Seminar Moderne Anwendung der magnetischen Resonanz Vortrag von Jana Koch

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Gliederung

Einleitung

Theorie M2-Protein

Protonentransfer

Diskussion

Ergebnisse

Zusammenfassung

Quellen

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Einleitung

Aufklärung der Struktur und der funktionellen Dynamik vom pH-sensitiven und protonenselektiven His-37 im M2-Protein gebunden an eine Cholesterin enthaltene Virushülle mit Festkörper NMR

Dient zum besseren Verständnis des Protonen-Leitungs-Mechanismus

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Einleitung

Im hohen pH-Bereich verhindern die vier Histidine aus der Kantenvorderseite der π-gestapelten Struktur, eine hydrogengebundene Wasserkette zum führenden Proton

Im niedrigen pH-Bereich

bildet das Imidazol eine ausführliche

Hydrogenbindung zum Wasser

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Theorie M2-Protein

M2-Protein ist ein Membranprotein in einer Virushülle

Zählt zum Influenzavirus A

M2-Protein ermöglicht den Zufluss von Protonen in das Virusinnere

M2-Protein ist eines der drei integralen Membranproteine der Influenzavirus-Virion

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Theorie M2-Protein

Lysosom niedriger pH-Wert

Anbinden einer Fusionssequenz

Verschmelzung von Virushülle und Membran

Anschließend wird das Virusinnere mit RNA-haltigen Viruskapsiden in das Zytosol freigegeben

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Theorie M2-Protein

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Protonentransfer

Im synthetischen Material ist das Proton durch Hydrogenbindung an Wasser gebunden

Bindung an titrierbare Heterozyklen

Zum Vergleich: Wasser und titrierbare Protein-Seitenketten werden im biologischen Leitungsmechanismus genutzt

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Protonentransfer

M2 Proton bildet einen tetrameren Protonenkanal

Durch Aktivierung bei pH 6 leitet der M2 Kanal 10 bis 10.000 Protonen pro Sekunde

pH-sensitiver und protonenselektiver Rückstand ist dem His-37 zuzuordnen

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Diskussion

15N chemische Verschiebung von His-37 in DMPC/DMPG zeigt, dass sich vier His-Doppelschichten bei pKs von 8.2, 8.2, 6.3 und < 5 bilden

Die dritte Protonierung ist verantwortlich für die Kanalaktivierung und den Protonentransfer

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Diskussion

Zwei Modelle der Protonenleitung

Verschluss-Modell

Pendel-Modell

Forschungsgruppe beschäftigt sich vorrangig mit dem pH von 8.5 für den geschlossenen Kanal und 4.5 für den leitenden Kanal

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Diskussion

15N und 13C chemische Verschiebung von His ist empfindlich gegenüber dem Protonierungszustand und der tautomeren Struktur vom Imidazol

Deprotonierung erhöht 15N chemische Verschiebung von 80 ppm und die chemische Verschiebung von Cγ/Cδ im His-37

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Diskussion

2D 13C-13C und 15N-13C Korrelationsspektren

His-markiert das M2TM

Ausschließlich Signale neutraler Imidazole bei pH 8.5

Nε2-protonierte τ-Tautomer und Nδ1-protonierte π-Tautomer existieren bei einem Verhältnis von 3:1

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Diskussion

Die Peaks Cδ2(τ)-Cγ(π) und Cδ2(τ)-Cδ2(π) zeigen, dass beide Tautomere sich in jedem Kanal befinden

Stabilisierung des protonierten Nδ1(π) erfolgt durch Wasserstoffanbindung

Bei pH 4.5 Nδ1 und Nε2 haben Protonen chemische Verschiebung von 170-180 ppm, unprotoniertes Signal beträgt chemische Verschiebung bei 250 ppm

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Diskussion

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Diskussion

Spiralförmige Helix

des His-37

Entfernung von Cα-Nδ1 schränkt χ2-Verdrehungswinkel ein

Entfernung Cδ2-Nα wirkt auf χ1- und χ2- Winkel

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Diskussion

Die Tetradimension hat die Möglichkeit Metallionen zu koordinieren

Inhibieren von Cu2+ im M2-Protein

Das kleinere π-Tautomer kann die vierfache Symmetrie durch das Übernehmen der ττ oder der τ0 Konfiguration des Rotamers annehmen

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Ergebnisse

Seitenkette des His-37 bei hohen pH-Werten unbeweglich

Bei niedrigen pH-Werten sollte die Seitenkette dynamisch bleiben

Virenmembran immobilisiert das Protein-Rückgrat (Nα-H und Cα-Hα) und isoliert das Potential der Seitenkettenbewegung

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Ergebnisse

Bei pH 8.5 wurde Cγ-Nδ1 der starren Grenze von Cε1-Nδ1 Kopplungen (1.15 kHz und 1.39 Å) zugeordnet und eine starre Grenze der Cδ2-Hδ2 Kopplung (23.9 kHz und 1.08 Å) erhalten

Die bekannte 180° Ringflip-Bewegung wird ausgeschlossen, weil sie wenig Wirkung auf die Cδ2-Hδ2 Kopplung (SCδ2-Hδ2 = 0.94) hat

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Ergebnisse

Anstieg der Protonenkonzentration in der Virus-Membran, können Ringflips vorkommen

Bewegung des Ringflips schneller als 104 s, um die Cδ2-Hδ2 Kopplung im Durchschnitt zu erhalten

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Ergebnisse

Vorgeschlagen wird Protonenleitungsmechanismus, in dem Imidazol durch Deprotonierung des Cε1-Hε1 eingesetzt wird

Dadurch werden die dauernden Ringflips gewährleistet

Dies erleichtert die Protonenübertragung auf die C-Endwassermoleküle des Imidazols

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Ergebnisse

Daten zeigen, dass die höchste Energiebarriere dieses Prozesses, das Imidazol in Bewegung bringt

Dies erleichtert die Protonenleitfähgkeit des temperaturabhängigen M2-Proteins

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Zusammenfassung

dynamisches Protonenübertragungs-Modell ist mit der beobachteten Isotop-Wirkung des schweren Wasserstoff im Einklang

H-gebundene Mischketten mit verschiedenen Elementen erkennbar

Die Daten weisen stark darauf hin, dass das His-37 an der Protonenleitung durch das M2-Protein aktiv beteiligt wird

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Zusammenfassung

Experimente stellen die Fähigkeit von Festkörper-NMR unter Beweis, um die funktionell wichtige Membran der Protein-Dynamik und der Chemie aufzuklären

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Quellen

F. Hu, W. Luo, M. Hong, Science, 2010, 330, 505-508

Supporting Information, Science, 2010, 330

D. Schrama et. al, Nat. Rev. Drug Discov. , 2006, 5, 147-159

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