain–peptide or phosphorylation interactions are coloured according to

the secondary structure of the domain ( -helices are in purple, -strands are in yellow, and turns are in

light blue), and the interacting peptides are coloured red or orange, or are shown schematically. Solid

black arrows denote activation events, whereas dashed arrows indicate an interaction between a domain

of one protein and a particular region of another (if known, the labels on these arrows indicate the

residues that the domain binds). The steps are as follows. Step 1, FGF1 binds FGFR1, which dimerizes

and autophosphorylates. Step 2, the SH2-domain-containing transforming protein-1 (SHC1)

phosphotyrosine-binding (PTB) domain binds phosphotyrosine (pTyr) on FGFR1, and FGFR1

phosphorylates SHC1. Step 3, the FGFR substrate-2 (FRS2) PTB domain binds pTyr on FGFR1 and

FGFR1 phosphorylates FRS2. Step 4, the SH2-domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP2) SH2

domain binds pTyr on FRS2. Step 5, the growth-factor-receptor-bound protein-2 (GRB2) Src-homology-2

(SH2) domain binds pTyr on SHP2 (SHP2 is possibly phosphorylated by FGFR1) and its C-terminal Src-

homology-3 (SH3) domain binds SHP2. Step 6, the GRB2 SH2 domain binds pTyr on SHC1. Step 7, the

C-terminal SH3 domain of GRB2 binds the SOS1 Pro-rich region (GRB2 can also bind to FRS2). Step 8,

the SOS1 globular domains bind and activate Ras. Step 9, Ras binds Raf1, which results in mitogen-

activated-protein-kinase recruitment.

Thụ thể insulin

Thụ thể insulin có ở nhiều tế bào khác nhau trong cơ thể, kể cả ở những tế bào insulin không có

khả năng làm tăng sự hấp thụ glucose.

Thụ thể insulin (KLPT 340 000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có bản chất glycoprotein. Mỗi

tiểu đơn vị được tạo ra từ một mARN và chúng gắn với nhau nhờ cầu nói disulfide. Gen mã hóa

thụ thể insulin gồm 22 exon và nằm trên NST số 19 ở người. Tiểu đơn vị nhỏ nối kết với insulin

nằm ở vùng ngoại bào, trong khi đó tiểu đơn vị đóng vai trò là cầu nối hướng vào trong bào

tương. Phần nội bào của tiểu đơn vị có hoạt tính tyrosine kinase.

Hình 6.20: Insulin, thụ thể IGF-I và IGF-II. Mỗi hormone nối kết với thụ thể tương ứng của

nó, tuy nhiên insulin cũng nối kết với thụ thể IGF-I, còn IGF-I và IGF-II nối kết với cả 3 loại thụ

thể. Lưu ý sự tương đồng về cấu trúc giữa thụ thể insulin và thụ thể IGF-I, và cũng nên nhớ rằng

có 15 trình tự lập lại ở phần ngoại bào của thụ thể IGF-II. ISF là dịch kẽ.(Theo Ganong’s review

of medical physiology 23rd, 2009)

Sự nối kết của insulin vào thụ thể làm phát sinh hoạt tính tyrosine kinase của tiểu đơn vị, tạo ra

sự phosphoryl hóa tự động của tiểu đơn vị trên những tyrosine còn sót lại. Sự phosphoryl hóa tự

động có vai trò rất quan trọng trong việc tăng cường các tác dụng của insulin, gây ra sự

phosphoryl hóa cho các protein nội bào và sự khử phosphoryl của các các chất khác (serine và

threonin còn sót lại). IRS-1 đóng vai trò trung gian trong đáp ứng tín hiệu và đồng thời cũng là

chất tác hiệu trong những hệ thống khác, do vậy nó có phần khác so với insulin. Ví dụ, chuột có

gen mã hóa thụ thể insulin bị bất hoạt, sẽ có những triệu chứng chậm phát triển rõ rệt tử cung, dị

dạng thần kinh trung ương và da, chết khi mới sinh do suy hô hấp. Ngược lại, khi IRS-1 bị bất

hoạt, chuột chỉ chậm phát triển tử cung nhẹ, sống và kháng insulin.

Hình 6.21: Minh họa cho hoạt động của Insulin receptor subtrate-1 (IRS-1)(Theo Ganong’s

review of medical physiology 23rd, 2009)

Protein điều hòa sự phát triển đồng hóa tác dụng của insulin thông qua phosphatidylinositol 3-

kinase (PI3K).Thực nghiệm cho thấy ở những loài không xương sống , con đường này bao gồm

sự phát triển của tế bào thần kinh và thần kinh thị giác.

Thụ thể insulin gần giống với thụ thể của IGF-I nhưng lại khác với thụ thể của IGF-II. Những

thụ thể khác của yếu tố sinh trưởng và những thụ thể của các gen gây ung thư đều là tyrosine

kinases. Mặc dù vậy, thành phần amino acid của các thụ thể này vẫn rất khác nhau.

Khi insulin bám vào thụ thể của nó, nó kết tập thành từng đám và được đưa vào tế bào bời những

thụ thể trung gian nhập bào. Cuối cùng, phức hợp thụ thể-insulin đi vào lysosomes, tại đây cái

thụ thể bị phá hủy hay được tái sử dụng. Chu kì bán hủy của thụ thể insulin khoảng 7 giờ.

Hình 6.22: Sự phosphoryl hóa PDK-1 và PDK-2 dẫn tới sự kích hoạt PKB/Akt. Khi PKB/Akt

được kích hoạt nó gây ra sự vận động của protein vận chuyển glucose từ máu vào mỡ và tế bào

cơ vân. Như vậy nhiều glucose được hấp thụ hơn dẫn đến hạ đường huyết.

Hình 6.23: Lộ trình tính hiệu của thụ thể insulin và chú giải

6.4 Nhóm thụ thể Hormone nội bào: (intracellular hormone receptors)

Hình 6.24: Ligand của thụ thể nhân và các thụ thể tương ứng

Cho đến nay, đã có 48 loại thụ thể nhân đã được xác định dựa vào phổ điều hòa chức năng của

chúng. Các quá trình điều hòa bao gồm sự tăng trưởng và phát triển của tế bào, quá trình viêm

và sự chuyển hóa. Những phân tử tín hiệu kị nước, tạo liên kết với các thụ thể nhân được chứng

minh là có khả năng khuếch tán qua màng tế bào, xuyên qua bào tương và đến nhân tương tác

với thụ thể (theo các cơ chế khác nhau) để sinh ra các đáp ứng sinh học.

Một số nhóm ligand sinh học tan hoàn toàn trong lipid do vậy có khả năng đi xuyên qua màng tế

bào và tương tác với nhóm thụ thể nội bào. Các ligand này có thể có bản chất là steroids

(corticosteroids, mineralocorticoids, sex steroids, vitamin D), hormone tuyến giáp... Việc ligand

nối kết với thụ thể tương ứng sẽ kích thích các quá trình phiên mã và dịch mã, hay chính xác hơn

là thúc đẩy quá trình điều hòa các đoạn gene đích nhằm tạo ra các đáp ứng sinh học. Ngày nay,

nhiều đoạn DNA đích có vai trò là “yếu tố đáp ứng” (response elements) đã được xác định.

Những thụ thể kích hoạt gene (gene-active receptors) này thuộc về một họ protein có nguồn gốc

từ những phần tử báo trước chung (common precursor). Bằng kĩ thuật phân giải DNA, người ta

đã tìm được bản chất cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của những thụ thể này. Hình dưới đây

mô tả cơ chế hoạt động của glucocorticoid, giải thích như sau: Khi không có hormone, thụ thể

gắn kết với hsp90 [một protein xuất hiện để ngăn chặn sự gấp nếp bình thường một số vùng cấu

trúc (structural domains) của thụ thể]. Khi gắn kết với hormone tương ứng sẽ dẫn đến hiện tượng

giải phóng hsp90, khiến vùng liên kết DNA và kích hoạt phiên mã của thụ thể gấp cuộn lại đúng

cấu trúc lập thể chức năng của nó, cuối cùng là kích thích sự phiên mã gene đích.

Hình 6.25: Mô tả sơ lược hoạt động của thụ thể nhân

Cơ chế hoạt động điều hòa sự biểu hiện gene của các hormone nhóm này dẫn đến hai hệ quả

quan trọng sau:

1. Các hormone chỉ tác động sau quá trình biệt hóa kéo dài từ 30 phút đến hàng giờ,

đây là khoảng thời gian cần có để tổng hợp nên các protein mới. Điều này có

nghĩa là những hormone kích hoạt gene (gene-active hormone) không có cơ hội

sửa đổi (alter) vùng có bệnh lý trong vài phút. Ví dụ, glucocorticoids không thể

làm giảm nhẹ biểu hiện của hen phế quản cấp tính.

2. Tác động của các yếu tố này có thể kéo dài hàng giờ hay thậm chí nhiều ngày sau

khi nồng độ agonist (phân tử nối kết vào thụ thể, gây ra các đáp ứng kích thích

sau đó trong tế bào) giảm xuống bằng 0. Tính chất này có liên quan đến chu kì

hoạt động của phần lớp protein và enzymes, bởi vì chúng có thể duy trì hoạt tính

trong tế bào nhiều giờ và nhiều ngày kể từ khi chúng được tổng hợp. Do vậy,

những tác động có lợi hay gây hại (beneficial or toxic effects) của hormone kích

hoạt gene (gene-active hormone) thường xuyên chỉ giảm từ từ kể từ khi ngưng

đưa vào cơ thể.

Đại cƣơng về vị trí và cách nối kết ligand của thụ thể nhân

Ở phần này ta sẽ đề cập đến 2 vấn đề cơ bản của thụ thể đó là “vị trí” và “cơ chế tiếp cận ligand”.

Phần dimer hóa của thụ thể nhân và vai trò điều hòa dịch mã của nó sẽ không được trình bày vì

nó đi sâu vào cơ chế phân tử của nội tiết học, cần một thời lượng lớn để biểu đạt các nội dung do

vậy vượt quá giới hạn của đề tài.

Vị trí thụ thể nhân

Hình 6.26: Vùng cấu trúc của thụ thể nhân (Theo Goodman & Gilman’s Manual of

Pharmacology and Therapeutics)

Thụ thể nhân được tổng hợp tại ribosoms, ngoài nhân giống như các protein khác trong tế bào.

Việc đưa ngược lại thụ thể nhân vào nhân đòi hỏi một loại tín hiệu được gọi là nuclear

localization signal (NLS), nằm ở rìa vùng C và D (xem hình). Nhờ loạt tín hiệu này, phần lớn các

thụ thể nhân đều có mặt trong nhân dù có hay không có ligand hiện diện. Một ngoại lệ đáng quan

tâm đó là trường hợp của thụ thể glucocorticoid (GR), khi không có ligand nó sẽ bám vào phân

tử chaprone ở trong bào tương, bao gồm cả heat shock proteins (hsps). Khi hormone nối kết vào

thụ thể sẽ gây ra sự biến đổi cấu trúc dẫn đến phân ly phức hợp chaperone, hoạt hóa quá trình

đưa GR đi vào nhân bởi cuclear localization signal.

Quá trình nối kết với ligand

Các thụ thể nhân có thể tạo liên kết ái lực cao với các ligand ưa lipid (lipophilic ligand). Vùng

trực tiếp thực hiện chức năng này đó là C-terminal ligand-binding domains (LBDs), domains D

và E trong hình trên. Vùng này cũng có một vài chức năng khác, như là dimer hóa thụ thể hay

điều hòa dịch mã).

Cấu trúc của LBD có sự tương đồng trong phần lớn các thụ thể. Tất cả đều có cấu trúc bậc 3

điển hình chung bao gồm 12 đoạn xoắn α. Ligand nối kết tại vòng xoắn 3 (H3), H4 và H5. Sự

thay đổi cấu trúc lập thể sau khi ligand bám vào chủ yếu là sự cuốn gọn của đầu tận C (H12), tạo

thành một cái mũ (cap) tại vùng gắn của ligand. Mặc dù cơ chế nối kết của ligand nhìn chung là

tương đồng ở mọi thụ thể, mỗi ligand và thụ thể đều có nét đặc thù riêng dựa vào cấu trúc phân

tử của mình. Hình sau đây sẽ mô tả cơ chế chung của quá trình nối kết ligand:

Hình 6.27: Mô tả sự tiếp nhận ligand của thụ thể

Quá trình nhận diện gene đích của thụ thể

Một yếu tố đặc biệt khác của thụ thể nhân là khả năng nhận diện và bám vào vùng gene cần điều

hòa, phụ thuộc tín hiệu của ligand tương ứng. Gene đích chứa một trình tự DNA đặc biệt được

gọi là yếu tố đáp ứng hormone (HREs). Vùng C là nơi nối kết trực tiếp vào HRE. Vùng này có từ

66-68 amino acids, bao gồm 2 tiểu đơn vị dưới gọi là ngón tay kẽm (zinc finger, đã được đề cập

ở phần tổng quan).

Modules dạng kẽm (zinc-ordered modules) bao gồm các amino acid cơ bản tiếp xúc với DNA tại

LBD, cấu trúc của vùng gắn DNA (DNA-binding domain) rất giống nhau ở các siêu họ thụ thể

nhân. Sự nối kết vào DNA đặc hiệu được điều hòa bởi phức hợp nhiều yếu tố (trình bày trong

bảng ở dưới). Tất cả các thụ thể của hormone steroid ngoại trừ thụ thể của estrogen đều nối kết

với chuỗi kép DNA tại trình tự AGAACA.

Hình 6.28: Cấu trúc cơ bản của vùng gắn DNA đặc hiệu. A. Thụ thể hormone steroid và

AGGACA. B. RXR-NR và AGGTCA.

Theo qui ước, trình tự chuỗi kép được miêu tả bằng chuỗi bổ sung theo chiều 5’-3’. Những thụ

thể nhân khác nhận diện trình tự AGGTCA. Yếu tố quyết định tính đặc hiệu này nằm ở nhóm

amino acid gọi là P-box của DBD. Mỗi trình tự 6 DNA này được gọi là Half-sites. Chỉ có 2 trình

tự khác nhau của những half-site này (phần được gạch dưới). Ở một vài thụ thể nhân, sự duỗi

đầu C (C-terminal extension) của DBD góp phần tăng tính đặc hiệu của các half-sites mở rộng,

tăng tính đặc hiệu với trình tự DNA 5’ với hexomer (xem lại sơ đồ vùng cấu trúc của thụ thể

nhân bên trên). Một tính chất khác đặc hiệu cho gene đích đó là mật độ phân bố và độ rộng của

các half-site (spacing và orientation), phần lớn được gắn bởi thụ thể (dimers).