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Spektroskopische Untersuchung des H-Clusters von

photosynthetischen [FeFe]-Hydrogenasen am Beispiel von

HydA1 aus Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Institut für Biochemie der Pflanzen

Abteilung Photobiotechnologie

vorgelegt von

Christina Kamp

aus

Viersen

Bochum

Oktober 2008

Spectroscopic characterization of the H-Cluster of the

photosynthetic [FeFe]-Hydrogenase HydA1 of

Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Bioscience

Ruhr-University Bochum

Department of Biochemistry of Plants

submitted by

Christina Kamp

from

Viersen, Germany

Bochum

October 2008

Teile der Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Kamp, C., Silakov, A., Winkler, M., Reijerse, E., Lubitz, W. und Happe, T. (2008).

“Isolation and first EPR characterization of the [FeFe]-hydrogenases from green algae.”

Biochim Biophys Acta 1777: 410-416.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1

Summary 2

1. EINLEITUNG 3

1.1. Hydrogenasen als Schlüsselenzyme für die H2-Produktion 3

1.2. Die Struktur von [FeFe]-Hydrogenasen 4

1.3. [FeFe]-Hydrogenasen in Grünalgen 6

1.4. in vivo-Wasserstoffproduktion von Grünalgen 9

1.5. Zielsetzung 10

2. MATERIAL und METHODEN 12 2.1. Organismen 12

2.2. Proteine und Molekulargewichtsmarker 12

2.3. Chemikalien 12

2.4. Gase 13

2.5. Lösungen, Puffer und Medien 13

2.5.1. Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medium 13

2.5.2. TAP-S-Medium 14

2.5.3. Selbstentschwefelndes Medium 14

2.5.4. 57Fe-Medium 14

2.5.5. TAP-Platten 14

2.6. Sterilisation von Flüssigkeiten und Glasgeräten 15

2.7. Kultivierung der Algen 15

2.8. Bestimmung der Chlorophyllkonzentration 15

2.9. Induktion der Hydrogenaseexpression 16

2.9.1. Anaerobe Induktion 16

2.9.2. Schwefelmangel-Induktion 16

2.10. Arbeiten am Anaerobzelt 17

2.11. Isolierung von [FeFe]-Hydrogenasen 17

2.12. Konzentrierung von Proteinlösungen 19

2.13. Dialyse von Proteinlösungen 19

2.14. Gaschromatographische Bestimmung der in vitro-Hydrogenaseaktivität 19

2.15. Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 20

Inhaltsverzeichnis

2.16. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 20

2.17. Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen 21

2.18. Western Blot und Immunodetektion von Proteinen 21

2.19. Sequenzierung von Proteinen 22

2.20. Biochemische Charakterisierung von [FeFe]-Hydrogenasen 23

2.20.1. Bestimmung des Temperaturoptimums 23

2.20.2. Untersuchung der pH-Toleranz 24

2.20.3. Untersuchung der Salzabhängigkeit 24

2.20.4. Untersuchung der Sauerstoffsensitivität 25

2.20.5. Inhibierung von Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid 25

2.21. Biophysikalische Untersuchungen von [FeFe]-Hydrogenasen 26

2.21.1. EPR-Spektroskopie 26

2.21.2. FTIR-Spektroskopie 27

3. ERGEBNISSE 29 3.1. Etablierung eines neuen Reinigungsprotokolls für HydA1 aus C. reinhardtii 29

3.1.1. Induktion der Hydrogenase-Expression 29

3.1.1.1. Anaerobe Induktion 29

3.1.1.2. Schwefelmangel-Induktion 29

3.1.1.3. Optimierung der Schwefelmangel-Induktion 31

3.1.2. Reinigung von HydA1 aus C. reinhardtii 32

3.1.3. Nutzung des entwickelten Reinigungsprotokolls für die Isolierung weiterer

[FeFe]-Hydrogenasen aus C. moewusii und C. submarinum 34

3.1.4. Massenspektrometrische Sequenzanalyse zur Identifizierung der isolierten

HydA-Proteine 36

3.2. Biochemische Charakterisierung der isolierten Hydrogenasen 37

3.2.1. Bestimmung des Temperaturoptimums 37

3.2.2. Vergleichende Analyse zur pH-Toleranz der HydA-Proteine 37

3.2.3. Einfluss der Ionenstärke auf die Enzymaktivität 39

3.2.4. Untersuchung der Sauerstoffsensitivität 39

3.2.5. Inhibierung der Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid 40

3.3. Spektroskopische Untersuchung des H-Clusters 43

3.3.1. EPR-Spektroskopie 43

3.3.1.1. Vergleichende Untersuchung der HydA-Proteine 43

3.3.1.2. Der Hox-Zustand von HydA1 aus C. reinhardtii 45

Inhaltsverzeichnis

3.3.1.3. ENDOR- und HYSCORE-Analyse des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus

C. reinhardtii 46

3.3.2. FTIR-Spektroskopie 51

3.3.2.1. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei

kryogenen Temperaturen 51

3.3.2.2. Isotopenmarkierung der CO-Liganden des H-Clusters mit 13C 52

3.3.2.3. Untersuchung der reduzierten Zustände des H-Clusters 56

3.3.2.4. Spektroelektrochemie an HydA1 aus C. reinhardtii 59

4. DISKUSSION 63 4.1. Expression und Reinigung der [FeFe]-Hydrogenasen aus C. reinhardtii,

C. moewusii und C. submarinum 63

4.1.1. Verbesserte Expression der HydA-Proteine unter Schwefelmangel 63

4.1.2. Das neue Reinigungssystem für HydA1 64

4.2. Die hohe Toleranz der HydA-Proteine gegenüber biochemischen Einflüssen 64

4.3. Untersuchung der O2-und CO-Sensitivität: Die hohe O2-Toleranz von HydA

aus C. submarinum 65

4.4. Die Struktur des H-Clusters von Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen 66

4.4.1. Der Hox-CO-Zustand 67

4.4.2. Die Photodissoziation von Hox-CO und der Zwischenzustand LI2 71

4.4.3. Der Hox-Zustand 71

4.4.4. Die reduzierten Zustände: Hred1 und Hred2 72

4.4.5. Der katalytische Mechanismus im H-Cluster 73

5. LITERATUR 75

Abbildungsverzeichnis 83

Tabellenverzeichnis 85

Erklärung 86

Danksagung 87

Lebenslauf 88

Zusammenfassung 1

Zusammenfassung Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen sind monomere, kernkodierte Enzyme, die im Chloroplasten

lokalisiert und über ihren natürlichen Elektronendonor Ferredoxin mit der photosynthetischen

Elektronentransportkette verbunden sind. Sie katalysieren die Umsetzung von Protonen und

Elektronen zu molekularem H2 und werden nur unter Anaerobiose exprimiert. Im Gegensatz zu

bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen bestehen sie nur aus dem katalytisch aktiven Zentrum und

besitzen keine zusätzlichen [FeS]-Cluster. Das macht sie für strukturelle Untersuchungen und

mögliche biotechnologische Anwendungen besonders interessant.

Ziel dieser Arbeit war die Reinigung und strukturelle Charakterisierung der [FeFe]-Hydrogenase

HydA1 aus C. reinhardtii. Dazu sollte zunächst ein neues Expressions- und Reinigungssystem

für HydA1 etabliert und anschließend eine erste strukturelle Untersuchung des katalytisch

aktiven Zentrums mittels EPR- und FTIR-Spektroskopie durchgeführt werden.

Durch die Entwicklung eines neuen Expressions- und Reinigungssystems konnte die

Proteinausbeute von HydA1 im Vergleich zu früheren Arbeiten um das 40-fache gesteigert und

durchschnittlich 500 µg HydA1 mit einer spezifischen Aktivität von 741 µmol H2 min-1 mg-1

isoliert werden. Zusätzlich war es erstmals möglich, auch die Hydrogenasen HydA1 aus

C. moewusii mit einer spezifischen Aktivität von 1598 µmol H2 min-1 mg-1 Protein, doppelt so

hoch wie die von HydA1 aus C. reinhardtii, und HydA aus C. submarium in vergleichbarer

Menge zu isolieren. Eine Untersuchung der Proteine in Bezug auf ihre biochemischen

Eigenschaften ergab, dass HydA aus C. submarinum nicht nur eine höhere Toleranz gegenüber

pH-Wert und hoher Ionenstärke aufweist, sondern auch erheblich sauerstofftoleranter ist als die

Hydrogenasen aus C. reinhardtii und C. moewusii. Durch die erstmals möglichen

spektroskopischen Untersuchungen des H-Clusters von HydA1 konnte gezeigt werden, dass das

H-Cluster von Grünalgen-Hydrogenasen ähnlich aufgebaut ist wie das von bakteriellen [FeFe]-

Hydrogenasen. Unterschiede in den detektierten g-Werten und Wellenzahlen, sowie eine

unterschiedliche Reaktion auf Oxidationsmittel und Licht machen allerdings deutlich, dass die

elektronische Struktur und die Symmetrie der Liganden unterschiedlich ist. Während der Hox-

und Hox-CO-Zustand große Ähnlichkeit mit CpI und DdH in dieser Form aufweist, zeigt der

Zwischenzustand LI2 ebenso wie ein zusätzlich detektierter Hred-Zustand eine andere Geometrie.

Dennoch lassen die Ergebnisse auf einen ähnlichen katalytischen Mechanismus für beide

Enzymgruppen schließen.

Summary 2

Summary

Green algal [FeFe]-hydrogenases are nuclear encoded, monomeric enzymes localized in the

chloroplast and linked to the photosynthetic electron transport chain with ferredoxin as their

natural electron donor. They catalyze the reduction of protons and electrons to molecular

hydrogen and are only expressed under anaerobic conditions. In contrast to bacterial

[FeFe]-hydrogenases they only contain the catalytic hydrogen-activating center and no accessory

[FeS]-clusters. Therefore green algal [FeFe]-hydrogenases are especially suited for structure

analyses or biotechnological applications.

In this work the [FeFe]-hydrogenase HydA1 from C. reinhardtii was purified and characterized

by analysing the structure of their catalytic center using EPR- and FTIR-spectroscopic methods.

Newly established and efficient induction and purification protocols yielded 500 µg HydA1 with

a specific activity of 741 µmol H2 min-1 mg-1 corresponding to a 40-fold increase in protein

compared to previous protocols. Similar amounts were also purified from two so far undescribed

hydrogenases, HydA1 from C. moewusii with a specific activity of 1598 µmol H2 min-1 mg-1,

which was surprisingly twofold higher compared to HydA1 from C. reinhardtii, and HydA from

the brakish water green alga C. submarinum.

Biochemical analyses of the isolated HydA proteins indicate that HydA from C. submarinum is

more tolerant to changes in pH or ionic strength as HydA1 from C. reinhardtii and HydA1 from

C. moewusii and surprisingly more stable in the presence of oxygen.

Initial examinations of the active site of HydA1 show that the structure of the H-cluster from

green algal type [FeFe]-hydrogenases seems to be similar to the active sites of bacterial

[FeFe]-hydrogenases. However, differences in the detected g-values, wavenumbers and the

response of the enzyme to the treatment with oxidants and light show that the electronic structure

and the symmetry of the ligands is different. While the Hox and the Hox-CO state is similar to

DdH and CpI, the light-induced intermediate state LI2 and a second detected reduced state, Hred1,

is different. However, the catalytic mechanism seems to be similar in both species.

1. Einleitung 3

1. Einleitung

Molekularer Wasserstoff gilt wegen seines hohen Energiegehalts und seiner umweltfreundlichen

Verbrennung zu Wasser als potentieller Energieträger der Zukunft. Die biologische

Wasserstoffproduktion durch Grünalgen und die genaue Untersuchung der Struktur und

Funktionsweise der in diesen Organismen für die Wasserstoffproduktion zuständigen Enzyme,

der sogenannten Hydrogenasen, ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger

biologisch-basierter Wasserstofftechnologien, da gerade Grünalgen-Hydrogenasen aufgrund

ihres einfachen Aufbaus und ihrer hohen katalytischen Aktivität besonders gut für

biotechnologische Anwendungen geeignet sind (Melis und Happe 2001, Happe et al. 2002).

1.1. Hydrogenasen als Schlüsselenzyme für die H2-Produktion

Hydrogenasen wurden bisher in zahlreichen, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen

Organismen gefunden. Ihre Funktion ist die Katalyse der reversiblen Redoxreaktion

2 H+ + 2 e- ↔ H2. Dabei können einerseits Protonen und Elektronen beispielsweise zur ATP-

Gewinnung freigesetzt werden, andererseits werden durch die Umsetzung zu molekularem H2

überschüssige Elektronen und Protonen in der Zelle abgebaut. Im lebenden Organismus läuft die

Reaktion meist nur in eine Richtung ab. Je nach ihrer Funktion in der Zelle, H2-Aufnahme oder

H2-Abgabe, können Hydrogenasen im Periplasma oder im Cytoplasma, in gelöster Form oder

membrangebunden vorkommen (Frey 2002, Vignais und Billoud 2007).

Die prinzipielle Einteilung der Hydrogenasen erfolgt aufgrund ihres Metallatoms im aktiven

Zentrum. [NiFe]-Hydrogenasen sind heterodimere Enzyme mit einem dinuklearen [NiFe]-

Cluster innerhalb des aktiven, H2-bindenden Zentrums und hauptsächlich in Prokaryoten zu

finden (Lubitz et al. 2007). Die zweite Gruppe beinhaltet die sogenannten [FeFe]-Hydrogenasen,

welche ein [4Fe-4S]-Cluster verbunden mit einem [2Fe]-Subcluster, das sogenannte H-Cluster

(hydrogen-activating cluster), als aktives Zentrum besitzen. [FeFe]-Hydrogenasen kommen auch

in Eukaryoten und einigen strikt anaeroben Protozoen vor (Adams 1990, Vignais und Colbeau

2004, Ghirardi et al. 2007). Auch Grünalgen-Hydrogenasen gehören zu dieser Klasse. Im

Gegensatz zu [NiFe]-Hydrogenasen sind [FeFe]-Hydrogenasen eher in die H2-Produktion als in

die H2-Oxidation involviert und daher von zentraler Bedeutung für mögliche biotechnologische

Anwendungen. Sie sind im allgemeinen sauerstoffempfindlicher und lassen sich schneller durch

Kohlenmonoxid inhibieren als [NiFe]-Hydrogenasen (Adams 1990, Vignais und Billoud 2007),

1. Einleitung 4

weisen dagegen aber eine etwa hundertfach höhere katalytische Aktivität auf (Happe und

Kaminski 2002). Kürzlich wurde eine dritte Gruppe entdeckt, welche die sogenannten

[Fe]-Hydrogenasen oder [FeS]-Cluster-freien Hydrogenasen umfasst und bisher nur in

methanogenen Archae gefunden wurden (Korbas et al. 2006, Shima et al. 2008). Prominenter

Vertreter dieser Gruppe ist die Hmd (H2-forming methylentetrahydromethanopterin

dehydrogenase), die eine Fe(CO)2-Gruppe verbunden mit einem organischen Cofaktor enthält.

1.2. Die Struktur von [FeFe]-Hydrogenasen

Im Gegensatz zu den [NiFe]-Hydrogenasen ist die Funktionsweise von [FeFe]-Hydrogenasen

bisher weniger gut verstanden. Bislang konnten die Röntgenkristallstrukturen von zwei

bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen aufgelöst werden, CpI aus Clostridium pasteurianum und

DdH aus Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 7757) (Abb.1.1.).

Die periplasmatische, heterodimere [FeFe]-Hydrogenase DdH aus D. desulfuricans hat ein

Molekulargewicht von insgesamt 53 kDa und besteht aus dem aktiven Zentrum (H-Cluster) und

zwei weiteren klassischen [4Fe-4S]-Clustern, den sogenannten Ferredoxin-ähnlichen Clustern

oder F-Clustern. Die physiologische Rolle von DdH ist die Oxidation von H2 (Nicolet et al. 1999

und 2000). Die cytoplasmatische, monomere [FeFe]-Hydrogenase CpI aus C. pasteurianum hat

ein Molekulargewicht von 61 kDa und besitzt neben dem H-Cluster vier weitere F-Cluster, zwei

klassische [4Fe-4S]-Cluster nahe am aktiven Zentrum, ein [4Fe-4S]-Cluster mit einem

Histidinliganden und ein [2Fe-2S]-Cluster (Peters et al. 1998). Sie ist ein H2-produzierendes

Enzym.

Spektroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass das katalytische Zentrum beider

Hydrogenasen ähnlich aufgebaut ist (Abb.1.2.). Es besteht aus einem [4Fe-4S]-Cluster, welches

über das Schwefelatom eines Cysteinrestes mit einem [2Fe]-Subcluster verbunden ist. Die

beiden Fe-Atome des [2Fe]-Subclusters sind jeweils mit einem CO- und einem CN-Liganden

assoziiert und im oxidierten Zustand durch einen CO-Brückenliganden verbunden. In der

reduzierten Form ist dieser CO-Ligand terminal an das Fe(2)-Atom gebunden. Das Fe(2)-Atom

besitzt eine freie Koordinationsstelle, die als putative Bindestelle für H2 und Kohlenmonoxid gilt.

Weiterhin sind die beiden Fe-Atome durch einen bisher unbekannten Liganden, vermutlich

Dithiomethylamin, verbunden (Pierik et al. 1998, Peters et al. 1998, Nicolet et al. 1999, Frey

2002, Lubitz et al. 2007).

1. Einleitung 5

Die F-Cluster dienen als Transport-Relais für die bei der Reaktion benötigten Elektronen.

Zusätzlich besitzen beide Enzyme einen Kanal aus hydrophoben Aminosäureresten, der von der

Proteinoberfläche ins aktive Zentrum zum Fe(2)-Atom führt und über den vermutlich

Wasserstoff aufgenommen oder abgegeben wird. Zusätzlich werden Reste im Inneren und an der

Oberfläche des Proteins diskutiert, wie beispielsweise ein Lysinrest nahe am Fe(2)-Atom, die in

den Protonentransfer involviert sind (Peters 1999, Nicolet et al. 2000, Cohen et al. 2005).

H-Cluster

F-Cluster

DdH

Abb. 1.1. Strukturmodell der [FeFe]-Hy

und CpI aus Clostridium pasteu

Die Röntgenkristallstruktur von DdH zeigt

einer kleinen Untereinheit von 11 kDa (

vorhanden. CpI ist ein Monomer von 61

beinhaltet, ist in blau dargestellt, die Dom

dritte Domäne, die ein einzelnes [4Fe-4S

Domäne, die das [2Fe-2S]-Cluster beinhal

CpI

drogenasen DdH aus Desulfovibrio desulfuricans (Nicolet et al. 1998)

rianum (Peters et al. 1998)

ein Dimer, bestehend aus einer großen Untereinheit von 42 kDa (rot) und

türkis). Neben dem H-Cluster sind noch zwei weitere [4Fe-4S]-Cluster

kDa, bestehend aus vier Domänen. Die Domäne, die das aktive Zentrum

äne mit den zwei klassischen [4Fe-4S]-Clustern ist grün eingefärbt. Eine

]-Cluster mit einem Histidinliganden enthält, ist türkis und die vierte

tet, ist violett gekennzeichnet.

1. Einleitung 6

Abb. 1.2. Aufbau des H-Clusters von [FeFe]-Hydrogenasen

Das H-Cluster besteht aus einem [4Fe-4S]-Cluster, das über das S-Atom eines Cysteinrestes mit einem

[2Fe]-Subcluster, koordiniert durch CO- und CN-Liganden, verbunden ist. Im oxidierten Zustand Hox sind die

Fe-Atome Fe(1) und Fe(2) durch eine CO-Brücke verbunden, im reduzierten Zustand Hred bindet der

CO-Brückenligand terminal an das Fe(2)-Atom. Das Fe(2)-Atom besitzt eine freie Koordinationsstelle, an der

vermutlich H2 freigesetzt oder oxidiert wird und das Enzym reversibel durch Kohlenmonoxid inhibiert werden kann.

1.3. [FeFe]-Hydrogenasen in Grünalgen

Grünalgen-Hydrogenasen katalysieren die Umsetzung von Protonen und Elektronen zu

molekularem Wasserstoff und sind mit einem Molekulargewicht von durchschnittlich 48 kDa die

bislang kleinsten entdeckten [FeFe]-Hydrogenasen. Im Gegensatz zu den unter 1.2.

beschriebenen bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen bestehen sie nur aus dem katalytisch aktiven

Zentrum und besitzen keine weiteren [FeS]-Cluster (Florin et al. 2001, Winkler et al. 2002 und

2004, Happe und Kaminski 2002, Forestier et al. 2003). Dies macht sie für strukturelle und

funktionelle Untersuchungen besonders interessant. Sie sind monomere, kernkodierte Enzyme,

die im Chloroplasten lokalisiert und über ihren natürlichen Elektronendonor Ferredoxin (PetF),

ebenfalls ein [FeS]-Protein, mit der photosynthetischen Elektronentransportkette verbunden sind

(Happe et al. 1994, Florin et al. 2001, Happe und Kaminski 2002). Im Gegensatz zu den schon

beschriebenen Hydrogenasen DdH und CpI ist über die Struktur von Grünalgen-Hydrogenasen

noch relativ wenig bekannt. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen verschiedener [FeFe]-

Hydrogenasen zeigt allerdings, dass alle Sequenzmotive, die für das H-Cluster charakteristisch

sind, auch in Grünalgen-Hydrogenasen zu finden sind (Abb.1.3.).

Alle bisher beschriebenen [FeFe]-Hydrogenase-Gene kodieren für Proteine mit einem mehr oder

weniger flexiblen N-Terminus (F-Domäne) und einem homologen, katalytisch relevanten

C-Terminus (H-Domäne). Neben den vier hoch konservierten Cysteinresten, die das [4Fe-4S]-

Cluster koordinieren und es mit dem [2Fe]-Subcluster verbinden, wurden außerdem Reste

1. Einleitung 7

identifiziert, die an der Strukturbildung des H-Clusters beteiligt und in den katalytischen

Protonentransfer involviert sind, sowie die hydrophobe Tasche bilden, in der das katalytische

Zentrum eingebettet ist (Nicolet et al. 2000).

Die Gene von Grünalgen-Hydrogenasen besitzen Exons und Introns sowie Transitpeptid-

Sequenzen unterschiedlicher Länge am N-Terminus, die notwendig sind, um das translatierte

Protein von den Ribosomen zum Chloroplasten zu transportieren (Florin et al. 2001, Forestier

et al. 2003). Ein weiterer Unterschied zu bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen sind zwei

spezifische Peptidinsertionen am N- und C-Terminus, deren Funktion noch unbekannt ist.

Möglicherweise spielen diese zusätzlichen Strukturschleifen eine Rolle bei der

Signaltransduktion oder der Interaktion mit Ferredoxin (Melis und Happe 2001, Ghirardi et al.

2007).

Da die [FeFe]-Hydrogenasen aus Grünalgen keine zusätzlichen F-Cluster besitzen, über die der

Elektronentransport zum aktiven Zentrum stattfinden kann, wird vermutet, dass eine direkte

Wechselwirkung zwischen Ferredoxin und dem H-Cluster stattfindet. Strukturmodelle für die

[FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus Chlamydomonas reinhardtii zeigen, dass das Protein eine

negative Oberflächenladung mit einer positiv geladenen Bindenische aufweist (Abb.1.4.). An

dieser Stelle findet vermutlich über elektrostatische Wechselwirkungen die direkte Interaktion

von Ferredoxin mit dem H-Cluster statt (Winkler et al. 2002, Horner et al. 2002). Genaue

Aussagen über den Aufbau und die Funktionsweise von Grünalgen-Hydrogenasen können

allerdings nur durch weitere Untersuchungen erfolgen.

1. Einleitung 8

Abb.1.3. Sequenzalignment von bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen und Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen

Vergleichend zu DdH und CpI sind die Aminosäuresequenzen der hier untersuchten Hydrogenasen aus

Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas moewusii und Chlorococcum submarinum dargestellt. Blau:

homologe Bereiche, rot: Grünalgenspezifische homologe Bereiche, orange: konservierte Cysteinreste, die das

[4Fe-4S]-Cluster koordinieren, violett: Reste, die in den Protonentransfer involviert sind, türkis: Reste, die an der

Strukturbildung des aktiven Zentrums beteiligt sind. Das Sequenzalignment wurde mit dem Programm Jalview Java

alignment editor (Clamp et al. 2004) durchgeführt.

1. Einleitung 9

Abb. 1.4. Strukturmodell und Oberflächenladungsmodell der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus

Chlamydomonas reinhardtii

Die Modelle wurden mittels der Modellierungssoftware von Swiss Model (http://swissmodel.expasy.org) (Guex und

Peitsch 1997) unter Verwendung der von DdH und CpI bekannten Parameter erstellt. Die α-Helices sind rot, die

β-Faltblätter türkis dargestellt. Die negative Oberflächenladung von HydA1 ist rot, die positiv geladene Nische, in

der vermutlich das Ferredoxin bindet, ist blau eingefärbt.

1.4. in vivo-Wasserstoffproduktion von Grünalgen

Aufgrund ihrer hohen Sauerstoffsensibilität werden Hydrogenasen nur unter anaeroben

Bedingungen exprimiert (Forestier et al. 2003). Die Expression der Hydrogenase und die

Ausbildung des Wasserstoffmetabolismus als Anpassung an Anaerobiose ist für Grünalgen der

einzige Weg, genügend ATP zum Überleben unter diesen Stressbedingungen zu generieren

(Melis et al. 2000, Zhang et al. 2001, Melis und Happe 2001). Vor einigen Jahren wurde

entdeckt, dass die Grünalge C. reinhardtii auch unter Schwefelmangelbedingungen H2

produziert und die dabei gemessene in vitro-Aktivität der [FeFe]-Hydrogenase bedeutend höher

ist, als in einer artifiziell anaerobisierten Kultur (Melis et al. 2000, Zhang et al. 2002).

Eine Kultivierung der Algen in schwefelfreiem Medium führt bei Ausschluss von Sauerstoff und

normaler Belichtung zur Ausbildung eines mehrere Tage anhaltenden photofermentativen

Wasserstoffmetabolismus (Happe et al. 2002). Dabei kommt es neben der Expression der

Hydrogenase und Pyruvat-Format-Lyase als Schlüsselenzyme des Wasserstoffmetabolismus und

der Pyruvat-Gärung (Winkler et al. 2002, Hemschemeier und Happe 2004, Hemschemeier et al.

2008) unter anderem zur Bildung von Sulfat-Transportern mit hoher Sulfat-Affinität (Grossmann

2000), des Enzyms Arylsulfatase, welches Sulfat aus Sulfatestern freisetzen kann, und durch eine

Umverteilung des Schwefels zur Synthese von Zellwandproteinen mit weniger schwefelhaltigen

http://swissmodel.expasy.org/

1. Einleitung 10

Aminosäuren. Weiterhin ist eine Akkumulation von Stärke und die Einstellung des

Zellwachstums zu beobachten (Zhang et al. 2001). Da das Photosystem II abgebaut und die

Lichtenergie auf das Photosystem I konzentriert wird (State I- / State II-Transition), sinkt die

Photosyntheserate rapide. Die Respirationsrate bleibt dagegen konstant. Dadurch wird der in der

Kultur vorhandene Sauerstoff veratmet und es kommt zu anoxischen Bedingungen (Wykoff et al.

1998, Melis und Happe 2001). Durch die Umstellung des Stoffwechsels und die dadurch

verursachte Abwesenheit anderer Elektronensenken wie z. B. des Calvinzyklus entsteht ein

Überschuss an Reduktionsäquivalenten. Die Hydrogenase ist durch Ferredoxin mit der

photosynthetischen Elektronentransportkette verbunden (Florin et al. 2001, Happe und Kaminski

2002). Daher können Elektronen und Protonen aus der Wasserspaltung am Photosystem II über

den Plastochinon-Pool, den Cytochrom-b6 f-Komplex, Plastocyanin, das Photosystem I und

Ferredoxin auf die Hydrogenase übertragen und zu molekularem Wasserstoff umgesetzt werden.

Zusätzlich kann die Hydrogenase überschüssige Elektronen aus dem Abbau der akkumulierten

Stärke, dem Calvin-Zyklus und Fermentationsprodukten abbauen (Happe et al. 2002,

Hemschemeier und Happe 2004). Dies verdeutlicht nicht nur die entscheidende Rolle der

Hydrogenase als H2-produzierendes Enzym sondern auch als Stressprotein in vivo.

1.5. Zielsetzung

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Reinigung und strukturelle Charakterisierung der

[FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii. Das Enzym konnte bereits 1993 von Happe und

Naber isoliert werden, allerdings war die Proteinmenge zu gering, um die Struktur oder den

katalytischen Mechanismus des Enzyms zu untersuchen. Daher soll zum einen ein neues

Expressionssystem für HydA1, bei dem die Hydrogenase-Expression durch Schwefelmangel

induziert wird, und zum anderen ein neues, effektives Reinigungsprotokoll entwickelt werden,

um das Enzym in ausreichender Menge in nativer Form aus der Alge zu isolieren. Anschließend

sind eine biochemische Charakterisierung des Enzyms, sowie erste Strukturuntersuchungen des

aktiven Zentrums durch Elektronen-Paramagnetische-Resonanz-Spektroskopie (EPR) und

Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) vorgesehen. Zusätzlich sollen

hinsichtlich einer späteren biotechnologischen Anwendung zwei weitere, bisher unbeschriebene

Grünalgen-Hydrogenasen isoliert und vergleichend zu HydA1 aus C. reinhardtii untersucht

werden, HydA aus der Brackwasser-Alge Chlorococcum submarinum, die besonders für

biotechnologische Anwendungen interessant sein könnte, da sie in Medien mit hohen

1. Einleitung 11

Salzkonzentrationen kultiviert werden kann, was das Risiko von Kontaminationen vermindert

(Blackwell und Gilmour 1991) und HydA1 aus Chlamydomonas moewusii, die in früheren

Versuchen bei anaerober Adaptation eine im Vergleich zu C. reinhardtii drei mal höhere

in vitro-Hydrogenaseaktivität gezeigt hat (Winkler et al. 2004).

2. Material und Methoden 12

2. Material und Methoden

2.1. Organismen

Algenstamm SAG-Nr.

Chlamydomonas moewusii SAG 24.91

Chlamydomonas reinhardtii 137 SAG 11-32a

Chlorococcum submarinum SAG 2.96

Alle Stämme wurden aus der Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen (SAG)

bezogen.

2.2. Proteine und Molekulargewichtsmarker

Protein Firma/Herkunft

Goat-Anti-Rabbit HRP-Konjugat Pierce

polyklonales Rabbit-Anti-HydA1-Antiserum Happe et al. 1994

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich

Trypsin (Sequencing-Grade) Promega

#SMO441 Prestained Protein Molecular Weight Marker (19-119 kDa) Fermentas

2.3. Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien wurden mit dem höchstmöglichen Reinheitsgrad von den Firmen

Acros Organics, AppliChem, Biomol, Carl Roth, Chemgas, Fluka, J. T. Baker, Merck, Riedel-de

Haen, Serva Electrophoresis, Sigma-Aldrich und Thermo Fisher Scientific bezogen.


2.4. Gase

Gas Firma

Argon (Ar) 5.0 Air Liquide

Formiergas (90% N2, 10% H2) Air Liquide

Kohlenmonoxid (CO) 4.7 Air Liquide 13CO (99% Reinheit) Cambridge Isotope Laboratories

Stickstoff (N2) 5.0 Air Liquide

Wasserstoff (H2) 5.0 Air Liquide

2.5. Lösungen, Puffer und Medien

2.5.1. Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medium

20 mM Tris

1 ml Spurenelemente

1 ml Kaliumphosphat-Puffer pH 7,2

50 ml Beij´sche Salzlösung

ad 1 l H2O mit Essigsäure auf pH 7,2 einzustellen

Spurenelemente

50 g EDTA Na2-Salz

22 g ZnSO4 x 7 H2O (10,4 g ZnCl für TAP-S-Medium)

11,4 g H3BO3

5,1 g MnCl2 x 4 H2O

1,6 g CoCl2 x 6 H2O

1,6 g CuSO4 x 5 H2O (1,1 g CuCl2 x 6 H2O für TAP-S-Medium)

5 g FeSO4 x 7 H2O (3,6 g FeCl2 x 4 H2O für TAP-S-Medium)

1,1 g (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O

ad 1 l H2O Alle Komponenten mit Ausnahme des EDTA Na2-Salzes wurden in H2O gelöst und zusammen aufgekocht.

Nach Abkühlung der Lösung wurde das EDTA Na2-Salz zugegeben und der pH-Wert mit KOH (20% w/v) auf

pH 6,7 eingestellt. Anschließend wurde die Lösung auf 1 l aufgefüllt, autoklaviert und bei 4°C gelagert.


Kaliumphosphat-Puffer pH 7,2

283 mM KH2PO4

717 mM K2HPO4

Beij´sche Salzlösung

8,1 mM MgSO4 (MgCl2 x 6 H2O für TAP-S-Medium)

149,5 mM NH4Cl

6,8 mM CaCl2

2.5.2. TAP-S-Medium

TAP-Medium, in dem alle Sulfatsalze durch die entsprechenden Chloridsalze ersetzt wurden.

2.5.3. Selbstentschwefelndes Medium

TAP-S-Medium mit 75 µM MgSO4 pro l.

2.5.4. 57Fe-Medium

Selbstentschwefelndes Medium, in dem FeCl2 durch 57Fe ersetzt wurde. Bei der Herstellung des Selbstentschwefelden Mediums wurde eine Spurenelementlösung ohne FeCl2 x 4 H2O

verwendet. Nach dem Autoklavieren wurden 0,2 ml 57Fe-Lösung pro l Medium (0,5 µM) zugegeben und der

pH-Wert auf 7,2 eingestellt.

57Fe-Lösung

100 mg 57Fe (at 97% minimum, Chemgas)

25 ml Königswasser

50 ml H2O Das 57Fe wurde in 25 ml Königswasser gelöst und nach Verdünnung mit H2O in einem mit Butylgummi- und

Standard Seal 25-Stopfen (Grace) zukrimpbaren 100 ml Injektionsfläschchen (Thermo Fisher Scientific)

anaerob bei Raumtemperatur gelagert.

2.5.5. TAP-Platten

15 g Agar pro l TAP-Medium


2.6. Sterilisation von Flüssigkeiten und Glasgeräten

Alle temperaturstabilen Lösungen, Puffer, Medien und sonstige Materialien wurden vor

Gebrauch für 20 min bei 121°C und 1 bar autoklaviert (Varioklav® Dampfsterilisator, Thermo

Fisher Scientific). Temperaturinstabile Lösungen wurden mittels einer 0,2 µm Membran

(Filtropur S, Sarstedt) sterilfiltriert. Glasgeräte wurden bei Bedarf für 4 h bei 180°C

hitzesterilisiert (Brutschrank WTC, Binder).

2.7. Kultivierung der Algen

Die Haltung der verschiedenen Algenstämme erfolgte auf TAP-Platten (2.5.) bei einer

Temperatur von 20°C und einer Lichtintensität von 100 µmol Photonen m-2 s-1.

Für die Kultivierung der Algen in Flüssigmedium wurden 200 ml TAP-Medium (2.5.) mit dem

jeweiligen Algenstamm angeimpft und bei 20°C und einer Lichtintensität von 150 µmol

Photonen m-2 s-1 auf einem Schüttler (120 U min-1, Certomat® R, Braun) bis zu einem

Chlorophyllgehalt von 20 µg Chlorophyll ml-1 kultiviert (2.8.). Anschließend wurden 1-2 ml

Algenkultur in frisches TAP-Medium (200 ml oder größere Volumina) überführt und wiederum

bis zu einer Chlorophyllkonzentration von 20 µg Chlorophyll ml-1 inkubiert. Die Kultivierung

von C. moewusii erfolgte in Flaschen unter konstantem Rühren. Das Medium enthielt zusätzlich

10 mM Natriumhydrogencarbonat, welches nach dem Autoklavieren sterilfiltriert zugegeben

wurde (Filtropur S, 0,2 µm, Sarstedt).

2.8. Bestimmung der Chlorophyllkonzentration

Zur Bestimmung der Chlorophyllkonzentration einer Algenkultur wurde 1 ml Kultur pelletiert

(1 min, 13000 rpm, Mini Spin Zentrifuge, Eppendorf) und nach Zugabe von 1 ml Aceton durch

Inkubation für 3 min bei 80°C (Thermo Compact Heizblock, Eppendorf) aufgeschlossen. Nach

Abzentrifugieren der Zelltrümmer (1 min, 13000 rpm, Mini Spin Zentrifuge, Eppendorf) wurde

der Überstand bei 652 nm spektralphotometrisch untersucht (SmartSpec 3000

Spektralphotometer, Bio-Rad). Die Chlorophyllkonzentration wurde wie folgt berechnet:


E652 / ε652 * d = Chlorophyllkonzentration [mg ml-1]

E652: Extinktion bei 652 nm

ε652: Extinktionskoeffizient von Chlorophyll a / b bei 652 nm: 34,5 ml mg-1 cm-1

d: Schichtdicke der Küvette: 1 cm

2.9. Induktion der Hydrogenase-Expression

2.9.1. Anaerobe Induktion

Für die anaerobe Induktion wurden die Algen in TAP-Medium bis zu einer

Chlorophyllkonzentration von 20 µg Chlorophyll ml-1 kultiviert (2.7.), 10 min bei 2000 rpm

abzentrifugiert (Sorvall® RC-5B Refrigerated Superspeed Zentrifuge, DuPont Instruments) und

in 0,1 Volumen frischem TAP-Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen

abgedunkelt und mit Argon begast, bis das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität erreicht

war (2.14.).

2.9.2. Schwefelmangel-Induktion

Zur Induktion der Hydrogenase-Expression durch Schwefelmangel wurden die Algen in TAP-

Medium bis zu einem Chlorophyllgehalt von 20 µg Chlorophyll ml-1 angezogen (2.7.), 10 min

bei 2000 rpm abzentrifugiert (SorvallR RC-5B Refrigerated Superspeed Zentrifuge, DuPont

Instruments) und anschließend im selben Volumen TAP-S-Medium (2.5.) resuspendiert. Die

weitere Kultivierung erfolgte in Flaschen unter konstantem Rühren. Die Kulturen wurden durch

einen Deckel mit Gummidichtung, durch den mit einer Spritze Proben entnommen werden

konnten, luftdicht verschlossen und bei Raumtemperatur und einer Lichtintensität von < 50 µmol

Photonen m-2 s-1 für 24-48 h auf einem Magnetrührer inkubiert.

Für größere Volumina wurden alternativ 5-10 l selbstentschwefelndes Medium (2.5.) direkt mit

dem jeweiligen Algenstamm angeimpft (5 ml Algenkultur l-1), ebenfalls luftdicht verschlossen

und für ca. 7 Tage bei Raumtemperatur und einer Lichtintensität von < 50 µmol Photonen m-2 s-1

auf einem Magnetrührer kultiviert bis das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität erreicht

war (2.14.). Die Kultivierung der Algen in 57Fe-Medium (2.5.) erfolgte analog.


2.10. Arbeiten am Anaerobzelt

Arbeiten, die unter sauerstofffreien Bedingungen stattfinden sollten, wurden an einem

Anaerobzelt (Coy Laboratory Products) mit einer Atmosphäre von 99% N2 und 1% H2

durchgeführt. Restsauerstoff wurde über Palladium-Katalysatoren im Anaerobzelt mit H2 zu H2O

umgesetzt, welches durch Aluminium-Katalysatoren gebunden wurde. Die Regeneration der

Katalysatoren erfolgte nach Bedarf durch Inkubation für 6-12 h bei 125°C (Palladium) bzw.

220°C (Aluminium) (Brutschrank WTC, Binder). Gegenstände und Flüssigkeiten wurden über

eine Schleuse mit angeschlossener Vakuumpumpe (Öl-Drehschieber-Vakuumpumpe DVP Typ

LB25, Toepffer Lab Systems) ins Zelt gebracht. Flüssigkeiten wurden zur Entfernung von

Sauerstoff zunächst 30 min mit Argon begast und anschließend im Vakuum der Schleuse

entgast, bis keine Gasblasen mehr aufstiegen. Anschließend wurden sie ins Zelt geschleust und

vor Benutzung mindestens drei Tage aufbewahrt.

2.11. Isolierung von [FeFe]-Hydrogenasen

Alle Reinigungsschritte wurden unter anaeroben Bedingungen (2.10.) so weit möglich bei 4°C

durchgeführt. Alle Puffer wurden vor Gebrauch, soweit nicht anders angegeben, mit 10 mM

NaDT zum Schutz des Enzyms vor Restsauerstoff versetzt. Zur Zentrifugation größerer

Volumina außerhalb des Anaerobzeltes wurden luftdichte 500 ml Zentrifugenbecher der Firma

Nalgene® Labware verwendet.

Für die Isolierung der Hydrogenase wurden 8 l Schwefelmangelkultur (2.9.2.) mit 25 mM NaDT

(Endkonzentration) versetzt und außerhalb des Zeltes abzentrifugiert (10 min, 2000 rpm,

Sorvall® RC-5B Refrigerated Superspeed Zentrifuge, DuPont Instruments). Anschließend konnte

das Pellet in 30 ml 50 mM Tris-HCl pH 8, 10% Glycerin, 25 mM NaDT gelöst und anaerob bei

- 80°C gelagert werden.

Für den Zellaufschluss wurde das Pellet in 100 ml 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaDT, 2%

Triton X-100 (Endvolumen) aufgenommen und 25 min unter Rühren aufgeschlossen. Nach

Abzentrifugieren der Zelltrümmer (20 min, 6000 rpm, 4°C, Sorvall® RC-5B Refrigerated

Superspeed Zentrifuge, DuPont Instruments) wurde der Proteinüberstand mit 40%

Ammoniumsulfat gefällt. Dazu wurde eine 100% gesättigte Ammoniumsulfatlösung nach

Versetzen mit 150 mM NaDT über eine peristaltische Pumpe (Perimax 12, Spetec) gleichmäßig


zugetropft und die Proteinlösung anschließend zur Einstellung des Gleichgewichtes noch 1 h

weitergerührt. Nach Zentrifugation für 1 h bei 6000 rpm und 4°C (Sorvall® RC-5B Refrigerated

Superspeed Zentrifuge, DuPont Instruments) wurde der Überstand mit 75% Ammoniumsulfat

gefällt. Das Präzipitat wurde erneut abzentrifugiert (1 h, 6000 rpm, 4°C, Sorvall® RC-5B

Refrigerated Superspeed Zentrifuge, DuPont Instruments) und das Pellet in 10-15 ml 50 mM

Tris-HCl pH 8,5 gelöst und über Nacht gegen 100 Volumen desselben Puffers dialysiert (2.13.).

Nach Zentrifugation für 10 min (Heraeus-Christ Piccolo, Stufe 4) wurde die Proteinlösung mit

einer peristaltischen Pumpe (Perimax 12, Spetec) auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule

(30 mm x 60 mm, GE Healthcare), die zuvor mit 5 Volumen 50 mM Tris-HCl pH 8,5 äquilibriert

worden war, aufgetragen (Fließgeschwindigkeit 3 ml min-1). Nach Waschen der Säule mit

100 ml desselben Puffers wurden die Proteine durch einen pH-Gradienten von 50 mM Tris-HCl

pH 8,5 bis 50 mM Kaliumphosphat pH 7 (6-faches Säulenvolumen, Fließgeschwindigkeit

3 ml min-1) und einem nachfolgenden Waschschritt mit 120 ml 50 mM Kaliumphosphat pH 7

eluiert. Für den pH-Gradienten sowie den nachfolgenden Waschschritt wurde eine ÄKTA-

FPLC-Anlage der Firma Amersham Pharmacia Biotech verwendet. Die Hydrogenase

enthaltenden Fraktionen (2.14.) wurden vereint und mit dem 1,5-fachen Volumen 50 mM

Tris-HCl pH 8,5 verdünnt. Anschließend wurde die Proteinlösung auf eine zweite Q-Sepharose

Fast Flow-Säule (20 mm x 35 mm, GE Healthcare), die zuvor mit 5 Volumen 50 mM Tris-HCl

pH 8,5 äquilibriert worden war, aufgetragen (Perimax 12, Spetec, Fließgeschwindigkeit

3 ml min-1). Nach Waschen mit 10 ml 50 mM Tris-HCl pH 8,5 wurde die Hydrogenase durch

einen KCl-Gradienten von 50 mM Tris-HCl pH 8,5 bis 50 mM Tris-HCl pH 8,5 500 mM KCl

(4-faches Säulenvolumen, Fließgeschwindigkeit 3 ml min-1 ÄKTA-FPLC, Amersham Pharmacia

Biotech) eluiert. Die Hydrogenase enthaltenden Fraktionen wurden vereint und mittels vivaspin

6 Zentrifugalkonzentratoren (Sartorius) (2.12.) auf ein Volumen von < 1 ml einkonzentriert

(Heraeus-Christ Piccolo, Stufe 2). Anschließend erfolgte die Abtrennung von noch kleineren in

der Probe vorhandenen Verunreinigungen durch Größenausschlusschromatographie über eine

HiLoadTM 16/60 Superdex 75 prep grade Gelfiltrationssäule (16 mm x 600 mm, GE Healthcare).

Die Säule wurde entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Die Elution der Proteine

erfolgte bei 1 ml min-1 (Perimax 12, Spetec) in 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 150 mM KCl, 2 mM

NaDT. Die Hydrogenase-Fraktionen wurden vereint und mittels vivaspin 6 Zentrifugal-

konzentratoren (Sartorius) auf 1 ml einkonzentriert (Heraeus-Christ Piccolo, Stufe 2).

Das Protein wurde anschließend in PCR-Gefäße aliquotiert und diese in mit Butylgummistopfen

und Standard Seal 25-Stopfen (Grace) zukrimpbaren 8 ml Rollrandflaschen (ND20, Thermo

Fisher Scientific) anaerob bei - 80°C gelagert.


2.12. Konzentrierung von Proteinlösungen

Zur Konzentrierung von Proteinlösungen wurden vivaspin 6 und vivaspin 500 Zentrifugal-

konzentratoren (10000 MWCO PES) der Firma Sartorius nach Herstellerangaben verwendet.

2.13. Dialyse von Proteinlösungen

Zur Entsalzung von Proteinlösungen in präparativem Maßstab wurden Dialyseschläuche der

Firma Serva Electrophoresis (Membra-CelTM Dialysis Membranes, MWCO 3500, 16 mm

Diameter) nach Herstellerangaben verwendet. Die Dialyse der Proben erfolgte über Nacht gegen

das entsprechende Volumen des gewünschten Puffers.

Für die Dialyse von Proteinlösungen im µl-Maßstab wurde eine Mikrotropfendialyse nach

Marusyk et al. (1980) durchgeführt. Dazu wurde die Proteinlösung auf einen Membranfilter

(Nitrocellulose Membranfilter, Porengröße 0,025 µm, Millipore), der auf der Oberfläche der

entsprechenden Pufferlösung schwamm, pipettiert und nach 30 min wieder abgenommen.

2.14. Gaschromatographische Bestimmung der in vitro-Hydrogenaseaktivität

Die Hydrogenaseaktivität wurde gaschromatographisch über die durch das Enzym produzierte

Wasserstoffmenge bestimmt. Dazu wurde ein 2 ml-Reaktionsansatz, bestehend aus 60 mM

K-Phosphat pH 6,8, 100 mM NaDT, 10 mM Methylviologen und 2-15 µl Proteinlösung, im

Anaerobzelt in ein 8 ml-Testgefäß (8 ml-Rollrandflasche ND20, Thermo Fisher Scientific)

pipettiert und dieses durch einen Suba Seal 25-Rotgummistopfen (Sigma-Aldrich) luftdicht

verschlossen. Für die Bestimmung der in vitro-Hydrogenaseaktivität von Algenkulturen wurden

100 µl Kultur und zusätzlich 1% Triton X-100 in den Ansatz gegeben. Nach 3 minütiger

Entgasung mit Argon wurden die Testgefäße 20 min bei 37°C im Schüttelwasserbad (julabo

SW-20C, Julabo Labortechnik) inkubiert. Danach wurden mit einer 1 ml Kunststoffspritze

(NormJect®, Henke Sass Wolf) 200 µl Gasphase in den Gaschromatographen (GC-2010,

Shimadzu) injiziert und die gebildete Wasserstoffmenge bestimmt. Zur Ermittlung des

Umrechnungsfaktors für die durch die Software des Gerätes ausgegebene Flächeneinheit [area]


in die entsprechende Wasserstoffmenge [nmol] wurde das Gerät mit H2 geeicht. Es ergab sich

ein Umrechnungsfaktor von 135 areas pro nmol H2. Die Hydrogenaseaktivität wurde wie folgt

berechnet:

µmol H2 * 40a / 20b / mg Chlorophyll = Aktivität [µmol H2 min-1 mg-1 Chlorophyll]

µmol H2 * 40a / 20b / mg Protein = spezifische Aktivität [µmol H2 min-1 mg-1 Protein]

a: Injektion von 200 µl Gasphase bei 8 ml Gefäßvolumen

b: 20 min Inkubation

2.15. Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde ein Bio-Rad-Mikroassay nach Bradford (1976)

durchgeführt. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben unter Verwendung von BSA

als Standard.

2.16. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zur Trennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht wurden SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophoresen nach Laemmli (1970) durchgeführt. Zur Analyse wurden Gele mit einem

15% igen Trenngel (15% Acrylamid-Bisacrylamid 37,5:1, 375 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1% SDS)

und einem 6% igen Sammelgel (6% Acrylamid-Bisacrylamid 37,5:1, 125 mM Tris-HCl pH 6,8,

0,1% SDS) verwendet. Die Proteinproben wurden vor der Elektrophorese mit ¼ Volumen 4x

SDS-Probenpuffer und 3 µl β-Mercaptoethanol versetzt und 3 min bei 95°C denaturiert (Thermo

Compact Heizblock, Eppendorf). Anschließend erfolgte die Elektrophorese bei 60 V in einer

Mini-Protean® 3 Cell Elektrophoresekammer der Firma Bio-Rad. Die Proteine wurden

anschließend durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blau R250 sichtbar gemacht (2.17.).


4x SDS-Probenpuffer Elektrophoresepuffer

200 mM Tris-HCl pH 6,8 25 mM Tris

8% SDS 250 mM Glycin

40% Glycerin 0,1% SDS

0,04% Bromphenolblau pH 8,8

2.17. Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamidgelen

Die Färbung von Proteinen in Polyacrylamidgelen erfolgte durch den Farbstoff Coomassie

Brillant Blau R250. Dazu wurden die Gele zunächst 30 min in Färbelösung und anschließend zur

Entfärbung des Hintergrunds in Entfärbelösung unter Schütteln (Rotamax 120, Heidolph)

inkubiert.

Färbelösung Entfärbelösung

50% (v/v) Methanol 10% (v/v) Methanol

10% (v/v) Essigsäure 10% (v/v) Essigsäure

0,1% (w/v) Coomassie Brillant Blau R250

2.18. Western Blot und Immunodetektion von Proteinen

Der spezifische Nachweis von HydA1 aus C. reinhardtii erfolgte durch Western Blot und

nachfolgende Detektion mit einem spezifischen Antikörper. Dazu wurden die Proteine

gelelektrophoretisch getrennt (2.16.) und anschließend in einer Transferapparatur (Fast-Blot

B44-Kammer, Biometra) für 20 min bei 0,24 A auf eine Nitrocellulose-Membran (0,45 µm,

Schleicher & Schuell) übertragen. Nach dem Transfer wurde die Membran 30 min bei

Raumtemperatur in Blockingpuffer und anschließend 2 h bei 4°C mit dem primären Antikörper

(polyklonales Rabbit-Anti-HydA1-Antiserum gegen HydA1 aus C. reinhardtii, Happe et al.

1994, 1:5000 in Blockingpuffer) inkubiert. Danach wurde die Membran dreimal 10 min mit

PBS-Puffer, 0,1% Tween 20 gewaschen und anschließend 1 h bei Raumtemperatur mit dem

sekundären Antikörper (Goat-Anti-Rabbit HRP-Konjugat, Pierce, 1:5000 in Blockingpuffer)

inkubiert. Im Anschluss wurde die Membran zweimal mit PBS-Puffer, 0,1% Tween 20 und


einmal mit PBS-Puffer gewaschen und in Äquilibrierungs-Puffer äquilibriert. Die Detektion

erfolgte mit dem SuperSignal West Dura Extended Substrat-Kit der Firma Pierce gemäß

Herstellerangaben und einem Chemilumineszenz-Detektor (FluorChem 8800) der Firma Alpha

Innotech.

Transferpuffer PBS-Puffer Blockingpuffer Äquilibrierungs-Puffer

20% Methanol 4 mM NaH2PO4 PBS-Puffer 100 mM Tris-HCl pH 9,5

25 mM Tris 16 mM Na2HPO4 2% Milchpulver 100 mM NaCl

192 mM Glycin 115 mM NaCl 0,1% Tween 20 50 mM MgCl2

2.19. Sequenzierung von Proteinen

Die massenspektrometrische Identifizierung von HydA1 aus C. reinhardtii erfolgte mittels

MALDI-TOF-Analyse nach Karas et al. (1987) und Rosenfeld et al. (1992) in Zusammenarbeit

mit Dr. Frank Fischer (Institut für Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität Bochum). Nach

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.16.) und anschließender Coomassie-Blau-Färbung

(2.17.) wurde die entsprechende Proteinbande aus dem Gel ausgeschnitten und zur Entfärbung in

100 µl Waschpuffer 15 min bei 37°C inkubiert (Brutschrank, WTC Binder). Anschließend wurde

das Gelstück im Vakuumkonzentrator (Super Speed Concentrator, Bachofer) getrocknet. Es

folgte die Zugabe von 10 µl Trypsin-Lösung (12,5 ng/µl in 25 mM NH4HCO3) und eine

Inkubation der Probe bei 37°C über Nacht. Nach Zugabe von 10 µl Elutionspuffer und

20 minütiger Inkubation im Ultraschallbad wurde der Überstand massenspektrometrisch

untersucht. Es wurden 0,6 µl Überstand auf einem Probenträger mit 0,6 µl Matrixlösung

vermischt und getrocknet. Danach folgte die Analyse am Voyager DE-Pro Massenspektrometer

(Applied Biosystems) im automatischen Modus der Einstellungen aus der Doktorarbeit von

Frank Fischer (2006). Die erhaltenen Fragmentmassen wurden unter http://expasy.org/sprot/

ausgewertet.

Waschpuffer Elutionspuffer Matrixlösung

25 mM NH4HCO3 50% (v/v) Acetonitril 10 mg/ml Cyano-4-hydroxycinnam-Säure

50% (v/v) Acetonitril 0,5% (v/v) TFA 1% (v/v) TFA

60% (v/v) Acetonitril

http://expasy.org/sprot/


Zur Identifizierung von HydA aus C. submarinum und HydA1 aus C. moewusii wurde eine

Sequenzierung der Proteine nach Jensen et al. (1998) in Zusammenarbeit mit Dr. Markus

Piotrowski (Institut für Pflanzenphysiologie, Ruhr-Universität Bochum) durchgeführt. Nach

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2.16.) und anschließender Coomassie-Blau-Färbung

(2.17.) wurden die entsprechenden Proteinbanden aus dem Gel ausgeschnitten zur Entfärbung

zwei Mal im doppelten Volumen 50% (v/v) Acetonitril für 15 min unter Schütteln inkubiert

(Thermo Compact Heizblock, Eppendorf). Anschließend wurde die Lösung entfernt und

1 Volumen Acetonitril zugegeben. Nach 5 minütiger Inkubation und Entfernung der Lösung

erfolgte die Zugabe von 1 Volumen 100 mM NH4HCO3. Nach 5 min wurde zusätzlich

1 Volumen Acetonitril zugegeben und die Gelstücke weitere 15 min unter Schütteln inkubiert.

Danach wurde die Flüssigkeit vollständig abgenommen und die Gelstücke im

Vakuumkonzentrator (Super Speed Concentrator, Bachofer) getrocknet. Es folgte die Zugabe

von 30 µl Trypsin-Lösung (10 ng/µl in 50 mM NH4HCO3), die nach 10 minütiger Inkubation auf

Eis wieder entfernt wurde. Die Gelstücke wurden mit 25 mM NH4HCO3 bedeckt und bei 37°C

über Nacht inkubiert (Brutschrank WTC, Binder). Zur Extraktion der Peptide wurden die

Ansätze anschließend 2 min im Ultraschallbad inkubiert und der Überstand in ein neues

Reaktionsgefäß überführt. Zur vollständigen Elution der Peptide aus dem Gel wurden die

Restansätze mit 1 Volumen 25 mM NH4HCO3 versetzt, 15 min unter Schütteln inkubiert, mit

1 Volumen Acetonitril versetzt und nach weiteren 15 min erneut im Ultraschallbad inkubiert.

Der Überstand wurde abgenommen und ebenfalls in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die

Gelstücke wurden in 1 Volumen Acetonitril, 5% (v/v) Ameisensäure 15 min unter Schütteln

inkubiert, die Flüssigkeit abgenommen, mit den restlichen Überständen vereint und auf ein

Volumen von 15 µl einkonzentriert. Die Proben wurden anschließend bei -20°C gelagert. Die

massenspektrometrische Untersuchung und die nachfolgende Auswertung erfolgte mit dem

Q-TOF-2 Hybridmassenspektrometer und der zugehörigen Software von Micromass.

2.20. Biochemische Charakterisierung von [FeFe]-Hydrogenasen

2.20.1. Bestimmung des Temperaturoptimums

Zur Bestimmung des Temperaturoptimums der [FeFe]-Hydrogenasen wurden in vitro-

Aktivitätstests wie unter 2.14. beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden jeweils

15 min bei Temperaturen von 20-70°C im Schüttelwasserbad inkubiert und die gebildete


Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Für jeden Temperaturschritt wurden von

drei Proteinchargen jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

2.20.2. Untersuchung der pH-Toleranz

Zur Bestimmung des pH-Optimums der [FeFe]-Hydrogenasen wurden in vitro-Aktivitätstests

mit unterschiedlichen Reaktionspuffern wie unter 2.14. beschrieben durchgeführt. Alle

Puffersubstanzen wurden in einer Konzentration von 50 mM angesetzt, mit KCl auf eine

Ionenstärke von 150 mM eingestellt und konnten bei 37°C verwendet werden. Die Berechnung

der benötigten Stoffmengen erfolgte mit Hilfe des online verfügbaren Puffer-Kalkulators der

Universität Liverpool (http://www.liv.ac.uk/buffers/buffercalc.html). Die Reaktionsansätze

wurden jeweils 15 min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert und die gebildete

Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Für jeden Puffer wurden

Doppelbestimmungen mit je drei unterschiedlichen Proteinchargen durchgeführt.

pH-Wert Puffersubstanz

MES Bis-Tris K-Phosphat Hepes Mops Tris Tricin

5,5 +

6,0 + + +

6,5 + + +

7,0 + + +

7,5 + + +

8,0 + + +

8,5 + +

9,0 + +

2.20.3. Untersuchung der Salzabhängigkeit

Zur Untersuchung des Einflusses von Salz auf die Aktivität von [FeFe]-Hydrogenasen wurden

in vitro-Aktivitätstests, die statt K-Phosphat pH 6,8 50 mM Tris-HCl pH 7,5 mit

unterschiedlichen Salzkonzentrationen (0-2 M KCl) als Reaktionspuffer enthielten, wie unter

2.14. beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsansätze wurden jeweils 15 min bei 37°C im

Schüttelwasserbad inkubiert und die gebildete Wasserstoffmenge gaschromatographisch

http://www.liv.ac.uk/buffers/buffercalc.html


bestimmt. Für jeden Puffer wurden Doppelbestimmungen mit je zwei unterschiedlichen

Proteinchargen durchgeführt.

2.20.4. Untersuchung der Sauerstoffsensitivität

Zur Untersuchung der Sauerstoffsensitivität der [FeFe]-Hydrogenasen wurden in vitro-

Aktivitätstests wie unter 2.14. beschrieben durchgeführt. Es wurden je 1 ml 60 mM K-Phosphat

pH 6,8, 2 mM NaDT und 2-15 µl Proteinlösung im Anaerobzelt in 8 ml-Testgefäße

(8 ml-Rollrandflasche ND20, Thermo Fisher Scientific) pipettiert und diese durch Suba Seal 25-

Rotgummistopfen (Sigma-Aldrich) lufticht verschlossen. Anschließend wurden mit einer 1 ml

Kunststoffspritze (NormJect®, Henke Sass Wolf) außerhalb des Zeltes definierte Mengen Luft

(0-3 ml) in die Testgefäße gespritzt und diese anschließend 15 min auf Eis unter Schütteln

inkubiert. Nach 3 minütiger Entgasung mit Argon wurden die restlichen Komponenten des

Reaktionsansatzes zugegeben, die Gefäße nochmals 3 min mit Argon entgast und die Ansätze für

20 min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurde die gebildete

Wasserstoffmenge wie beschrieben gaschromatographisch bestimmt. Es wurden von zwei

Proteinchargen jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

2.20.5. Inhibierung von Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid

Um die Reaktion von [FeFe]-Hydrogenasen mit Kohlenmonoxid zu untersuchen, wurden

in vitro-Aktivitätstests wie unter 2.14. beschrieben durchgeführt. Dazu wurden luftdicht

verschlossene Testsansätze, die je 1 ml 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT und 2-15 µl

Proteinlösung enthielten, außerhalb des Anaerobzeltes unterschiedlich lange (0-25 min) mit CO

begast (ca. 125 µl CO sec-1), anschließend 3 min mit Argon entgast und nach Zugabe der

restlichen Komponenten des Reaktionsansatzes und 3 minütiger Argonbegasung für 20 min bei

37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurde die gebildete Wasserstoffmenge wie

beschrieben gaschromatographisch bestimmt.

Für eine genauere Bestimmung der CO-Sensitivität der Hydrogenasen wurden in einer weiteren

Versuchsreihe je 1 ml 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT und 2-15 µl Proteinlösung wie

unter 2.20.4. beschrieben in 8 ml-Testgefäße pipettiert und diese durch Suba Seal 25-

Rotgummistopfen lufticht verschlossen. Anschließend wurden mit einer 1 ml Kunststoffspritze

aus einer mit CO befüllten Bürette definierte Mengen CO (0-3 ml) in die Testgefäße gespritzt

und diese anschließend 15 min auf Eis unter Schütteln inkubiert. Nach 3 minütiger Entgasung


mit Argon, Zugabe der restlichen Komponenten des Reaktionsansatzes und nochmaliger

Entgasung mit Argon wurden die Ansätze für 20 min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert

und die gebildete Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Es wurden von zwei

Proteinchargen jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.

2.21. Biophysikalische Untersuchungen von [FeFe]-Hydrogenasen

2.21.1. EPR-Spektroskopie

Die EPR-spektroskopische Untersuchung der [FeFe]-Hydrogenasen erfolgte in Zusammenarbeit

mit Dr. Alexey Silakov (Max-Planck-Institut für Bioanorganische Chemie, Mülheim an der

Ruhr). Für die Untersuchung wurden die Proteinproben mittels vivaspin 500

Zentrifugalkonzentratoren (Sartorius) auf ein Volumen von 30 µl und eine Konzentration von

100 µM eingestellt (2.12.) und anschließend falls notwendig dialysiert (2.13.). Eine Begasung

der Proben mit CO, Ar oder H2 erfolgte außerhalb des Anaerobzeltes. Dazu wurde die Probe in

ein PCR-Gefäß überführt und dieses offen in einer 8 ml-Rollrandflasche (ND20, Thermo Fisher

Scientific) positioniert. Nach Verschließen des Gefäßes mit einem Suba Seal 25-

Rotgummistopfen (Sigma-Aldrich) erfolgte die Begasung für 20 min über eine Kanüle.

Anschließend wurde die Probe mit Hilfe einer 0,5 ml-Gastight®-Spritze (Hamilton Medical) in

ein EPR-Röhrchen (Quartz, Innendurchmesser 2 mm) überführt, in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und anschließend außerhalb des Zeltes vermessen.

Die Aufnahme der Spektren erfolgte an einem Bruker ELEXSYS E580 Q-Band Spektrometer

mit einer SuperQ-FT Mikrowellenbrücke und der zugehörigen Software von Bruker Optic bei

ca. 34 GHz und einer Temperatur von 20 K nach der Methode des 2 Puls-Elektronenspinechos

(Hahn 1950, Schweiger et al. 2001). Dabei wird ein Elektronenspinecho als Funktion des

externen Magnetfeldes nach zwei Mikrowellenpulsen (π/2 und π) aufgezeichnet. Die

Verzögerung zwischen den Mikrowellenpulsen wurde auf τ = 360 ns, die Länge des

Mikrowellenpulses π/2 auf 36 ns und die von π auf 68 ns eingestellt. Für die Messungen wurde

ein selbstgebauter, leicht überkuppelter zylindrischer TE011 Resonator (Sinnecker et al. 2004),

ähnlich wie bei Sienkiewicz et al. (1996) beschrieben, verwendet. Kryogene Temperaturen

wurden durch Verwendung eines Oxford CF935 Kryostaten auf der Basis von flüssigem Helium

erreicht. Die Belichtung der Proben erfolgte innerhalb des EPR-Setups im Kryostaten bei 40 K


durch Verwendung eines OPO Laser Systems (Quantel, Brilliant Serie) bei 531 nm mit 8 mJ pro

Puls.

Für die zur Untersuchung der 57Fe-Hyperfeinwechselwirkungen durchgeführten Davies

ENDOR- (Davies 1974) und HYSCORE-Messungen wurde ein selbsteingerichtetes

Datenaufnahmesystem verwendet, das auf der SpecMan-Software basiert (Epel et al. 2005). Die

Radiofrequenzimpulse wurden durch einen SMT02 Radiofrequenzgenerator (Rhode &

Schwartz) erzeugt und durch einen ENI 3200 RF solid-state Amplifier verstärkt. Die

Durchführung der ENDOR- und HYSCORE-Messungen und die Auswertung der Spektren

erfolgte in Analogie zu den Angaben aus der Doktorarbeit von Alexey Silakov (2007).

2.21.2. FTIR-Spektroskopie

Die FTIR-spektroskopische Untersuchung der [FeFe]-Hydrogenasen erfolgte in Zusammenarbeit

mit Dr. Alexey Silakov (Max-Planck-Institut für Bioanorganische Chemie, Mülheim an der

Ruhr). Für die Untersuchung wurden die Proteinproben auf ein Volumen von 20 µl und eine

Konzentration von 300-400 µM eingestellt und wie unter 2.21.1. beschrieben vorbereitet.

Die Messungen erfolgten an einem Bruker IFS 66 v/s FTIR-Spektrometer mit MCT-Detektor

und der zugehörigen Software Opus von Bruker Optic. Die Probenkammer wurde während der

Messung mit N2 gespült, um die Bildung von CO2 und Wasserdampf zu vermeiden. Die

Spektren wurden im doppelseitigen Vorwärts-Rückwärts-Modus aufgenommen und die Apertur

auf 1,5 mm eingestellt. Für die Messungen wurde eine luftdicht verschließbare Küvette mit

CaF2-Fenstern verwendet. Kryogene Temperaturen wurden durch Verwendung eines Oxford

Optistat CF Kryostaten, welcher mit CaF2- und Saphir-Fenstern ausgestattet ist, auf der Basis

von flüssigem Helium erreicht. Die Belichtung der Proben erfolgte innerhalb des IR-Setups

durch eine Lampe mit 200 Watt.

Für die Spektroelektrochemischen Messungen wurde eine temperierbare, optisch transparente

Elektrochemie-Dünnschicht-Zelle (OTTLE-Zelle) nach Moss et al. (1990) mit einem sich

zwischen zwei CaF2-Fenstern und der Probenlösung befindlichen Goldnetz als Arbeitselektrode,

einer Platinelektrode als Gegenelektrode und einer Ag/AgCl-Elektrode als Referenzelektrode

verwendet. Das Redoxpotential der Zelle wurde über einen an die Elektroden angeschlossenen

M270 Potentiostaten (EG&G Princeton Applied Research) und der zugehörigen Software M270

kontrolliert. Die Temperatur der Messzelle wurde durch einen RML 6 Thermostaten (Lauda)

konstant gehalten (4°C). Um alle gemessenen Potentiale wie standardmäßig üblich gegen die

Standardwasserstoffelektrode (NHE) anzugeben, wurde das Potential der Ag/AgCl-Elektrode vor


und nach jeder Messung durch Aufnahme eines Voltammogramms von Methylviologen

bestimmt, und die gemessenen Potentiale nachträglich um die Differenz zwischen Ag/AgCl-

Elektrode und Standardwasserstoffelektrode (hier experimentell ermittelt: - 240 mV) korrigiert.

Die Aufnahme der Spektren erfolgte über einen Potentialbereich von - 510 bis 100 mV in

Schritten von 25-50 mV nach einer elektrochemischen Äquilibrierungszeit von 10 min bei jedem

Schritt bei 4°C. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit Hilfe des Programms MatLabTM. Die

Bestimmung des Mittelpunktspotentials der einzelnen Redoxübergänge erfolgte unter

Verwendung der Nernst-Gleichung (Atkins 1994).

3. Ergebnisse 29

3. Ergebnisse

3.1. Etablierung eines neuen Reinigungsprotokolls für HydA1 aus

C. reinhardtii

3.1.1. Induktion der Hydrogenase-Expression

3.1.1.1. Anaerobe Induktion

Die Induktion der Hydrogenase-Expression ist durch anaerobe Induktion (Happe et al. 1993)

oder durch Schwefelmangelbedingungen (Melis et al. 2000, Zhang et al. 2002, Winkler et al.

2002) möglich. Bei dem artifiziellen System der anaeroben Adaptation werden anaerobe

Stressbedingungen durch Aufkonzentrierung der Algen und Begasung mit Argon geschaffen, die

Unterbindung der endogenen Sauerstoffproduktion erfolgt durch Abdunklung der Zellen. Das

Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität ist nach ungefähr 4 h erreicht und liegt für

C. reinhardtii bei ca. 3 µmol H2 min-1 mg-1 Chlorophyll. Ähnliches gilt für C. submarinum. Die

für C. moewusii bestimmte maximale in vitro-Hydrogenaseaktivität ist um das Vierfache höher

(Daten nicht gezeigt).

3.1.1.2. Schwefelmangel-Induktion

Für die Schwefelmangel-Induktion wurden die Algen zunächst in TAP-Medium bis zu einem

Chlorophyllgehalt von 20 µg Chlorophyll ml-1 kultiviert, anschließend in TAP-S-Medium

überführt, luftdicht verschlossen und bei geringer Belichtung für 24-48 h inkubiert. Bei

C. reinhardtii ist das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität nach 48 h erreicht und mit

70 µmol H2 min-1 mg-1 Chlorophyll um das 25-fache höher als bei der anaeroben Induktion

(Abb. 3.1. A).

Auch bei C. moewusii und C. submarinum funktioniert die Methode Schwefelmangel besser als

die Methode der anaeroben Adaptation. C. moewusii erreicht ähnliche Aktivitätswerte wie

C. reinhardtii, C. submarinum mit durchschnittlich 35 µmol H2 min-1 mg-1 Chlorophyll etwa die

Hälfte. Das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität ist bei beiden im Gegensatz zu

C. reinhardtii schon nach 24 h erreicht (Abb. 3.1. A).

3. Ergebnisse 30

A

B Abb. 3.1. Induktion der Hydrogenase-Expression in C. reinhardtii, C. moewusii und C. submarinum durch Schwefelmangel A Die Algen wurden in TAP-Medium bis zu einem Chlorophyllgehalt von 20 µg ml-1 angezogen und anschließend

in TAP-S-Medium überführt. Danach wurden die Kulturen luftdicht verschlossen und bei geringer Belichtung für

96 h unter Rühren inkubiert. Zu den angegeben Zeitpunkten wurden je 100 µl Kultur steril entnommen und die

Entwicklung der in vitro-Hydrogenaseaktivität gaschromatographisch bestimmt.

B Bei dem optimierten System der Schwefelmangel-Induktion wurde selbstentschwefelndes Medium direkt mit

C. reinhardtii, C. moewusii und C. submarinum angeimpft und die Kulturen unter anaeroben Bedingungen für

10 Tage bei geringer Belichtung unter Rühren kultiviert. Es wurden täglich 100 µl Kultur entnommen und die

Entwicklung der in vitro-Hydrogenaseaktivität gaschromatographisch bestimmt.

3. Ergebnisse 31

3.1.1.3. Optimierung der Schwefelmangel-Induktion

Um die Methode der Schwefelmangel-Induktion im Hinblick auf die geplante Isolierung der

Hydrogenase in großem Maßstab zu optimieren, wurden für die nachfolgenden Versuche keine

zwei Medien mehr, TAP-Medium für die Kultivierung der Algen und TAP-S-Medium zur

Schaffung von Schwefelmangelbedingungen, sondern nur noch selbstentschwefelndes Medium

(2.5.) verwendet. Die direkte Kultivierung in selbstentschwefelndem Medium bietet den Vorteil,

dass bei gleichem Zeitaufwand weniger Medium benötigt wird und der bei großen Volumina

recht aufwändige Zentrifugationsschritt zur Überführung der Algen von TAP-Medium in TAP-

S-Medium wegfällt, wodurch zusätzlich das Risiko für Kontaminationen vermindert wird.

Zusätzlich ist diese Methode durch die allmähliche Anpassung an Schwefelmangelbedingungen

schonender für die Alge (Laurinavichene et al. 2002).

Das selbstentschwefelnde Medium wurde direkt mit dem jeweiligen Algenstamm angeimpft und

die Kulturen luftdicht verschlossen bei geringer Belichtung für 7-8 Tage inkubiert. In dieser Zeit

wachsen die Zellen bis zu einem Chlorophyllgehalt von ca. 20-25 µg Chlorophyll ml-1 und

verbrauchen dabei den im Medium vorhandenen Schwefel und Sauerstoff. Dadurch wird die

Hydrogenase-Bildung induziert, das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität ist bei allen

drei Algenstämmen nach 7-8 Tagen erreicht und vergleichbar mit den unter 3.1.1.2.

beschriebenen Werten (Abb. 3.1. B).

Anaerobe Induktion Schwefelmangel-Induktion 5 Stunden 7. Tag 8. Tag

HydA1

Abb. 3.2. Western Blot von HydA1 aus C. reinhardtii, exprimiert unter Schwefelmangel und anaerober

Adaptation

Die anaerobe Induktion und die Schwefelmangel-Induktion wurden wie unter 2.9. beschrieben durchgeführt. Die

Probenentnahme erfolgte jeweils, als das Maximum der in vitro-Hydrogenaseaktivität erreicht war. Es wurde jeweils

eine 10 µg Chlorophyll entsprechende Menge gelelektrophoretisch getrennt und durch Immunodetektion mit einem

spezifisch gegen HydA1 gerichteten Antikörper untersucht.

3. Ergebnisse 32

3.1.2. Reinigung von HydA1 aus C. reinhardtii

Für die Isolierung der Hydrogenase aus C. reinhardtii wurden 8 l Schwefelmangelkultur

verwendet. Die Reinigung erfolgte unter sauerstofffreien Bedingungen im Anaerobzelt. Das

entwickelte Reinigungsprotokoll ist unter 2.11. beschrieben und schematisch in Abb. 3.3.

dargestellt.

Abb. 3.3. Schematische Darstellung des entwickelten Reinigungsprotokolls zur Isolierung von [FeFe]-Hydrogenasen aus Grünalgen

Nach Aufschluss der Zellen durch Triton X-100 wurde der Gesamtproteinextrakt zunächst zur

Entfernung des Chlorophylls und größerer Zellkomponenten mit Ammoniumsulfat gefällt.

Hierbei erfolgte der Ausfall der Hydrogenase im zweiten Fällungsschritt mit 75%

Ammoniumsulfat. Anschließend erfolgte eine Trennung der Proteine mittels Anionenaustausch-

chromatographie über zwei aufeinanderfolgende Q-Sepharose Fast Flow-Säulen. Bei der ersten

Säule wurden die Proteine durch einen pH-Gradienten von pH 8,5-7 eluiert, bei der zweiten

Säule durch einen Salzgradienten von 0-500 mM Kaliumchlorid. Die Hydrogenase konnte in den

Fraktionen ab einem pH-Wert von 7 und einer Salzkonzentration von ca. 300 mM detektiert

werden. Im letzten Schritt erfolgte eine Trennung der Proteine mittels Größenausschluss-

chromatographie über eine HiLoadTM 16/60 Superdex 75 Gelfiltrationssäule. Dabei eluiert die

Hydrogenase bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml min-1 gemäß ihrem Molekulargewicht von

46 kDa als Monomer nach ca. 58 ml. Das saubere Protein wurde anschließend einkonzentriert

und weiter untersucht. Der typische Verlauf der Reinigung ist in Abb. 3.4. und Tab. 3.1. gezeigt.

3. Ergebnisse 33

kDa M 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 13 14 15

119 79 46 31 24 19

HydA1

Abb. 3.4. SDS-PAGE und Western Blot der verschiedenen Reinigungsstufen von HydA1 aus C. reinhardtii

M: Molekulargewichtsmarker, 1: Proteinextrakt nach Ammoniumsulfatfällung, 2-6: ausgewählte Fraktionen

Q-Sepharose pH-Gradient, M: Molekulargewichtsmarker, 7-9: ausgewählte Fraktionen Q-Sepharose KCl-Gradient,

10: Konzentrierte Probe nach Q-Sepharose KCl-Gradient, 11-13: ausgewählte Fraktionen Gelfiltration Superdex 75,

14: HydA1 1 µg, 15: Western Blot gegen 1 µg gereinigtes HydA1

Die Auftrennung der Proteine erfolgte auf einem 15% igen SDS-Gel mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung

bzw. Immunodetektion mit einem spezifisch gegen HydA1 gerichteten Antikörper.

Tab. 3.1. Übersicht über die Reinigung der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii

Gesamtaktivität

[µmol H2 min-1] Gesamtprotein [mg]

Menge [%]

Spezifische Aktivität [µmol H2 min-1 mg-1]

Reinigungsfaktor (-fach)

Gesamtproteinextrakt (8 l) 3780 270 100 14 1 Ammoniumsulfat-Fällung 40-75% 2856 84 48 34 2

1. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose pH-Gradient

1744 8 47 218 16

2. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose KCl-Gradient

533 1,5 25 355 25

Gelfiltration Superdex 75 371 0,5 22 741 53

Aus 8 l Schwefelmangelkultur konnten durchschnittlich 500 µg Hydrogenase mit einer

spezifischen Aktivität von ca. 741 µmol H2 min-1 mg-1 Protein bei Verwendung von reduziertem

Methylviologen als Elektronendonor und einem Reinheitsgrad von 95-100% isoliert werden.

Dies ist eine 40-fach höhere Ausbeute als zuvor bei Happe et al. (1993) beschrieben und nur

etwa 50% weniger als bisher durch die Überexpression in C. acetobutylicum (Girbal et al. 2005)

gewonnen werden konnte. Für die Reinigung konnte ein Reinigungsfaktor von 53 ermittelt

werden, die bestimmte Restaktivität im Vergleich zur Gesamtaktivität des Rohextrakts lag bei

3. Ergebnisse 34

22%. Da der Anteil an Hydrogenase in Schwefelmangelkulturen im Vergleich zur

Gesamtproteinmenge sehr viel höher ist als in einer anaerob induzierten Kultur, ist der

Reinigungsfaktor entsprechend niedrig, was für die Qualität des Expressionssystems spricht.

3.1.3. Nutzung des entwickelten Reinigungsprotokolls für die Isolierung weiterer

[FeFe]-Hydrogenasen aus C. moewusii und C. submarinum

Das für die Isolierung von HydA1 aus C. reinhardtii entwickelte Reinigungsprotokoll konnte

ebenfalls erfolgreich für die Isolierung der bisher noch nicht näher charakterisierten

Hydrogenasen aus C. moewusii und C. submarinum verwendet werden.

Die Hydrogenase aus C. submarium zeigte während des Reinigungsverlaufs ähnliche

Eigenschaften wie HydA1 aus C. reinhardtii. Nach Aufschluss der Zellen und Ammoniumsulfat-

fällung des Gesamtproteinextrakts erfolgte wie bereits beschrieben eine Fraktionierung über

zwei Q-Sepharose Fast Flow-Säulen und eine Größenausschlusschromatographie über

Superdex 75, wobei die Hydrogenase wie HydA1 aus C. reinhardtii bei einem pH-Wert von 7,

einer Salzkonzentration von 300 mM und gemäß ihrem Molekulargewicht als Monomer nach

58 ml eluierte. Da die Zellwand von C. submarinum schwieriger aufzuschließen war als die von

C. reinhardtii, musste die Tritonkonzentration in dem für den Zellaufschluss verwendeten Puffer

auf 2% und die Inkubationszeit auf 25 min erhöht werden. Insgesamt konnten aus 8 l

Schwefelmangelkultur durchschnittlich 500 µg Hydrogenase mit einer spezifischen Aktivität von

ca. 639 µmol H2 min-1 mg-1 Protein und einem Reinheitsgrad von 90-95% isoliert werden (Abb.

3.5. und Tab. 3.2.). Die bestimmte Restaktivität im Vergleich zur Gesamtaktivität des

Rohextrakts lag bei 28%, der ermittelte Reinigungsfaktor hatte einen Wert von 213.

Kleinere Unterschiede konnten bei der Isolierung der Hydrogenase aus C. moewusii festgestellt

werden. Während der Anionenaustauschchromatographie löste sich das Enzym im Gegensatz zu

HydA1 aus C. reinhardtii bereits ab einem pH-Wert von 7,5 und einer Salzkonzentration von

200 mM KCl von den Q-Sepharose-Säulen. Die Trennung mittels Gelfiltration über Superdex 75

verlief dagegen identisch zu den beiden anderen Enzymen. Im Falle von C. moewusii konnten

insgesamt ca. 300 µg Hydrogenase mit einer spezifischen Aktivität von 1598 µmol H2 min-1 mg-1

Protein, doppelt so hoch wie die von HydA1 aus C. reinhardtii, isoliert werden (Tab. 3.3.). Der

Reinheitsgrad des isolierten Enzyms lag ähnlich wie bei C. submarinum bei 90-95% (Abb. 3.5.).

3. Ergebnisse 35

Abb. 3.5. SDS-PAGE der isolierten

M: Molekulargewichtsmarker, 1: Hy

Die Auftrennung der Proteine erfolg

Tab. 3.2. Übersicht über die Reinig

Gesam [µmo

Gesamtproteinextrakt (8 l) Ammoniumsulfat-Fällung 40-75% 1. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose pH-Gradient 2. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose KCl-Gradient Gelfiltration Superdex 75

Tab. 3.3. Übersicht über die Reinig

Gesam

[µmo Gesamtproteinextrakt (8 l) Ammoniumsulfat-Fällung 40-75% 1. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose pH-Gradient 2. Anionenaustausch- Chromatographie Q-Sepharose KCl-Gradient Gelfiltration Superdex 75

kDa M 1 2

119 79 46 31 24 19

[FeFe]-Hydrogenasen aus C. submarinum und C. moewusii

dA C. submarinum 500 ng, 2: HydA1 C. moewusii 500 ng

te auf einem 15% igen SDS-Gel mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung.

ung der [FeFe]-Hydrogenase HydA aus C. submarinum

taktivität l H2 min-1]

Gesamtprotein [mg]

Menge [%]



3081 1027 100 3 1

1248 156 47 8 3

1160 8 46 145 48

536 2 33 268 89

320 0,5 28 639 213

ung der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. moewusii

taktivität l H2 min-1]

Gesamtprotein [mg]

Menge [%]



2640 240 100 11 1

1728 54 67 32 3

1388 2 58 694 63

574 0,8 28 717 65

479 0,3 23 1598 145

3. Ergebnisse 36

3.1.4. Massenspektrometrische Sequenzanalyse zur Identifizierung der isolierten

HydA-Proteine

Da für C. reinhardtii und C. moewusii in früheren Arbeiten die Existenz von zwei Hydrogenase-

Genen, hydA1 und hydA2, nachgewiesen wurde (Forestier et al. 2003, Winkler et al. 2004),

wurden die isolierten Enzyme zur genauen Identifizierung sequenziert. Dazu wurden die

Proteine gelelektrophoretisch getrennt, mit Trypsin verdaut und die entstandenen Fragmente

anschließend massenspektrometrisch untersucht. Das Ergebnis ist in Abb. 3.6. zu sehen. Im Falle

von C. submarinum konnten drei Peptide identifiziert werden, die wie erwartet eindeutig der

HydA-Sequenz der [FeFe]-Hydrogenase zuzuordnen sind. Bei dem aus C. reinhardtii isolierten

Enzym handelt es sich, wie auch durch Western-Blot gezeigt (Abb. 3.2. und 3.4.), um HydA1. Es

konnten fünf Fragmente bestimmt werden, deren Größe und Sequenz spezifisch für HydA1 ist.

Gleiches gilt für die Hydrogenase aus C. moewusii. Es konnten zwei Peptide nachgewiesen

werden, von denen eins das isolierte Enzym als HydA1 identifiziert. Es wurde somit nur HydA1

aus den Schwefelmangelkulturen isoliert.

Abb. 3.6. Identifizierung der isolierten HydA-Proteine aus C. reinhardtii, C. moewusii und C. submarinum

Die isolierten Proteine wurden mit Trypsin verdaut und die entstandenen Fragmente massenspektrometrisch

untersucht. Die Aminosäuresequenzen der HydA-Proteine wurden mit dem Programm Jalview Java alignment editor

(Clamp et al. 2004) verglichen. Konservierte und homologe Bereiche sind in dunkel- bzw. hellblau markiert. Die

durch die massenspektrometrische Untersuchung identifizierten Sequenzbereiche sind rot gekennzeichnet.

3. Ergebnisse 37

3.2. Biochemische Charakterisierung der isolierten Hydrogenasen

3.2.1. Bestimmung des Temperaturoptimums

Zur genaueren Charakterisierung der isolierten [FeFe]-Hydrogenasen wurde unter anderem die

Temperatursensitivität der Enzyme untersucht. Dabei wurden die Proteine wie unter 2.20.1.

beschrieben jeweils 15 min bei Temperaturen von 20-70°C inkubiert und die Enzymaktivität

anschließend gaschromatographisch über die durch die Enzyme produzierte Wasserstoffmenge

bestimmt. Die Messung zeigte, dass die Aktivität aller Hydrogenasen mit steigender Temperatur

linear zunimmt und bei etwa 60°C ein Maximum erreicht (Daten nicht gezeigt). Ab einer

Temperatur von 70°C sinkt die Aktivität wieder und man misst nur noch ca. 50% der

Maximalaktivität. Dies bestätigt frühere Untersuchungen zu HydA1 aus C. reinhardtii (Roessler

und Lien 1984, Happe et al. 1993) und zeigt, dass die Hydrogenasen aus C. moewusii und

C. submarinum die gleiche hohe Temperaturtoleranz besitzen.

3.2.2. Vergleichende Analyse zur pH-Toleranz der HydA-Proteine

Zur Untersuchung der pH-Toleranz der drei isolierten [FeFe]-Hydrogenasen wurden in vitro-

Aktivitätstests wie unter 2.20.2. beschrieben durchgeführt und die Enzymaktivität wiederum

gaschromatographisch über die durch die Enzyme produzierte Wasserstoffmenge bestimmt. Für

die Aktivitätstests wurden unterschiedliche Reaktionspuffer mit verschiedenen pH-Werten

verwendet. Es wurde ein Bereich von pH 5,5 bis 9 untersucht und für jeden pH-Wert mindestens

zwei unterschiedliche Puffersubstanzen getestet. Das Ergebnis ist in Abb. 3.7. zu sehen.

Alle drei Grünalgen-Hydrogenasen weisen eine hohe pH-Toleranz auf, da im gesamten

untersuchten Bereich Enzymaktivität nachweisbar ist. Das pH-Optimum liegt bei allen drei

Enzymen bei einem pH-Wert von 7. Betrachtet man den gesamten pH-Bereich erkennt man, dass

HydA1 aus C. reinhardtii und HydA1 aus C. moewusii bei allen pH-Werten eine ähnlich hohe

Aktivität aufweisen. HydA aus C. submarinum scheint dagegen etwas aktiver im sauren Bereich

und etwas weniger aktiv im basischen zu sein.

3. Ergebnisse 38

A

B

C

Abb. 3.7. Bestimmung des pH-Optimums von HydA1 aus C. reinhardtii (A), HydA1 aus C. moewusii (B) und

HydA aus C. submarinum (C)

Zur Bestimmung des pH-Optimums wurden in vitro-Aktivitätstests mit unterschiedlichen Reaktionspuffern

durchgeführt. Alle Puffersubstanzen wurden in einer Konzentration von 50 mM angesetzt und mit KCl auf eine

Ionenstärke von 150 mM eingestellt. Die Ansätze wurden jeweils 15 min bei 37°C inkubiert und die gebildete

Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Für jeden Puffer wurden Doppelbestimmungen mit je drei

unterschiedlichen Proteinchargen durchgeführt. Die Standardabweichung betrug < 15%.

3. Ergebnisse 39

3.2.3. Einfluss der Ionenstärke auf die Enzymaktivität

Der Einfluss der Ionenstärke auf die Aktivität der [FeFe]-Hydrogenasen wurde durch eine

Konzentrationsreihe mit steigenden KCl-Konzentrationen untersucht. Zur Bestimmung der

Enzymaktivität wurden in vitro-Aktivitätstests, die jeweils unterschiedliche Salzkonzentrationen

enthielten, durchgeführt. Alle drei Hydrogenasen weisen eine hohe Toleranz gegenüber Salz bis

zu einer Konzentration von 2 M auf (Daten nicht gezeigt). Die Zugabe von Salz steigert bei allen

drei Enzymen die Aktivität um bis zu 50%. HydA1 aus C. reinhardtii und HydA1 aus

C. moewusii weisen ein Aktivitätsmaximum bei einer Salzkonzentration von 1 M KCl auf, die

maximale Aktivität von HydA aus C. submarinum dagegen ist erst bei einer Konzentration von

1,5 M KCl erreicht.

3.2.4. Untersuchung der Sauerstoffsensitivität

[FeFe]-Hydrogenasen sind extrem sauerstoffempfindlich und werden nur unter anaeroben

Bedingungen exprimiert (Forestier et al. 2003). Um zu untersuchen, ob sich die drei isolierten

Hydrogenasen in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff unterscheiden, wurden alle

Enzyme jeweils 15 min in Gegenwart von 2 mM NaDT steigenden Sauerstoffkonzentrationen

ausgesetzt und anschließend die noch vorhandene Enzymaktivität wie bereits beschrieben durch

in vitro-Aktivitätstests gaschromatographisch bestimmt. Das Ergebnis ist in Abb. 3.8. dargestellt.

Wie erwartet sinkt die Aktivität aller drei Hydrogenasen mit steigender Sauerstoffkonzentration

im Testansatz. Dabei zeigen HydA1 aus C. reinhardtii und HydA1 aus C. moewusii eine ähnlich

hohe Sauerstoffempfindlichkeit. Bei einer Konzentration von 2,5% O2 sind bereits nur noch 50%

Enzym aktiv, bei 8% ist keine messbare Aktivität mehr nachweisbar. HydA aus C. submarinum

zeigt dagegen eine deutlich höhere Toleranz gegenüber Sauerstoff. Bei 2,5% O2 sind noch ca.

85% Enzym aktiv, bei 8% sind im Gegensatz zu den Proteinen aus C. reinhardtii und

C. moewusii noch 40% der Ausgangsaktivität vorhanden. Dies stellt zusammen mit der pH-

Toleranz einen weiteren Unterschied dar, der dieses Enzym und den Organismus C. submarinum

besonders interessant für biotechnologische Anwendungen macht.

3. Ergebnisse 40

Abb. 3.8. Sauerstoffsensitiviät von [FeFe]-Hydrogenasen

Die Untersuchung der Sauerstoffsensitivität der [FeFe]-Hydrogenasen wurde wie unter 2.20.4. beschrieben

durchgeführt. Es wurden definierte Mengen O2 in Testansätze mit 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT und

2-15 µl Proteinlösung gespritzt und diese 15 min inkubiert. Anschließend wurden die restlichen Komponenten des

in vitro-Reaktionsansatzes zugegeben und die gebildete Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Es

wurden jeweils Vierfachbestimmungen durchgeführt. Die Standardabweichung betrug < 15%.

3.2.5. Inhibierung der Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid

Neben der hohen Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff ist die Inhibierung von Hydrogenasen

durch Kohlenmonoxid ein wichtiges Charakteristikum dieser Enzymklasse. Die Inhibierung mit

CO ist im Gegensatz zu der irreversiblen Schädigung des H-Clusters durch O2 reversibel. Bei

Begasung der Proteine mit CO bindet dieses als externer Ligand an das Fe(2)-Atom und

blockiert somit vermutlich den H2-Gaskanal (Pierik et al. 1998). Dieser sogenannte Hox-CO-

Zustand ist relativ stabil und bei anderen Hydrogenasen spektroskopisch bereits gut untersucht

(Lemon und Peters 1999, Albracht et al. 2006). Als Grundlage für die durchzuführenden EPR-

und FTIR-Messungen und zur weiteren Charakterisierung der isolierten Grünalgen-

Hydrogenasen wurde in zwei verschiedenen Versuchsreihen die Reaktion der HydA-Proteine mit

CO untersucht.

Im ersten Versuch wurden Testsansätze mit je 1 ml 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT

und 2-15 µl Proteinlösung unterschiedlich lange mit CO begast und anschließend die noch

verbliebene Enzymaktivität gaschromatographisch bestimmt (2.20.5.). Das Ergebnis ist in

Abb. 3.9. A zu sehen. Bei allen drei Hydrogenasen sinkt die Enzymaktivität rapide, sobald sie in

3. Ergebnisse 41

Kontakt mit CO kommen. Bereits nach 2 min CO-Begasung ist bei allen drei Hydrogenasen nur

noch ca. 10% der Ausgangsaktivität nachweisbar, eine vollständige Inhibierung ist nach 20 min

erreicht. Eine 40 minütige Begasung der inhibierten HydA-Proteine mit Wasserstoff und Argon

sowie eine 20 minütige Belichtung bei 200 Watt führt zu einer ca. 5% igen Reaktivierung der

Enzyme. Da die Reaktion mit CO insgesamt sehr schnell abläuft und in diesem Versuchsansatz

keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei HydA-Proteinen festzustellen war, wurde

eine genauere Untersuchung der CO-Sensitivität der Hydrogenasen analog zu der Untersuchung

der Sauerstoffempfindlichkeit durchgeführt.

In einem zweiten Versuchsansatz wurden alle Enzyme jeweils 15 min steigenden CO-

Konzentrationen ausgesetzt und anschließend die noch vorhandene Enzymaktivität im in vitro-

Aktivitätstest bestimmt (Abb. 3.9. B). Dabei zeigte sich, dass HydA1 aus C. moewusii schneller

durch CO inhibiert wird, als HydA1 aus C. reinhardtii und HydA aus C. submarinum. Im

Gegensatz zu HydA1 und HydA, bei denen bei einer CO-Konzentration von 10% noch 50% der

Ursprungsaktivität und bei 37,5% CO noch ca. 15% Aktivität nachweisbar ist, ist bei

C. moewusii bei 6% CO nur noch 15% der Ausgangsaktivität vorhanden. Bei einer

Konzentration von 25% CO im Testansatz ist das Enzym bereits vollständig inhibiert. Dies lässt

auf einen schnelleren Umsatz des Enzyms schließen, was auch die im Gegensatz zu HydA1 aus

C. reinhardtii und HydA aus C. submarinum höhere spezifische Aktivität belegen würde.

3. Ergebnisse 42

A

B Abb. 3.9. Inhibierung von Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid

A Luftdicht verschlossene Testsansätze mit 1 ml 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT und 2-15 µl

Proteinlösung wurden 0-25 min mit CO begast und nach Zugabe der restlichen Komponenten des Reaktionsansatzes

20 min bei 37°C inkubiert. Die gebildete Wasserstoffmenge wurde anschließend gaschromatographisch bestimmt

(2.20.5.).

B Für eine genauere Bestimmung der CO-Sensitivität wurden definierte Mengen CO in anaerob verschlossene

Testansätze mit 60 mM K-Phosphat pH 6,8, 2 mM NaDT und 2-15 µl Proteinlösung gespritzt und diese 15 min

inkubiert. Anschließend wurden die restlichen Komponenten des in vitro-Reaktionsansatzes zugegeben und die

gebildete Wasserstoffmenge gaschromatographisch bestimmt. Es wurden jeweils Vierfachbestimmungen

durchgeführt. Die Standardabweichung betrug < 15%.

3. Ergebnisse 43

3.3. Spektroskopische Untersuchung des H-Clusters 3.3.1. EPR-Spektroskopie

3.3.1.1. Vergleichende Untersuchung der HydA-Proteine

Um erste Hinweise auf die Struktur und die vorliegenden Redoxzustände des H-Clusters der drei

isolierten Hydrogenasen zu erhalten, wurden diese EPR-spektroskopisch untersucht. Da nur die

paramagnetischen Zustände des H-Clusters, Hox-CO und Hox, durch EPR detektierbar sind,

wurden die HydA-Proteine sowohl in der isolierten Form als auch in der CO-inhibierten Form

untersucht. Das Ergebnis ist in Abb.3.10. dargestellt.

Der Hox-CO-Zustand aller drei HydA-Proteine zeigt im EPR-Spektrum das für das H-Cluster von

[FeFe]-Hydrogenasen in diesem Zustand charakteristische axiale EPR-Signal (Abb. 3.10. A, D,

F). Für die isolierte Form erhält man dagegen komplexe Spektren, die eine Mischform aus

rhombischem EPR-Signal, das der oxidierten Form des H-Clusters (Hox) zuzuordnen ist, und

axialem Signal zeigen (Abb. 3.10. B, E, F). Da die Proteine nach der Reinigung oftmals nicht in

homogener Form vorliegen, werden solche Mischsignale häufig beobachtet (Bennet et al. 2000).

Dass auch ein axiales Signal vorliegt, obwohl die isolierte Form nicht mit CO inhibiert wurde,

lässt sich dadurch begründen, dass CO-Liganden von zerstörten Clustern dissoziieren und als

freie CO-Moleküle wiederum intakte Enzyme inhibieren können („Kannibalisationseffekt“)

(Albracht et al. 2006). Dadurch liegt ein kleiner Teil der untersuchten Probe zusätzlich im

Hox-CO-Zustand vor, der im EPR-Spektrum das beschriebene axiale Signal zeigt. Eine Begasung

der isolierten Form aus C. reinhardtii mit Wasserstoff scheint wie auch für DdH aus

D. desulfuricans und CpI aus C. pasteurianum gezeigt (Albracht et al. 2006, Chen et al. 2002)

zum reduzierten Zustand des H-Clusters (Hred) zu führen, welcher wie erwartet diamagnetisch

und somit EPR-silent ist. Man erhält im Spektrum nur ein Rauschsignal (Abb. 3. 10. C).

Allerdings bleibt die Probe im Gegensatz zu DdH nach einer Begasung mit Argon zur

Wiederentfernung des H2 und Überführung in den oxidierten Zustand Hox in diesem Zustand, das

EPR-Signal ändert sich nicht.

3. Ergebnisse 44

EP

R A

mpl

itude

Magnetfeld [mT] Abb. 3.10. Q-Band Puls-EPR-Spektren der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii (A, B, C),

HydA aus C. submarinum (D, E) und HydA1 aus C. moewusii (F)

A HydA1 C. reinhardtii Hox-CO-Zustand, 30 µM in 50 mM Tris-HCl pH 8,5, nach Begasung der isolierten Form

mit CO für 20 min

B HydA1 C. reinhardtii isolierte Form, 100 µM in 50 mM Tris-HCl pH 8,5

C HydA1 C. reinhardtii isolierte Form nach Begasung mit H2 für 20 min und Argon für 35 min

D HydA C. submarinum Hox-CO-Zustand, 100 µM in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM NaDT,

nach Begasung der isolierten Form mit CO für 20 min

E HydA C. submarinum isolierte Form, 100 µM in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM NaDT

F HydA1 C. moewusii Hox-CO-Zustand, 100 µM in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM NaDT,

nach Begasung der isolierten Form mit CO für 20 min

Das Spektrum zeigt zusätzlich eine Simulation des Hox-CO-Zustands (blau) und des Hox-Zustands (rot)

Alle Messungen wurden bei einer Temperatur von 20 K durchgeführt. Über jedem Spektrum sind die dazugehörigen

Werte des g-Tensors angegeben (blau: g-Werte für Hox-CO, rot: g-Werte für Hox).

3. Ergebnisse 45

3.3.1.2. Der Hox-Zustand von HydA1 aus C. reinhardtii

Der Hox-Zustand ist im Gegensatz zum Hox-CO-Zustand direkt in den katalytischen Zyklus

eingebunden und spielt daher eine wichtige Rolle für die Bestimmung der Struktur des

H-Clusters. Den oxidierten Zustand von DdH erhält man durch Begasung der inaktiven oder

reduzierten Form mit Argon (Albracht et al. 2006). Dies trifft allerdings wie bereits gezeigt für

HydA1 nicht zu. Weitere Versuche, das Enzym biochemisch zu oxidieren, schlugen ebenfalls

fehl. Die Zugaben von Ferrocyanid (Razavet et al. 2002) und Thionin, welche erfolgreich als

Oxidationsmittel zur Bildung des Hox-Zustandes bei CpI verwendet wurden (Zambrano et al.

1989, Bennet et al. 2000), zerstörten das aktive Zentrum von HydA1. Auch der Verzicht auf

NaDT im letzten Reinigungsschritt führte nur zu einem partiell oxidierten Zustand. Daher wurde

versucht, den Hox-Zustand durch Photodissoziation des Hox-CO-Zustands zu erhalten. Die

Inhibierung von Hydrogenasen mit CO ist reversibel. Durch Einwirkung von Lichtimpulsen bei

kryogenen Temperaturen löst sich das CO wieder ab (Photodissoziation) und der Hox-CO-

Zustand wird in den aktiven Hox-Zustand überführt (Chen et al. 2002, Albracht et al. 2006). Bei

DdH und CpI kann während dieses Prozesses ein Zwischenzustand (LI2) detektiert werden, der

durch eine reversible, partielle Ablösung des CO-Brückenliganden charakterisiert ist, während

der externe, zu entfernende CO-Ligand noch gebunden ist (Chen et al. 2002, Roseboom et al.

2006).

Das Ergebnis der Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 ist in Abb.3.11. zu sehen.

Das Enzym wurde zunächst mit CO inhibiert und zeigt das für diesen Zustand charakteristische

axiale EPR-Signal (Abb.3.11. A). Durch die anschließende Belichtung löst sich das CO wieder

ab und das EPR-Signal wird rhombisch (Abb.3.11. B). Im Gegensatz zu den bereits bekannten

[FeFe]-Hydrogenasen konnte hierbei kein zusätzlicher Zwischenzustand nachgewiesen werden.

Inkubiert man die Probe nach der Belichtung für 10 min in 200 K kaltem Ethanol erfolgt wieder

eine vollständige Bindung des CO und man erhält wieder Spektrum A.

Tab. 3.4. Überblick über die ermittelten g-Werte

Spezies Hox-CO Hox

C. reinhardtii 2.052 2.007 2.007 2.102 2.040 1.998

C. moewusii 2.052 2.008 2.008 2.103 2.038 1.998

C. submarinum 2.056 2.008 2.008 2.100 2.040 1.998

3. Ergebnisse 46

EP

R A

mpl

itude

Magnetfeld [mT] Abb. 3.11. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei 20 K

A: Hox-CO-Zustand vor Belichtung

B: Hox-CO-Zustand nach Belichtung bei 531 nm für 3 h

Die Abbildung zeigt zusätzlich eine Simulation des Hox-CO-Zustands (blau) und des Hox–Zustands (rot). Über jedem

Spektrum sind die dazugehörigen g-Werte angegeben.

3.3.1.3. ENDOR- und HYSCORE-Analyse des Hox-CO-Zustands von HydA1 C. reinhardtii

Um genauere Hinweise auf die elektronische Struktur des H-Clusters von HydA1 zu erhalten,

wurden die Fe-Atome des H-Clusters mit 57Fe markiert und die Hyperfeinwechselwirkungen der

Fe-Atome im Hox-CO-Zustand von HydA1 untersucht. Dazu wurden die Algen in 57Fe-Medium

angezogen und die Hydrogenase wie beschrieben gereinigt.

Abb. 3.12. zeigt das EPR-Spektrum des 57Fe-angereicherten Enzyms im Hox-CO-Zustand im

Vergleich zum unmarkierten H-Cluster. Man sieht wie bereits beschrieben ein axiales Signal.

Durch die Anreicherung des Enzyms mit 57Fe verbreitert sich das EPR-Signal. Dieser Effekt

wird durch die starken 57Fe-Hyperfeinwechselwirkungen der Fe-Atome hervorgerufen. Um das

Signal besser aufzulösen und die genauen Parameter der Hyperfeinkopplungen zu bestimmen,

wurden anschließend sensitivere ENDOR- und HYSCORE-Messungen durchgeführt.

3. Ergebnisse 47

57Fe-markierte Probe

unmarkierte Probe

g-Wert Abb. 3.12. Q-Band FID-EPR-Spektrum des 57Fe-angereicherten Hox-CO-Zustands (blau) und des

unmarkierten Hox-CO-Zustands (rot) von HydA1

Die Spektren wurden bei einer Temperatur von 20 K, einer Frequenz von 33,80 GHz und tmw = 1 µs aufgenommen.

Die Zahlen 1-3 zeigen die Feldpositionen an, an denen zusätzlich ENDOR- und HYSCORE-Experimente

durchgeführt wurden.

In Abb. 3.13. ist das Q-Band-ENDOR-Spektrum des 57Fe-angereicherten H-Clusters zu sehen.

Im Falle einer starken Hyperfeinwechselwirkung (|A| > |2υ(57Fe)| ) erscheint das ENDOR-Signal

als Duplett (zentriert um |A/2|) und wird durch Verdopplung der Larmor-Frequenz νFe der 57Fe-Kerne (ca. 1,65 MHz bei 1200 mT) geteilt. Im Falle von HydA1 erkennt man im

niedrigeren Frequenzbereich (< 20 MHz) zwei Sets von Dupletts. Die Peaks in den Dupletts

werden durch die Larmor-Frequenz der 57Fe-Kerne geteilt, was zeigt, dass die detektierten

Signale eindeutig von den 57Fe-Kernen stammen. Basierend auf der Simulation, können vier 57Fe-Hyperfeinkopplungen (A1-A4) aufgelöst werden. Die genauen Parameter der

Hyperfeinkopplungen sind in Tabelle 3.5. aufgelistet. Die Spektren zeigen große Ähnlichkeit zu

den ENDOR-Spektren von DdH (Silakov et al. 2007). Daher sind die beobachteten Signale

vermutlich den 57Fe-Kernen des [4Fe-4S]-Clusters des H-Clusters zuzuordnen.

3. Ergebnisse 48

experimentelle Daten Simulation

Frequenz [MHz] Abb. 3.13. Q-Band Davies-ENDOR-Spektren des 57Fe-angereicherten Hox-CO-Zustands

Die Spektren wurden an verschiedenen Feldpositionen aufgenommen (s. Abb. 3.15.). Experimentelle Bedingungen:

Temperatur: 25 K, trf = 30 µs, Magnetfeldstärke: 1 1205,4 mT, 2 1194,0 mT, 3 1180,0 mT. Die Spektren in rot,

orange, grün und schwarz sind Simulationen der einzelnen 57Fe-Hyperfeinkopplungen A1, A2, A3, A4 des 57Fe-HF-

Tensors (s. Tab. 3.5.). Das violette Spektrum stellt die Summe dieser Simulationen dar. Die Sterne markieren

Messartefakte.

Um zusätzlich die Wechselwirkung schwach gekoppelter Kerne zu untersuchen, wurde die

HYSCORE-Technik angewendet, durch die auch der Frequenzbereich unter 5 MHz aufgelöst

werden kann. In einem HYSCORE-Spektrum erscheinen Signale, die zu schwachen

Hyperfeinkopplungen (|A| < |2υ(57Fe)|) gehören, im (++)- bzw. (--)-Quadranten, wohingegen

starke Hyperfeinwechselwirkungen (|A| > |2υ(57Fe)|) im (+-)- bzw. (-+)-Quadranten detektiert

werden. Abb. 3.14. zeigt die Q-Band HYSCORE-Spektren von HydA1. Um alle Parameter der

Hyperfeinkopplungen aufzulösen, wurden Spektren an verschiedenen Feldpositionen

aufgenommen. Es konnten zwei Sets von Signalen beobachtet werden, die den 57Fe-Kernen des

[2Fe]-Subclusters zugeordnet werden können. Ein Set von Crosspeaks (A5) erscheint im

(+-)-Quadranten des HYSCORE-Spektrums, was zeigt, dass eine starke Kopplung vorliegt

(|A'| > |2υ(57Fe)|). Die Form der Crosspeaks und die Tatsache, dass sie bei Verminderung des

Magnetfeldes breiter werden, lässt eine starke dipolare Verteilung vermuten. Simulationen dieser

3. Ergebnisse 49

Crosspeaks zeigen eine anisotrope 57Fe-Hyperfeinkopplung mit rhombischem Charakter. Ein

anderes Set von Peaks (A6) ist im (++)-Quadranten zu finden. Diese Signale gehören zu einem

anderen, schwach gekoppelten 57Fe-Kern (|A'| < |2υ(57Fe)|). Auch diese Signale sind stark von

der Feldposition abhängig, was eine dipolare Natur der 57Fe-Hyperfeinkopplung vermuten lässt.

Die genauen Parameter des 57Fe-Hyperfein-Tensors sind in Tab. 3.5. dargestellt.

Durch die Hyperfeinkopplungen A1-A6 konnten somit alle sechs Fe-Atome im H-Cluster

aufgelöst werden.

Freq

uenz

[MH

z]

Frequenz [MHz] Abb. 3.14. Q-Band HYSCORE-Spektren des 57Fe-angereicherten Hox-CO-Zustands

Die Spektren wurden an verschiedenen Feldpositionen aufgenommen (s. Abb. 3.15.). Experimentelle Bedingungen:

Temperatur: 25 K, Frequenz: 33,81 GHz, tmw(π/2) = 40 ns, Magnetfeldstärke: 1 1205,4 mT, 2 1194,0 mT, 3

1180,0 mT, Verzögerung zwischen den ersten beiden Pulsen (τ): 1 376 ns, 2 352 ns, 3 300 ns. Die schwarzen und

roten Linien repräsentieren die Frequenzen der Crosspeaks, basierend auf einer Simulation mittels der A5 und A6

Hyperfeinkopplungskonstanten.

3. Ergebnisse 50

ext

Abb. 3.15. Schematische Darstellung der Orientierung des 57Fe-Hyperfein-Tensors des H-Clusters im

Hox-CO-Zustand (Silakov et al. 2007)

Die roten Pfeile repräsentieren die Z-Achse des Hyperfein-Tensors, der blaue Pfeil die Ausrichtung des g-Tensors.

Alle sechs Fe-Atome weisen Spindichte auf, die durch elektronische Austausch-Wechselwirkung zwischen den Fe-

Atomen verursacht wird Die Hyperfeinwechselwirkungen des [4Fe-4S]-Clusters werden durch Austausch-

Wechselwirkung zwischen dem Fe1-Atoms des [4Fe-4S]-Clusters und dem Fep-Atom des [2Fe]-Subclusters

hervorgerufen. Bei Bindung von externem CO ist die Elektronenspindichte am Fep lokalisiert, dadurch ist die

Hyperfeinwechselwirkung am Fep-Atom stärker und am Fed-Atom schwächer.

Tab. 3.5. Überblick über die ermittelten Parameter der Hyperfeinwechselwirkungen der 57Fe-Kerne im

Hox-CO-Zustand

Alle Werte sind in [MHz] angegeben. Die Zuordnung erfolgte in Anlehnung an das für DdH erstellte

Spin-Kopplungs-Modell (Abb. 3.15.)

HFK Ax Ay Az Aiso Zuordnung

A1 28.5 25.0 29.2 27.6 [4Fe-4S]HA2 30.3 23.5 30.5 28.0 [4Fe-4S]H

Fe3-Fe4

A3 34.7 34.7 29.9 33.1 [4Fe-4S]HA4 34.5 37.7 30.9 34.3 [4Fe-4S]H

Fe1-Fe2

A5 5.7 2.9 0.4 3.0 [2Fe]H Fep

A6 3.0 3.0 -2.1 1.3 [2Fe]H Fed

3. Ergebnisse 51

3.3.2. FTIR-Spektroskopie

3.3.2.1. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei

kryogenen Temperaturen

Da durch EPR-Spektroskopie nicht alle Redoxzustände des H-Clusters detektiert werden können,

wurde HydA1 aus C. reinhardtii zusätzlich FTIR-spektroskopisch untersucht. Bei einer FTIR-

spektroskopischen Untersuchung von [FeFe]-Hydrogenasen sind im Wellenzahlenbereich von

1800-2100 cm-1 verschiedene Absorptionsbanden zu sehen, die den CN- und CO-Liganden des

H-Clusters zugeordnet werden können.

Hierbei wurde zunächst wieder der für [FeFe]-Hydrogenasen charakteristische Hox-CO-Zustand

untersucht. Vergleicht man das von diesem Zustand aufgenommene FTIR-Spektrum (Abb. 3.16.

A) mit bekannten Spektren von DdH und CpI (Nicolet et al. 2001, Roseboom et al. 2006, Chen

et al. 2002), gehören die Banden bei 2090 cm-1 und 2083 cm-1 zu den CN-Liganden des

proximalen und distalen Fe-Atoms, das Bandenpaar 2013 cm-1 und 1964 cm-1 zu der gekoppelt

auftretenden Streckschwingung des externen und des intrinsischen CO-Liganden des distalen Fe-

Atoms und die Bande bei 1970 cm-1 zu der Schwingung des intrinsischen CO-Liganden des

proximalen Fe-Atoms. Die Bande im niedrigeren Frequenzbereich bei 1807 cm-1 ist dem CO-

Brückenliganden zuzuordnen.

Durch Belichtung bei kryogenen Temperaturen kann der Hox-CO-Zustand im Gegensatz zu den

bisherigen EPR-Experimenten vollständig in den aktiven oxidierten Zustand Hox überführt

werden, der das für diesen Redoxzustand charakteristische Bandenmuster zeigt (Abb. 3.16. D).

Dabei tritt nach 2 min Belichtung ein Zwischenzustand auf. Ein solcher Zwischenzustand

während der Photodissoziation ist wie bereits erwähnt auch für andere [FeFe]-Hydrogenasen

beschrieben und durch eine reversible, partielle Ablösung des CO-Brückenliganden

charakterisiert (Pierik et al. 1998, Roseboom et al. 2006) (Abb. 3.16. B und C). Im

Differenzspektrum (Abb. 3.16. C) erscheinen sechs neue Banden (gelb) zusätzlich zu einer

Bande des Hox-Zustands (blau). Im Gegensatz zum Hox-CO-Zustand sind die CN-Banden stark

zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben, was zeigt, dass sich die Geometrie des dinuklearen

Clusters während der Photodissoziation stark ändert. Dies wird wahrscheinlich durch eine

Änderung der Bindung des CO-Brückenliganden verursacht, allerdings zeigt die Bande bei

1817 cm-1, dass dieser nicht dissoziiert ist. Die Bestimmung von vier CO-Streckschwingungen

lässt zudem den Schluss zu, dass im LI2-Zustand dieselbe Anzahl CO-Liganden vorhanden ist

wie im CO-inhibierten Zustand. Daher ist anzunehmen, dass der LI2-Zustand eine Art

3. Ergebnisse 52

Hox-CO-Zustand mit veränderter Geometrie darstellt und aufgrund dessen der Übergang

Hox-CO/LI2 so schnell stattfindet, dass er durch EPR-Spektroskopie nicht nachweisbar war.

Im Hox-Zustand (Abb. 3.16. D) sind drei Banden im Bereich der CN-Liganden, zwei Banden im

Bereich der terminalen CO-Liganden und eine Bande im Bereich der CO-Brücke zu sehen, was

zeigt, dass eine Ablösung des externen, inhibierenden CO-Liganden stattgefunden hat. Da sich

die Koordination des proximalen Fe-Atoms bei der Dissoziation des externen CO-Liganden vom

distalen Fe-Atom nicht ändert, dürfte die Bande bei 2091 cm-1 wie im Hox-CO-Zustand dem

proximalen CN-Liganden und die Bande bei 1966 cm-1 trotz leichter Verschiebung dem

proximalen CO-Liganden zuzuordnen sein. Die Bande bei 1940 cm-1 ist demnach die

Schwingung des distalen CO-Liganden. Für CNd könnten zwei Banden, bei 2079 cm-1 und

2073 cm-1, in Frage kommen. Da die Bande des distalen CO-Liganden eine kleine Schulter in

Richtung 1935 cm-1 aufweist, könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass zwei verschiedene

Konformationen des distalen Fe-Atoms vorliegen, was dazu führt, dass sich die CN und CO-

Liganden aufsplitten. Da dies aber bei der EPR-spektroskopischen Untersuchung der

Hydrogenase nicht nachweisbar war, ist zu vermuten, dass diese Konformationsabweichung nur

geringen oder keinen Einfluss auf die Gesamtstruktur des H-Clusters hat.

Im Hox-CO-Zustand scheint die Schwingung des COp wie bei DdH vermutet mit der Schwingung

COd/COext gekoppelt zu sein, da sich die Bande von 1970 cm-1 zu 1966 cm-1 verschoben hat. Ob

dies auch im Hox-Zustand der Fall ist, ist im Spektrum nicht sichtbar. Eine Bestätigung der

richtigen Zuordnung der Absorptionsbanden und Aufschluss über eine solche mögliche

Kopplung kann durch eine isotopische Markierung der CO-Liganden mit 13C gegeben werden,

die im nachfolgenden Versuch gezeigt ist.

3.3.2.2. Isotopenmarkierung der CO-Liganden des H-Clusters mit 13C

Für eine Markierung mit 13C wurde die isolierte Form statt mit CO mit 13CO begast (Abb. 3.17.,

1B). Da durch eine Begasung mit CO der Hox-CO-Zustand entsteht, erwartet man in diesem Fall

die Bildung eines Hox-CO-Zustands, bei dem der externe CO-Ligand markiert ist (Hox-13CO).

Aufgrund der Isotopenmarkierung verschieben sich die CO-Banden im FTIR-Spektrum im

Gegensatz zum normalen Hox-CO-Zustand (Abb. 3.17., 1A) in Abhängigkeit von der reduzierten

Masse des 13CO. Der erwartete Bandenshift lässt sich durch die Teller-Redlich-Produktregel

berechnen:

3. Ergebnisse 53

Abb. 3.16. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei 40 K

A Hox-CO-Zustand, 300 µM in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM NaDT nach Begasung der

isolierten Form mit CO für 20 min

B Hox-CO-Zustand nach Belichtung innerhalb des FTIR-Setups für 2 min (LI2)

C Differenzspektrum A/B: gelb: Banden des Zwischenzustands LI2, blau: Banden des Hox-Zustands

D Hox-CO-Zustand nach Belichtung für 1 h (Hox), nach Inkubation bei 150 K im Dunkeln wird das abgelöste CO

wieder gebunden und man erhält wieder Spektrum A

Π ωi*

= µ n/2 ωi und ωi

*: Schwingungsfrequenz der nicht markierten und n-Mal markierten Moleküle i ωi

µ* µ und µ*: reduzierte Masse der nicht markierten und markierten CO-Gruppen

Für einen einzelnen 12CO/13CO-Austausch (n = 1) kann man den rechten Teil der Gleichung wie

folgt auflösen:

µ 1/2 = 1/16 + 1/13 1/2 = 0,9777

µ* 1/16 + 1/12

Wellenzahl [cm-1]

Da die Bande 2013 cm-1 zu 1992 cm-1 shiftet, kann der Shift der anderen Bande (1964 cm-1)

berechnet werden, da die Schwingung gekoppelt ist:

3. Ergebnisse 54

Π ωi*

= 1992 * x = 0,9777 => x = 1940,6 cm-1

i ωi 2013 * 1964

Im Spektrum 1B ist eine Bande bei 1944 cm-1 zu sehen, was nahezu mit dem berechneten Wert

übereinstimmt. Es handelt sich also eindeutig um die gekoppelte Schwingung COd/COext. Die

Bande bei 1967 cm-1 ist somit wieder dem proximalen CO-Liganden zuzuordnen. Allerdings ist

diese ebenfalls im Gegensatz zum Hox-CO-Zustand um - 3 cm-1 verschoben, was zeigt, dass

diese Schwingung wie schon vermutet nicht unabhängig von der COd/COext-Schwingung ist.

Bezieht man diesen Umstand in die Berechnung mit ein, erhält man für die COd/COext-

Schwingung einen Wert, der exakt mit dem Messwert im Spektrum übereinstimmt:

Π ωi*

= 1992 * 1967 * x = 0,9777 => x = 1943,8 cm-1

i ωi 2013 * 1970 * 1964

Zusätzlich zu den bisher beschriebenen, erwarteten Banden des Hox-13CO-Zustands sind zwei

weitere Banden im Bereich der terminalen CO-Liganden zu sehen (1923 cm-1 und 1985 cm-1),

die nicht eindeutig zugeordnet werden können. Eine mögliche Kontamination mit 13C18O durch

das verwendete 13CO kann ausgeschlossen werden, da eine Markierung der CO-Liganden mit 13C18O zu einer anderen Verschiebung der Banden als im Spektrum zu sehen führen würde.

Der Hox-13CO-Zustand wurde anschließend 1 h bei 200 K belichtet. Der resultierende Zustand ist

der Hox-(13CO)3-Zustand (Abb. 3.17., 1C). Neben den verbliebenen Banden des Hox-13CO-

Zustands erscheinen im Spektrum zwei neue Banden bei 1969 cm-1 und 1928/1920 cm-1, die im

Vergleich zu den entsprechenden Banden des Hox-13CO-Zustands um - 21 cm-1 und zu denen des

Hox-CO-Zustands um - 42 cm-1 verschoben sind. Das bedeutet, dass sowohl COext als auch COd

isotopisch markiert sind. Zusätzlich erkennt man auch Banden des Hox-CO-Zustands (2013 cm-1

und 1964 cm-1). Dies lässt sich dadurch erklären, dass bei einer Belichtung bei 200 K

CO-Liganden ausgetauscht werden können (Roseboom et al. 2006). Wie beschrieben ist die

Schwingung von COd und COext gekoppelt und die von CObr unabhängig. Werden 13COext und

CObr ausgetauscht, würden die Banden der Schwingung COd/COext wieder bei derselben

Wellenzahl detektiert werden wie beim Hox-CO-Zustand, da als externer Ligand wieder

unmarkiertes CO vorliegt. Der CO-Brückenligand dagegen müsste aufgrund der

Isotopenmarkierung in die Region < 1800 cm-1 shiften, was allerdings nicht zu sehen ist, da die

verwendete Küvette eine Nachweisgrenze von 1800 cm-1 hat. Ebenso möglich wäre eine

zusätzliche Markierung des proximalen CO-Liganden mit 13C, was eine daraus resultierende

Bande bei 1926 cm-1 zur Folge hätte. Dies wird allerdings im Spektrum nicht vollständig

3. Ergebnisse 55

aufgelöst. Es ist daher zu vermuten, dass bei einer Belichtung des Hox-13CO-Zustands bei 200 K

ein Austausch der CO-Liganden stattfindet und so alle CO-Liganden mit 13C markiert werden.

Dies wird im weiteren Verlauf des Experiments durch Belichtung des Hox-(13CO)3-Zustands für

1 h bei 40 K bestätigt (Abb. 3.17., 2C).

Eine Belichtung des Hox-13CO-Zustands bei 40 K sollte wie auch in Abb. 3.16. bei Hox-CO

gezeigt zu einer Ablösung des externen 13CO führen. Der resultierende Zustand wäre wiederum

Hox (Abb. 3.17., 2A und B). Dies konnte auch durch die Messung bestätigt werden. Allerdings

sind zusätzlich zu den Banden des Hox-Zustands zwei weitere Banden bei 1955 cm-1 und

1909 cm-1 zu sehen, die sich durch partielles Labelling der CO-Liganden aufgrund des

Ligandenaustauschs während der Belichtung, wie schon bei 200 K gezeigt, erklären lassen. Eine

Markierung von CObr würde die entsprechende Bande von ca. 1800 cm-1 zu 1768 cm-1

verschieben ohne die anderen Schwingungen zu beeinflussen. Da diese aber ebenfalls

verschoben sind, sind vermutlich COd und/oder COp isotopisch markiert. Wären die beiden

Schwingungen unabhängig voneinander, würde die Markierung eines der beiden Liganden die

zugehörige Bande um - 42 cm-1 verschieben. Da aber nur ein Shift von ca. - 21 cm-1 zu sehen ist,

müssen die Schwingungen gekoppelt sein. Durch die Produktregel kann der Shift der einen

Bande berechnet werden, wenn der Shift der anderen bekannt ist. Unter der Annahme, dass sich

die Bande bei 1940 cm-1 durch eine 13C-Markierung des CO-Liganden zu einer Frequenz von

1909 cm-1 verschiebt, verschiebt sich die Bande bei 1966 cm-1 bei einer Kopplung der

Schwingung zu 1953,5 cm-1, was im Spektrum zu sehen ist.

Π ωi*

= 1909 * x = 0,9777 => x = 1953,5 cm-1

i ωi 1940 * 1966

Es liegt somit eine Mischung aus Hox und einem Hox-Zustand vor, bei dem COp oder COd 13C

markiert ist, wobei eine 13COd-Markierung wahrscheinlicher ist, da dies auch schon beim

Hox-(13CO)3-Zustand der Fall war. Nach Erwärmen der Probe auf 200 K und Inkubation für1 h

im Dunkeln bindet das 13CO wieder und man erhält den Ausgangszustand Hox-13CO, was zeigt,

dass alle detektierten Absorptionsbanden zu intaktem Cluster gehören.

Das Spektrum, das man nach Belichtung des Hox-(13CO)3 erhält (Abb.3.17., 2C) ist ebenfalls eine

Art Hox-Zustand, zeigt aber einige Unterschiede. Es sind Banden des nicht markierten Hox sowie

des markierten vorhanden (vgl. Abb.3.17., 2A und B). Zusätzlich erscheinen jedoch zwei weitere

Banden bei 1923 cm-1 und 1896 cm-1. Beide sind ca. - 43 cm-1 vom Bandenpaar 1966/1940 cm-1

entfernt, was bedeutet, dass beide terminalen CO-Liganden 13C markiert sind. Dies wird, unter

3. Ergebnisse 56

der Annahme, dass sich die Bande bei 1940 cm-1 aufgrund des Doppellabellings (13COp/ 13COd,

daher n=2) zu 1896 cm-1 verschiebt, durch die Kalkulation

Π ωi*

= 1896 * x = 0,97772 => x = 1923 cm

-1

i ωi 1940 * 1966

bestätigt. Das Aufwärmen der Probe auf 200 K und eine einstündige Inkubation im Dunkeln

führt anschließend wieder zum Ausgangszustand Hox-(13CO)3.

3.3.2.3. Untersuchung der reduzierten Zustände des H-Clusters

Wie in Abb. 3.18. B zu sehen liegt die Hydrogenase nach der Isolierung in einem Gemisch

oxidiert/reduziert vor. Das Spektrum zeigt Banden des Hox-Zustands (1966 cm-1 und 1940 cm-1)

und Banden, die aufgrund der Ähnlichkeit zu DdH in dieser Form vermutlich dem reduzierten

Zustand Hred zuzuordnen sind, wobei die Bande bei 1888 cm-1 die Schwingung des CObr, die bei

1920 cm-1 die von COd und die bei 1965 cm-1 die von COp darstellen könnte. Die Zuordnung der

CN-Liganden ist schwieriger. Bei DdH ist die Bande im Frequenzbereich von 2041 cm-1 dem

CN-Liganden des distalen Fe-Atoms zuzuordnen, welche sich bei Reduktion der Probe von

2082 cm-1 zu 2041 cm-1 verschiebt, da sich die Oxidationsstufe des distalen Fe-Atoms ändert. In

diesem Spektrum ist eine Bande bei 2028 cm-1 zu sehen, die dieser Schwingung zugeordnet

werden könnte. Eine weitere auffällige Bande ist im Bereich 1931 cm-1 zu sehen, kann aber nicht

zugeordnet werden. Der detektierte reduzierte Zustand ist EPR-silent und hat vermutlich die

Fe-Konfiguration Fe(I)-Fe(I). Im Gegensatz zu den zuvor durchgeführten EPR-Messungen sind

im Spektrum keine auffälligen Banden des Hox-CO-Zustands zu sehen, daher liegt dieser Zustand

vermutlich in so geringem Anteil vor, dass er nicht nachweisbar ist.

Bei DdH führt eine Begasung mit H2 zu einem einzigen klaren reduzierten Zustand (Roseboom

et al. 2006). Die reduzierte, H2-begaste Probe von HydA1 dagegen zeigt ein kompliziertes

Spektrum, in dem insbesondere im Bereich der Schwingungen der CO-Liganden doppelt so viele

Banden vorhanden sind als für einen Einzelzustand zu erwarten wäre (Abb. 3.18. C). Außerdem

sind die Banden im Gegensatz zum in der isolierten Probe detektierten Hred leicht verschoben.

Auch die Bande bei 2028 cm-1 scheint sich in zwei Banden, 2032 cm-1 und 2026 cm-1,

aufzusplitten. Daher sind im reduzierten Zustand höchstwahrscheinlich zwei untereinander und

im Vergleich zu DdH und CpI recht ähnliche Zwischenzustände vorhanden, die durch den

3. Ergebnisse 57

1

Wellenzahl [cm-1]

2

Wellenzahl [cm-1]

Abb. 3.17. Isotopenmarkierung der CO-Liganden mit 13C

1: A Hox-CO-Zustand, 300 µM, nach Begasung der isolierten Form mit CO für 20 min

B Hox-13CO-Zustand, 300 µM, nach Begasung der isolierten Form mit 13CO für 20 min

C Hox-13CO-Zustand nach Belichtung für 1 h bei 200 K (Hox-(13CO)3)

2: A Hox-Zustand, nach Belichtung des Hox-CO-Zustands für 1 h bei 40 K

B Hox-13CO-Zustand nach Belichtung für 1 h bei 40 K

C Belichtung von Hox-(13CO)3 für 1 h bei 40 K

Alle Spektren wurden bei einer Temperatur von 40 K aufgenommen

3. Ergebnisse 58

katalytischen Zyklus im H-Cluster zu begründen sind und wahrscheinlich, da sie mittels EPR

nicht nachweisbar sind, wie DdH und CpI die Fe-Konfiguration Fe(I)-Fe(I) besitzen.

Ein weiterer Versuch, einen klaren Einzelzustand Hred zu erhalten, war die Zugabe von NaDT zu

der isolierten Probe (Abb. 3.18. D). Dies resultierte in einem Spektrum, in dem ungefähr neun

Banden in der Region unter 2000 cm-1 zu sehen sind, die kaum Ähnlichkeit mit den Banden der

vorigen Spektren aufweisen und daher nicht interpretiert werden können. Für einen

Einzelzustand wäre die maximale Anzahl an Banden im Bereich der CO-Schwingungen gleich

der Anzahl an CO-Liganden am dinuklearen Cluster, also für den Hox- und Hred-Zustand drei und

für den Hox-CO-Zustand vier Banden. Daher ist zu vermuten, dass hier drei verschiedene

Zustände vorliegen, unter anderem vielleicht eine Art superreduzierter Zustand wie bei

Roseboom et al. (2006) beschrieben.

Alle Proben lassen sich durch Begasung mit CO vollständig in den Hox-CO-Zustand überführen,

was zeigt, dass alle detektierten Banden und Zwischenformen zu intaktem Cluster gehören.

Wellenzahl [cm-1]

Abb. 3.18. FTIR-Spektren der isolierten und reduzierten Form von HydA1 aus C. reinhardtii A Hox-Zustand, nach Belichtung von Hox-CO für 1 h

B isolierte Form, 300 µM in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2 mM NaDT

C isolierte Form nach Begasung mit H2 für 20 min

D isolierte Form nach Zugabe von 40 mM NaDT

Alle Spektren wurden bei einer Temperatur von 40 K aufgenommen.

3. Ergebnisse 59

3.3.2.4. Spektroelektrochemie an HydA1 aus C. reinhardtii

Um die einzelnen Redoxzustände des H-Clusters, insbesondere die reduzierten Zustände,

genauer aufzulösen, wurde HydA1 im nachfolgenden Versuch spektroelektrochemisch

untersucht. Dazu wurden in einem Potentialbereich von - 510 mV bis 100 mV FTIR-Spektren

aufgenommen und die spektrale Veränderung des H-Clusters während der Redoxübergänge in

Abhängigkeit von der angelegten Spannung beobachtet. Das Ergebnis ist in den folgenden

Abbildungen (3.19. und 3.20.) dargestellt.

Bei Anlegen eines Potentials von - 260 mV befindet sich das H-Cluster im oxidierten Zustand

Hox, zusätzlich ist noch eine Bande des Hox-CO-Zustands zu sehen (2013 cm-1) (Abb. 3.20. B).

Erniedrigt man das Potential, verschwinden die Hox-Banden und man erhält den reduzierten

Zustand Hred1 mit den Banden 1935 cm-1, 1890 cm-1 und 1793 cm-1. Die Banden, die den CN-

Liganden zuzuordnen sind, werden im Spektrum nicht gut aufgelöst, befinden sich nach

Auswertung des Differenzspektrums aber bei ca. 2083 cm-1 und 2054 cm-1. Der Shift eines der

CN-Liganden zu 2054 cm-1 verdeutlicht, dass beim Übergang Hox/Hred1 eines der beiden

Fe-Atome reduziert wurde. Eine Reduktion der Fe-Atome führt zu einer Elektronenanreicherung

dieser. Dadurch verstärkt sich die Fe-CO-Bindung und die entsprechende

CO-CN-Schwingungsfrequenz wird kleiner. Dieser Effekt kann für alle Banden im Falle des

Hox/Hred1-Übergangs beobachtet werden.

Bei weiterer Erniedrigung des Potentials auf - 510 mV verschwinden die Banden des Hred1 und

neue (2030 cm-1, 2008 cm-1, 1955 cm-1, 1920 cm-1 und 1883 cm-1) erscheinen, die einem zweiten

reduzierten Zustand Hred2 zugeordnet werden. Da im Frequenzbereich 1800 cm-1 keine Bande zu

sehen ist, dafür aber bei 1955 cm-1 eine erscheint, ist zu vermuten, dass der CO-Brückenligand

dissoziiert und im Hred2-Zustand terminal am Fe-Atom gebunden vorliegt. Die Banden bei

2030 cm-1 und 2008 cm-1 gehören vermutlich wieder zu den CN-Liganden. Dass diese im

Vergleich zu Hred1 noch weiter verschoben sind und auch die Banden der beiden anderen

CO-Liganden um ca. - 10 cm-1 verschoben sind, untermauert die Annahme, dass eine

Konformationsänderung des CO-Brückenliganden stattgefunden hat. Die Banden des Hox-CO-

Zustands nehmen während der Reduktion gleichermaßen mit den Banden des Hox-Zustands ab.

Im Anschluss an die Reduktion wurde das Potential erhöht und die Probe wieder oxidiert, wobei

das exakte Erscheinen und Verschwinden von Banden wie bei der Reduktion in umgekehrter

Reihenfolge beobachtet werden konnte.

Bei einem Potential von - 100 mV verschwinden die Banden des Hox-Zustands und andere

erscheinen. Dieser Zustand könnte eine Art überoxidierter Zustand mit der Fe-Konfiguration

Fe(II)-Fe(II) sein, in dem das Enzym inaktiv vorliegt.

3. Ergebnisse 60

A

B

Abb. 3.19. Dreidimensionale Darstellung der Änderung der Absorptionsbanden während der

elektrochemischen Reduktion (A) und Oxidation (B) des H-Clusters von HydA1

A elektrochemische Reduktion in 25-50 mV-Schritten ausgehend von einem Initialpotential von - 260 mV

bei 4°C und pH 7,5 (1000 Scans)

B elektrochemische Oxidation in 25-50 mV-Schritten ausgehend von einem Initialpotential von - 510 mV

bei 4°C und pH 7,5 (2000 Scans)

3. Ergebnisse 61

Abb. 3.20. Ausgewählte FTIR-Spektren bei verschiedenen Potentialen während der elektrochemischen

Reduktion und Oxidation des H-Clusters von HydA1

A überoxidierter Zustand Hsox und Hox-CO-Zustand (die Banden des Hox-CO-Zustands sind hervorgehoben)

B Hox-Zustand

C reduzierter Zustand Hred1

D reduzierter Zustand Hred2

Die Probe wurde zunächst ausgehend von einem Initialpotential von - 260 mV reduziert (blau) und anschließend

wieder oxidiert (rot). Alle Spektren wurden bei einer Temperatur von 4°C aufgenommen. Die Konzentration der

eingesetzten Probe betrug ca. 200 µM in 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 2mM NaDT.

Die Intensität der Hred2-Banden war während der Oxidation genauso stark wie bei der Reduktion.

Die Signale von Hred1 und Hox dagegen waren etwas kleiner und die Signale des

Hox-CO-Zustands nahmen, gerade auch beim überoxidierten Zustand, weiter zu. Dies zeigt, dass

Teile der Probe während des Experiments durch die Behandlung zerstört werden

(„Kannibalisationseffekt“, Albracht et al. 2006) und könnte zudem ein Zeichen dafür sein, dass

der vollständig reduzierte Zustand Hred2 bei 4°C stabiler ist als Hred1 und Hox.

Im Anschluss an die potentiometrische Titration wurden durch Analyse und Auswertung der

Intensität der für den jeweiligen Zustand charakteristischen CO-Banden die

Mittelpunktspotentiale für den Übergang von einem Redoxzustand in den nächsten ermittelt.

3. Ergebnisse 62

Dabei wurde für den Übergang Hox/Hred1 ein Redoxpotential von - 400 mV und für den

Übergang Hred1/Hred2 ein Potential von - 455 mV bestimmt (Abb. 3.21.).

Abb. 3.21. Intensität charakteristischer CO-Banden bei der elektrochemischen Reduktion und Oxidation

Die Änderungen in der Intensität der Absorptionsbanden während der potentiometrischen Reduktion bzw. Oxidation

bei 4°C und pH 7,5 wurden mit Hilfe der Nernst-Gleichung für einen Elektronenübergang (n=1) ausgewertet. Dabei

wurde für den Übergang Hox/Hred1 ein Mittelpunktspotential von - 400 mV(vs. NHE) und für Hred1/Hred2 ein Potential

von - 455 mV bestimmt. Bei beiden Richtungen der Titration wurden die gleichen Potentiale ermittelt. Für den

Übergang Hox/Hsox konnte kein Redoxpotential bestimmt werden, da die Intensität der Banden für den Hsox-Zustand

nicht der Nernst-Gleichung folgte. Die leeren Kreise stellen die Bandenintensität bei der Oxidation dar, ausfüllte

Kreise die Reduktion.

Tab. 3.6. Überblick über die detektierten FTIR-Banden

Alle Werte sind in [cm-1] angegeben.

Zustand CNp CNd COp COd - COext CObr Hsox 2106 2093 2047 2033 1910 Hox 2091 2076 1966 1940 1799 Hox-CO 2090 2083 1970 2013 1964 1810 Hred1 2083 2054 1935 1890 1793 Hred2 2030 2008 1920 1883 1955 Hox-13CO 2090 2083 1967 1992 1944 1810

Hox-(13CO)3 2090 2083 1964 1967 1970

1969 19281992 1944 2013 1964

1810

4. Diskussion 63

4. Diskussion Primäres Ziel der Arbeit war die Expression, Reinigung und strukturelle Charakterisierung der

[FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii. Dazu sollte zunächst ein neues Expressions- und

Reinigungssystem für HydA1 etabliert und anschließend eine erste strukturelle Untersuchung

des katalytisch aktiven Zentrums mittels EPR- und FTIR-Spektroskopie durchgeführt werden.

Vergleichend zu HydA1 aus C. reinhardtii wurden dabei zusätzlich die Hydrogenasen HydA1

aus C. moewusii und HydA aus C. submarinum untersucht.

4.1. Expression und Reinigung der [FeFe]-Hydrogenasen aus C. reinhardtii, C. moewusii

und C. submarinum

4.1.1. Verbesserte Expression der HydA-Proteine unter Schwefelmangel

Das in früheren Arbeiten verwendete Verfahren der anaeroben Adaptation zur Induktion der

Hydrogenase-Expression führte zu vergleichsweise niedrigen Expressionsraten und

infolgedessen zu geringen Proteinausbeuten. Daher war eine biochemische Charakterisierung

von Grünalgen-Hydrogenasen nur partiell und eine strukturelle Untersuchung bisher nicht

möglich (Happe et al. 1993, Ueno et al. 1999, Florin et al. 2001, Winkler et al. 2002). Eine

heterologe Expression von Grünalgen-Hydrogenasen in Escherichia coli und Clostridium

acetobutylicum führte zu inaktivem Apoprotein oder zu Protein mit, im Gegensatz zu homolog

exprimierter Hydrogenase, geringerer spezifischer Aktivität (Girbal et al. 2005, King et al.

2006). Daher sollte HydA1 im Hinblick auf die strukturelle Untersuchung des H-Clusters in

nativer Form direkt aus C. reinhardtii isoliert werden.

Zur Verbesserung der Expressionsrate von HydA1 wurde in dieser Arbeit ein neues System, bei

dem Schwefelmangel zur Induktion der Hydrogenase-Expression verwendet wird (Melis et al.

2000, Laurinavichene et al. 2002), angewandt und so modifiziert, dass eine direkte Kultivierung

der Algen in selbstentschwefelndem Medium möglich war, wodurch die Gefahr der

Kontaminationen beim Mediumswechsel, die benötigte Mediumsmenge und der Zeitaufwand

verringert werden konnten (3.1.1.). Die Expressionsrate von HydA1 aus C. reinhardtii konnte

dadurch im Vergleich zu einer anaerob induzierten Kultur erheblich gesteigert (Abb. 3.2.) und

die maximal messbare in vitro-Hydrogenaseaktivität um das 25-fache erhöht werden (Abb. 3.1.).

4. Diskussion 64

Zusätzlich war es dadurch möglich, erstmals auch die Hydrogenasen aus den Grünalgenstämmen

C. moewusii und C. submarinum in vergleichbar großer Menge zu exprimieren (Abb. 3.1.).

4.1.2. Das neue Reinigungsprotokoll für HydA1

Aufbauend auf das verbesserte Expressionssystem wurde ein neues Reinigungsverfahren für

HydA1 aus C. reinhardtii etabliert, das weitestgehend auf die Hydrogenasen von C. moewusii

und C. submarinum übertragen werden konnte und somit universell für die Isolierung von

[FeFe]-Hydrogenasen aus Grünalgen ist (3.1.2. und 3.1.3.). Das entwickelte Reinigungsprotokoll

besteht aus einer Ammoniumsulfatfällung gefolgt von drei aufeinanderfolgenden

säulenchromatographischen Trennschritten (Abb. 3.3.) und ist damit im Gegensatz zu bisher

beschriebenen, recht komplizierten Reinigungsvorschriften (Happe et al. 1993, Ueno et al. 1999)

bedeutend kürzer und effektiver. Aus 8 l Schwefelmangelkultur konnten durchschnittlich 500 µg

Hydrogenase mit hoher spezifischer Aktivität, im Falle von HydA1 aus C. moewusii mit

1598 µmol H2 min-1 mg-1 Protein sogar doppelt so hoch wie die von HydA1 aus C. reinhardtii,

isoliert werden (Tab. 3.1., 3.2. und 3.3.). Dies ist eine 40-fach höhere Proteinausbeute im

Vergleich zu früheren Arbeiten (Happe et al. 1993) und nur etwa 50% weniger, als durch die

Überexpression von mit einem StrepTag erweiterten HydA1 in C. acetobutylicum (Girbal et al.

2005) gewonnen werden konnte.

4.2. Die hohe Toleranz der HydA-Proteine gegenüber biochemischen Einflüssen

Durch die in dieser Arbeit isolierten Proteinmengen war es erstmals möglich, die

[FeFe]-Hydrogenasen aus C. reinhardtii, C. moewusii und C. submarinum sowohl biochemisch

als auch strukturell zu charakterisieren. Dabei zeigte sich, dass alle drei HydA-Proteine eine

große Toleranz gegenüber biochemischen Einflüssen wie Temperatur, pH-Wert oder hoher

Ionenstärke zeigen (3.2.).

Alle drei Enzyme haben ein Temperaturoptimum von etwa 60°C und sind in einem pH-Bereich

von pH 5,5-9,0 mit einem Optimum bei pH 7 aktiv. Dabei sind für die Hydrogenasen aus

C. reinhardtii und C. moewusii im gesamten pH-Bereich vergleichbare Enzymaktivitäten

messbar, HydA aus C. submarinum scheint dagegen etwas aktiver im sauren und etwas weniger

aktiv im basischen Bereich zu sein (Abb. 3.7.). Ähnliches konnte auch in früheren Arbeiten für

4. Diskussion 65

die Hydrogenasen aus Chlorococcum littorale (Ueno et al. 1999), Chlorella fusca (Winkler et al.

2002) Scenedesmus obliquus (Florin et al. 2001) und CpI aus C. pasteurianum (Adams und

Mortenson 1984) gezeigt werden.

Zusätzlich wurde, wie auch für bakterielle [FeFe]-Hydrogenasen beschrieben (van Dijk et al.

1980), festgestellt, dass hohe Salzkonzentrationen einen positiven Effekt auf die Enzymaktivität

haben, wenn reduziertes Methylviologen als Elektronendonor verwendet wird (3.2.3.). Bei der

Untersuchung des Einflusses der Ionenstärke auf die Enzymaktivität wurde für die

Hydrogenasen aus C. reinhardtii und C. moewusii ein Aktivitätsmaximum bei einer

Konzentration von 1 M KCl und für C. submarinum von 1,5 M KCl im Reaktionspuffer

bestimmt. Die untersuchten HydA-Proteine sind somit sehr tolerant in Bezug auf hohe

Ionenstärken, allerdings verringert sich die Aktivität in Gegenwart des natürlichen

Elektronendonors Ferredoxin, da die hohe Salzkonzentration vermutlich die elektrostatischen

Wechselwirkungen zwischen Hydrogenase und Ferredoxin stört (Roessler und Lien 1982).

Die allgemein ungewöhnlich hohe Toleranz von Grünalgen-Hydrogenasen gegenüber

biochemischen Einflüssen untermauert ihre entscheidende Rolle als Stressprotein bei der

Umstellung des Stoffwechsels der Alge auf einen photofermentativen Wasserstoffmetabolismus

unter Anaerobiose. C. submarinum kann im Gegensatz zu C. reinhardtii und C. moewusii in

Medien mit hohen Salzkonzentrationen kultiviert werden (Blackwell und Gilmour 1991), was

das Risiko von Kontaminationen vermindert. Die höhere Salztoleranz von HydA könnte ebenso

wie die hohe pH-Toleranz durch den natürlichen Lebensraum der Alge begründet sein.

Brackwasser unterliegt im Vergleich zu reinen Süß- und Salzwassergewässern größeren

Schwankungen sowohl im pH-Wert als auch in der Salzkonzentration. Durch die höhere

Toleranz gerade gegenüber diesen Einflüssen könnte C. submarinum einen Vorteil in vivo

aufweisen und ist deshalb für eine biotechnologische Anwendung besonders interessant.

4.3. Untersuchung der O2-und CO-Sensitivität: Die hohe O2-Toleranz von HydA aus

C. submarinum

Eine weitere charakteristische Eigenschaft von [FeFe]-Hydrogenasen ist ihre hohe

Sauerstoffsensitivität und die Inhibierung durch Kohlenmonoxid. Die Inhibierung mit CO ist im

Gegensatz zu der irreversiblen Schädigung des H-Clusters durch O2 reversibel (Chen et al. 2002,

Albracht et al. 2006). Bei Begasung der Proteine mit CO bindet dieses als externer Ligand an das

4. Diskussion 66

Fe(2)-Atom und blockiert so vermutlich den H2-Gaskanal (Pierik et al. 1998). Eine Bindung von

O2 an das Fe(2)-Atom führt vermutlich zu einer Oxidation des [2Fe]-Subclusters zu Fe (III).

Dadurch gehen CO- und CN-Liganden verloren und das H-Cluster wird irreversibel zerstört

(Lubitz et al. 2007). Zum Teil unterscheiden sich [FeFe]-Hydrogenasen in ihrer Sensitivität

gegenüber O2. So kann beispielsweise DdH aus D. desulfuricans unter aeroben Bedingungen

gereinigt werden und ist nur im aktiven oxidierten Zustand sauerstoffempfindlich, wohingegen

CpI aus C. pasteurianum wie die hier untersuchten Grünalgen-Hydrogenasen strikt anaerob

isoliert werden muss (Adams und Mortenson 1984, Lubitz et al. 2007). Grünalgen-

Hydrogenasen werden im Vergleich zu bakteriellen Hydrogenasen schneller durch O2 und CO

inhibiert, was vermutlich auf das Fehlen zusätzlicher F-Cluster zurückzuführen ist (Adams 1990,

Ghirardi et al. 2007).

Bei der vergleichenden Untersuchung der isolierten HydA-Proteine in Bezug auf ihre CO- und

O2-Sensitivität zeigte sich, dass die HydA1-Proteine aus C. reinhardtii und C. moewusii eine

ähnlich hohe Sauerstoffempfindlichkeit aufweisen, HydA aus C. submarium dagegen wesentlich

sauerstofftoleranter ist (3.2.4. und 3.2.5.). Bei einer Konzentration von 8% O2 sind sowohl

HydA1 aus C. reinhardtii als auch HydA1 aus C. moewusii bereits vollständig inhibiert, während

bei HydA aus C. submarium noch 50% der Ausgangsaktivität vorhanden ist (Abb.3.8.). Dies

macht HydA für weitere Untersuchungen besonders interessant, da im Hinblick auf

biotechnologische Anwendungen insbesondere daran gearbeitet wird, Hydrogenasen durch

Austausch gezielter Aminosäuren sauerstofftoleranter zu machen (Buhrke et al. 2005, Ghirardi

et al. 2007).

In Bezug auf eine Inhibierung mit Kohlenmonoxid zeigen die Hydrogenasen aus C. reinhardtii

und C. submarium ähnliche Eigenschaften, HydA1 aus C. moewusii wird dagegen schneller

inhibiert (Abb. 3.9.). Dies lässt auf einen schnelleren Umsatz des Enzyms schließen, was auch

die im Gegensatz zu HydA1 aus C. reinhardtii und HydA aus C. submarinum höhere spezifische

Aktivität belegen würde.

4.4. Die Struktur des H-Clusters von Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen

Durch die in dieser Arbeit durchgeführte EPR- und FTIR-spektroskopische Untersuchung des

katalytischen Zentrums von Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen konnte erstmals gezeigt werden,

dass das H-Cluster aller drei HydA-Proteine prinzipiell ähnlich aufgebaut ist wie das H-Cluster

4. Diskussion 67

der bereits beschriebenen bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen DdH und CpI (3.3.) (Abb. 4.1.).

Unterschiede in den ermittelten g-Werten oder den detektierten Wellenzahlen, sowie eine zum

Teil unterschiedliche Reaktion auf Licht, Oxidationsmittel oder eine Begasung mit Wasserstoff

und Argon zeigen allerdings, dass die elektronische Struktur des H-Clusters und die Symmetrie

der Liganden von Grünalgen- und bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen unterschiedlich ist.

Abb. 4.1. Strukturmodell des H-Clusters von [FeFe]-Hydrogenasen im Hox-Zustand (Silakov et al. 2007)

4.4.1. Der Hox-CO-Zustand

Durch eine Begasung mit CO wird das H-Cluster in den Hox-CO-Zustand überführt, der sowohl

im EPR-Spektrum das für [FeFe]-Hydrogenasen in diesem Zustand charakteristische axiale

Signal als auch das im FTIR-Spektrum für diesen Zustand typische Bandenmuster zeigt

(Abb.3.10. und 3.16.) (Pierik et al. 1998, Lemon et al. 1999, Nicolet et al. 2001, Chen et al.

2002, Albracht et al. 2006, Roseboom et al. 2006). Der Hox-CO-Zustand von Grünalgen-

Hydrogenasen ist somit prinzipiell ähnlich aufgebaut wie der Hox-CO-Zustand von DdH und

CpI. Kleine Unterschiede in den ermittelten g-Werten und detektierten Wellenzahlen zeigen

allerdings, dass Unterschiede in der elektronischen Struktur und der Anordnung der Liganden

vorhanden sind (Tab. 4.1. und 4.2.).

Die genaue Untersuchung der elektronischen Struktur des mit 57Fe markierten Hox-CO-Zustands

durch ENDOR- und HYSCORE-Techniken zeigt, dass die elektronische Struktur des

4. Diskussion 68

Abb. 4.2. Überblick über die verschiedenen Zustände des H-Clusters von HydA1 aus C. reinhardtii

Durch Begasung der isolierten Form mit CO lässt sich das H-Cluster in den CO-inhibierten Zustand Hox-CO

überführen, wobei das externe CO an der freien Koordinationsstelle des Fed-Atoms bindet. Durch Belichtung bei

kryogenen Temperaturen löst sich das CO wieder und man erhält den aktiven oxidierten Zustand Hox, der sich im

Gegensatz zu bakteriellen Hydrogenasen nicht biochemisch herstellen lässt. Der dabei auftretende Zwischenzustand

LI2 ist eine Art Hox-CO-Zustand mit veränderter Geometrie. Unter reduzierenden Bedingungen erhält man zwei

Zustände, Hred1 und Hred2. In Hred2 ist der CO-Brückenligand terminal an Fed gebunden.

Tab. 4.1. Vergleich der ermittelten g-Werte mit CpI (Chen et al. 2002) und DdH (Lubitz et al. 2007)

Spezies Hox-CO Hox

C. reinhardtii 2.052 2.007 2.007 2.102 2.040 1.998

C. moewusii 2.052 2.008 2.008 2.103 2.038 1.998

C. submarinum 2.056 2.008 2.008 2.100 2.040 1.998

D. desulfuricans 2.065 2.007 2.001 2.100 2.040 1.999

C. pasteurianum 2.074 2.011 2.011 2.100 2.040 2.001

4. Diskussion 69

Tab. 4.2. Überblick über die ermittelten FTIR-Banden im Vergleich zu DdH (Roseboom et al. 2006) und

CpI (Chen et al. 2002)

Alle Werte sind in [cm-1] angegeben.

Zustand Spezies CNp CNd COp COd - COext CObrHsox HydA1 2106 2093 2047 2033 1910 Hinact DdH 2106 2087 1983 2007 1848

HydA1 2091 2076 1966 1940 1799 DdH 2093 2079 1965 1940 1802

Hox

CpI 2086 2072 1971 1948 1802 HydA1 2090 2083 1970 2013 1964 1810 DdH 2096 2088 1971 2016 1963 1810

Hox-CO

CpI 2095 2077 1971 2017 1974 1810 Hred DdH 2079 2041 1965 1916 1894 Hred1 HydA1 2083 2054 1935 1890 1793 Hred2 HydA1 2030 2008 1920 1883 1955 Hsred DdH ? ? 1932 1883 1955

HydA1 2090 2083 1967 1992 1944 1810 DdH 2096 2088 1963 1995 1949 1812

Hox-13CO

CpI 2095 2077 1971 2000 1947 1810 HydA1

2090 2083 1964 1967 1970

1969 19281992 1944 2013 1964

1810 Hox-(13CO)3

DdH 2096 2088 1962 1973 1926 1770

Hox-CO-Zustands von HydA1 ähnlich ist wie die elektronische Struktur von DdH, sich aber von

der elektronischen Struktur von CpI unterscheidet (3.3.1.3.) (Tab. 4.3.). Es konnten sechs 57Fe-Hyperfeinkopplungen aufgelöst werden, die in dieser Form auch für DdH detektiert worden

sind (Silakov et al. 2007). Ein Vergleich der für HydA1 und DdH ermittelten Parameter zeigt,

dass die isotropen Teile des Hyperfein-Tensors ähnlich, der dipolare Teil dagegen leicht

unterschiedlich ist (Tab. 4.3.).

Der isotrope Teil des Hyperfein-Tensors spiegelt die ungepaarte Spinpopulation der Fe-Kerne

wieder. Die Ähnlichkeit dieser Werte für beide Spezies zeigt, dass die Verteilung von

ungepaarten Spins gleich ist. Alle sechs Fe-Atome weisen Spindichte auf, die durch

elektronische Austausch-Wechselwirkung zwischen den Fe-Atomen verursacht wird. Bei DdH

wird angenommen, dass das [2Fe]-Subcluster sowohl im oxidierten als auch im CO-inhibierten

Zustand die Konfiguration Fe(I)-Fe(II) aufweist, wobei das paramagnetische Fep(I)-Atom mit

dem formal diamagnetischen [4Fe-4S]2+-Cluster verbunden ist (Silakov et al. 2007). Die

Hyperfeinwechselwirkungen des [4Fe-4S]-Clusters werden durch Austausch-Wechselwirkung

zwischen dem Fe-Atoms, welches das [4Fe-4S]-Cluster mit dem [2Fe]-Subcluster verbindet, und

dem Fep-Atom des [2Fe]-Subclusters hervorgerufen (Popescu und Münck 1999, Silakov et al.

4. Diskussion 70

2007). Im Hox-Zustand ist der ungepaarte Elektronenspin gleichmäßig auf die beiden Fe-Atome

des [2Fe]-Subclusters verteilt. Bei Bindung eines externen CO-Liganden vergrößert sich der

Abstand zwischen den beiden Fe-Atomen des [2Fe]-Subclusters von 2,56 Å auf 2,71 Å (Fiedler

und Brunold 2005), wodurch es zu einer Lokalisierung der Elektronenspindichte am proximalen

Fe-Atom kommt, was anhand einer starken Hyperfeinwechselwirkung am Fep-Atom und einer

schwachen am Fed-Atom detektiert werden kann (Silakov et al. 2007). Dies ist auch bei HydA1

der Fall (Abb. 3.13. und 3.14., Tab. 3.5.).

Der dipolare Teil der Hyperfeinkopplung (Axyz) ist sensitiver in Bezug auf die Umgebung des

Kerns als der isotrope Teil (Aiso). Die hier beobachteten Unterschiede zeigen, dass die

Symmetrie der Liganden der Fe-Atome in DdH und HydA1 unterschiedlich ist, was sich auch in

den unterschiedlichen g-Werten und Wellenzahlen wiederspiegelt (Tab. 4.1. und 4.2.).

Auch für CpI wurde gezeigt, dass die Bindung eines externen CO-Liganden zu einer Änderung

der elektronischen Struktur des H-Clusters führt (Telser et al.1986, Popescu und Münck 1999).

Es wurden vier Hyperfeinkopplungen aufgelöst, die vermutlich zum [4Fe-4S]-Cluster gehören,

allerdings konnte nur eine einzige isotrope Hyperfeinwechselwirkung für das [2Fe]-Subcluster

nachgewiesen werden (Telser et al.1986), was zeigt, dass sich die elektronische Struktur von CpI

von DdH und HydA1 unterscheidet.

Tab. 4.3. Überblick über die ermittelten Werte des 57Fe-Hyperfein-Tensors (Ax, Ay, Az) und des isotropen

Teils (Aiso) im Vergleich zu DdH (Silakov et al. 2007)

Alle Werte sind in [MHz] angegeben.

D. desulfuricans C. reinhardtii HFK Ax Ay Az Aiso Ax Ay Az Aiso Zuordnung

A1 27.8 21.8 30.3 26.7 28.5 25.0 29.2 27.6 [4Fe-4S]HA2 26.7 23.8 30.2 27.0 30.3 23.5 30.5 28.0 [4Fe-4S]H

Fe3-Fe4

A3 35.4 35.0 30.4 33.6 34.7 34.7 29.9 33.1 [4Fe-4S]HA4 34.5 38.4 30.7 34.8 34.5 37.7 30.9 34.3 [4Fe-4S]H

Fe1-Fe2

A5 5.3 4.5 2.2 4.0 5.7 2.9 0.4 3.0 [2Fe]H Fep

A6 2.1 2.1 -1.7 0.8 3.0 3.0 -2.1 1.3 [2Fe]H Fed

Zusätzlich konnte durch FTIR-Spektroskopie gezeigt werden, dass die Schwingung des COp-

Liganden im Hox-CO-Zustand ebenso wie bei DdH und anders als bei CpI mit der Schwingung

COd/COext des distalen und externen CO-Liganden gekoppelt ist, da sich die entsprechende

4. Diskussion 71

Bande bei der Überführung in den Hox-Zustand im Spektrum von 1970 cm-1 zu 1966 cm-1

verschiebt (Abb.3.16. und Tab.4.2). HydA1 hat somit auch in dieser Hinsicht im

Hox-CO-Zustand eine größere Ähnlichkeit mit DdH als mit CpI.

4.4.2. Die Photodissoziation von Hox-CO und der Zwischenzustand LI2

Durch Belichtung des Hox-CO-Zustands bei kryogenen Temperaturen lässt sich das CO wieder

entfernen und das H-Cluster wird in den oxidierten Zustand Hox überführt (Chen et al. 2002,

Albracht et al. 2006, Roseboom et al. 2006). Bei DdH und CpI kann während dieses Prozesses

ein Zwischenzustand (LI2) detektiert werden, der durch eine reversible, partielle Ablösung des

CO-Brückenliganden charakterisiert ist, während der externe, zu entfernende CO-Ligand noch

gebunden ist (Pierik et al. 1998, Chen et al. 2002, Roseboom et al. 2006). Auch bei HydA1 ist

eine Ablösung des externen CO-Liganden durch Photodissoziation des Hox-CO-Zustands

möglich, was im Hox-Zustand resultiert (Abb.3.11. und 3.16.). Bei der Belichtung tritt allerdings

ein Zwischenzustand auf, der sich geometrisch von dem für DdH und CpI beschriebenen

LI2-Zustand unterscheidet (Abb.3.16.). Im FTIR-Spektrum ist zu sehen, dass die CN-Banden des

H-Clusters stark zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben sind, was bedeutet, dass sich die

Geometrie des [2Fe]-Subclusters während der Photodissoziation stark ändert. Eine Bande bei

1817 cm-1 zeigt allerdings, dass der CO-Brückenligand im Gegensatz zu DdH und CpI nicht

dissoziiert. Der Zwischenzustand LI2 von HydA1 ist somit eine Art Hox-CO-Zustand mit

veränderter Geometrie.

Durch eine isotopische Markierung der CO-Liganden mit 13C konnte gezeigt werden, dass das

H-Cluster von HydA1 bei Belichtung zum Teil anders reagiert als das H-Cluster von DdH. Bei

DdH ist zu beobachten, dass bei einer Belichtung des Hox-13CO-Zustands bei kryogenen

Temperaturen COd und CObr dissoziieren und durch 13CO ausgetauscht werden (Roseboom et al.

2006). Bei HydA1 werden dagegen alle CO-Liganden des H-Clusters durch 13CO ersetzt (Abb.

3.17.).

4.4.3. Der Hox-Zustand

Der für HydA1 detektierte Hox-Zustand ist nahezu identisch mit dem Hox-Zustand von DdH und

zeigt ebenfalls große Ähnlichkeit zu der oxidierten Form von CpI (Abb.3.10. und 3.16.). Die

ermittelten g-Werte für den Hox-Zustand unterscheiden sich nur geringfügig, bei den detektierten

FTIR-Banden sind kleinere Unterschiede festzustellen (Tab. 4.1. und 4.2.). Durch die

4. Diskussion 72

Untersuchung von 13C markiertem H-Cluster konnte gezeigt werden, dass die Schwingungen von

COp und COd miteinander gekoppelt sind (Abb.3.17.). Im Gegensatz zu DdH und CpI lässt sich

das H-Cluster von HydA1 nur durch Photodissoziation des Hox-CO-Zustands (3.3.1.2.) oder

durch Anlegen eines elektrochemischen Potentials (3.3.2.4.) und nicht biochemisch oder durch

Begasung der reduzierten Form mit Argon in den Hox-Zustand überführen. Die für CpI

verwendeten Oxidationsmittel zerstören das H-Cluster von HydA1, was zeigt, dass der oxidierte

Zustand von HydA1 empfindlicher ist als der von CpI. Dies könnte auf die fehlenden F-Cluster

bei Grünalgen-Hydrogenasen und die direkte Interaktion des H-Clusters mit den verwendeten

Reagenzien zurückzuführen sein.

4.4.4. Die reduzierten Zustände: Hred1 und Hred2

Bei DdH führt die Begasung mit H2 zu einem einzigen reduzierten Zustand, in dem der

CO-Brückenligand terminal an das distale Fe-Atom gebunden ist (Nicolet et al. 2001, Roseboom

et al. 2006). Bei HydA1 erhält man weder durch die Zugabe von NaDT noch durch Begasung

mit H2 einen klaren reduzierten Zustand (Abb. 3.21.), was vermutlich wiederum durch das

Fehlen der zusätzlichen F-Cluster zu begründen ist. Durch das Anlegen eines elektrochemischen

Potentials konnten zwei reduzierte Zustände von HydA1 aufgelöst werden (3.3.2.4.).

Bei einem Potential von - 400 mV erhält man den reduzierten Zustand Hred1 (Abb. 3.20.). Bei

diesem Zwischenzustand ist einer der CN-Liganden verschoben, was zeigt, dass eines der Fe-

Atome reduziert wurde. Dieser Zustand hat aufgrund des im Spektrum detektierten

Bandenmusters und des ähnlichen Mittelpunkspotential von - 400 mV für den Übergang

Hox/Hred1 Ähnlichkeit zum reduzierten Zustand von DdH (Tab. 4.2. und 4.4.). Allerdings ist im

Gegensatz zu DdH die CO-Brücke noch gebunden. Bei einem Potential von - 450 mV erhält man

einen zweiten reduzierten Zustand Hred2, in dem vermutlich wie bei DdH der CO-Brückenligand

dissoziiert ist und nun terminal gebunden an Fed vorliegt. Das für diesen Zustand detektierte

Bandenmuster hat Ähnlichkeit mit dem superreduzierten Zustand Hsred von DdH, allerdings

unterscheiden sich beide in ihrem Mittelpunktspotential (Tab.4.4.). Die Reduktion von HydA1

ist im Gegensatz zu DdH reversibel (Abb.3.19. und Tab.4.4.). Da bei der EPR-spektroskopischen

Untersuchung außer Hox und Hox-CO kein weiterer Zustand nachgewiesen werden konnte, sind

die reduzierten Zustände beide diamagnetisch und haben vermutlich wie DdH und CpI die

Konfiguration Fe(I)-F(I).

4. Diskussion 73

Tab. 4.4. Vergleich der Mittelpunktspotentiale bei der elektrochemischen Titration von HydA1 und DdH

(Roseboom et al. 2006)

D. desulfuricans C. reinhardtii

Übergang Potential (mV) pH 7 pH 8 Übergang Potential (mV)

pH 7,5 Htrans / Hox (2e-) irreversibel - 261 - 301 Hox - 260 Hox / Hred (1e-) - 354 - 395 Hox / Hred1 (1e-) - 400 Hred / Hsred irreversibel - 500 - 540 Hred1 / Hred2 (1e-) - 455

4.4.5. Der katalytische Mechanismus im H-Cluster

Der katalytische Mechanismus von [FeFe]-Hydrogenasen ist im Gegensatz zu

[NiFe]-Hydrogenasen bisher weniger gut verstanden. Für DdH wird angenommen, dass der

Wasserstoff durch einen H2-Gaskanal zum Fed-Atom gelangt, dort an die freie

Koordinationsstelle bindet und heterolytisch gespalten wird (Nicolet 2000, Lubitz et al. 2007).

Die freiwerdenden Elektronen werden auf das [4Fe-4S]-Cluster, die F-Cluster und anschließend

auf einen externen Elektronenakzeptor, die freiwerdenden Protonen auf verschiedene Reste im

Protein, möglicherweise auch den Dithiometylamin-Liganden, übertragen. Verschiedene

Untersuchungen belegen, dass das [2Fe]-Subcluster im Hox-Zustand die Konfiguration

Fep(I)-Fed(II) aufweist, wobei das paramagnetische Fep(I)-Atom mit dem formal

diamagnetischen [4Fe-4S]2+-Cluster verbunden ist. Während des katalytischen Zyklus wechselt

das [2Fe]-Subcluster zwischen der Konfiguration Fep(I)-Fed(II) im Hox- und Fep(I)-Fed(I) im

Hred-Zustand (Silakov et al. 2007, Lubitz et al. 2007). Daraus lässt sich ein Modell ableiten, das

sowohl die H2-Oxidation als auch die H2-Produktion erklärt (Abb. 3.4.) und somit auch auf

HydA1 übertragen werden kann, da die spektroskopische Untersuchung gezeigt hat, dass der

Hox-Zustand von HydA1 wie DdH die Konfiguration Fep(I)-Fed(II) und die reduzierten Zustände

vermutlich die Konfiguration Fep(I)-Fed(I) besitzen (4.4.1. und 4.4.4.). Bei HydA1 läuft der

Mechanismus in umgekehrter Reihenfolge, möglicherweise aber über dieselben Zwischenstufen,

wie bei DdH ab. Die Elektronen werden vermutlich durch Ferredoxin direkt über das [4Fe-4S]-

Cluster auf das Fed-Atom des [2Fe]-Subclusters übertragen. Gleichzeitig werden Protonen über

den Protonentransferpfad zum Fed-Atom transportiert und dort mit den Elektronen zu

molekularem H2 umgesetzt, der dann über den hydrophoben Gaskanal freigesetzt wird (Winkler

et al. 2002).

Da HydA1 nur aus dem katalytisch aktiven H-Cluster besteht und keine zusätzlichen F-Cluster

besitzt, können, wie die Messungen zeigen, in vitro keine Elektronen abgegeben werden.

Dadurch bleibt das Enzym beispielsweise nach einer Begasung mit H2 oder Zugabe von NaDT

4. Diskussion 74

im reduzierten Zustand, lässt sich nicht biochemisch oxidieren und reagiert empfindlicher auf

zugegebene Reagenzien.

aktiv

inaktiv

Abb.4.3. Überblick über die verschiedenen Redoxzustände des H-Clusters und den möglichen katalytischen

Mechanismus von [FeFe]-Hydrogenasen am Beispiel von DdH (Lubitz et al. 2007) Die Zustände, die in den katalytischen Zyklus involviert sind, sind gelb eingerahmt. Für jeden Zustand sind die

Oxidationszahlen der Fe-Atome des [2Fe]-Subclusters und zusätzlich der am Fed-Atom bindende Ligand X in

eckigen Klammern angegeben. Das [4Fe-4S]-Cluster hat jeweils die Oxidationsstufe 2+. Die EPR-aktiven Zustände

Hox und Hox-CO sind rot dargestellt, der diamagnetische Zustand Hred blau.

Eine exakte Aufklärung der Struktur des H-Clusters von Grünalgen-[FeFe]-Hydrogenasen

könnte durch eine für die Zukunft geplante Auflösung und Analyse der Röntgenkristallstruktur

des Proteins erfolgen, genauere Hinweise auf den katalytischen Mechanismus könnte

beispielsweise die Untersuchung von Protonentransfermutanten liefern.

5. Literatur 75

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Abbildungsverzeichnis Abb. 1.1. Strukturmodell der [FeFe]-Hydrogenasen DdH aus Desulfovibrio desulfuricans (Nicolet et al. 1998) und CpI aus Clostridium pasteurianum (Peters et al. 1998) 5 Abb. 1.2. Aufbau des H-Clusters von [FeFe]-Hydrogenasen 6 Abb. 1.3. Sequenzalignment von bakteriellen [FeFe]-Hydrogenasen und Grünalgen-

[FeFe]-Hydrogenasen 8 Abb. 1.4. Strukturmodell und Oberflächenladungsmodell der [FeFe]-Hydrogenase

HydA1 aus Chlamydomonas reinhardtii 9 Abb. 3.1. Induktion der Hydrogenase-Expression in C. reinhardtii, C. moewusii und C. submarinum durch Schwefelmangel 30 Abb. 3.2. Western Blot von HydA1 aus C. reinhardtii, exprimiert unter Schwefelmangel und anaerober Adaptation 31 Abb. 3.3. Schematische Darstellung des entwickelten Reinigungsprotokolls zur

Isolierung von[FeFe]-Hydrogenasen aus Grünalgen 32 Abb. 3.4. SDS-PAGE und Western Blot der verschiedenen Reinigungsstufen von

HydA1 aus C. reinhardtii 33 Abb. 3.5. SDS-PAGE der isolierten [FeFe]-Hydrogenasen aus C. submarinum und

C. moewusii 35 Abb. 3.6. Identifizierung der isolierten HydA-Proteine aus C. reinhardtii,

C. moewusii und C. submarinum 36 Abb. 3.7. Bestimmung des pH-Optimums von HydA1 aus C. reinhardtii (A), HydA1

aus C. moewusii (B) und HydA aus C. submarinum (C) 38 Abb. 3.8. Sauerstoffsensitiviät von [FeFe]-Hydrogenasen 40 Abb. 3.9. Inhibierung von Hydrogenasen durch Kohlenmonoxid 42 Abb. 3.10. Q-Band Puls-EPR-Spektren der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii (A, B, C), HydA aus C. submarinum (D, E) und HydA1 aus C. moewusii (F) 44 Abb. 3.11. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei 20 K 46 Abb. 3.12. Q-Band FID-EPR-Spektrum des 57Fe-angereicherten Hox-CO-Zustands (blau) und des unmarkierten Hox-CO-Zustands (rot) von HydA1 47


Abb. 3.13. Q-Band Davies-ENDOR-Spektren des 57Fe-angereicherten Hox-CO- Zustands 48 Abb. 3.14. Q-Band HYSCORE-Spektren des 57Fe-angereicherten Hox-CO-Zustands 49 Abb. 3.15. Schematische Darstellung der Orientierung des 57Fe-Hyperfein-Tensors

des H-Clusters im Hox-CO-Zustand (Silakov et al. 2007) 50 Abb. 3.16. Photodissoziation des Hox-CO-Zustands von HydA1 aus C. reinhardtii bei

40 K 53 Abb. 3.17. Isotopenmarkierung der CO-Liganden mit 13C 57 Abb. 3.18. FTIR-Spektren der isolierten und reduzierten Form von HydA1 aus

C. reinhardtii 58 Abb. 3.19. Dreidimensionale Darstellung der Änderung der Absorptionsbanden

während der elektrochemischen Reduktion (A) und Oxidation (B) des H-Clusters von HydA1 60

Abb. 3.20. Ausgewählte FTIR-Spektren bei verschiedenen Potentialen während der

elektrochemischen Reduktion und Oxidation des H-Clusters von HydA1 61 Abb. 3.21. Intensität charakteristischer CO-Banden bei der elektrochemischen

Reduktion und Oxidation 62 Abb. 4.1. Strukturmodell des H-Clusters von [FeFe]-Hydrogenasen im Hox-

Zustand (Silakov et al. 2007) 67 Abb. 4.2. Überblick über die verschiedenen Zustände des H-Clusters von HydA1

aus C. reinhardtii 68 Abb. 4.3. Überblick über die verschiedenen Redoxzustände des H-Clusters und den

möglichen katalytischen Mechanismus von [FeFe]-Hydrogenasen am Beispiel von DdH (Lubitz et al. 2007) 74

Tabellenverzeichnis 85

Tabellenverzeichnis Tab. 3.1. Übersicht über die Reinigung der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus C. reinhardtii 33 Tab. 3.2. Übersicht über die Reinigung der [FeFe]-Hydrogenase HydA aus

C. submarinum 35 Tab. 3.3. Übersicht über die Reinigung der [FeFe]-Hydrogenase HydA1 aus

C. moewusii 35 Tab. 3.4. Überblick über die ermittelten g-Werte 45 Tab. 3.5. Überblick über die ermittelten Parameter der Hyperfeinwechselwirkungen

der 57Fe-Kerne im Hox-CO-Zustand 50 Tab. 3.6. Überblick über die detektierten FTIR-Banden 62 Tab. 4.1. Vergleich der ermittelten g-Werte mit CpI (Chen et al. 2002) und DdH

(Lubitz et al. 2007) 68 Tab. 4.2. Überblick über die ermittelten FTIR-Banden im Vergleich zu DdH

(Roseboom et al. 2006) und CpI (Chen et al. 2002) 69 Tab. 4.3. Überblick über die ermittelten Werte des 57Fe-Hyperfein-Tensors

(Ax, Ay, Az) und des isotropen Teils (Aiso) im Vergleich zu DdH (Silakov et al. 2007) 70

Tab. 4.4. Vergleich der Mittelpunktspotentiale bei der elektrochemischen Titration von HydA1 und DdH (Roseboom et al. 2006) 73

ERKLÄRUNG Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der von mir heute eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig

übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den

DANKSAGUNG Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Thomas Happe für die Betreuung dieser Arbeit und die

Möglichkeit zur Promotion in der Arbeitsgruppe Photobiotechnologie.

Gleiches gilt für Prof. Dr. Eckhard Hofmann, der freundlicherweise das Zweitgutachten

übernommen hat.

Des weiteren möchte ich mich ganz herzlich bei unseren Kooperationspartnern am Max-Planck-

Institut für Bioanorganische Chemie, Prof. Dr. Wolfgang Lubitz, Dr. Edward Reijerse und im

Besonderen Dr. Alexey Silakov für die Zusammenarbeit und die Möglichkeit der Durchführung

der EPR- und FTIR-spektroskopischen Untersuchungen bedanken.

Weiterhin danke ich Dr. Frank Fischer und Dr. Markus Piotrowski für die Sequenzierung der

isolierten Proteine sowie allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen der Arbeitsgruppe

Photobiotechnologie.

LEBENSLAUF

Persönliche Daten

Christina Kamp

geboren am 12.1.1980

in Viersen, Nordrhein-Westfalen

Schulbildung

1986-1990

1990-1999

Besuch der Kreuzherren-Grundschule Dülken

Besuch des Albertus-Magnus-Gymnasiums Dülken

Studium und Promotion

1999-2005

2005-2008

Studium der Biologie an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Thema der Diplomarbeit:

Untersuchungen zur Expression und Funktion des E. coli Proteins Rsd, ein

möglicher Antisigmafaktor für σ70

angefertigt im Institut für Physikalische Biologie in der Abteilung

Molekularbiologie der Prokaryoten

Promotion an der Ruhr-Universität Bochum

Thema der Doktorarbeit:

Spektroskopische Untersuchung des H-Clusters von photosynthetischen

[FeFe]-Hydrogenasen am Beispiel von HydA1 aus Chlamydomonas reinhardtii

angefertigt im Institut für Biochemie der Pflanzen in der Abteilung

Photobiotechnologie

Spektroskopische Untersuchung des H-Clusters von ... · by analysing the structure of their...

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